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特表2024-500966メラノコルチン受容体アゴニスト化合物の結晶形Ｉおよびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-10
(54)【発明の名称】メラノコルチン受容体アゴニスト化合物の結晶形Ｉおよびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07D 207/16 20060101AFI20231227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20231227BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231227BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231227BHJP
A61P 15/10 20060101ALI20231227BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20231227BHJP
【ＦＩ】
C07D207/16 CSP
A61P43/00 111
A61P3/04
A61P3/10
A61P29/00
A61P15/10
A61K31/5377
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538839
(86)(22)【出願日】2021-12-22
(85)【翻訳文提出日】2023-06-22
(86)【国際出願番号】 KR2021019583
(87)【国際公開番号】W WO2022139443
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】10-2020-0180807
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500239823
【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100122161
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 崇
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ユン・キム
(72)【発明者】
【氏名】サン・デ・イ
(72)【発明者】
【氏名】リ・ラ・キム
(72)【発明者】
【氏名】スン・ウォン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ホ・ヨン・イ
(72)【発明者】
【氏名】スル・ア・チュン
(72)【発明者】
【氏名】ジン・オク・ハム
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC73
4C086GA06
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA05
4C086NA14
4C086ZA70
4C086ZA81
4C086ZC35
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、化学式１で表される化合物の結晶形Ｉ、その製造方法およびこれを含む薬学的組成物に関する。本発明の化学式１で表される化合物の結晶形Ｉは、ＸＲＰＤパターン、ＤＳＣプロファイル、ＴＧＡプロファイルおよび／またはＤＶＳプロファイルにより特性化することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１の化合物、その薬学的に許容可能な塩またはその溶媒和物の結晶形Ｉであって、Ｘ線粉末回折パターン（ＸＲＰＤ）で、下記回折角（２θ値）：８．２４０±０．２゜、９．３６３±０．２゜、１０．２６９３±０．２゜、１０．５９６９±０．２゜、１２．０５０±０．２゜、１２．８４１±０．２゜、１３．５０３±０．２゜、１５．５７３８±０．２゜、１６．６０３０±０．２゜、１７．００９±０．２゜、１７．３０５±０．２゜、１８．３６４±０．２゜、１８．７３９０±０．２゜、１９．１８８±０．２゜、１９．４７６±０．２゜、２０．００１±０．２゜、２０．４７７±０．２゜、２０．６６５±０．２゜、２１．３４８±０．２゜、２１．９７６±０．２゜、２２．５８０±０．２゜、２３．８９６±０．２゜、４．３３４±０．２゜、２４．８１２±０．２゜、２５．２４３±０．２゜、２５．８３３±０．２゜、２６．６４６±０．２゜、２７．８２±０．２゜、２８．３１６±０．２゜、２８．６０９±０．２゜、２９．６９２±０．２゜、３０．１８５±０．２゜および３０．８７５±０．２゜から選択される３個以上の特徴的なピークを有する、結晶形Ｉ。
【化1】
Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ５アルキルである）
【請求項2】
前記Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ４アルキルである、請求項１に記載の結晶形Ｉ。
【請求項3】
前記化学式１の化合物が、Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドである、請求項２に記載の結晶形Ｉ。
【請求項4】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩およびヨウ化水素酸塩からなる群から選択される、請求項１に記載の結晶形Ｉ。
【請求項5】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の結晶形Ｉの製造方法であって、結晶化溶媒に前記化学式１の化合物を溶解させて混合溶液を製造するステップと、
前記混合溶液から結晶を取得するステップとを含む、結晶形Ｉの製造方法。
【請求項6】
前記結晶化溶媒は、有機溶媒を含む、請求項５に記載の結晶形Ｉの製造方法。
【請求項7】
前記有機溶媒は、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソアミルエーテル、エチルメチルエーテル、メチルプロピルエーテル、メチルブチルエーテル、エチルプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジフェニルエーテル、アニソル、ジメチルアセトアミド、メチルイソブチルケトン、イソプロピルアセテート、１－ペンチルアルコール、トルエンまたはこれらの混合物を含む、請求項６に記載の結晶形Ｉの製造方法。
【請求項8】
前記有機溶媒は、メチルターシャリーブチルエーテルを含む、請求項７に記載の結晶形Ｉの製造方法。
【請求項9】
前記結晶を取得するステップは、前記混合溶液を冷却すること、攪拌することおよび濾過することのうち少なくとも一つを含む、請求項５に記載の結晶形Ｉの製造方法。
【請求項10】
前記結晶を取得するステップは、前記混合溶液を０～１０℃の温度に冷却することを含む、請求項９に記載の結晶形Ｉの製造方法。
【請求項11】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の結晶形Ｉ、および薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項12】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の結晶形Ｉ、および薬学的に許容可能な担体を含む、メラノコルチン－４受容体機能亢進用薬学的組成物。
【請求項13】
前記組成物は、肥満、糖尿、炎症または勃起不全の予防または治療用である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年１２月２２日付けの韓国特許出願第１０－２０２０－０１８０８０７号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されている全ての内容は、本明細書の一部として組み込まれる。
【0002】
本発明は、メラノコルチン受容体に対する優れた亢進活性を示す新規化合物の結晶形Ｉ、その製造方法およびこれを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）タンパク質は、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）によって分泌するホルモンであり、体内脂肪の含量の増加に伴い分泌量が増加し、視床下部（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）で生成される様々な神経ペプチド（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）の機能を調節することで、食欲、体脂肪含量およびエネルギー代謝をはじめ、様々な生体内機能を調節する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０４，６６１－６７１（２０００））。レプチンタンパク質による食欲と体重調節のシグナル伝達は、その下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に様々な要因の調節により行われ、その最も代表的なものが、メラノコルチン（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）、ＡｇＲＰ（ａｇｏｕｔｉｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）および神経ペプチドＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ、ＮＰＹ）ホルモンである。
【0004】
