特表2023-549062ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を使用したがんの治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-22
(54)【発明の名称】ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を使用したがんの治療
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20231115BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231115BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20231115BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231115BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231115BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231115BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231115BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20231115BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C07K16/30
A61P43/00 121
A61P35/00
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K31/4709
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525020
(86)(22)【出願日】2021-10-29
(85)【翻訳文提出日】2023-06-19
(86)【国際出願番号】 EP2021080075
(87)【国際公開番号】W WO2022090439
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】20204807.0
(32)【優先日】2020-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514099673
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ガーリンガー， マルコ
(72)【発明者】
【氏名】セミアニコワ， マリア
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC202
4C084ZC412
4C084ZC422
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB36
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB03
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、がんの治療、特に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を使用したがんの治療に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
個体におけるがんの治療における使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体であって、前記治療がＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と組み合わせた前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項2】
個体におけるがんの治療のための医薬の製造におけるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の使用であって、前記治療がＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と組み合わせた前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、使用。
【請求項3】
個体におけるがんを治療するための方法であって、前記個体にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項4】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む第１の医薬と、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む第２の医薬とを含み、任意に、個体におけるがんを治療するための前記第２の医薬と組み合わせた前記第１の医薬の投与のための指示書を含む添付文書を更に含む、キット。
【請求項5】
前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分と
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＥ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項6】
前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに特異的に結合する第３の抗原結合部分及び／又は第１のサブユニットと第２のサブユニットとから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項7】
前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含み、
前記第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において前記第１の抗原結合部分の前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、前記第１の抗原結合部分が、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端において前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、前記第３の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項１～６のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項8】
前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の前記第１の抗原結合部分が、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含み、並びに／又は前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の前記第２の抗原結合部分及び（存在する場合）前記第３の抗原結合部分が、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項9】
前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含み、並びに／又は前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／若しくはエフェクター機能を低下させる一若しくは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項10】
前記ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体がシビサタマブである、請求項１～９のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項11】
前記ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が、ＴＧＦβ（特に、ＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２）、ＴＧＦβ（共）受容体（特にＴβ１、２及び／又は３）、ＳＭＡＤタンパク質（特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４）、インテグリン（特に、インテグリンαｖβ６）、並びに脱ユビキチン化酵素（特に、ＵＳＰ４及び／又はＵＳＰ１５）からなる群から選択されるＴＧＦβシグナル伝達経路の成分を標的とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項12】
前記ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ（共）受容体阻害剤である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項13】
前記ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が、キナーゼ阻害剤、特にＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項14】
前記ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤がガルニセルチブである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項15】
前記治療が、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアテゾリズマブの投与を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項16】
前記がんがＣＥＡ陽性がんである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項17】
前記がんが、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、及び胃がんからなる群から選択されるがん、特に結腸直腸がんである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項18】
上記に記載されるとおりの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、がんの治療、特に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を使用したがんの治療に関する。
本発明は、がんの治療、特に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を使用したがんの治療に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞を関与させるように設計された新しいクラスのがん治療薬である。このような抗体が、Ｔ細胞上のＣＤ３と腫瘍細胞に発現する抗原に同時に結合すると、腫瘍細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、Ｔ細胞の活性化とそれに続く腫瘍細胞の溶解が引き起こされる。
Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞を関与させるように設計された新しいクラスのがん治療薬である。このような抗体が、Ｔ細胞上のＣＤ３と腫瘍細胞に発現する抗原に同時に結合すると、腫瘍細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、Ｔ細胞の活性化とそれに続く腫瘍細胞の溶解が引き起こされる。
【0003】
Ｔ細胞二重特異性抗体シビサタマブ（ＲＧ７８０２、ＲＯ６９５８６８８、ＣＥＡ－ＴＣＢ）は、Ｔ細胞受容体の特異性とは無関係に細胞表面でＣＥＡ糖タンパク質を発現する腫瘍細胞にＴ細胞をリダイレクトする、腫瘍細胞上のがん胎児性抗原（ＣＥＡ）とＴ細胞上のＣＤ３とを標的とする新規のＴ細胞活性化二重特異性抗体である（Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；５（８）：１－３０）。Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗体の主な利点は、それらが新生抗原の負荷とは無関係にＴ細胞によるがん細胞の認識を媒介することである。ＣＥＡは多くの結腸直腸がん（ＣＲＣ）の細胞表面で過剰発現しているため、シビサタマブは非超変異マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）ＣＲＣの有望な免疫療法剤である。
【0004】
シビサタマブは、Ｔ細胞上のＣＤ３イプシロン鎖に対する単一の結合部位と、中程度から高いＣＥＡ細胞表面発現を伴うがん細胞への結合力を調整する２つのＣＥＡ結合部位とを有する（Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２（１３）：３２８６－９７）。これにより、一部の組織に生理学的に存在する、ＣＥＡ発現レベルが低い健康な上皮細胞を標的とすることが回避される。がん細胞表面上のＣＥＡ及びＴ細胞上のＣＤ３へのシビサタマブの結合は、Ｔ細胞の活性化、サイトカイン分泌、及び細胞傷害性顆粒の放出を引き起こす。少なくとも２つの以前の化学療法レジメンに失敗したＣＥＡ発現転移性ＣＲＣを有する患者におけるシビサタマブの第Ｉ相試験では、単剤療法で又はＰＤ－Ｌ１阻害抗体と組み合わせて治療された患者のそれぞれ１１％（４／３６）及び５０％（５／１０）において放射線収縮を伴う抗腫瘍活性を示した（Ａｒｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｊｕｎ １；２８（ｓｕｐｐｌ＿３）：ｍｄｘ３０２．００３－ｍｄｘ３０２．００３；Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｍａｙ ２０；３５（１５＿ｓｕｐｐｌ）：３００２）。この用量漸増試験の一部の患者は、最終推奨用量よりも低い用量で治療されたが、それにもかかわらず、奏効率は、腫瘍のサブグループが治療に耐性があることを示している。
【0005】
したがって、シビサタマブに対する応答率及び／又は治療有効性を増加させることが望ましいであろう。
【発明の概要】
【0006】
発明の説明
