特表 2024-503826 ＰＤ１－ＬＡＧ３二重特異性抗体及びＣＤ２０ Ｔ細胞二重特異性抗体を用いる併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-29

(54)【発明の名称】ＰＤ１－ＬＡＧ３二重特異性抗体及びＣＤ２０ Ｔ細胞二重特異性抗体を用いる併用療法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240122BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240122BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240122BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240122BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240122BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240122BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240122BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

A61P43/00 121

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 G

A61K39/395 U

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K47/68

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K16/28

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023540992

(86)(22)【出願日】2022-01-04

(85)【翻訳文提出日】2023-08-31

(86)【国際出願番号】 EP2022050040

(87)【国際公開番号】W WO2022148732

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】21150425.3

(32)【優先日】2021-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】コダッリ ディーク， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ペロ， マリオ

(72)【発明者】

【氏名】ウェーバー， パトリック アレクサンダー アーロン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB12

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体及びＣＤ２０ Ｔ細胞活性化二重特異性抗体を用いる併用療法、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及び併用療法を使用する方法に関する。
【選択部】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用され、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項2】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、請求項１に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項3】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＩｇＧ ＦｃドメインであるＦｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体に対する結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項4】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項5】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む前記ＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む前記ＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項6】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項7】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１～３又は５のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項8】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項9】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合するＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合するＦａｂフラグメントとを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項10】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、請求項１～６又は８又は９のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項11】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項12】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号４１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号４４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項13】

ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が前記併用治療の前に行われ、前記前治療と前記併用治療との間の期間が、前記ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【請求項14】

ＣＤ２０発現がんの治療に使用するための抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む組成物であって、前記治療が、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物との組み合わせでの、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む前記組成物の投与を含み、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
ＶＬドメインであって、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、組成物。

【請求項15】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む前記ＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む前記ＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項16】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、請求項１４又は１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１４～１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントと
を含む、請求項１４～１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体がグロフィタマブである、請求項１４～１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体がモスネツズマブである、請求項１４～１８に記載の組成物。

【請求項21】

疾患、特にＣＤ２０発現がんの併用治療、逐次治療又は同時治療に使用するための、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせを含む、医薬組成物。

【請求項22】

ＣＤ２０発現がん、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択される血液がんの治療に使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

ＣＤ２０発現がんを治療するための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせの使用であって、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、使用。

【請求項24】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントと
を含む、請求項２３又は２４に記載の使用。

【請求項26】

対象においてＣＤ２０発現がんを治療するための方法であって、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を前記対象に投与することを含み、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、方法。

【請求項27】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントと
を含む、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体がグロフィタマブである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、静脈内投与又は皮下投与される、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体と同時に、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の前に、又は前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の後に投与される、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ＰＤ１－ＬＡＧ３二重特異性抗体及びＣＤ２０ Ｔ細胞活性化二重特異性抗体を用いる併用療法、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及び併用療法を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
Ｂ細胞増殖性障害は、白血病及びリンパ腫の両方を含む不均一な悪性腫瘍群を記載する。リンパ腫はリンパ細胞から発生し、２つの主要なカテゴリーである、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む。米国では、Ｂ細胞起源のリンパ腫は、全ての非ホジキンリンパ腫症例の約８０～８５％を構成し、起源のＢ細胞における遺伝子型及び表現型の発現パターンに基づいて、Ｂ細胞サブセット内にかなりの不均一性がある。例えば、Ｂ細胞リンパ腫サブセットには、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、並びにより侵攻性のサブタイプであるマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などの増殖の遅い緩徐進行型及び不治の疾患が含まれる。Ｂ細胞増殖性障害の治療のための様々な薬剤の利用可能性にもかかわらず、患者における寛解を延長し、治癒率を改善するための安全で効果的な治療法の開発が継続的に必要とされている。

【0003】

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ細胞上に発現するＣＤ２０及びＴ細胞上に存在するＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ε）を標的とする分子である。同時の結合は、Ｂ細胞のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性殺傷をもたらす。ＣＤ２０^＋Ｂ細胞の存在下では、循環しているか組織内であるかにかかわらず、薬理学的に活性な用量のＣＤ２０－ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化及び関連するサイトカイン放出を引き起こす。末梢血におけるＢ細胞枯渇と並行して、ＣＤ２０ Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、最初の投与後２４時間以内に末梢血中のＴ細胞の一過性減少及びサイトカイン放出のピークをもたらし、続いて、急速なＴ細胞回復及び７２時間以内にサイトカインレベルのベースラインへの回帰をもたらす。Ｔ細胞活性化二重特異性抗体による治療中の２つの主要な報告された逃避機構には、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の頻度の増加、及びＢ前駆細胞上のＰＤ－Ｌ１発現レベルの増加が含まれる。Ｔ_ｒｅｇは、ＣＴＬＡ４及び他の機構を介してエフェクターＴ細胞の活性化を抑制する。しかしながら、Ｔ細胞が完全に活性化される場合でさえ、ＰＤ１のアップレギュレーションは、腫瘍細胞によって発現されるＰＤ－Ｌ１に結合した後に阻害性シグナル伝達をもたらすであろう。これらの機構は、エフェクターＴ細胞の抑制及び疲弊、又は機能不全を誘導し、これらはチェックポイント遮断により治療することができる。

【0004】

疲弊したＴ細胞は、阻害性分子ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）の持続的発現を特徴とし、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－１リガンド）相互作用の遮断がＴ細胞疲弊を逆転させ、抗原特異的Ｔ細胞応答を回復させ得ることが見出された。しかしながら、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１経路単独を標的とすることは、おそらく耐性機構、ＭＤＳＣの免疫抑制活性、及び／又は制御性Ｔ細胞に起因して、Ｔ細胞疲弊の逆転を常にもたらすとは限らない。

【0005】

リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３又はＣＤ２２３）は、ＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株で発現する分子を選択的に単離するように設計された実験で、最初に発見された（Ｔｒｉｅｂｅｌ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２３５（２００６），１４７－１５３）。ＬＡＧ３は、ＣＤ４に対して構造相同性を有し、４つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリー様ドメイン（Ｄ１～Ｄ４）を有する、固有の膜貫通タンパク質である。この膜の遠位にあるＩｇＧドメインは、短いアミノ酸配列（他のＩｇＧスーパーファミリータンパク質にはみられない、いわゆるエキストラループ）を含む。細胞内ドメインは、ＬＡＧ３がＴ細胞機能に対して負の影響を与えることが必要とされる固有のアミノ酸配列（ＫＩＥＥＬＥ、配列番号１０３）を含む。ＬＡＧ３は、メタロプロテアーゼによって接続ペプチド（ＣＰ）で開裂され、可溶性形態を生成することができ、この形態は、血清中で検出可能である。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ３タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、親和性は、より高く、ＣＤ４とは別の部位で結合する（Ｈｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）、５７４４－５７４９）。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）で発現し、Ｔ細胞活性化に従ってアップレギュレーションする。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞の機能とＴ細胞のホメオスタシスを調節する。免疫不応答性であるか、又は機能不全を示す従来のＴ細胞の一部は、ＬＡＧ３を発現する。ＬＡＧ３^＋Ｔ細胞は、腫瘍部位に、また、慢性ウイルス感染中に豊富に含まれる（Ｓｉｅｒｒｏ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ １５（２０１１）、９１－１０１）。ＬＡＧ３は、ＣＤ８ Ｔ細胞の疲弊において、ある役割を果たすことが示されている（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２００９）、２９－３７）。従って、ＬＡＧ３の活性をアンタゴナイズし、腫瘍に対する免疫応答を生成し、回復させるために使用可能な抗体が必要とされている。

【0006】

機能不全腫瘍特異的Ｔリンパ球上のＰＤ－１及びＬＡＧ－３の両方を標的とすることによって、ＰＤ１－ＬＡＧ３は、有効な抗腫瘍免疫応答を回復させ、現在利用可能なチェックポイント阻害剤よりも多くのがん患者に生存利益を提供することを目的とする。ＰＤ－１／ＬＡＧ－３共発現機能不全Ｔ細胞を優先的に標的化し、潜在的に腫瘍微小環境におけるＬＡＧ－３発現Ｔｒｅｇの標的化を減少させることによって、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂは、抗腫瘍免疫応答を回復させながらＴｒｅｇ媒介免疫抑制効果の再活性化を回避し得る。

【0007】

有効なＣＤ２０発現がん治療法が存在するが、最適以下の応答、再発性難治性疾患、及び／又は１つ以上の治療剤に対する耐性は依然として課題である。さらに、より高いリスク及び細胞遺伝学的異常を有する患者は、承認された治療法に対する最適未満の応答、並びにより短い奏効期間及び無増悪生存期間を依然として有する。したがって、血液悪性腫瘍の治療のための、より効果的で安全かつ永続的な標的化併用療法が必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体とを用いる併用療法に関する。本明細書に記載の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、より良好な選択性及び有効性を提供するので、抗ＰＤ１抗体よりも有利であることが分かった。これらの抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、更に、シンク効果の低下（Ｔ細胞によるインターナリゼーションの低下によって示される）を示すことを特徴とし、これらの二重特異性抗体は、従来のＴ細胞に対して、Ｔｒｅｇに対するよりも優先的に結合し、Ｔｒｅｇ抑制からＴ細胞エフェクター機能を守ることができ、腫瘍特異的なＴ細胞エフェクター機能の増加及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍根絶の増加を示す。これらの特性に基づいて、それらは、Ｔ細胞二重特異性抗体、特に抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせで使用するのに有利である。

【0009】

がん、特にＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用される、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が本明細書に記載される。

【0010】

本発明は、本明細書に上で規定するような方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0011】

一態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が単一の組成物で一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物で別々に投与される、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0012】

さらに、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用され、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＩｇＧ ＦｃドメインであるＦｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。より詳しくは、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む。

【0013】

一態様において、本明細書で上に記載される方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインであって、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含むＶＬドメインと
を含む、第２の抗原結合ドメインを含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0014】

別の態様において、本明細書に開示される方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0015】

更なる態様において、本明細書に記載される使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインであって、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、第２の抗原結合ドメインを含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0016】

追加の態様において、本明細書に記載される方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインであって、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、第２の抗原結合ドメインを含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0017】

さらに、本明細書に開示される方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと
を含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0018】

更なる態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合するＦａｂフラグメント及びＬＡＧ３に特異的に結合するＦａｂフラグメントを含む抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合するＦａｂフラグメントを含み、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＬが重鎖の一部であり、ＶＨが軽鎖の一部であるように互いに置き換えられている。

【0019】

別の態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体がＰＤ－１に対する一価結合及びＬＡＧ３に対する一価結合を含む、本明細書で上に開示した方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0020】

更なる態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体がヒト化抗体又はキメラ抗体である、本明細書で上に開示した方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。特に、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体はヒト化抗体である。さらに、本明細書で上に記載される抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体であって、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含むＦｃドメインを含む抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体であって、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗体が提供される。特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。

【0021】

特定の態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0022】

より詳しくは、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む。

【0023】

さらに、Ｃ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用するためのものであり、かつ、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号４４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む、第１の抗原結合ドメインを含む。一態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。特に、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む。更なる態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。

【0024】

特定の一態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、グロフィタマブである。別の態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、モスネツズマブである。

【0025】

更なる態様において、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用され、組み合わせが約１週間～３週間の間隔で投与するためのものである、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。

【0026】

更に別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するためのものであり、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が併用治療の前に行われ、前治療と併用治療との間の期間が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である。好ましくは、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである。

【0027】

更なる一態様において、ＣＤ２０発現がんの治療に使用するための抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む組成物であって、当該治療が、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物との組み合わせでの、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む当該組成物の投与を含み、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、組成物が提供される。

【0028】

一態様において、組成物は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む。更なる一態様において、組成物は、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体であって、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含むＶＬドメインと
を含む、第２の抗原結合ドメインを含む、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む。

【0029】

一態様において、組成物は、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む。

【0030】

特定の一態様において、組成物は、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体であって、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントと
を含む抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む。

【0031】

さらに、ＣＤ２０発現がんの治療に使用するための抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む組成物であって、治療が、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物との組み合わせでの抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む組成物の投与を含み、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、組成物が提供される。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号４４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む、第１の抗原結合ドメインを含む。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。特に、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特定の一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はグロフィタマブである。別の特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はモスネツズマブである。

【0032】

更に別の態様において、ＣＤ２０発現がんの治療に使用するための抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む組成物であって、当該治療が、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物との組み合わせでの抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む組成物の投与を含み、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が併用治療の前に行われ、前治療と併用治療との間の期間が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答した個体のＢ細胞の減少に十分である、組成物が提供される。好ましくは、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである。

【0033】

更なる態様において、（Ａ）有効成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む第１の組成物、及び（Ｂ）疾患、特にＣＤ２０発現がんの併用治療、逐次治療又は同時治療に使用するための、有効成分としての抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む第２の組成物を含む、医薬製品が提供される。

【0034】

別の態様において、疾患、特にＣＤ２０発現がんの併用治療、逐次治療又は同時治療に使用するための、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせを含む、医薬組成物が提供される。特に、医薬組成物は、Ｂ細胞増殖性障害、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択される疾患の治療に使用するためのものである。

【0035】

別の態様において、増殖性疾患を治療するため又はその進行を遅延するため、特にＣＤ２０発現がんを治療するための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせの使用であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、使用が提供される。

【0036】

更なる一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインであって、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含むＶＬドメインと
を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。

【0037】

別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせの、増殖性疾患を治療するため、又は増殖性疾患の進行を遅延させるため、特にＣＤ２０発現がんを治療するための医薬の製造における使用であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含む、使用が提供される。

【0038】

更に別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせの、増殖性疾患を治療するための、又はその進行を遅延させるための、特にＣＤ２０発現がんを治療するための医薬の製造における使用であって、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が、併用治療の前に行われ、前治療と併用治療との間の期間が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答した個体におけるＢ細胞の減少のために十分である使用が提供される。好ましくは、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである。

【0039】

更なる態様において、対象においてＣＤ２０発現がんを治療するための方法であって、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を対象に投与することを含み、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、方法が提供される。

【0040】

一態様において、方法であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含むＶＬドメインと
を含む、方法が提供される。

【0041】

別の態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１のＦａｂフラグメントと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２のＦａｂフラグメントとを含む方法が提供される。

