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特表2024-506200細胞治療用組成物及びＴＧＦ－Ｂシグナル伝達を調節する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-09
(54)【発明の名称】細胞治療用組成物及びＴＧＦ－Ｂシグナル伝達を調節する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240202BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240202BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240202BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240202BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240202BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240202BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240202BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240202BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240202BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240202BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240202BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N5/0783
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/85 Z
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K35/17
A61P37/04
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/7088
A61K35/12
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548964
(86)(22)【出願日】2022-02-15
(85)【翻訳文提出日】2023-09-21
(86)【国際出願番号】 IB2022000063
(87)【国際公開番号】W WO2022172085
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】63/149,628
(32)【優先日】2021-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/306,836
(32)【優先日】2022-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】クーン、シャンタル
(72)【発明者】
【氏名】シャピロ、ゲイリー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA13
4C085AA14
4C085DD62
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZB27
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
ポリペプチドを使用してトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達（例えば、ＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体に特異的に結合するＴＧＦβ受容体、抗体、またはその抗原結合断片）を調節する方法を提供する。抗体またはその断片を含む組成物、及びそれをＴＧＦβ活性が関与する疾患の治療に使用する方法を提供する。核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、抗原結合断片、ならびにこれらの抗原結合剤及びその断片を含む医薬組成物も開示する。本発明はまた、本明細書で提供されるＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを利用するための治療方法も提供する。
【選択図】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ
【選択図】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がん関連抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む、遺伝子改変されたＴ細胞の集団。
【請求項2】
前記ＣＡＲが、ＡＤＧＲＥ２、ＣＬＥＣ１２、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＣＥＡＣＡＭ５、クラウジン１８．２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＣＣ（ＧＵＣＹ２Ｃとしても知られる）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ｘ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＩ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１３、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、及びＷＴ－１からなる群から選択される抗原を認識する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項3】
前記ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターが、ＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体に結合する、請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項4】
前記ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターが、表１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項5】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９ ＣＡＲまたはＧＣＣ ＣＡＲである、請求項1～４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項6】
前記細胞が自家である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項7】
前記細胞が同種異系である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項8】
前記細胞が、ＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする第２の核酸を含むベクターを使用して遺伝子改変される、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項9】
前記細胞が、２つのベクター、すなわち、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む第１のベクター、及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする核酸を含む第２のベクターを使用して遺伝子改変される、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項10】
前記ＣＡＲが、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、２Ｂ４、ＧＤＩ １ａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせ及び変形からなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項11】
前記ＣＡＲが、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される膜貫通ドメイン由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項12】
ＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする第２の核酸を含むベクター。
【請求項13】
配列内リボソーム進入部位をさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項14】
２Ａ自己切断部位をさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項15】
請求項１２～１４のいずれか１項に記載のベクターで改変された免疫細胞。
【請求項16】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１５に記載の免疫細胞。
【請求項17】
請求項１に記載の免疫細胞の集団を含む、医薬組成物。
【請求項18】
宿主における免疫応答の調節方法であって、前記方法が、請求項１に記載の細胞集団を前記宿主に投与することを含み、前記免疫応答の調節が、宿主免疫細胞によるＩＦＮγ産生の増加、ＩＬ－２産生の増加、抗原提示の増加、及び増殖の増加のうちの１つ以上を含む、前記調節方法。
【請求項19】
がんの治療を必要とする対象における、前記がんの治療方法または予防方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の請求項１に記載の細胞集団を投与することを含む、前記治療方法または予防方法。
【請求項20】
前記がんが、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、及びそれらの転移からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１５日に出願された米国仮出願第６３／１４９，６２８号及び２０２２年２月４日に出願された米国仮出願第６３／３０６，８３６号に対する優先権を主張し、それぞれの開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年２月１５日に出願された米国仮出願第６３／１４９，６２８号及び２０２２年２月４日に出願された米国仮出願第６３／３０６，８３６号に対する優先権を主張し、それぞれの開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
がん特異的抗原を標的とする改変された細胞を使用する免疫療法は、一部のがんの治療に有効であることが示されている。しかしながら、悪性細胞は、免疫による認識や排除から自らを守るために、免疫抑制的な微小環境を生成するように適応する。腫瘍微小環境における高レベルのＴＧＦβは、一部の種類のがん細胞の維持と進行に寄与し得る。腫瘍微小環境は、標的細胞療法の場合など、免疫応答の刺激を伴う治療法に重大な課題をもたらす。したがって、がんを治療するための新規治療戦略が望まれている。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、とりわけ、がん（例えば、固形腫瘍）の治療に使用するための、ＴＧＦβシグナル伝達を調節するための新規の系を提供する。本発明は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達の調節が、標的改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法などの養子細胞療法を強化できるという発見に部分的に基づいている。本明細書に記載される、抗体（例えば、抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ）、ＴＧＦ－βＲ２の抗原結合断片または組換え細胞外ドメインの系によって影響を受けるようなＴＧＦ－βシグナル伝達の調節は、腫瘍における免疫抑制性微小環境を軽減し、免疫療法の効果を増強する。
【0004】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、合成生物学の新たなフロンティアとなっており、これらの非常に強力な細胞を腫瘍微小環境に向かわせるために、複数のプロモーターと遺伝子産物が想定されており、腫瘍微小環境において、Ｔ細胞は、負の調節シグナルを回避し、効果的な腫瘍の死滅を媒介することができる。ＡＰ１９０３による誘導性カスパーゼ９構築物の薬物誘導二量体化による不要なＴ細胞の除去は、Ｔ細胞集団を制御することができる強力なスイッチを薬理学的に開始することができる１つの方法を示している（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１；３６５（１８）：１６７３－８３）。したがって、ＣＡＲは内在性Ｔ細胞受容体と同様の方法でＴ細胞活性化を引き起こし得るように思われるが、この技術の臨床応用に対する主な障害は、これまでのところ、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖、注入後の細胞の急速な消失、及び期待外れの臨床活動に限定されている。したがって、当技術分野では、望ましくない影響（例えば、高い毒性、不十分な有効性）を伴わずに特異的かつ有効な抗腫瘍効果を示し得るアプローチを用いたがんの治療のための新規組成物及び方法を発見することが緊急に必要とされている。