生体内のカロリー過多による結果として、血液内のレプチンの濃度が増加すると、脳下垂体（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｇｌａｎｄ）でのプロオピオメラノコルチン（ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ；ＰＯＭＣ）タンパク質ホルモンの分泌は増加し、ＡｇＲＰとＮＰＹの生成は減少する。ＰＯＭＣ神経細胞から小さなペプチドホルモンであるａｌｐｈａ－ＭＳＨ（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が生成され、このホルモンは、二次神経細胞のメラノコルチン－４受容体（Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ－４ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＭＣ４Ｒ）アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）として、食欲減少を結果的に誘導する。一方、カロリー不足による結果として、レプチンの濃度が減少すると、ＭＣ４Ｒ拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるＡｇＲＰの発現が増加し、ＮＰＹの発現も増加して、結果的に食欲を増進させる。すなわち、レプチンの変化に応じて、ａｌｐｈａ－ＭＳＨホルモンとＡｇＲＰホルモンは、ＭＣ４Ｒに対して亢進と拮抗の役割を行うことで、食欲調節に関わる。
【0005】
Ａｌｐｈａ－ＭＳＨホルモンは、ＭＣ４Ｒ以外に３つのＭＣＲ ｓｕｂｔｙｐｅにも結合して、様々な生理反応を誘導する。現在まで５種のＭＣＲ ｓｕｂｔｙｐｅが究明されており、そのうち、ＭＣ１Ｒの場合、主に皮膚細胞で発現し、メラニン色素調節（ｓｋｉｎｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に関わり、ＭＣ２Ｒは、副腎（ａｄｒｅｎａｌ ｇｌａｎｄ）で主に発現し、グルココルチコイドホルモン（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）の生成に関わると知られており、ＰＯＭＣから由来したＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）のみがそのリガンドである。中枢神経系で主に発現するＭＣ３ＲとＭＣ４Ｒは、食欲、エネルギー代謝および体内脂肪貯蔵効率の調節などに関わり、様々な組織で発現するＭＣ５Ｒは、外分泌機能（ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を調節すると知られている（Ｗｉｋｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ４２（５）３９３－４２０（２０００））。特に、ＭＣ４Ｒ受容体の活性化は、食欲の減少とエネルギー代謝の増加を誘導することで、体重を効率的に減少させる効果を示すことから、肥満治療剤の開発の主な作用点として立証されている（Ｒｅｖｉｅｗ：Ｗｉｋｂｅｒｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３７５，２９５－３１０（１９９９））；Ｗｉｋｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ４２（５）３９３－４２０（２０００）；Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ ４５０，９３－１０９（２００２）；Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １０，３５１－３５２（２００４））。
【0006】
食欲と体重調節において、ＭＣ４Ｒの役割は、アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）タンパク質の異常発現動物モデル（ａｇｏｕｔｉ ｍｏｕｓｅ）実験により一次的に立証された。アグーチマウス（Ａｇｏｕｔｉ ｍｏｕｓｅ）の場合、遺伝的変異によってアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）タンパク質が中枢神経系にも高い濃度で発現し、視床下部でＭＣ４Ｒの拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の役割を果たすことで、肥満を誘導することが明らかになっている（Ｙｅｎ，ＴＴ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８，４７９－４８８（１９９４）；Ｌｕ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７１，７９９－８０２（１９９４））。以降の研究結果では、視床下部神経で、実際、アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）タンパク質と類似のＡｇＲＰ（ａｇｏｕｔｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）が発現することが観察され、これらもＭＣ４Ｒに対する拮抗剤として食欲調節に関わると知られている（Ｓｈｕｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１１，５９３－６０２（１９９７）；Ｏｌｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８，１３５－１３８（１９９７））。
【0007】
生体内のＭＣ４Ｒアゴニストであるａｌｐｈａ－ＭＳＨを動物に対して大脳投与すると、食欲を減少する効果が示され、これに対して、ＭＣ４Ｒ拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるＳＨＵ９１１９（ｐｅｐｔｉｄｅ）またはＨＳ０１４（ｐｅｐｔｉｄｅ）を処理すると、食欲をまた増加させる現象が観察されている（Ｋａｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４５，９０－９３（１９９８））。それだけでなく、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ ＩＩ（ＭＴＩＩ、Ａｃ－Ｎｌｅ－ｃ［Ａｓｐ－Ｈｉｓ－ＤＰｈｅ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ］－ＮＨ２）とその類似のアゴニストであるＨＰ２２８を用いた動物試験において、大脳、腹腔または皮下投与の後、食欲抑制、体重減少、エネルギー代謝の増加の効能などが確認されている（Ｔｈｉｅｌｅ Ｔ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７４（１ Ｐｔ ２），Ｒ２４８－５４（１９９８）；Ｌｅｅ Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １２，Ａ５５２（１９９８）；Ｍｕｒｐｈｙ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８９，２７３－８２（２０００））。これとは逆に、代表的なＳＨＵ９１１９を動物に投与すると、顕著且つ継続した飼料摂取および体重増加を示し、ＭＣＲアゴニストが肥満治療剤になることができるという薬理学的な証拠を提供する。ＭＴＩＩ投与時に著しく現れる食欲減少効果が、ＭＣ４Ｒ ＫＯ（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）マウスでは現れないが、この実験結果は、食欲減少効果が、主に、ＭＣ４Ｒの活性化により行われていることをまた証明する（Ｍａｒｓｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２１，１１９－１２２（１９９９））。
【0008】
現在まで開発されている肥満治療剤としては、中枢神経系に作用する食欲抑制剤が主な種類であり、中でも、神経シグナル伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）の作用を調節する薬物がほとんどであった。その例としては、ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎ ａｇｅｎｔであるフェンテルミン（ｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ）およびマジンドール（ｍａｚｉｎｄｏｌ）と、ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ ａｇｅｎｔであるフルオキセチン（ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ）およびシブトラミン（ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）などがある。しかし、前記神経シグナル伝達物質調節剤の場合は、数多いサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）受容体により、食欲阻害の他に様々な生理作用にも広範な影響を及ぼす。したがって、前記調節剤の場合、各サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）別に選択性が欠如し、長期間投与すると、様々な副作用が伴われる大きな欠点がある。
【0009】
一方、メラノコルチンアゴニストは、神経シグナル伝達物質ではなく、神経ペプチド（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）であり、ＭＣ４Ｒ遺伝子ＫＯマウスにおいてエネルギー代謝以外の他の機能は全て正常である点からみて、他の生理機能に対する影響なしに、食欲阻害による体重減少のみを誘導することができるという点で作用点としての利点を有する。特に、その受容体が、現在まで開発されている新薬作用点のうち最も成功的な範疇に属するＧ－タンパク質結合受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）として、ｓｕｂｔｙｐｅ受容体に対する選択性の確保が相対的に容易であるという面が、既存の作用点とは大きく区別される。
【0010】
このようなメラノコルチン受容体を作用点として活用した例として、国際公開番号ＷＯ２００８／００７９３０号およびＷＯ２０１０／０５６０２２号では、メラノコルチン受容体のアゴニストとしての化合物を開示している。
