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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】エフェクターレスＦＣ分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231220BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537963
(86)(22)【出願日】2021-12-20
(85)【翻訳文提出日】2023-08-08
(86)【国際出願番号】 EP2021086735
(87)【国際公開番号】W WO2022136238
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】20315503.1
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルナー・ディットリヒ
(72)【発明者】
【氏名】マルクス・ヘルマン・コーン
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン・ランゲ
(72)【発明者】
【氏名】トーマス・ランガー
(72)【発明者】
【氏名】ジユ・リー
(72)【発明者】
【氏名】エルコーレ・ラオ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、修飾されたＦｃ領域であって、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のような抗体エフェクター機能を媒介しないが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合による長い血清半減期を維持するＦｃ領域を含む分子を提供する。この目的のため、本発明の分子は、抗体ヒンジ領域のジスルフィド架橋を含まないが、少なくとも２つの共有結合によって、Ｃ末端で結合されている。さらに、本発明の分子は、追加のジスルフィド結合を有するＣＨ２ドメインを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２つのポリペプチドを含む分子であって、前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を形成し、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合によって結合されており、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置するジスルフィド結合によって結合されておらず、
各ポリペプチドは、前記Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない追加の内部ジスルフィド結合を含み、
追加の内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、
分子。
【請求項2】
前記追加の内部ジスルフィド結合が、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、請求項１に記載の分子。
【請求項3】
前記追加の内部ジスルフィド結合が、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；およびＳ２６７ＣとＡ３２７Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、請求項１または２に記載の分子。
【請求項4】
前記２つの共有結合が、２つのジスルフィド結合である、請求項１～３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項5】
Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合が、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる、請求項１～４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項6】
Ｃ１ｑならびに／またはＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、および／もしくはＦｃγＲ３に対する親和性が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、少なくとも１０分の１に低下している、請求項１～５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項7】
プロテインＡおよび／またはＦｃｇＲｎに対する親和性が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、低下していない、請求項１～６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項8】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのＦｃ領域である、請求項１～７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項9】
前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ３またはＣＨ４ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～８のいずれか１項に記載の分子。
【請求項10】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域である、請求項１～９のいずれか１項に記載の分子。
【請求項11】
前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の分子。
【請求項12】
前記分子が、少なくとも１つの活性部分をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の分子。
【請求項13】
前記活性部分が、少なくとも１つのポリペプチドのＣＨ２ドメインのＮ末端に位置し、前記分子が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合のＣ末端に位置する活性部分を含まない、請求項１２に記載の分子。
【請求項14】
前記活性部分が、抗原結合部分である、請求項１２または１３に記載の分子。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の分子をコードしているポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
モノクローナル抗体に加えてＦｃ融合タンパク質は、極めて有望な生物薬剤であり、これらの化合物のマーケットは、近年、著しく拡大している。これらの分子が成功を収めている理由は、小さい化学化合物と比較したそれらの高い特異性、安全性、および循環血中での長い半減期である。２０１７年までに、１０種類を超えるＦｃ融合タンパク質が承認されており、さらに審査中のものもある。抗体は、２つの異なるタンパク質鎖である軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）で構成されている。１つのＬＣは１つのＨＣに共有結合されており、ＨＣは、それらの部分で共有結合されている（ジスルフィド結合による）。ＬＣは可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）で構成されるのに対して、ＨＣは可変ドメイン（ＶＨ）およびいくつかの定常ドメイン（例えば、ＩｇＧのＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン）からなる。機能上、抗体を、２つのＦａｂ（抗原結合断片）領域および１つのＦｃ（結晶性断片）領域に分けることができる。各Ｆａｂ領域は、４つのドメイン：ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１からなる。Ｆｃ領域は、残りの定常ドメイン（ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含む。Ｆａｂ領域は、ヒンジ領域と呼ばれる柔軟な配列を介して、Ｆｃ領域に接続されている。このヒンジ領域は、ＨＣを結合するジスルフィド架橋を含む。
【0002】
抗体は、多機能タンパク質である。抗原はＦａｂ領域によって結合され、抗体のエフェクター機能はＦｃ領域によって媒介される。抗体のエフェクター機能は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、および抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）を含む。これらの作用は、それぞれＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）および補体タンパク質Ｃ１ｑへの抗体Ｆｃ領域の結合を介して媒介される。これらの抗体エフェクター機能は、自然抗体、さらに一部の改変された治療用抗体（例えば、腫瘍学における）の有効性にとって重要である。一方、前記エフェクター機能は、他の多くの改変された治療用抗体、例えば、炎症誘発性サイトカインのような可溶性標的に対する抗体にとっては望ましくない。このような抗体は、そのＦａｂ断片の結合を介して、それらの特異的な標的を、主に遮断することによって、または遮断することによってのみ作用するように設計されることが多いが、そのＦｃ領域のあらゆるエフェクター機能は、免疫反応への干渉および潜在的に有害な免疫反応、極端な場合、抗ＣＤ２８抗体ＴＧＮ１４１２で認められた「サイトカインストーム」を引き起こす。
【0003】
一方、Ｆｃ領域は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって媒介される「再利用」機構を介して、循環血中の抗体およびＦｃ融合タンパク質の半減期を著しく延長させる。加えて、Ｆｃ領域は、その分子の全体的な安定性に寄与し、そのＦｃドメインの重要で望ましい別の機能は、プロテインＡに対するその強力で特異的な結合である。固定化プロテインＡへの抗体およびＦｃ融合タンパク質の結合は、通常、抗体およびＦｃ融合タンパク質の精製中の第１の精製工程である。したがって、前記抗体分子からのＦｃ領域の単純な除去は、重大な問題点を有するであろう。
【0004】
このため、いくつかの変異体Ｆｃ領域が、前記Ｆｃ領域の好ましい作用（半減期延長、プロテインＡ結合、安定化）を維持しつつ、抗体エフェクター機能を低下させるために開発されてきた。これらの取り組みは、アグリコシル化変異体および点変異を有する変異体を含む（非特許文献１）。しかし、点変異変異体の多くは少なくとも一部の抗体エフェクター機能を維持しており、アグリコシル化変異体は低下した溶解性または安定性を示す（非特許文献２）。抗体エフェクター機能を消失させる別の試みは、Ｆｃ領域へのＦｃγＲおよびＣ１ｑの結合に寄与するヒンジ領域の修飾または除去である（非特許文献３）。このような「ヒンジ欠失」抗体は、ＦｃγＲ媒介性エフェクター機能を実質的に示さないことが認められた（非特許文献４）。しかし、これらの構造によって、安定性が低下し、ＦｃＲｎへの結合が損なわれており、これは、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期がより短くなることを意味するであろう。
【0005】
このため、抗体エフェクター機能を持たないが、高い安定性を維持し、ＦｃＲｎ結合およびプロテインＡ結合が損なわれていない抗体またはＦｃ融合タンパク質の必要性が依然として存在している。本発明は、機能的なヒンジ領域は欠如しているが、Ｆｃ部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合およびＣＨ２ドメイン中の追加の内部ジスルフィド結合を含むＦｃ領域を提供することによって、この必要性に対処している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．２０１８；９（１）：６３～７３ページ
【非特許文献2】Ｄｕｍｅｔら、ＭＡｂｓ．２０１９；１１（８）：１３４１～１３５０ページ
【非特許文献3】Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：５２０
【非特許文献4】Ｖａｌｅｉｃｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２０年１２月；９（４）：５０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
第１の態様において、本発明は、２つのポリペプチドを含む分子であって、
前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を形成し、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合によって結合されており、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置するジスルフィド結合によって結合されておらず、
各ポリペプチドは、前記Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない追加の内部ジスルフィド結合を含み、
追加の内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、
分子を提供する。
前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を形成し、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合によって結合されており、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置するジスルフィド結合によって結合されておらず、
各ポリペプチドは、前記Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない追加の内部ジスルフィド結合を含み、
追加の内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、
分子を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態において、追加の内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。
【0009】
いくつかの実施形態において、追加の内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；およびＳ２６７ＣとＡ３２７Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。
【0011】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる。
【0012】
いくつかの実施形態において、Ｃ１ｑならびに／またはＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２および／もしくはＦｃγＲ３に対する親和性は、Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、少なくとも１０分の１に低下している。
【0013】
いくつかの実施形態において、プロテインＡおよび／またはＦｃｇＲｎに対する親和性は、Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、低下していない。
