特表 2024-502281 メラノコルチン－４受容体の選択的アゴニストとしての使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-18

(54)【発明の名称】メラノコルチン－４受容体の選択的アゴニストとしての使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/5377 20060101AFI20240111BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240111BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240111BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240111BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240111BHJP

   A61P 15/10 20060101ALI20240111BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240111BHJP

【ＦＩ】

A61K31/5377

A61P43/00 111

A61P3/04

A61P3/10

A61P29/00

A61P15/10

A61P17/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023538838

(86)(22)【出願日】2021-12-21

(85)【翻訳文提出日】2023-08-14

(86)【国際出願番号】 KR2021019500

(87)【国際公開番号】W WO2022139406

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】10-2020-0180505

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500239823

【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100122161

【弁理士】

【氏名又は名称】渡部 崇

(72)【発明者】

【氏名】ヒ・ドン・パク

(72)【発明者】

【氏名】ス・ジン・ヨ

(72)【発明者】

【氏名】ヒョン・ソ・パク

(72)【発明者】

【氏名】ジン・ソク・パク

(72)【発明者】

【氏名】ヘ・ウォン・アン

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC73

4C086GA13

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA70

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZB11

4C086ZC35

4C086ZC41

(57)【要約】

本発明は、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）の選択的アゴニストとしての式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療有効量の下記式（１）

【化1】

（式中、Ｒ1は、Ｃ₂－Ｃ₅アルキルである。）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用を有するメラノコルチン受容体に関連する疾患の予防又は治療用薬剤。

【請求項2】

前記式（１）の化合物が、下記式（２）

【化2】

で示されるＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。

【請求項3】

前記薬学的に許容される塩が、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。

【請求項4】

前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性が、メラノコルチン－１受容体に対する割合で２以上であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。

【請求項5】

前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性が、メラノコルチン－１受容体に対する割合で５以上であることを特徴とする請求項４に記載の薬剤。

【請求項6】

前記メラノコルチン受容体に関連する疾患が、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。

【請求項7】

前記メラノコルチン受容体に関連する疾患が、肥満であることを特徴とする請求項６に記載の薬剤。

【請求項8】

色素沈着が低減されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。

【請求項9】

経口剤であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。

【請求項10】

治療有効量の下記式（１）

【化3】

（式中、Ｒ1は、Ｃ₂－Ｃ₅アルキルである。）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体とともに含む、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用を有するメラノコルチン受容体に関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物。

【請求項11】

前記式（１）の化合物が、下記式（２）

【化4】

で示されるＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドであることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記薬学的に許容される塩が、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸からなる群から選択されるのを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性が、メラノコルチン－１受容体に対する割合で２以上であることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性が、メラノコルチン－１受容体に対する割合で５以上であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記メラノコルチン受容体に関連する疾患が、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記メラノコルチン受容体に関連する疾患が、肥満であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

色素沈着が低減されることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項18】

経口剤であることを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）の選択的アゴニストとしての下記式（１）

【化1】

（式中、Ｒ1は、Ｃ₂－Ｃ₅アルキルである。）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

メラノコルチン受容体（ＭＣＲ）は、Ｇ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、Ｇ－タンパク質の主な役割は、２次メッセンジャーを活性化し、シグナル伝達を通じて多くの生理学的刺激に対する細胞の応答を制御することである。現在までに、メラノコルチン受容体には５つのサブタイプが同定されている。ＭＣ１Ｒは、主にメラノサイトとマクロファージで発現し、メラノサイトのメラニン色素を調節することにより皮膚と毛髪の色を決定する。ＭＣ２Ｒは、副腎と脂肪組織で発現し、副腎における副腎皮質刺激ホルモンによる副腎ホルモン分泌調節を媒介する機能が良く知られている。ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ及びＭＣ５Ｒは、神経端部だけでなく脳内にも発現していることから、メラノコルチンペプチドによる中枢神経作用を媒介し、行動、学習、記憶、食欲、神経の発生・再生などに影響を与えることが分かっている。これまで、ＭＣ３Ｒは勃起不全及び炎症反応に、ＭＣ４Ｒは肥満及び糖尿病に関与すると知られており、各受容体の作用の特異性に関する研究が活発に行われている（非特許文献１）。その結果、ＭＣ４Ｒが肥満者の遺伝的研究に深く関与していることがわかり、ＭＣ４Ｒが除去されたノックアウトマウスが過食により肥満を発症することを示すことにより、この受容体が食欲の調節に重要な役割を果たしていることを実証した（非特許文献２、３及び４）。