【0005】
本発明は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）において発現するＣＡＲ及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む免疫調節系を提供することによって、これらのニーズに対処する。免疫調節系を含む組成物及び治療方法を使用して、がん及び他の疾患及び／または病態を治療することができる。特に、本発明は、ＴＧＦβの調節不全性の発現に関連する疾患、障害または病態（例えば、がん、固形腫瘍）の治療に使用され得る、アーマー化ＣＡＲを発現する改変免疫細胞を提供する。ＴＧＦβモジュレーターを共発現するアーマー化ＣＡＲ Ｔ細胞は、形質導入されたＴ細胞上でＣＡＲの高い表面発現を示し、がん細胞の細胞溶解を増強する。したがって、本発明は、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む免疫調節系（例えば、改変されたＣＡＲ Ｔ細胞）を使用して、がん及び病原体に対する免疫応答を増強するための方法及び組成物を提供する。
【0006】
本発明は、部分的に、ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む改良されたＣＡＲポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子、改良されたＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞（例えば、Ｔ細胞）、及びがん（例えば、固形腫瘍がん）を治療するために養子細胞療法において改変された細胞を使用する方法を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態では、本発明は、必要とする対象に投与した場合に、ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞（本明細書では「非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞」とも呼ばれる）と比較して、対象において免疫応答を誘発することができる、ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを発現するように改変されたＣＡＲ－Ｔ細胞（本明細書では「ＴＧＦβアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞」とも呼ばれる）を提供する。
【0008】
いくつかの態様では、本発明は、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む抗原受容体を有する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、その場合、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。これらの改変された免疫応答性細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は抗原指向性であり、免疫抑制に抵抗し、及び／または免疫活性化特性が強化されている。
【0009】
一態様では、本発明は、がん関連抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む、遺伝子改変されたＴ細胞の集団を提供する。
【0010】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＡＤＧＲＥ２、ＣＬＥＣ１２、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＣＥＡＣＡＭ５、クラウジン１８．２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＣＣ（ＧＵＣＹ２Ｃとしても知られる）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ｘ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＩ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１３、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、及びＷＴ－１からなる群から選択される抗原を認識するＣＡＲを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲまたはＧＣＣ ＣＡＲを含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体に結合するＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、表１から選択されるアミノ酸配列を含むＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、細胞集団は自家である。
【0015】
いくつかの実施形態では、細胞集団は同種異系である。
【0016】
いくつかの実施形態では、細胞集団は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来である。
【0017】
いくつかの実施形態では、細胞集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする第２の核酸を含むベクターを使用して遺伝子改変する。
【0018】
いくつかの実施形態では、細胞集団を、２つのベクター、すなわち、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む第１のベクターと、ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする核酸を含む第２のベクターを使用して遺伝子改変する。
【0019】
いくつかの実施形態では、細胞集団を、Ｃｒｉｓｐｒを使用して遺伝子改変する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、レトロウイルス形質導入（ｇ－レトロウイルスを含む）、レンチウイルス形質導入、トランスポゾン及びトランスポザーゼ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ及びＰｉｇｇｙＢａｃ系）、メッセンジャーＲＮＡ転移媒介遺伝子発現、遺伝子編集（遺伝子挿入または遺伝子欠失／破壊）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、またはＴＡＬＥＮ（転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ）系を使用して遺伝子改変する。
【0020】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、２Ｂ４、ＧＤＩ １ａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせ及び変形からなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される膜貫通ドメインに由来する膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含む。
【0022】
一態様では、本発明は、ＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする第２の核酸を含むベクターを提供する。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする第２の核酸を含むベクターは、配列内リボソーム進入部位を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ベクターは、２Ａリボソーム配列をさらに含む。
【0025】
一態様では、本発明は、ＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをコードする第２の核酸を含むベクターで改変された免疫細胞を提供する。
【0026】
いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。
【0027】
一態様では、本発明は、宿主における免疫応答の調節方法を提供し、この方法は、がん関連抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む遺伝子改変されたＴ細胞の集団を宿主に投与することを含み、免疫応答の調節には、宿主免疫細胞による以下の１つ以上が含まれる：ＩＦＮγ産生の増加、ＩＬ－２産生の増加、抗原提示の増加、及び増殖の増加。
【0028】
一態様では、本発明は、がん関連抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む、遺伝子改変されたＴ細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
【0029】
一態様では、本発明は、治療または予防を必要とする対象におけるがんの治療方法または予防方法を提供し、この方法は、がん関連抗原及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、有効量の遺伝子改変されたＴ細胞集団を対象に投与することを含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、がんは、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、及びそれらの転移からなる群から選択される。
【0031】
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチド（例えば、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーター）をコードする核酸配列を含む免疫調節系を提供する。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、可変重鎖（ｖＨ）を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、可変重鎖（ｖＨ）及び可変軽鎖（ｖＬ）を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、二重または多重特異性抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、単離ＣＤＲまたはそれらのセット、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ラクダ抗体、マスク抗体、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖、タンデムダイアボディ、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ナノボディ、ｈｕｍａｂｏｄｙ、ミニボディ、ＢｉＴＥ、アンキリンリピートタンパク質、ＤＡＲＰＩＮ、アビマー、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ、Ａｆｆｉｌｉｎ、トランスボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＴｒｉｍｅｒＸ、マイクロタンパク質、Ｆｙｎｏｍｅｒ、センチリン、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ、またはそれらの断片からなる群から選択される抗原結合分子を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、重鎖のみ抗体を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドは、表１から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、二量体抗原結合剤を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂに結合する。
【0039】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂ受容体に結合する。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂ受容体２（ＴＧＦ－ｂＲ２）に結合する。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂ受容体２（ＴＧＦ－ｂＲ２）またはその断片を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂＲ２の細胞外ドメイン（ＴＧＦ－ｂＲ２）を含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＡＤＧＲＥ２、ＣＬＥＣ１２、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＣＥＡＣＡＭ５、クラウジン、１８．２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＣＣ（ＧＵＣＹ２Ｃとしても知られる）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ｘ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＩ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１３、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７ ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、及びＷＴ－１からなる群から選択される抗原に結合する。