【0011】
また、本発明の発明者らは、鋭意研究を重ねて、メラノコルチン受容体、特に、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対する選択的な亢進活性に優れた下記化学式１の新規な化合物およびその製造方法を発明している（韓国出願番号第１０－２０１９－０１４１６４９号（２０１９．１１．０７．出願））。
【0012】
【化1】
【0013】
一方、薬学的に活性である成分の結晶構造は、時にはその薬物の化学的安定性に影響を及ぼす。相違する結晶化条件および貯蔵条件は、その化合物の結晶構造を変化させる可能性があり、時には異なる形態の結晶形が伴われる生産を引き起こす可能性がある。一般的に、無定形薬物生成物は、規則的な結晶構造を有しておらず、時には不良な生成物安定性、さらに小さな粒子径、難しい濾過、凝集しやすさおよび不良な流動性といったその他の欠陥を有する。したがって、生成物の様々な物性を改善する必要がある。このように、一つの化合物に対して、高純度および良好な化学的安定性を有する結晶構造について研究する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】国際特許出願公開番号ＷＯ２００８／００７９３０号
【特許文献2】国際特許出願公開番号ＷＯ２０１０／０５６０２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明の目的は、メラノコルチン受容体、特に、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対する選択的な亢進活性に優れる新規な化合物の安定した結晶形およびその製造方法を提供することである。
【0016】
本発明の他の目的は、前記新規な化合物の安定した結晶形を含む薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0017】
上記目的を達成するために、
一側面において、本発明は、下記化学式１の化合物、その薬学的に許容可能な塩またはその溶媒和物の結晶形Ｉであって、
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ、Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）パターンで、下記回折角（２θ値）：８．２４０±０．２゜、９．３６３±０．２゜、１０．２６９３±０．２゜、１０．５９６９±０．２゜、１２．０５０±０．２゜、１２．８４１±０．２゜、１３．５０３±０．２゜、１５．５７３８±０．２゜、１６．６０３０±０．２゜、１７．００９±０．２゜、１７．３０５±０．２゜、１８．３６４±０．２゜、１８．７３９０±０．２゜、１９．１８８±０．２゜、１９．４７６±０．２゜、２０．００１±０．２゜、２０．４７７±０．２゜、２０．６６５±０．２゜、２１．３４８±０．２゜、２１．９７６±０．２゜、２２．５８０±０．２゜、２３．８９６±０．２゜、４．３３４±０．２゜、２４．８１２±０．２゜、２５．２４３±０．２゜、２５．８３３±０．２゜、２６．６４６±０．２゜、２７．８２±０．２゜、２８．３１６±０．２゜、２８．６０９±０．２゜、２９．６９２±０．２゜、３０．１８５±０．２゜および３０．８７５±０．２゜から選択される３個以上の特徴的なピークを有する、結晶形Ｉを提供する。
一側面において、本発明は、下記化学式１の化合物、その薬学的に許容可能な塩またはその溶媒和物の結晶形Ｉであって、
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ、Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）パターンで、下記回折角（２θ値）：８．２４０±０．２゜、９．３６３±０．２゜、１０．２６９３±０．２゜、１０．５９６９±０．２゜、１２．０５０±０．２゜、１２．８４１±０．２゜、１３．５０３±０．２゜、１５．５７３８±０．２゜、１６．６０３０±０．２゜、１７．００９±０．２゜、１７．３０５±０．２゜、１８．３６４±０．２゜、１８．７３９０±０．２゜、１９．１８８±０．２゜、１９．４７６±０．２゜、２０．００１±０．２゜、２０．４７７±０．２゜、２０．６６５±０．２゜、２１．３４８±０．２゜、２１．９７６±０．２゜、２２．５８０±０．２゜、２３．８９６±０．２゜、４．３３４±０．２゜、２４．８１２±０．２゜、２５．２４３±０．２゜、２５．８３３±０．２゜、２６．６４６±０．２゜、２７．８２±０．２゜、２８．３１６±０．２゜、２８．６０９±０．２゜、２９．６９２±０．２゜、３０．１８５±０．２゜および３０．８７５±０．２゜から選択される３個以上の特徴的なピークを有する、結晶形Ｉを提供する。
【0018】
【化2】
【0019】
前記化学式１中、
Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ５アルキルである。
Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ５アルキルである。
【0020】
前記化学式１の化合物は、不斉炭素中心と不斉軸または不斉平面を有することができ、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体、ＲまたはＳ異性体、ラセミ体、部分立体異性体混合物および個々の部分立体異性体として存在することができ、これらの全ての異性体および混合物は、前記化学式１の化合物の範囲に含まれる。
【0021】
本明細書において、便宜上、他に断らない限り、化学式１の化合物は、化学式１の化合物、その薬学的に許容可能な塩、その異性体およびその溶媒和物を全て含む意味で使用される。
【0022】
本発明による一具体例において、前記化学式１のＲ１は、Ｃ２～Ｃ５アルキルである。本発明による他の具体例において、前記化学式１のＲ１は、直鎖または分岐状のＣ２～Ｃ５アルキル、例えば、エチル、n－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルまたはｔｅｒｔ－ブチルである。
【0023】
本発明による他の具体例において、前記化学式１のＲ１は、Ｃ２～Ｃ４アルキルである。本発明による他の具体例において、前記化学式１のＲ１は、直鎖または分岐状のＣ２～Ｃ４アルキル、例えば、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルである。具体的には、前記Ｒ１は、ｉｓｏ－プロピルであることができる。
【0024】
本発明による一具体例において、前記薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、卜リクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸などのスルホン酸などにより形成された酸付加塩を含むが、これに制限されるものではない。
【0025】
本発明による一具体例において、前記溶媒和物（ｓｏｌｖａｔｅ）は、水和物；メタノール、エタノール、２－プロパノール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、ｎ－ブタノール、１，４－ブタンジオール、ｔｅｒｔ－ブタノール、酢酸、アセトン、ブチルアセテート、メチルアセテート、エチルアセテート、プロピルアセテート、ｔ－ブチルアセテート、イソブチルアセテート、メチルエチルケトン、２－ペンタノン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、トルエンおよびこれらの混合物などの有機溶媒との溶媒和物を含むことができる。
【0026】
本発明による一具体例において、結晶形Ｉは、Ｘ線粉末回折パターンで、８．２４０±０．２゜、９．３６３±０．２゜、１０．２６９３±０．２゜、１０．５９６９±０．２゜、１２．０５０±０．２゜、１２．８４１±０．２゜、１３．５０３±０．２゜、１５．５７３８±０．２゜、１６．６０３０±０．２゜、１７．００９±０．２゜、１７．３０５±０．２゜、１８．３６４±０．２゜、１８．７３９０±０．２゜、１９．１８８±０．２゜、１９．４７６±０．２゜、２０．００１±０．２゜、２０．４７７±０．２゜、２０．６６５±０．２゜、２１．３４８±０．２゜、２１．９７６±０．２゜、２２．５８０±０．２゜、２３．８９６±０．２゜、４．３３４±０．２゜、２４．８１２±０．２゜、２５．２４３±０．２゜、２５．８３３±０．２゜、２６．６４６±０．２゜、２７．８２±０．２゜、２８．３１６±０．２゜、２８．６０９±０．２゜、２９．６９２±０．２゜、３０．１８５±０．２゜および３０．８７５±０．２゜から選択される３個以上、５個以上、７個以上、９個以上、１０個以上、１３個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、２３個以上、２５個以上、２７個以上または３０個以上の特徴的なピークを有することができる。
【0027】
本発明による他の具体例において、結晶形Ｉは、Ｘ線粉末回折パターンで、８．２４０±０．２゜、９．３６３±０．２゜、１０．２６９３±０．２゜、１０．５９６９±０．２゜、１２．０５０±０．２゜、１２．８４１±０．２゜、１３．５０３±０．２゜、１５．５７３８±０．２゜、１６．６０３０±０．２゜、１７．００９±０．２゜、１７．３０５±０．２゜、１８．３６４±０．２゜、１８．７３９０±０．２゜、１９．１８８±０．２゜、１９．４７６±０．２゜、２０．００１±０．２゜、２０．４７７±０．２゜、２０．６６５±０．２゜、２１．３４８±０．２゜、２１．９７６±０．２゜、２２．５８０±０．２゜、２３．８９６±０．２゜、４．３３４±０．２゜、２４．８１２±０．２゜、２５．２４３±０．２゜、２５．８３３±０．２゜、２６．６４６±０．２゜、２７．８２±０．２゜、２８．３１６±０．２゜、２８．６０９±０．２゜、２９．６９２±０．２゜、３０．１８５±０．２゜および３０．８７５±０．２゜の特徴的なピークを有することができる。
【0028】
本発明による一具体例において、前記結晶形Ｉは、図１に示したＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを有することができる。
【0029】