【0003】

メラノコルチン受容体の中でもＭＣ４Ｒは、エネルギー代謝と体重調節に関与することが知られている。他のＭＣＲサブタイプにおいても、皮膚色素沈着、エネルギー恒常性、外分泌機能など生体内の様々な機能の調節に関与していることから、ＭＣ４Ｒアゴニスト化合物のＭＣ４Ｒに対する選択性を確保することは、将来起こりうる副作用を予防する上で非常に重要である。特に、ＭＣ１Ｒは、主に皮膚細胞で発現し、メラニン色素活性を介して皮膚の色素沈着に関与することが知られている。メラノコルチン受容体に対する既存の非選択的アゴニストに現れる皮膚色素沈着の副作用は、主にＭＣ１Ｒ刺激能及び皮膚内薬物蓄積に起因すると考えられていた。そこで、本発明者らは、既存の化合物の中から、ＭＣ４Ｒを選択的に活性化し得る構造と活性の関係を把握することにより、ＭＣ４Ｒに対して選択性を示し得る化合物の創製を試みた（非特許文献５、６、７及び８）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】MacNeil DJ et al., Eur J Pharmacol 2002, 450, 93

【非特許文献2】Lu D, Willard D et al., Nature 1994, 371(6500), 799

【非特許文献3】Huszar D et al., Cell 1997, 88(1), 131

【非特許文献4】Hinney A et al., J Clin Endocrinol Metab 1990, 84(4), 1483

【非特許文献5】Wikberg et al, Eur. J. Pharmacol 1999, 375, 295-310

【非特許文献6】Wikberg, et al., Pharm Res 2000, 42 (5) 393-420

【非特許文献7】Douglas et al., Eur J Pharm 2002, 450, 93-109

【非特許文献8】O’Rahilly et al., Nature Med 2004, 10, 351-352

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）の選択的アゴニストとしての、下記式（１）

【化2】

（式中、Ｒ1は、Ｃ₂－Ｃ₅アルキルである。）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩の使用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、治療有効量の下記式（１）

【化3】

（式中、Ｒ1は、Ｃ₂－Ｃ₅アルキルである。）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用を有するメラノコルチン受容体に関連する疾患の予防又は治療用薬剤を提供する。

【0007】

また、本発明は、治療有効量の前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体とともに含む、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用を有する、メラノコルチン受容体に関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0008】

さらに、本発明は、治療有効量の前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象者に投与することを含み、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用による、メラノコルチン受容体に関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0009】

また、本発明は、メラノコルチン－４受容体の選択的アゴニストとしての前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0010】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0011】

本発明の一側面によれば、治療有効量の前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用を有する、メラノコルチン受容体に関連する疾患予防又は治療用薬剤が提供される。

【0012】

本発明の別の側面によれば、治療有効量の前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体とともに含む、メラノコルチン－４受容体に対する選択的アゴニスト作用を有する、メラノコルチン受容体に関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物が提供される。

【0013】

本発明による一実施形態において、前記式（１）の化合物は、下記式（２）

【化4】

で示されるＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドである。

【0014】

本発明による別の実施形態において、前記薬学的に許容される塩は、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸などの有機カルボン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸又はナフタレンスルホン酸などのスルホン酸などによって形成される酸付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による別の実施形態において、前記薬学的に許容される塩は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸からなる群から選択され得る。本発明による別の実施形態において、前記薬学的に許容される塩は、塩酸塩である。