患者由来の結腸直腸がんオルガノイド（ＰＤＯ）を使用することで、本発明者らは、ＴＧＦβがシビサタマブの有効性に対抗する強力な免疫抑制因子であり、したがって、シビサタマブ等のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の奏効率及び／又は治療有効性が、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と組み合わせることによって増加し得ることを見出した。
患者由来の結腸直腸がんオルガノイド（ＰＤＯ）を使用することで、本発明者らは、ＴＧＦβがシビサタマブの有効性に対抗する強力な免疫抑制因子であり、したがって、シビサタマブ等のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の奏効率及び／又は治療有効性が、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と組み合わせることによって増加し得ることを見出した。
【0007】
したがって、第１の態様では、本発明は、個体におけるがんの治療における使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体であって、治療がＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【0008】
更なる態様では、本発明は、個体におけるがんの治療のための医薬の製造におけるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の使用であって、治療がＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、使用を提供する。
【0009】
また更なる態様では、本発明は、個体にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を投与することを含む、個体におけるがんを治療するための方法を提供する。
【0010】
一態様では、本発明は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む第１の医薬と、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を第２の医薬とを含み、任意に、個体におけるがんを治療するための第１の医薬と第２の医薬を組み合わせた投与のための指示書を含む添付文書を更に含む、キットも提供する。
【0011】
上記又は本明細書に記載のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、又はキットは、以下に記載する特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる（文脈で別段の指示がない限り）。
【0012】
本明細書に記載のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３とＣＥＡとに特異的に結合する二重特異性抗体である。特に有用なＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、例えばＰＣＴ公開番号国際公開第２０１４／１３１７１２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0013】
「二重特異性」との用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの抗原決定基、特に、２つの別個の細胞で発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【0014】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。
【0015】
本明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞に結合する部分（例えば、第２の抗原結合部分）に指向することができる。別の態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書に更に定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施形態では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義され、当該技術分野で知られているような抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域には、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。
【0016】
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合部分の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する抗原結合部分、又はこの抗原結合部分を含む抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0017】
「親和性」は、分子（例えば受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。特に断らない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗原結合部位と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）で表され、これは、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。アフィニティは、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0018】
「ＣＤ３」は、別途明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ３を指す。この用語は、「全長」の、未処置のＣＤ３、及び、細胞内でのプロセシングによりもたらされる任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号２４も参照されたい。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号２５も参照されたい。
【0019】
「がん胎児性抗原」又は「ＣＥＡ」（がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている）は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。この用語は、「全長」の、未処置のＣＥＡ、及び細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＣＥＡを包含する。この用語は、ＣＥＡの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一態様では、ＣＥＡはヒトＣＥＡである。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０６７３１、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４３５４．２に示されている。一態様では、ＣＥＡは膜結合ＣＥＡである。一態様では、ＣＥＡは、細胞、例えばがん細胞の表面に発現したＣＥＡである。
【0020】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ分子等に関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在する場合の区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、明示的に示されていない限り、二重特異性抗体の特定の順序又は配向を与えることを意図していない。
【0021】
本明細書で使用される「価数」という用語は、抗体内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。したがって、「抗原に対する一価の結合」という用語は、抗体内の抗原に特異的な１つの（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
【0022】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
【0023】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で互換的に使用される。
【0024】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、二価であっても二重特異性であってもよい。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
【0025】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含んでいる、類似の構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。可変領域配列に関連して本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されるナンバリングシステムを指す。
【0026】
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔナンバリング」と呼ばれる。特定的には、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の６４７～６６０頁を参照されたい）を、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照されたい）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と言及することによって更に明確にしている。
【0027】
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般的に、抗体は、６つのＣＤＲを含み、ＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、以下が挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
【0028】
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
【0029】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の順序で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
【0030】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。
【0031】
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインと、からなるタンパク質を指す。
【0032】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換わっている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
【0033】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、即ち重鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１）で構成される重鎖と、軽鎖の可変ドメイン及び定常領域（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ－ＣＬ）で構成される軽鎖とを含むＦａｂ分子を意味する。
【0034】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる）と、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプに更に分類されてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから本質的になる。
【0035】
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう定義されている。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよく、又は完全長重鎖の開裂した変異体を含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照されたい）に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
【0036】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むペプチドと同一のポリペプチドとの会合を減らすか又は防ぐ、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）のそれぞれに対し、別個の修飾を含み、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合する更なる構成要素（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で、同一ではない場合がある。いくつかの態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【0037】
用語「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
【0038】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のために、％アミノ酸 配列同一性の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを用いて又はその後ＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって認定され、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．から公的に利用可能である。あるいは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
【0039】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる連結の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
【0040】