【0044】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９またはＧＣＣに結合する。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、２Ｂ４、ＧＤＩ １ａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせ及び変形からなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0046】
前記ＣＡＲが、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される膜貫通ドメイン由来の膜貫通ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の免疫調節系。
【0047】
特定の実施形態では、修飾されたＣＤ３ｚポリペプチドは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）の全部または一部を欠いており、その場合、ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２、及びＩＴＡＭ３である。特定の実施形態では、修飾されたＣＤ３ｚポリペプチドはさらに、塩基性リッチストレッチ（ＢＲＳ）領域の全部または一部を欠いており、その場合、ＢＲＳ領域は、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２、及びＢＲＳ３である。
【0048】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫調節系を含む核酸を提供し、その場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列と、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする配列は、単一の構築物上に存在する。
【0049】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列と、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする配列は、異なる構築物上に存在する。
【0050】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫調節系をコードする核酸を含むベクターを提供する。
【0051】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、ベクターは、２Ａリボソーム配列を含む。いくつかの実施形態では、２Ａリボソーム配列は、Ｐ２ＡまたはＴ２Ａである。
【0053】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫調節系を含む免疫応答性細胞を提供する。
【0054】
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原またはストレスリガンドに対して特異性を有する標的化剤、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を含む免疫応答性細胞を提供する。
【0055】
いくつかの実施形態では、標的化剤は、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＵＬＢＰ１－６からなる群から選択されるストレスリガンドに特異的に結合する。
【0056】
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を含む免疫応答性細胞を提供する。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲと、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸を、同じポリヌクレオチド上に提供する。
【0058】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲと、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸を、別個のポリヌクレオチド上に提供する。
【0059】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、細胞から分泌される。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、可変重鎖（ｖＨ）を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、可変重鎖（ｖＨ）及び可変軽鎖（ｖＬ）を含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、二量体抗原結合剤を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂに結合する。
【0065】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂ受容体２（ＴＧＦ－ｂＲ２）またはその断片を含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂＲ２の細胞外ドメインを含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂ受容体に結合する。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドは、ＴＧＦ－ｂ受容体２（ＴＧＦ－ｂＲ２）に結合する。
【0069】
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、ベクター、改変されたｍＲＮＡ、または宿主細胞の染色体に組み込まれた配列から発現するＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする配列を、エンドヌクレアーゼを使用して宿主細胞染色体に組み込む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする配列を、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓ１３を使用して宿主細胞染色体に組み込む。
【0070】
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、ベクター、改変されたｍＲＮＡ、または宿主細胞の染色体に組み込まれた配列から発現し、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする配列を、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓ１３を使用して宿主細胞染色体に組み込む。
【0071】
いくつかの実施形態では、免疫反応性細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及びリンパ系細胞へ分化する可能性のある多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞）からなる群から選択される。
【0072】
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、改変された自家細胞である。いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、改変された同種異系細胞である。
【0073】
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、ＡＤＧＲＥ２、ＣＬＥＣ１２、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＣＥＡＣＡＭ５、クラウジン、１８．２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＣＣ（ＧＵＣＹ２Ｃとしても知られる）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ｘ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＩ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１３、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、及びＷＴ－１からなる群から選択される腫瘍抗原に結合するＣＡＲを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９またはＧＣＣに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＧＣＣに結合する。
【0075】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ９７、２Ｂ４、ＧＤＩ １ａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせ及び変形に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される膜貫通ドメインに由来する膜貫通ドメインを含む。
【0077】
特定の実施形態では、修飾されたＣＤ３ｚポリペプチドは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）の全部または一部を欠いており、その場合、ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２、及びＩＴＡＭ３である。特定の実施形態では、修飾されたＣＤ３ｚポリペプチドはさらに、塩基性リッチストレッチ（ＢＲＳ）領域の全部または一部を欠いており、その場合、ＢＲＳ領域は、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２、及びＢＲＳ３である。
【0078】
いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ｚドメインを含まない。
【0079】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドは、免疫応答性細胞の免疫応答を増強する。
【0080】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の有効量の免疫調節系を含む医薬組成物を提供する。
【0081】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫調節系をコードする有効量の核酸配列を含む医薬組成物を提供する。
【0082】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫調節系をコードする有効量のベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0083】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の有効量の免疫応答細胞を含む医薬組成物を提供する。
【0084】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0085】
一態様では、本発明は、がんを治療するキットを提供し、キットは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を含む免疫応答性細胞を含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の免疫調節系をコードする核酸またはベクターを含む。
【0087】
一態様では、本発明は、対象におけるがんまたはその転移を治療または予防する方法を提供し、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の免疫応答性細胞を投与することを含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物を、造血系のがんを治療するために使用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物を、固形腫瘍がんを治療するために使用することができる。
【0089】
いくつかの実施形態では、がんは、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、及び網膜芽腫からなる群から選択される。
【0090】
いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤を投与することをさらに含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤を、対象に全身的に投与する。
【0092】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤を、ＣＡＲ及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸とは別に投与する。
【0093】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１、ＣＸＣＲ２、及び／またはＩＬ－１５を標的とする。
【0094】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤である。
【0095】
一態様では、本発明は、免疫細胞の活性を調節する方法を提供し、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。