【0015】

本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物の塩酸塩は、下記反応スキーム１に従って製造することができる。しかし、当業者は、式（１）の構造に基づいて種々の方法により式（１）の化合物を製造することができる。
＜反応スキーム１＞

【化5】

（式中、Ｒ2は、Ｃ₁－Ｃ₅アルキルであり；
Ｒ3は、非置換又は１個若しくは２個のＣ₁－Ｃ₅アルキルで置換されたＣ₃－Ｃ₈シクロアルキルであり；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、水素又はハロゲンである。）

【0016】

本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性は、メラノコルチン－１受容体に対する比率（ratio）で２以上であってもよい。本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性は、メラノコルチン－１受容体に対する割合で３以上であってもよい。本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性は、メラノコルチン－１受容体に対する割合で４以上であってもよい。本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性は、メラノコルチン－１受容体に対する割合で５以上であってもよい。

【0017】

本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩のメラノコルチン－４受容体に対する選択性は、受容体のアゴニスト活性を測定し、比較することによって確認することができる。例えば、メラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）及びメラノコルチン－１受容体（ＭＣ１Ｒ）に対するアゴニスト活性をＥＣ₅₀（half maximal effective concentration、最大アゴニスト活性の５０％を誘導する濃度）で測定した後、ＥＣ₅₀の場合、数値が小さいほどアゴニスト能に優れており、ＭＣ１ＲのＥＣ₅₀のＭＣ４ＲのＥＣ₅₀の比（ＭＣ１Ｒ／ＭＣ４Ｒ）を計算すると、比の値が大きいほどＭＣ４Ｒの選択性に優れていることが確認できる。

【0018】

本発明による別の実施形態において、前記メラノコルチン受容体に関連する疾患は、肥満、糖尿、炎症及び勃起不全症からなる群から選択することができる。本発明による別の実施形態において、前記メラノコルチン受容体に関連する疾患は、肥満であってもよい。

【0019】

本発明による別の実施形態において、前記薬剤又は医薬組成物は、色素沈着を低減することができる。本発明による前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩は、メラノコルチン受容体の他のサブタイプと比較して、メラノコルチン－４受容体に対して優れた選択性有する。例えば、本発明による前記式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩は、メラノコルチン－４受容体と比較して、メラノコルチン－１受容体対比に対する優れた選択性が有し、それにより皮膚色素沈着が低減され、メラノコルチン受容体に関連する疾患を効率的に予防又は治療することができる。

【0020】

本発明による別の実施形態において、個々の対象に対する「治療有効量」は、前記の薬理学的効果、すなわち治療効果を達成するのに十分な量を指す。化合物の量は、対象の状態及び重症度、投与方式、及び治療される対象の年齢に応じて変化し得るが、当業者であればその知識に基づいて決定することができる。

【0021】

本発明による別の実施形態において、前記式（１）の化合物の治療有効投与量は、例えば、投与の頻度と強度に応じて、典型的には１日あたり約０．１～５００ｍｇ範囲である。成人の筋肉内又は静脈内投与の典型的な１日量は、１日あたり約０．１～３００ｍｇの範囲であり、分割単位用量で投与することができる。患者によっては、より高用量の１日投与量が必要な場合もある。

【0022】

本発明において、「医薬組成物」は、本発明の有効成分に加えて、担体、希釈剤、賦形剤などの他の化学成分を含むことができる。したがって、前記医薬組成物には、必要に応じて、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はそれらの組み合わせを含むことができる。医薬組成物は、体内への化合物の投与を容易にする。化合物を投与するための様々な方法には、経口、注射、エアロゾル、非経口及び局所投与などが含まれるが、これらに限定されない。

【0023】

本明細書において、「担体（carrier）」は、細胞又は組織への化合物の投入を容易にする化合物を意味する。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織内への多くの有機化合物の投入を容易にする従来の担体である。