【0042】

一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む方法が提供される。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号４４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む、第１の抗原結合ドメインを含む。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。特に、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特定の一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はグロフィタマブである。別の特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はモスネツズマブである。

【0043】

更に別の態様において、対象においてＣＤ２０発現がんを治療する方法であって、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を対象に投与することを含み、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が併用治療の前に行われ、前治療と併用治療との間の期間が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答して個体のＢ細胞を減少させるのに十分である方法が提供される。好ましくは、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである。

【0044】

一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、静脈内投与又は皮下投与される。別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体と同時に、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の前に、又は抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の後に投与される。

【0045】

上の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、実施例で使用される特定の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体（図１Ａ）、及び特定の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体（図１Ｂ）の概略図である。これらの分子は、それぞれ実施例２及び実施例１に更に詳細に記載されている。図１Ａは、１＋１フォーマットの抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を示し、ＰＤ１結合ドメインは、ｃｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨ／ＶＬドメインの交換）を含み、ＬＡＧ３結合ドメインは、正しい対形成を補助するために、アミノ酸変異を有するＣＨ１ドメインとＣＫドメインとを含む（「帯電バリアント」）。Ｆｃ部分は、ノブ・イントゥ・ホール変異（黒色矢印によって示される）と、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に無効にするアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇとを含む。図１Ｂでは、２＋１フォーマットの例示的な二重特異性抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体が示される（ＣＤ２０ ＴＣＢと命名）。

【図2】図２は、Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する、ＣＤ２０ ＴＣＢとの組み合わせでの抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体（ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ）の効果を示す。ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂをＰＤ－１抗体（ニボルマブ、ペンブロリズマブ及び親ＰＤ－１抗体）と比較する。

【図3】図３は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２担持完全ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＣＤ２０ ＴＣＢとの組み合わせでのＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ対ＰＤ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究のプロトコルを示す図である。以下の表では、異なる組合せを受けたマウスのサブグループを定義する。実験を実施例４に記載する。

【図4】図４は、研究の結果を示す。ＣＤ２０を発現する１．５×１０^６個のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞をヒト化ＮＳＧマウスに皮下注射した。腫瘍が約３５０～４００ｍｍ^３の平均体積に達した後（１４日目）、マウスを、以下を受ける６つの群に無作為化した：Ａ）対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ビヒクル）；Ｂ）ＣＤ２０－ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）、Ｃ）ＣＤ２０－ＴＣＢ（０．１５ ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ニボルマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）、Ｄ）ＣＤ２０－ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ニボルマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｐ．）＋抗ＬＡＧ３（１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）、Ｅ）ＣＤ２０－ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）、Ｆ）ＣＤ２０－ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）。腫瘍体積をデジタルカリパスによって週に３回測定した。データを平均腫瘍体積及び平均の標準誤差（＋／－ＳＥＭ）として示す。

【図5】図５Ａ～図５Ｆでは、１４日目から４５日目までの期間にわたる腫瘍体積（ｍｍ^３＋／－ＳＥＭ）の測定値が、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂで治療した群における抗腫瘍応答の均一性を示す各個々の動物について示される。腫瘍増殖曲線は、ビヒクル群については図５Ａ、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ単独（０．１５ｍｇ／ｋｇ）については図５Ｂ、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとニボルマブとの組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ）については図５Ｃ、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとニボルマブ及びＬＡＧ３（１．５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ）については図５Ｄ、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとＰＤ１／ＬＡＧ３ ＢｓＡｂとの組み合わせについては図５Ｅ（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び図５Ｆ（３ｍｇ／ｋｇ ＰＤ１／ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ）に示される。

【図6】図６は、３ｍｇ／ｋｇのＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとＰＤ１／ＬＡＧ３ ＢｓＡｂとの組み合わせが、ニボルマブ又はニボルマブ＋抗ＬＡＧ３との組み合わせでの治療と比較して、統計的に有意な腫瘍防御をもたらしたことを示す。この分析のため、腫瘍体積データを新しい終点を導入して変換した。すなわち、本発明者らは、各動物の最後に観察された腫瘍体積が８００ｍｍ３未満であるかどうか、又はバイナリ読み出し及び低サイズ腫瘍の割合を提供しないかどうかを評価した。次いで、このエンドポイントを、Ｃｈｉ２検定に基づくペアワイズ群比較に供した。

【図7】図７は、ＯＣＩ－Ｌｙ１８を担持する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ又はペンブロリズマブ＋抗ＬＡＧ３との組み合わせでのＣＤ２０ ＴＣＢのｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究のプロトコルを示す。以下の表では、異なる組合せを受けたマウスのサブグループを定義する。実験を実施例５に記載する。

【図8】図８は、研究の結果を示す。ヒト化ＮＳＧマウスに、ＣＤ２０を発現するＯＣＩ－Ｌｙ１８リンパ腫細胞を皮下注射した。腫瘍が約２００ｍｍ^３の平均体積に達した後（１０日目）、マウスを無作為化し、治療薬を注射した。腫瘍体積（ｍｍ^３＋／－ＳＥＭ）の測定値を、マウス群内の平均体積として示す。少なくとも６匹（ビヒクルの場合）又は７匹（治療群の場合）のマウス／群／時点があるまで、腫瘍サイズを測定した。ビヒクルを２６日目まで、治療群を３５日目まで追跡した。データを平均腫瘍体積及び平均の標準誤差（＋／－ＳＥＭ）として示す。

【図9】図９Ａ～図９Ｄでは、１０日目から３５日目までの期間にわたる腫瘍体積（ｍｍ^３＋／－ＳＥＭ）の測定値が各個々の動物について示される。腫瘍増殖曲線を、ビヒクル群については図９Ａに、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ単独については図９Ｂに、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂとの組み合わせについては図９Ｃに、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとペンブロリズマブ及び抗ＬＡＧ３との組み合わせについては図９Ｄに示す。

【図10】図１０は、オビツヌツズマブによる前治療を使用した場合の、ＯＣＩ－Ｌｙ１８を担持する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂとの組合せと比較したＣＤ２０ ＴＣＢ単独のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究のプロトコルを示す。以下の表では、異なる組合せを受けたマウスのサブグループを定義する。実験を実施例６に記載する。

【図11】図１１は、研究の結果を示す。ヒト化ＮＳＧマウスに、ＣＤ２０を発現するＯＣＩ－Ｌｙ１８リンパ腫細胞を皮下注射した。腫瘍が約４００ｍｍ^３の平均体積に達した後（１７日目）、マウスを無作為化し、治療法を実験レイアウトに従って注射した。腫瘍体積（ｍｍ^３＋／－ＳＥＭ）の測定値を、マウス群内の平均体積として示す。腫瘍サイズを、治療群については３５日目まで、ビヒクル群については２６日目まで測定した。

【図12】図１２Ａ～図１２Ｃでは、１７日目から３５日目までの期間にわたる腫瘍体積（ｍｍ^３＋／－ＳＥＭ）の測定値が各個々の動物について示される。腫瘍増殖曲線を、図１２Ａにおけるビヒクル群、図１２Ｂにおけるオビヌツズマブ及びＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ、並びに図１２Ｃにおけるオビヌツズマブと、ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ及びＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂとの組み合わせについて示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

発明の詳細な説明
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。

【0048】

本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含む。

【0049】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体を除き、そのようなバリアントは、一般的に、少量存在する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。

【0050】

本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を意味する。「二重特異性」という用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基、例えば、異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合している抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の対によってそれぞれ形成される２つの結合部位に特異的に結合することができることを意味する。そのような二重特異性抗体は、１＋１フォーマットでである。他の二重特異性抗体フォーマットは、２＋１フォーマット（第１の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位と、第２の抗原又はエピトープに対する１つの結合部位とを含む）、又は２＋２フォーマット（第１の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位と、第２の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位とを含む）である。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。

【0051】

「価数」という用語は、本出願で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の結合ドメインの存在を示す。この場合、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、抗原結合分子中のそれぞれ２個の結合ドメイン、４個の結合ドメイン及び６個の結合ドメインの存在を示す。本発明の二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）であってもよい。特定の態様において、本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、２個より多い結合部位が存在する場合であっても（すなわち、抗体は三価又は多価である）、抗体は、二重特異性であってもよい。

【0052】

「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプに更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。

【0053】

「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、交差Ｆａｂフラグメント、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体フラグメントから作られる多重特異性抗体、及び単一ドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体フラグメントの総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントの総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントであり、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。これに加え、抗体フラグメントは、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与える。抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。

【0054】

インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントを生じ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂフラグメント」という用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖フラグメントと、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体フラグメントを指す。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を担持するＦａｂ’フラグメントである。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂフラグメント）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）_２フラグメントが得られる。

【0055】

「クロスＦａｂフラグメント」又は「ｘＦａｂフラグメント」又は「クロスオーバーＦａｂフラグメント」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂフラグメントを指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ_{（ＶＬＶＨ）}とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ_{（ＣＬＣＨ１）}とも呼ばれる。

【0056】

「単鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；かつ当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。当該単鎖Ｆａｂフラグメントは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。これに加え、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。

【0057】

「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの１つを有する。ここで、ＶＨとＶＬは、一緒に、ある抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成し、当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。これに加え、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。

【0058】

「単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、Ｖ_ＨのＮ末端とＶ_ＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体フラグメントは、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与える。

【0059】

「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、Ｖ_ＮＡＲフラグメント、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ－ラクタマーゼの可変ドメイン（Ｖ_ＮＡＲフラグメント）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性ベータ－シート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号Ｂ１及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つの螺旋形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及び欧州特許出願公開第１６４１８１８号Ａ１を参照されたい。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の付着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのアルファらせんとベータ－ターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のアルファらせん及びベータ－ターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号Ａ１を参照されたい。

【0060】

単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶ_ＨＨフラグメント）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来Ｖ_ＮＡＲフラグメントを含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。ベータ－サンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号Ｂ１を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。

【0061】

参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。

【0062】

本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」という用語は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の一部を指す。より詳しくは、「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗体の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。一態様において、抗原結合ドメインは、その抗原に結合し、その機能をブロックするか、又は部分的にブロックすることができる。ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義するように、抗体及びそのフラグメントを含む。これに加え、抗原結合ドメインは、足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインを含んでいてもよい（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照）。

【0063】

本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。特に指定されない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態において、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、この用語は「全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。この用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。

【0064】

「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態において、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－７Ｍ以下、例えば、１０^－７Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。

【0065】

「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0066】

本明細書で使用される場合、ある抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原に対するＫｄが１０^－９Ｍ以下、更により詳しくは１０^－１０Ｍ以下の抗体を指す。「低親和性」の抗体は、Ｋｄが１０^－８以上の抗体を指す。

【0067】

「親和性成熟した」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の変更を有する抗体を指し、これに対して、親抗体は、そのような変更を有しておらず、そのような変更によって、抗原に対する抗体の親和性が向上する。

【0068】

「ＣＤ２０」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ－１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、特に指定されない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号６１）に示されている。ＣＤ２０は、プレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球上に発現される約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られる膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンスプライス境界によって特徴付けられ、造血細胞及び非リンパ組織の間で固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発達及び分化において役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中で１１ｑ１２に局在している。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする２つの転写バリアントをもたらす。「ＣＤ２０」という用語は、「全長」の、未処理ＣＤ２０、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＣＤ２０を包含する。この用語は、ＣＤ２０の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。

【0069】

「抗ＣＤ２０抗体」及び「ＣＤ２０に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＤ２０の標的化において診断剤及び／又は治療剤として有用であるような充分な親和性で、ＣＤ２０に結合可能である抗体を指す。一実施形態において、無関係な非ＣＤ２０タンパク質に対する抗ＣＤ２０抗体の結合度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されるＣＤ２０に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＣＤ２０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、異なる種に由来するＣＤ２０間で保存されているＣＤ２０のエピトープに結合する。

【0070】

「ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体」とは、Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３（２００４）２７３８－２７４３；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１（２００３）１０４５－１０５２、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ５（２０１３），２２－３３に記載される、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物学的活性を有する抗ＣＤ２０抗体を意味し、以下の表１に要約する。

【表A】

^＊ＩｇＧ_１アイソタイプの場合

【0071】

ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例としては、例えば、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、トシツムマブ（Ｂ１）、ヒト化Ｂ－Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開第２００５／０４４８５９号に開示されているようなキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８ ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号に開示されているような）及びＡＴ８０ ＩｇＧ１が挙げられる。

【0072】

一態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、配列番号５５の重鎖可変領域配列（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び配列番号５６の軽鎖可変領域配列（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む。別の態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、非改変抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように改変される。一態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体のＦｃ領域中のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約４０％が非フコシル化されている。

【0073】

特定の態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブ（推奨ＩＮＮ，ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４，２０１２，ｐ．４５３）である。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブはＧＡ１０１と同義である。商品名は、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）又はＧＡＺＹＶＡＲＯ（登録商標）である。これは、以前の全てのバージョン（例えば、Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，２０１１，ｐ．７５－７６）に置き換わり、以前はアフツズマブとして知られていた（推奨 ＩＮＮ，ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２，２００９，ｐ．１７６；Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２，２００８，ｐ．１２４）。一態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はトシツモマブである。

【0074】

Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例としては、例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、カラツズマブ、オクレリズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ブリツキシマブ、ＨＩ４７ ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６ ＩｇＧ１（国際公開第２００５／１０３０８１号に開示されているもの）、２Ｆ２ ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号及び国際公開第２００５／１０３０８１号に開示されているもの）、及び２Ｈ７ ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０５６３１２号に開示されているもの）が挙げられる。

【0075】

「ヒト化Ｂ－Ｌｙ１抗体」という用語は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されるヒト化Ｂ－Ｌｙ１抗体を指し、それは、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ－Ｌｙ１（マウス重鎖（ＶＨ）の可変領域：配列番号６４；マウス軽鎖（ＶＬ）の可変領域：配列番号６５：（Ｐｏｐｐｅｍａ，Ｓ．ａｎｄ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｓｔ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ３（１９８７）１３１－１３９を参照）から、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとのキメラ化及びその後のヒト化によって得られたものである（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号を参照）。これらの「ヒト化Ｂ－Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に詳細に開示されている。

【0076】

「減少」という用語（及び「減少する」又は「減少すること」 などのその文法的変形）、例えば、Ｂ細胞の数又はサイトカイン放出の減少は、当技術分野で公知の適切な方法によって測定される場合、それぞれの量の減少を指す。明確にするために、この用語は、０までの減少（又は分析方法の検出限界未満）、すなわち完全な消失又は排除も含む。逆に、「増加した」とは、それぞれの量の増加を指す。