【0014】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのＦｃ領域である。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、各ポリペプチドのＣＨ３またはＣＨ４ドメインのＣ末端に位置する。
【0016】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域である。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、各ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記分子は、少なくとも１つの活性部分をさらに含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記活性部分は、少なくとも１つのポリペプチドのＣＨ２ドメインのＮ末端に位置し、前記分子は、Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合のＣ末端に位置する活性部分を含まない。
【0020】
いくつかの実施形態において、前記活性部分は、抗原結合部分である。
【0021】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の任意の実施形態による分子をコードしているポリヌクレオチドを提供する。
【0022】
本発明は、Ｆｃの潜在的に有害な抗体エフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＡＤＣＤ）を示さないが、すべての望ましいＦｃの機能性：ＦｃＲｎ結合を介した長い血清半減期、プロテインＡ結合を介した容易な精製、および高い分子安定性を維持する分子を提供する。
【0023】
本発明の分子のこれらの有利な特性は、以下の特性の組合せによる：機能的な抗体ヒンジ領域の欠如であって、抗体エフェクター機能を低下させる機能的な抗体ヒンジ領域の欠如、および少なくとも２つのＣ末端の共有結合に加えてＣＨ２ドメイン中の追加の内部ジスルフィド結合であって、いずれも安定性を増強する結合。このため、本発明は、抗体エフェクター機能を持たず、ＦｃＲｎ結合が損なわれておらず、かつ安定性が増強されている分子を提供する。
【0024】
抗体エフェクター機能を低下させる点変異を有する既知のＦｃ変異体（例えば、「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ））と比較して、本発明の分子にあるようなＮ末端のヒンジ領域の欠如は、ＡＤＣＤをより効率的に消失させる（図８）。
【0025】
Ｃ末端の共有結合を持たないヒンジ欠失抗体は、安定性が低下し、かつＦｃＲｎ結合が損なわれる（Ｖａｌｅｉｃｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２０年１２月；９（４）：５０に示される通り）が、本発明の分子は、ＦｃＲｎ結合が損なわれていない。
【0026】
加えて、本発明の分子のＣＨ２ドメイン中のＣ末端の共有結合と追加の内部ジスルフィド結合の組合せは、分子を安定化し、このため、Ｎ末端のヒンジ領域の欠如を完全に補完することができる（表６）。
【0027】
前記分子のＣＨ２ドメインは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない追加の内部ジスルフィド結合を含む。これは、前記分子の安定性をさらに増強する。特定の内部ジスルフィド結合は、他のものより良好な安定化をもたらす。安定化という観点から、特に望ましい内部ジスルフィド結合は、Ｐ２３８Ｃ／Ｌ３２８Ｃ、Ｓ２６７Ｃ／Ａ３２７Ｃ、およびＶ２４０Ｃ／Ｉ３３２Ｃである。
【0028】
その上、本発明の分子の２つのポリペプチドは、そのＣ末端の少なくとも２つの鎖間共有結合による安定した二量体を形成する。前記分子は、適切に折り畳まれており、追加のＣ末端の共有結合によって媒介される凝集は、認められなかった（ＳＥＣ－ＭＡＬＳデータ、図４および１１参照）。凝集体形成を防ぐことは、凝集体がＡＤＣＤを媒介し得ることから、Ｆｃ領域を含む分子にとって極めて重要である。その上、本発明の分子のＣ末端の共有結合は、その抗体の天然ＦｃのＣ末端をマスキングし、Ｆｃ末端凝集によって媒介されるＡＤＣＤも防ぐ。
【0029】
さらに、前記分子は、標準的なタンパク質発現系において、高い発現レベルを有する。
【0030】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つのＣ末端の共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列中に含まれる。この場合、前記少なくとも２つのＣ末端の共有結合は、この配列内の少なくとも２つのジスルフィド結合である。驚くべきことに、前記抗体ヒンジ領域の配列は、Ｆｃ部分のＣ末端に位置する場合も、鎖間ジスルフィド結合を形成する。前記抗体ヒンジ領域の配列は、ヒト内因性抗体ヒンジ領域から得られるため、外因性配列の使用を避けることができ、これは、抗薬物抗体（ＡＤＡ）形成のリスクを減少させる。
【0031】
いくつかの実施形態において、前記分子は、Ｆｃ部分のＮ末端に位置する活性部分を含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、Ｆｃ領域のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合のＣ末端に位置する活性部分を含まない。これは、ＦｃのＣ末端部分が、前記活性部分に干渉できない、例として、標的へのその結合を妨げないという利点を有する。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、抗原結合部分である。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】Ｆｃ結合タンパク質のための結合部位が示されているＩｇＧの概略図である（Ａ）。ＦｃγＲおよびＣ１ｑは、下部ヒンジ領域に結合する（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：５２０）。この部位は、下部ＣＨ２および上部ＣＨ３ドメインに位置するＦｃＲｎおよびプロテインＡの結合部位とは異なる（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：５２０）。本発明によるエフェクターレスＦｃ領域の概略図である（Ｂ）。Ｆｃ領域のＮ末端に位置するヒンジ領域は、除去され、その配列は、前記Ｆｃ領域のＣ末端に移行された。その上、ＣＨ１ドメインは、リンカー配列を介してＣＨ２ドメインに接続されている。したがって、この新しい配置は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑのための結合部位を完全に除去している。
【図2】異なる抗ＴＮＦα抗体変異体の概観を示す図である。このＦａｂは、アダリムマブ由来のものであり、すべての変異体において同じである。Ｍａｂ０１は、ＩｇＧ１野生型（ｗｔ）を有するアダリムマブである。Ｍａｂ０２は、既知の「ＬＡＬＡ」（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）変異に加えて、グリコシル化を回避するためのＮ２９７Ａ変異を有するＩｇＧ１変異体である（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．２０１８；９（１）：６３～７３ページ）。Ｍａｂ０３は、ＩｇＧ１と比較して、エフェクター機能が低下しているＩｇＧ２ Ｆｃ骨格を有する。Ｍａｂ０４は、既知のＥ２６９ＲおよびＫ３２２Ａ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ骨格を有する。Ｍａｂ０５は、ＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）変異および追加の既知のＰ３２９Ａ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ骨格を有する。Ｍａｂ０６は、Ｃ末端に移動されたヒンジ領域の配列を伴い、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間にリンカー配列を伴わない本発明によるＦｃ ＩｇＧ１（「逆さまの」と表記されている）である。Ｍａｂ０７は、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に１９ＧＳ－リンカーをさらに含んでいる、本発明によるＦｃ ＩｇＧ１（「逆さまの」と表記されている）である。
【図4-1】分析用サイズ排除クロマトグラフィーおよび異なる抗体の算出された分子量を示す図である。（Ａ）散乱光強度の尺度としてのレイリー比の相対シグナル強度が、経過時間に対してプロットされている。（Ｂ）ピークのクローズアップ図。主要なピーク画分内のタンパク質の算出された分子量が示されている。Ｍａｂ０６は、「ｕｄ－ＩｇＧ１」と表記されており；Ｍａｂ０７は、「ｕｄ－ＩｇＧ１（１９ＧＳ）」と表記されている。
【図5】ＳＰＲによって決定される異なる抗体へのＴＮＦαの結合を示す図である。抗体は、チップに固定化され、ヒトＴＮＦαは、検体として使用された。対応する抗体変異体が示されている。Ｍａｂ０６は、「ｕｄ－ＩｇＧ１」と表記されており；Ｍａｂ０７は、「ｕｄ－ＩｇＧ１（１９ＧＳ）」と表記されている。
【図6-1】異なるＦｃＲに対する異なる抗体のＳＰＲ－親和性測定値を示す図である。相互作用分析のために、前記ＦｃＲは、センサーチップに固定化された。このセンサーグラムは、様々な濃度における異なる抗体の結合プロファイルを示している。Ｍａｂ０６は、「ｕｄ－ＩｇＧ１」と表記されており；Ｍａｂ０７は、「ｕｄ－ＩｇＧ１（１９ＧＳ）」と表記されている。
【図7】エフェクター機能：ＡＤＣＣを示す図である。（Ａ）前記アッセイのアッセイ原理の略図。膜固定抗原の結合において、エフェクター細胞は、ＦｃγＲＩＩＩ活性化によって活性化される。このエフェクター細胞の活性化は、標的細胞の細胞溶解をもたらす。（Ｂ）ＩｇＧ１ ｗｔ、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ａ（アグリコシル化）、およびＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ変異体を用いて得られたＡＤＣＣアッセイの結果。（Ｃ）ＩｇＧ１ ｗｔ、ＩｇＧ１ Ｅ２６９Ｒ、Ｋ３２２Ａ、およびＩｇＧ２。（Ｄ）ＩｇＧ１ ｗｔ、本発明によるＦｃ ＩｇＧ１（「ｕｄ－ＩｇＧ１」）、１９ＧＳ－リンカーを含む本発明によるＦｃ ＩｇＧ１（「ｕｄ－ＩｇＧ１（１９ＧＳ）」）。活性度は、特異的溶解％で得られる（実施例の項における「方法」を参照）。
【図8】エフェクター機能：ＡＤＣＤを示す図である。（Ａ）前記アッセイのアッセイ原理の略図。抗原抗体複合体（免疫複合体）の形成は、補体系の動員をもたらす。結果として、標的細胞を死滅させる膜傷害複合体が構築される。（Ｂ）ＩｇＧ１ ｗｔ、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ａ（アグリコシル化）、およびＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ変異体。（Ｃ）ＩｇＧ１ ｗｔ、ＩｇＧ１ Ｅ２６９Ｒ、Ｋ３２２Ａ、およびＩｇＧ２。（Ｄ）ＩｇＧ１ ｗｔ、本発明によるＦｃ ＩｇＧ１（「ｕｄ－ＩｇＧ１」）、１９ＧＳ－リンカーを含む本発明によるＦｃ ＩｇＧ１（「ｕｄ－ＩｇＧ１（１９ＧＳ）」）。活性度は、特異的溶解％で得られる（材料および方法を参照）。
【図9-1】異なるＧＬＰ１－ＲＡ－Ｆｃ融合タンパク質の概観を示す図である。すべての融合タンパク質は、同じＧＬＰ１配列およびＦｃドメインに対するリンカー配列を含有する。なお、ＧＬＰ１－Ｆｃ０１およびＧＬＰ１－Ｆｃ０４は、ＩｇＧ４由来Ｆｃドメインを含有する。このＦｃ変異体は、エフェクター機能を低下させる既知のＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異ならびに半抗体形成を回避するための既知のＳ２２８Ｐ変異を含有する。すべてのＩｇＧ１－Ｆｃ変異体は、エフェクター機能を低下させるＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）変異を含有する。明確にするために、これらの変異は、図に表記されていない。本発明によるＦｃ変異体（ＧＬＰ－Ｆｃ０４～ＧＬＰ－Ｆｃ０１４）は、「逆さまの」と表記されている。
【図11-1】分析用サイズ排除クロマトグラフィーおよび異なるＧＬＰ１－ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質の算出された分子量を示す図である。明確にするために、１つのグラフに７セットのデータのみを示している。（Ａ、Ｂ）レイリー比の相対シグナル強度が、経過時間に対してプロットされている。（Ｃ、Ｄ）ピークのクローズアップ図。主要なピーク画分内のタンパク質の算出された分子量が示されている。
【図12-1】ｎａｎｏＤＳＦを用いて決定されたＧＬＰ１－ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質の安定性を示す図である。明確にするために、１つのグラフに最大で４つの変異体を示している。（Ａ）変異体ＧＬＰ１－Ｆｃ０１～ＧＬＰ１－Ｆｃ０４、（Ｂ）ＧＬＰ１－Ｆｃ０５～ＧＬＰ１－Ｆｃ０８、（Ｃ）ＧＬＰ１－Ｆｃ０９～ＧＬＰ１－Ｆｃ１２、ならびに（Ｄ）ＧＬＰ１－Ｆｃ１３およびＧＬＰ１－１４。すべての測定は、２回ずつ行われた。曲線は平均値データを表し、その標準偏差は影として示されている。各サンプルにおける蛍光強度は、３３０ｎｍおよび３５０ｎｍで測定されている。それぞれの上のパネルには、３５０ｎｍ／３３０ｎｍにおける蛍光強度の比が、温度に対してプロットされている。この３５０ｎｍ／３３０ｎｍ比は、前記タンパク質のアンフォールディングにおいて誘導されたトリプトファン残基のスペクトルシフトに関する尺度である。下のパネルには、融解曲線の一次導関数が示されている。一次導関数の最大値は、タンパク質安定性の尺度としての変曲点（ＩＰ）を算出するために使用された。
【図13】ＧＬＰ１－Ｆｃ０１およびＧＬＰ１－Ｆｃ０４の薬力学的プロファイルを示す図である。雌ｄｂ／ｄｂマウスまたは痩せた対照に、ビヒクル（ＰＢＳ）または対照に対して、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ１－Ｆｃ０１またはＧＬＰ１－Ｆｃ０４を、４日毎に１４日間皮下投与した。体重増加（Ａ）および摂食血糖値（Ｂ）を、本試験全体を通して分析し、（Ｂ）をベースライン（１日目）からのグルコース変化として示した。皮下への化合物投与の時点は、矢印で示されている。データは平均値±ＳＥＭであり、１群あたりｎ＝８である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明は、２つのポリペプチドを含む分子であって、前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を形成し、前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合によって結合されており、前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置するジスルフィド結合によって結合されておらず、各ポリペプチドは、前記Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない追加の内部ジスルフィド結合を含み、追加の内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、分子を提供する。
【0034】