【0096】
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の活性を調節する方法を提供し、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。
【0097】
一態様では、本発明は、対象における腫瘍負荷を軽減する方法を提供し、方法は、本明細書に記載の核酸、ベクター、または免疫応答性細胞を含む有効量の免疫調節系を投与することを含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍サイズを縮小させる。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の腫瘍を根絶する。
【0099】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸、ベクター、または免疫応答性細胞を含む免疫調節系を対象に投与することを含む、対象におけるがん細胞に応答した免疫活性化サイトカイン産生を増加させる方法を提供する。
【0100】
一態様では、本発明は、抗原特異的免疫応答性細胞の産生方法を提供し、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、及びＴＧＦ－ｂシグナル伝達を調節する組換えポリペプチドをコードする核酸を免疫応答性細胞に導入することを含む。
【0101】
前述の一般的な説明及び以下の発明を実施するための形態はどちらも例示的かつ説明的なものであるにすぎず、特許請求される発明を限定するものではないと理解すべきである。
【0102】
以下の図で構成される、本明細書に含まれる図面は、単に例示目的にすぎず、限定するためではない。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1A】免疫応答性細胞（例えば、形質導入されたＴ細胞）におけるＣＡＲ及びＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターの例示的な発現を示す。リンパ球の集団を示す。
【図1B】免疫応答性細胞（例えば、形質導入されたＴ細胞）におけるＣＡＲ及びＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターの例示的な発現を示す。シングレットを示す。
【図1C】免疫応答性細胞（例えば、形質導入されたＴ細胞）におけるＣＡＲ及びＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターの例示的な発現を示す。ＣＤ３＋生細胞の集団を示す。
【図1D】免疫応答性細胞（例えば、形質導入されたＴ細胞）におけるＣＡＲ及びＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターの例示的な発現を示す。ＴＧＦ－βを発現するアーマー化（ａｒｍｏｒｅｄ）ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を評価する例示的なフローサイトメトリー結果を示す。
【図1E】免疫応答性細胞（例えば、形質導入されたＴ細胞）におけるＣＡＲ及びＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターの例示的な発現を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲのみで形質導入された非アーマー化細胞、及びＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）、ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ２（配列番号２）、ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（配列番号３）、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ（配列番号４）、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（配列番号５）、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１（配列番号６）及びｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１（配列番号８）でアーマー化されたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、または非形質導入細胞を使用した、形質導入効率をＣＡＲ染色陽性の生細胞（％）として示す棒グラフを示す。
【図2】エフェクターを使用した、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞（Ａ）及びＣＤ１９ｋｏ Ｒａｊｉ細胞（Ｂ）に対する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを共発現する免疫応答性細胞の例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅アッセイ結果を、ＣＤ１９ ＣＡＲのみで形質導入された非アーマー化細胞、ならびにＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）、ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ２（配列番号２）、ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（配列番号３）、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ（配列番号４）、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（配列番号５）、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１（配列番号６）、及びｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１（配列番号８）でアーマー化されたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、または非形質導入細胞の標的と比較して示すグラフである。
【図3】Ａは、ＴＧＦ－β結合剤の分泌を示す例示的なＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフを示し、Ｂは、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴＧＦβＲ２結合剤の分泌及びそれらの同族抗原に結合する能力を示す例示的なＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフを示す。
【図4】構築物ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）、ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ２（配列番号２）、ＴＧＦｂ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（配列番号３）、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ（配列番号４）、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（配列番号５）、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１（配列番号６）及びｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１（配列番号８）を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞由来の上清によるＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を評価するルシフェラーゼアッセイの例示的な結果を示す棒グラフを示す。
【図5A】ＴＧＦｂ－ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１ Ｇ４Ｓ二量体（配列番号１７）、ＴＧＦｂ－ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１ ２×Ｇ４Ｓ二量体（配列番号１８）、ＴＧＦｂ－ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１ミニボディ（配列番号２１）、ＴＧＦｂ－ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１ミニボディ＋ヒンジ（配列番号１９）を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞由来の上清によるＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を評価するルシフェラーゼアッセイの例示的な結果を示す棒グラフを示す。
【図5B】ＴＧＦ－βに対する多量体結合剤の分泌についてのルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して設計し、スクリーニングした例示的なＴＧＦ－βモジュレーターの概略図を示す。
【図5C】ＶＨＨ結合ドメインを含む例示的なＴＧＦ－βモジュレーターの概略図を示す。
【図6】Ａは、ＣＡＲのみを発現する非アーマー化細胞と比較した、単量体ＴＧＦｂ－ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）及び二量体ＴＧＦｂ－ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１ Ｇ４Ｓ二量体（配列番号１７）結合剤を共発現するアーマー化ＣＡＲ Ｔ細胞の相対遮断活性を評価するルシフェラーゼアッセイの例示的な結果を示す棒グラフを示す。Ｂは、ＴＧＦβＲ２ ＶＨＨ及びｓｃＦｖ単量体及び二量体構築物の相対的な遮断活性を評価するために使用されるルシフェラーゼアッセイの例示的な結果を示す棒グラフを示す。非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２単量体、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ二量体、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ三量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ二量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ３単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ３ Ｇ４Ｓ二量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ Ｇ４Ｓ二量体。
【図7A】例示的なＴＧＦｂモジュレーターがヒトＴＧＦｂＲ２に結合することを示す例示的なＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフを示す。非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２単量体、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ二量体、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ三量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ二量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ３単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ３ Ｇ４Ｓ二量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ Ｇ４Ｓ二量体。
【図7B】例示的なＴＧＦｂモジュレーターがマウスＴＧＦｂＲ２には結合しないことを示す例示的なＥＬＩＳＡ結果を示す棒グラフを示す。非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２単量体、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ二量体、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ三量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ２ Ｇ４Ｓ二量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ３単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ３ Ｇ４Ｓ二量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ単量体、ｈＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ Ｇ４Ｓ二量体。
【図8A】実施例６に記載のＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞の腫瘍増殖を評価するための例示的な注射タイムラインを示す。
【図8B】非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、ＴＧＦ－β結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスにおける例示的な腫瘍体積の経時変化を示す。