【0077】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。

【0078】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象にＴ細胞活性化を誘導することのできる治療剤、特に対象にＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療剤の例には、ＣＤ３等の活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＤ２０又はＣＤ１９等の標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。更なる例としては、Ｔ細胞活性化ドメインと、ＣＤ２０又はＣＤ１９などの標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球，特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し，抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子のＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。

【0080】

特に指定されない限り、「ＣＤ３」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＣＤ３を指す。この用語は、「全長」の、未処理のＣＤ３、及び、細胞内でのプロセシングによりもたらされる任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施形態において、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号６６も参照されたい。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号６７も参照されたい。

【0081】

「ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体」、「ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的に結合する二重特異性抗体」、「ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的な二重特異性抗原結合分子」又は「抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体」は、本明細書で相互に置き換え可能に使用され、ＰＤ１及びＬＡＧ３に、抗体がＰＤ１及びＬＡＧ３を標的とする際に診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で結合することが可能な二重特異性抗体を指す。

【0082】

「ＰＤ１」という用語は、プログラム細胞死タンパク質１としても知られ、１９９２年に最初に記述された２８８アミノ酸のＩ型膜タンパク質である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１（１９９２），３８８７－３８９５）。ＰＤ－１は、Ｔ細胞制御因子の伸長したＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、２つのリガンドＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）を有する。このタンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインと、その後に膜貫通領域と、細胞内尾部とを含む。細胞内尾部は、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ中に位置する２つのリン酸化部位を含み、ＰＤ－１がＴＣＲシグナルを負の方向に制御することを示唆している。このことは、リガンド結合の際の、ＰＤ－１の細胞質尾部に対するＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２ホスファターゼの結合に一致している。ＰＤ－１は、ナイーブＴ細胞では発現しないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在する活性化に従ってアップレギュレーションされ、活性化したＴ細胞及び疲弊したＴ細胞の両方で観察される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８（１９９６）、７６５－７７２）。これらの疲弊したＴ細胞は、機能不全の表現型を有し、適切に応答することができない。ＰＤ－１は、比較的広い発現パターンを有するが、その最も重要な役割は、Ｔ細胞に対する共阻害受容体としての役割であろう（Ｃｈｉｎａｉ ｅｔ ａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３６（２０１５）、５８７－５９５）。したがって、現在の治療手法は、Ｔ細胞応答を向上させるために、ＰＤ－１とそのリガンドとの相互作用をブロックすることに集中している。「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ－１」、「ＰＤ－１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ－１」及び「ｈＰＤ－Ｉ」という用語は、相互に置き換え可能に使用することができ、ヒトＰＤ－１のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、ＰＤ－１と共通の少なくとも１つのエピトープを有するアナログを含む。ヒトＰＤ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１５１１６（配列番号６８）に示される。

【0083】

「抗ＰＤ１抗体」及び「ＰＤ１に結合する抗原結合ドメインを含む抗体」という用語は、抗体が、ＰＤ１を標的とする際に診断及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性で、ＰＤ１（特に、細胞表面で発現するＰＤ１ポリペプチド）に結合することが可能な抗体を指す。一態様において、無関係な非ＰＤ１タンパク質に対する抗ＰＤ１抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、ＰＤ１に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様において、ヒトＰＤ１に結合する抗原結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）のヒトＰＤ１への結合についての結合親和性のＫ_Ｄ値を有する。好ましい一実施形態において、結合親和性のそれぞれのＫ_Ｄ値は、ＰＤ１結合親和性について、ヒトＰＤ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ１－ＥＣＤ）を用い、表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。「抗ＰＤ１抗体」という用語は、ＰＤ１及び第２の抗原に結合することが可能な二重特異性抗体も包含する。

【0084】

特定の態様において、抗ＰＤ１抗体は、ＭＤＸ １１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ－０１１（ピジリズマブ）、ＰＤＲ００１（スパルタリズマブ）、ＳＨＲ１２１０（カンレリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群から選択される。特定の一態様において、抗ＰＤ１抗体はペンブロリズマブ、又は配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である。ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）は、ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、ラムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、及びＳＣＨ－９００４７５としても知られており、国際公開第２００９／１１４３３５号（ＣＡＳ登録番号１３７４８５３－９１－４）に記載の抗ＰＤ－１抗体である。特定の一態様において、抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブ、又は配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である。ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ／Ｏｎｏ）は、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知であり、国際公開第２００６／１２１１６８号（ＣＡＳ登録番号９４６４１４－９４－４号）に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。別の特定の態様において、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインＶＬ、又はそのヒト化バリアントを含む。特定の態様において、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインＶＬを含む。

【0085】

「ＬＡＧ３」又は「Ｌａｇ－３」又は「リンパ球活性化遺伝子－３」又は「ＣＤ２２３」という用語は、本明細書で使用される場合、特に指定されない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＬＡＧ３を指す。この用語は、「全長」の未処理のＬＡＧ３と、細胞の処理から生じるＬＡＧ３の任意の形態を包含する。この用語は、ＬＡＧ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。好ましい一実施形態において、「ＬＡＧ３」という用語は、ヒトＬＡＧ３を指す。例示的に処理された（シグナル配列を含まない）ＬＡＧ３のアミノ酸配列を配列番号６９に示す。例示的な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＬＡＧ３のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。

【0086】

「抗ＬＡＧ３抗体」及び「ＬＡＧ３に結合する抗体」という用語は、抗体が、ＬＡＧ３を標的とする際に診断及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性で、ＬＡＧ３に結合することが可能な抗体を指す。一態様において、無関係な非ＬＡＧ３タンパク質に対する抗ＬＡＧ３抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されるＬＡＧ３に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＬＡＧ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の態様において、抗ＬＡＧ３抗体は、異なる種由来のＬＡＧ３の中で保存されているＬＡＧ３のエピトープに結合する。好ましい一実施形態において、「抗ＬＡＧ３抗体」、「ヒトＬＡＧ３に特異的に結合する抗体」、及び「ヒトＬＡＧ３に結合する抗体」とは、１．０×１０^－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫ_Ｄ値、一実施形態において１．０×^－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫ_Ｄ値、一実施形態において１．０×１０^－９ｍｏｌ／ｌ～１．０×１０^－１３ｍｏｌ／ｌのＫ_Ｄ値の結合親和性で、ヒトＬＡＧ３抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗体を指す。この観点で、結合親和性は、標準的な結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて、例えば、ＬＡＧ３細胞外ドメインを用いて決定される。「抗ＬＡＧ３抗体」という用語は、ＬＡＧ３及び第２の抗原に結合することが可能な二重特異性抗体も包含する。一態様において、抗ＬＡＧ３抗体は、レラトリマブ若しくはＢＭＳ－９８６０１６、又は配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体である。

【0087】

「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、これらが結合する抗原の生体活性を阻害するか、又は減らす抗体である。いくつかの実施形態において、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生体活性を実質的に、又は完全に阻害する。例えば、本発明の二重特異性抗体は、抗原刺激に対する機能不全状態から、Ｔ細胞による機能応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死）を回復するように、ＰＤ－１及びＬＡＧ３によるシグナル伝達をブロックする。

【0088】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。

【0089】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨにあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬにある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、以下が挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。

【0090】

特に指定されない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。

【0091】

「Ｋａｂａｔのような可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置ナンバリング」という用語及びその変形は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．の抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリング方式を使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＨＶＲの短縮、又はそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所与の抗体に対して、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによってナンバリングされた配列との相同領域での整列によって決定され得る。一般的に、天然４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。

【0092】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１ドメイン、ＦＲ２ドメイン、ＦＲ３ドメイン及びＦＲ４ドメインの４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0093】

本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。

【0094】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。

【0095】

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0096】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含む、キメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明による特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に改変されるか、又は変更されているものである。

【0097】

「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。

【0098】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。そのようなバリアントは、一般的に少量で存在する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない多様な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法が本明細書に記載されている。

【0099】

「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。特に、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしてなくてもよい。重鎖のアミノ酸配列は、常に、Ｃ末端リシンを伴って存在するが、Ｃ末端リシンを含まないバリアントは、本発明に含まれる。

【0100】

ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと、を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよそのアミノ酸位置２３１のアミノ酸残基から、おおよそのアミノ酸位置３４０のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態において、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに付着している。本発明のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその位置３４１のアミノ酸残基から、おおよその位置４４７のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのようなバリアントＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。

【0101】

「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態において、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる具体的な実施形態において、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、それにより、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0102】

「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子バリアント及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失され得る。そのようなバリアントは、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照）。

【0103】

「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。

【0104】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による連結の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を担持する細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。

【0105】

「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーであり、ここで、「ｎ」は、一般に、１～１０の間、典型的には２～４の数、特に２である。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号７１）、（Ｇ_４Ｓ）_２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）、（Ｇ４Ｓ）_３（配列番号７３）及び（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号７４）、より詳しくは（Ｇ_４Ｓ）_２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）である。

【0106】

「～に融合する」又は「～に接続する」とは、構成要素（例えば、抗原結合ドメイン及びＦｃドメイン）が、ペプチド結合によって直接的に、又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。

【0107】

本出願において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。

【0108】

参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、公的に入手可能なＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ等のコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で達成され得る。ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
この場合、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。

【0109】

特定の態様において、本明細書で提供される本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントが想定される。例えば、二重特異性抗体の結合親和性及び／又は他の生体特性を改良することが望ましい場合がある。二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって調製されてもよく、又はペプチド合成によって調製されてもよい。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が含まれる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終コンストラクトに到達させるために作ることができる。置換変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｃに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、対象となる分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。

【表B】

【0110】

アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0111】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。

【0112】

「アミノ酸配列バリアント」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られたバリアント（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態において、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてよい。変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを決定するためにスクリーニングされてもよい。

【0113】

アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する二重特異性抗体が挙げられる。分子の他の挿入バリアントには、二重特異性抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。

【0114】

特定の態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変更される。分子のグリコシル化バリアントは、１つ以上のグリコシル化部位が作成されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を変えることによって、簡便に得られるだろう。例えば、Ｆｃドメインに付着する炭水化物が変更されてもよい。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合付着される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態において、特定の改良された特性を有するバリアントを作成するために、本発明の二重特異性抗体中のオリゴ糖改変が行われてもよい。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着するフコースを欠いた炭水化物構造を有する二重特異性抗体のバリアントが提供される。そのようなフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明の二重特異性抗体の更なるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。そのようなバリアントは、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。

【0115】

特定の態様において、本発明の二重特異性抗体のシステイン操作されたバリアント、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いて抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作製することができる。特定の実施形態において、以下の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作製されてもよい。

【0116】

特定の態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含むように改変されてもよい。抗体の誘導体化に適した部位としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが付着する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療法に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。

【0117】

別の態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。

【0118】

「イムノコンジュゲート」は、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含む、１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされている抗体である。

【0119】

「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを指す。

【0120】

「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドが意図するのは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。

【0121】

本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ以上の連続した群として散在してもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。

【0122】

「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸フラグメントに組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施形態において、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。

【0123】

「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む発現カセットを含む。

【0124】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生産するのに使用できる任意の種類の細胞系である。特に、宿主細胞は、原核生物又は真核生物の宿主細胞である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も挙げられる。

【0125】

ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。

【0126】

薬剤、例えば医薬組成物の「治療有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な投薬量及び期間での有効な量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。

【0127】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。

【0128】

「医薬組成物」という用語は、中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、かつ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。

【0129】

「薬学的に許容され得る賦形剤」は、医薬組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されないが、バッファー、安定剤又は防腐剤が挙げられる。

【0130】

「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。

【0131】

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」等、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患進行率を低下させること、症状の寛解又は緩和、及び回復又は改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の分子を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。

【0132】

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺細気管支肺胞がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部若しくは頸部のがん、皮膚若しくは眼内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形膠芽細胞腫、星細胞種、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫（上述のがんのいずれかの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ以上の組み合わせであってもよい。一実施形態において、がんという用語は、ＣＤ２０発現がんを指す。

【0133】

「ＣＤ２０の発現」という用語は、それぞれ腫瘍又はがん、好ましくは非固形腫瘍からの細胞内、好ましくはＴ細胞又はＢ細胞、より好ましくはＢ細胞の細胞表面上の有意なレベルの発現ＣＤ２０を示すことを意図している。「ＣＤ２０を発現するがん」を有する患者は、当該技術分野で公知の標準的なアッセイによって決定することができる。例えば、ＣＤ２０抗原の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出、ＦＡＣＳを使用して、又は対応するｍＲＮＡのＰＣＲベースの検出を介して測定され得る。

【0134】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２０発現がん」という用語は、がん細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全てのがんを指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、ＣＤ２０発現がんは、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ球性白血病を指す。かかるリンパ腫及びリンパ性白血病には、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地域性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、及び非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫、肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）有毛細胞性リンパ腫、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病が含まれる。

【0135】

一態様において、ＣＤ２０発現がんは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の態様において、ＣＤ２０発現がんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、有毛細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、又は原発性ＣＮＳリンパ腫からなる群から選択される。

【0136】

「Ｂ細胞増殖性障害」とは、患者のＢ細胞の数が健常対象のＢ細胞の数と比較して増加している疾患、特にＢ細胞の数の増加が疾患の原因又は特徴である疾患を意味する。「ＣＤ２０陽性Ｂ細胞増殖性障害」は、Ｂ細胞、特に悪性Ｂ細胞が（正常Ｂ細胞に加えて）ＣＤ２０を発現するＢ細胞増殖性障害である。例示的なＢ細胞増殖障害としては、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、並びにいくつかのタイプの多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）が挙げられる。

【0137】

「治療する方法」、「治療方法」という用語、又はその等価物は、例えばがんに適用される場合、患者のがん細胞の数を減少させるか若しくは排除するか、又はがんの症状を緩和するように設計された手順又は一連の作用を指す。がん又は別の増殖性障害を「治療する方法」は、がん細胞若しくは他の障害が実際に排除されること、細胞障害の数が実際に減少すること、又はがん若しくは他の障害の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。多くの場合、がんを治療する方法は、成功の可能性が低い場合であっても実施されるが、患者の病歴及び推定生存予想を考慮すると、それにもかかわらず、全体的に有益な一連の作用を誘導すると考えられる。