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、本用語はまた、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）までの低減、即ち、相互作用の完全な終止も含む。逆に、「結合上昇」は、個々の相互作用に対する結合親和性における上昇を指す。
【0041】
「融合された（されている）」とは、構成要素（例えばＦａｂ分子とＦｃドメインサブユニット）が、直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で連結されていることを意味する。
【0042】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する第２の抗原結合部分とを含む。
【0043】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【0044】
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【0045】
特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分と、を含む。
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分と、を含む。
【0046】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0047】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列と、配列番号８の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0048】
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0049】
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１５の重鎖可変領域配列と、配列番号１６の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0050】
いくつかの態様では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。いくつかの態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。そのような態様では、第２の抗原結合部分は、好ましくは、従来のＦａｂ分子である。
【0051】
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、任意にペプチドリンカーを介して、互いに融合されている。
【0052】
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、のいずれかである。
【0053】
いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。
【0054】
特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する単一の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する２つの抗原結合部分とを含む。よって、いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する、第３の抗原結合部分、特にＦａｂ分子、より具体的には従来のＦａｂ分子を含む。第３の抗原結合分子は、第２の抗原結合部分に関して記載される特徴の全て（例えば、ＣＤＲ配列、及び／又は可変領域配列）を、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。いくつかの態様では、第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分と同一である（例えば、第３の抗原結合分子は、従来のＦａｂ分子でもあり、同じアミノ酸配列を含む）。
【0055】
特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを更に含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。更に特定の態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。特定の好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号２３に提示されている。
【0056】
第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び、存在する場合、第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ分子であるいくつかの態様では、（ａ）（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているかのいずれか一方であり、且つ、（ｂ）存在する場合、第３の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
【0057】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＣＨ３ドメインの中にある。したがって、一態様では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
【0058】
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
【0059】
したがって、いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能な第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。好ましくは、より大きな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。
【0060】
具体的なそのような態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、任意に、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
【0061】
いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【0062】
特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ以上である。特定の態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。
【0063】
典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸置換が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一態様では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する。一態様では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。
【0064】
一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）、すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基はグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0065】
いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、第１、第２及び第３の抗原結合部分（特にＦａｂ分子）と、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、任意に１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になる。
【0066】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の構成要素を互いに直接融合させても、又は好ましくは１つ以上の適切なペプチドリンカーを介して融合させてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
【0067】
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１個以上のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当該技術分野に知られており、本明細書に説明されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ又は（Ｇ４Ｓ）ｎＧ５ペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。いくつかの態様では、当該ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、いくつかの態様では５から１００アミノ酸の長さ、更なる態様では１０から５０アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、当該ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、且つ（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝１、２、３、４又は５、及びｍ＝０、１、２、３、４又は５）、いくつかの態様ではｘ＝４及びｎ＝２又は３、更なる態様ではｘ＝４及びｎ＝２、なお更なる態様ではｘ＝４、ｎ＝１及びｍ＝５である。いくつかの態様では、当該ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。他の態様では、当該ペプチドリンカーはＧ４ＳＧ５である。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、更なるペプチドリンカーを伴い又は伴うことなく融合していてもよい。
【0068】
好ましい態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
【0069】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0070】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列と、配列番号８の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0071】
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0072】
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５の重鎖可変領域配列と、配列番号１６の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0073】
上記の態様によるＦｃドメインは、Ｆｃドメインに関して上に記載される特徴の全てを単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
【0074】
一態様では、抗原結合部分及びＦｃ領域は、ペプチドリンカー、特に、配列番号１９及び配列番号２０にあるようなペプチドリンカーによって、互いに融合している。一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）と、配列番号１８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号２０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドとを含む。
【0075】
特に好ましい態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）と、配列番号１８の配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列を含むポリペプチドと、配列番号２０の配列を含むポリペプチドとを含む。
【0076】
特に好ましい態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体はシビサタマブ（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ），Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ ８０，２０１８，ｖｏｌ．３２，ｎｏ．３，ｐ．４３８）である。
【0077】
当業者に知られるであろう他のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体も、本発明における使用が検討されている。
【0078】
本明細書におけるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）βシグナル伝達阻害剤と組み合わせて使用される。
【0079】
「ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤」という用語は、ＴＧＦβ経路を介したシグナル伝達を阻害する分子を指す。「ＴＧＦβ」は、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ１、２及び３の３つのアイソフォーム全てを包含する。特定の態様では、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ１、特にヒトＴＧＦβ１である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ヒトＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤である。
【0080】
ＴＧＦβシグナル伝達経路は、ＴＧＦβと、そのＩ型受容体及びＩＩ型受容体であるＴβＲＩ及びＴβＲＩＩ（それぞれ、シングルパス膜貫通受容体であり、内因性セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する）との相互作用によって活性化され得る。
【0081】
