特表 2023-553697 グリピカン－３およびＴ細胞受容体を標的とする免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-25

(54)【発明の名称】グリピカン－３およびＴ細胞受容体を標的とする免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20231218BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231218BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231218BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231218BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231218BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231218BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61P35/00

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023536866

(86)(22)【出願日】2021-12-17

(85)【翻訳文提出日】2023-08-08

(86)【国際出願番号】 EP2021086559

(87)【国際公開番号】W WO2022129560

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/127,224

(32)【優先日】2020-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】20306633.7

(32)【優先日】2020-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505166225

【氏名又は名称】アブリンクス エン．ヴェー．

(71)【出願人】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル・ヤンセン

(72)【発明者】

【氏名】カルロ・ブトン

(72)【発明者】

【氏名】エヴリーヌ・ドンブレヒト

(72)【発明者】

【氏名】ブラム・ラウケンス

(72)【発明者】

【氏名】パオロ・ミオニ

(72)【発明者】

【氏名】リリー・パオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン・ペイプ

(72)【発明者】

【氏名】ピーター・ショット

(72)【発明者】

【氏名】ベネディクト・セルイス

(72)【発明者】

【氏名】アナ・ポーラ・ヴィンテム

(72)【発明者】

【氏名】ダイアン・ファン・フーリック

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本技術は、がんに罹っている対象を処置するための新規のタイプの薬物を提供することを目的とする。具体的には、本技術は、１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）がＴＣＲに結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤがＧＰＣ３に結合することを特徴とする少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドを提供する。本技術はまた、核酸、ベクターおよび組成物も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、
少なくとも３つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ）第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示し、第１のＩＳＶＤは、場合により、前記ポリペプチドのＮ末端に配置されている、
ポリペプチド。

【請求項2】

ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈する、
請求項１または２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなる、
請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、１０未満のアミノ酸、好ましくは６未満のアミノ酸からなるリンカーを介して互いに連結されており、リンカーは最も好ましくは５ＧＳリンカーである、
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、請求項６または７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤである、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を呈する、請求項９～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項９～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

ポリペプチドは、配列番号１と９０％を超える配列同一性を呈するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項15】

ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項16】

ＧＰＣ３と特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含む、ポリペプチド。

【請求項17】

少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。

【請求項18】

少なくとも１つのＩＳＶＤのアミノ酸配列は：
ａ）配列番号３と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号４と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、
請求項１６または１７に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、
請求項１６～１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、
少なくとも２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常ドメインに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｆ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｇ）第１のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むか、または
ｈ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、
ポリペプチド。

【請求項21】

ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｆ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｇ）第１のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｈ）第１のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
請求項２０に記載のポリペプチド。

【請求項22】

ａ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｂ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｃ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｄ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｅ）Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｆ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｇ）Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈するか、または
ｈ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈する、
請求項２０または２１に記載のポリペプチド。

【請求項23】

ａ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｂ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、
ｃ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、
ｄ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｅ）Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｆ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、
ｇ）Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなるか、または
ｈ）ＧＰＣ３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなる、
請求項２０～２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項24】

ポリペプチドは、配列番号１、４９～７２、および７８～８１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項２０～２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項25】

前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項１６～２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項26】

増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる低分子量タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項２５に記載のポリペプチド。

【請求項27】

増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載のポリペプチド。

【請求項28】

増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤである、請求項２７に記載のポリペプチド。

【請求項29】

ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。

【請求項30】

ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、請求項２８または２９に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を呈する、請求項２８～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項32】

前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項２８～３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項33】

請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

【請求項34】

請求項３３に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。

【請求項35】

請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、請求項３３に記載の核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ）請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、方法。

【請求項36】

請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチド、または請求項３３に記載の核酸を含む、組成物。

【請求項37】

少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

医薬としての使用のための、請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物。

【請求項39】

がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんの処置における使用のための、請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物。

【請求項40】

肝臓がんは肝細胞癌である、請求項３９に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【請求項41】

がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんを処置する方法であって、
医薬的に活性な量の、請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【請求項42】

肝臓がんは肝細胞癌である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

医薬の調製における、請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物の使用。

【請求項44】

がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんを処置するための医薬組成物の調製における、請求項１～３２のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物の使用。

【請求項45】

肝臓がんは肝細胞癌である、請求項４４に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

説明
１ 本技術の分野
本技術は、グリピカン－３（ＧＰＣ３）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を標的化するポリペプチドに関する。本技術はまた、ポリペプチドをコードする核酸分子および核酸を含むベクター、ならびにポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物にも関する。本技術はさらに、がん細胞または感染細胞のような異常細胞が関与する疾患に罹っている対象を処置する方法における使用のためのこれらの製品に関する。さらに、本技術は、これらの製品を生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

２ 技術背景
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、がん細胞、（特にウイルスに）感染した細胞、または、他の方法で損傷された細胞を死滅させるＴリンパ球である。Ｔリンパ球（Ｔ細胞とも呼ばれる）は、その細胞表面上に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ３受容体を発現する。αβ ＴＣＲ－ＣＤ３複合体（または「ＴＣＲ複合体」）は、異なる６種のＩ型１回貫通型膜貫通タンパク質：リガンド認識を担うＴＣＲヘテロ二量体を形成するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖、ならびに、非共有結合で会合したＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびζの各鎖で構成されるが、これらの鎖は、受容体活性化時にリン酸化されるチロシンである細胞質配列モチーフを保有し、多数のシグナル伝達成分を動員する（非特許文献１）。

【0003】

ヘテロ二量体Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のαおよびβの両鎖は、定常ドメインおよび可変ドメインとからなる。Ｔ細胞は、自己ＭＨＣ分子によって提示される同族ペプチドのＴＣＲ認識に際して活性化され、この場合、チロシンリン酸化ＣＤ３複合体によってシグナル伝達が開始され、その結果、Ｔ細胞増殖および分化がもたらされる。

【0004】

一方のアーム上に腫瘍認識部分を有し（標的結合アーム）、一方、分子の他方のアームがＴ細胞抗原に対する特異性を有する（エフェクター結合アーム）、多くの場合ＣＤ３であるが、二重特異性抗体が操作されてきた。こういった二重特異性抗体は、いわゆるＴ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）であるが、悪性細胞に対する患者の免疫応答を増強する多標的分子である。多重特異性抗体によるＴ細胞と腫瘍細胞の共会合により、Ｔ細胞と腫瘍細胞の間に細胞溶解性シナプスの形成がもたらされ、このことがＴ細胞の活性化を誘導し、腫瘍細胞死滅をもたらす。

【0005】

Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の大部分はＴ細胞上のＣＤ３複合体を標的とするが、αβ Ｔ細胞受容体の定常ドメインを標的とするいくつかの二重特異性バインダーが特許文献１に記載されている。

【0006】

グリピカン－３（ＧＰＣ３）は、ヘパラン硫酸ＧＡＧ鎖およびコアタンパク質からなるＧＰＩアンカー細胞表面糖タンパク質である。それは、細胞増殖および分化を制御して、胚形成および初期発生に関係あるとされてきた。ＧＰＣ３の発現は発生過程で高いが、正常な成人組織ではその発現はほぼ存在しないが、腎近位尿細管および気管支細胞においては中度の／低い発現がある。初期発生におけるその役割と一致して、高レベルのＧＰＣ３も胎盤で発現する。

【0007】

ＧＰＣ３は、Ｗｎｔ、ＨｈおよびＹＡＰの各経路を含めて、複数のシグナル伝達カスケードを介して初期発生を制御している可能性が高い。加えて、ＧＰＣ３は、ＦＧＦ２などの基本的な増殖因子と相互作用して細胞増殖を調節することができる。実験設定において、ＧＰＣ３の過剰発現により、ＦＧＦ２誘導性の細胞増殖を阻害することができる。対照的に、ＧＰＣ３はまた、阻害性増殖因子であるＢＭＰ７を負に調節する。まとめると、ＧＰＣ３の活性は、細胞増殖を阻害することができるだけではなく、肝臓のがんおよびその他の形態のがんの発癌を促進する可能性もあるので、高度に前後関係に左右される可能性がある。

【0008】

ＧＰＣ３の発現は、重要なアンメットニーズがある疾患、肝細胞癌（ＨＣＣ）由来の腫瘍組織でとりわけ広く見られる。可溶性ＧＰＣ３は、ＨＣＣ患者の血清中にも検出される場合もあり、異なる病因論がある肝疾患と区別するために使用されてきた。

【0009】

二重特異性抗体構築物が複数の様式で提唱されている。例えば、二重特異性抗体様式は、２つの抗体の化学的コンジュゲーションまたはそれらの断片を含んでいてもよい（非特許文献２；非特許文献３）。

【0010】

しかしながら、このような二重特異性抗体様式の不利益は、高分子量および高濃度での高い粘性を含み、それにより例えば皮下投与は難しくなり、特異的および高い親和性結合のために、各結合単位が２つの可変ドメインの相互作用を必要とするという点で、ポリペプチドの安定性および生産効率への影響を有する。このような二重特異性抗体様式はまた、劣った生産効率および低力価ならびに／または軽鎖の誤対合もしくは重鎖の誤対合に関するＣＭＣの問題を引き起こす可能性が潜在的にある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】ＷＯ２０１６／１８０９６９Ａ１

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｃａｌｌら、２００４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：１２９５～１３０５頁

【非特許文献2】Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５．２２９（４７０８）：８１～８３頁

【非特許文献3】Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８７．１３９（７）：２３６７～２３７５頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

したがって、細胞傷害性応答を誘導するのに十分な親和性で標的細胞とＴ細胞の両方に結合する抗体構築物のニーズがある。同時に、このような構築物は、非標的細胞に対して、すなわち標的抗原を発現しないかまたは低レベルでしか標的抗原を発現しない細胞に対して、細胞傷害性応答を誘導するものであってはならない。これにより、効能と安全性のバランスをとることができる。さらに、このような構築物が、例えば微生物宿主内で効率的に生成することができることが望ましい。このような構築物は、処置しようとする対象において、連続する処置間にうまく間隔をあけることができるように十分長い半減期を呈示することも理想的には必要である。さらに、このような構築物の反応性を、処置しようとする対象において、既存の抗体に限定することが望ましい（すなわち、抗体構築物での第１の処置の前に対象に存在する抗体）。さらに、ポリペプチドは、例えば、非標的細胞に対する細胞傷害活性によって引き起こされる、望ましくない副作用を全く発揮しないか、またはそれを最小限しか発揮しないことが求められる。

【課題を解決するための手段】

【0014】

３ 本発明の要約
本発明者らは、ＧＰＣ３およびＴＣＲを同時に特異的に標的とするポリペプチドが、インビトロでＧＰＣ３発現細胞の効率的なＴ細胞媒介性死滅をもたらすことを見出した。前記ポリペプチドは、効率的に生産することができた（例えば微生物宿主で）。さらに、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、既存の抗体（すなわち、抗体構築物での第１の処置の前に対象に存在する抗体）には限定的な反応性を呈することを示すことができた。好ましい実施形態において、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、連続する処置間にうまく間隔をあけることができるように十分長い半減期を呈示する。さらに、このようなポリペプチドは、ＧＰＣ３を全く発現しないかまたは低レベルのそれを発現する細胞に対しては限定的な活性のみを示した。このことは、ＧＰＣ３陽性がん標的細胞に対して高度に特異的なＴ細胞媒介性細胞傷害性応答を誘導できる可能性を示唆するが、一方、良好な安全性プロファイルを呈する。

【0015】

一態様において、ペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、少なくとも２つのＩＳＶＤがＧＰＣ３に特異的に結合し、１つのＩＳＶＤがＴ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する。好ましくは、ＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤはヒトＧＰＣ３に特異的に結合し、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤはヒトＴＣＲに特異的に結合する。より好ましくは、ＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、別個のＩＳＶＤである。別の態様において、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドは、好ましくは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、血清タンパク質に、好ましくはヒト血清アルブミンのようなヒト血清タンパク質に結合するＩＳＶＤであり得る。

【0016】

一態様において、本技術は、ＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。さらなる実施形態において、本技術のポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、２つのＩＳＶＤは、場合により、ペプチド性リンカーを介して連結されている。好ましくは、ＧＰＣ３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤは、別個のＩＳＶＤである。さらに、ポリペプチドは、好ましくは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、血清タンパク質に、好ましくはヒト血清アルブミンのようなヒト血清タンパク質に結合するＩＳＶＤであり得る。

【0017】

別の態様において、本技術のポリペプチドは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合するＩＳＶＤ、およびＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、２つのＩＳＶＤは場合によりペプチド性リンカーを介して連結されている。このようなポリペプチドを使用して、ＧＰＣ３を発現する細胞の死滅にＴ細胞を向けなおすことができる。理想的には、ＴＣＲに結合するＩＳＶＤは、例えばヒトＴ細胞に特異的に結合する前記ポリペプチドに含まれる唯一の結合部分である。さらに、実施例が示すところは、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤがそのようなポリペプチドのＮ末端に配置される場合、同じ抗ＴＣＲ ＩＳＶＤがＮ末端に配置されない場合と比較して、より良好なＴ細胞媒介性細胞傷害性が達成されること、である。したがって、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤからＮ末端に配置されることが好ましい。最も好ましくは、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤは、それを含むポリペプチドのＮ末端に配置される。さらに、ポリペプチドは、好ましくは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、血清タンパク質に、好ましくはヒト血清アルブミンのようなヒト血清タンパク質に結合するＩＳＶＤであり得る。

【0018】

ポリペプチドを発現することが可能な核酸分子、核酸または核酸を含むベクター、およびポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物も提供される。組成物は、好ましくは医薬組成物である。

【0019】

本明細書に開示されるようなポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む宿主細胞または（非ヒト）宿主も提供される。

【0020】

さらに、本明細書に開示されるようなポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ．好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ．本技術によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、方法が提供される。

【0021】

さらに、本技術は、医薬としての使用のための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくはベクターを含む組成物を提供する。好ましくは、ポリペプチドまたは組成物は、肝臓がんまたは肺がんのようながんの処置における使用のためのものである。

【0022】

加えて、がんを処置する方法であって、医薬的に活性な量の本開示によるポリペプチドまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。がんは、肝臓がんまたは肺がんから選択されることが好ましい。一部の実施形態において、本方法は、１種またはそれ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。

【0023】

さらに、がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんを処置するための医薬組成物の調製におけるポリペプチドまたは組成物の使用が提供される。

【0024】

特に、本技術は以下の実施形態を提供する：

【0025】

実施形態１．少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも３つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ） 第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示し、第１のＩＳＶＤは、場合により、前記ポリペプチドのＮ末端に配置されている、
ポリペプチド。

【0026】

実施形態２．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0027】

実施形態３．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈する、実施形態１または２のいずれかに記載のポリペプチド。

【0028】

実施形態４．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなる、実施形態１～３のいずれかに記載のポリペプチド。

【0029】

実施形態５．第１のＩＳＶＤおよび第２のＩＳＶＤは、１０未満のアミノ酸、好ましくは６未満のアミノ酸からなるリンカーを介して互いに連結されており、リンカーは最も好ましくは５ＧＳリンカーである、実施形態１～４のいずれかに記載のポリペプチド。

【0030】

実施形態６．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１～５のいずれかに記載のポリペプチド。

【0031】

実施形態７．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態６に記載のポリペプチド。

【0032】

実施形態８．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態６または７のいずれかに記載のポリペプチド。

【0033】

実施形態９．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤである、実施形態８に記載のポリペプチド。

【0034】

実施形態１０．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態９に記載のポリペプチド。

【0035】

実施形態１１．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態９または１０のいずれかに記載のポリペプチド。

【0036】

実施形態１２．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を呈する、実施形態９～１１のいずれかに記載のポリペプチド。

【0037】

実施形態１３．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列からなる、実施形態９～１２のいずれかに記載のポリペプチド。

【0038】

実施形態１４．ポリペプチドは、配列番号１と９０％を超える配列同一性を呈するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～１３のいずれかに記載のポリペプチド。

【0039】

実施形態１５．ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１～１４のいずれかに記載のポリペプチド。

【0040】

実施形態１６．少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含む、ポリペプチド。

【0041】

実施形態１７．少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含む、実施形態１６に記載のポリペプチド。

【0042】

実施形態１８．少なくとも１つのＩＳＶＤのアミノ酸配列は：
ａ）配列番号３と９０％を超える配列同一性、または
ｂ）配列番号４と９０％を超える配列同一性
を含む、実施形態１６または１７のいずれかに記載のポリペプチド。

【0043】

実施形態１９．前記少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、実施形態１６～１８のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態２０．少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｆ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｇ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むか、または
ｈ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、
ポリペプチド。

【0044】

実施形態２１．ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｆ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｇ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｈ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
実施形態２０に記載のポリペプチド。

【0045】

実施形態２２．ａ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｃ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｄ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｅ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｆ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｇ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える同一性を呈するか、または
ｈ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える同一性を呈する、
実施形態２０または２１のいずれかに記載のポリペプチド。

【0046】

実施形態２３．ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｆ）第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、
ｇ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなるか、または
ｈ）第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなる、実施形態２０～２２のいずれかに記載のポリペプチド。