【0138】

「組み合わせ」、「同時投与」又は「同時投与すること」という用語は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を２つの別個の製剤として（又は単一の製剤として）投与することを指す。同時投与は、同時であっても順次であってもよく、好ましくは、両方（又は全て）の活性剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する期間が存在する。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、同時に又は順次（例えば、連続注入により静脈内（ｉ．ｖ．）でのいずれかで同時投与される（１つは抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であり、１つは抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体である）。両方の治療剤が順次に同時投与される場合、用量は２回の別々の投与で同じ日に投与されるか、又は薬剤の１つが１日目に投与され、２番目が２日目～７日目、好ましくは２日目～４日目に同時投与される。したがって、「順次」という用語は、第１の成分（抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体）の投与後７日以内、好ましくは第１の成分の投与後４日以内を意味し、「同時に」という用語は同じ時を意味する。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の維持用量に関して「同時投与」という用語は、治療サイクルが両方の薬物に適切である場合、例えば毎週、維持用量を同時に同時投与することができることを意味する。又は、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を例えば２週間ごとに投与し、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を３週間ごとに投与する。或いは、維持用量は、１日以内又は数日以内のいずれかで順次同時投与される。

【0139】

本発明で使用するための例示的な抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせでのそれらの使用、特にＣＤ２０発現がんを治療又は進行遅延させる方法、より詳しくはＢ細胞増殖性障害を治療又は進行遅延させる方法におけるそれらの使用に関する。本明細書で使用される場合、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗体である。したがって、それらはＣＤ２０発現Ｂ細胞を標的としている。

【0140】

したがって、本明細書で使用される場合、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む。

【0141】

特定の態様において、組み合わせで使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号４３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号４４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む。

【0142】

一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は全長抗体である。一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ_１クラスの抗体である。一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体フラグメント、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、より詳しくはＦａｂ分子である。特定の態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換えられる）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体はヒト化抗体である。

【0143】

別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。

【0144】

別の特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む、第３の抗原結合ドメインを含む。

【0145】

更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されたクロスＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、従来のＦａｂ分子である。

【0146】

別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。

【0147】

複数のＦａｂ分子はＦｃドメインに、又は互いに、直接、又は、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含む、１つ以上のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーを介して、融合することができる。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。好適な非免疫原性ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）（配列番号７１）、（Ｇ_４Ｓ）_２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）、（Ｇ４Ｓ）_３（配列番号７３）及び（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号７４）、より詳しくは（Ｇ_４Ｓ）_２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）が挙げられる。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_２である。別の好適なリンカーは、配列（Ｇ_４Ｓ）_４（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号７４）を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを伴い又は伴わずに融合していてもよい。

【0148】

更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ＥＵナンバリングによる）アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。

【0149】

特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号５８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号５９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号５７のポリペプチド配列、配列番号５８のポリペプチド配列、配列番号５９のポリペプチド配列及び配列番号６０のポリペプチド配列を含む（ＣＤ２０ ＴＣＢ）。

【0150】

特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はグロフィタマブである。

【0151】

グロフィタマブ（Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ １２１ ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，２０１９、ＣＤ２０－ＴＣＢ、ＲＯ７０８２８５９、又はＲＧ６０２６としても知られている）は、Ｂ細胞上のＣＤ２０への二価結合及びＴ細胞上のＣＤ３、特にＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ）への一価結合のための２：１の分子構成を有する新規Ｔ細胞係合二重特異性全長抗体である。そのＣＤ３結合領域は、可撓性リンカーを介して頭部－－尾部様式でＣＤ２０結合領域の１つに融合される。この構造は、１：１構成を有する他のＣＤ２０－ＣＤ３二重特異性抗体と比較して優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を有するグロフィタマブを与え、前臨床ＤＬＢＣＬモデルにおいて大きな抗腫瘍効果をもたらす。ＣＤ２０二価性は、競合する抗ＣＤ２０抗体の存在下でこの効力を維持し、これらの薬剤による前治療又は同時治療の機会を提供する。グロフィタマブは、ＦｃｇＲ及びＣ１ｑへの結合が完全に消失した、操作されたヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む。ヒトＣＤ２０発現腫瘍細胞及びＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３εに同時に結合することによって、Ｔ細胞の活性化、増殖及びサイトカイン放出に加えて、腫瘍細胞溶解を誘導する。グロフィタマブによって媒介されるＢ細胞の溶解はＣＤ２０特異的であり、ＣＤ２０発現の非存在下又はＣＤ２０発現細胞へのＴ細胞の同時結合（架橋）の非存在下では起こらない。殺傷に加えて、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５及びＣＤ６９）、サイトカイン放出（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０）、細胞傷害性顆粒放出（グランザイムＢ）及びＴ細胞増殖の増加によって検出されるように、ＣＤ３架橋による活性化を受ける。

【0152】

別の態様において、組み合わせで使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号８３のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号８４のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号８５のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号８６のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号８７のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号８８のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含むより詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号９０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、及び／又は配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む。

【0153】

更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号９２のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号９３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号９４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号９５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号９６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号９７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。

【0154】

特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１００の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１０２の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更なる特定の実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号９９のポリペプチド配列、配列番号１００のポリペプチド配列、配列番号１０１のポリペプチド配列及び配列番号１０２のポリペプチド配列を含む。

【0155】

特定の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はモスネツズマブである。モスネツズマブ（ＲＯ７０３０８１６；ＢＴＣＴ４４６５Ａとしても知られている）は、ヒトＩｇＧ１クラスのヒト化全長抗ＣＤ２０／ＣＤ３ Ｔ細胞依存性二重特異性（ＴＤＢ）抗体であり、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域にアミノ酸置換Ｎ２９７Ｇ（ＥＵナンバリング従う）を含む。この置換は、Ｆｃガンマ（ＦＣ－γ）受容体への結合が最小限であり、結果としてＦｃエフェクター機能を低下させる非グリコシル化重鎖をもたらす。モスネツズマブの作用機序は、ＣＤ３を介したＴ細胞とＣＤ２０発現細胞との係合を伴い、ＣＤ２０発現細胞のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞溶解をもたらす。全長抗体としてのその構造及び非臨床データに基づいて、モスネツズマブの薬物動態（ＰＫ）特性は、他のモノクローナル抗体と同様に、臨床現場での間欠投薬を可能にする。

【0156】

特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１６／０２０３０９号Ａ１又は国際公開第２０１５／０９５３９２号Ａ１に記載されている。

【0157】

更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はまた、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））を含み得る。更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＸｍＡｂ（登録商標）１３６７６である。別の態様において、二重特異性抗体はＲＥＧＮ１９７９である。別の態様において、二重特異性抗体はＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）である。

【0158】

本発明で使用するための例示的な二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体
本明細書で提供される組み合わせでは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、生産性、安定性、結合親和性、生体活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率及び毒性の低下など、特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗体が使用される。本明細書で使用するための特定の二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体は、国際公開第２０１８／１８５０４３号Ａ１に記載されている。

【0159】

特定の態様において、Ｔ細胞表面に結合する際にインターナリゼーションの低下を示す、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。インターナリゼーションは、標的受容体がＴＣＲシグナル伝達を阻害する準備ができた細胞表面で迅速に再発現しつつ、数時間以内に分解し得る分子の重要なシンクを表す。更なる態様において、Ｔｒｅｇに対してよりも、従来のＴ細胞に対して優先的に結合する、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。このことは、ブロッキング抗体を用いたＴｒｅｇ上のＬＡＧ－３の標的化が、その抑制機能を増加させ、最終的に他のＴ細胞に対する正のブロッキング効果を覆い隠すことによって悪化し得るため、有利である。更なる態様において、Ｔｒｅｇ抑制からＴ細胞エフェクター機能を守ることができる、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。別の態様において、本明細書で提示されるアッセイで示されるように、腫瘍細胞株ＡＲＨ７７と共に培養すると、ＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌を誘発することができる、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。更なる態様において、腫瘍特異的なＴ細胞エフェクター機能の増加を示し、及び／又はＴ細胞の細胞毒性効果を高める、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。別の態様において、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍根絶の増加を示す、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。

【0160】

一態様において、本発明は、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する当該第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む。

【0161】

一態様において、二重特異性抗体は、ＩｇＧであるＦｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低下させるか、又は無効にしさえする。特に、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。

【0162】

更なる態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、ＩｇＧであるＦｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗体が提供される。

【0163】

別の態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、二重特異性抗体が提供される。

【0164】

特定の更なる態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。

【0165】

別の態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、二重特異性抗体が提供される。

【0166】

更なる態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、二重特異性抗体が提供される。

【0167】

別の態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。

【0168】

特定の態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含み、
ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、二重特異性抗体が提供される。

【0169】

一態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。

【0170】

更なる態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。

【0171】

更なる態様において、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。特に、二重特異性抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。

【0172】

一態様において、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、二価である。このことは、二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合する１個の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する１個の抗原結合ドメインとを含む（１＋１フォーマット）ことを意味する。

【0173】

一態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントとを含む、二重特異性抗体が提供される。特定の態様において、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられている。特定の態様において、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換えられている。

【0174】

特定の態様において、二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、二重特異性抗体が提供される。

【0175】

より詳しくは、二重特異性抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む。

【0176】

Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
特定の態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供され、該二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させ、エフェクター機能を低下させるか又は失わせる１つ以上のアミノ酸修飾を含むＦｃドメインを含む。

【0177】

特定の態様において、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを生成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

【0178】

以下のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様において、本発明は、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体に関する。特に、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。

【0179】

Ｆｃドメインは、本発明の二重特異性抗体に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかしながら、同時に、好ましい抗原を担持する細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、特定的な実施形態において、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ ドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。より詳しくは、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。

【0180】

１つのそのような態様において、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示し、及び／又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様において、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘発しない。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌のうち１つ以上である。特定の態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様において、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は該Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より詳しくは約９０％より大きい結合親和性を示す場合に達成される。

【0181】

特定の態様において、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクター機能が低下するように操作される。特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一態様において、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を低下させる。別の態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。一態様において、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より詳しくは５％未満を示す。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。別の態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの各受容体への結合が低下する。いくつかの態様において、補体成分に対する結合親和性（具体的には、Ｃ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、上記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保護）は、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％を超える結合親和性を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、そのような親和性の約８０％より大きく、更に約９０％より大きい親和性を示してもよい。特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したＴ細胞プライミング。

【0182】

エフェクタ機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９において１つ以上の置換を含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。

【0183】

本発明の一つの態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのそのような実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。更に特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、ＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体の結合をほとんど完全になくす。当該文書は、そのような突然変異体Ｆｃドメインを調製するための方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などの特性を決定するための方法も記載する。そのような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ナンバリングはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌのＥＵインデックスに従う、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）。

【0184】

一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、（ｉ）任意に変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は（ｉｉ）任意に変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は（ｉｉｉ）任意に変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有するか、又は任意に変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は（ｉｖ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、又は（ｖ）両Ｆｃ領域ポリペプチドが、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含み、１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む（全て、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる位置）。

【0185】

一態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態において、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔナンバリング）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。したがって、一態様において、二重特異性抗体であって、（全て、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる位置）両Ｆｃ領域ポリペプチドが、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＳ３５４Ｃを含むか、又は１つのＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体が提供される。

【0186】

半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７－５９３及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９－２４３４）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するバリアントを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、「Ｎａｔｕｒｅ」第３２２巻（１９８８年）第７３８～７４０頁；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。

【0187】

Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。好適なかかる結合アッセイを本明細書に記載する。或いは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。或いは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。

【0188】

以下のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明の二重特異性抗体の好ましい態様を記載する。一態様において、Ｆｃドメインが、Ｆｃγ受容体に対する、特にＦｃ受容体に対する抗体の結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。別の態様において、Ｆｃドメインがエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。特定の態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。

【0189】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合ドメインを含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を高めるために、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。

【0190】

したがって、特定の態様において、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一態様において、当該改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。

【0191】

具体的な態様において、上記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変と、を含む。したがって、本発明は、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体に関し、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0192】

ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。

【0193】

したがって、一態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が位置換え可能である。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。具体的な態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のスレオニン残基がトリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。

【0194】

なお更なる態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５）。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0195】

しかしながら、欧州特許第１ ８７０ ４５９号に記載される他のホールにノブを入れる技術も、これに代えて、又はこれに加えて使用することができる。一実施形態において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0196】

一態様において、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異を含み、「ホール」鎖のＣＨ３ドメインに変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、更に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0197】

一態様において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいて、変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又は多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいて、変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、更に、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、変異Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0198】

別の態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えばＰＣＴ公開である国際公開２００９／０８９００４に記載されているように、静電ステアリング効果を媒介する改変を含む。一般に、この方法では、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にある１つ以上のアミノ酸残基を帯電したアミノ酸残基で置き換えて、ホモ二量体形成が静電気的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電気的に有利になるようにする。

【0199】

「ノブ・イントゥ・ホール技術」の他に、ヘテロ二量体化を推進するために多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを改変するための他の技術は、当該技術分野で知られている。これらの技術、特に、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、及び国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載される技術は、二重特異性抗体との組み合わせで「ノブ・イントゥ・ホール」に対する代替として、本明細書で想定される。

【0200】

一態様において、二重特異性抗体において、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、欧州特許第１８７０４５９号に記載される手法を用いる。この手法は、第１及び第２の重鎖の間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷で帯電したアミノ酸の導入に基づく。

【0201】

したがって、この態様において、多重特異性抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメインと第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、それぞれの抗体ＣＨ３ドメインの間に存在する界面を形成し、第１の重鎖のＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、抗体の三次構造中の当該界面内に位置する一連のアミノ酸を含み、界面に位置する一連のアミノ酸から、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、第１のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸によって置換されており、界面に位置する一連のアミノ酸から、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、第２のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている。この態様の二重特異性抗体は、本明細書では、「ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体」とも呼ばれる（ここで、省略語「＋／－」は、それぞれのＣＨ３ドメインに導入されたのと反対の電荷に帯電したアミノ酸を表す）。

【0202】

一態様において、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、正に帯電したアミノ酸は、Ｋ、Ｒ及びＨから選択され、負に帯電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。

【0203】

一態様において、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、正に帯電したアミノ酸は、Ｋ及びＲから選択され、負に帯電したアミノ酸は、Ｅ又はＤから選択される。

【0204】

一態様において、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、正に帯電したアミノ酸は、Ｋであり、負に帯電したアミノ酸は、Ｅである。