ＴＧＦβは潜在型で分泌され、これはインテグリン依存性過程を介して活性化され得る。インテグリンαｖβ６は、潜在型ＴＧＦβの活性化に役割を果たす。活性化されたＴＧＦβは、最初にＴＧＦβ共受容体ベータグリカン（ＴβＲＩＩＩとも呼ばれる）と係合する。ベータグリカン上に提示された後、ＴＧＦβはＴβＲＩＩに結合し、その後、ＴβＲＩを動員してヘテロマーシグナル伝達複合体を形成する。ＴβＲＩは、そのグリシン－セリン隣接膜ドメイン中のセリン及びトレオニン残基においてＴβＲＩＩによってリン酸化される（受容体転移ホルスホリル化）。活性化されたＴβＲＩは、下流のエフェクタータンパク質ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３をリン酸化し、その後、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は、ＳＭＡＤ４とのヘテロマー複合体へと集合する。ＳＭＡＤ複合体は核に移行し、そこで転写因子として作用して遺伝子発現を調節する。ＴＧＦβシグナル伝達標的遺伝子には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１（ＰＡＩ－１）及びＳＭＡＤ７遺伝子が含まれる。ＳＭＡＤ７は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＳＭＵＲＦ２を動員してＴβＲ１を活性化し、それによって、プロテオソーム／リソソーム分解のためにこの受容体を標的化することで、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤として作用する。ＴβＲ１のユビキチン化は、ＵＳＰ４／１５脱ユビキチン化酵素によって逆転され得る。
【0082】
ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与する１つ以上のタンパク質を標的とし、例えば、そのようなタンパク質とＴＧＦβシグナル伝達経路の他の成分（複数可）との間の相互作用を阻害すること、そのようなタンパク質の分解を促進すること、そのようなタンパク質の発現を阻害／低減すること、又はそのようなタンパク質の機能（例えば酵素機能）を阻害することによって、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性を阻害する分子であり得る。例示的な阻害部位には、ＴＧＦβリガンド、ＴＧＦβ（共）受容体（Ｔβ１、２及び／又は３）、ＳＭＡＤタンパク質（特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４）、潜在型ＴＧＦβの活性化に関与するインテグリン、例えばインテグリンαｖβ６、又は脱ユビキチン化酵素、例えばＵＳＰ４／１５が含まれるが、これらに限定されない。追加的又は代替的に、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性が、ＴＧＦβシグナル伝達をダウンレギュレーションするタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ７及び／又はＳＭＵＲＦ２等）の機能を促進することによって阻害される場合がある。
【0083】
ＴＧＦβシグナル伝達及びその阻害剤は、例えば、Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１９）９，７４３ ｏｒ Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ（２０１７）９，ａ０２２３０１（いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に概説されている。
【0084】
ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤には、様々なモダリティ、例えば中和抗体、リガンドトラップ、ＴＧＦβシグナル伝達経路の成分の変異型、受容体チロシンキナーゼ阻害剤等の小分子、ペプチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ得る。
【0085】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与する２つ以上のタンパク質の相互作用を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与する１つ以上のタンパク質の分解を促進する。一態様では、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与する１つ以上のタンパク質の発現を阻害又は低減する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与する１つ以上のタンパク質の機能（例えば酵素機能）を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達に関与するそのようなタンパク質（複数可）は、ＴＧＦβ（特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２）、ＴＧＦβ（共）受容体（特にＴβ１、２及び／又は３）、ＳＭＡＤタンパク質（特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４）、インテグリン（特にインテグリンαｖβ６）及び脱ユビキチン化酵素（特にＵＳＰ４及び／又はＵＳＰ１５）からなる群から選択される。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ（特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２）、ＴＧＦβ（共）受容体（特にＴβ１、２及び／又は３）、ＳＭＡＤタンパク質（特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４）、インテグリン（特にインテグリンαｖβ６）及び脱ユビキチン化酵素（特にＵＳＰ４及び／又はＵＳＰ１５）からなる群から選択されるＴＧＦβシグナル伝達経路の成分を標的とする（例えば、特異的に結合する）。
【0086】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２の阻害剤である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２と、ＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩとの相互作用を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２を標的とする（例えば、特異的に結合する）。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２に結合する抗体、特にヒト及び／又はモノクローナル抗体である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、抗体フレソリムマブ（ＧＣ１００８としても知られる）（完全ヒト化ＩｇＧ４モノクローナルｐａｎ－ＴＧＦβ１／２／３抗体；例えば、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ＯＮＥ ２０１４，９，ｅ９０３５３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。一態様では、ＴＧＦβ阻害剤は、抗体ＬＹ２３８２７７０（ＴβＭ１としても知られる）（ＩｇＧ４モノクローナルＴＧＦβ１抗体；例えば、Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２０１４，４５，２２２１－３１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。一態様では、ＴＧＦβ阻害剤は、Ｂｅｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ ２０１６，８，３８９－４０４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている抗体ＸＰＡ．４２．６８１又は抗体ＸＰＡ．４２．０８９である。
【0087】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２、最も具体的にはＴＧＦβ－２の発現を阻害又は低減する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、トラベダーセン（ＡＳ１２００９としても知られる）（例えば、Ｖａｌｌｉｅｒｅｓ，ＩＤｒｕｇｓ ２００９，１２（７），４４５－５３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。トラベデルセン（Ｔｒａｂｅｄｅｒｓｅｎ）は、配列５’－ＣＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡ－３’を有する一本鎖ホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（１８量体）である。
【0088】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩ阻害剤である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩと、ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ－１及び／又はＴＧＦβ－２との相互作用を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩと、別のＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩとの相互作用を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩを標的とする（例えば、特異的に結合する）。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩ、より具体的にはＴβＲＩＩに結合する抗体、特にヒト及び／又はモノクローナル抗体である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、抗体ＬＹ３０２２８５９（ＩＭＣ－ＴＲ１としても知られる）（例えば、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０，１６，１１９１－２０５；Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１７，７９，６７３－６８０（両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。
【0089】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩ、より具体的にはＴβＲＩ及び／又はＴβＲＩＩ、最も具体的にはＴβＲＩの機能、特に酵素的機能、最も具体的にはキナーゼ機能を阻害する。一態様において、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は小分子である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、キナーゼ阻害剤、特にＴＧＦβ受容体キナーゼ阻害剤である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９としても知られる）（例えば、Ｆａｉｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１７，３４，４０７０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。ガルニセルチブの構造、ＩＵＰＡＣ名、ＣＡＳ番号を以下に示す。
［ＩＵＰＡＣ名：４－（５，６－ジヒドロ－２－（６－メチル－２－ピリジニル）－４Ｈ－ピロロ（１，２－ｂ）ピラゾール－３－イル）－６－キノリンカルボキサミド；ＣＡＳ番号：７００８７４－７２］
【0090】
別の態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、バクトセルチブ（ＴＥＷ－７１９７としても知られる）である（例えば、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１４，２２，４２１３－３８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。バクトセルチブの構造、ＩＵＰＡＣ名及びＣＡＳ番号を以下に示す。
［ＩＵＰＡＣ名：２－フルオロ－Ｎ－［［５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］アニリン；ＣＡＳ番号：１３５２６０８－８２－２］
【0091】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβリガンドトラップである。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ（共）受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩの可溶性形態である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩの細胞外ドメインの一部、特に（その一部）を含む。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及び／又はＴβＲＩＩＩの細胞外ドメインの一部、特に（その一部）を含み、更なるタンパク質ドメイン、特にＦｃドメイン、より具体的にはヒト及び／又はＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合タンパク質である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン（の一部）とＦｃドメイン（例えば、Ｍｕｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ２００２，１０９，１５５１－１５５９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）とを含む融合タンパク質である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴβＲＩＩＩ（ベータグリカン）の細胞外ドメイン（の一部）及び（ヒト）Ｆｃドメイン（例えば、Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２，６２，４６９０－４６９５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）を含む融合タンパク質である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、２つ以上のＴＧＦβ受容体、特にＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩのうち２つ以上の細胞外ドメインの一部、特に（その一部）を含む融合タンパク質である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメインの一部、特に（その一部）と、ＴβＲＩＩＩの細胞外ドメインの一部、特に（その一部）とを含む融合タンパク質である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、融合タンパク質ＲＥＲ（ＴβＲＩＩＩの単一の細胞外ドメイン及びＴβＲＩＩの２つの細胞外ドメインを含む；例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６，７，８６０８７－８６１０２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。