【図8C】非アーマー化または非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、ＴＧＦ－β結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスにおける例示的な肝転移を示す。
【図8D】非アーマー化または非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、ＴＧＦ－β結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスにおける例示的な肺転移を示す。
【図8E】肝臓及び肺の組織におけるルシフェラーゼ発現腫瘍細胞の例示的な画像化結果を示す。
【図9】異なるＴＧＦ－ｂリガンドトラップ（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１～ＴＧＦｂＲ２ ＥＣＤ単量体、ホモ二量体（Ａ）及びヘテロ二量体（Ｂ））を分泌するアーマー化マウスＣＡＲ－Ｔ由来の上清を、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較するＳＢＥ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－ｂレポーターアッセイの例示的な結果を示す棒グラフを示す。
【図10A】ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞の腫瘍増殖を評価するための例示的な注射タイムラインを示す。
【図10B】非形質導入Ｔ細胞または非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを共発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与したマウスにおける経時的な例示的な腫瘍体積を示す。
【図10C】ＴＧＦｂＲ１＋２ＥＣＤ二量体を共発現するアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞または非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを共発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与したマウスにおける経時的な例示的な腫瘍体積を示す。
【図10D】全身性抗ＴＧＦｂ抗体（１Ｄ１１）または非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを共発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与したマウスにおける経時的な例示的な腫瘍体積を示す。
【図11】ＣＤ１９を発現するＭＣ３８細胞から発生したマウスにおける例示的な腫瘍体積を経時的に示すグラフを示す。非形質導入Ｔ細胞、非アーマー化抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＴＧＦ－ｂに対する阻害結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１）をマウスに投与した。
【図12】ＴＧＦ－ｂ（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１））に対する結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞による宿主免疫応答の活性化の増強を示す例示的なＲＮＡ配列分析を示すグラフを示す。
【図13】ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウス由来の腫瘍における腫瘍浸潤性Ｔ細胞（ＣＤ３ｄ＋、ＣＤ３ｅ＋、ＣＤ３ｇ＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８ａ＋）及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＧｚｍＢ＋）の例示的なバイオマーカースコアを示す。
【図14】ＣＡＲ－Ｔ細胞を分泌するＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）を投与したマウス由来の腫瘍におけるＴ細胞シグネチャー及びＩＦＮｇシグネチャーの増加を示す例示的な単一試料Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）の濃縮スコアを示す。
【図15】非形質導入対照Ｔ細胞、非アーマー化ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、または抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）単量体分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスにおける、ＴＣＲａ／ｂ、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５．１、及びＣＤ４５を含む例示的な表面マーカー分析を示す。
【図16A】抗ＴＧＦ－ｂまたは抗ＴＧＦｂＲ２遮断抗体でアーマー化されたヒトＧＣＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能向上を示す、ＧＳＵ異種移植モデルにおける例示的なｉｎ ｖｉｖｏ分析を示すグラフである。
【図16B】抗ＴＧＦ－ｂまたは抗ＴＧＦｂＲ２遮断抗体でアーマー化されたヒトＧＣＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能向上を示す、ＧＳＵ異種移植モデルにおける例示的なｉｎ ｖｉｖｏ分析を示すグラフである。
【図17A】抗Ｆｌａｇ免疫捕捉ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して測定された、ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１及びＴＧＦｂＲ２ ＶＨＨを共発現する抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌されるＴＧＦｂモジュレーターの腫瘍濃度及び／または血漿濃度を示す。
【図17B】抗Ｆｌａｇ免疫捕捉ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して測定された、ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１及びＴＧＦｂＲ２ ＶＨＨを共発現する抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌されるＴＧＦｂモジュレーターの腫瘍濃度及び／または血漿濃度を示す。
【図17C】抗Ｆｌａｇ免疫捕捉ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して測定された、ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１及びＴＧＦｂＲ２ ＶＨＨを共発現する抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌されるＴＧＦｂモジュレーターの腫瘍濃度及び／または血漿濃度を示す。
【図17D】抗Ｆｌａｇ免疫捕捉ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して測定された、ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１及びＴＧＦｂＲ２ ＶＨＨを共発現する抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌されるＴＧＦｂモジュレーターの腫瘍濃度及び／または血漿濃度を示す。
【図18】ＴＧＦｂの非存在下（Ａ）及びＴＧＦｂの存在下（Ｂ）における、非アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗ＴＧＦｂＲ２ ＶＨＨ単量体アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び抗ＴＧＦｂＲ２ ＶＨＨ二量体アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた、ＨＴ２９－ＧＣＣ陽性細胞における例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅アッセイ結果を示すグラフである。Ｃは、ＴＧＦｂの存在下及び非存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を示す。
【図19】反復抗原刺激後の細胞上のＰＤ－１／Ｌａｇ３発現を示す例示的なフローサイトメトリー結果を示す。
【図20A】アーマー化及び非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにドミナントネガティブＴＧＦｂＲ２（ｄｎＴＧＦｂＲ２）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＧＣＣ発現細胞ＧＳＵの（皮下）異種移植モデルを示す。
【図20B】アーマー化及び非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにドミナントネガティブＴＧＦｂＲ２（ｄｎＴＧＦｂＲ２）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＧＣＣ発現細胞ＨＴ５５の（皮下）異種移植モデルを示す。
【図20C】アーマー化及び非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにドミナントネガティブＴＧＦｂＲ２（ｄｎＴＧＦｂＲ２）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＧＣＣ発現細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＦＰ４ Ｌｕｃの（皮下）異種移植モデルを示す。
【図21A】アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＨＴ５５肝臓転移モデルの例示的な結果を示す。
【図21B】アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＨＴ５５肝臓転移モデルの例示的な結果を示す。
【図21C】アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＨＴ５５肝臓転移モデルの例示的な結果を示す。
【図22】Ａは、示された時点で実施したフローサイトメトリー及びＦＡＣＳ表現型解析によってカウントされたＣＡＲ－Ｔ細胞を示す。Ｂは、Ｍｓｌｎに対するＣＡＲを、ＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２－ＶＨもしくはｄｎＴＧＦｂＲ２）またはＧＦＰに対する対照ＶＨ（Ｍｓｌｎ－対照ＶＨ）と共に共発現する抗Ｍｓｌｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞傷害性の割合を示す。
【0104】
定義
本発明が、より容易に理解されるように、特定の用語を以下に最初に定義する。以下の用語及び他の用語に関するさらなる定義は、本明細書によって記載される。
本発明が、より容易に理解されるように、特定の用語を以下に最初に定義する。以下の用語及び他の用語に関するさらなる定義は、本明細書によって記載される。
【0105】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書に記載される種類の１つ以上の方法、及び／またはステップを含み、及び／または本開示などを読む際に当業者には明らかになる。
【0106】
投与する：本明細書で使用される場合、対象に組成物を「投与する」とは、対象に組成物を与えるか、塗布するか、または接触させることを意味する。投与は、例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、及び皮内などの多数の経路のいずれかによって達成され得る。
【0107】
養子細胞療法：本明細書で互換的に使用される場合、「養子細胞療法」または「養子細胞移植」または「細胞療法」または「ＡＣＴ」という用語は、細胞、例えば、本明細書に記載の遺伝子改変細胞の集団を、必要とする患者に投与することを指す。細胞は、それを必要とする患者から採取して、増殖させることができ（すなわち、自家細胞）、または患者以外のドナーから採取した細胞とすることもできる（すなわち、同種異系細胞）。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲ及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを発現するように改変されたリンパ球などの免疫細胞（例えば、ＴＧＦβアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞）である。ＡＣＴには、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、γδ Ｔ 細胞、制御性Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、及び末梢血単核球などの様々な細胞型を使用することができるが、これらに限定されない。
【0108】