【0205】

一態様において、ＣＨ３（＋／－）操作された二重特異性抗体において、１つの重鎖のＣＨ３ドメイン中、位置４０９のアミノ酸ＲがＤによって置換されており、位置のアミノ酸ＫがＥによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９９のアミノ酸ＤがＫによって置換されており、位置３５７のアミノ酸ＥがＫによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0206】

一態様において、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載される手法を用いる。一実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＫによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＤによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。別の実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＫによって置換されており、位置３５１のアミノ酸ＬがＫによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＤによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0207】

別の態様において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＫによって置換されており、位置３５１のアミノ酸ＬがＫによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＤによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。さらに、以下の置換の少なくとも１つが他の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれる。位置３４９のアミノ酸ＹがＥによって置換されており、位置３４９のアミノ酸ＹがＤによって置換されており、位置３６８のアミノ酸ＬがＥによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。一実施形態において、位置３６８のアミノ酸Ｌは、Ｅによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0208】

一態様において、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載される手法を用いる。一態様において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＹによって置換されており、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＡによって置換されており、位置４０９のアミノ酸ＫがＦによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。別の実施形態において、上述の置換に加え、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４１１（元はＴ）、３９９（元はＤ）、４００（元はＳ）、４０５（元はＦ）、３９０（元はＮ）及び３９２（元はＫ）のアミノ酸の少なくとも１つが置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。好ましい置換は次のとおりである。
－ 位置４１１のアミノ酸Ｔを、Ｎ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｅ及びＷから選択されるアミノ酸で置換する（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
－ 位置３９９のアミノ酸Ｄを、Ｒ、Ｗ、Ｙ及びＫから選択されるアミノ酸で置換する（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
－ 位置４００のアミノ酸Ｄを、Ｅ、Ｄ、Ｒ及びＫから選択されるアミノ酸で置換する（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
－ 位置４０５のアミノ酸Ｆを、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｖ及びＷから選択されるアミノ酸で置換する（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
－ 位置３９０のアミノ酸Ｎを、Ｒ、Ｋ及びＤから選択されるアミノ酸で置換する（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
－ 位置３９２のアミノ酸Ｋを、Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｌ、Ｆ及びＥから選択されるアミノ酸で置換する（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0209】

別の態様において、二重特異性抗体が、国際公開第２０１２／０５８７６８）号に従って操作されており、すなわち、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３５１のアミノ酸ＬがＹによって置換されており、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＶによって置換されており、位置４０９のアミノ酸ＫがＦによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。多重特異性抗体の別の実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＡによって置換されており、位置４０９のアミノ酸ＫがＦによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。後者の上述の実施形態において、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９２のアミノ酸ＫがＥによって置換されており、位置４１１のアミノ酸ＴがＥによって置換されており、位置３９９のアミノ酸ＤがＲによって置換されており、位置４００のアミノ酸ＳがＲによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0210】

一態様において、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載される手法を用いる。一態様において、両重鎖のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸改変は、位置３６８及び／又は４０９に導入される（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0211】

一態様において、二重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載される手法を用いる。国際公開第２０１１／０９０７６２号は、「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）技術に従ったアミノ酸改変に関する。一実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＷによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のアミノ酸ＹがＡによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。別の実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のアミノ酸ＴがＹによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のアミノ酸ＹがＴによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0212】

一態様において、二重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、国際公開第２００９／０８９００４号に記載される手法を用いる。一実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９２のアミノ酸Ｋ又はＮが、負に帯電したアミノ酸によって（一実施形態において、Ｅ又はＤによって、好ましい一実施形態において、Ｄによって）置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置３９９のアミノ酸Ｄ、位置３５６のアミノ酸Ｅ又はＤ、又は位置３５７のアミノ酸Ｅが、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（一実施形態において、Ｋ又はＲ、好ましい一実施形態において、Ｋによって置換されており、好ましい一実施形態において、位置３９９又は３５６のアミノ酸が、Ｋによって置換されている）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。更なる一実施形態において、上述の置換に加え、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０９のアミノ酸Ｋ又はＲが、負に帯電したアミノ酸によって（一実施形態において、Ｅ又はＤによって、好ましい一実施形態において、Ｄによって）置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。１つのなお更なる態様において、上述の置換に加えて、又は上述の置換に代えて、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４３９のアミノ酸Ｋ及び／又は位置３７０のアミノ酸Ｋが、互いに独立して、負に帯電したアミノ酸によって（一実施形態において、Ｅ又はＤによって、好ましい一実施形態において、Ｄによって）置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0213】

一態様において、多重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖のヘテロ二量体化を補助するために、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載される手法を用いる。一実施形態において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置２５３のアミノ酸ＫがＥによって置換されており、位置２８２のアミノ酸ＤがＫによって置換されており、位置３２２のアミノ酸ＫがＤによって置換されており、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置２３９のアミノ酸ＤがＫによって置換されており、位置２４０のアミノ酸ＥがＫによって置換されており、位置２９２のアミノ酸ＫがＤによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0214】

本明細書に報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様において、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。

【0215】

一態様において、本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様において、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。本明細書に報告される全ての態様のうちの一実施形態において、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0216】

Ｆａｂドメイン内の改変
一態様において、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換されている、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。

【0217】

１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、国際公開２００９／０８０２５２号、国際公開２００９／０８０２５３号及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１に記載される。これらの多重特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（そのようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。

【0218】

特定の態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体であって、Ｆａｂフラグメントの１つにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置き換えられている、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。特定の態様において、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換えられている、二重特異性抗体である。

【0219】

別の態様において、正しい対形成を更に改善するために、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの改変は、クロスしているか、又はクロスしていないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。これらの改変は、例えば、国際公開第２０１５／１５０４４７号、国際公開第２０１６／０２０３０９号及び国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３４０８号に記載される。

【0220】

特定の態様において、定常ドメインＣＬにおけるＦａｂフラグメントの１つにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。特定の態様において、二重特異性抗体は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂフラグメントの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、二重特異性抗体である。

【0221】

特定の態様において、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が提供される。特定の態様において、二重特異性抗体は、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂフラグメントにおいて、位置１２３のアミノ酸（ＥＵナンバリング）が、アルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、位置１２４のアミノ酸（ＥＵナンバリング）が、リシン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵナンバリング）及び位置２１３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、二重特異性抗体である。

【0222】

更なる態様において、二重特異性抗体は、二価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の軽鎖と第２の重鎖と
を含み、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換えられている。

【0223】

ａ）の抗体はｂ）で報告されている改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。

【0224】

（ｂ）の抗体では、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬが、当該抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換わっており、重鎖内で、可変重鎖ドメインＶＨが、当該抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換えられている。

【0225】

一態様において、（ｉ）（ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）が、正に帯電したアミノ酸によって置換されており、（ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）が、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか、又は（ｉｉ）（ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）が、正に帯電したアミノ酸によって置換されており、（ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）が、負に帯電したアミノ酸によって置換されている。

【0226】

別の態様において、（ｉ）（ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）（好ましい一実施形態において、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており）、（ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、又は（ｉｉ）（ｂ）の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）（好ましい一実施形態において、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており）、（ｂ）の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0227】

一態様において、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４及び１２３のアミノ酸は、Ｋによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0228】

一態様において、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３のアミノ酸は、Ｒによって置換されており、位置１２４のアミノ酸は、Ｋによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0229】

一態様において、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸は、Ｅによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0230】

一態様において、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４及び１２３のアミノ酸がＫによって置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸がＥによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0231】

一態様において、第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３のアミノ酸がＲによって置換されており、位置１２４のアミノ酸がＫによって置換されており、第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸が両方ともＥによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0232】

一態様において、第２の重鎖の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４及び１２３のアミノ酸がＫによって置換されており、第２の軽鎖の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７及び２１３のアミノ酸がＥによって置換されており、第１の軽鎖の可変ドメインＶＬにおいて、位置３８のアミノ酸がＫによって置換されており、第１の重鎖の可変ドメインＶＨにおいて、位置３９のアミノ酸がＥによって置換されており、第２の重鎖の可変ドメインＶＬにおいて、位置３８のアミノ酸がＫによって置換されており、第２の軽鎖の可変ドメインＶＨにおいて、位置３９のアミノ酸がＥによって置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0233】

一態様において、二重特異性抗体は、二価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の軽鎖と第２の重鎖と
を含み、第２の軽鎖及び第２の重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっており、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられている。

【0234】

（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告される改変を含まず、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。（ｂ）の抗体において、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬは、当該抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換わっており、定常軽鎖ドメインＣＬは、当該抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換わっており、重鎖内で、可変重鎖ドメインＶＨは、当該抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換わっており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、当該抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換え得られている。

【0235】

一態様において、二重特異性抗体は、二価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の軽鎖と第２の重鎖と
を含み、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられている。

【0236】

ａ）の抗体はｂ）で報告されている改変を含有せず、ａ）の重鎖及び軽鎖は単離された鎖である。（ｂ）の抗体において、軽鎖内で、定常軽鎖ドメインＣＬが、当該抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換わっており、重鎖内で、定常重鎖ドメインＣＨ１が、当該抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換え得られている。

【0237】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体と、
（ｂ）第２の抗原に対して特異的に結合する１つ、２つ、３つ又は４つの一本鎖Ｆａｂフラグメントと
を含む、二重特異性抗体であり、
（ｂ）の当該一本鎖Ｆａｂフラグメントは、（ａ）の当該全長抗体に対し、ペプチドリンカーを介し、当該全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端で融合している。

【0238】

一態様において、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体に対し、ペプチドリンカーを介し、当該全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端で融合する。

【0239】

一態様において、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、当該全長抗体の重鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。

【0240】

一態様において、第２の抗原に結合する１つ又は２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、当該全長抗体の軽鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。

【0241】

一態様において、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、当該全長抗体の重鎖又は軽鎖のそれぞれのＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。

【0242】

一態様において、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、当該全長抗体のそれぞれの重鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。

【0243】

一態様において、第２の抗原に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントは、全長抗体に対し、当該全長抗体のそれぞれの軽鎖のＣ末端で、ペプチドリンカーを介して融合している。

【0244】

一態様において、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体と、
ｂ）
（ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は
（ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）からなる、第１のポリペプチドであって、
当該第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介し、当該全長抗体の２つの重鎖の１つのＣ末端に対し、そのＶＨドメインのＮ末端と融合している、第１のポリペプチドと、
（ｃ）
（ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
（ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなる第２のポリペプチドであって、
当該第２のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介し、当該全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に対し、ＶＬドメインのＮ末端と融合している、第２のポリペプチドとを含む、三価抗体であり、
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、一緒に、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成する。

【0245】

一態様において、（ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び（ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置の間にジスルフィド結合を導入することによって、鎖間ジスルフィド架橋を介して接続され、安定化される：
（ｉ）重鎖可変ドメインの位置４４から軽鎖可変ドメインの位置１００まで、又は
（ｉｉ）重鎖可変ドメインの位置１０５から軽鎖可変ドメインの位置４３まで、又は
（ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの位置１０１から軽鎖可変ドメインの位置１００まで（ナンバリングは常にＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0246】

安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入するための技術は、国際公開９４／０２９３５０号、Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９７）１４５３－１４５９；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５（１９９８）３８７－３９３、及びＳｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（１９９９）１７１１－１７２１に記載される。一実施形態において、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意要素のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの位置４４と軽鎖可変ドメインの位置１００との間にある。一実施形態において、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意要素のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの位置１０５と軽鎖可変ドメインの位置４３との間にある（ナンバリングは常にＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。一実施形態において、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬとの間に当該任意のジスルフィド安定化を有しない三価の二重特異性抗体が好ましい。

【0247】

一態様において、二重特異性抗体は、三重特異性抗体又は四重特異性抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられており、及び／又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられている、全長抗体の第２の（改変された）軽鎖及び第２の（改変された）重鎖とを含み、
（ｃ）１つ又は２つの更なる抗原（すなわち、第３及び／又は第４の抗原）に特異的に結合する１～４個の抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介し、（ａ）及び／又は（ｂ）の軽鎖又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合している。

【0248】

（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告される改変を含まず、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。

【0249】

一態様において、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、１つ又は２つの更なる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインを含む。

【0250】

一態様において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントからなる群から選択される。

【0251】

一態様において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメントである。

【0252】

一態様において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦａｂフラグメントである。

【0253】

一態様において、抗原結合ドメインは、（ａ）及び／又は（ｂ）の重鎖のＣ末端に融合している。

【0254】

一態様において、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、１つの更なる抗原に特異的に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインを含む。

【0255】

一態様において、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、第３の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合ドメインを含む。好ましい一実施形態において、そのような２つの同一の抗原結合ドメインは、（ａ）及び（ｂ）の重鎖のＣ末端に対し、同じペプチドリンカーを介して両方とも融合している。好ましい一実施形態において、２つの同一の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントである。

【0256】

一態様において、三重特異性抗体又は四重特異性抗体は、（ｃ）で、第４の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、当該２つの抗原結合ドメインは、（ａ）及び（ｂ）の重鎖のＣ末端に対し、同じペプチド接続部を介して両方とも融合している。好ましい一実施形態において、当該２つの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖフラグメント又はｓｃＦａｂフラグメントである。

【0257】

一態様において、二重特異性抗体は、二重特異性の四価抗体であり、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖（及び２つのＦａｂフラグメントを含む）と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の２つの更なるＦａｂフラグメントと
を含み、当該追加のＦａｂフラグメントは、両方とも、ペプチドリンカーを介し、（ａ）の重鎖のＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合しており、
Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が行われた：
（ｉ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、若しくは（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられており、及び／若しくは定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられているか、又は
（ｉｉ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられているか、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられているか、又は
（ｉｉｉ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられているか、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられているか、又は
（ｉｖ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられているか、又は
（ｖ）（ａ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられており、（ｂ）の両方のＦａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている。

【0258】

一態様において、当該追加のＦａｂフラグメントは、（ａ）の重鎖のＣ末端又は（ａ）の重鎖のＮ末端のいずれかにペプチドリンカーを介して、両方とも融合している。

【0259】

一態様において、当該追加のＦａｂフラグメントは、（ａ）の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して、両方とも融合している。