本発明による結晶形Ｉは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイルで、１５５～１６５℃で吸熱ピークが示されることができる。溶融吸熱は、開始温度１５９．１４゜で開始することができる。
【0030】
本発明による一具体例において、前記結晶形Ｉは、図２に示したＤＳＣプロファイルを有することができる。
【0031】
本発明による結晶形Ｉは、熱重量分析（ＴＧＡ）プロファイルで、２７０℃以下の温度で加熱した時に、重量損失が観察されないことができる。前記用語「重量損失が観察されない」とは、例えば、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０％（すなわち、重量損失が全くない）の重量損失を有することを含むことができる。
【0032】
本発明による一具体例において、前記結晶形Ｉは、図３に示したＴＧＡプロファイルを有することができる。
【0033】
本発明による結晶形Ｉは、水分吸着分析（ＤＶＳ）の結果、０～９０％ＲＨで観察された全重量の増加が、５％ｗ／ｗ以下、例えば、４％ｗ／ｗ以下、３％ｗ／ｗ以下、２％ｗ／ｗ以下、１％ｗ／ｗ以下、０．５％ｗ／ｗ以下または０．２％ｗ／ｗを示すことができる。
【0034】
本発明による一具体例において、前記結晶形Ｉは、図４に示したＤＶＳプロファイルを有することができる。
【0035】
本発明による結晶形Ｉは、安定性試験の結果（ＨＰＬＣ）、加速条件（４０℃、７５％ＲＨ）および過酷条件（８０℃）で、４週間化学的安定性を示したことから、熱および湿度に安定した結晶形であることが分かる。
【0036】
本明細書において、
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析は、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ Ｐｅｒｔ Ｐｒｏ ＭＰＤ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄを用いて行った結果を示す。
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析は、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ Ｐｅｒｔ Ｐｒｏ ＭＰＤ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄを用いて行った結果を示す。
【0037】
示差走査熱量（ＤＳＣ）分析は、ＤＳＣ１，Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ ＡＧを用いて行った結果を示す。
【0038】
熱重量分析（ＴＧＡ）は、ＴＧＡ／ＤＳＣ １，Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ ＡＧを用いて行った結果を示す。
【0039】
水分吸着分析（ＤＶＳ）は、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｖａｐｏｒ ｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａｈｎ Ｄ２００ ｕｌｔｒａ－ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ（ＤＶＳ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて行った結果を示す。
【0040】
安定性分析は、ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃを用いて行った結果を示す。
【0041】
前記結晶形Ｉは、粗製の化学式１の化合物、無定形の化学式１の化合物または化学式１の化合物の他の結晶形に比べて純度がさらに高いことができ、物理的および化学的にさらに安定していることができる。
【0042】
それだけでなく、前記化学式１の化合物の結晶形Ｉは、公知のメラノコルチン－４－受容体アゴニストに比べて、メラノコルチン－４受容体に対する亢進能力、肥満、糖尿、炎症、勃起不全などの疾病に対する予防または治療効果がさらに優れていることができるが、本発明の効果がこれに制限されるものではない。
【0043】
他の側面において、本発明は、結晶化溶媒に前記化学式１の化合物を溶解させて混合溶液を製造するステップと、前記混合溶液から結晶を取得するステップとを含む、結晶形Ｉの製造方法を提供する。
【0044】
先ず、前記化学式１で表される化合物を結晶化溶媒に溶解させる。
【0045】
前記結晶形Ｉの製造のための、前記化学式１の化合物は、化学式１の化合物、その塩、その異性体、またはこれらの溶媒和物であることができる。
【0046】
前記化学式１の化合物は、韓国出願番号第１０－２０１９－０１４１６４９号（２０１９年１１月０７日出願）の明細書に記載の製造方法によって取得されることができる。
【0047】
前記結晶化溶媒は、化合物の結晶化のための適切な溶媒であれば、特に制限なく使用可能である。一具体例において、前記結晶化溶媒は、有機溶媒を含む。
【0048】
前記有機溶媒は、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソアミルエーテル、エチルメチルエーテル、メチルプロピルエーテル、メチルブチルエーテル、エチルプロピルエーテルなどのジアルキルエーテル系溶媒；テトラヒドロフラン、テトラヒドロピランなどの環状エーテル系溶媒；ジフェニルエーテル、アニソルなどの芳香環含有エーテル系溶媒；ジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒；イソプロピルアセテートなどのエステル系溶媒；１－ペンチルアルコールなどのアルコール系溶媒；トルエンなどのトルエン系溶媒；またはこれらの混合物；を含むことができる。
【0049】
本発明による一具体例において、前記有機溶媒は、エーテル系溶媒であることができる。
【0050】
本発明による他の具体例において、前記有機溶媒は、メチルターシャリーブチルエーテル（ｍｅｔｈｙｌ ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＭＴＢＥ）を含むことができる。
【0051】
一具体例において、前記結晶化溶媒は、前記化学式１の化合物を完全に溶解させる量で使用されることができる。
【0052】
一具体例において、前記化学式１の化合物１ｇに対して、結晶化溶媒は、０．５～１０ｍＬ、０．５～５ｍＬ、０．８～３ｍＬ、１．０～２．５ｍＬ、１．５～２ｍＬ、１．６～１．８ｍＬまたは１．６２５ｍＬを使用することができる。
【0053】
前記化学式１の粗製の化合物の溶媒での溶解は、１５～３０℃、具体的には、２３～２８℃の温度で攪拌なしにまたは攪拌下で行われることができる。
【0054】
本発明による一具体例において、前記化学式１の化合物０．６ｇに対して、ＭＴＢＥ０．９７５ｍＬを用いて、２５℃で、化学式１の化合物が溶解された混合溶液を取得することができる。
【0055】
次に、前記化学式１の化合物が溶解された混合溶液から結晶を取得する。
【0056】
前記結晶の取得は、例えば、溶液を冷却させるか、溶媒を蒸発させるか、逆溶媒を添加して過飽和させるか、スラリー転換などの方法を使用することから行われることができる。
【0057】
また、任意の順序で前記混合溶液を攪拌することおよび濾過することのうち少なくとも一つをさらに含むことができる。
【0058】
本発明による一具体例において、前記混合溶液を冷却した後、攪拌し、濾過して、結晶を取得することができる。
【0059】
前記冷却は、前記酸が滴加された混合溶液の温度が０℃～１０℃になるように行うことであり得る。具体的には、前記冷却は、前記混合溶液の温度が０℃～５℃、または３℃になるように行うことであり得る。
【0060】
前記攪拌は、これに制限されるものではないが、例えば、１時間～７２時間、１０時間～４８時間、１５時間～３６時間、２０時間～２４時間または２１時間行うことができる。
【0061】
本発明の製造方法は、結晶形Ｉの製造方法の任意のステップで非極性有機溶媒を添加するステップをさらに含むことができる。一具体例において、混合溶液を製造する前、混合溶液を製造しながら、混合溶液を製造した後、冷却する前、冷却した後、冷却と同時に、または冷却した混合溶液を攪拌する前、攪拌した後、または攪拌と同時に、溶液に非極性有機溶媒を添加するステップをさらに含むことができる。前記非極性有機溶媒を添加して結晶化粒子の生成速度を増加させることで、取得される結晶形Ｉの収率または生産安定性を優秀にすることができるが、本発明がこれに限定されるものではない。
【0062】
前記非極性有機溶媒は、非極性特性を有する有機溶媒であれば、特に制限なく使用可能であるが、例えば、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、四塩化炭素、ベンゼン、クロロホルムなどを使用することができる。
【0063】
前記のように取得された結晶形Ｉは、粗製の化学式１の化合物、化学式１の無定形化合物または化学式１の任意の結晶形に比べて純度がさらに高いことができ、物理的および化学的にさらに安定していることができるが、本発明の効果がこれに制限されるものではない。
【0064】
さらに他の側面において、本発明は、（ｉ）前記結晶形Ｉ；および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
【0065】
本発明による結晶形Ｉは、メラノコルチン受容体、特に、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対して優れた亢進作用を示すことから、また、本発明は、上述の結晶形Ｉを有効成分として含むメラノコルチン受容体の機能亢進用薬学的組成物を提供することができる。具体的には、前記薬学的組成物は、メラノコルチン－４受容体機能亢進用組成物であることができる。
【0066】
また、前記薬学的組成物は、肥満、糖尿、炎症および勃起不全症に対する予防または治療に優れた効果を示すことができ、肥満の予防または治療用、糖尿の予防または治療用、炎症の予防または治療用、または勃起不全の予防または治療用組成物であることができるが、本発明の用途がこれらの疾病にのみ制限されるものではない。