本発明の分子設計は、分子が、Ｆｃ媒介性抗体エフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＡＤＣＤ）を引き起こさないが、Ｆｃ領域の望ましい機能：ＦｃＲｎ結合、プロテインＡ結合、および安定化を維持することを可能にする。本発明は、抗体エフェクター機能を担うＦｃγＲおよびＣ１ｑのための結合部位は、抗体ヒンジ領域に部分的に位置しているが、ＦｃＲｎおよびプロテインＡのための結合部位は、Ｆｃ領域のよりＣ末端側の部分に位置している（図１）という発見に基づいている。このため、前記ヒンジ領域の除去によって、望ましいＦｃ機能を損なうことなく、抗体エフェクター機能が消失する。その上、本発明の分子の２つのＣ末端の共有結合およびＣＨ２ドメイン中の追加の内部ジスルフィド結合は、単なるヒンジ欠失抗体変異体で認められる欠点（損なわれたＦｃＲｎ結合、低下された安定性）を克服する（Ｖａｌｅｉｃｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２０年１２月；９（４）：５０）。
【0035】
定義
本発明が以下で詳細に説明される前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬は変更されることがあるため、これらに限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書で使用された用語集は、特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されるべきである。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明が以下で詳細に説明される前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬は変更されることがあるため、これらに限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書で使用された用語集は、特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されるべきである。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0036】
本明細書の本文全体を通して、いくつかの文献が言及されている。本明細書に言及されている文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、使用説明書などを含む）のそれぞれは、前出または後出を問わず、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0037】
この記載および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0038】
抗体位置：抗体分子または抗体分子の断片内にあるアミノ酸の位置は、別段の指定がない限り、ＥＵ番号付けに従って指定される。
【0039】
「分子」は、本明細書で使用する場合、共有結合性相互作用および／または非共有結合性相互作用（例えば、疎水性または静電的相互作用）によって結びついている原子の群である。一実施形態において、分子のすべての原子は、共有結合性相互作用によって接続されている。
【0040】
いくつかの実施形態において、前記分子は、抗体である。いくつかの実施形態において、前記分子は、多特異性抗体である。いくつかの実施形態において、前記分子は、Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記分子は、Ｆｃ領域および活性部分を含むＦｃ融合タンパク質である。
【0041】
「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、ペプチド結合によって共有結合されている１０個以上のアミノ酸の鎖である。したがって、「ポリペプチド」という用語は、このような鎖の長さとは関係なく、多重鎖タンパク質の鎖を表し得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、多重鎖タンパク質の鎖である。
【0042】
「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用する場合、２つのポリペプチドからなる複数の定常重鎖（ＣＨ）免疫グロブリンドメインによって形成される免疫グロブリン分子の断片である。自然抗体において、前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体および補体系の構成成分への結合を媒介する。天然のＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤでは、そのＦｃ領域は、両方の重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインによって形成される。天然のＩｇＭおよびＩｇＥでは、そのＦｃ領域は、両方の重鎖のＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインによって形成される。本発明のＦｃ領域は、自然抗体のＦｃ領域、すなわち、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインと同じＣＨドメインによって形成されることがある。本発明のＦｃ領域は、天然の免疫グロブリンのＣＨドメインと同一であるか、または例えば、１つまたはいくつかの点変異を挿入することによって、天然の免疫グロブリンのＣＨドメインに由来するＣＨドメインを含む。
【0043】
「ヒンジ領域」は、本明細書で使用する場合、Ｆｃ領域とＦａｂ領域の間に位置する抗体配列の一部である。これは、セグメントの可動性を提供し、抗体分子を安定化することができる。ヒンジ領域は構造データに基づいて明確に定義され得る、例えば、ＩｇＧ１ヒンジ領域は残基２２１～２３７を含む（Ｒ．Ｎｅｚｌｉｎ、「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８、２３～２６ページ）。ＩｇＧ抗体において、ヒンジ領域は、抗体の２つの重鎖を結合するジスルフィド結合を含む。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４は、このようなジスルフィド結合を２つ含むが、ＩｇＧ２は４つ含み、ＩｇＧ３は１１含む（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｍａｙ、２０１２ ＭＡｂｓ．２０１２年１月～２月；４（１）：１７～２３ページ）。
【0044】
本発明の分子において、ある領域が、Ｆｃ領域のＮ末端に位置する場合、すべての自然抗体の場合と同様に、「ヒンジ領域」とのみ称される。ヒンジ領域と同一か、または高度に類似しているアミノ酸配列が、（本発明の分子のいくつかの実施形態におけるように）Ｆｃ領域のＣ末端に置かれる場合、それは、「（抗体）ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列」と称される。高度に類似とは、抗体ヒンジ領域の配列と少なくとも７０％同一であることを意味し、かつ／または抗体ヒンジ領域の配列の少なくとも７個の連続するアミノ酸を含むことを意味する。
【0045】
「共有結合」は、本明細書で使用する場合、原子間の電子対を共有することを伴う化学結合である。共有結合は、静電的相互作用または疎水性作用のような非共有結合性相互作用とは異なる。
【0046】
共有結合、例えば、ジスルフィド結合が、Ｆｃ領域の「Ｃ末端に位置する」ということは、前記Ｆｃ領域を形成する両方のポリペプチドにおけるアミノ酸残基、例えば、前記共有結合の形成に関与しているシステイン残基は、前記Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの部分のＣ末端に位置することを意味する。
【0047】
Ｆｃ領域の「Ｎ末端に位置する」共有結合、例えば、ジスルフィド結合がないということは、前記Ｆｃ領域を形成する両方のポリペプチドにおいて、前記Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの部分のＮ末端に位置するアミノ酸残基、例えば、このような共有結合の形成に関与しているシステイン残基が存在しないことを意味する。
【0048】
「内部ジスルフィド結合」は、本明細書で使用する場合、１つの免疫グロブリンドメイン、例えば、ＣＨドメイン内の２つのシステイン残基によって形成されるジスルフィド結合である。これは、内部ジスルフィド結合が、常に鎖内ジスルフィド結合であって、異なるポリペプチド鎖を結合する鎖間ジスルフィド結合ではないことを意味する。「対応する野生型ＣＨ２ドメインに存在しない内部ジスルフィド結合」は、「追加の内部ジスルフィド結合」とも呼ばれ、天然のＣＨ２ドメイン、すなわち、本発明の修飾されたＣＨ２の由来となる天然のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合である。
【0049】
いくつかの実施形態において、内部ジスルフィドは、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合から選択される。
【0050】
「リンカー」は、本明細書で使用する場合、分子の２つの領域を結合する短くて柔軟なアミノ酸配列である。例として、リンカーは、Ｆａｂ領域とＦｃ領域；活性部分とＦｃ領域；またはＦｃ領域と少なくとも２つの鎖間共有結合を含む分子のＣ末端領域を結合することができる。典型的なリンカーは、アミノ酸１～２０個からなる。
【0051】
いくつかの実施形態において、前記リンカーは、いくつかのグリシンおよび／またはセリン残基を含む。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基からなる。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、天然の抗体分子のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、前記Ｆｃ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの由来となる天然の抗体分子のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む。
【0052】
一実施形態において、Ｆｃ領域および少なくとも２つの鎖間共有結合を含むＣ末端領域は、アミノ酸６個からなるリンカーによって結合されている。一実施形態において、Ｆｃ領域および少なくとも２つの鎖間共有結合を含むＣ末端領域は、アミノ酸１個からなるリンカーによって結合されている。
【0053】
「活性部分」は、本明細書で使用する場合、分子または分子の一部であり、これが生物学的構造物（例えば、前記分子に対する受容体）と相互作用することによって、生物学的機能を発揮する。
【0054】
いくつかの実施形態において、活性部分は、ペプチドである。いくつかの実施形態において、活性部分は、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、活性部分は、酵素である。いくつかの実施形態において、活性部分は、サイトカインである。いくつかの実施形態において、活性部分は、抗原結合部分である。
【0055】
「抗原結合部分」は、本明細書で使用する場合、抗体または抗体断片であって、このような抗体の標的に結合する能力がある抗体または抗体断片である。抗原結合部分の例は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、ＶＨＨ、ＩＳＶＤ（免疫グロブリン単一可変ドメイン）、（例えば、ＮＡＮＯＢＯＤＹ分子）、およびＶＮＡＲ（可変新抗原受容体）である。
【0056】
Ｆｃ領域
本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ２抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ３抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、異なる抗体クラスまたはサブクラスのＣＨドメイン、例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを含む混合Ｆｃ領域を形成する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ２抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ３抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、異なる抗体クラスまたはサブクラスのＣＨドメイン、例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを含む混合Ｆｃ領域を形成する。
【0057】
Ｃ末端の共有結合
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。
【0058】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれている。いくつかの実施形態において、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列は、抗体ヒンジ領域の配列と同一である。いくつかの実施形態において、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列は、抗体ヒンジ領域の配列と高度に類似している。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列と少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列と少なくとも７５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列と少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列と少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列の少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記配列は、抗体ヒンジ領域の配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【0059】
いくつかの実施形態において、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列は、ＩｇＧ４ヒンジ領域の配列と同一であるか、または高度に類似している。いくつかの実施形態において、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号１）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡ（配列番号２）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡ（配列番号３）、ＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４）、ＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡ（配列番号５）、ＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡ（配列番号６）から選択される。いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記プロリン－システインリッチ配列は、ＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号７）、ＧＰＰＣＰＰＣＰＡ（配列番号８）、ＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡ（配列番号９）から選択される。
【0060】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合である。