【0260】

一態様において、当該追加のＦａｂフラグメントは、（ａ）の重鎖のＮ末端にペプチドリンカーを介して、両方とも融合している。

【0261】

一態様において、Ｆａｂフラグメントにおいて、以下の改変が行われる：（ａ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、又は（ｂ）の両Ｆａｂフラグメントにおいて、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換わっており、及び／又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられている。

【0262】

一態様において、二重特異性抗体は、四価抗体であり、
（ａ）第１の抗体の（改変された）重鎖であって、第１の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ－ＣＨ１ドメイン対を含み、当該重鎖のＣ末端に、当該第１の抗体の第２のＶＨ－ＣＨ１ドメイン対のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している、第１の抗体の（改変された）重鎖と、
（ｂ）（ａ）の当該第１の抗体の２つの軽鎖と、
（ｃ）第２の抗体の（改変された）重鎖であって、第２の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ－ＣＬドメイン対を含み、当該重鎖のＣ末端に、当該第２の抗体の第２のＶＨ－ＣＬドメイン対のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して融合している、第２の抗体の（改変された）重鎖と、
（ｄ）それぞれＣＬ－ＣＨ１ドメインを含む、（ｃ）の当該第２の抗体の２つの（改変された）軽鎖と
を含む。

【0263】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖と、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に接続している、第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖と
を含む。

【0264】

（ａ）の抗体は、（ｂ）で報告される改変を含まず、重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。

【0265】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体と、
（ｂ）ＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインとを含む第２の抗原に特異的に結合するＦｖフラグメントと
を含み、両ドメインが、ジスルフィド架橋を介して互いに接続しており、
ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのいずれかのみが、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖にペプチドリンカーを介して融合する。

【0266】

二重特異性抗体において、（ａ）の重鎖及び軽鎖は、単離された鎖である。

【0267】

一態様において、ＶＨ２ドメイン又はＶＬ２ドメインのうち他方は、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の重鎖又は軽鎖にペプチドリンカーを介して融合していない。

【0268】

本明細書で報告される全ての態様において、第１の軽鎖は、ＶＬドメインとＣＬドメインとを含み、第１の重鎖は、ＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む。

【0269】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置き換わっている、１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントと、
（ｃ）第１のＦｃ領域の重鎖と第２のＦｃ領域の重鎖とを含む１つのＦｃ領域を含む、三価抗体であり、
２つのＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＬドメインのＣ末端は、Ｆａｂフラグメントの１つのＶＨドメインのＮ末端に接続している。

【0270】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つのＦａｂフラグメントと、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置き換わっている、１つのＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントと、
（ｃ）第１のＦｃ領域の重鎖と第２のＦｃ領域の重鎖とを含む１つのＦｃ領域を含む、三価抗体であり、
第１のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの１つのＮ末端に接続しており、ＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＣＬドメインのＣ末端は、他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、第２のＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインのＣ末端は、第１のＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に、又はＣｒｏｓｓＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に接続している。

【0271】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体と、
（ｂ）重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを含むＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインとを含む第２の抗原に特異的に結合し、軽鎖フラグメント内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が、当該抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置き換えられており、重鎖フラグメント内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が、当該抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置き換えられている、Ｆａｂフラグメントと
を含み、
重鎖Ｆａｂフラグメントは、全長抗体の重鎖の１つのＣＨ１ドメインと、全長抗体のそれぞれのＦｃ領域との間に挿入され、軽鎖ＦａｂフラグメントのＮ末端は、全長抗体の重鎖と対を形成する全長抗体の軽鎖のＣ末端にコンジュゲートされ、その中に重鎖Ｆａｂフラグメントが挿入される。

【0272】

一態様において、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖とからなる、全長抗体と、
（ｂ）重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを含むＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインとを含む第２の抗原に特異的に結合し、軽鎖フラグメント内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が、当該抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置き換えられており、重鎖フラグメント内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が、当該抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置き換えられており、Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントのＣ末端は、全長抗体の重鎖の１つのＮ末端にコンジュゲートされており、Ｆａｂフラグメントの軽鎖フラグメントのＣ末端は、全長抗体の重鎖と対を形成する全長抗体の軽鎖のＮ末端にコンジュゲートされており、これに対し、Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントがコンジュゲートされている、Ｆａｂフラグメントと
を含む。

【0273】

ポリヌクレオチド
本明細書に記載の二重特異性抗体又はそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドが更に提供される。

【0274】

「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、これにより、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照）。

【0275】

「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離されたポリヌクレオチドは、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。

【0276】

本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現すると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。

【0277】

いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明による二重特異性抗体に含まれるポリペプチドをコードする。

【0278】

一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ＰＤ１に特異的に結合する当該第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。

【0279】

本発明で使用するための二重特異性抗体の調製
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸（複数可）が提供される。

【0280】

天然抗体又は天然抗体フラグメントの場合、２つの核酸が必要であり、１つは軽鎖又はそのフラグメント用で、もう１つは重鎖又はそのフラグメント用である。そのような核酸（複数可）は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖（複数可））をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上、又は異なる発現ベクター上にあってもよい。４つの核酸が必要とされるヘテロ二量体重鎖を有する特定の二重特異性抗体の場合、１つは第１の軽鎖のため、１つは、ヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖のため、１つは第２の軽鎖のため、１つは、第２のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖のためのものである。４つの核酸は、１つ以上の核酸分子又は発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、そのような核酸（複数可）は、第１のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は第１のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列及び／又は第２のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体の第２のヘテロモノマーＦｃ領域（例えば、抗体の第１及び／又は第２の軽鎖及び／又は第１及び／又は第２の重鎖）を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上又は異なる発現ベクター上にあってもよく、通常、これらの核酸は、２つ又は３つの発現ベクター上に位置しており、すなわち、１つのベクターは、これらの核酸のうち、２つ以上を含んでいてもよい。これらの二重特異性抗体の例は、ＣｒｏｓｓＭａｂ及びＴ細胞二重特異性抗体である（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１を参照）。例えば、ヘテロモノマー重鎖の１つは、いわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗと、任意に、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃのうち１つ）を含み、他方は、いわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖと、任意に、Ｙ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照）。

【0281】

一態様において、本明細書に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、ＰＤ１及びＬＡＧ３に特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードする。更なる態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。あるそのような態様において、宿主細胞は、以下を含む（例えば、以下を用いて形質転換されている）。（１）アミノ酸配列をコードする第１の核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が抗体の第１のＶＬを含み、他方が第１のＶＨを含む、第１のベクターと、アミノ酸配列をコードする第２の核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が抗体の第２のＶＬを含み、他方が第のＶＨを含む、第２のベクター、又は（２）アミノ酸配列をコードする第１の核酸を含み、アミノ酸配列の一方が可変ドメイン（好ましくは軽鎖可変ドメイン）を含む第１のベクターと、アミノ酸配列をコードする核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が軽鎖可変ドメインを含み、他方が第１の重鎖可変ドメインを含む第２のベクターと、アミノ酸配列をコードする核酸対を含み、アミノ酸配列の一方が第２のベクターとはそれぞれ他の軽鎖可変ドメインを含み、他方が第２の重鎖可変ドメインを含む第３のベクター、又は（３）アミノ酸配列をコードする核酸を含み、アミノ酸配列の一方が抗体の第１のＶＬを含む第１のベクターと、抗体の第１のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターと、抗体の第２のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第３のベクターと、抗体の第２のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第４のベクター。一態様において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一態様において、二重特異性抗体を製造する方法が提供され、この方法は、上に提供されるように、抗体の発現に適した条件で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む。

【0282】

本明細書に記載される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体又は抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の組換え産生のため、例えば上記のような二重特異性抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定され得る。

【0283】

抗体コード化ベクターのクローニング又は発現のための好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌中の抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体フラグメントの発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製され得る。

【0284】

原核生物に加えて、糸状菌や酵母等の真核生物は、抗体をコードするベクターのクローニング又は発現宿主として適しており、その中には、グリコシル化経路が「ヒト化」された菌株や酵母株が含まれ、その結果、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体が産生される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４、及びＬｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照されたい。

【0285】

（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。

【0286】

植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術）を参照。

【0287】

脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されるような、２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されるようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載される）；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）；並びに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照されたい。

【0288】

アッセイ
本明細書に提供される二重特異性抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定され得るか、スクリーニングされ得るか、又は特徴付けられ得る。

【0289】

１．親和性アッセイ
対応する抗原に対する、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子、抗体及び抗体フラグメントの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置、受容体又は組換え発現によって得られ得るような標的タンパク質を用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に記載される方法に従って決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示的及び例示的な実施形態は、国際公開第２０１８／１８５０４３号の実施例２、８又は１１に記載されている。一態様によれば、Ｋ_Ｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。

【0290】

２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の二重特異性抗体を、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの公知の方法によってその抗原結合活性について試験する。対応する組換え抗原又は抗原発現細胞への本明細書で提供される抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の結合は、国際公開第２０１８／１８５０４３号の実施例８又は１１に記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価することができる。更なる態様において、新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、異なる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、単球、ＮＫ細胞及びＴ細胞に対する結合を示すために、結合アッセイに使用され得る。

【0291】

別の態様において、２つの異なる受容体ＰＤ１及びＬＡＧ３の二量体化又は最後の結合／相互作用を示すために、細胞二量体化アッセイを使用し、これらの受容体は、両標的に対して二重特異性抗体を用いて切断するか、又は架橋する際に、酵素の２つのフラグメントと細胞質融合する。ここで、唯一１つの受容体のみが、酵素活性を示さない。この特異的な相互作用について、両受容体の細胞質ゾルＣ末端は、個々に、レポーター酵素の異種サブユニットに融合する。１つの酵素サブユニットのみがレポーター活性を示さなかった。しかしながら、両受容体に対する同時結合は、両受容体の局所的な細胞蓄積、２種類の異種酵素サブユニットの相補性を引き起こし、最終的に、基質を加水分解し、それによって、化学発光シグナルを生成する特異的で機能的な酵素の形成をもたらすと予想される（国際公開第２０１８／１８５０４３号の実施例１１）。

【0292】

３．活性アッセイ
一態様において、生物学的活性を有する抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を同定するためのアッセイが提供される。生体活性としては、例えば、異なる免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖、免疫調整サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ又はＴＮＦ－アルファの分泌、ＰＤ１経路のブロック、ＬＡＧ３経路のブロック、腫瘍細胞の死滅を高める能力が挙げられるだろう。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生体活性を有する抗体も提供される。特定の態様において、本発明の抗体は、そのような生体活性について試験される。一態様において、１つの個体（ドナーＸ）由来のリンパ球から、別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球までの活性化を測定する免疫細胞アッセイが提供される。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用は、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路をブロックする効果を示すことができる。このアッセイ中のＴ細胞は、本発明の二重特異性抗体存在下又は非存在下、活性化及びそのＩＦＮ－γ分泌について試験された。このアッセイは、国際公開第２０１８／１８５０４３号の実施例９により詳細に記載されている。

【0293】

医薬組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書で提供される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、本明細書で提供される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む。別の実施形態において、医薬組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。

【0294】

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容され得る賦形剤に溶解又は分散した治療有効量の１つ以上の二重特異性抗体を含む。「薬学的に許容され得る又は薬理学的に許容され得る」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの抗体と、任意に多追加の有効成分とを含む医薬組成物の調製は、本明細書に参考として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当該技術分野で既知である。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る賦形剤」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組合せが挙げられる。

【0295】

非経口組成物には、注射による投与、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射のために、本発明の抗原結合分子は水溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの、生理学的に適合性の緩衝剤中で製剤化し得る。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。或いは、融合タンパク質は、好適なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための、粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁液は、好適な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。

【0296】

有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施形態において、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。

【0297】

本発明の例示的な薬学的に許容され得る賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。

【0298】

例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤には、ヒスチジン－酢酸緩衝液が含まれる。

【0299】

既に記載した組成物に加え、二重特異性抗体は、デポー製剤として配合されてもよい。そのような徐放性調製物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。それゆえに、例えば融合タンパク質は、好適なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容され得るオイルの乳剤エマルションとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えば、低溶解性の塩等の難溶性誘導体として製剤化してよい。

【0300】

本発明の二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。

【0301】

本明細書に開示される二重特異性抗体は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容され得る塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。

【0302】

本発明の組成物は、治療される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。

【0303】

一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物、並びに本明細書に記載の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を含む第２の医薬が提供される。一態様において、医薬組成物は、ＣＤ２０発現がんの治療に使用するためのものである。特定の態様において、医薬組成物は、Ｂ細胞増殖性障害、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択される疾患の治療に使用するためのものである。

【0304】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。

【0305】

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の投与
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の両方（両方とも本明細書では物質と呼ばれる）は、非経口投与、肺内投与及び鼻腔内投与、並びに局所治療のために所望される場合は病変内投与を含む任意の好適な手段によって投与され得る。しかしながら、本明細書に記載される方法は、非経口、特に静脈内注入によって投与される治療剤に関して特に有用である。

【0306】

非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。一態様において、治療剤は非経口的に、特に静脈内投与される。特定の態様において、物質は静脈内注入によって投与される。別の態様において、物質は皮下投与される。

【0307】

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の両方が、優良医療慣行と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に公知な他の要因が含まれる。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の両方は、必ずしもそうである必要はないが、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に任意に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、障害又は治療の種類、及び上記の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0308】

疾患の予防又は治療のために、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の適切な投薬量（それらの組み合わせ、又は１つ以上の他の追加の治療剤との組み合わせで使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の種類、疾患の重症度及び経過、両方の薬剤が予防目的又は治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及び治療剤に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。各物質は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の物質を、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかにかかわらず、対象に投与するための初期の候補投薬量とすることができる。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投薬量は、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。二重特異性抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の例では、投薬量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等が、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１つ以上の用量を患者に投与してもよい。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初のより高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

【0309】

一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の両方の投与は、単回投与である。特定の態様において、治療剤の投与は２回以上の投与である。そのような一態様において、物質は、毎週、２週間ごと、又は３週間ごと、特に２週間ごとに投与される。一態様において、物質は治療有効量で投与される。一態様において、物質は、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を投与せずに、対応する治療レジメンにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の用量よりも高い用量で投与される。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初期投与、及び抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の１回以上のその後の投与を含み、第２の用量は第１の用量よりも高い。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初期投与、及び抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の１回以上のその後の投与を含み、第１の用量は第２の用量よりも低くない。

【0310】

一態様において、本発明による治療レジメンにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、対象への抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の最初の投与（少なくとも同じ治療過程の範囲内で）である。一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の投与は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与の前に対象に行われない。別の態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与前に投与される。