【0024】

本明細書において、「希釈剤（diluent）」は、生物学的に活性な形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解する溶媒中で希釈される化合物を意味する。この分野では、緩衝液に溶解した塩が希釈剤として使用される。従来使用されている緩衝液は、体液中の塩の形態を模倣したリン酸緩衝食塩水である。緩衝剤塩は、低濃度で溶液のｐＨを制御できるため、緩衝希釈剤は化合物の生物学的活性をほとんど変化させない。

【0025】

本明細書において、「薬学的に許容される」とは、化合物の生物学的活性と物性を損なわない性質を意味する。

【0026】

本発明による化合物は、様々な薬学的に投与される剤形として製剤化することができる。本発明の医薬組成物の製造において、有効成分、具体的には式（１）の化合物又はその薬学的に許容される塩は、製造される剤形を考慮して選択された薬学的に許容される担体と混合される。例えば、本発明の医薬組成物は、必要に応じて注射剤、経口剤などとして製剤化することができる。

【0027】

本発明の化合物は、公知の医薬用担体と賦形剤を用いて常法により製剤化し、単位又は複数のユニットの容器に挿入することができる。製剤は油又は水性溶媒中の溶液、懸濁液又はエマルションであってもよく、従来の分散剤、懸濁化剤又は安定化剤を含む。また、本発明の化合物は、例えば、使用前に無菌で、蒸発物質を含まない水に溶解される乾燥粉末の形態であってもよい。本発明の化合物は、ココアバター又はその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用することによって坐剤に製剤化することができる。経口投与のための固体投与形態には、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末及び顆粒が含まれる。カプセル剤や錠剤が好ましい。錠剤及び丸剤は腸溶コーティングされていることが好ましい。固体形態は、本発明の化合物をスクロース、ラクトース、デンプンなどの不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、崩壊剤、結合剤などから選択される少なくとも１つの担体と混合することによって製造される。さらに、経皮投与剤形、例えば、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ又は噴霧剤として製剤化することができる。本発明による別の実施形態において、前記薬剤又は医薬組成物は、経口剤であってもよい。

【0028】

本明細書において、「予防」という用語は、疾患に罹患する可能性を低減又は排除することを指す。

【0029】

本明細書において、「治療」という用語は、疾患の症状を示す対象における疾患の進行を阻止、遅延又は緩和させることを意味する。

【発明の効果】

【0030】

本発明による薬剤又は医薬組成物は、メラノコルチン－４受容体に対する優れた選択性により、他のメラノコルチン受容体に対する作用による副作用の危険がなく、安全性を確保しつつ、肥満、糖尿、炎症又は勃起不全症などのメラノコルチン受容体に関連する疾患を効率的に予防又は治療することができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】マウスモデルに薬物を反復投与し、皮膚及び血漿中の薬物の濃度を測定した結果である（比較物質：セトメラノチド）。

【図2】サルを用いた反復毒性試験により皮膚と体毛の色素沈着パターンを確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、実施例を挙げて本願発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の保護範囲は、これらの実施例に限定されるものではないことを理解されたい。

【0033】

製造例：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩の合成

【化6】

表題化合物は、下記工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを通じて得られた。

【0034】

工程Ａ：メチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレートの製造
製造例１で得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート塩酸塩（２８．７ｇ、８２．７３ｍｍｏｌ）、製造例２で得られた（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボン酸（２４．５ｇ、８６．８７ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２２．２ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１５．７ｇ、１１５．８３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（４００ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（７２．０ｍＬ、４１３．６６ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。室温で１６時間撹拌した後、反応溶媒を減圧濃縮し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して、表題化合物（４１．１９ｇ、８７％）を得た。
MS [M+H] = 575 (M+1)

【0035】

工程Ｂ：（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸の製造
前記工程Ａで得られたメチル（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボキシレート（３９．４ｇ、６８．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（４５０ｍＬ）に溶解し、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５７．２ｍＬ、３４３．０９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１６時間撹拌し、６Ｎ塩酸水溶液で薬ｐＨ５に調整した後、反応溶液を減圧濃縮した。濃縮液をジクロロメタンで溶解し、不溶固体を濾紙でろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して粗生成物（３８．４ｇ、９９％）を得、これを精製せずに次の工程で使用した。
MS [M+H] = 561 (M+1)