【0047】

実施形態２４．ポリペプチドは、配列番号１、４９～７２、および７８～８１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態２０～２３のいずれかに記載のポリペプチド。

【0048】

実施形態２５．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１６～２４のいずれかに記載のポリペプチド。

【0049】

実施形態２６．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態２５に記載のポリペプチド。

【0050】

実施形態２７．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態２５～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0051】

実施形態２８．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態２７に記載のポリペプチド。

【0052】

実施形態２９．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態２８に記載のポリペプチド。

【0053】

実施形態３０．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態２８～２９のいずれかに記載のポリペプチド。

【0054】

実施形態３１．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を呈する、実施形態２８～３０のいずれかに記載のポリペプチド。

【0055】

実施形態３２．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列からなる、実施形態２８～３１のいずれかに記載のポリペプチド。

【0056】

実施形態３３．実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

【0057】

実施形態３４．実施形態３３に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。

【0058】

実施形態３５．実施形態１～３２のいずれかにに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、実施形態３３に記載の核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ）実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、方法。

【0059】

実施形態３６．少なくとも１つの実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３３に記載の核酸を含む組成物。

【0060】

実施形態３７．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態３６に記載の組成物。

【0061】

実施形態３８．医薬としての使用のための、実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３６もしくは３７に記載の組成物。

【0062】

実施形態３９．がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんの処置における使用のための、実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３６もしくは３７に記載の組成物。

【0063】

実施形態４０．肝臓がんは肝細胞癌（ＨＣＣ）である、実施形態３９に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0064】

実施形態４１．肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、好ましくは扁平上皮癌（ＳＣＣ）である、実施形態３９に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

【0065】

実施形態４２．がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんを処置する方法であって、医薬的に活性な量の、実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３６もしくは３７に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【0066】

実施形態４３．肝臓がんは肝細胞癌である、実施形態４２に記載の方法。

【0067】

実施形態４４．肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、好ましくは扁平上皮癌（ＳＣＣ）である、実施形態４２に記載の方法。

【0068】

実施形態４５．医薬の調製における、実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３６もしくは３７に記載の組成物の使用。

【0069】

実施形態４６．がん、好ましくは肝臓がんまたは肺がんを処置するための医薬組成物の調製における、実施形態１～３２のいずれかに記載の、好ましくは実施形態１～１５のいずれかに記載のポリペプチド、または実施形態３６もしくは３７に記載の組成物の使用。

【0070】

実施形態４７．肝臓がんは肝細胞癌である、実施形態４６に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

【0071】

実施形態４８．肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、好ましくは扁平上皮癌（ＳＣＣ）である、実施形態４６に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

【図面の簡単な説明】

【0072】

【図1】播種６０時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＩｎｃｕｃｙｔｅベースのヒトＴＤＣ（Ｔ細胞依存性細胞傷害性）ＨｅｐＧ２－Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける、三重特異性ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーＡ０２２６０００２７（図１Ａ）、Ａ０２２６０００３１（図１Ｂ実線）および参照Ａｂ１による構築物（図１Ｂ点線）の用量依存性死滅を示す図である。対照（左）は、（黒四角）化合物なし、および（黒三角）１００％死滅用のＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ １μＭ。

【図2】播種７２時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＩｎｃｕｃｙｔｅベースのヒトＴＤＣ ＨｅｐＧ２－Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅を示す図である。図は、三重特異性３価Ｔ細胞エンゲージャー様式が抗ＴＣＲ ＩＳＶＤと抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤの間のリンカー長さの点で異なる場合の様式最適化の工程１を表す。対照（左）は、化合物なし（白四角）および１００％死滅用の参照（白丸）である。

【図3】播種６０時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＩｎｃｕｃｙｔｅベースのヒトＴＤＣ ＨｅｐＧ２－Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅を示す図である。図は、三重特異性４価Ｔ細胞エンゲージャーの様式がバイパラトピックＧＰＣ３結合ＩＳＶＤの配置およびそれらの間のリンカー長さの点で異なる場合の、様式最適化の工程２を表す。対照（左）は、化合物なし（白四角）および１００％死滅用の参照（白丸）である。

【図4-1】ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの様式最適化の工程３を示す図である。抗ＴＣＲ ＩＳＶＤ Ｔ０１７０００６２４を、３価様式および４価様式のシーケンシングされた最適化バリアントＴＣＥ０１で置換した。播種６０時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＩｎｃｕｃｙｔｅベースのヒトＴＤＣ ＨｅｐＧ２－Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける（図４Ａ）、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのヒトＴＤＣ Ｈｕｈ７アッセイにおける（図４Ｂ）、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅。対照（左）は、化合物なし（白四角）および１００％死滅用の参照（白丸）である。

【図4-2】図４－１の続き。

【図5-1】播種６０時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＩｎｃｕｃｙｔｅベースのヒトＴＤＣ ＨｅｐＧ２－Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける（図５Ａ）、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのヒトＴＤＣ Ｈｕｈ７アッセイにおける（図５Ｂ）、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅を示す図である。抗ＴＣＲ ＩＳＶＤの配置を抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤと変更したか、または、抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤの配置を抗アルブミンＩＳＶＤと変更した場合の、ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの様式最適化の工程４が表されている。対照（左）は、化合物なし（白四角）および１００％死滅用の参照（白丸）である。

【図5-2】図５－１の続き。

【図6-1】播種６０時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＩｎｃｕｃｙｔｅベースのヒトＴＤＣ ＨｅｐＧ２－Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける（図６Ａ）、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのヒトＴＤＣ Ｈｕｈ７アッセイにおける（図６Ｂ）、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅を示す図である。リンカー長さを変動させる場合の、ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの様式最適化の工程５が表されている。対照（左）は、化合物なし（白四角）および１００％死滅用の参照（白丸）である。

【図6-2】図６－１の続き。

【図7-1】播種６０時間後に分析した、エフェクター対標的比１５：１を使用する、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのヒトＴＤＣ Ｈｕｈ７アッセイにおける、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの細胞傷害性に対する（図７Ａ）、ならびに、標的細胞（Ｈｕｈ７）の存在下（図７Ｂ）および非存在下（図７Ｃ）における三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーによるＴ細胞活性化に対する、可溶性ＧＰＣ３（ｓＧＰＣ３）の影響の評価を示す図である。対照（左）は、化合物なし（白丸、図７Ａ）およびアイソタイプ対照（白丸、図７ＢおよびＣ）である。

【図7-2】図７－１の続き。

【図8】３７℃で、０．５時間、３時間、２４時間および４８時間の時点で測定された、Ｔ細胞エンゲージャー内部移行（図８Ａ）およびＧＰＣ３発現（図８Ｂ）の時間経過を示す図である。対照（左）は、４℃での各化合物について０．５時間での測定値である。

【図9-1】エフェクター対標的比１５：１を使用する、ＧＰＣ３の低下する発現レベルを発現する様々な腫瘍細胞株に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのヒトＴＤＣアッセイにおける、三重特異性ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅を示す図である。６０時間で分析したＨｅｐＧ２（図９Ａ）、７５時間で分析したＮＣＩ－Ｈ６６１（図９Ｂ）、６０時間で分析したＨｕｈ－７（図９Ｃ）、６５時間で分析したＭＫＮ－４５（図９Ｄ）、６５時間で分析したＢｘＰＣ－３（図９Ｅ）、６０時間で分析した（図９Ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２９２。対照（左）は、（白四角）化合物なし（エフェクターおよびＴ細胞のみ）である。

【図9-2】図９－１の続き。

【図10-1】エフェクター対標的比１５：１を使用し６０時間で分析した、２つの腫瘍細胞株、ＮＣＩ－Ｈ６６１（図１０Ａ）およびＢｘＰＣ－３（図１０Ｂ）に対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのヒトＴＤＣアッセイにおける、選択された５つの三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤベースのＴ細胞エンゲージャーの用量依存性死滅を示す図である。対照（左）は、化合物なし（白四角、エフェクターおよびＴ細胞のみ）ならびに３０ｎＭでＴ０１７０００６９８である（白ひし形）。

【図10-2】図１０－１の続き。

【図11】４価（図１１Ａ）および３価（図１１Ｂ）の選択されたＩＳＶＤベースＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャー様式に対する９６の正常ヒト血清サンプルからの既存の抗体の反応性の中央値および四分位範囲を示す図である。

【図12】効能モデルの研究計画を示す図である。Ｈｕｈ－７腫瘍細胞をＮＯＧマウスに皮下注射した。腫瘍は、平均腫瘍体積およそ１５０ｍｍ^３に達するまで増殖した。この時点で、インビトロで増殖させたＴ細胞を各マウスに腹腔内で注射した（Ｄ０）。静脈内に注射されるＡ０２２６００４２４による処置は、Ｔ細胞注射の３時間後、０日目に開始し、３日目、６日目、９日目および１２日目（ｑ３ｄ）に継続した。Ａ０２２６００４２４の４つの用量レベル（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、および２ｍｇ／ｋｇ）を試験した。対照Ｔ０１７０００６９８を対照群に２ｍｇ／ｋｇで０日目、３日目、６日目、９日目および１２日目（ｑ３ｄ）に注射した。生存の血液サンプリングを、試験化合物の投与前の６日目および１２日目に行った。すべてのマウスを１５日目に殺処分し、血液サンプルおよび腫瘍サンプルを収集した。

【図13】効能モデルの結果を示す図である。Ａ０２２６００４２４の４つの用量レベル（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、および２ｍｇ／ｋｇ）を試験した。対照Ｔ０１７０００６９８を対照群に２ｍｇ／ｋｇで注射した。

【発明を実施するための形態】

【0073】

５ 本発明の詳細な説明
本技術は、肝臓がんおよび肺がんなどのがんを処置するための新規のタイプの薬物を提供することを目的とする。

【0074】

本発明者らは、ＧＰＣ３およびＴＣＲを同時に特異的に標的とするポリペプチドが、インビトロでＧＰＣ３発現細胞の効率的なＴ細胞媒介性死滅をもたらすことを見出した。前記ポリペプチドは、効率的に生産することができた（例えば微生物宿主で）。さらに、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、既存の抗体（すなわち、抗体構築物での第１の処置の前に対象に存在する抗体）には限定的な反応性を呈することを示すことができた。好ましい実施形態において、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、連続する処置間にうまく間隔をあけることができるように十分長い半減期を呈示する。さらに、このようなポリペプチドは、ＧＰＣ３を全く発現しないかまたは低レベルのそれを発現する細胞に対しては限定的な活性のみを示した。このことは、ＧＰＣ３陽性がん標的細胞に対して高度に特異的なＴ細胞媒介性細胞傷害性応答を誘導できる可能性を示唆する。

【0075】

上記とは別に、本明細書に開示されるＧＰＣ３結合ＩＳＶＤは、ヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３への高い親和性結合を提供し、したがって、ＧＰＣ３への結合が必要とされる他の用途に１価または多価の形態で容易に使用するができる。

【0076】

５．１ ポリペプチド
単一特異性１価ポリペプチド
一態様において、ポリペプチドは、単一特異性であり、１価である。

【0077】

用語「単一特異性」は、１種の（特異的な）タイプの標的分子に結合することを指す。したがって、単一特異性のポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する。

【0078】

用語「１価」は、分子、例えばＩＳＶＤを（特異的に）標的化する結合単位／ビルディングブロックが１つのみ存在することを示す。

【0079】

したがって、一態様において、本技術は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含むＧＰＣ３に、好ましくはヒトＧＰＣ３に特異的に結合する１つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性１価ポリペプチドを提供する。ＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３；または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤから選択することができる。

【0080】

好ましくは、ＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３；または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤから選択される。

【0081】

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、ＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤは：
ａ）配列番号３と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、ＩＳＶＤ；または
ｂ）配列番号４と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、ＩＳＶＤ、
から選択される。

【0082】

別の態様において、本技術は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含む、Ｔ細胞上のＴＣＲ、好ましくはヒトＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する１つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性１価ポリペプチドを提供する。ＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤであり得る。

【0083】

好ましくは、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むＩＳＶＤである。

【0084】

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＳＶＤであり、好ましくは、ＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0085】

これらの１価化合物は、多価および／または多重特異性ポリペプチドのビルディングブロックとしても機能する。

【0086】

ＩＳＶＤを含む（１価または多価）ポリペプチドのＮ末端に配置されるＩＳＶＤは、好ましくは、そのＮ末端にグルタミン酸（Ｅ）を呈しない。したがって、１位におけるグルタミン酸（Ｅ）が、典型的には、ポリペプチドのＮ末端に配置されるＩＳＶＤでは、アスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。したがって、例えば、配列番号３、４または５がポリペプチドのＮ末端に配置される場合、これらの配列は典型的にはＥ１Ｄ置換を呈することになる。逆に、配列番号２がＮ末端に配置されない場合、この配列は典型的にはＤ１Ｅ突然変異を呈することになる。したがって、一般的に、配列番号２～５の第１の位置は、これらの配列がＮ末端に配置されるか否かに応じて、Ｅの場合もありＤの場合もある。好ましい実施形態において、本技術のポリペプチドに含まれる第１のＩＳＶＤの第１のアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）である。

【0087】

単一特異性多価ポリペプチド
別の態様において、ポリペプチドは、単一特異性であり、少なくとも２価であるが、例えば、３価、４価、５価、６価などであってもよい。

【0088】

用語「２価」、「３価」、「４価」、「５価」、または「６価」は全て用語「多価」に該当し、それぞれ２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤの存在を示す。

【0089】

したがって、一態様において、本技術は、ＧＰＣ３に、好ましくはヒトＧＰＣ３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性２価ポリペプチドであって、
２つのＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、
２つのＩＳＶＤは、好ましくは、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
単一特異性２価ポリペプチドを提供する。

【0090】

好ましくは、単一特異性２価ポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

【0091】

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、第１および第２のＩＳＶＤは、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列からなり；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、第１および第２のＩＳＶＤは、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列からなり；
ｃ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、好ましくは、第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなるか；または
ｄ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、好ましくは、第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。

【0092】

これに関して、用語「第１のＩＳＶＤ」および「第２のＩＳＶＤ」は、ＧＰＣ３に結合する具体的に列挙されたＩＳＶＤの互いの相対的な位置のみを示し、番号付けは、ポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近い。それに応じて、「第２のＩＳＶＤ」はしたがって、「第１のＩＳＶＤ」よりＣ末端により近い。番号付けは、絶対ではなく、２つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すに過ぎないため、それぞれＧＰＣ３、ＴＣＲまたは血清アルブミンに結合する追加の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得る可能性を排除しない。さらにそれは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその間に配置され得る可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、セクション「多重特異性多価ポリペプチド」および５．４「（インビボでの）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、別のヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含んでいてもよく、これも「第１のＩＳＶＤ」と「第２のＩＳＶＤ」の間に配置されていてもよい（そのためこのような構築物は、後続のセクションで説明されるように多重特異性と称される）。

【0093】

好ましい実施形態において、単一特異性多価ポリペプチドの、特に上述した単一特異性２価ポリペプチドの（少なくとも２つの）ＩＳＶＤは、ペプチド性リンカーを介して連結されている。２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのペプチド性リンカーの使用は当業界において周知である。単一特異性多価ポリペプチドと共に、特に上述した単一特異性２価ポリペプチドと共に使用できる例示的なペプチド性リンカーは、表Ａ－５に示される。使用されることが多いペプチド性リンカーのクラスの一つは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号１００）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを呈し、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはそれより多くであり得る）などのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む。このようなＧＳリンカーの一部の使用されることが多い例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１０３）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）：３２５～３３０が参照される。一実施形態において、単一特異性多価ポリペプチドの、特に、単一特異性２価ポリペプチドのＩＳＶＤは、表Ａ－５に記載のリンカーを介して連結されている。一実施形態において、（少なくとも）２つのＩＳＶＤは、３５ＧＳリンカーまたは９ＧＳリンカーを介して連結されている。好ましい実施形態において、（少なくとも）２つのＩＳＶＤは、９ＧＳリンカーを介して連結されている。

【0094】

多重特異性多価ポリペプチド
さらなる態様において、ポリペプチドは、少なくとも二重特異性であるが、例えば、三重特異性、四重特異性、五重特異性などであってもよい。さらに、ポリペプチドは、少なくとも２価であるが、例えば、３価、４価、５価、６価などであってもよい。

【0095】

用語「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」、「五重特異性」などは全て用語「多重特異性を有する」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、５種などの異なる標的分子に結合することを指す。

【0096】

用語「２価」、「３価」、「４価」、「５価」、「６価」などは全て用語「多価」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、５種、６種などの結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤの存在を示す。