【0311】

別の態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体との組み合わせで使用するためのものであり、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が併用治療の前に行われ、前治療と併用治療との間の期間が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である。

【0312】

Ｔ細胞の活性化は、重度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらす可能性がある。ＴｅＧｅｎｅｒｏ（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２００６）３５５，１０１８－１０２８）によって行われた第１相試験では、６人の健常ボランティア全員が、不適切に投薬されたＴ細胞刺激スーパー－アゴニスト抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の注入後急速に、ほぼ致死的な重症サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を経験した。対象への抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体などのＴ細胞活性化治療剤の投与に関連するサイトカイン放出は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、例えばオビヌツズマブでの当該対象の前治療によって有意に減少させることができる。ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）前治療（Ｇｐｔ）の使用は、腫瘍細胞の排除を媒介するために投薬開始から十分に高いＴ細胞活性化治療剤の曝露レベルを支持しながら、Ｔ細胞活性化治療剤（例えば、ＣＲＳ）による強い全身性Ｔ細胞活性化からの高度に関連性のある有害事象（ＡＥ）のリスクが低減されるように、末梢血及び二次リンパ器官の両方におけるＢ細胞の急速な枯渇を助けるはずである。現在までに、オビヌツズマブの安全性プロファイル（サイトカイン放出を含む）は、進行中のオビヌツズマブ臨床試験において数百人の患者で評価及び管理されている。最後に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体などのＴ細胞活性化治療剤の安全性プロファイルを支持することに加えて、Ｇｐｔはまた、これらの固有の分子に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成を防止するのに役立つはずである。

【0313】

本発明において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体との組み合わせを、治療法において１つ以上の塚の薬剤との組み合わせで使用することができる。例えば、少なくとも１つの追加の治療剤を同時投与することができる。特定の態様において、追加の治療剤は免疫療法剤である。

【0314】

上述のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、治療剤の投与は、追加の１つ以上の薬剤の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行うことができる。一実施形態において、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。

【0315】

治療方法及び組成物
ＣＤ２０は、幹細胞及び形質細胞を除いて大部分のＢ細胞で発現され（ｐａｎ－Ｂ－細胞マーカー）、ほとんどのヒトＢ細胞悪性腫瘍（腫瘍関連抗原）、例えば多発性骨髄腫を除くリンパ腫及び白血病、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病で頻繁に発現される。

【0316】

一態様において、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を対象に投与することを含む、対象におけるＣＤ２０発現がんを治療又は進行遅延させる方法が提供される。

【0317】

そのような一態様において、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することを更に含む。更なる実施形態において、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を対象に投与することを含む、Ｂ細胞を枯渇させる方法が本明細書で提供される。上記の態様のいずれかによる「個体」又は「対象」は、好ましくはヒトである。

【0318】

更なる態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を含む、がん免疫療法に使用するための組成物が提供される。特定の実施形態において、がん免疫療法の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を含む組成物が提供される。

【0319】

更なる態様において、医薬の製造又は調製における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を含む組成物の使用が本明細書で提供される。一態様において、医薬はＣＤ２０発現がんの治療用である。一態様において、医薬は、Ｂ細胞増殖性障害の治療のためのものである。更なる態様において、薬剤は、Ｂ細胞増殖性障害を有する個体に有効量の薬剤を投与することを含む、Ｂ細胞増殖性障害を治療する方法に使用するためのものである。そのような一態様において、上記方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる態様において、医薬はＢ細胞を枯渇させるためのものである。Ｂ細胞増殖性障害は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択される。特定の一態様において、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。

【0320】

更なる態様において、Ｂ細胞がんを治療するための方法が本明細書で提供される。一実施形態において、本方法は、そのようなＢ細胞がんを有する個体に有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を投与することを含む。そのような一実施形態において、本方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体へ投与することを更に含む。上記実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。特に、Ｂ細胞がんは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一態様において、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。

【0321】

上述の併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本明細書に報告される抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の投与は、追加の治療剤（複数の場合がある）の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行われ得る。一態様において、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与、有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに約１ヶ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内に行われる。

【0322】

本明細書に記載の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体（及び任意の追加の治療剤）の両方を、非経口、肺内及び鼻腔内、並びに局所治療のために所望される場合は病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。

【0323】

本明細書に報告されるように、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の両方が、優良医療慣行と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に公知な他の要因が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0324】

当業者は、多くの場合、二重特異性分子は治癒をし得ないが、部分的な利益のみを提供する場合があることを容易に認識する。いくつかの実施形態において、何らかの利点を有する生理学的変化も治療的に有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様において、生理学的変化を与える二重特異性抗体の量は、「有効量」又は「治療有効量」とみなされる。

【0325】

本明細書で定義される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の両方は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための初期の候補投薬量であってもよい。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投薬量は、約１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の例示的投薬量の一例は、約０．０５μｇ／ｋｇ～約１０００μｇ／ｋｇの範囲であろう。抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の場合、用量はまた、投与当たり、約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０５ｍｇ／体重ｋｇ、約２ｍｇ／体重ｋｇ、約４ｍｇ／体重ｋｇ、約１０ｍｇ／体重ｋｇ、約２０ｍｇ／体重ｋｇ、約３０ｍｇ／体重ｋｇ、約４０ｍｇ／体重ｋｇ、約４５ｍｇ／体重ｋｇ、約５０ｍｇ／体重ｋｇ、約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約２００ｍｇ／体重ｋｇ、約３００ｍｇ／体重ｋｇ、約４００ｍｇ／体重ｋｇ、約５００ｍｇ／体重ｋｇ、約６００ｍｇ／体重ｋｇ、約８００ｍｇ／体重ｋｇ、約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、上部約１２００ｍｇ／体重ｋｇ又はそれ以上、及びその中の誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．０５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等が、上述の数に基づいて投与されてもよい。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、約０．０１ｍｇ、２．５ｍｇ～約１０ｍｇ又は約２０ｍｇ又は約３０ｍｇの用量で患者に投与され得る。そのような投薬量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。初期のより低い負荷用量、続いて１つ以上のより高い用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。一態様において、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３は、約１００ｍｇから、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、又は約１５００ｍｇの用量で患者に投与され得る。

【0326】

本明細書で定義されるＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、意図した目的を達成するために有効な量で、一般的に使用されるだろう。疾患の症状を治療又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗体、又はその医薬組成物が、治療有効量で投与されるか、又は塗布される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0327】

全身投与の場合、治療有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるＩＣ_５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。そのような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定することができる。

【0328】

初期投薬量も、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。

【0329】

治療効果を維持するのに十分な二重特異性抗体 の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は、個々に調節されてもよい。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定することができる。

【0330】

局所投与又は選択的な取り込みの場合には、二重特異性抗体の有効な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化し得る。

【0331】

本明細書に記載の二重特異性抗体の治療に有効な投薬量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、一般的に治療利益を与える。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ_５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定できる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗体が好ましい。一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した投薬量の範囲の処方に使用できる。投薬量は、好ましくは毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、用いられる剤形、利用される投与経路、対象の症状などに応じて、この範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の症状（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１のＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５を参照）を考慮して個々の医師が選択することができる。

【0332】

本発明の二重特異性抗体で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合（毒性を排除する場合）、治療をより高いレベルに調整することも知っている。対象となる障害の管理における投与量の大きさは、治療される症状の重症度、投与経路等によって変わる。症状の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、投与量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び反応に応じて変化する。

【0333】

そのような他の薬剤は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。有効量のそのような他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依存する。二重特異性抗体は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0334】

上述のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗体の投与は、追加の治療薬剤及び／若しくはアジュバントの投与前、追加の治療剤及び／若しくはアジュバントの投与と同時に、並びに／又は追加の治療薬剤及び／若しくはアジュバントの投与後に行われてもよい。

【0335】

Ｈ．製造品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書で上できてされる抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体である。

【0336】

ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）組成物を含む第１の容器であって、該組成物が抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）組成物を含む第２の容器であって、該組成物が抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体を含む、第２の容器とを備え得る。本発明のこの実施形態における製造品は、特定の症状を治療するために上記組成物が使用可能であることを示す添付文書を更に備えてもよい。

【0337】

これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。

【表C】

【0338】

ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。

【0339】

発明の態様
以下に、本発明の態様のいくつかを列挙する。

【0340】

１．ＣＤ２０発現がんを治療する方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用される、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0341】

２．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、項目（項）１に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0342】

３．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＩｇＧ ＦｃドメインであるＦｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体に対する結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、項１又は２に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0343】

４．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む、項１～３のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0344】

５．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、ＰＤ１に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、項１～４のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0345】

６．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含むＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と
を含む、ＶＨドメインと、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３と
を含む、ＶＬドメインと
を含む、項１～４のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0346】

７．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む前記ＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む前記ＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0347】

８．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0348】

９．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、項１～５又は７のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0349】

１０．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、ＬＡＧ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと
を含む、項１～９のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0350】

１１．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合するＦａｂフラグメントと、ＬＡＧ３に特異的に結合するＦａｂフラグメントとを含む、項１～１０のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0351】

１２．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＰＤ１に特異的に結合するＦａｂフラグメントを含み、前記可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＬが重鎖の一部であり、ＶＨが軽鎖の一部であるように互いに置き換えられている、項１～１１のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0352】

１３．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、ＰＤ－１に対する一価結合及びＬＡＧ３に対する一価結合を含む、項１～１２のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0353】

１４．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、項１～１３のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0354】

１５．前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、項１～１４のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0355】

１６．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、項１～１５のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0356】

１７．前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号４１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号４２のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号４４のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号４５のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む、項１～１６のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0357】

１８．前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ３）及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ３）を含む、項１～１７のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0358】

１９．前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５０のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む、項１～１８のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0359】

２０．前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＣＤ２０）及び／又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＣＤ２０）を含む、項１～１９のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0360】

２１．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、項１～２０のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0361】

２２．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、項１～２１のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0362】

２３．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせで使用され、前記組み合わせが約１週間～３週間の間隔で投与するためのものである、項１～２２のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0363】

２４．ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が前記併用治療の前に行われ、前記前治療と前記併用治療との間の期間が、前記ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である、項１～２３のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。

【0364】

２５．疾患、特にＣＤ２０発現がんの併用治療、逐次治療又は同時治療に使用するための、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせを含む、医薬組成物。

【0365】

２６．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容され得る担体と、抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を含む第２の医薬とを含む、医薬組成物。

【0366】

２７．ＣＤ２０発現がん、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群から選択される血液がんの治療に使用するための、項２６に記載の医薬組成物。

【0367】

２８．ＣＤ２０発現がんを治療するための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体との組み合わせの使用。

【0368】

２９．対象においてＣＤ２０発現がんを治療するための方法であって、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び有効量の抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を前記対象に投与する工程を含む、方法。

【0369】

３０．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、項２９に記載の方法。

【0370】

３１．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体が、静脈内投与又は皮下投与される、項２９又は３０に記載の方法。

【0371】

３２．前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体と同時に、前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の前に、又は前記抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の後に投与される、項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【実施例】

【0372】

組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２．

【0373】

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。

【0374】

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成されたか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ国レーゲンスブルク）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同体の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために、好適な制限部位を有する遺伝子セグメントを設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を使用して設計された。

【0375】

細胞培養技術
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。

【0376】

タンパク質精製
標準的なプロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、－２０℃又は－８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質解析及び分析的特性評価のために提供された。

【0377】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。

【0378】

分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準とした。

【0379】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９－００５－０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合を、ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐｈ７．４）、２５℃（又は代替的に３７℃）中で測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒～３分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３～１０分間洗浄して解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを用いてＫＤ値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサーグラムの分析及び親和性データの計算に使用する。

【0380】

実施例１
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製、精製及び特性評価
ＴＣＢ分子は、国際公開第２０１６／０２０３０９号Ａ１に記載される方法に従って調製された。

【0381】

実験で使用した抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ又はＣＤ２０ ＴＣＢ）は、国際公開第２０１６／０２０３０９号Ａ１の実施例１に記載されている分子Ｂに対応する。分子Ｂは、「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖から構成される。２つの異なる重鎖のアセンブリを促進するために、ＣＨ３ドメイン中の点変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）を導入した。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。２つの異なる軽鎖の正しい集合を促進するために、ＣＤ３結合ＦａｂのＶＨドメイン及びＶＬドメインの交換、並びにＣＤ２０結合ＦａｂのＣＨドメイン及びＣＬドメインの点変異を行った。２＋１は、その分子が、ＣＤ２０に特異的な２つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な１つの抗原結合ドメインを有することを意味する。

【0382】

ＣＤ２０ ＴＣＢは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む。２＋１フォーマットの二重特異性抗体の概略図を図１Ｂに示す。

【0383】

この分子は、国際公開第２０１６／０２０３０９号Ａ１の実施例１において更に特徴付けられる。

【0384】

実施例２
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体の調製、精製及び特性評価
１つの結合アームにおいてＶＨ／ＶＬドメイン交換／置き換え（ＣｒｏｓｓＭＡｂ^{Ｖｈ－ＶＬ}）によりヒトＰＤ１及びヒトＬＡＧ３に結合する二重特異性抗体を、国際公開第２０１８／１８５０４３号の実施例１０．１に記載されるように作製した。多重特異性１＋１ ＣｒｏｓｓＭＡｂ^{Ｖｈ－Ｖｌ}抗体の調製は、国際公開第２００９／０８０２５２号にも記載されている。二重特異性抗体を、表１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現プラスミドを使用して発現させた。１＋１ ＣｒｏｓｓＭＡｂ^{Ｖｈ－Ｖｌ}二重特異性抗体の模式的な構造を図１Ａに示す。

【表1】

【0385】

全てのコンストラクトについて、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術を、第１のＣＨ３ドメインにおける典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）置換及び第２のＣＨ３ドメインにおける対応するホール置換（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４１０Ｖ）（及び２つの追加の導入されたシステイン残基Ｓ３５４Ｃ／Ｙ３４９’Ｃ）と共に使用した（上に記載するそれぞれの対応する重鎖（ＨＣ）配列に含まれる）。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。正しい対形成を改善するために、従来のＦａｂ（帯電バリアント）のＣＨ及びＣＬドメインにアミノ酸置換を更に導入した。