【0036】

工程Ｃ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミドの製造
前記工程Ｂで得られた（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－４－（Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド）ピロリジン－２－カルボン酸（３８．４ｇ、６８．６０ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１８．４ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１３．０ｇ、９６．０４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）に溶解し、モルホリン（５．９ｍＬ、６８．８０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５９．７ｍＬ、３４３．０２ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり加えた。室温で１６時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで２回抽出をした。有機層を塩化ナトリウム水溶液と水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、カラム・クロマトグラフィーで精製して表題化合物（３７．０５ｇ、８６％）を得た。
MS [M+H] = 630 (M+1)

【0037】

工程Ｄ：Ｎ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩の製造
前記工程Ｃで得られたＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド（５．０ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、２Ｎ塩酸酢酸エチル溶液（３．９７ｍＬ、１５．８９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３０分間撹拌した後、反応溶媒を減圧下濃縮した。得られた粗固体を、ヘキサンとジエチルエーテルを用いて粉砕することにより精製して表題化合物（５．２３ｇ、９９％）を得た。
MS [M+H] = 630 (M+1)
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 7.49-7.44 (m, 4H), 4.83 (m, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.79-3.47 (m, 14H), 3.03-3.00 (m, 1H), 2.86-2.82 (m, 1H), 2.73-2.67 (m, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.97 (m, 1H), 1.80-1.62 (m, 5H), 1.50 (s, 9H), 1.44-1.27 (m, 3H), 1.06-1.04 (m, 9H)

【0038】

実施例１：ＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒのインビトロ活性比較実験
製造例で得られたＮ－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（３Ｓ，４Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－クロロフェニル）ピロリジン－３－カルボニル）－５－（モルホリン－４－カルボニル）ピロリジン－３－イル）－Ｎ－（（１ｓ，４Ｒ）－４－メチルシクロヘキシル）イソブチルアミド塩酸塩（以下、「試験化合物」という）をメラノコルチン受容体アゴニストとして知らされたα－ＭＳＨ、ＮＤＰ－α－ＭＳＨ及びＭＴＩＩ（メラノタンＩＩ）を比較物質として、以下のルシフェラーゼアッセイ、結合親和性、β－アレスチン及びｃＡＭＰアッセイによりＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒに対する活性を測定した。その結果を表１～４にそれぞれ示した。

【0039】

実施例１－１：ルシフェラーゼアッセイ
メラノコルチン－１受容体（ＭＣ１Ｒ）及びメラノコルチン－４受容体（ＭＣ４Ｒ）に対するアゴニスト能を測定のために、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ４Ｒ及びＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答エレメント）制御下のルシフェラーゼ遺伝子（ＣＲＥ－ＬＵＣ）を恒常的に発現する細胞株を樹立した。ＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒ遺伝子を含む哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３（Ｎｅｏ））（Invitrogen社製）を製造した後、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答エレメント）の調節下でルシフェラーゼ遺伝子（ＣＲＥ－ＬＵＣ）を発現させるベクター（ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ）（Stratagen社製）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Invitrogen社製）を用いてヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株を形質転換した。形質転換細胞株（ＨＥＫ ＭＣ１Ｒ－Ｌｕｃ及びＨＥＫ ＭＣ４Ｒ－Ｌｕｃ）を２４時間、５％ＣＯ₂が存在する３７℃のインキュベーターで１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むルベッコ改変イーグルス培地（ＤＭＥＭ）を使用して培養した。前記細胞株を１０ｍＬの選択培地（１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００単位／ｍＬペニシリン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００単位／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、８００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））の存在下で４日間培養した。選択培地によって死滅した細胞を、新しい選択培地１０ｍＬに培地を交換して除去する過程を、４日に１回、３回反復した。最終的にされた増殖したクローンによって形成された個々のコロニーを、顕微鏡下で１ウェルあたり１ｍＬの選択培地を含む２４－ウェル細胞培養プレートに移し、４日間培養した。フォルスコリン（SIGMA社製）を最終濃度１０μＭになるように処理し、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃インキュベーター内で５時間培養した。各ウェルを５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Promega社製）で処理し、室温で１５分間放置した後、ルミノメーター（Victor社製）を使用して各ウェルの発光を測定した。フォルスコリンの処理により、基本値の１００倍以上の発光を示すクローンを選別し、各化合物のＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒアゴニスト能の測定に用いた。