【0097】

例えば、ポリペプチドは、二重特異性２価、例えば２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、１つのＩＳＶＤはＧＰＣ３に特異的に結合し、１つのＩＳＶＤはＴ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、この場合、ＧＰＣ３およびＴＣＲは、ヒトＧＰＣ３およびヒトＴＣＲであるのが好ましい。ポリペプチドはまた、二重特異性３価、例えば３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、２つのＩＳＶＤはＧＰＣ３に特異的に結合し、１つのＩＳＶＤはＴ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、この場合、ＧＰＣ３およびＴＣＲは、ヒトＧＰＣ３およびヒトＴＣＲであるのが好ましい。別の例において、ポリペプチドは、三重特異性４価、例えば４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、２つのＩＳＶＤはヒトＧＰＣ３に特異的に結合し、１つのＩＳＶＤはＴ細胞上のヒトＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合し、１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合する。このようなポリペプチドは、例えば２つのＩＳＶＤがヒトＧＰＣ３上の２つの異なるエピトープと結合する場合、同時にバイパラトピックであり得る。用語「バイパラトピック」は、同じ標的分子の２つの異なる部分（例えば、エピトープ）に結合することを指す。好ましい三重特異性４価ポリペプチドは、例えば、ＩＳＶＤ構築物Ａ０２２６００４２４であり、これは、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤ、Ｔ細胞上のヒトＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する１つのＩＳＶＤ、ヒト血清アルブミンに結合する１つのＩＳＶＤを含み、ＧＰＣ３に結合することに関してバイパラトピックである。

【0098】

一実施形態において、本技術は、
少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる二重特異性２価ポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、
少なくとも２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、
二重特異性２価ポリペプチドを提供する。

【0099】

好ましい実施形態において、このようなポリペプチドは、
少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｂ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

【0100】

したがって、このようなポリペプチドは、ポリペプチドであって：
ａ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｂ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、
ｃ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える同一性を呈するか、または
ｄ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える同一性を呈する、
ポリペプチドであり得る。

【0101】

好ましくは、このようなポリペプチドにおいて、
ａ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
ｂ）第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなるか、または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなり、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。

【0102】

別の態様において、本技術は、上記の二重特異性２価ポリペプチドおよび下記（セクション５．４；「（インビボにおける）半減期の延長」）で詳細に説明されるヒト血清アルブミンに結合する第３のＩＳＶＤを含む三重特異性３価ポリペプチドを提供する。

【0103】

一実施形態において、本技術は、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる二重特異性３価ポリペプチドであって、
前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも３つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインと特異的に結合し、配列番号６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｂ）第２のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３と特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、ＧＰＣ３と特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
前記ポリペプチドによって結合されるＴＣＲおよびＧＰＣ３は、それぞれヒトＴＣＲおよびヒトＧＰＣ３であることが好ましい、
二重特異性３価ポリペプチドを提供する。

【0104】

多重特異性多価ポリペプチドの好ましい実施形態において、
ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

【0105】

多重特異性多価ポリペプチドのさらなる態様において：
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を呈し、好ましくは、前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列からなり；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を呈し、好ましくは、前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列からなり；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を呈し、好ましくは、前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。

【0106】

これに関して、用語「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などは、ＩＳＶＤの互いの相対的な位置のみを示し、番号付けは、ポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近く、それに対して「第２のＩＳＶＤ」は、「第３のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近い。したがって、Ｃ末端から考える場合、ＩＳＶＤの配置は逆である。番号付けは絶対ではなく、少なくとも４つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すに過ぎないため、ＧＰＣ３に結合する他の結合単位／ビルディングブロック、例えば追加のＩＳＶＤ、または別の標的に結合するＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得ることは排除されない。さらに、番号付けは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその間に配置され得る可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、下記のセクション５．４「（インビボでの）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、別のヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含んでいてもよく、これも例えば「第３のＩＳＶＤ」と「第４のＩＳＶＤ」との間に配置されていてもよい。

【0107】

さらなる態様において、本技術は、したがって、上記の二重特異性３価ポリペプチド、および下記（セクション５．４；「（インビボにおける）半減期の延長」）で詳細に説明されるヒト血清アルブミンに結合する第４のＩＳＶＤを含む、三重特異性４価ポリペプチドを提供する。

【0108】

好ましい実施形態において、ＴＣＲに結合する第１のＩＳＶＤは、ポリペプチドのＮ末端に配列される。

【0109】

別の態様において、本技術は、上記（セクション５．１；「単一特異性１価ポリペプチド」）で単一特異性１価ポリペプチドに関して詳細に説明されるＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤ、および下記（セクション５．４；「（インビボにおける）半減期の延長」）で詳細に説明されるヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む二重特異性２価ポリペプチドを提供する。

【0110】

別の態様において、本技術は、上記の単一特異性２価ポリペプチド（セクション５．１；「単一特異性２価ポリペプチド」）および下記（セクション５．４；「（インビボにおける）半減期の延長」）で詳細に説明されるヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む二重特異性３価ポリペプチドを提供する。

【0111】

本明細書に記載される前記多重特異性多価ポリペプチドの構成要素、好ましくはＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上の好適なリンカー、例えばペプチド性リンカーによって互いに連結されていてもよい。

【0112】

２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は当業界において周知である。例示的なペプチド性リンカーは、表Ａ－５に示される。使用されることが多いペプチド性リンカーのクラスの一つは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号１００）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを呈し、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはそれより多くであり得る）などのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む。このようなＧＳリンカーの一部の使用されることが多い例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１０３）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）：３２５～３３０が参照される。本明細書に開示されるポリペプチドにおいて、ポリペプチドの構成要素を互いに連結するために、５ＧＳリンカーおよび９ＧＳリンカーの使用が好ましい。好ましくは、ＴＣＲに特異的に結合する第１のＩＳＶＤを、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤに連結するために、１０未満のアミノ酸、例えば６未満のアミノ酸のリンカー、特に５ＧＳリンカーが使用される。

【0113】

多重特異性多価ポリペプチドの一態様において、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤ、およびＴＣＲに特異的に結合する１つのＩＳＶＤを含む。本技術のこの態様において、ＴＣＲに結合するＩＳＶＤは、５ＧＳリンカーを介してＧＰＣ３に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤのうちの１つに連結され、それに対してＧＰＣ３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、９ＧＳリンカーを介して互いに連結されている。さらなる態様において、多重特異性多価ポリペプチドは、アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含み、これは、ＴＣＲに結合するＩＳＶＤに連結されていないＧＰＣ３に結合するＩＳＶＤに、９ＧＳリンカーを介して、さらに連結されている（下記のセクション５．４「（インビボにおける）半減期の延長」に記載される通り）。発明者らは、驚くべきことに、このような立体配置は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性応答を誘発する上でポリペプチドの効率を増加させることができることを見出した。

【0114】

したがって、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下：ＴＣＲに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、ＧＰＣ３に特異的に結合する第３のＩＳＶＤ、および本明細書で定義される増加した半減期を有するポリペプチドを提供する任意選択の結合単位、を含むかまたはそれからなることが好ましい。増加した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位は、好ましくは血清アルブミンに結合する、ＩＳＶＤであることが好ましい。

【0115】

ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下：ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、リンカー、ＧＰＣ３に特異的に結合する第３のＩＳＶＤ、リンカー、およびヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、を含むかまたはそれからなることがさらにより好ましく、第１および第２のＩＳＶＤの間のリンカーは５ＧＳリンカーであることが好ましく、それに対して、他方のリンカーは９ＧＳリンカーであることが好ましい。

【0116】

ポリペプチドのこのような立体配置は、がんを処置することに関する強い効力、加えて、既存の抗体への少ない結合をもたらすことができる。

【0117】

好ましくは、多重特異性多価ポリペプチドは、ヒト血清中の既存の抗体による結合の低減を呈示する。この目的を達成するために、一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ（好ましくは、ポリペプチドのＣ末端でのＩＳＶＤ）中に、しかし好ましくはそれぞれのＩＳＤＶ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を呈する。別の実施形態において、ポリペプチドは、１～５個の（好ましくは天然に存在する）アミノ酸の伸長を呈し、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）の伸長を含む。ＩＳＶＤのＣ末端は、通常、ＶＴＶＳＳ（配列番号１１６）である。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を呈する。別の実施形態において、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１２位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を呈する。これらの実施形態において、単一のアラニンを付加した後、ポリペプチドのＣ末端が、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１２５）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１２６）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号１２７）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号１２８）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号１２９）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号１３０）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号１３１）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号１３２）、またはＶＱＶＱＳＡ（配列番号１３３）、好ましくはＶＴＶＳＳＡ（表Ａ－７を参照）を呈するように、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号１１７）、ＶＱＶＳＳ（配列番号１１８）、ＶＴＶＫＳ（配列番号１１９）、ＶＴＶＱＳ（配列番号１２０）、ＶＫＶＫＳ（配列番号１２１）、ＶＫＶＱＳ（配列番号１２２）、ＶＱＶＫＳ（配列番号１２３）、またはＶＱＶＱＳ（配列番号１２４）である。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくともＣ末端ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）、場合により、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を呈し、１～５個の（好ましくは天然に存在する）アミノ酸の伸長を呈し、例えばＣ末端ＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）の伸長を呈する（ポリペプチドのＣ末端が、例えば配列ＶＴＶＳＳＡ、ＶＫＶＳＳＡまたはＶＱＶＳＳＡ、好ましくはＶＴＶＳＳＡからなるように）。これに関するさらなる情報については、例えばＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５を参照されたい。

【0118】

好ましい実施形態において、多重特異性多価ポリペプチドは、配列番号１と、９０％を超える配列同一性、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を呈するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、より好ましくは、４つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ下記のセクション「５．２ 免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「５．４（インビボにおける）半減期の延長」に記載のＡｂｍ定義を使用する項目Ａ～Ｄ（またはＫａｂａｔの定義を使用する場合、Ａ’～Ｄ’）で定義された通りであり、特に：
・Ｔ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＧＰＣ３に特異的に結合する第３のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ヒト血清アルブミンに結合する第４のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、
または代替としてＫａｂａｔの定義を使用する場合、：
・ＴＣＲに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号３１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＧＰＣ３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＧＰＣ３に特異的に結合する第３のＩＳＶＤは、配列番号３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ヒト血清アルブミンに結合する第４のＩＳＶＤは、配列番号３４のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

【0119】

一部の態様において、ポリペプチドは、配列番号１、４９～７２、および７８～８１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0120】

好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる（表Ａ－３を参照）。最も好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

【0121】

ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較した場合、ヒトＴＣＲおよびヒトＧＰＣ３の少なくとも半分の結合親和性、より好ましくはそれと少なくとも同じ結合親和性を呈し、この場合、結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの同じ方法を使用して測定される。

【0122】

５．２ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）は、「単一可変ドメイン」と同義的に使用され、これは、免疫グロブリン分子であって、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、それにより形成されるものを定義する。これは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）またはその断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ）とは別に免疫グロブリン単一可変ドメインを設定している。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）とが相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与することになり、すなわち合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に関与することになる。

【0123】

上記の定義を考慮すれば、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子；当業界において公知）の、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、例えばジスルフィドで連結されたＦｖまたはｓｃＦｖ断片、もしくはこのような従来の４鎖抗体由来のダイアボディ（全て当業界において公知）の抗原－結合ドメインは通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとみなされないが、これは、これらの場合では、抗原のそれぞれのエピトープに結合することは通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによって起こるのではなく、一対の（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインによって、すなわち連帯してそれぞれの抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンドメインのＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ対によって起こるためである。

【0124】

対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合せずに抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶ_Ｈ、単一のＶ_ＨＨまたは単一のＶ_Ｌドメインによって形成される。

【0125】

したがって、単一の抗原結合単位（すなわち、機能的な抗原結合単位を形成するのに、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位）を形成することが可能である限りは、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｌ－配列）もしくはその好適な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｈ－配列またはＶ_ＨＨ配列）もしくはその好適な断片であり得る。

【0126】

免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、例えば重鎖ＩＳＶＤであってもよく、例えばＶ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、例えばラクダ化Ｖ_Ｈまたはヒト化されたＶ_ＨＨなどであってもよい。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｖ_ＨＨであり、例えばラクダ化Ｖ_Ｈまたはヒト化Ｖ_ＨＨなどである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体または重鎖抗体由来であってもよい。

【0127】

例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（またはｄＡｂとして使用するのに好適なアミノ酸配列）；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれか１つのあらゆる好適な断片であり得る。

【0128】

特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばＶ_ＨＨ、例えばヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ化Ｖ_Ｈなど）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である。

【0129】

「Ｖ_ＨＨドメイン」は、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_ＨＨ抗体断片、およびＶ_ＨＨ抗体としても公知であり、これは元々、「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠失した抗体」の；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６～４４８、１９９３）免疫グロブリンの可変ドメインと結合する抗原として説明されていた。用語「Ｖ_ＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体（本明細書では「Ｖ_Ｈドメイン」と称される）に存在する重鎖可変ドメインおよび従来の４鎖抗体（本明細書では「Ｖ_Ｌドメイン」と称される）に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために選択された。Ｖ_ＨＨのさらなる説明のために、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総論（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２、２００１）が参照される。

【0130】

典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物の免疫化、免疫グロブリンを生産する細胞を融合してハイブリドーマを作り出すこと、および望ましい特異性に関してスクリーニングすることを含む。代替として、免疫グロブリンは、ナイーブまたは合成ライブラリーを、例えばファージディスプレイによってスクリーニングすることによって生成してもよい。

【0131】

免疫グロブリン配列の生成は、様々な出版物で広範囲に説明されおり、そのなかでも、ＷＯ９４／０４６７８、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１を例示することができる。これらの方法において、前記標的抗原に対する免疫応答を誘導するために、ラクダ科動物が標的抗原で免疫化される。前記免疫化から得られたＶＨＨのレパートリーはさらに、標的抗原と結合するＶＨＨに関してスクリーニングされる。

【0132】

これらの例において、抗体の生成は、免疫化および／またはスクリーニングのために精製した抗原を必要とする。抗原は、天然源から精製してもよいし、または組換え体生産の過程で精製してもよい。

【0133】

免疫グロブリン配列の免疫化および／またはスクリーニングは、このような抗原のペプチド断片を使用して実行することができる。

【0134】

本技術は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ免疫グロブリン配列を含む異なる起源の免疫グロブリン配列を使用することができる。本技術はまた、完全ヒト、ヒト化またはキメラ配列も含む。例えば、本技術は、ラクダ免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、またはラクダ化ドメイン抗体、例えば、Ｗａｒｄら（例えばＷＯ９４／０４６７８およびＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４および１９９６）を参照）によって記載されるようなラクダ化ｄＡｂを含む。さらに、本技術はまた、融合した免疫グロブリン配列、例えば、多価および／または多重特異性構築物（１つまたはそれ以上のＶ_ＨＨドメインを含有する多価および多重特異性ポリペプチドならびにそれらの調製のため、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、１０．７３４６～７３５０、２００１、加えて例えばＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１が参照される）、ならびにタグまたは他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射化学物質などを含む免疫グロブリン配列を形成する融合した免疫グロブリン配列も使用し、これらは本技術の免疫グロブリン配列から誘導可能である。

【0135】

「ヒト化Ｖ_ＨＨ」は、天然に存在するＶ_ＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されている、すなわち、前記天然に存在するＶ_ＨＨ配列のアミノ酸配列中の（特にフレームワーク配列中の）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の４鎖抗体（例えば上記で示された）からのＶ_Ｈドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってヒト化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書や先行技術（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に記載のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。ここでも注目すべきことに、このようなヒト化Ｖ_ＨＨは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。

【0136】

「ラクダ化Ｖ_Ｈ」は、天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶ_ＨＨドメインにおける対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってラクダ化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書や先行技術（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に記載のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。このような「ラクダ化」置換は好ましくは、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌの境界を形成する、および／またはそこに存在するアミノ酸位置に、および／または本明細書で定義されるようないわゆるラクダの特徴的な残基に挿入される（例えばＷＯ９４／０４６７８ならびにＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４および１９９６）、上記を参照）。好ましくは、ラクダ化Ｖ_Ｈを生成または設計するための出発材料または開始点として使用されるＶ_Ｈ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶ_Ｈ配列、さらに好ましくはヒトのＶ_Ｈ配列、例えばＶ_Ｈ３配列である。しかしながら、注目すべきことに、このようなラクダ化Ｖ_Ｈは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶ_Ｈドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。

【0137】

免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の好ましい構造は、４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）で構成されるとみなすことができ、これらは、当業界および本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；および「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）として言及され；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）が途中に存在し、これらは、当業界および本明細書ではそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；および「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）として言及される。

【0138】

ＷＯ０８／０２００７９の５８頁および５９頁段落ｑ）でさらに記載されるように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１～２）：１８５～１９５；例えばこの出版物の図２を参照）の論文に記載のラクダ科動物からのＶ_ＨＨドメインに適用された通り、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって付与されるＶ_Ｈドメインの一般的な番号付けに従って番号付けすることができる。注目すべきことに、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインに関して当業界において周知の通り、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変化することがあり、Ｋａｂａｔの番号付けによって示されたアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる１つまたはそれ以上の位置が実際の配列において占有されていなくてもよいし、または実際の配列がＫａｂａｔの番号付けによって許容される数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）。これは、一般的に、Ｋａｂａｔによる番号付けは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けに対応していてもよいし、または対応していなくてもよいことを意味する。Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常、１１０～１２０の範囲となり、１１２～１１５となることが多い。しかしながら、注目すべきことに、それより短い配列およびそれより長い配列も、本明細書に記載される目的にとって好適であり得る。