【0061】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、各ポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインのＣ末端に位置する。
【0062】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、各ポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する。
【0063】
いくつかの実施形態において、前記少なくとも２つの共有結合は、各ポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する。
【0064】
ＣＨ２ドメインの内部ジスルフィド結合
各ポリペプチドは、Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれが、対応する野生型ＣＨ２ドメインに存在しない内部ジスルフィド結合を含む。前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；およびＳ２６７ＣとＡ３２７Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｖ２４０ＣとＩ３３２Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である内部ジスルフィド結合も開示される。
各ポリペプチドは、Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれが、対応する野生型ＣＨ２ドメインに存在しない内部ジスルフィド結合を含む。前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；およびＳ２６７ＣとＡ３２７Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、Ｖ２４０ＣとＩ３３２Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である。Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃのシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合である内部ジスルフィド結合も開示される。
【0065】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドのそれぞれは、Ｆｃ領域を形成している免疫グロブリンドメインのＣ末端を、前記免疫グロブリンドメインのＣ末端に位置するジスルフィド結合のうちの１つに結合させるリンカーを含む。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、アミノ酸６個を含む。
【0066】
例示的な実施形態
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合である。
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合である。
【0067】
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合である。
【0068】
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれる。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合である。
【0069】
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。
【0070】
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合であり、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合であり、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれ、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれ、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合であり、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む。
【0071】
いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、少なくとも２つのジスルフィド結合であり、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、２つのジスルフィド結合であり、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれ、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、プロリン－システインリッチ配列中に含まれ、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、前記２つのポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を形成し、前記少なくとも２つの共有結合は、非天然アミノ酸間のクリックケミストリーによって生成された共有結合であり、前記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのそれぞれは、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合であって、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される前記内部ジスルフィド結合を含む。
【0072】
いくつかの実施形態において、前記分子は、抗体であり、内因性配列のみを含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、多特異性抗体であり、内因性配列のみを含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、単一特異性抗体であり、内因性配列のみを含む。
【0073】
いくつかの実施形態において、前記分子は、活性部分を含む。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、抗原結合部分である。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、ペプチドである。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、酵素である。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、サイトカインである。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、毒素である。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、放射線造影剤である。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、栄養素である。
【0074】
いくつかの実施形態において、前記分子は、Ｆｃ部分のＮ末端に位置する活性部分を含む。いくつかの実施形態において、前記分子は、Ｆｃ領域のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合のＣ末端に位置する活性部分を含まない。これは、ＦｃのＣ末端部分が、前記活性部分に干渉できない、例として、標的へのその結合を妨げないという利点を有する。いくつかの実施形態において、前記活性部分は、抗原結合部分である。
【0075】
いくつかの実施形態において、各ポリペプチドは、Ｆｃ部分のＮ末端に位置する抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチドは、Ｆｃ部分のＮ末端に位置するＦａｂ断片の重鎖を含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチドは、Ｆｃ部分のＮ末端に位置するＩＳＶＤを含む。
【0076】
ポリヌクレオチド、ベクター、細胞
第２の態様において、本発明は、本発明の分子をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドに関する。これは、上記のすべての実施形態を指す。第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、本発明の分子との複合体に含まれる１つまたはそれ以上の追加のポリペプチドもコードすることがある。一実施形態において、前記１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、抗体または抗体様構造物をコードする。一実施形態において、前記１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、単離される。
第２の態様において、本発明は、本発明の分子をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドに関する。これは、上記のすべての実施形態を指す。第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、本発明の分子との複合体に含まれる１つまたはそれ以上の追加のポリペプチドもコードすることがある。一実施形態において、前記１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、抗体または抗体様構造物をコードする。一実施形態において、前記１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、単離される。
【0077】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む１つまたはそれ以上の発現ベクターに関する。「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、コード情報を宿主細胞に導入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、核酸分子であって、それが融合されている別の核酸を輸送する能力のある核酸分子を含む。ある種類のベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントか挿入されることがある環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであって、追加のＤＮＡセグメントが、そのウイルスゲノムに挿入されることがある、ウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製する能力がある（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入において、宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それによって、この宿主ゲノムと共に複製される。加えて、特定のベクターは、それらが含む遺伝子の発現を指示する能力がある。このようなベクターは、「発現ベクター」として本明細書で言及される。
【0078】
第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞または本発明の第３の態様によるもう１つまたはそれ以上の発現ベクターに関する。多種多様な細胞発現系は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞など）のような原核および真核細胞の使用を含めて、前記ポリヌクレオチドを発現するために使用されることがある。この目的のために、本発明のポリヌクレオチドが、細胞内で発現され、また一実施形態においては、前記細胞を培養している培地中に分泌され、そこから発現産物を回収できるように、前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを用いて、細胞を形質転換するか、または細胞にトランスフェクトする。
【0079】
内部ジスルフィド結合を有するＣＨ２ドメイン
別の態様において、本発明は、ＣＨ２ドメインであって、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む前記ＣＨ２ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであって、野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む前記ＣＨ２ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｖ２４０ＣとＩ３３２Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。
別の態様において、本発明は、ＣＨ２ドメインであって、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む前記ＣＨ２ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであって、野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む前記ＣＨ２ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記内部ジスルフィド結合は、システイン残基Ｖ２４０ＣとＩ３３２Ｃの間に形成されたジスルフィド結合である。
【0080】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＨ２ドメインであって、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない少なくとも２つの内部ジスルフィド結合を含む前記ＣＨ２ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであって、前記野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインには存在しない少なくとも２つの内部ジスルフィド結合を含む前記ＣＨ２ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン中の前記内部ジスルフィド結合は、以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃに加えてＳ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃに加えてＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃ；Ｐ２３８ＣとＡ３２７ＣおよびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃに加えてＳ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃに加えてＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃに加えてＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成される。
【0081】
前記分子を安定化するために、追加のジスルフィド結合、例えば、当該分野に記載されるＣＨ３ドメイン中のドメイン内ジスルフィド結合（Ｗｏｚｎｉａｋ－Ｋｎｏｐｐ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１）：ｅ３００８３）を導入することも可能である。