【0040】

ＨＥＫ ＭＣ１Ｒ－Ｌｕｃ細胞及びＨＥＫ ＭＣ４Ｒ－Ｌｕｃ細胞を９６－ウェルのルミノメーター細胞培養プレート（Costar社製）の各ウェルに１、００μＬの培養液に２．５×１０⁴細胞になるように添加し、６％ＣＯ₂の存在下、３７℃のインキュベーターで１８時間培養した。前記培養液を用いて各工程濃度に希釈したＭＣＲアゴニストを、最終ＤＭＳＯ濃度が１％を越えないように処理し、６％ＣＯ₂の存在下、３７℃のインキュベーターで５時間培養した。各ウェルを５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Promega社製）で処理し、室温で５分間放置した後、ルミノメーター（Victor社製）を用いて各ウェルの発光を測定した。各工程濃度で希釈したアゴニストによって誘導される発光量を、１０μＭのＮＤＰ－α－ＭＳＨ処理によって示される量に対する相対的な％値に換算した。ＥＣ₅₀は、各アゴニストによって誘導できる最大発光量の５０％を誘導する濃度として表示した。前記測定値は、統計ソフトウェア（Ｐｒｉｚｍ）を使用して測定した。

【0041】

前記実験により得られた各化合物のＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒのアゴニスト能を測定した結果をＥＣ₅₀（ｎＭ）単位で表１に示した。

【表1】

【0042】

実施例１－２：結合親和性
ヒト組換えＭＣ１Ｒを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株及びＭＣ４Ｒを発現するＨＥＫ－２９３細胞株を樹立した後、各細胞株から膜を回収した。９６－ウェル細胞培養プレートに細胞株膜と工程別濃度に希釈したＭＣＲアゴニストを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ吸着緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて反応した。ＥＣ₅₀は、各アゴニストによって誘導され得る最大結合の５０％を誘導させる濃度として計算され、その結果を表２に示した。

【表2】

【0043】

実施例１－３：β－アレスチンアッセイ
Ｐｒｏｌｉｎｋ（ＰＫ）－タグ付きＭＣ１Ｒ、ＭＣ４Ｒと酵素受容体（ＥＡ）－タグ付きβ－アレスチンが同時に発現するＰａｔｈｈｕｎｔｅｒ ｅＸｐｒｅｓｓβ－アレスチン細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞株）を樹立した。この細胞株のＭＣＲ－ＰＫ部分が活性化されると、β－アレスチン－ＥＡが動員され、β－ガラクトシダーゼ酵素断片である酵素受容体（ＥＡ）とＰｒｏｌｉｎｋ（ＰＫ）が相互作用する。活性化された酵素は、β－ガラクトシダーゼ活性によって基質を加水分解して化学発光信号を生成し、その活性を測定することができる。 Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ ｅＸｐｒｅｓｓβ－アレスチン細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞株）を培養した後、細胞を細胞培養プレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ₂の存在か、３７℃のインキュベーターで４８時間培養した。培養後、緩衝液で５倍に希釈されたサンプルを５μＬ加え、ビヒクル濃度を１％とし、各工程濃度で希釈したＭＣＲアゴニスト化合物を加えた後、３７℃で９０分間反応させた。各アゴニスト化合物の活性（％）は、１００％ｘ（サンプルの平均ＲＬＵ値－ビヒクルコントロールの平均ＲＬＵ値）／（コントロールリガンドの平均最大値－ビヒクルコントロールの平均ＲＬＵ値）で示し、前記値は、ＣＢＩＳデータ解析スイート（ChemInnovation社製、ＣＡ）によって分析した。前記実験により得られた各化合物のメラノコルチン受容体の活性能を測定した結果をＥＣ₅₀（ｎＭ）単位で表３に示した。