【0067】
本明細書において、「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、細胞または組織内への化合物の投入を容易にする化合物を意味する。
【0068】
本発明の結晶形Ｉを臨床的な目的で投与する時に、単一容量または分離容量で宿主に投与される総一日容量は、体重１ｋｇ当たり０．０１～１０ｍｇの範囲が好ましいが、個々の患者に対する特異的な容量水準は、使用される特定の化合物、患者の体重、性別、健康状態、食餌、薬剤の投与時間、投与方法、排泄率、薬剤混合および疾患の重症度などに応じて変化することができる。
【0069】
本発明の結晶形Ｉは、目的に応じて、如何なる経路でも投与可能である。例えば、本発明の無定形の化合物は、注射または経口投与が可能である。
【0070】
本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、粒剤、シロップまたはエマルジョンのような様々な経口投与の形態であることができ、または筋肉内、静脈内または皮下投与のための注射用製剤のような非経口投与の形態であることができる。
【0071】
注射用製剤は、公知の技術に応じて、好適な分散剤、湿潤剤、懸濁剤、または賦形剤を使用して製造することができる。
【0072】
本発明の薬学的製剤に使用可能な賦形剤としては、甘味剤、結合剤、溶解剤、溶解補助剤、湿潤剤、乳化剤、等張化剤、吸着剤、崩壊剤、酸化防止剤、防腐剤、滑沢剤、充填剤、芳香剤などが含まれることができるが、これに制限されない。例えば、賦形剤として、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシン、シリカ、マグネシウムアルミニウムケイ酸塩、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、アルギニン酸、ナトリウムアルギニン酸塩、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、オレンジエッセンス、ストロベリーエッセンス、バニラ香などが使用されることができる。
【0073】
本発明の薬学的組成物が経口投与の形態である場合、使用される担体の例としては、セルロース、ケイ酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、リン酸カルシウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ゼラチン、タルクなどが挙げられるが、これに制限されない。
【0074】
本発明の薬学的組成物が注射用製剤の形態である場合、前記担体としては、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、疑似糖水溶液、アルコール、グリコール、エーテル、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステル、グリセリドなどが挙げられるが、これに制限されない。
【0075】
さらに他の側面において、メラノコルチン受容体、特に、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）の機能亢進用途に使用するための上述の結晶形Ｉを提供する。
【0076】
一実施形態において、肥満、糖尿、炎症または勃起不全の治療または予防用途に使用するための、上述の結晶形Ｉを提供する。
【0077】
さらに他の側面において、上述の結晶形Ｉを対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与するステップを含むメラノコルチン受容体、特に、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）の機能亢進方法を提供する。
【0078】
さらに他の側面において、上述の結晶形Ｉを対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与するステップを含む肥満、糖尿、炎症または勃起不全を治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【0079】
本発明による結晶形Ｉは、メラノコルチン受容体、特に、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対して優れた亢進作用を示すことから、肥満、糖尿、炎症および勃起不全症に対する予防または治療に有用に使用されることができる。
【0080】
本発明による結晶形Ｉは、メラノコルチン－４受容体に対するｏｎ－ｔａｒｇｅｔ効果を示すことから、体重減少および食餌減少効果を示し、且つ不安および憂鬱に影響を及ぼさず、ｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ ｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）阻害に対する副作用や突然変異の誘発といった安全性の問題なしに投与が可能である。
【0081】
また、本発明による結晶形Ｉは、粗製の化学式１の化合物、化学式１の無定形化合物または化学式１の任意の他の結晶形に比べて、純度、収率、物理的および化学的安定性に優れる。
【0082】
具体的には、前記結晶形Ｉは、化学式１の化合物、化学式１の無定形化合物または化学式１の任意の他の結晶形に比べて、溶解性、貯蔵安定性、生成安定性に優れることができる。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【発明を実施するための形態】
【0084】
以下、製造例および実施例を参照して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明の例示であって、本発明の範囲がこれらによって限定されるものではない。
【0085】
製造例１：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の製造
【化3】
【0086】
下記ステップＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの過程を経て標題化合物を得た。
【0087】
ステップＡ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの製造
窒素の下で、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｒ）－４－（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（４８．５ｇ、１５０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（２５０ｍｌ）に溶解し、アジ化ナトリウム（１９．５ｇ、３００ｍｌ）を添加した。８０℃で１６時間攪拌を行い、反応溶媒を減圧濃縮させた後、水を添加し、エチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮して、粗製の（ｃｒｕｄｅ）１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３９．５９ｇ、９８％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
窒素の下で、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｒ）－４－（（メチルスルホニル）オキシ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（４８．５ｇ、１５０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（２５０ｍｌ）に溶解し、アジ化ナトリウム（１９．５ｇ、３００ｍｌ）を添加した。８０℃で１６時間攪拌を行い、反応溶媒を減圧濃縮させた後、水を添加し、エチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮して、粗製の（ｃｒｕｄｅ）１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３９．５９ｇ、９８％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
【0088】
MS [M+H] = 271 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.43-4.37 (m, 1H), 4.35-4.27 (br, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.73-3.66 (m, 1H), 3.44-3.38 (m, 1H), 2.63-2.49 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H), 1.50 (s, 4.5H), 1.44 (s, 4.5H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.43-4.37 (m, 1H), 4.35-4.27 (br, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.73-3.66 (m, 1H), 3.44-3.38 (m, 1H), 2.63-2.49 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H), 1.50 (s, 4.5H), 1.44 (s, 4.5H)
【0089】
ステップＢ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの製造