【0082】
いくつかの実施形態において、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含むＣＨ２ドメインは、より大きな分子の一部である。いくつかの実施形態において、前記分子は、抗体である。いくつかの実施形態において、前記分子は、多特異性抗体である。いくつかの実施形態において、前記分子は、単一特異性抗体である。
【実施例】
【0083】
実施例１は、抗ＴＮＦ抗体であるアダリムマブの取扱いを示す一方で、実施例２は、ＧＬＰ１受容体アゴニスト（ＲＡ）Ｆｃ融合タンパク質を使用する。
【0084】
方法
以下の項目は、以下の実施例で使用された方法を要約している。
以下の項目は、以下の実施例で使用された方法を要約している。
【0085】
タンパク質構築物およびタンパク質発現
ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞において、すべてのタンパク質を一時的に発現させた。異なる抗体変異体の配列は、その配列表に示されている。異なるタンパク鎖に対するＤＮＡを、合成し（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、培養上清への適切なタンパク質分泌のために必要とされるＣＭＶプロモーター配列およびリーダー配列下の発現ベクターにクローニングした。発現および精製は、基本的に、Ｂｅｃｋｅｒら、（２０１９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２０１９年１月；１５３：１～６ページに記載される通りに行われた。要約すると、ＤＮＡ：ＰＥＩの比が１：３であるＰＥＩを使用して、細胞にトランスフェクトした。発現を６日間行い、遠心分離（２０分、３０００ｇ、４℃）によって、細胞を培養上清から分離した。培養上清を、０．２２μｍで濾過し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。溶出後、タンパク質を脱塩し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、さらに精製した。
ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞において、すべてのタンパク質を一時的に発現させた。異なる抗体変異体の配列は、その配列表に示されている。異なるタンパク鎖に対するＤＮＡを、合成し（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、培養上清への適切なタンパク質分泌のために必要とされるＣＭＶプロモーター配列およびリーダー配列下の発現ベクターにクローニングした。発現および精製は、基本的に、Ｂｅｃｋｅｒら、（２０１９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２０１９年１月；１５３：１～６ページに記載される通りに行われた。要約すると、ＤＮＡ：ＰＥＩの比が１：３であるＰＥＩを使用して、細胞にトランスフェクトした。発現を６日間行い、遠心分離（２０分、３０００ｇ、４℃）によって、細胞を培養上清から分離した。培養上清を、０．２２μｍで濾過し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。溶出後、タンパク質を脱塩し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、さらに精製した。
【0086】
ＧＬＰ１－ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質に対する配列の両側を、リーダー配列またはＨｉｓタグに続いてＴｅｖ切断部位を含有するリーダー配列のいずれかで直接挟んだ。Ｈｉｓタグを介した精製のために、タンパク質を、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で平衡化したＨｉｓタグ精製樹脂（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ）カラムに捕捉した。３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５ｍＭイミダゾールを用いて、カラムを洗浄し、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭイミダゾールを用いて、前記タンパク質を溶出した。室温にて一晩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中でＴｅｖ切断を行い、切断混合物を、プロテインＡカラムに直接充填し、さらに精製した。Ｈｉｓタグが存在しない場合、上記の通り、プロテインＡを使用して、前記タンパク質を精製した。
【0087】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
タンパク質サンプル（５μｇタンパク質）を、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または５０ｍＭジチオトレイトールを含む４×ＬＤＳサンプル緩衝液のいずれかと、それぞれ、非還元条件または還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために混合した。サンプルを、泳動緩衝液としてＭＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに載せる前に、９９℃にて５分間インキュベートした。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質ラダーを、マーカーとして使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
タンパク質サンプル（５μｇタンパク質）を、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または５０ｍＭジチオトレイトールを含む４×ＬＤＳサンプル緩衝液のいずれかと、それぞれ、非還元条件または還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために混合した。サンプルを、泳動緩衝液としてＭＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに載せる前に、９９℃にて５分間インキュベートした。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質ラダーを、マーカーとして使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【0088】
分析用サイズ排除クロマトグラフおよび多角度静的光散乱測定（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、新たに脱気し、０．２μｍで濾過したＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行した。すべてのサンプルにおいて、サンプル量は５０μＬであり、すべてのサンプルにおいて、タンパク質濃度は、３ｍｇ／ｍＬに調整された。ＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、クロマトグラフィーシステムとして使用した。前記システムを、多角度静的光散乱（ＭＡＬＳ）検出器（ｍｉｎｉＤａｗｎ、Ｗｙａｔｔ）および濃度検出器として屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ－１０１、昭和電工）に接続した。ＡＳＴＡ５．３．４．２０（Ｗｙａｔｔ）ソフトウェアを使用して、データ解析を行った。すべてのサンプルに対して、０．１８５の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、新たに脱気し、０．２μｍで濾過したＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行した。すべてのサンプルにおいて、サンプル量は５０μＬであり、すべてのサンプルにおいて、タンパク質濃度は、３ｍｇ／ｍＬに調整された。ＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、クロマトグラフィーシステムとして使用した。前記システムを、多角度静的光散乱（ＭＡＬＳ）検出器（ｍｉｎｉＤａｗｎ、Ｗｙａｔｔ）および濃度検出器として屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ－１０１、昭和電工）に接続した。ＡＳＴＡ５．３．４．２０（Ｗｙａｔｔ）ソフトウェアを使用して、データ解析を行った。すべてのサンプルに対して、０．１８５の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を使用した。
【0089】
ＭＳ分析
ＬＣ－ＭＳによって、タンパク質の完全性を確認した。タンパク質サンプルを、ＰＮＧａｓｅＦを含有するｄｄＨ２Ｏ（１：５０ｖ／ｖ）（グリセロール非含有、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したタンパク質１２．５μｇを用いて、３７℃にて１５時間脱グリコシル化した。サンプルを、還元条件下で分析する場合、０．１Ｍジチオトレイトールを加えた。ＬＣ－ＭＳ分析を、デュアルＥＳＩインターフェイスおよびＡｇｉｌｅｎｔ１２９０／１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ６５４０ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＵＨＤ）Ｑ－ＴＯＦで行った。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを、ガードカラムＰＬＲＰ－Ｓ３００Ａ ５μｍ、３×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＰＬＲＰ－Ｓ１０００Ａ ５μｍ、５０×２．１ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、２００μＬ／分およびカラム温度８０℃で行った。
ＬＣ－ＭＳによって、タンパク質の完全性を確認した。タンパク質サンプルを、ＰＮＧａｓｅＦを含有するｄｄＨ２Ｏ（１：５０ｖ／ｖ）（グリセロール非含有、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したタンパク質１２．５μｇを用いて、３７℃にて１５時間脱グリコシル化した。サンプルを、還元条件下で分析する場合、０．１Ｍジチオトレイトールを加えた。ＬＣ－ＭＳ分析を、デュアルＥＳＩインターフェイスおよびＡｇｉｌｅｎｔ１２９０／１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ６５４０ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＵＨＤ）Ｑ－ＴＯＦで行った。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを、ガードカラムＰＬＲＰ－Ｓ３００Ａ ５μｍ、３×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＰＬＲＰ－Ｓ１０００Ａ ５μｍ、５０×２．１ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、２００μＬ／分およびカラム温度８０℃で行った。
【0090】
タンパク質１μｇをカラムに注入し、漸増するアセトニトリル濃度を用いた直線濃度勾配を用いて、０～１７分まで溶出した。使用された溶出液は、ＬＣ水および０．１ギ酸を含有する緩衝液Ａならびに９０％アセトニトリル、１０％ＬＣ水、および０．１ギ酸を含有する緩衝液Ｂであった。ソフトウェアＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍ Ｂ．０６（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、得られた質量データを解析した。ＧＰＭＡＷソフトウェアバージョン１０．３２（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ Ｄａｔａ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、タンパク質のアミノ酸配列に基づいた分子量を算出した。
【0091】
表面プラズモン共鳴分析
ＦｃＲに結合する抗体のすべての分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行した。抗Ｈｉｓ捕捉を使用して、ＦｃγＲ結合アッセイを行った。抗テトラＨｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を、ｐＨ７．２のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）へと緩衝液を交換し、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで２５μｇ／ｍＬに希釈し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供されたアミンカップリングキットを使用して、表面密度約１０，０００ＲＵまで、シリーズＳ ＣＭ５チップに直接固定した。Ｈｉｓタグ付き組換えヒトおよびマウスＦｃγＲ（ＦｃｙＲＩ／ＣＤ６４ ＃１２５７－ＦＣ；ＦｃγＲＩＩａ／ＣＤ３２ａ（Ｒ１６７） ＃１３３０－ＣＤ；ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ／ＣＤ３２ｂ／ｃ ＃１８７５－ＣＤ；ＦｃγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａ ＃４３２５－ＦＣ；ＦｃγＲ４／ＣＤ１６－２ ＃４３２５－ＦＣ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）で２μｇ／ｍＬに希釈し、流速１０μＬ／分で３０秒間注入した。抗体を、３０００から３７ｎＭまで連続３倍希釈し、２回ずつ、捕捉された受容体に対して２分間注入した。ｈＦｃγＲＩへの結合のために、３００ｎＭから３．７ｎＭまでの連続希釈液を作製した。前記表面を、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンを用いて、３０秒間再生した。センサーグラムを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して処理し、１：１結合モデルに適合させて、反応速度定数を得た。ビオチン化ＦｃＲｎを使用して、ＦｃＲｎ結合測定を行った。ビオチン化ヒトＦｃＲｎタンパク質は、Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ（＃ＩＴＦ０１）から購入された。ビオチン化ＦｃＲｎの可逆的捕捉のため、ビオチン捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した捕捉アッセイが使用された。ビオチン捕捉試薬溶液を、流速２μＬ／分で３００秒間注入することによって、ＣＡＰチップ表面を調製した。ＦｃＲｎタンパク質を、一般に１００ＲＵの捕捉レベルに達するまで、濃度０．５μｇ／ｍＬおよび流速１０μＬ／分で９０秒間捕捉した。分析されたタンパク質を、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中、１６００ｎＭ～１２．５ｎＭの１：１希釈系列に使用した。前記タンパク質を、６０秒間注入し、緩衝液注入による分離を、１２０秒間測定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を、アッセイ緩衝液として、流速３０μＬ／分で使用した。製造業者の説明通り、ビオチン捕捉キットの再生溶液を用いて、チップ表面を再生した。捕捉されたＦｃＲｎを含まないフローセルを基準として使用し、かつ緩衝液注入の減算を使用して（二重参照）、結合曲線をＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアｖ２．０で解析した。平衡解離定数（ＫＤ）を、各タンパク質濃度についての平衡結合反応（Ｒｅｑ）の包括的な定常状態データの適合によって決定した。