【0139】

本出願において、別段の指定がない限り、ＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２０１０年編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、第３章、３３～５１頁）に記載されたように、ＡｂＭの定義に従って決定された。この方法によれば、ＦＲ１は、１～２５位でアミノ酸残基を構成し、ＣＤＲ１は、２６～３５位でアミノ酸残基を構成し、ＦＲ２は、３６～４９位でアミノ酸残基を構成し、ＣＤＲ２は、５０～５８位でアミノ酸残基を構成し、ＦＲ３は、５９～９４位でアミノ酸残基を構成し、ＣＤＲ３は、９５～１０２位でアミノ酸残基を構成し、ＦＲ４は、１０３～１１３位でアミノ酸残基を構成する。

【0140】

ＣＤＲ領域の決定は、異なる方法に従って行ってもよい。ＫａｂａｔによるＣＤＲ決定において、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は、１～３０位でアミノ酸残基を構成し、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は、３１～３５位でアミノ酸残基を構成し、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は、３６～４９位でアミノ酸残基を構成し、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は、５０～６５位でアミノ酸残基を構成し、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は、６６～９４位でアミノ酸残基を構成し、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は、９５～１０２位でアミノ酸残基を構成し、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は、１０３～１１３位でアミノ酸残基を構成する。

【0141】

このような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は、あらゆる好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的な教本、および本明細書で述べられたさらなる開示および先行技術に基づき当業者には明らかであろう。

【0142】

フレームワーク配列は、好ましくは免疫グロブリンフレームワーク配列または免疫グロブリンフレームワーク配列から得られた（例えば、ヒト化またはラクダ化によって）フレームワーク配列（の好適な組合せ）である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶ_Ｌ配列）および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶ_Ｈ配列またはＶ_ＨＨ配列）から得られたフレームワーク配列であり得る。特に好ましい一態様において、フレームワーク配列は、Ｖ_ＨＨ配列から得られたフレームワーク配列（それにおいて、前記フレームワーク配列が、場合により、部分的または完全にヒト化されていてもよい）であるか、または従来のラクダ化Ｖ_Ｈ配列（本明細書で定義される通り）であるかのいずれかである。

【0143】

特に、本技術で使用されるＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、ＩＳＶＤ配列が、ヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ化Ｖ_Ｈを含むＶ_ＨＨになるように、特徴的な残基（本明細書で定義される通り）の１つまたはそれ以上を含有していてもよい。このようなフレームワーク配列の一部の好ましい、ただし非限定的な例（その好適な組合せ）は、本明細書に記載のさらなる開示から明確になるであろう。

【0144】

ここでも、本明細書において免疫グロブリン配列に関して一般的に記載される通り、また、前述のもののいずれかの好適な断片（または断片の組合せ）、例えば、好適には１つまたはそれ以上のフレームワーク配列が隣接する、および／またはそれを介して連結された１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を含有する断片（例えば、これらのＣＤＲおよびフレームワーク配列は、断片がそれから得られた完全サイズの免疫グロブリン配列において生じ得る同じ順番で）を使用することも考えられる。

【0145】

しかしながら、注目すべきことに、本技術は、ＩＳＶＤ配列（またはそれを発現させるのに使用されるヌクレオチド配列）の起源にも、ＩＳＶＤ配列またはヌクレオチド配列が生成される（または生成された）または得られる方法にも限定されない。したがって、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）であってもよいし、または合成もしくは半合成の配列であってもよい。具体的な、ただし非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）または合成もしくは半合成の配列であり、その例としては、これらに限定されないが、「ヒト化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列（例えば部分的または完全にヒト化されたマウスまたはウサギ免疫グロブリン配列、特に、部分的または完全にヒト化されたＶ_ＨＨ配列）、「ラクダ化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列、加えて、親和性成熟（例えば、合成、ランダムまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列から得られた断片を組み合わせること、オーバーラップするプライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似の技術；または前述のもののいずれかのあらゆる好適な組合せなどの技術により得られた免疫グロブリン配列が挙げられる。

【0146】

同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列または合成もしくは半合成の配列であってもよく、例えば、好適な天然に存在するテンプレートからＰＣＲによって単離される配列（例えば細胞から単離したＤＮＡまたはＲＮＡ）、ライブラリー（特に、発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、天然に存在するヌクレオチド配列に突然変異を導入すること（それ自体公知のあらゆる好適な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）によって調製されるヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを使用するＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体公知のＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。

【0147】

上述したように、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの一般的な説明のために、以下のさらなる説明、加えて本明細書において引用された先行技術が参照される。しかしながら、この点において、この説明および先行技術は、主として、いわゆる「Ｖ_Ｈ３クラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（すなわち、ＤＰ－４７、ＤＰ－５１またはＤＰ－２９などのＶ_Ｈ３クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）を説明したものであることに留意すべきである。しかしながら、本技術は、その最も広い意味で、一般的にあらゆるタイプのＮａｎｏｂｏｄｙを使用することができ、例えば、例えばＷＯ２００７／１１８６７０に記載されたように、いわゆる「Ｖ_Ｈ４クラス」に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（すなわち、ＤＰ－７８などのＶ_Ｈ４クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）も使用することに留意すべきである。

【0148】

一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（特にＶ_ＨＨ配列、例えば（部分的に）ヒト化Ｖ_ＨＨ配列およびラクダ化Ｖ_Ｈ配列など）は、フレームワーク配列（ここでも本明細書にさらに記載される通り）の１つまたはそれ以上における１つまたはそれ以上の「特徴的な残基」（本明細書に記載される通り）の存在によって特徴付けることができる。したがって、一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列と定義することができ、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、特徴的な残基の１つまたはそれ以上は、さらに本明細書で定義される通りである。

【0149】

詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は、さらに本明細書で定義される通りである。

【0150】

より詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し：
Ｋａｂａｔの番号付けに従って１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８位におけるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が、以下の表Ａ－０に記載した特徴的な残基から選択される。

【0151】

【表1-1】

【表1-2】

【0152】

本技術はとりわけ、ＴＣＲまたはＧＰＣ３の定常ドメインに結合することができるＩＳＶＤを使用する。本技術に関して、特定の標的分子「に結合すること」は、抗体およびそのそれぞれの抗原に関して理解される通り当業界における通常の意味を有する。

【0153】

多重特異性多価ポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する１つまたはそれ以上のＩＳＶＤを含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、ＧＰＣ３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤ、およびＴＣＲに特異的に結合する１つのＩＳＶＤを含んでいてもよい。

【0154】

本技術で使用されるＩＳＶＤは、ポリペプチドがＧＰＣ３およびＴＣＲに特異的に結合することができるように、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドの一部を形成することができる。

【0155】

したがって、本技術で使用されるＩＳＶＤの標的分子は、それぞれＧＰＣ３およびＴＣＲの定常ドメインである。ＴＣＲへの結合は、例えば、ＴＣＲアルファサブユニットおよび／またはＴＣＲベータサブユニットに結合することによって達成することができる。その例は、哺乳類のＧＰＣ３およびＴＣＲである。ヒトＧＰＣ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ５１６５４、表Ａ－８を参照）およびヒトＴＣＲ（表Ａ－８を参照）が好ましいが、一方、他の種からのバージョンも本技術に適しており、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル（本明細書では「ｃｙｎｏ」としても言及される）、またはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカからのＧＰＣ３およびＴＣＲが挙げられる。

【0156】

本技術で使用できるＴ細胞上のＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、以下の項目Ａに記載される通りである：
Ａ．ヒトＴＣＲに特異的に結合し：
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0157】

好ましい実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１３５のヒトＴＣＲ－αのおよび／または配列番号１３６のＴＣＲ－βの定常ドメイン、またはその多型バリアントもしくはアイソフォームに結合する。

【0158】

このようなヒトＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２にＩＳＶＤ ＴＣＥ０１に関して示されるように、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）フレームワーク領域を含み（前述の項目Ａで定義されたＣＤＲに加えて）、ＩＳＶＤ ＴＣＥ０１（配列番号２；表Ａ－１およびＡ－２を参照）の全長アミノ酸配列からなるＩＳＶＤであることが最も好ましい。

【0159】

また、好ましい実施形態において、ヒトＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を呈していてもよく、ＣＤＲは、前述の項目Ａで定義された通りである。特に、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤは最も好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列である。

【0160】

このようなＴＣＲに結合するＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ａ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲにおいて２または１つのアミノ酸の差異を呈する場合、ＩＳＶＤは、好ましくは、配列番号２に記載の構築物ＴＣＥ０１のように、ヒトＴＣＲの少なくとも半分の結合親和性、より好ましくはそれと少なくとも同じ結合親和性を呈し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

【0161】

本技術で使用できるＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、以下の項目ＢおよびＣに記載される通りである：
Ｂ．ヒトＧＰＣ３に特異的に結合し：
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0162】

Ｃ．ヒトＧＰＣ３に特異的に結合し：
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0163】

好ましい実施形態において、ＩＳＶＤは配列番号１３４のヒトＧＰＣ３に結合する。

【0164】

このようなヒトＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤの好ましい例は、それぞれ表Ａ－２にＩＳＶＤ Ａ０２２６００３５１およびＡ０２２６００３１４に関して示されるように、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）フレームワーク領域を含み（それぞれ前述の項目ＢおよびＣで定義されたＣＤＲに加えて）、ＩＳＶＤ Ａ０２２６００３５１またはＡ０２２６００３１４（配列番号３または４、表Ａ－１およびＡ－２を参照）の全長アミノ酸配列からなるＩＳＶＤであることが最も好ましい。

【0165】

また、好ましい実施形態において、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３または４と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を呈していてもよく、ＣＤＲは、それぞれ前述の項目ＢまたはＣで定義された通りである。特に、ヒトＧＰＣ３に結合するＩＳＶＤは最も好ましくは、配列番号３または４のアミノ酸配列である。

【0166】

このようなヒトＧＰＣ３に結合するＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目ＢまたはＣ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲにおいて２または１つのアミノ酸の差異を呈する場合、ＩＳＶＤは、好ましくは、それぞれ配列番号３および４に記載の構築物Ａ０２２６００３５１またはＡ０２２６００３１４のように、ヒトＧＰＣ３の少なくとも半分の結合親和性、より好ましくはそれと少なくとも同じ結合親和性を呈し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

【0167】

好ましくは、上記の項目Ａ～Ｃで定義されるＩＳＶＤのそれぞれは、ポリペプチドに含まれる。

【0168】

このような上記の項目Ａ～Ｃで定義されるＩＳＶＤのそれぞれを含むポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドのように、ヒトＴＣＲおよびヒトＧＰＣ３の好ましくは少なくとも半分の結合親和性、より好ましくはそれと少なくとも同じ結合親和性を呈し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

【0169】

上記の項目Ａ～Ｃおよび下記の項目Ｄで言及される配列番号（セクション５．４「（インビボにおける）半減期の延長」を参照）は、ＡｂＭの定義によるＣＤＲの定義（表Ａ－２を参照）に基づく。Ｋａｂａｔ定義により同じＣＤＲを定義する配列番号（表Ａ－２－１を参照）は、同様に、上記の項目Ａ～Ｃおよび下記の項目Ｄで使用することができることに留意する（セクション５．４「（インビボにおける）半減期の延長」を参照）。

【0170】

したがって、本技術で使用できるＴ細胞上のＴＣＲの定常ドメインまたはＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、ＡｂＭの定義を使用して上述した通りであり、下記の項目Ａ’～Ｃ’に記載の通りＫａｂａｔ定義を使用して記載することもできる：
Ａ’．ヒトＴＣＲに特異的に結合し、
ｉ．配列番号３１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
好ましくは、配列番号３１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0171】

このようなヒトＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶＤの好ましい例は、それぞれ表Ａ－２－１にＩＳＶＤ ＴＣＥ０１に関して示されるように、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）フレームワーク領域を含み（前述の項目Ａ’で定義されたＣＤＲに加えて）、ＩＳＶＤ ＴＣＥ０１（配列番号２、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）の全長アミノ酸配列からなるＩＳＶＤであることが最も好ましい。

【0172】

Ｂ’．ヒトＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
好ましくは、配列番号３２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0173】

Ｃ’．ヒトＧＰＣ３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
好ましくは、配列番号３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0174】

このようなヒトＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤの好ましい例は、それぞれ表Ａ－２－１にＩＳＶＤ Ａ０２２６００３５１およびＡ０２２６００３１４に関して示されるように、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）フレームワーク領域を含み（それぞれ前述の項目Ｂ’およびＣ’で定義されたＣＤＲに加えて）、ＩＳＶＤ Ａ０２２６００３５１またはＡ０２２６００３１４（配列番号３または４、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）の全長アミノ酸配列からなるＩＳＶＤであることが最も好ましい。

【0175】

第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一な、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることによって計算することができ、この場合、第１のアミノ酸配列と比較した場合の第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加のそれぞれは、単一のアミノ酸残基（すなわち単一の位置）における差としてみなされる。

【0176】

通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１の」アミノ酸配列として取り扱われることになり、その他のアミノ酸配列が「第２の」アミノ酸配列として取り扱われることになる。

【0177】

「アミノ酸の差異」は、本明細書で使用される場合、参照配列に相対する単一のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を指し、好ましくは置換である。

【0178】

アミノ酸置換は、好ましくは保存的置換である。このような保存的置換は、好ましくは以下のグループ（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（ａ）小さい脂肪族の、非極性の、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負電荷を有する残基およびその（非荷電性）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。

【0179】

特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙへの、またはＳｅｒへの；ＡｒｇからＬｙｓへの；ＡｓｎからＧｌｎへの、またはＨｉｓへの；ＡｓｐからＧｌｕへの；ＣｙｓからＳｅｒへの；ＧｌｎからＡｓｎへの；ＧｌｕからＡｓｐへの；ＧｌｙからＡｌａへの、またはＰｒｏへの；ＨｉｓからＡｓｎへの、またはＧｌｎへの；ＩｌｅからＬｅｕへの、またはＶａｌへの；ＬｅｕからＩｌｅへの、またはＶａｌへの；ＬｙｓからＡｒｇへの、Ｇｌｎへの、またはＧｌｕへの；ＭｅｔからＬｅｕへの、Ｔｙｒへの、またはＩｌｅへの；ＰｈｅからＭｅｔへの、Ｌｅｕへの、またはＴｙｒへの；ＳｅｒからＴｈｒへの；ＴｈｒからＳｅｒへの；ＴｒｐからＴｙｒへの；ＴｙｒからＴｒｐへの；および／またはＰｈｅからＶａｌへの、Ｉｌｅへの、またはＬｅｕへの置換。

【0180】

５．３ 特異性
用語「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、特定の結合単位、例えばＩＳＶＤが十分に高い親和性で結合することができる、同じ生物からの抗原などの異なる標的分子の数を指す（下記を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、本明細書において、「選択性」、「選択的に結合する」または「選択的な結合」と同義的に使用される。結合単位、例えばＩＳＶＤは、好ましくはその指定された標的に特異的に結合する。

【0181】

結合単位の特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般的に、モル／リットル（またはＭ）の単位において発現されるＫＤ、または解離定数によって示される。親和性はまた、１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）^－１（またはＭ^－１）の単位において発現される会合定数、ＫＡとして表すこともできる。

【0182】

親和性は、部分と標的分子上の結合部位との間の結合強度の尺度であり：ＫＤ値が低いほど、標的分子と標的化部分との間の結合強度はより強くなる。

【0183】

典型的には、本技術で使用される結合単位（例えばＩＳＶＤ）は、その標的に、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満、好ましくは１０^－７～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満、より好ましくは１０^－８～１０^－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０^５～１０^１２リットル／モルまたはそれより多く、好ましくは１０^７～１０^１２リットル／モルまたはそれより多く、より好ましくは１０^８～１０^１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）結合する。

【0184】

一般的に、１０^－４モル／リットルより大きいあらゆるＫＤ値（または１０^４リットル／ｍｏｌより低いあらゆるＫＡ値）が、非特異的な結合を示すとみなされる。

【0185】

生物学的な相互作用のＫＤ、例えば、特異的とみなされる免疫グロブリン配列の抗原への結合のＫＤは、典型的には、１０^－５モル／リットル（１００００ｎＭまたは１０μＭ）～１０^－１２モル／リットル（０．００１ｎＭまたは１ｐＭ）またはそれ未満の範囲内である。

【0186】

したがって、特異的／選択的な結合は、同じ測定方法、例えばＳＰＲを使用した場合、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）は、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で、ＴＣＲおよび／またはＧＰＣ３に結合し、関連する標的に１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合することを意味する場合がある。ＧＰＣ３の関連する標的の例は、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＧＰＣ４、ＧＰＣ５またはＧＰＣ６である。したがって、本技術の一実施形態において、ＧＰＣ３に結合するポリペプチド中に含まれるＩＳＶＤは、ＧＰＣ３に、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＧＰＣ４、ＧＰＣ５およびＧＰＣ６に、１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合する。

【0187】

したがってポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較した場合、ヒトＴＣＲおよびヒトＧＰＣ３の少なくとも半分の結合親和性、より好ましくはそれと少なくとも同じ結合親和性を好ましくは呈し、この場合、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。

【0188】

特定の種からの特定の標的への特異的な結合は、結合単位が、異なる種からの類似した標的にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。例えば、ヒトＴＣＲへの特異的な結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザルからのＴＣＲにも特異的に結合する可能性があることを排除しない。同様に、例えば、ヒトＧＰＣ３への特異的な結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）からのＧＰＣ３にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。