【0092】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、インテグリン、特にインテグリンαｖβ６阻害剤である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与するインテグリン、特にインテグリンαｖβ６を標的とする（例えば、特異的に結合する）。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与するインテグリン、特にインテグリンαｖβ６に結合する抗体、特にヒト及び／又はモノクローナル抗体である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、抗体２６４ＲＡＤ（例えば、Ｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１３，３２，４４０６－４４１６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）である。
【0093】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、脱ユビキチン化酵素、特にＵＳＰ４及び／又はＵＳＰ１５阻害剤である。
【0094】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤタンパク質、特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４阻害剤である。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤタンパク質、特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４と、別のＳＭＡＤタンパク質、特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４との相互作用を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤタンパク質、特にＳＭＡＤ２、３及び／又は４とＤＮＡとの相互作用を阻害する。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤ相互作用ペプチドアプタマーである。ＳＭＡＤ相互作用ペプチドアプタマーは、例えばＣｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４，３８６４－３８７４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、細胞透過性ペプチドである。ＳＭＡＤ３を選択的に標的とする細胞透過性ペプチドが、例えば、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１７，１２７，２５４１－２５５４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
【0095】
一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与するタンパク質、例えば対応する天然タンパク質と比較してアミノ酸の欠失／置換／付加、又はドメインの欠失／置換／付加を有するタンパク質の改変型である。一態様では、そのような修飾タンパク質は、対応する天然タンパク質と比較して、機能が低下又は逆転している（例えば、拮抗的ではなく作動的、又はその逆）。一態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβの修飾型（例えば、変異体ＴＧＦβ）、特にアンタゴニスト機能を有するＴＧＦβの修飾型である。
【0096】
当業者に知られるであろう他のＴＧＦβシグナル伝達阻害剤も、本発明における使用が検討されている。
【0097】
「がん」という用語は、制御されていない細胞増殖を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的症状を指す。がんの例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例には、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の非扁平上皮がん及び扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（胃腸がんを含む）、膵臓がん（転移性膵臓がんを含む）、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん（局所進行性、再発性又は転移性のＨＥＲ－２陰性乳がん、及び局所再発性又は転移性のＨＥＲ２陽性乳がんを含む）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓癌腫及び様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに脂肪腫症、浮腫（脳腫瘍に関連するもの等）、及びメグズ症候群に関連する異常な血管増殖が含まれる。
【0098】
本発明のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、及びキットのいくつかの態様では、がんは、固形腫瘍がんである。「固形腫瘍がん」とは、（例えば、一般的には固形腫瘍を形成しない白血病等の血液がんとは対照的に）肉腫又は癌腫等の患者の体の特定の位置に位置する別個の腫瘍塊（腫瘍転移も含む）を形成する悪性腫瘍を意味する。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、扁平細胞癌腫、骨がん、肝臓がん及び腎臓がんが含まれる。本発明の文脈で企図される他の固形腫瘍がんには、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、筋肉、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん症状又は病変及びがん転移も含まれる。
【0099】
いくつかの態様では、がんは、ＣＥＡ陽性がんである。「ＣＥＡ陽性がん」又は「ＣＥＡ発現がん」とは、がん細胞でのＣＥＡの発現又は過剰発現により特徴づけられるがんを意味する。ＣＥＡの発現は、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はフローサイトメトリー法によって決定され得る。一態様では、がんはＣＥＡを発現する。一態様では、がんは、ＣＥＡに特異的な抗体を使用する免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定されるように、腫瘍細胞の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％又は少なくとも８０％でＣＥＡを発現する。
【0100】
いくつかの態様では、患者におけるがん細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ＩＨＣ又はフローサイトメトリー法によって決定され得る。
【0101】
いくつかの態様では、がんは、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、前立腺がん、又は本明細書に記載の他のがんである。
【0102】
特定の態様では、がんは、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、及び胃がんからなる群より選択されるがんである。好ましい態様では、がんは結腸直腸がん（ＣＲＣ）である。一態様では、結腸直腸がんは、転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）である。一態様では、結腸直腸がんは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）結腸直腸がんである。一態様では、結腸直腸がんは、マイクロサテライト安定性転移性結腸直腸がん（ＭＳＳ ｍＣＲＣ）である。
【0103】
本明細書における「患者」、「対象」又は「個体」は、がんの１つ以上の徴候、症候、又は他の指標を経験しているか又は経験したことがある、治療に適格な任意の単一のヒト対象である。いくつかの態様では、患者は、がんを有するか、又はがんを有すると診断されている。いくつかの態様では、患者は、局所進行若しくは転移性がんを有するか、又は局所進行若しくは転移性がんを有すると診断されている。患者は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体又は別の薬物で以前に治療されていても、治療されていなくてもよい。特定の態様では、患者は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体で以前に治療されていない。患者は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体療法が開始される前に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体以外の１つ以上の薬物を含む療法で治療されていてもよい。
【0104】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される個体における疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、限定されるものではないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられる。
【0105】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、有効量で投与される。
【0106】
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
【0107】
一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、特にがんの部位（例えば、固形腫瘍がん内）で、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の活性化をもたらす。当該活性化は、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の分化、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌、Ｔ細胞からの細胞傷害性エフェクター分子放出、Ｔ細胞の細胞傷害性活動、及びＴ細胞による活性化マーカーの発現を含み得る。一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、がんの部位（例えば、固形腫瘍がん内）で、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の数の増加をもたらす。
【0108】
上記及び本明細書に記載されるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用又はキットのいくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤による治療又は投与は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独による治療又は投与と比較して、Ｔ細胞、特にＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞の増殖の増大を、特にがんの部位においてもたらす。上記及び本明細書に記載されるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用又はキットのいくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤による治療又は投与は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独による治療又は投与と比較して、Ｔ細胞、特にＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の増大を、特にがんの部位においてもたらす。特定の態様では、活性化は、活性化マーカー（ＣＤ２５及び／又はＣＤ６９等）の発現、Ｔ細胞の細胞傷害活性（特にがん細胞の溶解）及び／又はＴ細胞によるサイトカイン（具体的には、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α及び／又はインターフェロン－γ）分泌を含む。上記及び本明細書に記載されるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用又はキットのいくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤による治療又は投与は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独による治療又は投与と比較して、Ｔ細胞、特にＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞による細胞溶解性分子（例えば、グランザイム及び／又はパーフォリン）の発現の増大を、特にがんの部位においてもたらす。
【0109】
上記又は本明細書のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、又はキットのいくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβ阻害剤の治療又は投与は、個体における応答をもたらし得る。いくつかの態様では、応答は、完全奏功であり得る。いくつかの態様では、応答は、治療の中止後の持続的応答であり得る。いくつかの態様では、応答は、治療の中止後に持続される完全奏功であり得る。他の態様では、応答は、部分奏功であり得る。いくつかの態様では、応答は、治療の中止後に持続される部分奏功であり得る。いくつかの態様では、応答は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独（すなわち、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤不使用）の治療又は投与と比較して改善され得る。