【表3】

【0044】

実施例１－４：ｃＡＭＰアッセイ
ＭＣ１Ｒ及びＭＣ４Ｒがそれぞれ過発現させたｃＡＭＰＨ ｕｎｔｅｒ Ｇｓ－共役細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１細胞株）を、アゴニスト反応による細胞内ｃＡＭＰレベル増加を測定できるように樹立した後、細胞を白血球培養プレートの各ウェルに細胞を接種し、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃のインキュベーターで２４時間培養した。培養後、培地を除去して、２：１ＨＢＢＳ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬を１５μＬ加えた。緩衝液で４倍に希釈したサンプルを５μｌ加えた後、ビヒクル濃度は１％とし、各工程濃度で希釈したＭＣＲアゴニスト化合物を加え、３７℃で３０分間反応させた。各アゴニスト化合物の活性（％）は、１００％ｘ（サンプルの平均ＲＬＵ値－ビヒクルコントロールの平均ＲＬＵ値）／（最大コントロールの平均ＲＬＵ値－ビヒクルコントロールの平均ＲＬＵ値）で示し、前記値は、ＣＢＩＳデータ解析スイート（ChemInnovation社製、ＣＡ）によって分析した。前記実験により得られた各化合物のメラノコルチン受容体のアゴニスト能をＥＣ₅₀（ｎＭ）単位で測定した結果を表４に示した。

【表4】

【0045】

前記表１～４において、ＥＣ₅₀値が低いほど、対応する受容体のアゴニスト能が良好であることを示す。ＭＣ４Ｒに対する特異性は、ＭＣ１ＲのＥＣ₅₀とＭＣ４ＲのＥＣ₅₀の比を計算することにより確認することができ、この比の値が大きいほどＭＣ４Ｒに対する選択性に優れていることを示す。本願発明の試験化合物の前記比は、少なくとも５から最大３７．９８までである。このことから、本発明の試験化合物は、皮膚色素沈着に関与するＭＣ１Ｒと比較して、生体内でのエネルギー代謝及び体重制御に関与するＭＣ４Ｒに対して優れた選択性を示すことが確認された。

【0046】

実施例２：皮膚内薬物の濃度及び分布の測定
ＭＣ４Ｒアゴニストのオフターゲット効果である皮膚色素沈着については、レプチン受容体が欠損したｄｂ／ｄｂマウスモデルに反復投与した後の皮膚及び血漿中の薬物濃度を測定することにより薬物の分布及び蓄積を評価した。その結果を図１に示した。比較物質として、ＭＣ１Ｒに比べてＭＣ４Ｒに対する選択性が低いＭＣ４Ｒアゴニストペプチドで臨床試験において皮膚色素沈着を示すことが報告（Clement et al., Nature Medicine, 2018）されたセトメラノチド（Ａｃ－ＲＣ［ｄＡ］Ｈ［ｄＦ］ＲＷＣ－ＮＨ₂ (ジスルフィド) (ＡｃＯＨ塩)）を用いた。

【0047】

図１から分かるように、本願発明の試験化合物は、反復投与しても皮膚に比較的蓄積しないことが確認された。

【0048】

実施例３：皮膚色素沈着の測定
ＭＣ４Ｒアゴニストのオフターゲット効果である皮膚色素沈着の発生の可能性を確認するため、サルを用いた反復毒性試験により皮膚と体毛での色沈着パターンを側指定した結果を図２に示した。

【0049】

図２から分かるように、本願発明の試験化合物は、２週間反復投与しても皮膚と体毛に色素沈着が生じないことが確認された。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】