【0189】

ヒトＴＣＲに結合し、本技術のポリペプチドに含まれる配列番号２を有するＩＳＶＤは、ＷＯ２０１６／１８０９６９Ａ１に記載されているＩＳＶＤ Ｔ０１７００５６Ｇ０５と比較して、改善された結合特性を呈する。より具体的には、配列番号２を有するＩＳＶＤは、Ｔ０１７０５６Ｇ０５に由来し、ＩＳＶＤ Ｔ０１７００５６Ｇ０５と比較して、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）ＴＣＲへの結合に関して改善された交差反応性をもたらすＣＤＲ１およびＣＤＲ３における特異的突然変異を含む。

【0190】

一方のＩＳＶＤが別のＩＳＶＤと比較して「ヒトおよび非ヒト霊長類のＴＣＲへの結合に関して改善された交差反応性」を呈する、と言われる場合、これが意味するところは、前記ＩＳＶＤに関して、ヒトＴＣＲに対するおよび非ヒト霊長類ＴＣＲに対する結合活性の比（例えばＫＤまたはｋ_ｏｆｆで表した）が、同じアッセイで他のＩＳＶＤに対して計算された同じ比よりも低いことである。

【0191】

ヒトおよび非ヒト霊長類のＴＣＲへの結合に関する良好な交差反応性によって、非ヒト霊長類に対して行われた前臨床研究における多重特異性Ｔ細胞誘導ポリペプチドの傷害性の評価が可能になる。

【0192】

結合単位の、その指定された標的への特異的な結合は、それ自体公知のあらゆる好適な方式、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびにそれ自体当業界において公知のそれらの様々な改変法；加えて本明細書で述べられる他の技術で決定することができる。

【0193】

解離定数は、当業者には明らかであろうが、実際の解離定数であってもよいし、または見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであり、その例としては、下記で述べられる技術が挙げられる。この点において、１０^－４モル／リットルまたは１０^－３モル／リットルより大きい（例えば１０^－２モル／リットルの）解離定数を測定できない可能性があることも明らかであろう。場合により、当業者には明らかであろうが、（実際の、または見かけの）解離定数は、［ＫＤ＝１／ＫＡ］という関係によって、（実際の、または見かけの）会合定数（ＫＡ）に基づき計算することができる。

【0194】

２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術を介して測定することができる（例えばＯｂｅｒら、２００１、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１５５１～１５５９を参照）。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、この場合、一方の分子がバイオセンサーチップに固定され、他方の分子が流動条件下で固定された分子上を通過することで、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ測定値、したがってＫ_Ｄ（またはＫ_Ａ）値が得られる。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して実行することができる。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９～２６）、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０～６２７）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５～１３１）、およびＪｏｈｎｎｓｏｎら（１９９１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８～２７７）を参照されたい。

【0195】

生体分子の相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えばＡｂｄｉｃｈｅら、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９～２１７を参照）。用語「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」は、本明細書で使用される場合、２つの表面：内部参照層（参照ビーム）およびバイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質の層（シグナルビーム）から反射した光の干渉縞を分析する、標識なしの光学技術を指す。バイオセンサーのチップに結合した分子の数の変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される干渉縞におけるシフトを引き起こし、その規模が、バイオセンサーチップ表面に結合した分子の数の直接の尺度である。相互作用はリアルタイムで測定できるため、会合および解離速度ならびに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＵＳＡの一部門）を使用して実行することができる。

【0196】

代替として、親和性は、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）プラットフォーム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｂｏｉｓｅ、ＵＳＡ）を使用する反応速度論除外アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ）（例えばＤｒａｋｅら、２００４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２８：３５～４３を参照）で測定することができる。用語「ＫｉｎＥｘＡ」は、本明細書で使用される場合、改変されていない分子の真の平衡結合親和性および速度論を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化溶液を、抗原（または抗体）でプレコーティングされたビーズを有するカラム上に通過させることで、遊離の抗体（または抗原）をコーティングされた分子に結合させることができる。このようにして捕獲された抗体（または抗原）の検出は、抗体（または抗原）と結合する蛍光標識したタンパク質を用いて達成される。

【0197】

ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化された生物学的な分析および迅速なサンプルの回転のためのプラットフォームを提供する（Ｆｒａｌｅｙら、２０１３、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５：１７６５～７４）。

【0198】

５．４ （インビボにおける）半減期の延長
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでいてもよく、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した（インビボにおける）半減期を有するポリペプチドを提供する。インビボにおける半減期の延長は、例えば、ポリペプチドが、投与された後、哺乳動物、例えばヒト対象において増加した半減期を呈することを意味する。半減期は、例えばｔ１／２ベータとして表することができる。

【0199】

基、残基、部分または結合単位のタイプは、一般的に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。

【0200】

より具体的には、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、または血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧに結合することができる結合単位からなる群から選択することができ、好ましくはヒト血清アルブミンに結合することができる結合単位である。結合単位は、好ましくはＩＳＶＤである。

【0201】

例えば、ＷＯ０４／０４１８６５は、血清アルブミンに結合する（特にヒト血清アルブミンに対する）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）であって、前記タンパク質の半減期を増加させるために他のタンパク質（例えば望ましい標的に結合する１種またはそれ以上の他のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）に連結されていてもよいものを記載している。

【0202】

国際出願ＷＯ０６／１２２７８７は、（ヒト）血清アルブミンに対する多数のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を記載している。これらのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）としては、Ａｌｂ－１（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号５２）およびそれらのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ－８（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号６２）と称されるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）が挙げられる。これらもまた、治療用タンパク質およびポリペプチドならびに他の治療的な実体または部分の半減期を延長するのに使用することができる。

【0203】

さらに、ＷＯ２０１２／１７５４００は、Ａｌｂ－２３と称されるＡｌｂ－１のさらに改善されたバージョンを記載している。

【0204】

好ましい実施形態において、ポリペプチドは、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０およびＡｌｂ－２３、好ましくは、ＷＯ２０１２／１７５４００の７～９頁で示されるようなＡｌｂ－８もしくはＡｌｂ－２３またはそのバリアント、ならびに、ＷＯ２０１２／１７５７４１、ＷＯ２０１５／１７３３２５、ＷＯ２０１７／０８０８５０、ＷＯ２０１７／０８５１７２、ＷＯ２０１８／１０４４４４、ＷＯ２０１８／１３４２３５、ＷＯ２０１８／１３４２３４に記載されるアルブミンバインダー、から選択される血清アルブミン結合部分を含む。一部の好ましい血清アルブミンバインダーは、表Ａ－４にも示される。ポリペプチドの特に好ましいさらなる構成要素は、項目Ｄに記載される通りである：
Ｄ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0205】

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２にＩＳＶＤ ＡＬＢ２３００２に関して示されるように、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）フレームワーク領域を含み（前述の項目Ｄで定義されたＣＤＲに加えて）、ＩＳＶＤ ＡＬＢ２３００２（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２を参照）の全長アミノ酸配列からなるＩＳＶＤであることが最も好ましい。

【0206】

項目Ｄはまた、Ｋａｂａｔ定義を使用して以下の通りに記載することもできる：
Ｄ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号３４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
好ましくは、配列番号３４のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
ＩＳＶＤ。

【0207】

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤの好ましい例は、表Ａ－２－１にＩＳＶＤ ＡＬＢ２３００２に関して示されるように、１つまたはそれ以上の（好ましくは全ての）フレームワーク領域を含み（前述の項目Ｄ’で定義されたＣＤＲに加えて）、ＩＳＶＤ ＡＬＢ２３００２（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）の全長アミノ酸配列からなるＩＳＶＤであることが最も好ましい。

【0208】

また、好ましい実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を呈していてもよく、ＣＤＲは、前述の項目ＤまたはＤ’で定義された通りである。特に、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列である。

【0209】

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目ＤまたはＤ’）と比べて少なくとも１つのＣＤＲにおいて２または１つのアミノ酸の差異を呈する場合、ＩＳＶＤは、配列番号５に記載の構築物ＡＬＢ２３００２のように、ヒト血清アルブミンの少なくとも半分の結合親和性、好ましくはそれと少なくとも同じ結合親和性を呈し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

【0210】

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端の位置にある場合、Ｃ末端アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）の伸長（好ましくはＡ）を呈示することができ、このようなＩＳＶＤは、配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９６および９８、最も好ましくは配列番号９６から選択されるのが好ましいが、これは、単一のアラニン伸長を有する配列番号５を表す（下記の表Ａ－４を参照）。一部の実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端の位置とは別の位置にあり（すなわち、ポリペプチドのＣ末端のＩＳＶＤではない）、配列番号５、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４および９７から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。

【0211】

５．５ 核酸分子
本明細書に開示されるようなポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。

【0212】

「核酸分子」（「核酸」と同義的に使用される）は、ヌクレオチド配列を形成するためにリン酸主鎖を介して互いに連結されたヌクレオチド単量体の鎖である。核酸は、例えばポリペプチドの発現および／または生産のために、宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトするのに使用することができる。生産目的のための好適な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞も、本技術に包含される。

【0213】

核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであってもよいし、ＰＮＡのような（例えば化学的に）修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。核酸は、一本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。

【0214】

核酸は、それ自体公知の方式で調製するかまたは得てもよいし、および／または好適な天然源から単離してもよい。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供されるように、部位特異的変異誘発に供してもよい。また当業者には明らかであろうが、核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば標的化部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば１つまたはそれ以上のリンカーをコードする核酸も、好適な方式で一緒に連結されていてもよい。

【0215】

核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、その例としては、これらに限定されないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つまたはそれ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（または２つまたはそれ以上のそれらの一部）を組み合わせること、短縮化された発現産物の発現をもたらす突然変異の導入；１つまたはそれ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して容易に消化および／またはライゲートすることができるカセットおよび／または領域を作り出すため）、ならびに／または１つまたはそれ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入を挙げることができる。

【0216】

５．６ ベクター
本明細書に開示されるようなポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を細胞に運ぶのに好適な媒体である。ベクターとしては、裸の核酸、例えばプラスミドまたはｍＲＮＡ、またはより大きい構造に埋め込まれた核酸、例えばリポソームもしくはウイルスベクターが挙げられる。

【0217】

ベクターは、一般的に、場合により、１つまたはそれ以上の調節エレメント、例えば１つまたはそれ以上の好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに連結された少なくとも１つの核酸を含む。ベクターは、好ましくは発現ベクターであり、すなわち、好適な条件下で、例えばベクターが（例えばヒト）細胞に導入されたときに、コードされたポリペプチドまたは構築物を発現させるのに好適なベクターである。ＤＮＡベースのベクターの場合、これは通常、転写のためのエレメントの存在（例えばプロモーターおよびポリＡシグナル）および翻訳のためのエレメントの存在（例えばコザック配列）を含む。

【0218】

好ましくは、ベクター中において、前記少なくとも１つの核酸および前記調節エレメントは、互いに「作動可能に連結」しており、これは、一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写および／または発現を開始させるかまたはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することができる場合、コード配列に「作動可能に連結している」とみなされる（ここで前記コード配列は、前記プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結している場合、それらは同じ方向となり、また通常は同じリーディングフレーム内にある。それらはまた通常は本質的に連続しているが、これもまたそうである必要はない場合もある。

【0219】

好ましくは、ベクターのいずれの調節エレメントも、それらが意図した宿主細胞または宿主生物においてそれらの意図した生物学的機能を提供できるようなものである。

【0220】

例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、意図した宿主細胞または宿主生物において「作動可能である」はずであり、これは、例えば前記プロモーターが、ヌクレオチド配列、例えばそれに作動可能に連結したコード配列の転写および／または発現を開始させること、またはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することが可能であるはずであることを意味する。

【0221】

５．７ 組成物

【0222】

本技術はまた、少なくとも１つの本明細書に開示のようなポリペプチド、本明細書に開示のようなポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、またはこのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物も提供する。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含んでいてもよく、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む。

【0223】

５．８ 宿主生物
本技術はまた、本明細書に開示されるようなポリペプチド、本明細書に開示されるようなポリペプチドをコードする核酸、および／または本明細書に開示されるようなポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞または宿主生物にも関する。

【0224】

好適な宿主細胞または宿主生物は当業者に明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物である。具体的には例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。最も好ましい宿主は、ピチア・パストリスである。

【0225】

５．９ ポリペプチドの方法および使用
本技術はまた、本明細書に開示されるようなポリペプチドを生産するための方法も提供する。本方法は、宿主細胞または宿主生物を、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合により、それに続いて、１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでいてもよい。
具体的には、本方法は、：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合により、それに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでいてもよい。

【0226】

生産目的のための好適な宿主細胞または宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。具体的な例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌またはピチア・パストリスが挙げられる。最も好ましい宿主は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

【0227】

記載されるポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は － 好ましくはポリペプチドまたはそれを含む組成物 － 医薬として有用である。

【0228】

したがって、本技術は、医薬としての使用のための、記載されるポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を提供する。

【0229】

また、がんの処置における使用のための、記載されポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物も提供される。

【0230】

さらに、がんを処置する方法であって、医薬的に活性な量の、記載されるポリペプチド、核酸分子またはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。

【0231】

さらに、医薬組成物の調製における、ポリペプチド、記載される核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用が提供される。

【0232】

さらに、好ましくはがんを処置するための、医薬組成物の調製における、ポリペプチド、記載される核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用が提供される。

【0233】

がんは、あらゆるタイプのＧＰＣ３発現がんであり得る。がんは、好ましくは肝臓がんまたは肺がんであり、好ましくは肝臓がんである。肝臓がんは、肝細胞癌であるのが好ましい。肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、最も好ましくは扁平上皮癌（ＳＣＣ）であるのが好ましい。

【0234】

好ましくは、ＧＰＣ３発現がん細胞は、Ｈｕｈ７細胞と、（平均して）少なくとも半分の量のＧＰＣ３タンパク質、好ましくはそれと少なくとも同量のＧＰＣ３タンパク質（平均して）を発現する。Ｈｕｈ７細胞は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから受託番号ＪＣＲＢ０４０３で公的に入手可能である。

【0235】

発現されたＧＰＣ３は、好ましくは細胞表面露出のＧＰＣ３を指す。細胞上の（細胞表面露出の）ＧＰＣ３の発現（およびその量）は、例えばフローサイトメトリー、免疫組織化学、または実施例に記載されるような当技術分野で普通に知られているルーチンの方法によって容易に決定することができる。

【0236】

「対象」は、本技術に関して言及される場合、あらゆる動物であってもよく、好ましくは哺乳動物であってもよい。哺乳動物のなかでも、ヒトと非ヒト哺乳動物との区別がなされる場合がある。非ヒト動物は、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ）、家畜（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはブタ動物）、または一般的に調査目的および／または抗体生産のために使用される動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、またはラクダ科動物、例えばラマまたはアルパカ）であり得る。

【0237】

予防および／または治療目的に関して、対象は、あらゆる動物であってもよく、より具体的には、あらゆる哺乳動物であってもよいが、好ましくはヒト対象である。

【0238】

物質（例えばポリペプチド、核酸分子およびベクターなど）または組成物は、あらゆる好適な投与経路によって、例えば経腸（例えば経口または直腸）または非経口（例えば皮膚上、舌下、頬側、経鼻、関節内、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、真皮下、または経粘膜）投与によって対象に投与することができる。好ましくは、非経口投与、例えば筋肉内、皮下または皮内投与である。最も好ましくは、皮下投与である。

【0239】

有効量の記載されるポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は、意図した処置結果を提供するために、対象に投与することができる。

【0240】

１つまたはそれ以上の用量が投与されてもよい。１つより多くの用量が投与される場合、用量は、ポリペプチド、組成物、核酸分子またはベクターの作用を最大化するために、好適な間隔で投与されてもよい。

【0241】

【表2】

【0242】

【表3】

【0243】

【表4】

【0244】

【表5】

【0245】

【表6-1】

【表6-2】

【0246】

【表7】

【0247】

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【表8-4】

【表8-5】

【表8-6】

【表8-7】

【0248】

【表9】

【0249】

【表10】

【実施例】

【0250】

６ 実施例
６．１ 実施例１：ＧＰＣ３に特異的に結合するＩＳＶＤの発見
２匹のラマおよび１匹のアルパカを、ヒトグリピカン－３アイソフォーム２前駆体［ＮＰ＿００４４７５；５８０ ＡＡ；ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］をコードする配列を含有するＤＮＡ二本遺伝子ベクターで免疫化した。その後、動物を組換えヒトグリピカン－３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１１９－ＧＰ）でブーストした。

【0251】

最後の免疫原注射の後、血液サンプルを収集し、フィコール－ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ）を製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳ）の説明書に従って使用して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製し、全ＲＮＡを抽出し保存した。

【0252】

全ＲＮＡを、ＩＳＶＤをコードする遺伝子断片を増幅するためのＲＴ－ＰＣＲの出発材料として使用した。これらの断片をファージミドベクターｐＡＸ２１２にクローニングした。ファージを、標準的なプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（第１版、２００２、Ｏ’ＢｒｉａｎおよびＡｉｔｋｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に従って調製し、４℃での濾過滅菌の後、さらなる使用まで貯蔵した。各免疫化動物からファージライブラリーを構築し、ライブラリーサイズ３×１０^８、６×１０^８および８×１０^８ｃｆｕを得た。