前記ステップＡで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２４．５９ｇ、９１．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１８０ｍｌ）に溶解した後、０℃で１Ｍトリメチルホスフィンテトラヒドロ溶液（１０９．２ｍｌ、１０９．２ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。同一温度で１時間攪拌をした後、常温で３時間攪拌をした。反応溶媒を減圧濃縮させた後、ジクロロメタン（１００ｍｌ）と水（１５０ｍｌ）を入れて３０分程度攪拌をさせた。層分離をし、ジクロロメタンでもう一度抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮して、粗製の１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２０．６２ｇ、９３％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
前記ステップＡで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アジドピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２４．５９ｇ、９１．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１８０ｍｌ）に溶解した後、０℃で１Ｍトリメチルホスフィンテトラヒドロ溶液（１０９．２ｍｌ、１０９．２ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。同一温度で１時間攪拌をした後、常温で３時間攪拌をした。反応溶媒を減圧濃縮させた後、ジクロロメタン（１００ｍｌ）と水（１５０ｍｌ）を入れて３０分程度攪拌をさせた。層分離をし、ジクロロメタンでもう一度抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮して、粗製の１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２０．６２ｇ、９３％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
【0090】
MS [M+H] = 245 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s,1.2H), 3.75-3.67 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 3.22-3.17 (m, 1H), 2.58-2.47 (m,1H), 1.82-1.71 (m, 1H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s,1.2H), 3.75-3.67 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 3.22-3.17 (m, 1H), 2.58-2.47 (m,1H), 1.82-1.71 (m, 1H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H)
【0091】
ステップＣ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの製造
前記ステップＢで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２０．６２ｇ、８４．４ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１５０ｍｌ）に溶解し、４－メチルシクロヘキサノン（９．５ｍｌ、１０１．３ｍｍｏｌ）を添加した。０℃でナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２６．８ｇ、１２６．６ｍｍｏｌ）を添加し、常温で１６時間攪拌をした。反応溶媒を減圧濃縮させ、水を添加し、エチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２２．９ｇ、８０％）を得た。
前記ステップＢで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２０．６２ｇ、８４．４ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１５０ｍｌ）に溶解し、４－メチルシクロヘキサノン（９．５ｍｌ、１０１．３ｍｍｏｌ）を添加した。０℃でナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２６．８ｇ、１２６．６ｍｍｏｌ）を添加し、常温で１６時間攪拌をした。反応溶媒を減圧濃縮させ、水を添加し、エチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（２２．９ｇ、８０％）を得た。
【0092】
MS [M+H] = 341 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.26 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.71 (m, 1H), 3.49-3.40 (m, 1H), 3.22-3.16 (m, 1H), 2.69-2.60(br, 1H), 2.58-2.46 (m, 1H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 1H), 1.62-1.35(m, 8H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H), 0.96 (d, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.26 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.71 (m, 1H), 3.49-3.40 (m, 1H), 3.22-3.16 (m, 1H), 2.69-2.60(br, 1H), 2.58-2.46 (m, 1H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 1H), 1.62-1.35(m, 8H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H), 0.96 (d, 3H)
【0093】
ステップＤ：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレートの製造
前記ステップＣで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３７．２９ｇ、１０９．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（６１．１ｍｌ、４３８．１ｍｍｏｌ）を入れた後、０℃でイソブチリルクロリド（１１．７ｍｌ、２１９ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で１６時間攪拌をさせた後、反応溶媒を減圧濃縮させてから炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、エチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３８．７９ｇ、８６％）を得た。
前記ステップＣで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）アミノ）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３７．２９ｇ、１０９．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（６１．１ｍｌ、４３８．１ｍｍｏｌ）を入れた後、０℃でイソブチリルクロリド（１１．７ｍｌ、２１９ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で１６時間攪拌をさせた後、反応溶媒を減圧濃縮させてから炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、エチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３８．７９ｇ、８６％）を得た。
【0094】
MS [M+H] = 411 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.72 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.33-3.14 (m, 1H), 2.69-2.60 (m, 2H), 2.57-2.43 (m, 1H), 1.87-1.79 (m, 1H), 1.70-1.61 (m, 1H), 1.60-1.32 (m, 8H), 1.47 (s, 4.5H), 1.41 (s, 4.5H), 1.10 (dd, 6H), 0.99 (d, 3H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.72 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.33-3.14 (m, 1H), 2.69-2.60 (m, 2H), 2.57-2.43 (m, 1H), 1.87-1.79 (m, 1H), 1.70-1.61 (m, 1H), 1.60-1.32 (m, 8H), 1.47 (s, 4.5H), 1.41 (s, 4.5H), 1.10 (dd, 6H), 0.99 (d, 3H)
【0095】
ステップＥ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩の製造
前記ステップＤで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３４．０ｇ、８２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解した後、０℃で、４Ｎ塩酸１，４－ジオキサン溶液（８２．８ｍｌ、３３１．３ｍｍｏｌ）を添加した。常温で６時間攪拌させた後、反応溶媒を減圧濃縮して、ｃｒｕｄｅ（２８．７ｇ、９９％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