【0386】

上のように発現した二重特異性抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって、上清から精製した。得られた生成物を、質量分析法によって属性について特性決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度、モノマー含有量及び安定性などの分析特性を特性決定した。

【0387】

比較のために使用される親ＰＤ１抗体ＰＤ１（０３７６）ＩｇＧ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。

【0388】

実施例３
Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対するＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとの組み合わせでのＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果
ＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体とＣＤ２０－ＴＣＢとの組み合わせ可能性を調べるために、本発明者らは、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞リンパ芽球様腫瘍細胞株（ＡＲＨ７７）の存在下で新たに精製したＣＤ４ Ｔ細胞を５日間共培養するアッセイを開発した。本発明者らは、ＰＤ－１リガンド、ＰＤ－Ｌ１の中間発現レベル、及び高レベルのＬＡＧ－３リガンドＭＨＣ－ＩＩのためにＡＲＨ７７細胞株を選択し、ＰＤ－１に加えてＬＡＧ－３遮断の寄与の評価を可能にした。

【0389】

ＣＤ４ Ｔ細胞を、５人の健常ドナーから得た１０^８個のＰＢＭＣから、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって濃縮した。培養前に、ＣＤ４ Ｔ細胞を、５μＭのカルボキシ－フルオレセイン－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。次いで、１０^５個のＣＤ４ Ｔ細胞を、ブロッキング抗ＰＤ１抗体（親抗ＰＤ－１、ニボルマブ又はペンブロリズマブのいずれか）、又は１０^－７～１０μｇ／ｍｌの間の濃度のＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７（ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ）、及び固定濃度のＣＤ２０－ＴＣＢ（６６ｐＭ）の存在下又は非存在下で、Ｂ細胞株と共に（５：１）９６ウェルプレートに蒔いた。５日後、最後の５時間のインキュベーションのために、本発明者らは、タンパク質輸送を遮断し、サイトカインの細胞内蓄積を可能にするために、Ｇｏｌｇｉ－ｐｌｕｇ及びＧｏｌｇｉ－ｓｔｏｐを添加した。

【0390】

興味深いことに、本発明者らは、グランザイムＢのＣＤ４ Ｔ細胞分泌に対する、ＣＤ２０－ＴＣＢとの組み合わせでのＰＤ－１遮断抗体の用量依存的効果を観察した（図２を参照）。しかしながら、等モルのＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞によって分泌されるグランザイムＢを用量依存的様式で増加させることにおいてＰＤ－１遮断抗体よりも強力かつ有効であり（Ｅ_ｍａｘ）、ＣＤ２０－ＴＣＢに対する好適な組み合わせパートナーとなった。対応するＥＣ５０値を以下の表２に示す：

【表2】

【0391】

実施例４
ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＷＳＵ－ＤＬＣＬ２移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体とＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとの併用療法の強力な抗腫瘍効果
ＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ（ＣＤ２０ ＴＣＢ）との組み合わせでのＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重特異性抗体ＰＤ１／ＬＡＧ３ ０９２７（ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ）の抗腫瘍活性を、皮下注射されたヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫モデルＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を移植したＨＳＣ－ＮＳＧマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。この組み合わせの有効性を、単一治療のＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢ、及びニボルマブ又はニボルマブ＋抗ＬＡＧ３参照抗体とのその組み合わせと比較した。

【0392】

ａ）実験材料及び方法
ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞株の調製：ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）は、最初はＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）から入手し、拡大後はＲｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託した。細胞を、１０％ＦＣＳ及び１×Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ中で培養した。５％ＣＯ_２で、水飽和した雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。９８．６％の生存率でＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総体積１００μｌ）中、動物あたり１．５×１０^６個の細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏ継代Ｐ１３）をマウスごとに皮下注射した。

【0393】

完全ヒト化マウスの作製：実験開始時に４～５週齢のメスＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、公認ガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定病原体不在条件下、１２時間明／ １２時間暗の日周期で維持した。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１×１０^５のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入１４～１６週目に、ヒト化免疫不全マウス（ＨＳＣ－ＮＳＧ）を舌出血させ、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーによって血液を分析した。効率的に生着したマウスを、ヒトＴ細胞頻度に従って異なる治療群に無作為に分けた。

【0394】

有効性実験：完全ヒト化ＨＳＣ－ＮＳＧマウスに、１：１の比でマトリゲルの存在下、０日目に１．５×１０^６個のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（ＣＤ２０を発現するヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）を皮下チャレンジした。全実験期間中、腫瘍をカリパスによって週に３回測定した。１４日目（腫瘍平均約３５０～４００ｍｍ^３）に、マウスを７つの群に無作為化し（図３）、最初の治療法を行った。毎週の予定された治療法を開始した：Ａ群はビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）を受け、Ｂ群はＣＤ２０ ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）を受け、Ｃ群はＣＤ２０ ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ニボルマブ（１．５ ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）を受け、Ｄ群はＣＤ２０ ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ニボルマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋抗ＬＡＧ３（ＢＭＳ－９８６０１６、１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）を受け、Ｅ群はＣＤ２０ ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（１．５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）を受け、Ｆ群はＣＤ２０ ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）＋ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ、１回／週、ｉ．ｖ．）を受けた。治療を、最大４００μｌの腹腔内注射によって行った。カリパスを用いて腫瘍増殖を週３回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔ_ｖ：（Ｗ^２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）

【0395】

試験は４５日目に終了した。

【0396】

したがって、治療法の影響は、腫瘍サイズを測定することによって評価され、平均として（図４）、又は各単一マウスの経時的な腫瘍増殖として（図５Ａ～５Ｆ）のいずれかで経時的な腫瘍成長として表示された。統計分析のため、各動物の最後に観察された腫瘍体積をエンドポイントとして使用し、それが８００ｍｍ３未満であるか否かを評価した。次いで、このエンドポイントを、Ｃｈｉ２検定に基づくペアワイズ群比較に供した（図６）。

【0397】

ｂ）結果
この設定では、ＣＤ２０ ＴＣＢによるＷＳＵ－ＤＣＬＣ２担持マウスの治療は、ビヒクルと比較した場合、３０日目から強力な腫瘍増殖阻害を媒介することが見出された（図４）。ＴＣＢによる活性化はＴ細胞上のＰＤ１発現並びにＬＡＧ３発現を誘導することが知られているため、ＣＤ２０ ＴＣＢをニボルマブ又はニボルマブ＋抗ＬＡＧ３抗体のいずれかと組み合わせて、有効性を更に改善しようと試みた。しかしながら、そのような組み合わせは、単一治療と比較した場合、統計学的に有意なレベルまで腫瘍増殖の減少を誘導しなかった（図４及び図６）。対照的に、ＣＤ２０ ＴＣＢとの組み合わせでの１．５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの両方のＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂによる治療は、４２日目までに強い腫瘍退縮を伴う強い腫瘍防御をもたらした。最後に観察された腫瘍サイズを考慮し、閾値を８００ｍｍ^３に固定して統計分析を適用した場合、ニボルマブ及び抗ＬＡＧ３抗体との組み合わせでのＣＤ２０ ＴＣＢによる治療と比較して、動物をＣＤ２０ ＴＣＢとの組み合わせでの３ｍｇ／ｋｇのＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂで治療した場合、抗腫瘍有効性の有意な増加が観察された。

【0398】

各単一動物の腫瘍増殖を図５Ａ～図５Ｆのスパイダープロットで示す。プロットは、ビヒクルでは、２つを除く全ての腫瘍が実験ウィンドウ全体にわたって進行したことを示す。ＣＤ２０－ＴＣＢをニボルマブ又はニボルマブ＋抗ＬＡＧ３と組み合わせた場合、抗腫瘍効果の大きな改善は観察されなかった。対照的に、３ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ２０－ＴＣＢとＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂとの組み合わせは、１匹を除くほとんどのマウスにおいて一貫した腫瘍制御を示した。

【0399】

実施例５
ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ－Ｌｙ１８移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体とＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとの併用療法の強力な抗腫瘍効果
ＣＤ２０ ＣＤ３二重特異性抗体との組み合わせでＰＤ－１及びＬＡＧ－３の共遮断の寄与を評価するために、ＣＤ２０ ＴＣＢ（グロフィタマブ）との組み合わせを、ＯＣＩ－Ｌｙ１８を担持するｈｕＨＳＣ－ＮＳＧマウスにおいて評価した。ＯＣＩ－Ｌｙ１８は、単剤療法として、腫瘍増殖の制御に失敗したＣＤ２０－ＴＣＢ治療にあまり感受性でないヒトＤＬＢＣリンパ腫モデルである。

【0400】

ａ）実験材料及び方法
完全ヒト化マウスの作製：実験開始時に４－５週齢のメスＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、公認ガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定病原体不在条件下、１２時間明／ １２時間暗の日周期で維持した。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１×１０^５のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入１４～１６週目に、マウスを舌下出血させ、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーによって血液を分析した。効率的に生着したマウスを、ヒトＴ細胞頻度に従って異なる治療群に無作為に分けた。

【0401】

ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞株の調製：ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）を、最初Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から入手し、拡大後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託した。ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ＃３５０５０－０３８）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｕｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃４２４０１－０４２）中で培養した。５％ＣＯ_２で、水飽和した雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。

【0402】

有効性実験：完全ヒト化ＨＳＣ－ＮＳＧマウス（１群あたり２０匹のマウス）に、１：１の比でマトリゲルの存在下、０日目に５×１０^６個のＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）を皮下チャレンジした。１１日目（腫瘍平均約２００ｍｍ^３）に、オビヌツズマブによる最初の治療を投与して、末梢Ｂ細胞を排除し、サイトカイン放出症候群を回避した。オビヌツズマブ（３０ｍｇ／ｋｇ）による前治療の後に、ビヒクル（ヒスチジン緩衝液）、ＣＤ２０ ＴＣＢ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、ペンブロリズマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び抗ＬＡＧ３抗体（１．５ｍｇ／ｋｇ；配列番号７９及び配列番号８０のアミノ酸配列を含む抗体）（ｉ．ｖ．）の毎週の予定された治療法を行った。（図７参照）。カリパスを用いて腫瘍増殖を週２～３回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔ_ｖ：（Ｗ^２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）

【0403】

試験は３５日目に終了した。

【0404】

ｂ）結果
この実験では、ＣＤ２０ ＴＣＢの単剤療法（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクル群と比較した場合、腫瘍増殖の遅延をもたらした（図８）。しかしながら、ＣＤ２０ ＴＣＢとＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせは、腫瘍制御を提供し、一部のマウスでは腫瘍拒絶を促進した（図９Ｃ）。興味深いことに、ＣＤ２０ ＴＣＢとペンブロリズマブ（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び抗ＬＡＧ３抗体（１．５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせは、ＣＤ２０ ＴＣＢ単剤療法と異ならなかった。

【0405】

これらのデータは、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂが、ＰＤ－１及びＬＡＧ－３の結合部位を一致させるために、３ｍｇ／ｋｇのＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂに対して、１．５ｍｇ／ｋｇで投与された単一特異性抗ＬＡＧ－３抗体との組み合わせでの標準治療の抗ＰＤ－１抗体よりも優れた様式でリンパ腫異種移植モデルの状況においてＣＤ２０ ＴＣＢの抗腫瘍活性を改善することを実証している。これらの研究は、ＰＤ－１阻害に対するＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂによるＬＡＧ－３阻害の寄与を確立し、抗ＬＡＧ－３抗体との組み合わせでの競合剤抗ＰＤ－１抗体に対するその差別化され作用機序を支持する。

【0406】

実施例６
ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ－Ｌｙ１８移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ１／ＬＡＧ３二重特異性抗体とＣＤ２０ ＣＤ３ ＴＣＢとの併用療法のオビヌツズマブによる前治療後の抗腫瘍効果

【0407】

この追加の実験では、グロフィタマブによって媒介されるＴ細胞との末梢Ｂ細胞係合によって誘導されるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を軽減するための抗ＣＤ２０枯渇抗体であるオビヌツズマブによる前治療を更に評価した（図１０）。

【0408】

ａ）実験材料及び方法
完全ヒト化マウスの作製：実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１×１０^５のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入後１４～１６週目に、マウスを舌下出血させ、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーによって血液を分析した。効率的に生着したマウスを、ヒトＴ細胞頻度に従って異なる治療群に無作為に分けた。

【0409】

ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞株の調製：ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）を、最初Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から入手し、拡大後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託した。ＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ＃３５０５０－０３８）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｕｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃４２４０１－０４２）中で培養した。５％ＣＯ_２で、水飽和した雰囲気中、３７℃で細胞を培養した。

【0410】

有効性実験：完全ヒト化ＨＳＣ－ＮＳＧマウス（１群あたり１４匹のマウス）に、１：１の比でマトリゲルの存在下、０日目に５×１０^６個のＯＣＩ－Ｌｙ１８細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）を皮下チャレンジした。１７日目（腫瘍平均約４００ｍｍ^３）に、オビヌツズマブ（３０ｍｇ／ｋｇ）による最初の治療を投与して、末梢Ｂ細胞を排除し、サイトカイン放出症候群を回避した。オビヌツズマブ前治療の後に、ビヒクル（ヒスチジン緩衝液）、ＣＤ２０ ＴＣＢ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、いずれもｉ．ｖ．の毎週の予定された治療法を行った（図１０を参照）。カリパスを用いて腫瘍増殖を週２～３回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔ_ｖ：（Ｗ^２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）

【0411】

試験は３５日目に終了した。

【0412】

ｂ）結果
この実験では、ビツヌツズマブ（３０ｍｇ／ｋｇ）で前治療したＣＤ２０ ＴＣＢ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の単剤療法は、ビヒクル群と比較した場合、部分的な腫瘍制御をもたらした（図１１、並びに図１２Ａ及び図１２Ｂ）。しかしながら、ＣＤ２０ ＴＣＢとＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせは、強力な腫瘍制御を提供した（図１１）。一部のマウスでは、腫瘍拒絶が観察された（図１２Ｃ）。これらのデータは、ＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂが、ＣＲＳを軽減するためにオビヌツズマブによる前治療が使用される場合にも、リンパ腫異種移植モデルの状況においてＣＤ２０ ＴＣＢの抗腫瘍活性を改善することを実証している。

【0413】

この研究は、オビヌツズマブ前治療の状況でのＣＤ２０－ＴＣＢの単一治療に対するＰＤ１－ＬＡＧ３ ＢｓＡｂによるＰＤ－１及びＬＡＧ－３阻害の寄与を確立した。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【配列表】

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【国際調査報告】