【0253】

ファージディスプレイライブラリーを、組換えタンパク質を使用してプローブした。簡単に言えば、ファージ粒子をビオチン化抗原（ヒトＧＰＣ３ Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１１９－ＧＰ；カニクイザルＧＰＣ３ ＤＧＰＩ ＤＨＳ－ＨＩＳ、自社生産（受託番号Ｐ５１６５４；Ｑ３－Ｒ３５８；Ｓ３５９－Ｈ５５９、Ｓ４９５Ａ、Ｓ５０９Ａ）；標準的なプロトコールを使用してすべてビオチン化）に、５０ｎＭ（２％Ｍａｒｖｅｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ中で）で、添加した。ビオチン化抗原を、ストレプトアビジンまたは抗ビオチンでコーティングされた磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に捕獲した。非結合ファージを洗い流した（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳを使用）；結合したファージをトリプシン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）の添加により溶出させた。溶出させたファージを指数関数的に増殖する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ－１細胞に感染させて、後続の選択ラウンド（ヘルパーファージによるレスキュー後）のために、および／または寒天プレート上にプレーティングした後の個々のクローンのスクリーニングのためにいずれかで使用した。このために、個々のコロニーを０．５ｍＬの培地を含有する９６ディープウェルプレートに選別し、一晩増殖させた。各クローンの一晩培養物８０μＬを２×ＴＹ中の６０％グリセロールの４０μＬと混合し、－８０℃で保存した。

【0254】

ＩＳＶＤの小さいスケールの生産のために、９６ディープウェルプレート（１ｍＬ体積）に一晩培養物を接種した。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによって、ＩＳＶＤ発現を誘導した。細胞ペレットを凍結し、１００μＬのＰＢＳ中でそれを溶解させることによって、ペリプラズム抽出物を調製した。死細胞片を遠心分離によって除去した。

【0255】

ペリプラズム抽出物を、ＥＬＩＳＡで、ヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３への結合に関してスクリーニングした。３８４ウェル高結合ＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、６００７５０９）を、４℃で、１μｇ／ｍＬのタンパク質（ＰＢＳ中）で一晩コーティングした。次いでプレートを室温で少なくとも１時間ブロックした（ＰＢＳ、１％カゼイン）。ペリプラズム抽出物の１：１０希釈物（ＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中）を室温で１時間添加した。非結合のペリプラズム抽出物を洗い流し（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）、結合したＩＳＶＤを、マウス抗ＦＬＡＧ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８５９２）および後続の基質ｅｓＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン；ＳＴＤ）の存在下での酵素反応を使用して検出した。

【0256】

ＥＬＩＳＡで陽性ヒットをＤＮＡシーケンシングし、非重複クローンをヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３でのオフレート、ならびにヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３を発現する細胞への結合についてさらに分析した。

【0257】

ＩＳＶＤのオフレートを、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で決定した。ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップを、カニクイザルグリピカン－３ ΔＧＰＩ－ＨＩＳ（自社生産；受託番号Ｐ５１６５４；Ｑ３－Ｒ３５８；Ｓ３５９－Ｈ５５９）およびヒトＧＰＣ３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１１９－ＧＰ）でコーティングした。ペリプラズム抽出物を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（１６７－２７２０、ＢｉｏＲａｄ））で１：１０に希釈した。実験を２５℃で実行した。得られたデータを、参照レーンの減算ならびにブランク緩衝液注入の減算によって二重参照した。処理した曲線を、ラングミュア解離（オフレート分析）モデルに基づくオフレート分析に使用した。

【0258】

それぞれ、ヒトＧＰＣ３（受託番号Ｐ５１６５４；Ｑ２５－Ｒ３５８、Ｓ３５９－Ｈ５８０）またはカニクイザルＧＰＣ３（受託番号Ｐ５１６５４；Ｑ３－Ｒ３５８；Ｓ３５９－Ｈ５５９）のいずれかを発現するＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ６０１０）を使用して、フローサイトメトリーでペリプラズム抽出物をヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３結合についてスクリーニングした。簡単に言うと、１×１０^５個の細胞を１：５に希釈したペリプラズム抽出物中で４℃で３０分間インキュベートし、次いで３回洗浄した。対照として、親ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ６０１０）を含めた。次に、細胞を１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ１８０４）と共に４℃で３０分間インキュベートし、再度洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥ標識抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－１１５－１６４）と共に４℃で３０分間インキュベートした。サンプルを洗浄し、５ｎＭのＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｔ３６０５）を補充したＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％アジ化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）を含むＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液をＦＡＣＳアレイ上で分析した。前方／側方散乱およびＴＯＰＲＯ３チャネル蛍光パラメーターを使用して、生で、無傷の細胞に対してゲーティングを設定した。非結合ＩＳＶＤを含む対照条件について得られた値よりも高い平均ＰＥチャネル蛍光値は、ヒットを示した。

【0259】

オフレート分析およびヒトおよびカニクイザルのＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞への結合（表２）に基づいて、２つのＩＳＶＤを選択した（表１）。

【0260】

【表11】

【0261】

【表12】

【0262】

６．２ 実施例２：三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤベースのＴ細胞エンゲージャーの生成
選択された抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ（表１の配列）を、Ｎ末端でＴＣＲの定常ドメインに結合する固定したＴ細胞エンゲージャーＩＳＶＤ（Ｔ０１７００５６Ｇ０５、抗ＴＣＲ）およびＣ末端で固定したアルブミン結合ＩＳＶＤ（ＡＬＢＸ００００１）と共に、三重特異性構築物にフォーマット化した。構築物中のビルディングブロックは、フレキシブルな３５ＧＳ（ＧｌｙＳｅｒリンカー）によって遺伝学的に連結され、結果として様式抗ＴＣＲ－３５ＧＳ－抗ＧＰＣ３－３５ＧＳ－ＡＬＢＸ００００１（表３）をもたらす。アミノ酸配列は、表Ａ－６に示される。

【0263】

多価ＩＳＶＤを、ピチア・パストリス中で発現させた。目的のＩＳＶＤ構築物を含有するＰ．パストリスＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０細胞をＢＧＣＭ培地で増殖させた。その後、培地をＢＭＣＭに切り替え、構築物はさらに増殖させ、メタノールの段階的な添加によって誘導した。細胞を遠心分離し、上清（分泌されたＩＳＶＤを含有する）を収集した。

【0264】

多価ＩＳＶＤをプロテインＡ樹脂で精製し、続いて脱塩工程を行い、必要に応じてＤ－ＰＢＳで分取ＳＥＣを行った。

【0265】

【表13】

【0266】

６．３ 実施例３：三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーのＴ細胞依存性細胞傷害性
抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤを含有する三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（表３）を、Ｔ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣ）で特徴付けた。ＧＰＣ３の高発現を有する肝臓がん細胞株であるＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ、クローンＨＢ８０６５）を、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４６２４）で標識し、Ａ０２２６０１５Ａ０８またはＡ０２２６０１８Ｃ０８（すなわち、それぞれ、構築物Ａ０２２６０００３１またはＡ０２２６０００２７）を含む三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー構築物の存在下での、様式抗ＴＣＲ－３５ＧＳ－抗ＧＰＣ３－３５ＧＳ－ＨＬＥ（ＨＬＥ＝半減期エクステンダー）で参照ＧＰＣ３結合単一抗体ドメイン（Ａｂ１）を有する構築物の存在下での、Ｔ細胞死滅のための標的として使用した。この目的を達成するために、プレート（９６ウェルＦ底、Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５１８０）を２００μＬ／ウェルのアッセイ培地でプレブロックした（２時間、３７℃）。各アッセイ成分の同時添加を、総量２００μＬ／ウェルで実行した：（１）５０μＬの希釈／滴定化合物（Ｎｂｓ；Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｂ７６５１））；（２）２５μＬの希釈ＨＳＡ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８７６３－１０Ｇ）（最終濃度：３０μＭ）；（３）２５μＬの希釈Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｒｅｄ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４６３２）（最終濃度：２５０ｎＭ）（４）１５：１の比にある、５０μＬのヒトＴ細胞（Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｔ細胞濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、カタログ番号１５０６１）を使用してバフィーコート（Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）から分離した）および５０μＬのＨｅｐＧ２ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎ（ＤＮＥＭ中新鮮、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ピルビン酸、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６）。全ての３つのチャンネル（位相差、緑色および赤色）での読取り向けに、４または６時間の間隔で、合計７２時間、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭの中に置いた。

【0267】

試験した三重特異性ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーは、図１に示すように、ＨｅｐＧ２ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎのヒトＴ細胞媒介性死滅を用量依存的に誘導した。ＩＣ５０値および死滅の最大パーセンテージは表４に示される。

【0268】

【表14】

【0269】

６．４ 実施例４：ＧＰＣ３バインダーのエピトープビニング
抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤのエピトープビニングをフローサイトメトリーを介して行い、１価ＩＳＶＤ Ａ０２２６０１５Ａ０８またはＡ０２２６０１８Ｃ０８のペリプラズム抽出物が、精製した三重特異性様式のＩＳＶＤと競合することを可能にした。この目的を達成するために、４×１０^４個のヒトＧＰＣ３ ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（参照、実施例１を参照）を、ペリプラズム抽出物の１／１５および１／１５０の希釈物、１５０ｎＭの競合物（三重特異性ＩＳＶＤ様式；過飽和濃度）ならびに０．２μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ１８０４）およびラット抗マウスＡＰＣ（ＢＤ－Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５０８７４）と共に、室温および３００ｒｐｍで５時間インキュベートした。サンプルをｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで読み出した。Ａ０２２６０１５Ａ０８とＡ０２２６０１８Ｃ０８の間に競合は観察されず、したがって、これらが異なる、非重複のエピトープに結合することが明らかとなった。

【0270】

６．５ 実施例５：ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーのための様式の最適化
表３に記載される様式のＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーは、死滅の最大パーセンテージによって示されるように、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣ）ＨｅｐＧ２ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおいて完全な効能に達しない（実施例３）。効力および効能を高めるために、抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤが、Ｎ末端で、抗ＴＣＲ ＩＳＶＤ Ｔ０１７００５６Ｇ０５の配列最適化されたバリアント、すなわちＴ０１７０００６２４と、Ｃ末端で、アルブミン結合ＩＳＶＤ、ＡＬＢ２３００２－Ａ（Ｃ末端単一のアラニン伸長を有する配列番号５）と、構築物の中央位置のＧＰＣ３結合ＩＳＶＤとで、組み合わされている、三重特異性構築物を生成した（表５および６）。最適化は２つの工程を包含した：工程１ － 抗ＴＣＲ ＩＳＶＤと抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ（三重特異性３価様式）の間のリンカー長さの最適化；工程２ － バイパラトピックＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャー（三重特異性４価様式）の生成および２つのＧＰＣ３結合ＩＳＶＤ間のリンカー長さの最適化。アミノ酸配列は、表Ａ－６に示される。

【0271】

生成された様式を、実施例３に記載されるように、ＴＤＣ ＨｅｐＧ２ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイで試験した。工程１様式および工程２様式の分析を、それぞれ播種７２時間後または６０時間後に実行した。

【0272】

表５および６は、ＴＤＣ ＨｅｐＧ２ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎアッセイにおける様式最適化の、それぞれ、工程１および工程２における様々な様式のＩＣ５０値および最大％の死滅を示す。

【0273】

工程１において、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーは、抗ＴＣＲ ＩＳＶＤと抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤの間のリンカーの長さを短くすることに伴い、７２％（３５ＧＳリンカー）から９４％（ＡＡＡリンカー）へと、向上した効能を有する細胞腫瘍死滅（向上した最大死滅）を示した（図２）。工程２において、Ａ０２２６０１８Ｃ０８とＡ０２２６０１５Ａ０８を、同じ構築物内で組み合わせ、２つのビルディングブロック間で異なる配置で異なるリンカー長さを用いて配置している、ＧＰＣ３バイパラトピックＴ細胞エンゲージャーを試験した。ここで、効能に対する試験した変数の影響は観察されなかった（図３）。

【0274】

【表15】

【0275】

【表16】

【0276】

高レベルのＨｅｐＧ２と比較して中間レベルのＧＰＣ３を発現する肝がん細胞株を死滅させる能力を評価するために、ＴＤＣ Ｈｕｈ７アッセイを実行した。この目的を達成するために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）（Ａｃｅａ）システムを使用した。まず、４×濃度（１２０μＭ）のＡｌｂｕｒｅｘ ２０ヒト血清アルブミン（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、カタログ番号２１６０－９７９）と共に５０μＬのアッセイ培地（最終アッセイ濃度３０μＭ）を含有する９６ウェルＥ－プレート（Ａｃｅａ、カタログ番号５２３２３６８００１）を、バックグラウンド測定のためにｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）内部に置いた。バックグラウンド測定後、各アッセイ成分の同時添加を総量２００μＬ／ウェルまで実行した：（１）５０μＬの希釈／滴定化合物；（２）５０μＬのＨｕｈ７（ＨＳＲＲＢ、クローンＪＣＲＢ０４０３）の単一細胞懸濁液；（３）エフェクター：標的比１５：１にマッチする、エフェクター細胞（ヒトＴ細胞、実施例３に記載されるように得られる）５０μＬの単一懸濁液。プレートを、１５分間隔での４００スイープの条件でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）中に置いた。適切な時点（約６０時間）で、電気抵抗値（ＣＩ）を分析したが、この場合、０のＣＩは１００％死滅を表した。

【0277】

ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの様式最適化の第３の工程において、抗ＴＣＲ ＩＳＶＤ Ｔ０１７０００６２４を、３価様式および４価様式のシーケンシングされた最適化バリアントＴ０１７０００６８０（ＴＣＥ０１、配列番号２）で置換した。効力および効能を、上述した通り、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７ ＴＤＣアッセイで評価した。様式、その説明、および機能性は表７に要約される。データは図４に図示される。様式最適化の第３の工程により、構築物全体で効能のさらなるわずかな向上がもたらされた。このエクササイズから、ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャー様式Ａ０２２６００１６７およびＡ０２２６００１６８を先に進めた。

【0278】

ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの様式最適化の工程４は、抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤと抗ＴＣＲ ＩＳＶＤの配置を変更することで構成されたが、このことは効能に関する効力に対して影響を与えた（表８、図５）。３価様式の場合、死滅効能は失われた。４価様式の場合、効力および効能が低下していようが、機能性は依然として観察することができた；死滅効能は、ＨｅｐＧ２ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ ｇｒｅｅｎでは２０％だけ、Ｈｕｈ７では４０％だけ低下した。さらに、抗アルブミンＩＳＶＤと抗ＧＰＣ３ ＩＳＶＤの配置を変更することはまた、死滅の効能に対して影響を有した。このエクスサイズから、ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャー様式Ａ０２２６００１６７およびＡ０２２６００１６８に変更はなされなかった。

【0279】

ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの様式最適化の工程５は、リンカー長さを変化させることで構成された（表９、図６）。３価様式の抗アルブミンＩＳＶＤの前のリンカー長さを短くすると、効能の低下がもたらされた。これは４価様式では見られず、したがってこの場合、９ＧＳ～３５ＧＳのリンカー長さを選択することができる。

【0280】

ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャー様式のセットから、Ａ０２２６００１６７およびＡ０２２６００１６８は、ＴＤＣアッセイにおいて最も高い効力および効能を備える三重特異性の３価および４価の様式を表す。効能は匹敵するが、３価様式Ａ０２２６００１６７と４価様式Ａ０２２６００１６８とは効力が異なる。ＨｅｐＧ２ ＴＤＣアッセイにおいて、Ａ０２２６００１６７はＡ０２２６００１６８よりも５分の１小さい効力であるが、一方、Ｈｕｈ７ ＴＤＣアッセイにおいてその差は５０倍に増加する。

【0281】

【表17】

【0282】

【表18】

【0283】

【表19】

【0284】

６．６ 実施例６：可溶性ＧＰＣ３の存在下でのＴ細胞活性化誘導の評価
ＧＰＣ３は可溶性の形態で循環中に放出され、ＨＣＣ患者の最大５０％においてレベルが増加する場合がある。循環中の可溶性ＧＰＣ３抗体凝集体によって、免疫複合体の沈着および関連する傷害性にいたる恐れがある。したがって、ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの存在下で可溶性ＧＰＣ３のＴ細胞活性化に対する効果を評価することが重要である。

【0285】

ＧＰＣ３の報告された血清レベルは、０．１～１０ｎＭに相当する１０～３００ｎｇ／ｍＬの間で変動する可能性がある。評価を、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーＡ０２２６００１６７および１６８の存在下で、１、１０、および１００ｎＭの可溶性ＧＰＣ３を使用して、３つの方法で行った：
（１）標的細胞（Ｈｕｈ－７）および可溶性ＧＰＣ３の存在下での細胞傷害性（図７Ａ）：可溶性ＧＰＣ３の非存在下と比較して、追加の死滅は観察されなかった；
（２）標的細胞および可溶性ＧＰＣ３の存在下でのＣＤ６９の上方制御（図７Ｂ）：可溶性ＧＰＣ３の非存在下と比較して、追加のＴ細胞活性化は観察されなかった；
（３）標的細胞の非存在下および可溶性ＧＰＣ３の存在下でのＣＤ６９の上方制御（図７Ｃ）：Ｔ細胞の活性化は見られなかった。したがって、可溶性ＧＰＣ３の上昇した血清レベルに起因する傷害性効果のリスクは低いと考えられる。