親和性：本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、結合部分（例えば、抗原結合剤（例えば、本明細書に記載される可変ドメイン））と標的（例えば、抗原（例えば、ＴＧＦＢまたはＴＧＦＢＲ））との間の結合相互作用の特性を指し、それは結合相互作用の強さを示す。いくつかの実施形態では、親和性の尺度は、解離定数（ＫＤ）として表される。抗原結合タンパク質のその標的に対する結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、反応速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）、または当技術分野で公知の他の方法によって決定され得る。
【0109】
結合活性：本明細書で使用する場合、用語「結合活性」とは、例えば相互作用の価数を考慮した、複数の部位における２つの分子の相互結合の強さの合計である。
【0110】
動物：本明細書で使用する場合、用語「動物」とは、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚、昆虫、及び／またはワームが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変された動物、及び／またはクローンであってもよい。
【0111】
自家：本明細書で使用される場合、用語「自家」とは、任意の材料が後に個体に再導入される場合の同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【0112】
同種異系：本明細書で使用される場合、「同種異系」とは、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質を指す。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体は、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体に由来する同種異系物質は、抗原的に相互作用するために遺伝的に十分に異なり得る。
【0113】
抗体または抗原結合剤：本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「抗原結合剤」とは、特定の標的抗原に対して特異的結合を付与するのに十分な古典的免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当業者であれば、これらの用語が本明細書では同じ意味で使用され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「抗原結合剤」はまた、「抗体断片（複数可）」も指し、これは例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクトな抗体の一部を含む。「抗体断片」の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体に含まれるＣＤＲ含有部分が挙げられる。当業者であれば、用語「抗体断片」が、任意の特定の生成様式を示唆するものではなく、また、それに限定されないことを理解するであろう。抗体断片は、任意の適切な手法を使用して作製されてよく、その手法としてはインタクトな抗体の切断、化学合成、組換え産生などが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において公知のように、自然界で産生されるようなインタクトな抗体は、およそ１５０ｋＤの四量体薬剤であり、これは２つの同一の重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）及び２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）で構成され、互いに会合して「Ｙ字型」構造と一般的に称される構造になる。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各約１１０アミノ酸長）で構成され、これらは、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置している）、それに続く３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙ字の幹の基部に位置している）である。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖可変領域及び定常領域を連結させる。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残部に連結させる。このヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合は、インタクトな抗体中で２つの重鎖ポリペプチドを互いに連結させる。各軽鎖は２つのドメインで構成され、これらは、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、それに続く別の「スイッチ」によって互いに分離された、カルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインである。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖－軽鎖二量体で構成され、その場合に重鎖及び軽鎖が１つのジスルフィド結合によって互いに連結され、２つの他のジスルフィド結合が、重鎖ヒンジ領域を互いに連結させるため、二量体が互いに連結されて四量体が形成される。天然に産生される抗体も、通常、ＣＨ２ドメイン上でグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル中で互いに圧縮されている２つのβシート（例えば、３本鎖、４本鎖、または５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループならびに４つのやや不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有する。天然抗体が折り畳まれる場合、ＦＲ領域は、ドメインに構造的フレームワークを提供するβシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方に由来するＣＤＲループ領域が三次元空間でまとまるため、それらは、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を形成する。抗体ポリペプチド鎖間のアミノ酸配列比較によって、２本の軽鎖（κ及びλ）クラス、いくつかの重鎖（例えば、μ、γ、α、ε、δ）クラス、ならびに特定の重鎖サブクラス（α１、α２、γ１、γ２、γ３、及びγ４）が定義される。抗体クラス（ＩｇＡ［ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を含む］、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ［ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む］、ならびにＩｇＭ）は、利用される重鎖配列のクラスに基づいて定義される。
【0114】
本発明の目的のために、特定の実施形態では、天然抗体中に認められるような、十分な免疫グロブリンドメイン配列を含むいずれのポリペプチドまたはポリペプチドの複合体も、そのようなポリペプチドが天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）か、あるいは組換え改変、化学合成、または他の人工系もしくは手法によって産生されるかどうかにかかわらず、「抗体」または「抗原結合剤」と称され得、及び／またはそれとして使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルであり、いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野において公知であるような、ヒト化、霊長類化、キメラ化などが行われている。さらに、用語「抗体」または「抗原結合剤」は、本明細書で使用される場合、適切な実施形態では、代替の提示において抗体の構造的及び機能的特徴を獲得するために当技術分野で公知の、または開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指し得ることを（別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り）包含すると理解される。例えば、いくつかの実施形態では、本用語は、二重または他の多重特異性（例えば、ｚｙｂｏｄｙなどの）抗体、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖抗体、ラクダ抗体、及び／または抗体断片を指し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生される場合に有することになる共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）を欠いている場合がある。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード［例えば、検出可能部分、治療的部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど］）を含有する場合がある。
【0115】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、用語「およそ」または「約」とは、１つ以上の目的の値に適用される場合に規定の参照値に類似した値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」とは、別途記載のない限り、あるいは別様に前後関係から明白な場合を除いて、表示された参照値（を上回るかまたは下回る）のいずれかの２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、もしくはそれ未満の範囲内に含まれる値域を指す（この数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。用語「約」または「およそ」が、記載された参照値を修飾するために使用される場合、記載された参照値自体は、記載された参照値のいずれかの側の記載された参照値に近い値と共に網羅されることが理解される。
【0116】
アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞：本明細書で使用される場合、用語「アーマー化ＣＡＲ細胞」または「アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞」とは、腫瘍免疫抑制及び腫瘍誘発性ＣＡＲ－Ｔ機能不全を回避する能力を有する遺伝子改変された細胞を指す。いくつかの実施形態では、アーマー化ＣＡＲ Ｔ細胞は、がん関連抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを含む。
【0117】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：可変ドメインの「ＣＤＲ」とは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの両方の蓄積、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔの定義、及び／または立体構造の定義、あるいは当技術分野で周知の任意のＣＤＲ決定法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として識別される場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃを参照のこと。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ及び他によって最初に記載された構造的ループ構造として識別される場合もある。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３，１９８９を参照のこと。ＣＤＲ同定のための他のアプローチとしては、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在のＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して導出される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５，１９９６に記載されている、観察された抗原接触部位に基づくＣＤＲの「接触定義」が挙げられる。本明細書でＣＤＲの「立体構造定義」と称される別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として同定される場合がある。例えば、Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１ １５６－１１６６，２００８を参照のこと。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従わない場合があるが、特定の残基もしくは残基の群またはＣＤＲ全体でさえ、抗原結合に大きな影響を与えないという予測または実験的発見に照らして短縮または延長される可能性があるが、それでもＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野で公知の任意のアプローチによって定義されるＣＤＲを指し得る。本明細書で使用される方法では、これらのアプローチのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用してもよい。複数のＣＤＲを含む任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ、及び／または立体構造の定義に従って画定され得る。
【0118】