ＦｃＲに結合する抗体のすべての分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行した。抗Ｈｉｓ捕捉を使用して、ＦｃγＲ結合アッセイを行った。抗テトラＨｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を、ｐＨ７．２のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）へと緩衝液を交換し、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで２５μｇ／ｍＬに希釈し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供されたアミンカップリングキットを使用して、表面密度約１０，０００ＲＵまで、シリーズＳ ＣＭ５チップに直接固定した。Ｈｉｓタグ付き組換えヒトおよびマウスＦｃγＲ（ＦｃｙＲＩ／ＣＤ６４ ＃１２５７－ＦＣ；ＦｃγＲＩＩａ／ＣＤ３２ａ（Ｒ１６７） ＃１３３０－ＣＤ；ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ／ＣＤ３２ｂ／ｃ ＃１８７５－ＣＤ；ＦｃγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａ ＃４３２５－ＦＣ；ＦｃγＲ４／ＣＤ１６－２ ＃４３２５－ＦＣ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）で２μｇ／ｍＬに希釈し、流速１０μＬ／分で３０秒間注入した。抗体を、３０００から３７ｎＭまで連続３倍希釈し、２回ずつ、捕捉された受容体に対して２分間注入した。ｈＦｃγＲＩへの結合のために、３００ｎＭから３．７ｎＭまでの連続希釈液を作製した。前記表面を、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンを用いて、３０秒間再生した。センサーグラムを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して処理し、１：１結合モデルに適合させて、反応速度定数を得た。ビオチン化ＦｃＲｎを使用して、ＦｃＲｎ結合測定を行った。ビオチン化ヒトＦｃＲｎタンパク質は、Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ（＃ＩＴＦ０１）から購入された。ビオチン化ＦｃＲｎの可逆的捕捉のため、ビオチン捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した捕捉アッセイが使用された。ビオチン捕捉試薬溶液を、流速２μＬ／分で３００秒間注入することによって、ＣＡＰチップ表面を調製した。ＦｃＲｎタンパク質を、一般に１００ＲＵの捕捉レベルに達するまで、濃度０．５μｇ／ｍＬおよび流速１０μＬ／分で９０秒間捕捉した。分析されたタンパク質を、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中、１６００ｎＭ～１２．５ｎＭの１：１希釈系列に使用した。前記タンパク質を、６０秒間注入し、緩衝液注入による分離を、１２０秒間測定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を、アッセイ緩衝液として、流速３０μＬ／分で使用した。製造業者の説明通り、ビオチン捕捉キットの再生溶液を用いて、チップ表面を再生した。捕捉されたＦｃＲｎを含まないフローセルを基準として使用し、かつ緩衝液注入の減算を使用して（二重参照）、結合曲線をＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアｖ２．０で解析した。平衡解離定数（ＫＤ）を、各タンパク質濃度についての平衡結合反応（Ｒｅｑ）の包括的な定常状態データの適合によって決定した。
【0092】
抗体へのヒトＴＮＦαの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において表面プラズモン共鳴を使用して実行した。抗体を、前記チップに固定化し、ＴＮＦαを、検体として使用した。抗体の捕捉のために、ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。前記捕捉抗体を、ヒト抗体捕捉キットに関する記載の通り、標準手順を使用して、研究グレードＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の第一アミン基（典型的には、１０．０００ＲＵ）を介して固定化した。分析された抗体を、典型的には３０ＲＵである最大の分析物結合シグナルをもたらすであろう調整されたＲＵ値を用いて、流速１０μＬ／分で捕捉した。濃度１００ｎＭにおける組換えヒトＴＮＦα（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｈ８９１６）に対して、結合トレースを、会合時間および解離時間、それぞれ２４０秒および３００秒を用いて測定した。ＨＢＳ－ＥＰを、アッセイ緩衝液として、流速３０μＬ／分で使用した。ヒト抗体捕捉キットの再生溶液を用いて、チップ表面を再生した。捕捉された抗体を含まないフローセルを基準として使用し、かつ緩衝液注入の減算を使用して（二重参照）、結合トレースをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムパッケージｖ４．１で分析した。
【0093】
ＡＤＣＣおよびＡＤＣＤ ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ヒトＴＮＦαの変異形態を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株にトランスフェクトすることによって、標的細胞を生成した。この変異形態は、膜プロテアーゼによって不完全にのみ切断されることが知られており、細胞表面に残る。このＴＮＦα形態を、選択のためのネオマイシン耐性遺伝子をさらに含有するＣＭＶプロモーター下の哺乳動物発現ベクターにクローニングした。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および選択のための１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８アンチビオティカム（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｍ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で増殖させた。いずれのアッセイも、同じ標的細胞を使用し、クロム（５１Ｃｒ）放出アッセイに基づいている。ＡＤＣＤアッセイでは、標的細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンと共に４分間インキュベートした。細胞を、５１Ｃｒで標識し、１ウェルあたり約３０００細胞で９６ウェルプレートに播種し、５％ＦＢＳを含有するＲＰＭ１－１６４０（Ｂｉｏｗｅｓｔ）培地を用いて培養した。固定濃度のモルモット補体（標準補体、Ｔｅｂｕｂｉｏ）および抗体を、様々な濃度で加えて、３７℃でさらに４時間培養した。放射能測定のために、一定量を抜き取り、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｊｅｔデバイス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ガンマ線計測を行った。ＡＤＣＤアッセイの記載と同様の方法で、ＡＤＣＣアッセイを実行したが、補体を加える代わりに、エフェクター細胞を、１０：１（エフェクター細胞：標的細胞）の割合で加えた。使用されたエフェクター細胞は、文献（Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕら、Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（１２）：４６６９～４６７７ページ）に記載される通り、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）受容体を発現する単一クローンのヒト細胞傷害性Ｔリンパ球であった。すべてのアッセイには、陰性対照が含まれており、これには、それぞれ補体またはエフェクター細胞が加えられなかった（自然放出）。０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を、前記細胞培養培地に加えることによって、最大５１Ｃｒ放出が得られた。結果は、特異的放出％として表記され、式：特異的放出％＝（実験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）に従って算出される。すべての測定は、３回ずつ行われた。
ヒトＴＮＦαの変異形態を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株にトランスフェクトすることによって、標的細胞を生成した。この変異形態は、膜プロテアーゼによって不完全にのみ切断されることが知られており、細胞表面に残る。このＴＮＦα形態を、選択のためのネオマイシン耐性遺伝子をさらに含有するＣＭＶプロモーター下の哺乳動物発現ベクターにクローニングした。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および選択のための１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８アンチビオティカム（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｍ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で増殖させた。いずれのアッセイも、同じ標的細胞を使用し、クロム（５１Ｃｒ）放出アッセイに基づいている。ＡＤＣＤアッセイでは、標的細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンと共に４分間インキュベートした。細胞を、５１Ｃｒで標識し、１ウェルあたり約３０００細胞で９６ウェルプレートに播種し、５％ＦＢＳを含有するＲＰＭ１－１６４０（Ｂｉｏｗｅｓｔ）培地を用いて培養した。固定濃度のモルモット補体（標準補体、Ｔｅｂｕｂｉｏ）および抗体を、様々な濃度で加えて、３７℃でさらに４時間培養した。放射能測定のために、一定量を抜き取り、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｊｅｔデバイス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ガンマ線計測を行った。ＡＤＣＤアッセイの記載と同様の方法で、ＡＤＣＣアッセイを実行したが、補体を加える代わりに、エフェクター細胞を、１０：１（エフェクター細胞：標的細胞）の割合で加えた。使用されたエフェクター細胞は、文献（Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕら、Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（１２）：４６６９～４６７７ページ）に記載される通り、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）受容体を発現する単一クローンのヒト細胞傷害性Ｔリンパ球であった。すべてのアッセイには、陰性対照が含まれており、これには、それぞれ補体またはエフェクター細胞が加えられなかった（自然放出）。０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を、前記細胞培養培地に加えることによって、最大５１Ｃｒ放出が得られた。結果は、特異的放出％として表記され、式：特異的放出％＝（実験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）に従って算出される。すべての測定は、３回ずつ行われた。
【0094】
マウスにおける薬力学
マウス試験は、Ｃｏｖａｎｃｅ（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、ＩＮ）で実行された。すべての手順は、米国農務省（ＵＳＤＡ）の動物福祉法（９ＣＦＲ第１、２、および３部）およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を遵守した。
マウス試験は、Ｃｏｖａｎｃｅ（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、ＩＮ）で実行された。すべての手順は、米国農務省（ＵＳＤＡ）の動物福祉法（９ＣＦＲ第１、２、および３部）およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を遵守した。
【0095】
雌ｄｂ／ｄｂ（ＢＫＳ．Ｃｇｏ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ＯｌａＨｓｄ）または痩せたマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ－［ｌｅａｎ］／ＯｌａＨｓｄ）は、Ｅｎｖｉｇｏから入手した。試験開始時、動物は１２週齢であり、ｎ＝８匹に群分けされた。マウスには、Ｐｕｒｉｎａ５００８を自由に摂食させ、水の摂取を自由にし、１２時間点灯／消灯サイクルを継続させた。層別化基準として、ＨｂＡ１ｃ値（溶血血液法）は、投与前期間の７日目に決定した。ＨｂＡ１ｃは、先行する約４週間の間の平均血糖レベルに関するバイオマーカーである。低いＨｂＡ１ｃ値、中間のＨｂＡ１ｃ値、および高いＨｂＡ１ｃ値は、可能な限り等しく群全体にわたって分散させ、同程度のＨｂ１Ａｃ群平均とした。すべての動物に、４日間に１回、適用量５ｍＬ／ｋｇのビヒクル（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ Ｒｅｆ１４１９０）または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物を皮下投与した。投与前期間の９日目ならびに投与期間の１、５、９、および１３日目（投与後０および４時間）、加えて２、３、４、６、７、８、１０、１１、１２、および１４日目に、血液サンプルを、麻酔なしで尾先端から採取し、グルコメーターを用いて、血糖を測定した。体重を、１日１回測定した。
【0096】
ＧＬＰ１受容体活性アッセイ
ヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）受容体に対する化合物のアゴニズムを、ヒトＧＬＰ１受容体を安定して発現する組換えＰＳＣ－ＨＥＫ－２９３細胞株のｃＡＭＰ応答を測定する機能アッセイによって決定した。細胞を、３７℃に置いたＴ１７５培養フラスコ内の培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中、コンフルエント近くまで増殖させ、１０％ＤＭＳＯを含有する細胞培養培地中１～５×１０７細胞／ｍＬの濃度で、２ｍＬバイアル内に採取した。各バイアルは、１．８ｍＬの細胞を含有した。前記バイアルを、イソプロパノール中－８０℃まで緩徐に凍結し、次に、保存のための液体窒素に移した。これらを使用する前に、凍結された細胞を、３７℃で速やかに解凍し、細胞緩衝液（１×ＨＢＳＳ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、実施例の条件に示される場合は０．１％ＨＳＡを添加）２０ｍＬで洗浄した（９００ｒｐｍで５分）。細胞を、アッセイ緩衝液（２ｍＭ ＩＢＭＸを添加した細胞緩衝液）に再懸濁し、細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。測定のために、５μＬの細胞（最終５０００細胞／ウェル）および試験化合物５μＬを、３８４－ウェルプレートに加え、続いて室温で３０分インキュベートした。細胞のｃＡＭＰ含有率を、均一時間分解蛍光技術を使用して決定した。（ＨＴＦＲ、ＣｉｓＢｉｏ）。溶解緩衝液（キットの構成成分）で希釈されたＨＴＲＦ試薬の添加後、前記プレートを１時間インキュベートし、続いて６６５／６２０ｎｍにおける蛍光比を測定した。アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を、最大応答の５０％活性化（ＥＣ５０）をもたらす濃度を決定することによって定量化した。
ヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）受容体に対する化合物のアゴニズムを、ヒトＧＬＰ１受容体を安定して発現する組換えＰＳＣ－ＨＥＫ－２９３細胞株のｃＡＭＰ応答を測定する機能アッセイによって決定した。細胞を、３７℃に置いたＴ１７５培養フラスコ内の培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中、コンフルエント近くまで増殖させ、１０％ＤＭＳＯを含有する細胞培養培地中１～５×１０７細胞／ｍＬの濃度で、２ｍＬバイアル内に採取した。各バイアルは、１．８ｍＬの細胞を含有した。前記バイアルを、イソプロパノール中－８０℃まで緩徐に凍結し、次に、保存のための液体窒素に移した。これらを使用する前に、凍結された細胞を、３７℃で速やかに解凍し、細胞緩衝液（１×ＨＢＳＳ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、実施例の条件に示される場合は０．１％ＨＳＡを添加）２０ｍＬで洗浄した（９００ｒｐｍで５分）。細胞を、アッセイ緩衝液（２ｍＭ ＩＢＭＸを添加した細胞緩衝液）に再懸濁し、細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。測定のために、５μＬの細胞（最終５０００細胞／ウェル）および試験化合物５μＬを、３８４－ウェルプレートに加え、続いて室温で３０分インキュベートした。細胞のｃＡＭＰ含有率を、均一時間分解蛍光技術を使用して決定した。（ＨＴＦＲ、ＣｉｓＢｉｏ）。溶解緩衝液（キットの構成成分）で希釈されたＨＴＲＦ試薬の添加後、前記プレートを１時間インキュベートし、続いて６６５／６２０ｎｍにおける蛍光比を測定した。アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を、最大応答の５０％活性化（ＥＣ５０）をもたらす濃度を決定することによって定量化した。
【0097】
熱安定性測定
ｎａｎｏＤＳＦ技術に基づいたＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ Ｆｌｅｘデバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、熱安定性の分析を行った。前記デバイスは、蛍光測定と同時に散乱情報の回収を可能にするＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃｓを備えている。製造業者の使用説明書に従って、１℃／分の熱傾斜を用いた２０℃～９５℃の範囲で、測定を行った。すべてのタンパク質サンプルを、ＰＢＳに溶解し、タンパク質濃度を、０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。測定は、２回ずつ行われた。ソフトウェアＰＲ ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌ Ｖ．２．１（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、データ解析を行った。
ｎａｎｏＤＳＦ技術に基づいたＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ Ｆｌｅｘデバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、熱安定性の分析を行った。前記デバイスは、蛍光測定と同時に散乱情報の回収を可能にするＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃｓを備えている。製造業者の使用説明書に従って、１℃／分の熱傾斜を用いた２０℃～９５℃の範囲で、測定を行った。すべてのタンパク質サンプルを、ＰＢＳに溶解し、タンパク質濃度を、０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。測定は、２回ずつ行われた。ソフトウェアＰＲ ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌ Ｖ．２．１（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、データ解析を行った。
【実施例1】
【0098】
本発明によるアダリムマブのＦｃ変異体の生成
本発明によるＦｃ分子の概念は、抗ＴＮＦ抗体であるアダリムマブに対して試験された。本発明者らは、本発明によるＦｃアダリムマブの２つの異なるバージョン（図２、ｍａｂ０６（重鎖 配列番号１０）およびｍａｂ０７（重鎖 配列番号１１））を生成した。これら２つの構築物は、ヒンジ領域を置き換えているリンカーの長さのみ異なっていた。比較目的のため、エフェクター機能をサイレンスすることが知られているＦｃ－骨格変異体も生成した（図２、ｍａｂ０２、ｍａｂ０４、ｍａｂ０５）。Ｆａｂは、すべての構築物において同じであった。ＣＨＯまたはＨｅｋ２９３細胞において、すべての抗体を、一時的に発現させ、二段階精製手順を使用して精製した。興味深いことに、最大収量は、本発明によるＦｃ変異体を用いることで得られた（表１）。
本発明によるＦｃ分子の概念は、抗ＴＮＦ抗体であるアダリムマブに対して試験された。本発明者らは、本発明によるＦｃアダリムマブの２つの異なるバージョン（図２、ｍａｂ０６（重鎖 配列番号１０）およびｍａｂ０７（重鎖 配列番号１１））を生成した。これら２つの構築物は、ヒンジ領域を置き換えているリンカーの長さのみ異なっていた。比較目的のため、エフェクター機能をサイレンスすることが知られているＦｃ－骨格変異体も生成した（図２、ｍａｂ０２、ｍａｂ０４、ｍａｂ０５）。Ｆａｂは、すべての構築物において同じであった。ＣＨＯまたはＨｅｋ２９３細胞において、すべての抗体を、一時的に発現させ、二段階精製手順を使用して精製した。興味深いことに、最大収量は、本発明によるＦｃ変異体を用いることで得られた（表１）。
【0099】
【表1】
【0100】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図３）およびＭＡＬＳと組み合わせた分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって、すべての抗体の均一性を分析した。光散乱測定は、大きな粒子、例えば、凝集体の検出のための極めて高感度の方法である。さらに、これは、参照分子を必要とすることなく、分子量の算出を可能にする。すべての抗体サンプルにおいて、凝集体の存在は、検出限界を下回った（図４）。すべての抗体に対して得られた算出分子量は、前記算出値と良好に一致していた。加えて、すべての抗体変異体の同一性は、ＭＳによって確認された（表２）。
【0101】
【表2】
【0102】
１９ＧＳ－リンカーを有する本発明によるＦｃ ＩｇＧ１変異体（ｍａｂ０７）は、わずかに早くＳＥＣカラムから溶出する。この分子において、Ｆａｂドメインは、長いリンカー（ＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ、配列番号１２）を介して、Ｆｃ領域に結合されている。この配列は、明らかに、より開いた立体配置を可能にし、わずかに拡大した流体力学的半径が得られる。その抗原であるヒトＴＮＦαへの結合は、表面プラズモン共鳴－測定によって確認された（図５）。
【0103】
ＦｃＲに対する結合アッセイ
本発明によるアダリムマブのＦｃ変異体は、ＩｇＧヒンジ領域に位置するＦｃγＲ結合部位が欠けている（図１）。したがって、それらはＦｃγＲに結合することはない。本発明によるＦｃ変異体のＦｃγＲへの結合が、実際に消失したかどうかを確認するため、本発明者らは、表面プラズモン共鳴を使用し、変異をサイレンスする他の抗体変異体と比較して、固定されたＦｃγＲへの結合を測定した。本発明者らは、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ｂ、およびｃ、ならびにＦｃγＲＩＩＩａへの結合を分析した。加えて、本発明者らは、多くの抗体およびＦｃ融合タンパク質がマウスモデルで分析されていることから、マウス活性化ＦｃγＲＩＶを含めた。最後に、抗体およびＦｃ融合タンパク質の再利用のために重要なヒトＦｃＲｎ受容体も試験パネルに含まれた。結果は、表３に要約され、対応するセンサーグラムは、図６に示される。
本発明によるアダリムマブのＦｃ変異体は、ＩｇＧヒンジ領域に位置するＦｃγＲ結合部位が欠けている（図１）。したがって、それらはＦｃγＲに結合することはない。本発明によるＦｃ変異体のＦｃγＲへの結合が、実際に消失したかどうかを確認するため、本発明者らは、表面プラズモン共鳴を使用し、変異をサイレンスする他の抗体変異体と比較して、固定されたＦｃγＲへの結合を測定した。本発明者らは、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ｂ、およびｃ、ならびにＦｃγＲＩＩＩａへの結合を分析した。加えて、本発明者らは、多くの抗体およびＦｃ融合タンパク質がマウスモデルで分析されていることから、マウス活性化ＦｃγＲＩＶを含めた。最後に、抗体およびＦｃ融合タンパク質の再利用のために重要なヒトＦｃＲｎ受容体も試験パネルに含まれた。結果は、表３に要約され、対応するセンサーグラムは、図６に示される。
【0104】
【表3】
【0105】
非修飾ＩｇＧ１骨格（ｍａｂ０１）は、すべてのＦｃγＲに結合する。最大の結合親和性は、高親和性の結合受容体として知られているＦｃγＲＩを用いて得られた。非修飾ＩｇＧ２（ｍａｂ０３）は、比較目的で試験され、ＦｃＲγＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃへのいくらかの結合、およびＦｃＲγＩＩＩａへのより少ない程度の結合を示す。本発明によるＦｃ ＩｇＧ１を有する抗体（ｍａｂ０６、ｍａｂ０７）は、試験されたすべてのＦｃγＲへの検出可能な結合を示さなかった。これは、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ａ（ｍａｂ０２）およびＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ（ｍａｂ０５）骨格変異体についても言える。ＩｇＧ１ Ｅ２６９Ｒ、Ｋ３２２Ａ変異体（ｍａｂ０４）では、ＦｃγＲＩへの高親和性の結合が、依然として測定される。ＦｃγＲＩＩＩａおよびマウスＦｃγＲＩＶへのこの変異体の結合は、著しく減少するが、依然として検出可能であった。分析されたすべてのＦｃ変異体は、ｈＦｃＲｎに対する同様の結合親和性を示す。
【0106】
機能的細胞アッセイ（ＡＤＣＣおよびＡＤＣＤ）
ＡＤＣＣおよびＡＤＣＤは、抗体のエフェクター機能にとって、最も重要な機構である。したがって、本発明者らは、本発明によるアダリムマブのＦｃ変異体が、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＤを誘導しないことを確かめたいと考えた。ＡＤＣＣアッセイにおいて、膜固定抗原を発現する標的細胞を、対象とする抗体およびエフェクター細胞と共にインキュベートした。エフェクター細胞は、標的細胞に繋げられると、活性化され、前記標的細胞を死滅させる（図７Ａ）。分析されたすべての抗体変異体は、検出可能な特異的標的細胞溶解を示さないが、ＩｇＧ１ ｗｔ変異体は、有意な特異的細胞溶解を誘発する（図７Ｂ～Ｄ）。
ＡＤＣＣおよびＡＤＣＤは、抗体のエフェクター機能にとって、最も重要な機構である。したがって、本発明者らは、本発明によるアダリムマブのＦｃ変異体が、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＤを誘導しないことを確かめたいと考えた。ＡＤＣＣアッセイにおいて、膜固定抗原を発現する標的細胞を、対象とする抗体およびエフェクター細胞と共にインキュベートした。エフェクター細胞は、標的細胞に繋げられると、活性化され、前記標的細胞を死滅させる（図７Ａ）。分析されたすべての抗体変異体は、検出可能な特異的標的細胞溶解を示さないが、ＩｇＧ１ ｗｔ変異体は、有意な特異的細胞溶解を誘発する（図７Ｂ～Ｄ）。
【0107】
ＡＤＣＤ機構は、補体系の活性化によって細胞死に繋がる。補体カスケードは、標的細胞の細胞表面における抗原抗体複合体へのＣ１ｑタンパク質の結合によって惹起される。補体カスケード活性化の最終段階は、いわゆる膜傷害複合体の形成であり、これは、細胞溶解に繋がる（図８Ａ）。ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ａ（ｍａｂ０２）およびＩｇＧ２骨格（ｍａｂ０３）は、有意な特異的細胞溶解を、依然として誘発することができる（図８Ｂ、Ｃ）。ＩｇＧ１ Ｅ２６９Ｒ、Ｋ３２２Ａ変異体（ｍａｂ０４）は、より低レベルであるが、依然として検出可能な特異的細胞溶解を惹起する。本発明によるＦｃ ＩｇＧ１変異体（ｍａｂ０６、ｍａｂ０７）およびＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ変異体（ｍａｂ０５）では、特異的細胞溶解が認められないか、または有意な特異的細胞溶解が認められなかった（図８Ｂ、Ｄ）。
【実施例2】
【0108】
ＧＬＰ１受容体アゴニストＦｃ－ドメイン融合タンパク質
ペプチドＦｃ融合タンパク質のための本発明によるＦｃフォーマットを評価し、ｉｎ ｖｉｖｏ機能性を試験するために、本発明者らは、ＧＬＰ１受容体アゴニスト（ＲＡ）Ｆｃ融合タンパク質を使用した。このため、本発明者らは、ペプチドリンカーを介して、ヒトＧＬＰ１－ＲＡをＩｇＧ４ Ｆｃ領域（図９、ＧＬＰ１－Ｆｃ０１および０４）またはＩｇＧ１ Ｆｃ領域（図９、ＧＬＰ１－Ｆｃ０２、０５～０１４）に融合した。図９は、様々なＧＬＰ１－ＲＡ－Ｆｃ融合タンパク質変異体の概観を示す。
ペプチドＦｃ融合タンパク質のための本発明によるＦｃフォーマットを評価し、ｉｎ ｖｉｖｏ機能性を試験するために、本発明者らは、ＧＬＰ１受容体アゴニスト（ＲＡ）Ｆｃ融合タンパク質を使用した。このため、本発明者らは、ペプチドリンカーを介して、ヒトＧＬＰ１－ＲＡをＩｇＧ４ Ｆｃ領域（図９、ＧＬＰ１－Ｆｃ０１および０４）またはＩｇＧ１ Ｆｃ領域（図９、ＧＬＰ１－Ｆｃ０２、０５～０１４）に融合した。図９は、様々なＧＬＰ１－ＲＡ－Ｆｃ融合タンパク質変異体の概観を示す。
【0109】
ＩｇＧ４（ＧＬＰ１－Ｆｃ０４）およびＩｇＧ１（ＧＬＰ１－Ｆｃ０５）に対する本発明による単純なＦｃ変異体に加えて、本発明者らは、ＩｇＧ１（ＧＬＰ１－Ｆｃ０６～１４）に対する本発明による９つのＦｃ変異体であって、ＣＨ２ドメインに追加の内部ジスルフィド結合を含むＦｃ変異体を生成した。これは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインよりも先にアンフォールディングすることが知られているため、ＣＨ２ドメインを、さらに安定化することを意図されている。追加の内部ジスルフィド結合を有する変異体のうちの６つは、Ｃ末端に、野生型ヒンジ領域の配列に由来する配列を有する（ＧＬＰ－Ｆｃ０６～１１）が、他の３つの変異体は、Ｃ末端に、短縮されたプロリン－システインリッチ配列を有していた（ＧＬＰ－Ｆｃ１２～１４）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１０）およびＭＡＬＳと組み合わせた分析用サイズ排除クロマトグラフィー（図１１）を用いて、すべてのＧＬＰ１－Ｆｃ－ＲＡ融合タンパク質を、均一性について分析した。分析されたすべてのサンプルにおいて、凝集体の存在は、検出限界を下回り、得られた分子量は、ホモ二量体分子の算出モル質量と良好に一致した（表４）。