【0286】

Ｈｕｈ－７に対する細胞傷害性アッセイを、実施例５に記載されているように実行した。Ｔ細胞上のＣＤ６９発現を、抗ＣＤ６９抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、カタログ番号５５７０５０）および抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、カタログ番号５５６６５０）を使用するフローサイトメトリーによって決定した。

【0287】

６．７ 実施例７：ＧＰＣ３媒介性Ｔ細胞エンゲージャー内部移行
ＧＰＣ３は内部移行することが知られており、その内部移行速度は化合物の効能に対して影響を有する可能性がある。Ａ０２２６００１６７およびＡ０２２６００１６８と等価の三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの、および参照ＣＤ３－ＧＰＣ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体（Ａｂ２）の存在下での内部移行速度およびＧＰＣ３受容体密度を（表１０）、Ｈｕｈ－７細胞で４８時間の時間経過にわたり評価した。

【0288】

内部移行を、Ａ０２２６００１６７およびＡ０２２６００１６８およびＡｂ２をｐＨＡｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９８４１）で、これはｐＨ＞７では低蛍光および溶液のｐＨが酸性になると蛍光の増強を有するｐＨセンサー色素であるが、標識することによって、決定した。この標識に当たり、標識の単一部位挿入を有するように、Ｃ末端に外部の－ＧＧＣを備える様式を生成した（表１０）：Ａ０２２６００１６７－ＧＧＣはＡ０２２６００３７０に対応し、Ａ０２２６００１６８－ＧＧＣはＡ０２２６００３７２に対応し、対照としてＧＰＣ３ ＩＳＶＤのない様式、Ａ０２２６００３７３を生成した。アッセイを、黄色レーザーを備えるＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙで読み出した（ｐＨＡｂ：５３２ｎｍで励起最大、５６０ｎｍで発光最大）。内部移行速度を、０．５時間での４℃と比較して、３７℃での様々な時点（０．５時間、３時間、２４時間および４８時間）での内部移行を定量化することによって決定した（表１０、図８Ａ）。

【0289】

受容体の発現を、Ａ０２２６００１８Ｃ０８およびＡ０２２６００１５Ａ０８とは異なるＧＰＣ３エピトープに結合する固定濃度の３×ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ６タグ付きＩＳＶＤ（２０ｎＭ）を、赤色レーザーを備えるＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ上で検出するためのＡＰＣ標識抗ＦＬＡＧと組み合わせで使用して、決定した（表１０、図８Ｂ）。

【0290】

内部移行速度を、任意の単位を有する反応速度論曲線のスロープとして計算した。三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーは、参照二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＡｂ２よりも遅い内部移行速度を示す。ＧＰＣ３結合ＩＳＶＤ（Ａ０２２６００３７３）のない対照様式が内部移行を示さないので、ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの内部移行は、ＧＰＣ３媒介性である。４８時間以内のＧＰＣ３細胞表面発現の減少はまったく観察されなかった（表１０、図８）。

【0291】

【表20】

【0292】

６．８ 実施例８：がん細胞株のＧＰＣ３発現プロファイリングおよびＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの機能性との相関
がん細胞株のパネルに関するＧＰＣ３タンパク質発現レベルを、免疫細胞化学（ＩＣＣ）および製造業者の説明書に従ってＱＩＦ１ＫＩＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｋ００７８）を使用することの両方によって決定した（表１１）。加えて、免疫組織化学（ＩＨＣ）を、肝細胞癌サンプルおよび正常腎臓サンプルで実行した。

【0293】

ＩＣＣおよびＩＨＣを、Ｖｅｎｔａｎａ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴロボット（Ｖｅｎｔａｎａ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈｅ）を使用して実行した。細胞株および組織サンプルを最初に４％ホルマリンで固定し、その後パラフィン包埋した。脱パラフィン後、細胞を緩衝液ＣＣ１標準（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号９５０－１２４）を用いて９５℃の温度で４８分間コンディショニングし、続いてＢｌｏｃｋｅｒ ＡおよびＢ（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０－１０４）のそれぞれを用いて４分間のブロッキング工程を行った。マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ抗ＧＰＣ３抗体（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７９０－４５６４）を室温で６０分間適用し、続いて５ＭのＮａＣｌ中の０．０５％グルタルアルデヒド（Ｐｒｏｌａｂｏ、カタログ番号２０８７９－２３８）で４分間の固定を行った。抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ；カタログ番号７６０－１０８）中１／２００希釈でのビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０８０－０８０）を室温で３２分間適用した。検出を、ＤＡＢＭａｐ Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ；カタログ番号７６０－１２４）を用いて実行した。切片をヘマトキシリンＩＩ（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７９０－２２０８）で４分間対比染色し、青味剤（Ｖｅｎｔａｎａ、カタログ番号７６０－２０３７）で４分間色出しを行い、続いて脱水、および、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ＸＹＬ（Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８３１２－４）での封入を行った。細胞の染色強度（０：染色なし、１（または＋）：弱、２（または＋＋）：中度；３（または＋＋＋））：強として等級付け）と、あらゆる強度カテゴリーにおける陽性細胞のパーセンテージとの両方に関する半定量的評価によって、免疫組織化学的染色を評価した。ヒストスコア（Ｈスコア）を以下の式に従って算出した：
Ｈスコア＝３×（等級３の細胞の％）＋２×（等級２の細胞の％）＋１×（等級１の細胞の％）。

【0294】

文献（Ｄｅｔｒｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９５；４８：８７６～８７８頁およびＬｕｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｔｅｘ Ｃｌａｓｓ ｆｉｌｅｄ、２０１５年８月、第１４巻、８号）に記載されているように、あり得るスコアの範囲は０から３００までであった。ＨＣＣにおけるＨスコアの決定は、ＧＰＣ３の膜発現の評価に基づいた。

【0295】

ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）で決定されているように、試験した細胞株のパネル内で、Ｈｅｐ－Ｇ２（ＡＴＣＣ、クローンＨＢ－８０６５；５．２Ｅ５受容体／細胞）が最も高いレベルのＧＰＣ３発現を示し、これにＮＣＩ－Ｈ６６１（ＡＴＣＣ、クローンＨＴＢ－１８３；３．４Ｅ５受容体／細胞）およびＨｕｈ－７（ＨＳＲＲＢ、クローンＪＣＲＢ０４０３；６．８Ｅ４受容体／細胞）が続いたが、後者を中間の発現細胞株とみなした。これらの細胞株は、重要なＧＰＣ３発現固形腫瘍である肝臓がんおよび肺がんに由来した。ＩＣＣでなんら染色を示さなかった、低または極低のＧＰＣ３発現細胞株は、ＭＫＮ－４５（ＤＳＭＺ、クローンＡＣＣ４０９；１．５Ｅ４受容体／細胞）、ＮＣＩ－Ｈ２３（ＡＴＣＣ、クローンＣＲＬ－５８００；２．６Ｅ３受容体／細胞）、ＢｘＰＣ－３（ＡＴＣＣ、クローンＣＲＬ－１６８７；１．５Ｅ３受容体／細胞）およびＮＣＩ－Ｈ２９２（ＡＴＣＣ、クローン）ＣＲＬ－１８４８；６Ｅ２受容体／細胞）であった。

【0296】

がん細胞株と患者の腫瘍サンプルの間の比較の場合、両方についてＨスコアを決定した。ＩＣＣにおけるＧＰＣ３陽性がん細胞株、すなわちＨｕｈ－７、ＮＣＩ－Ｈ６６１およびＨｅｐＧ２は、８０より優れたＨスコアを示したが（表１１）、これは、ＩＨＣにおけるＧＰＣ３陽性肝細胞癌（ＨＣＣ）サンプルについて決定された平均Ｈスコア、８０、７５に相当する（表１２）。正常な腎臓のＧＰＣ３陽性サンプルは平均Ｈスコア０．７５を示し（表１２）、一方、がん細胞株ＭＫＮ－４５、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＢｘＰＣ－３およびＮＣＩ－Ｈ２９２はＧＰＣ３染色に関して陰性であった（表１１）。これらの細胞株を、ＧＰＣ３正常様発現レベルの細胞の代表とした。

【0297】

がん細胞株の同じパネルを用いる三重特異性ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーの機能性を評価するために、実施例５に記載されているように、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用してＴＤＣアッセイを実行した；結果は表１３および図９に示される。ＧＰＣ３高発現細胞株、Ｈｅｐ－Ｇ２およびＮＣＩ－Ｈ６６１の場合、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーＡ０２２６００１６７およびＡ０２２６００１６８は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＡｂ２と比較して、同様の効力（ＮＣＩ－Ｈ６６１）および１０分の１低い効力（Ｈｅｐ－Ｇ２）を示す。中間の発現細胞株、Ｈｕｈ－７の場合、Ａ０２２６００１６８は、ＧＰＣ３へのバイパラトピック結合を有する４価様式は、Ａｂ２と同じ効力を示すが、一方、３価様式Ａ０２２６００１６７の効力は１０分の１である。ＧＰＣ３低発現細胞株、ＭＫＮ－４５およびＢｘＰＣ－３の場合、Ａｂ２はｎＭ範囲の効力を示すが、一方、三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーは死滅効果をまったく示さない。極低のＧＰＣ３発現細胞株、ＮＣＩ－Ｈ２９２の場合、化合物はいずれも効果を示さない。ＧＰＣ３結合ＩＳＶＤを欠くＴ細胞エンゲージャー、Ｔ０１７０００６９８は、どの細胞株に対してなんら死滅効果を示さず、このことによって確認されるところは、三重特異性ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャーのＧＰＣ３特異的効果である。

【0298】

結論として、Ａｂ２は、細胞あたり１，０００個の受容体およびＨスコア０と低いＧＰＣ３発現レベルでがん細胞株を死滅させることができる効力のあるＴ細胞エンゲージャーである。それに対し、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー様式は、ＨＣＣサンプルおよび大細胞肺がんサンプルに類似のＨスコアを有するＧＰＣ３高および中発現のがん細胞株を強力に死滅させるが、一方、細胞あたり受容体１万個未満でＧＰＣ３レベルを発現し、正常な腎臓サンプルの平均未満のＨスコアを有する細胞株を、免れさせる。

【0299】

【表21】

【0300】

【表22】

【0301】

【表23】

【0302】

６．９ 実施例９：Ａ０２２６０１５Ａ０８およびＡ０２２６０１８Ｃ０８の配列最適化
ＩＳＶＤ Ａ０２２６０１５Ａ０８およびＡ０２２６０１８Ｃ０８をさらに配列最適化した。

【0303】

配列最適化は、ＩＳＶＤの１つまたはそれ以上の（望ましい）特性を改善するために、配列中の１つまたはそれ以上の特異的なアミノ酸残基を置き換えることを含む。

【0304】

このような配列最適化の一部の例は、本明細書に記載のさらなる説明で述べられており、その例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
１）ヒトＶＨ３－ＪＨ生殖細胞系コンセンサス配列とより同一なＩＳＶＤ配列を得るための、親野生型ＩＳＶＤ配列における置換であり、これは、ヒト化と称されるプロセスである。この目的を達成するために、いわゆる特徴的な残基を除き、ＩＳＶＤとヒトＶＨ３－ＪＨ生殖細胞系コンセンサスとの間で異なるＦＲ中の特定のアミノ酸が、タンパク質構造、活性および安定性が無傷のまま維持されるような方法でヒト対応物に変更される。

【0305】

２）ＩＳＶＤの安定性を増加させるための、ラマ生殖細胞系に対する置換であり、これは、ラクダ化と定義される。この目的を達成するために、親野生型ＩＳＶＤアミノ酸配列を、ＩＳＶＤのラマＩＧＨＶ生殖細胞系アミノ酸配列に対してアライメントする（ラマＩＧＨＶ生殖細胞系に対するＩＳＶＤのＢｌａｓｔＰ分析から上位のヒットとして同定された）。

【0306】

３）ここでも望ましい宿主細胞または宿主生物に応じて、貯蔵下での長期の安定性または特性を改善する置換、望ましい宿主細胞または宿主生物における発現レベルを増加させる置換、および／または（望ましくない）翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）を除去または低減する置換。

【0307】

４）１１位におけるＶａｌに対する突然変異および８９位におけるＬｅｕに対する突然変異（Ｋａｂａｔの番号付けによる）は、あらゆる天然に存在する既存の抗体の結合を最小化する。

【0308】

Ａ０２２６０１５Ａ０８の配列最適化は、親ＩＳＶＤクローンＡ０２２６０１５Ａ０８と比較して１３のアミノ酸置換（すなわちＬ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｖ２３Ａ、Ｐ４０Ａ、Ｄ５２ｃＥ、Ｎ５４Ｙ、Ｄ７３Ｎ、Ｋ７６Ｎ、Ｄ７９Ｙ、Ｋ８３Ｒ、Ｇ８８Ａ、Ｖ８９Ｌ、Ｆ９１Ｙ）を含む、最終的な配列最適化されたバリアントＡ０２２６００３１４（表１４）をもたらした。

【0309】

Ａ０２２６０１８Ｃ０８の配列最適化は、親ＩＳＶＤクローンＡ０２２６０１８Ｃ０８と比較して、８つのアミノ酸置換（すなわちＬ１１Ｖ、Ｖ２３Ａ、Ｇ５４Ａ、Ｒ６０Ａ、Ｅ８１Ｑ、Ｔ８２ａＮ、Ｎ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含むＡ０２２６００３４５と８つのアミノ酸置換（すなわちＬ１１Ｖ、Ｖ２３Ａ、Ｇ５４Ｋ、Ｒ６０Ａ、Ｅ８１Ｑ、Ｔ８２ａＮ、Ｎ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含むＡ０２２６００３５１との、２つの配列最適化されたバリアント（表１４）をもたらした。

【0310】

【表24】

【0311】

親ＩＳＶＤと比較した配列最適化バリアントの特性を、以下の通りに評価した：
実施例１に記載されるように、フローサイトメトリーによって、バリアントを、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ－７およびＣＨＯ Ｆｌｉｐ－Ｉｎカニクイザル－ＧＰＣ３細胞への結合について評価した。

【0312】

バリアントの熱安定性を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用するサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）で試験した。このアッセイでは、親ＩＳＶＤおよびそのバリアントは、異なるｐＨで、ＳＹＰＲＯ（商標）オレンジの存在下でインキュベートされ、温度勾配が適用される。ＩＳＶＤが変性を開始させたら、ＳＹＰＲＯ（商標）オレンジが結合し蛍光の上昇がもたらされ、その結果、特定のｐＨにつき融解温度（Ｔｍ）の決定が可能となる。

【0313】

結果は、表１５および表１６に要約される。

【0314】

【表25】

【0315】

【表26】

【0316】

親ＩＳＶＤ Ａ０２２６０１５Ａ０８と比較して、Ａ０２２６００３１４は、ヒトＧＰＣ３またはカニクイザルＧＰＣ３を発現する様々な細胞株に対する結合効力において２分の１を下回る低下を呈した。Ｔｍはわずかに５℃だけ、許容値内で低下した。Ａ０２２６００３１４の参照ｈＩＧＨＶ３－２３ＳＯ／ＩＧＨＪ４と比較したフレームワーク領域のフレームワーク同一性％は、ＡｂＭ定義に基づいて８８．８％であり（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）による、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、２０１０を参照）、Ｋａｂａｔの定義に基づいて８５．１％である。

【0317】

親ＩＳＶＤ Ａ０２２６０１８Ｃ０８と比較して、ヒトＧＰＣ３またはカニクイザルＧＰＣ３を発現する様々な細胞株に対するバリアントＡ０２２６００３４５およびＡ０２２６００３５１の結合効力は、２倍上昇した。バリアントＡ０２２６００３４５およびＡ０２２６００３５１のＴｍは、それぞれ、７５℃および７４℃に上昇した。Ａ０２２６００３４５とＡ０２２６００３５１の両方について、参照ｈＩＧＨＶ３－２３ＳＯ／ＩＧＨＪ４と比較したフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭ定義に基づいて８９．９％、Ｋａｂａｔ定義に基づいて８９．７％である。

【0318】

６．１０ 実施例１０：三重特異性配列最適化ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーの生成
配列最適化ＧＰＣ３ ＩＳＶＤＡ０２２６００３１４（Ａ０２２６０１５Ａ０８の最適化バリアント）、Ａ０２２６００３４５およびＡ０２２６００３５１（Ａ０２２６０１８Ｃ０８の最適化バリアント）を、表１７に記載されるようなビルディングブロックとリンカー長さの最適な組合せの評価用の５つの三重特異性ＧＰＣ３ Ｔ細胞エンゲージャー様式の生成のために使用した。

【0319】

【表27】

【0320】

実施例８に記載されているように、選択された５つの様式を、機能性について異なるがん細胞株を用いてｘＣＥＬＬｉｎｇｅｎｃｅベースのＴＤＣアッセイで試験した。結果は表１８に表される。ＧＰＣ３高および中発現の細胞株ＨｅｐＧ２、ＮＣＩ－Ｈ６６１およびＨｕｈ－７の場合、３価の様式と比較して、４価の様式についてはより高い効力が得られた。ＧＰＣ３高発現の細胞株ＮＣＩ－Ｈ６６１の場合、４価の様式Ａ０２２６００４２４およびＡ０２２６００４２７は、Ａ０２２６００４２５およびＡ０２２６００４２６よりも効力がある。ＧＰＣ３低発現の細胞株、ＮＣＩ－Ｈ２３およびＢｘＰＣ－３の場合、死滅効果の欠如を、すべての三重特異性ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャー様式に対して確認した。