【0110】
いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβ阻害剤の治療又は投与は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独（すなわち、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤不使用）で治療された対応する患者集団と比較して、患者集団の奏効率を増加させ得る。
【0111】
本発明の併用療法は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の投与を含む。
【0112】
本明細書で使用される場合、「組み合わせ（併用）」（及びその文法的変化形、例えば「組み合わせる」又は「組み合わせること」）は、本発明によるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体とＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の組み合わせを包含し、ここで、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が同時に体内で生物学的効果を発揮することができることを条件として、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、同じ又は異なる容器に入っており、同じ又は異なる薬学的調合物に入っており、一緒に又は別々に投与され、同時に又は連続して、任意の順序で投与され、同じ又は異なる経路によって投与される。例えば、本発明によるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体とＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を「組み合わせること」は、特定の薬学的調合物中のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を初めに投与し、続いて、別の薬学的調合物中のＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を投与すること、又はその逆を意味し得る。
【0113】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、当該技術分野で知られる任意の適切なやり方で投与され得る。一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、連続して（異なる時間に）投与される。別の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、同時に（同じ時間に）投与される。理論に縛られることを望むものではないが、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤をＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体より前に及び／又はそれと同時に投与することが有利であり得る。いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤とは別個の組成物に入っている。いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤と同じ組成物に入っている。
【0114】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、任意の適切な経路で投与されてよく、同じ投与経路によって又は異なる投与経路によって投与されてもよい。いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、又は鼻腔内で投与される。特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、静脈内で投与される。いくつかの態様では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、又は鼻腔内で投与される。有効量のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が、疾患の予防又は治療のために投与され得る。治療される疾患の種類、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の種類、疾患の重症度及び経過、個体の臨床症状、個体の病歴及び治療への応答、並びに主治医の裁量に基づいて、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及び／又はＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の適切な投与経路又は投与量が決定され得る。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが企図される。ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【0115】
本発明の組み合わせは、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の組み合わせは、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。特定の態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、化学療法剤、腫瘍細胞増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞アポトーシスのアクチベーターである。特定の態様では、追加の治療剤は、アテゾリズマブ等のＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストである。
【0116】
上記又は本明細書中のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、又はキットのいくつかの態様では、治療は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアテゾリズマブの投与を更に含む。
【0117】
本発明の組み合わせは、放射線療法と組み合わせることもできる。
【0118】
本明細書で提供されるキットは、典型的には、１つ以上の容器と、容器上若しくは容器に関連するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物単独で、又は症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は、本発明の組み合わせに使用されるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体である。別の活性剤は、本発明の組み合わせに使用されるＴＧＦβシグナル伝達阻害剤であり、これは、二重特異性抗体のように同じ組成物及び容器に入っていてもよく、又は異なる組成物及び容器で提供されていてもよい。ラベル又は添付文書は、本組成物（複数可）ががん等の選択された症状を治療するために使用されることを示す。
【0119】
一態様では、本発明は、同じ又は別個の容器に（ａ）ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、及び（ｂ）ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含み、任意に（ｃ）がんを治療するための方法としての組み合わせ治療の使用を指示する印刷された指示書を含む添付文書を更に含む、がんの治療を目的とするキットを提供する。さらに、キットは、（ａ）中に組成物が含有されている第１の容器であって、組成物がＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が含有されている第２の容器であって、組成物がＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む、第２の容器と、任意に、（ｃ）中に組成物が含有されている第３の容器であって、組成物が細胞傷害性薬剤あるいは治療剤を更に含む、第３の容器とを含み得る。一態様では、更なる治療剤は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアテゾリズマブである。本発明のこれらの態様におけるキットは、組成物ががんを治療するために使用することができることを示す添付文書を更に含み得る。代替的又は追加的に、本キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第３（又は第４）の容器を更に含んでもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0120】
【図1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシビサタマブ（ＣＥＡ－ＴＣＢ）免疫療法に対するＴＧＦβの効果。（Ａ）組換えＴＧＦβの存在下又は非存在下で、事前活性化ＣＤ８ Ｔ細胞との１２日間の共培養中にシビサタマブ又はＤＰ４７－ＴＣＢで処理した、細胞表面ＣＥＡ発現レベルが高い３つの患者由来結腸直腸がんオルガノイド株（ＰＤＯ）の成長曲線。（Ｂ）２つのＰＤＯ株を使用し、ＣＤ８ Ｔ細胞の代わりにＣＤ４ Ｔ細胞を使用したことを除いて、（Ａ）と同じ。（Ｃ）２つのＰＤＯ株を使用し、事前活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の代わりにｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞を使用したことを除いて、（Ａ）と同じ。全ての実験を３回実施し、示される結果は平均値である。
【図2】（Ａ）事前活性化Ｔ細胞を用いた１２日目のＰＤＯ成長の定量。（Ｂ）ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞を用いた１２日目のＰＤＯ成長の定量。エラーバーは、３回の反復から計算された１つの標準偏差を表す。
【図3】ＣＤ８ Ｔ細胞のグランザイム発現及び増殖に対するＴＧＦβの効果。（Ａ）ＰＤＯを発現する高細胞表面ＣＥＡとの８日間の共培養後にフローサイトメトリーによって測定したｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞におけるグランザイム発現。（Ｂ）ＰＤＯを発現する高細胞表面ＣＥＡとの８日間の共培養後にフローサイトメトリーによって評価した、ＤＰ４７－ＴＣＢ又はシビサタマブのいずれかで処理したｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖。（Ｃ）共培養物を組換えＴＧＦβで処理したことを除いて、（Ｂ）と同じ。
【図4】ＴＧＦβ阻害剤ガルニセルチブによるシビサタマブ活性に対するＴＧＦβ阻害効果の逆転。組換えＴＧＦβ並びにガルニセルチブの存在下又は非存在下で、ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞との１２日間の共培養中にシビサタマブ又はＤＰ４７－ＴＣＢで処理した、細胞表面ＣＥＡ発現レベルが高い２つの患者由来結腸直腸がんオルガノイド株（ＰＤＯ）の成長曲線。
【実施例】
【0121】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を考慮すると、種々の他の態様が実施されてもよいことが理解される。
【0122】
実施例１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシビサタマブ（ＣＥＡ－ＴＣＢ）免疫療法に対するＴＧＦβの効果。
細胞表面ＣＥＡ発現レベルが高い３つの患者由来結腸直腸がんオルガノイド株（ＰＤＯ）を、２：１のエフェクター：標的比での同種ＣＤ８ Ｔ細胞との１２日間の共培養中に、組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下のいずれかで、シビサタマブ（２０ｎＭ）又は対応する非標的対照抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ（ＶＨ領域及びＶＬ領域についてはそれぞれ配列番号２１及び２２を参照）（２０ｎＭ）で処理した（図１Ａ）。核ＧＦＰ標識オルガノイド細胞の成長を蛍光顕微鏡法によってモニターした。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抽出し、続いてＩＬ－２及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することによって、ＣＤ８ Ｔ細胞を同種異系の健康なドナーから生成した。ＣＤ８ Ｔ細胞及びＰＤＯ＋／－ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）を一緒に７２時間プレインキュベートした後、シビサタマブ又はＤＰ４７－ＴＣＢを添加した。
細胞表面ＣＥＡ発現レベルが高い３つの患者由来結腸直腸がんオルガノイド株（ＰＤＯ）を、２：１のエフェクター：標的比での同種ＣＤ８ Ｔ細胞との１２日間の共培養中に、組換えＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下のいずれかで、シビサタマブ（２０ｎＭ）又は対応する非標的対照抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ（ＶＨ領域及びＶＬ領域についてはそれぞれ配列番号２１及び２２を参照）（２０ｎＭ）で処理した（図１Ａ）。核ＧＦＰ標識オルガノイド細胞の成長を蛍光顕微鏡法によってモニターした。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抽出し、続いてＩＬ－２及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することによって、ＣＤ８ Ｔ細胞を同種異系の健康なドナーから生成した。ＣＤ８ Ｔ細胞及びＰＤＯ＋／－ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）を一緒に７２時間プレインキュベートした後、シビサタマブ又はＤＰ４７－ＴＣＢを添加した。
【0123】
ＣＤ８ Ｔ細胞の代わりに２つのＰＤＯ株及びＣＤ４ Ｔ細胞を使用して同じ実験を繰り返した（図１Ｂ）。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を同種異系健常ドナーＰＢＭＣから単離し、上記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。