前記ステップＤで得られた１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－１，２－ジカルボキシレート（３４．０ｇ、８２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解した後、０℃で、４Ｎ塩酸１，４－ジオキサン溶液（８２．８ｍｌ、３３１．３ｍｍｏｌ）を添加した。常温で６時間攪拌させた後、反応溶媒を減圧濃縮して、ｃｒｕｄｅ（２８．７ｇ、９９％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
【0096】
MS[M+H] = 311 (M+1)
【0097】
製造例２：（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸の製造
【化4】
【0098】
国際公開番号ＷＯ２００４／０９２１２６号に記載の方法で標題化合物を得た。
【0099】
MS[ M+H] = 282 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43-7.33 (m, 4H), 3.90-3.69 (m, 3H), 3.59 (dd, J = 11.2, 10.0 Hz, 1H), 3.29 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43-7.33 (m, 4H), 3.90-3.69 (m, 3H), 3.59 (dd, J = 11.2, 10.0 Hz, 1H), 3.29 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
【0100】
製造例３：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドの製造（ＭＣ７０）
【化5】
【0101】
下記ステップＡ、ＢおよびＣの過程を経て標題化合物を得た。
【0102】
ステップＡ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレートの製造
製造例１で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（２８．７ｇ、８２．７３ｍｍｏｌ）、製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（２４．５ｇ、８６．８７ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．２ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（１５．７ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（４００ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ'－ジイソプロピルエチルアミン（７２．０ｍｌ、４１３．６６ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で１６時間攪拌を行い、反応溶媒を減圧濃縮させた後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を入れてエチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で二回ずつ洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（４１．１９ｇ、８７％）を得た。
製造例１で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（２８．７ｇ、８２．７３ｍｍｏｌ）、製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（２４．５ｇ、８６．８７ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．２ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（１５．７ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（４００ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ'－ジイソプロピルエチルアミン（７２．０ｍｌ、４１３．６６ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で１６時間攪拌を行い、反応溶媒を減圧濃縮させた後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を入れてエチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で二回ずつ洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（４１．１９ｇ、８７％）を得た。
【0103】
MS [M+H] = 575 (M+1)
【0104】
ステップＢ：（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸の製造
前記ステップＡで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（３９．４ｇ、６８．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（４５０ｍｌ）に溶解した後、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５７．２ｍｌ、３４３．０９ｍｍｏｌ）を添加した。常温で１６時間攪拌を行い、６Ｎ塩酸水溶液でｐＨ５程度に調整した後、反応溶液を減圧濃縮させた。濃縮液をジクロロメタンで溶解した後、溶解されない固体は、紙フィルタで濾過した。濾過液を減圧濃縮して、粗製の標題化合物（３８．４ｇ、９９％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
前記ステップＡで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（３９．４ｇ、６８．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（４５０ｍｌ）に溶解した後、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５７．２ｍｌ、３４３．０９ｍｍｏｌ）を添加した。常温で１６時間攪拌を行い、６Ｎ塩酸水溶液でｐＨ５程度に調整した後、反応溶液を減圧濃縮させた。濃縮液をジクロロメタンで溶解した後、溶解されない固体は、紙フィルタで濾過した。濾過液を減圧濃縮して、粗製の標題化合物（３８．４ｇ、９９％）を取得し、精製なしに次のステップで使用した。
【0105】
MS [M+H] = 561 (M+1)
【0106】
ステップＣ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドの製造
前記ステップＢで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（３８．４ｇ、６８．６０ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１８．４ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（１３．０ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（２００ｍｌ）に溶解した後、順にモルホリン（５．９ｍｌ、６８．８０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ'－ジイソプロピルエチルアミン（５９．７ｍｌ、３４３．０２ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で１６時間攪拌を行い、反応溶液を減圧濃縮させた後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を入れてエチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で二回ずつ洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾過液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド（３７．０５ｇ、８６％、ＭＣ７０）を得た。
前記ステップＢで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（３８．４ｇ、６８．６０ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１８．４ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート（１３．０ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（２００ｍｌ）に溶解した後、順にモルホリン（５．９ｍｌ、６８．８０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ'－ジイソプロピルエチルアミン（５９．７ｍｌ、３４３．０２ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で１６時間攪拌を行い、反応溶液を減圧濃縮させた後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を入れてエチルアセテートで二回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で二回ずつ洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥濾過した。濾過液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド（３７．０５ｇ、８６％、ＭＣ７０）を得た。