【0321】

図１０は、選択された５つのＩＳＶＤ様式に対して異なる３つのＴ細胞ドナーを使用する、細胞株ＮＣＩ－Ｈ６６１およびＢｘＰＣ－３によって例示される、ｘＣＥＬＬｉｎｇｅｎｃｅベースのＴＤＣアッセイの用量依存性死滅曲線を示す。

【0322】

【表28】

【0323】

選択された５つ様式への既存の抗体の結合を、ＳＰＲベースのセットアップを使用して評価した（実施例１４）。図１１が示すところは、すべての様式に対して、低レベルの既存の抗体の結合のみが観察され、開発可能性の要件と適合したことである。

【0324】

ピチア・パストリスにおける成績を、５Ｌ発酵槽規模での上流処理（ＵＳＰ）過程の生成物力価および純度、ならびに下流処理（ＤＳＰ）後の収率に焦点を合わせて、５つの様式について評価した（表１９）。Ａ０２２６００４２４およびＡ０２２６００４２６を、高分子量（ＨＭＷ）種のパーセンテージが低いことと、ＲＰＣ上でバリアントのパーセンテージが低いことと、高力価および最良の総合ＤＳＰ収率とを兼ね備える、好ましいＩＳＶＤ開発候補として特定した。

【0325】

【表29】

【0326】

ＧＰＣ３駆動性殺傷効力と、既存の抗体への結合の減少と、ピチアにおける成績との最良の組合せに基づいて、Ａ０２２６００４２４を開発候補として選択した。

【0327】

６．１１ 実施例１１：ＧＰＣ３、ＴＣＲａｂおよび血清アルブミンに対するＡ０２２６００４２４の結合および親和性
以下に対するＡ０２２６００４２４の、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって定量化した：ヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３（それぞれ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１１９－ＧＰ、および自社生産（受託番号Ｐ５１６５４、Ｑ３－Ｒ３５８、Ｓ３５９－Ｈ５５９））；ヒトおよびカニクイザルＴＣＲａｂ（どちらも自社生産、この場合、アルファ鎖およびベータ鎖の細胞外ドメインが二量体化向けにジッパーペプチドに融合されている；受託番号：ヒトアルファ鎖Ｐ０１８４８、ヒトベータ鎖Ｐ０１８５０；カニクイザルアルファ鎖の予測配列はヒトと同一である、カニクイザルβ鎖の予測配列は４つのａａ：Ａ１２５Ｖ、Ｅ１３６Ｖ、Ｖ１６７Ｍ、Ｓ１７７Ｆ、で異なる）；ならびに、ヒト、カニクイザル、およびマウスの血清アルブミン（それぞれ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ８７６３、動物組織由来の自社生産、ＤｉｖＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅカタログ番号ＩＭＳＡ）。

【0328】

組換えＧＰＣ３タンパク質を、ＥＤＣおよびＮＨＳ化学反応（ランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ７．４）を使用して、アミンカップリングを介して、ＴＨＥ抗Ｈｉｓ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号ＡＢＩＮ３８７６９９）を固定したＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏｒａｄ）上に捕獲した。精製したＩＳＶＤを様々な濃度（０．３ｎＭ～１０００ｎＭ）で２分間注入し（流速４５μＬ／分）、解離を９００秒間フォローした。１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を１分間注入することによって（流速４５μＬ／分）、再生を実行した。データを、参照リガンドレーンおよびブランク緩衝液注入を引くことにより二重参照した。処理したセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアを使用して、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）に基づいて分析した。

【0329】

組換えＴＣＲタンパク質を、ＥＤＣおよびＮＨＳ化学反応（ランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ７．４）を使用して、アミンカップリングを介してＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏｒａｄ）上に固定した。精製したＩＳＶＤを様々な濃度（０．２ｎＭ～２００ｎＭ）で２分間注入し（流速９０μＬ／分）、解離を９００秒間フォローした。３ＭのＭｇＣｌ_２を３分間注入することによって（流速４５μＬ／分）、再生を実行した。データを、参照リガンドレーンおよびブランク緩衝液注入を引くことにより二重参照した。処理したセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアを使用して、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）に基づいて分析した。

【0330】

血清アルブミンタンパク質を、ＥＤＣおよびＮＨＳ化学反応（ランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ７．４）を使用して、アミンカップリングを介して、ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏｒａｄ）上に固定した。精製したＩＳＶＤを様々な濃度（０．２４ｎＭ～５００ｎＭ）で２分間注入し（流速４５μＬ／分）、解離を９００秒間フォローした。１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を４７秒間注入することによって（流速１００μＬ／分）、再生を実行した。データを、参照リガンドレーンおよびブランク緩衝液注入を引くことにより二重参照した。処理したセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアを使用して、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）に基づいて分析した。

【0331】

結果（表２０）は、Ａ０２２６００４２４がヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３と高い親和性で結合することを実証する。

【0332】

【表30】

【0333】

細胞発現のヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３へのＡ０２２６００４２４の結合を、ヒトおよびカニクイザルＧＰＣ３を過剰発現するＣＨＯ－ＦＩｐ－ｌｎ細胞、ならびにＨｕｈ－７細胞についてフローサイトメトリーによって評価し、１～２ｎＭのＥＣ５０値を得た（表２１）。

【0334】

ＥＣ３０の濃度で、それぞれ、ＴＣＲａｂ結合１価ＩＳＶＤ Ｔ０１７０００６２４およびＴ０１７０００６２３（Ｔ０１７００５６Ｇ０５バリアント）との競合において、Ａ０２２６００４２４を、ヒトおよびカニクイザルＴ細胞への結合について評価した。Ｔ細胞（実施例３に記載されるように得られるヒトＴ細胞およびＬＰＴ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ドイツ、から購入したカニクイザルＴ細胞）をアッセイの当日に解凍し、計数し、１Ｅ＋０６個の細胞／ｍＬの濃度に希釈し、これの後に、７５μＬをＶ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５１１８０）のウェルに添加した。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、２５μＬのＮｂおよび２５μＬの競合物質をウェルに添加した。Ｔ０１７０００６２４を、２×濃度の４Ｅ－０８Ｍ（ウェル内で２Ｅ－０８Ｍ）に希釈し、Ｔ０１７０００６２３を、２×濃度の１Ｅ－０７Ｍ（ウェル内で５Ｅ－０８Ｍ）に希釈し、Ａ０２２６００４２４を、８μＭ～７．８ｎＭの範囲にあるウェル中での最終濃度へと希釈した。細胞を再懸濁し、プレートを４℃で９０分間インキュベートし、その後、プレートを冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の５０μＬの１／１０００希釈Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ１８０４）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。プレートを冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の、５０μＬの１／１００希釈アロフィコシアニン結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－１３５－１６４）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。プレートを冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の、５５μＬの１／１０００希釈ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ４１７０）に再懸濁し、その後に、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）でデータを取得した。

【0335】

結果は表２１に示される。Ａ０２２６００４２４は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＴ細胞に、およそ２００ｎＭの親和性で、結合する。

【0336】

【表31】

【0337】

カニクイザルＴ細胞とのＡ０２２６００４２４の機能性を評価するために、実施例８に記載されているように、カニクイザルＴ細胞（ＬＰＴ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ドイツ）を使用して、Ｈｕｈ－７でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースのＴＤＣアッセイを実行した。カニクイザルとヒトのＴ細胞のＩＣ５０値は、同等であることが見出された（表２２）。

【0338】

【表32】

【0339】

６．１２ 実施例１２：ＧＰＣ３への結合に対するＡ０２２６００４２４の選択性
ＧＰＣ３のファミリーメンバー、すなわちＡ０２２６００４２４のＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＧＰＣ５およびＧＰＣ６への結合の非存在を、ＥＬＩＳＡによって評価し、Ａ０２２６００４２４のＧＰＣ４への結合の非存在を、ＳＰＲ（Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６）によって評価した。

【0340】

ヒトＧＰＣ１（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号４５１９－ＧＰ）、ヒトＧＰＣ２（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号２３０４－ＧＰ）、ヒトＧＰＣ３（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号２１１９－ＧＰ）、ヒトグリピカン－５（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号２６０７）－Ｇ５）およびヒトグリピカン－６（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２８４５－ＧＰ）を、３８４ウェルＨＢ ＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上に４℃で一晩直接コーティングした（２μｇ／ｍＬ、１×ＰＢＳ緩衝液）。翌日、プレートを６回洗浄し（ＡｑｕａＭａｘマイクロプレートウォッシャー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）、１×ＰＢＳ＋１％カゼインを用いて室温で２時間ブロックした。追加の６回の洗浄工程の後、Ａ０２２６００４２４（１×ＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、サンプルを除去し、続いて６回の洗浄工程を行い、抗ＩＳＶＤ ｍＡｂ ＡＢＨ００７７を、１７ｎＭの最終濃度（１×ＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で室温で１時間添加した。プレートを再度６回洗浄し、ＨＲＰに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｅａｍ、カタログ番号ａｂ９７０４０）（１／１２５０希釈；１×ＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）を、プレートに室温で１時間適用させた。６回の最終洗浄工程の後、ｅｓ（ＨＳ）ＴＭＢ基質（ＳＤＴ）を添加し、１０分後に１ＭのＨＣｌの添加によって反応を停止させた。プレートの吸光度を、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ装置（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）で波長４５０ｎｍおよび６２０ｎｍで測定し、データ分析向けにＯＤ_４５０～ＯＤ_６２０を計算しプロットした。

【0341】

組換えヒトＧＰＣ４／ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９１９５－ＧＰ）を、ＥＤＣおよびＮＨＳ化学反応（使用のランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ７．４）を使用して、アミンカップリングを介して、マウス抗ヒトＩｇＧ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）を固定したＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏｒａｄ）上に捕獲した。精製したＩＳＶＤを様々な濃度（４ｎＭ～１０００ｎＭ）で２分間注入し（流速４５μＬ／分）、解離を９００秒間フォローした。１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を１分間注入することによって（流速４５μＬ／分）、再生を実行した。データを、参照リガンドレーンおよびブランク緩衝液注入を引くことにより二重参照した。処理したセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアを使用して、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）に基づいて分析した。

【0342】

Ａ０２２６００４２４の試験したＧＰＣ３ファミリーメンバーのいずれへも、結合は検出されなかった。

【0343】

６．１３ 実施例１３：Ａ０２２６００４２４に対するヒト既存の抗体の反応性
Ａ０２２６００４２４への既存の抗体の結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して正常ヒト血清（ｎ＝９６）について評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として使用し、実験を２５℃で実行した。

【0344】

Ａ０２２６００４２４を、チップ上に固定されたＨＳＡへの、ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックの結合を介してセンサーチップ上に捕獲した。ＨＳＡを固定するために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μＬ／分）で活性化し、ＨＳＡを、ｐＨ４．５のＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中の１００μＬ／ｍｌで注入して、およそ２９００ＲＵの固定レベルにした。固定した後、表面をエタノールアミンＨＣｌ（流速３０μＬ／分）で不活性化した。

【0345】

その後、Ａ０２２６００４２４を、ＨＳＡ表面上に４５μｌ／分で２分にわたり注入して、ＩＳＶＤ捕獲レベルをおよそ８００ＲＵにした。既存の抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）で１：１０希釈し、その後、４５μｌ／分で２分にわたり注入し、それに続き、後続の４００秒の解離工程を行った。各サイクルの後（すなわち新しいＩＳＶＤ捕獲および血液サンプル注入工程の前に）、ＨＳＡ表面を、ＨＣｌ（１００ｍＭ）の４５μＬ／分で２分の注入を介して再生した。１）ＩＳＶＤ－ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンへの非特異的な結合を引くことによる二重の参照の後、既存の抗体結合を示すセンサーグラムを得た。１２５秒（会合終了から５秒後）に報告ポイントを設定することによって、既存の抗体の結合レベルを決定した。参照ＩＳＶＤの１２５秒での結合レベルに対する既存の抗体結合におけるパーセンテージの低減を計算した。

【0346】

４価のＩＳＶＤ様式Ａ０２２６００４２４は、抗ＴＣＲビルディングブロックについては突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ａ、各ＧＰＣ３においては突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌならびに血清アルブミン結合ビルディングブロックおよびＣ末端アラニンの導入によって既存の抗体結合の低減のために最適化されたことから、既存の抗体への結合は、対照の最適化されていない４価のＩＳＶＤ様式Ｆ０２７３０１０９９と比較してより実質的に少ないことが示される（図１１Ａ）。

【0347】

６．１４ 実施例１４：可溶性ＧＰＣ３の存在下におけるＡ０２２６００４２４によるＴ細胞活性化誘導の評価
可溶性ＧＰＣ３の存在下でのＡ０２２６００４２４によるＴ細胞活性化誘導を、実施例６に記載されるように評価した。Ａ０２２６００４２４は、その野生型バリアントＡ０２２６００１６８と同じ挙動を示した（図７）。

【0348】

６．１５ 実施例１５：インビトロ増殖Ｔ細胞を植え付けられたＨｕｈ－７腫瘍担持ＮＯＧマウスにおけるＡ０２２６００４２４のインビボ概念実証
腫瘍担持ＮＯＧマウスにおけるインビボ効能研究において、肝細胞癌Ｈｕｈ－７腫瘍細胞を皮下注射し、平均腫瘍体積約１５０ｍｍ^３に達するまで腫瘍を増殖させた。この時点で、インビトロで増殖させたＴ細胞をマウスに腹腔内で注射した。Ｔ細胞のＩＳＶＤ媒介性動員による腫瘍細胞の死滅を、腫瘍体積を測定し、腫瘍増殖の速度論を分析することによって評価した。腫瘍細胞死滅に対するＡ０２２６００４２４のインビボ効能を評価し、ＧＰＣ３特異性を欠く対照Ｔ細胞エンゲージャーＴ０１７０００６９８（配列番号７４、表Ａ－６）と比較した。

【0349】

詳細には、１００μＬのＨＢＳＳに再懸濁した２×ｌ０^６個のＨｕｈ－７腫瘍細胞をＮＯＧマウスに皮下注射した。腫瘍は、平均腫瘍体積およそ１５０ｍｍ^３に達するまで増殖させた。この時点で、２００μＬのＰＢＳに再懸濁した１０^７個のインビトロ増殖Ｔ細胞を各マウスの腹腔内で注射した（０日目）。Ｔ細胞のこの注射は、マウスを異なる群に無作為化して２４時間後に行った。静脈内で注射されるＡ０２２６００４２４による処置を、Ｔ細胞注射の３時間後、０日目に開始し、３日目、６日目、９日目および１２日目に継続した（ｑ３ｄ；図１２）。ＴＣＲ／ＧＰＣ３結合ポリペプチドの４つの用量レベル（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、および２ｍｇ／ｋｇ）を試験した。Ｔ０１７０００６９８を対照群に２ｍｇ／ｋｇで０日目、３日目、６日目、９日目および１２日目（ｑ３ｄ）に注射した。ヘパリン含有チューブへの生存の血液サンプリングを、６日目および１２日目に行って、抗体曝露を測定した。マウスを１５日目に殺処分し、血液および腫瘍組織を収集した。血液を、抗体曝露の測定に使用し、腫瘍組織を標的発現の分析（ＧＰＣ３）およびＴ細胞浸潤分析に使用した。

【0350】

腫瘍増殖速度論の結果を図１３に示す。Ｔ０１７０００６９８で処置したマウスを、２４日目の分析用の対照群として使用したが、この場合、対照マウスはすべて、エンドポイント基準（腫瘍体積２０００ｍｍ^３）に達していなかったので、生存していた。腫瘍停滞を誘導するための、Ａ０２２６００４２４対対照Ｔ０１７０００６９８の腫瘍増殖プロファイルにおいて、用量反応パターンが見られた。Ａ０２２６００４２４の０．７ｍｇ／ｋｇ（^＊＊、ｐ＝０．００１６）および２ｍｇ／ｋｇ（^＊、ｐ＝０．０４１５）の用量レベルは、対照Ｔ０１７０００６９８とは有意に異なった。０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇの用量は、腫瘍増殖の制御に対してより低い効果を有し、対照群と有意に異なってはいなかった。統計分析を、分析にダネットの多重比較検定を使用して、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実行した。

【0351】

結論として、結果は、Ａ０２２６００４２４が本モデルにおいて統計的に有意な腫瘍停滞を用量依存的に誘導できることを実証する。このことが確認するところ、Ｔ細胞をＨｕｈ－７腫瘍細胞上のＧＰＣ３に架橋することによる、ＧＰＣ３ ＩＳＶＤ Ｔ細胞エンゲージャーを介したポリペプチド誘導性Ｔ細胞媒介性死滅の概念である。

【産業上の利用可能性】

【0352】

７ 産業上の利用可能性
本明細書に記載されるポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクターおよび組成物は、例えばがんに罹っている対象の処置において使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】