【0124】
ＴＧＦβは、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞の両方に対するシビサタマブの有効性を損ない、高い抗原発現を有する標的細胞を使用した場合でも強力な免疫抑制活性を実証した。
【0125】
初期スクリーニングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、予め活性化したＣＤ８ Ｔ細胞を用いて生成した。腫瘍に関与するＴ細胞の多くはナイーブ状態であり得るので、本発明者らはまた、健康なドナー血液試料からｅｘ ｖｉｖｏで抽出されたＣＤ８ Ｔ細胞に対する影響を試験した。ＴＧＦβの効果は、活性化Ｔ細胞及びｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞に対して同様であった（図１Ｃ）。
【0126】
実施例２．１２日目のＰＤＯ成長の定量。
ＤＰ４７－ＴＣＢ処理ＰＤＯに対するシビサタマブ処理ＰＤＯの成長を計算するために、０日目から１２日目までの増殖の倍数変化を計算し、１を引いた。次いで、シビサタマブ処理ＰＤＯの倍数変化をＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の倍数変化で除し、百分率に変換した。これにより、ＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の０日目から１２日目までの成長が１００％に正規化される。
ＤＰ４７－ＴＣＢ処理ＰＤＯに対するシビサタマブ処理ＰＤＯの成長を計算するために、０日目から１２日目までの増殖の倍数変化を計算し、１を引いた。次いで、シビサタマブ処理ＰＤＯの倍数変化をＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の倍数変化で除し、百分率に変換した。これにより、ＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の０日目から１２日目までの成長が１００％に正規化される。
【0127】
予想されるように、シビサタマブによる処理は、ＤＰ４７－ＴＣＢ処理（対照）ＰＤＯと比較してＰＤＯの成長を減少させた。しかしながら、ＴＧＦβの添加により、この成長阻害はＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４ Ｔ細胞の両方の存在下で減少し、すなわち、ＴＧＦβは、ＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４ Ｔ細胞の両方について、シビサタマブ単独で処理したＰＤＯと比較して、シビサタマブ処理ＰＤＯの成長を増加させた（図２）。
【0128】
ＰＤＯと８日間共培養したＣＤ８ Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析により、ＴＧＦβがＣＥＡ－ＴＣＢ処理中にＴ細胞グランザイム発現を強く低下させ（図３Ａ）、Ｔ細胞の増殖も（図３Ｂ、図３Ｃ）低下させることが確認された。したがって、ＴＧＦβは、増殖及びエフェクター機能を遮断することによって、シビサタマブ媒介性腫瘍制御を強力に抑制する。
【0129】
実施例３．シビサタマブとＴＧＦβ阻害剤の併用療法
併用療法がシビサタマブの有効性に対するＴＧＦβの効果にどのように対抗し得るかを調べた。
併用療法がシビサタマブの有効性に対するＴＧＦβの効果にどのように対抗し得るかを調べた。
【0130】
高いＣＥＡレベルを安定的に発現するＰＤＯを、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での２Ｄ共培養において健康なドナーＰＢＭＣから単離されたｅｘ ｖｉｖｏ同種ＣＤ８ Ｔ細胞と組み合わせた。ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共にＴ細胞をプレインキュベートした後、ＴＧＦβ阻害剤ガルニセルチブを用いて又は用いずにＤＰ４７又はシビサタマブ処理のいずれかを加えた。
【0131】
ＧＦＰ ＰＤＯの増殖は、蛍光顕微鏡でコンフルエンシーの変化をモニタリングすることによって追跡し、併用療法の有効性は、単剤療法及び併用療法条件からの成長の減少を比較することによって評価した。
【0132】
ガルニセルチブは、ＣＤ８ Ｔ細胞及びシビサタマブと共培養した２つのＰＤＯモデルにおいてＴＧＦβ効果を強く低下させた（図４）。
【0133】
実施例４．材料及び方法
患者由来オルガノイドの生成
ＣＲＣ－０１由来のＰＤＯ培養物を、粗細断によってコア生検から直接確立し、続いて成長因子還元マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に包埋した。ＣＲＣ－０５及びＣＲＣ－０７から非常に小さい生検断片が入手可能であり、これらを初めに、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｕｍｏｕｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｕｎｉｔ（Ｈｏｍｅ ｏｆｆｉｃｅ ｌｉｃｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ ＰＤ４９８ＦＦ８Ｄ）によって、メスＣＤ１ヌードマウスの皮下又は腎臓被膜下に移植した。腫瘍が成長すると、マウスを選別し、腫瘍を取り出し、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｇｅｎｔｌｅＭＡＸ Ｏｃｔｏ解離器で解離させた。Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してマウス細胞を磁気的に除去し、精製したヒト腫瘍細胞を成長因子還元マトリゲル中に包埋した。１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン、１０ｍＭニコチンアミド、１０μＭ ＳＢ２０２１９０、１０ｎＭガストリン、１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭプロスタグランジンＥ２、５００ｎＭ Ａ－８３－０１、１００ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｍｅｒｃｋ）、１μｇ／ｍｌ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ、及び１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して、ＰＤＯを記載されるようにマトリゲル内で拡大させた（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１；１４１（５）：１７６２－７２）。マトリゲルマトリックス中で少なくとも２ケ月継続的に成長させた後（最低１２継代）、ＰＤＯを初めにｅＧＦＰタグ付けし（以下を参照）、その後、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２％Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有する１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で成長するように適合させた。ＰＤＯ培養物を、これらの条件で維持し、Ｔ細胞共培養アッセイ及びＦＡＣＳ分析の必要に応じて使用した。各ＰＤＯ株で結腸がんドライバー遺伝子の遺伝子分析を実施し、これらは、一致した腫瘍生検で同定された変異と同一であった。
患者由来オルガノイドの生成
ＣＲＣ－０１由来のＰＤＯ培養物を、粗細断によってコア生検から直接確立し、続いて成長因子還元マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に包埋した。ＣＲＣ－０５及びＣＲＣ－０７から非常に小さい生検断片が入手可能であり、これらを初めに、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｕｍｏｕｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｕｎｉｔ（Ｈｏｍｅ ｏｆｆｉｃｅ ｌｉｃｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ ＰＤ４９８ＦＦ８Ｄ）によって、メスＣＤ１ヌードマウスの皮下又は腎臓被膜下に移植した。腫瘍が成長すると、マウスを選別し、腫瘍を取り出し、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｇｅｎｔｌｅＭＡＸ Ｏｃｔｏ解離器で解離させた。Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してマウス細胞を磁気的に除去し、精製したヒト腫瘍細胞を成長因子還元マトリゲル中に包埋した。１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン、１０ｍＭニコチンアミド、１０μＭ ＳＢ２０２１９０、１０ｎＭガストリン、１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭプロスタグランジンＥ２、５００ｎＭ Ａ－８３－０１、１００ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｍｅｒｃｋ）、１μｇ／ｍｌ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ、及び１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して、ＰＤＯを記載されるようにマトリゲル内で拡大させた（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１；１４１（５）：１７６２－７２）。マトリゲルマトリックス中で少なくとも２ケ月継続的に成長させた後（最低１２継代）、ＰＤＯを初めにｅＧＦＰタグ付けし（以下を参照）、その後、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２％Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有する１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で成長するように適合させた。ＰＤＯ培養物を、これらの条件で維持し、Ｔ細胞共培養アッセイ及びＦＡＣＳ分析の必要に応じて使用した。各ＰＤＯ株で結腸がんドライバー遺伝子の遺伝子分析を実施し、これらは、一致した腫瘍生検で同定された変異と同一であった。
【0134】
核ｅＧＦＰでのＰＤＯの標識
ＧＦＰタグ付けヒストン２Ｂコンストラクト（ｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ）（Ｂｅｒｏｎｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｌ；１６（７）：８２１－７）を導入することによりＰＤＯの核を標識し、自動顕微鏡による細胞の定量を可能にした。ウイルス生成のために、１０％ＦＢＳ、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ中でＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を培養した。ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、９μｇのｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ、２．２５μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２６０；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２６０；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２６０から贈与）、及び０．７５ｕｇのｐＭＤ２．Ｇエンベローププラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ １２２５９；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５９；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２５９から贈与）を含有するプラスミド混合物を一晩トランスフェクションすることにより、レンチウイルス粒子を生成した。翌日、細胞の培地を交換し、２４時間後にウイルスを採取し、使用前に０．４５μＭフィルタに通した。レンチウイルス導入のために、マトリゲル中の培養物からＰＤＯを採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一の細胞に解離し、ペレット成形した。ウイルス及び１ｎＭ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した培地にペレットを再懸濁し、３００×ｇで１時間遠心分離した。培地を交換する前に、試料を再懸濁し、６時間から一晩の間、培養液に播種した。回収及び拡大の後、ｅＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによってソートし、使用前に更に拡大させた。