抗体依存性細胞傷害またはＡＤＣＣは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を保有する標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒を用いて標的細胞を死滅させることができる細胞傷害性の形態を指す。抗体によって細胞傷害性細胞が「武装化」され、これはこの機構による標的細胞の死滅に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるアッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるモデルなどの動物モデルで評価してもよい。
【0119】
抗原：本明細書で使用される場合、用語「抗原」とは、免疫応答を誘発する作用因子、及び／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）によって結合されるか、もしくは生物に曝露もしくは投与される場合に抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される）に結合する作用因子を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、生物内で（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）体液性応答を誘発し、あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、抗原は、生物内で（例えば、Ｔ細胞の受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞に関与する）細胞応答を誘発する。当業者であれば、特定の抗原が、標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発し得るが、標的生物種のすべてのメンバーにおいて誘発するとは限らないことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％で免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、抗原は、抗体及び／またはＴ細胞受容体に結合し、生物内で特定の生理学的応答を誘導する場合もあれば、誘導しない場合もある。いくつかの実施形態では、例えば、抗原は、そのような相互作用がｉｎ ｖｉｖｏで生じるか否かにかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体及び／またはＴ細胞受容体に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。
【0120】
～に関連する：本明細書でこの用語が使用される場合、２つの事象または実体は、一方の存在、レベル及び／または形態が、他方のそれらと相関する場合に互いに「関連」している。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベル及び／または形態が、（例えば、関連する集団にわたって）疾患、障害、または病態の発症率及び／または感受性と相関する場合に、特定の疾患、障害、または病態と関連するとみなされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体は、それらが直接的または間接的に相互作用することで、それらが互いに物理的に近接し、近接したままである場合、互いに物理的に「関連」している。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連した２つ以上の実体は、互いに共有結合し、いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連した２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びこれらの組み合わせにより、非共有的に相互作用する。いくつかの実施形態では、「がん細胞に関連する抗原」に関する用語「に関連する」は、がん細胞の表面上に特定の抗原が存在することを指す。
【0121】
結合：本明細書で使用される場合、用語「結合」とは一般に、２つ以上の実体間での、またはこれらにまたがる、非共有結合的会合を意味することが理解される。「直接」結合は、実体または部分間での物理的接触を含み、間接結合は、１つ以上の中間実体との物理的接触による物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間での結合は、相互作用する実体または部分が、単独で、またはより複雑な系との関連において研究される場合（例えば、担体実体と共有結合もしくは別の方法で会合する場合、及び／または生物系もしくは細胞内における場合）を含む、様々な文脈のいずれかで評価され得る。本明細書で使用される場合、「Ｋａ」とは、結合部分／標的複合体を形成するための特定の結合部分と標的との結合速度を指す。本明細書で使用される場合、「Ｋｄ」とは、特定の結合部分／標的複合体の解離速度を指す。本明細書で使用される場合、「ＫＤ」とは解離定数を指し、これはＫｄとＫａとの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して、例えば、表面プラズモン共鳴を使用するか、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによって決定され得る。
【0122】
担体：本明細書で使用される場合、用語「担体」とは、組成物と共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。いくつかの例示的な実施形態では、担体としては、滅菌液、例えば、水及び油など、例えば、石油、動物油、植物油、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、担体は、１つ以上の固体成分であるか、またはそれらを含む。
【0123】
特徴的部分：本明細書で使用される場合、用語「特徴的部分」は最も広義に使用され、物質の存在（または不存在）が、物質の特定の特徴、属性、または活性の存在（または不存在）と相関する物質の一部を指す。いくつかの実施形態では、物質の特徴的部分とは、その物質と、特定の特徴、属性、または活性を共有する関連物質には認められ、特定の特徴、属性、または活性を共有しない物質には認められない部分である。
【0124】
キメラ抗原受容体：本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、１つ以上の細胞外標的結合ドメイン（例えば、抗体由来の）、膜貫通領域、及び１つ以上の細胞内エフェクタードメインからなる、改変された受容体を指す。ＣＡＲは通常、所望の細胞表面抗原またはＭＨＣペプチド複合体に対する特異性を再配向するために、Ｔ細胞などの免疫細胞に導入される。これらの合成受容体は、通常、単一の融合分子内の柔軟なリンカーを介して１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連する標的結合ドメインを含む。標的結合ドメインは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を病的細胞（例えば、がん細胞）の表面上で、特定の標的に配向するために使用され、シグナル伝達ドメインは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化及び増殖のための分子機構を含む。通常、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の膜を通過する柔軟なリンカー（すなわち、膜貫通ドメインの形成）により、ＣＡＲの標的結合ドメインの細胞膜提示が可能になる。ＣＡＲは、リンパ腫及び固形腫瘍など、様々な悪性腫瘍の腫瘍細胞の表面に発現する抗原に対して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を再配向することに成功している（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．，２１（１ Ｐｔ １）：１２７－３０；Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，１１６（７）：１０３５－４４）。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の可変重鎖領域と軽鎖領域との融合に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成されていてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。あるいは、（例えば、Ｆａｂライブラリから得られた抗体由来ではなく）Ｆａｂに由来するｓｃＦｖを使用してもよい。様々な実施形態において、このｓｃＦｖを、膜貫通ドメインに融合させ、次いで細胞内シグナル伝達ドメインに融合させる。
【0125】
少なくとも３世代のＣＡＲが開発されている。第１世代のＣＡＲは、ＣＤ３ζの細胞質領域またはＦｃ受容体γ鎖に由来するシグナル伝達ドメインに結合した標的結合ドメインで構成された。第１世代のＣＡＲは、選択された標的にＴ細胞をうまく再配向することが示されたが、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期の増殖及び抗腫瘍活性をもたらすことはできなかった。第２世代及び第３世代のＣＡＲでは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの共刺激分子を含めることにより、改変されたＴ細胞の生存率を高め、増殖を増加させることに重点を置いている。本明細書に記載される実施形態は、部分的には、例えば、ＣＡＲ－ＴをＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターでアーマー化することによって、ＣＡＲ－Ｔを含む免疫療法をさらに改善し、それによってがん、特に固形腫瘍がんを治療する際に免疫療法をより効果的にすることに重点を置いている。本明細書で提供されるアーマー化ＣＡＲは、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、適していない腫瘍微小環境に直面した場合のＣＡＲ－Ｔの機能及び生存率を向上または増強する。
【0126】
コドン最適化：本明細書で使用される場合、「コドン最適化」核酸配列とは、核酸配列の翻訳及び得られたタンパク質の発現が、特定の発現系に対する最適化について改善されるように変更されている核酸配列を指す。「コドン最適化」核酸配列は、「コドン最適化」核酸配列が基づく非最適化親配列と同じタンパク質をコードする。例えば、核酸配列は、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト細胞、マウス細胞など）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞における発現のために「コドン最適化」される場合がある。
【0127】
同等：用語「同等」とは、本明細書で使用される場合、互いに同一ではない場合があるが、それらの間における比較を可能にするのに十分に類似し、観察される差または類似性に基づいて結論が合理的にもたらされる場合があるような、２つ以上の薬剤、実体、状況、状態のセットなどを指す。当業者であれば、文脈内において２つ以上のそのような薬剤、実体、状況、状態のセットなどが任意の所与の状況において同等とみなされるには、どの程度の同一性が求められるかを理解するであろう。
【0128】
～に対応する：本明細書で使用される場合、用語「に対応する」は、多くの場合、目的のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を指定するために使用される。当業者であれば、簡潔化のために、ポリペプチド中の残基が参照関連ポリペプチドに基づく古典的な番号付け方式を使用して多くの場合に指定されるため、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸は、実際には特定のアミノ酸鎖の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ参照ポリペプチドの１９０位に見られる残基に対応すると理解し、当業者は「対応する」アミノ酸の同定方法を容易に理解している。
【0129】
由来：本明細書で使用される場合、語句「指定配列に由来する」または「指定配列に特異的な」配列とは、例えば、指定配列の隣接領域に対応する、すなわち、それと同一の、またはそれに相補的な少なくともおよそ６つのヌクレオチドもしくは少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも約９つのヌクレオチドもしくは少なくとも３つのアミノ酸、少なくとも約１０～１２のヌクレオチドもしくは４つのアミノ酸、または少なくとも約１５～２１のヌクレオチドもしくは５～７つのアミノ酸の連続配列を含む配列を指す。特定の実施形態では、配列は、指定されたヌクレオチドまたはアミノ酸配列のすべてを含む。配列は、当技術分野で公知の技術によって決定されるような、特定の配列に固有の配列領域に相補的であるか（ポリヌクレオチド配列の場合）、またはそれと同一であり得る。配列が由来し得る領域としては、特定のエピトープをコードする領域、ＣＤＲをコードする領域、フレームワーク配列をコードする領域、定常ドメイン領域をコードする領域、可変ドメイン領域をコードする領域に加えて、非翻訳及び／または非転写領域が挙げられるが、これらに限定されない。得られた配列は、必ずしも試験中の目的の配列に物理的に由来しているとは限らないが、ポリヌクレオチドが由来する領域（複数可）の塩基配列によって提供される情報に基づく、化学合成、複製、逆転写または転写を含むが、これらに限定されないいかなる方法によっても生成され得る。したがって、配列は、元のポリヌクレオチドのセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかを表す場合がある。加えて、指定配列の領域に対応する領域の組合せを、使用目的と一致するように、当技術分野で公知の方法で改変または組み合わせてもよい。例えば、配列は、２つ以上の連続配列を含む場合があり、その各々が指定配列の一部を含み、指定配列と同一ではないが、指定配列に由来する配列を表すことを意図する領域が挿入されている。抗体分子に関して、「それに由来する」は、比較抗体に機能的または構造的に関連する抗体分子を含み、例えば、「それに由来する」は、類似した、または実質的に同じ配列または構造を有する、例えば、同じまたは類似したＣＤＲ、フレームワークまたは可変領域を有する抗体分子を含む。抗体の「それに由来する」はまた、残基、例えば、１つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超える残基を含み、これは連続していても、していなくともよいが、番号付けスキームまたは一般的な抗体構造に対する相同性または比較配列の、すなわち、ＣＤＲまたはフレームワーク領域内での三次元近接によって定義または同定される。用語「それに由来する」は、それに物理的に由来することに限定されず、任意の方法、例えば、別の抗体を設計するために比較抗体からの配列情報を使用することによる生成を含む。