【0110】
【表4】
【0111】
比較目的のために、本発明者らは、重鎖間にいかなる共有結合も有さない変異体も含めた（ＧＬＰ１－Ｆｃ０３）。他の試験された変異体とは対照的に、このＧＬＰ１－Ｆｃ０３変異体は、非還元条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥで、明確な分離を示した。
【0112】
すべての変異体についての活性は、ＧＬＰ１－Ｒ活性化アッセイで確認された。導入されたジスルフィド結合が、ＦｃＲｎへの結合に干渉しないことを明確にするため、ＦｃＲｎへの結合を、ｐＨ６．０における表面プラズモン共鳴技術を使用して確認した。ＧＬＰ１活性データおよびＦｃＲｎに対する結合データは、表５に示される。
【0113】
【表5】
【0114】
ＧＬＰ１－ＲＡ－Ｆｃ融合タンパク質の熱安定性は、ＤＳＦ法を用いて分析された（図１２、表６）。
【0115】
【表6】
【0116】
ＧＬＰ１－Ｆｃ０１（非修飾ＩｇＧ４骨格）は、１つの主なアンフォールディングイベントを示す。ＧＬＰ１－Ｆｃ０２（非修飾ＩｇＧ１骨格）は、より安定化されたタンパク質となり、２番目のアンフォールディングイベントが、明確に検出可能である。ＧＬＰ１－Ｆｃ０３（重鎖間にいかなる共有結合も有さない変異体）は、ＧＬＰ１－Ｆｃ０１およびＧＬＰ１－Ｆｃ０２よりも熱に不安定である。ＧＬＰ１－Ｆｃ０４（本発明によるＦｃ ＩｇＧ４変異体）は、ＧＬＰ１－Ｆｃ０３よりもわずかに安定している。ＧＬＰ１－Ｆｃ０２およびＧＬＰ１－Ｆｃ０３において、そのＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１由来であるのに対して、ＧＬＰ－Ｆｃ０１およびＧＬＰ１－Ｆｃ０４では、そのＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ４由来である。明確な２番目のアンフォールディングイベントが、ＩｇＧ１由来ＣＨ３ドメインを有する変異体においてのみ測定されることは、明白である（図１２Ａ）。これらのデータに基づいて、ＩｇＧ１ Ｆｃ骨格が、さらなる操作のために選ばれた。内部ジスルフィド結合は、本発明によるＦｃ変異体ＧＬＰ１－Ｆｃ０６～ＧＬＰ１－Ｆｃ１０における安定性をさらに改善するために、ＣＨ２ドメインに導入された。ＧＬＰ１－Ｆｃ０６は、わずかに高い熱安定性を示し、ＧＬＰ－Ｆｃ０７は、安定化をまったく示さなかったが、ＧＬＰ１－Ｆｃ０８、ＧＬＰ１－Ｆｃ０９、およびＧＬＰ１－Ｆｃ１０における導入されたジスルフィド結合は、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ Ｆｃ骨格（ＧＬＰ１－Ｆｃ－０２；図１２、表６）と同等の安定性を有するタンパク質をもたらした。
【0117】
本発明によるＦｃ変異体をさらに安定化するため、ヒンジ領域に相当するＦｃ領域とＣ末端配列の間のリンカー配列を除去した（ＧＬＰ１－Ｆｃ１１）。別の手法において、ヒンジ領域に相当するＣ末端配列を、プロリン－システインリッチ配列に短縮した（ＧＬＰ１－Ｆｃ１２）。これらのタンパク質において、２番目のアンフォールディングイベント（ＣＨ３ドメイン）のための熱安定性の増強が得られた（図１２Ｃ、表６）。ＣＨ２ドメイン内の内部ジスルフィド結合および短縮されたプロリン－システインリッチ配列の安定化効果は、ＧＬＰ１－Ｆｃ１３およびＧＬＰ１－Ｆｃ１４において組み合わされている（図１２Ｄ、表６）。
【0118】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける機能性
ＧＬＰ１－Ｆｃ０４では、本来のヒンジは除去されていないが、そのシステインがセリンに変異されていた。これは、本発明によるＧＬＰ１－ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ変異体であって、その親分子に可能な限り類似したＦｃ変異体を得るために行われ、この変異体は、直接薬力学解析のために選ばれた。両方のタンパク質を、ｄｂ／ｄｂ－マウスに、４日毎に１４日間皮下投与し、血糖に加えて体重もモニターした（図１３）。－１日目における平均体重（各群ｎ＝８）は、２４．９ｇ（痩せたビヒクル対照）、５４．２ｇ（ｄｂ／ｄｂビヒクル対照）、５５．４ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０１群）、および５４．８ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０４群）であった。処置期間後の平均体重は、２５．２ｇ（痩せたビヒクル対照、＋１．２％）、５７．７ｇ（ｄｂ／ｄｂビヒクル対照、＋６．５％）、５３．８ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０１群、－２．９％）、および５０．４ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０４群、－２．６％）であった。痩せたビヒクル対照において、体重は、処置期間中ほぼ一定を維持したのに対して、ｄｂ／ｄｂビヒクル対照では、体重が増加した。処置された群はいずれも、同程度の範囲で体重が減少した。両方の化合物、ＧＬＰ１－Ｆｃ０１およびＧＬＰ１－Ｆｃ０４は、血糖の変化に対して識別可能な効果を示さなかった。これらの所見は、ＧＬＰ１－ＲＡは、本発明によるＦｃ変異体に融合される場合、その完全な活性を維持することを示唆する。前記期間にわたる血糖変化のプロファイルが一致することは、本発明によるＦｃ変異体の再利用機能が、ｉｎ ｖｉｖｏで損なわれていないことを示唆する。
ＧＬＰ１－Ｆｃ０４では、本来のヒンジは除去されていないが、そのシステインがセリンに変異されていた。これは、本発明によるＧＬＰ１－ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ変異体であって、その親分子に可能な限り類似したＦｃ変異体を得るために行われ、この変異体は、直接薬力学解析のために選ばれた。両方のタンパク質を、ｄｂ／ｄｂ－マウスに、４日毎に１４日間皮下投与し、血糖に加えて体重もモニターした（図１３）。－１日目における平均体重（各群ｎ＝８）は、２４．９ｇ（痩せたビヒクル対照）、５４．２ｇ（ｄｂ／ｄｂビヒクル対照）、５５．４ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０１群）、および５４．８ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０４群）であった。処置期間後の平均体重は、２５．２ｇ（痩せたビヒクル対照、＋１．２％）、５７．７ｇ（ｄｂ／ｄｂビヒクル対照、＋６．５％）、５３．８ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０１群、－２．９％）、および５０．４ｇ（ＧＬＰ１－Ｆｃ０４群、－２．６％）であった。痩せたビヒクル対照において、体重は、処置期間中ほぼ一定を維持したのに対して、ｄｂ／ｄｂビヒクル対照では、体重が増加した。処置された群はいずれも、同程度の範囲で体重が減少した。両方の化合物、ＧＬＰ１－Ｆｃ０１およびＧＬＰ１－Ｆｃ０４は、血糖の変化に対して識別可能な効果を示さなかった。これらの所見は、ＧＬＰ１－ＲＡは、本発明によるＦｃ変異体に融合される場合、その完全な活性を維持することを示唆する。前記期間にわたる血糖変化のプロファイルが一致することは、本発明によるＦｃ変異体の再利用機能が、ｉｎ ｖｉｖｏで損なわれていないことを示唆する。
【0119】
開示項目
以下の項目についても開示される：
１．２つのポリペプチドを含む分子であって、
前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を形成し、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合によって結合されており、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置するジスルフィド結合によって結合されていない、
分子。
２．前記２つの共有結合が、２つのジスルフィド結合である、請求項１に記載の分子。
３．前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合が、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる、請求項１または２に記載の分子。
４．Ｃ１ｑならびに／またはＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、および／もしくはＦｃγＲ３に対する親和性が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、少なくとも１０分の１に低下している、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子。
５．プロテインＡおよび／またはＦｃｇＲｎに対する親和性が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、低下していない、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
６．前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのＦｃ領域である、請求項１～５のいずれか一項に記載の分子。
７．前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。
８．前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域である、請求項１～７のいずれか一項に記載の分子。
９．前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～８のいずれか一項に記載の分子。
１０．前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～９のいずれか一項に記載の分子。
１１．各ポリペプチドが、前記Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれが、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の分子。
１２．前記追加の内部ジスルフィド結合が、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、請求項１１に記載の分子。
１３．前記ポリペプチドのそれぞれが、前記Ｆｃ領域を形成しているポリペプチドの部分のＣ末端を、Ｆｃ領域を形成しているポリペプチドの前記部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合に結合させるリンカーを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の分子。
１４．前記分子が、少なくとも１つの活性部分をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の分子。
１５．請求項１～１４のいずれか一項に記載の分子をコードしているポリヌクレオチド。
以下の項目についても開示される：
１．２つのポリペプチドを含む分子であって、
前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を形成し、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合によって結合されており、
前記２つのポリペプチドは、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置するジスルフィド結合によって結合されていない、
分子。
２．前記２つの共有結合が、２つのジスルフィド結合である、請求項１に記載の分子。
３．前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合が、抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列に相当する配列中に含まれる、請求項１または２に記載の分子。
４．Ｃ１ｑならびに／またはＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、および／もしくはＦｃγＲ３に対する親和性が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、少なくとも１０分の１に低下している、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子。
５．プロテインＡおよび／またはＦｃｇＲｎに対する親和性が、前記Ｆｃ領域を形成する各ポリペプチドの部分のＮ末端に位置する抗体ヒンジ領域を含む同じ分子と比較して、低下していない、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
６．前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのＦｃ領域である、請求項１～５のいずれか一項に記載の分子。
７．前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。
８．前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域である、請求項１～７のいずれか一項に記載の分子。
９．前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～８のいずれか一項に記載の分子。
１０．前記少なくとも２つの共有結合が、各ポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～９のいずれか一項に記載の分子。
１１．各ポリペプチドが、前記Ｆｃ領域の一部であるＣＨ２ドメインを含み、これらのＣＨ２ドメインのそれぞれが、対応する野生型ＣＨ２ドメインには存在しない内部ジスルフィド結合を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の分子。
１２．前記追加の内部ジスルフィド結合が、ＥＵ番号付けに従った以下の位置：Ｐ２３８ＣとＤ２６５Ｃ；Ｐ２３８ＣとＡ３２７Ｃ；Ｐ２３８ＣとＬ３２８Ｃ；Ｓ２６７ＣとＡ３２７Ｃ；およびＶ２４０ＣとＩ３３２Ｃにおけるシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合からなる群から選択される、請求項１１に記載の分子。
１３．前記ポリペプチドのそれぞれが、前記Ｆｃ領域を形成しているポリペプチドの部分のＣ末端を、Ｆｃ領域を形成しているポリペプチドの前記部分のＣ末端に位置する少なくとも２つの共有結合に結合させるリンカーを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の分子。
１４．前記分子が、少なくとも１つの活性部分をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の分子。
１５．請求項１～１４のいずれか一項に記載の分子をコードしているポリヌクレオチド。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】