ＧＦＰタグ付けヒストン２Ｂコンストラクト（ｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ）（Ｂｅｒｏｎｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｌ；１６（７）：８２１－７）を導入することによりＰＤＯの核を標識し、自動顕微鏡による細胞の定量を可能にした。ウイルス生成のために、１０％ＦＢＳ、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ中でＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を培養した。ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、９μｇのｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ、２．２５μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２６０；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２６０；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２６０から贈与）、及び０．７５ｕｇのｐＭＤ２．Ｇエンベローププラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ １２２５９；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５９；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２５９から贈与）を含有するプラスミド混合物を一晩トランスフェクションすることにより、レンチウイルス粒子を生成した。翌日、細胞の培地を交換し、２４時間後にウイルスを採取し、使用前に０．４５μＭフィルタに通した。レンチウイルス導入のために、マトリゲル中の培養物からＰＤＯを採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一の細胞に解離し、ペレット成形した。ウイルス及び１ｎＭ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した培地にペレットを再懸濁し、３００×ｇで１時間遠心分離した。培地を交換する前に、試料を再懸濁し、６時間から一晩の間、培養液に播種した。回収及び拡大の後、ｅＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによってソートし、使用前に更に拡大させた。
【0135】
末梢血単核細胞からのＣＤ８／ＣＤ４ Ｔ細胞の単離及び増殖
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のプロトコルに従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いてバフィーコートから単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＦｌｏｗＣｏｍｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＭＣから単離した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ Ｃｅｌｌキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＰＢＭＣからＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を単離した。ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＣＤ８、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって評価し、少なくとも９０％のＣＤ８又はＣＤ４陽性細胞を有する集団のみをｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞として実験で直接使用するか、又は予め活性化したＴ細胞を生成するための製造業者のプロトコルに従って、１０％ＦＢＳ（Ｌａｂｔｅｃｈ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位ペニシリン／ストレプトマイシン及び３０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて拡大させるために使用した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のプロトコルに従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いてバフィーコートから単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＦｌｏｗＣｏｍｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＭＣから単離した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ Ｃｅｌｌキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＰＢＭＣからＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を単離した。ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＣＤ８、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって評価し、少なくとも９０％のＣＤ８又はＣＤ４陽性細胞を有する集団のみをｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞として実験で直接使用するか、又は予め活性化したＴ細胞を生成するための製造業者のプロトコルに従って、１０％ＦＢＳ（Ｌａｂｔｅｃｈ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位ペニシリン／ストレプトマイシン及び３０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて拡大させるために使用した。
【0136】
ＴＧＦβで処理したＰＤＯ及びＣＤ８／ＣＤ４ Ｔ細胞の共培養
ＴｒｙｐＬＥ ＥｘｐｒｅｓｓでＰＤＯを採取し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で中和した。細胞を７０μｍフィルタを通してフィルタにかけ、計数し、１０％ＦＢＳ（Ｌａｂｔｅｃｈ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ及び１００単位ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。－４日目に、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）のウェルあたり５０００個の腫瘍細胞を播種した。－３日目に、予め活性化されたＣＤ８又はＣＤ４ Ｔ細胞を、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の有無にかかわらず、２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。ＴＧＦβを含む又は含まない７２時間のプレインキュベーション後、０日目に、ウェルを２０ｎＭのシビサタマブ又は２０ｎＭの非標的化陰性対照抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ（両方ともＲｏｃｈｅによって提供される）で処理した。ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞実験のために、Ｔ細胞をＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）と７２時間プレインキュベートした後、０日目にＤＰ４７－ＴＣＢ又はシビサタマブ＋／－ＴＧＦβと共にエフェクター：標的比１：１で腫瘍細胞に添加した。腫瘍細胞のみも対照として含めた。全ての条件を３連でプレーティングした。
ＴｒｙｐＬＥ ＥｘｐｒｅｓｓでＰＤＯを採取し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で中和した。細胞を７０μｍフィルタを通してフィルタにかけ、計数し、１０％ＦＢＳ（Ｌａｂｔｅｃｈ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ及び１００単位ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。－４日目に、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）のウェルあたり５０００個の腫瘍細胞を播種した。－３日目に、予め活性化されたＣＤ８又はＣＤ４ Ｔ細胞を、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の有無にかかわらず、２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。ＴＧＦβを含む又は含まない７２時間のプレインキュベーション後、０日目に、ウェルを２０ｎＭのシビサタマブ又は２０ｎＭの非標的化陰性対照抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ（両方ともＲｏｃｈｅによって提供される）で処理した。ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞実験のために、Ｔ細胞をＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）と７２時間プレインキュベートした後、０日目にＤＰ４７－ＴＣＢ又はシビサタマブ＋／－ＴＧＦβと共にエフェクター：標的比１：１で腫瘍細胞に添加した。腫瘍細胞のみも対照として含めた。全ての条件を３連でプレーティングした。
【0137】
ＴＧＦβ阻害剤ガルニセルチブによるＰＤＯ及びＴ細胞共培養の処理
Ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞を上記のようにＰＢＭＣから単離し、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）と７２時間プレインキュベートした後、上記のように９６ウェルプレート中に５０００腫瘍細胞／ウェルの密度で２４時間前に播種した腫瘍細胞と組み合わせた（Ｅ：Ｔ １：１）。同日（０日目）に、共培養物を２０ｎＭのシビサタマブ又は２０ｎＭの非標的化陰性対照抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ＋／－ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋／－ガルニセルチブ（５μＭ又は１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）のいずれかで処理した。全ての条件を３連でプレーティングした。
Ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ８ Ｔ細胞を上記のようにＰＢＭＣから単離し、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）と７２時間プレインキュベートした後、上記のように９６ウェルプレート中に５０００腫瘍細胞／ウェルの密度で２４時間前に播種した腫瘍細胞と組み合わせた（Ｅ：Ｔ １：１）。同日（０日目）に、共培養物を２０ｎＭのシビサタマブ又は２０ｎＭの非標的化陰性対照抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ＋／－ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋／－ガルニセルチブ（５μＭ又は１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）のいずれかで処理した。全ての条件を３連でプレーティングした。
【0138】
免疫蛍光顕微鏡法によるがん細胞成長評価
Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＧＦＰコンフルエンスアプリケーションを使用して、１２日間の期間にわたってＧＦＰコンフルエンスを４８～９６時間毎に定量化した。ＧＦＰコンフルエンス分析は、共培養物中のＴ細胞を誤ってカウントすることなく、複数の時点にわたって、ＧＦＰ陽性ＰＤＯ細胞の成長を追跡することが可能であった。コンフルエンス分析は、更に、ＰＤＯ中心等のがん細胞密度の高い領域において不正確な結果をもたらした細胞核をカウントすることよりも優れていた。スフェロイド直径の測定に対するコンフルエンス分析の主な利点は、非常に変化しやすい形状を示すＰＤＯの成長でさえも追跡する能力である。おそらく成長培地の枯渇に起因するＰＤＯが成長遅延を示す前に、１０～１２日目に得られた読み取り値から成長減少率を計算した。成長低下率を計算するために、０日目から１２日目までの成長の倍数変化を計算し、１を引いた。次いで、シビサタマブ処理ＰＤＯの倍数変化をＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の倍数変化で除し、百分率に変換し、そのようにしてＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の０日目から１２日目までの成長を１００％に正規化した。
Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＧＦＰコンフルエンスアプリケーションを使用して、１２日間の期間にわたってＧＦＰコンフルエンスを４８～９６時間毎に定量化した。ＧＦＰコンフルエンス分析は、共培養物中のＴ細胞を誤ってカウントすることなく、複数の時点にわたって、ＧＦＰ陽性ＰＤＯ細胞の成長を追跡することが可能であった。コンフルエンス分析は、更に、ＰＤＯ中心等のがん細胞密度の高い領域において不正確な結果をもたらした細胞核をカウントすることよりも優れていた。スフェロイド直径の測定に対するコンフルエンス分析の主な利点は、非常に変化しやすい形状を示すＰＤＯの成長でさえも追跡する能力である。おそらく成長培地の枯渇に起因するＰＤＯが成長遅延を示す前に、１０～１２日目に得られた読み取り値から成長減少率を計算した。成長低下率を計算するために、０日目から１２日目までの成長の倍数変化を計算し、１を引いた。次いで、シビサタマブ処理ＰＤＯの倍数変化をＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の倍数変化で除し、百分率に変換し、そのようにしてＤＰ４７－ＴＣＢ処理対照の０日目から１２日目までの成長を１００％に正規化した。
【0139】
統計学的分析
標準偏差は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、１時点当たり３回の反復から計算した。
＊＊＊
標準偏差は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、１時点当たり３回の反復から計算した。
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【0140】
上述の発明は、理解を明確にする目的のために説明及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、これらの記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参考として明示的に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】