【0107】
MS [M+H] = 630 (M+1)
【0108】
実施例１:Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドの結晶形Ｉの製造
【化6】
【0109】
前記製造例３で製造した化合物（ＭＣ７０）０．６ｇを基準にＭＴＢＥ０．９７５ｍＬを使用して、２５℃の常温で３０分間化合物（ＭＣ７０）を溶解した。溶解を完了した後、３℃で冷却してから約２１時間攪拌し、濾過して、標題化合物（ＭＣ７０の結晶形Ｉ）を取得した。
【0110】
【0111】
実験例１．ＸＲＰＤ評価
粉末ＸＲＰＤ回折パターンは、固相検出器として、ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｚｅｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅとＮｉフィルタ（ｆｉｌｔｅｒ）を備えたＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’Ｐｅｒｔ Ｐｒｏ ＭＰＤ ｓｙｓｔｅｍを使用して、以下の方法で取得した。
粉末ＸＲＰＤ回折パターンは、固相検出器として、ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｚｅｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅとＮｉフィルタ（ｆｉｌｔｅｒ）を備えたＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’Ｐｅｒｔ Ｐｒｏ ＭＰＤ ｓｙｓｔｅｍを使用して、以下の方法で取得した。
【0112】
約２０～３０ｍｇの試料をガラス試料ホルダ（ｇｌａｓｓ ｓａｍｐｌｅ ｈｏｌｄｅｒ）に平坦な表面を有するように均一にして載せた後、機器のｇｅｎｅｒａｔｏｒを４５ｋＶ（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ）、４０ｍＡ（ｆｉｌａｍｅｎｔ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）に設定してから、ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅ（ｎｏｔ－ｓｐｉｎ）で測定した。０．０２６゜のステップサイズ（ｓｔｅｐ ｓｉｚｅ）および５１秒のＴｉｍｅ ｐｅｒ ｓｔｅｐの条件で、４～４０゜範囲のブラッグ（Ｂｒａｇｇ）角（２θ）を測定した。
【0113】
取得した結晶形ＩをＸＲＰＤで測定した結果を図１に図示した。
【0114】
図１に示したスペクトルから確認されるように、本発明による結晶形Ｉは、結晶性物質であることが確認され、ＸＲＰＤの具体的な値は、下記表１に示した。
【0115】
【表1】
【0116】
実験例２．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ１ ｓｙｓｔｅｍを使用してＤＳＣを測定した。約２～５ｍｇの試料を秤量し、４０μＬ Ａｌ ｃｒｕｃｉｂｌｅ（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｎ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ｐｉｎ－ｈｏｌｅ ｌｉｄ）に入れて１個のピンホール（ｐｉｎ ｈｏｌｅ）を形成する。次に、試料を１０℃／ｍｉｎの速度で２５℃から３５０℃まで加熱してＤＳＣを測定する。測定する間に、装置の内部に７０ｍＬ／ｍｉｎの速度で窒素ガスを供給して酸素および他の気体の流入を防ぐ。データの収集および評価は、ソフトウェアＳＴＡＲｅを用いて行った。
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ１ ｓｙｓｔｅｍを使用してＤＳＣを測定した。約２～５ｍｇの試料を秤量し、４０μＬ Ａｌ ｃｒｕｃｉｂｌｅ（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｎ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ｐｉｎ－ｈｏｌｅ ｌｉｄ）に入れて１個のピンホール（ｐｉｎ ｈｏｌｅ）を形成する。次に、試料を１０℃／ｍｉｎの速度で２５℃から３５０℃まで加熱してＤＳＣを測定する。測定する間に、装置の内部に７０ｍＬ／ｍｉｎの速度で窒素ガスを供給して酸素および他の気体の流入を防ぐ。データの収集および評価は、ソフトウェアＳＴＡＲｅを用いて行った。
【0117】
取得した結晶形ＩをＤＳＣ測定した結果を図２に図示した。
【0118】
図２から確認されるように、結晶形Ｉは、約１５９．１４℃（Ｏｎｓｅｔ）で１個の吸熱ピーク（ｐｅａｋ１６２．１３℃）が観察された。ここで、温度値は、±５℃の誤差を有することができる。
【0119】
実験例３．熱重量分析（ＴＧＡ）
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＴＧＡ／ＤＳＣ １ ｍｏｄｕｌｅを使用してＴＧＡを測定した。約４～８ｍｇの試料を秤量し、１００μＬ Ａｌ ｃｒｕｃｉｂｌｅ（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｃｒｕｃｉｂｌｅｓ）に入れる。次に、試料を１０℃／ｍｉｎの速度で３０℃から３５０℃まで加熱してＴＧＡを測定する。測定する間に装置の内部に８０ｍＬ／ｍｉｎの速度で窒素ガスを供給して酸素および他の気体の流入を防ぐ。データの収集および評価は、ソフトウェアＳＴＡＲｅを用いて行った。
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＴＧＡ／ＤＳＣ １ ｍｏｄｕｌｅを使用してＴＧＡを測定した。約４～８ｍｇの試料を秤量し、１００μＬ Ａｌ ｃｒｕｃｉｂｌｅ（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｃｒｕｃｉｂｌｅｓ）に入れる。次に、試料を１０℃／ｍｉｎの速度で３０℃から３５０℃まで加熱してＴＧＡを測定する。測定する間に装置の内部に８０ｍＬ／ｍｉｎの速度で窒素ガスを供給して酸素および他の気体の流入を防ぐ。データの収集および評価は、ソフトウェアＳＴＡＲｅを用いて行った。
【0120】
取得した結晶形ＩをＴＧＡ測定した結果を図３に図示した。
【0121】
図３から確認されるように、結晶形Ｉは、ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ以前には、重量損失が観察されず、無水物質であることが確認された。溶融吸熱は、開始温度１５９．１４℃で観察され、最大２７０℃まで熱的に安定した化合物であることが確認された。温度値は、±５℃の誤差を有する。
【0122】
実験例４．水分吸着分析（ＤＶＳ）
Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｖａｐｏｒ ｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａｈｎ Ｄ２００ ｕｌｔｒａ－ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ（ＤＶＳ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて、ＤＶＳを測定した。
Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｖａｐｏｒ ｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａｈｎ Ｄ２００ ｕｌｔｒａ－ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ（ＤＶＳ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて、ＤＶＳを測定した。
【0123】
先ず、１０～２０ｍｇの試料をｓａｍｐｌｅ ｐａｎに入れてｈａｎｇｄｏｗｎワイヤで吊り下げた後、重量と湿度が平衡になる時に測定を開始した。相対湿度を０％から９０％まで増加させた後、０％にまた下げることを１ｃｙｃｌｅとして２ｃｙｃｌｅ実施し、ｄｍ／ｄｔ方法で相対湿度を１０％ずつ増加させる方式で実験を行った。実験は、室温（２５℃）で行った。
【0124】
取得した結晶形ＩのＤＶＳを分析した結果を図４に図示した。
【0125】
図４に図示されたように、ＤＶＳ分析の結果、０～９０％ＲＨの間で観察された全重量の増加が０．２％ｗ／ｗであることを確認した。ＤＶＳ分析の後、ＸＲＰＤ分析が行われ、結果的なＸＲＰＤパターンが初期化合物のパターンと一致し、これにより、物理的変化が発生していないことを確認した。
【0126】
実験例５．安定性評価
約１０～３０ｍｇの試料を加速条件（４０℃、７５％ＲＨ）では開封状態で、過酷条件の場合、８０℃のオーブンで密閉状態で４週間保管した。当該試料を室温に保管した試料と比較するために、下記の表２の方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。
約１０～３０ｍｇの試料を加速条件（４０℃、７５％ＲＨ）では開封状態で、過酷条件の場合、８０℃のオーブンで密閉状態で４週間保管した。当該試料を室温に保管した試料と比較するために、下記の表２の方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。
【0127】
【表2】
【0128】
取得した結晶形Ｉの安定性を評価した結果を下記表３に示した。
【0129】
【表3】
【0130】
上記の表３から確認することができるように、本発明による結晶形Ｉは、加速条件（４０℃、７５％ＲＨ）および密閉状態（過酷条件、８０℃）で、４週まで約１．３％の含量の低下が観察され、加速条件の場合、４週間１％未満の含量の低下が観察された。これにより、本発明による結晶形Ｉは、４週間化学的安定性を示したことから、熱および湿度に優れる安定性を示すことを確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】