【0130】
決定する：本明細書に記載される多くの手法は、「決定する」ステップを含む。当業者は、本明細書を読むと、そのような「決定する」ことが、例えば、本明細書で明示的に言及される特定の技術を含む、当業者に利用可能な様々な技術のいずれかを利用し得ると理解するであろう。いくつかの実施形態では、決定は、物理的試料の操作を伴う。いくつかの実施形態では、決定は、例えば、コンピュータまたは関連する分析を実施するために適合された他の処理ユニットを利用する、データまたは情報の考察及び／または操作を伴う。いくつかの実施形態では、決定は、供給源から関連する情報及び／または材料を得ることを伴う。いくつかの実施形態では、決定することは、試料または実体の１つ以上の特徴を同等の参照物と比較することを伴う。
【0131】
改変された：用語「改変された」は、本明細書で使用される場合、人間によって設計もしくは改変され、及び／またはそれを存在させ、産生するために、人為的介入及び／または活動を必要とするポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞について記載している。例えば、改変された細胞は、特定の効果、かつ同じ種の天然の細胞の効果とは異なる効果を引き出すように意図的に設計されている。いくつかの実施形態では、改変された細胞は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を発現する。
【0132】
エフェクター機能：本明細書で使用される場合、用語「エフェクター機能」とは、本明細書に記載される抗原結合剤に起因するような生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。「減少または最小化した」抗体エフェクター機能は、野生型または非改変抗体から少なくとも５０％（あるいは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）減少していることを意味する。抗体エフェクター機能の決定は、当業者によって容易に決定可能及び測定可能である。いくつかの実施形態では、補体結合、補体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害の抗体エフェクター機能が影響を受ける。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グリコシル化を排除した定常領域における変異、例えば、「エフェクターレス変異」によって排除される。一態様では、エフェクターレス変異は、ＣＨ２領域におけるＮ２９７ＡまたはＤＡＮＡ変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）である。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６６０４（２００１）。あるいは、減少または排除したエフェクター機能をもたらす追加の変異としては、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）が挙げられる。あるいは、エフェクター機能は、産生技術、例えば、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）またはエフェクター機能を促進する際に無効もしくは効果が弱いグリコシル化パターンの変更をもたらす宿主細胞における発現などによって減少または排除され得る（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－３４７３（２００３）。
【0133】
エピトープ：本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）結合成分によって全体的または部分的に特異的に認識される任意の部分を含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原内の複数のアミノ酸で構成される。いくつかの実施形態では、そのようなアミノ酸残基は、抗原が関連する三次元立体構造を取る場合に表面に露出する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、抗原がそのような立体構造を取る場合に、空間内で互いに物理的に近接しているか、または互いに形が合う。いくつかの実施形態では、アミノ酸のうち少なくともいくつかは、抗原が別の立体構造を取る（例えば、線状化する）場合、互いに物理的に分離されている（例えば、非線状エピトープ）。
【0134】
賦形剤：本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」とは、例えば、所望の稠度または安定化効果を提供するか、またはこれに寄与するために医薬組成物に含まれる場合がある非治療剤を指す。好適な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【0135】
発現：用語「発現」または「発現される」とは、本明細書で核酸に関連して使用される場合、以下の事象のうち１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ鋳型のＲＮＡ転写産物の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）、（３）ポリペプチドへのＲＮＡの翻訳、及び／または（４）ポリペプチドの翻訳後修飾。
【0136】
Ｅｘ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｅｘ ｖｉｖｏ」とは、細胞を生物から取り出し、生物の外部（例えば、試験管内、培養バッグ内、バイオリアクター内）で増殖させるプロセスを意味する。
【0137】
融合タンパク質：本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、２つの異なる（例えば、異種）タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列から改変された核酸配列によってコードされるタンパク質を指す。当業者が疑いなく認識している通り、融合タンパク質を作製するために、得られる読み取り配列が内部終止コドンを含有しないように核酸配列を連結させる。
【0138】
宿主：用語「宿主」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、非ヒト霊長類）または系（例えば、細胞もしくは細胞株）を指すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、宿主は、本明細書に記載のＣＡＲ及び／またはＴＧＦβモジュレーターを発現する細胞または細胞集団を投与されている生物である。いくつかの実施形態では、細胞集団を投与すると、宿主における免疫応答が改善される。
【0139】
宿主細胞：本明細書で使用される場合、語句「宿主細胞」とは、外来ＤＮＡ（組換えまたは別の方法）が導入されている細胞を指す。例えば、宿主細胞を使用して、標準的な組換え技術によって本明細書に記載の改変ＣＡＲ分子を産生してもよい。当業者であれば、本開示を読むことにより、そのような用語が特定の対象細胞のみを指すだけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを理解するであろう。突然変異または環境の影響のいずれかにより、特定の修飾が後続の世代で生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【0140】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞を指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞としては、外来ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに適した任意の原核細胞及び真核細胞が挙げられる。例示的な細胞としては、原核生物及び真核生物の細胞（単細胞もしくは多細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び上述した細胞に由来する細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含み、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。
【0141】
免疫応答：本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」とは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核などの免疫系の細胞が、抗原またはワクチンなどの刺激に対して応答することを指す。免疫応答は、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関与する身体の任意の細胞を含み得る。免疫応答としては、自然免疫応答及び／または適応免疫応答が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答を測定する方法は当技術分野において周知であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞など）の増殖及び／または活性、サイトカインもしくはケモカインの分泌、炎症、抗体産生などを測定することを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、本明細書に記載のアーマー化または非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後に観察される免疫応答を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後の免疫応答は、ＣＡＲ発現細胞の増殖の増加、ＣＡＲ発現細胞によるＩＦＮｇ産生の増加、ＣＡＲ発現細胞のＩＬ－２産生の増加、宿主免疫細胞の増殖の増加、宿主免疫細胞によるＩＦＮｇ産生の増加、宿主免疫細胞のＩＬ－２産生の増加、宿主抗原提示細胞による抗原提示の増加、宿主抗原提示細胞による共刺激の増加、内皮の活性化の増加、または免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ）の腫瘍ホーミングの増加のうちの１つ以上によって測定される。
【0142】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とは、多細胞生物内ではなく、人工環境で、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養下などで生じる事象を指す。
【0143】
ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、ヒト及びヒト以外の動物などの多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞ベースの系に関して、この用語は、生細胞内で発生する事象を指すために使用される場合がある（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系とは対照的に）。
【0144】
単離される：本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、（１）最初に生成される場合にそれが会合していた構成要素のうち少なくともいくつかと分離されている（天然において、及び／または実験設定のいずれでも）、及び／または（２）ヒトの介入によって設計、産生、調製、及び／または製造された物質及び／または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に会合した他の構成要素の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超とは分離されている場合がある。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度である。本明細書で使用される場合、物質が実質的に他の構成要素を含まない場合、その物質は「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、特定の他の構成要素、例えば、１つ以上の担体または賦形剤など（例えば、緩衝液、溶媒、水など）と組み合わされた後でも依然として「単離されている」か、または「純粋」とさえみなされる場合があり、そのような実施形態では、物質の単離パーセントまたは純度パーセントは、そのような担体または賦形剤を含めることなく算出される。一例を示すと、いくつかの実施形態では、天然のポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体ポリマーは、ａ）その起源または誘導の供給源によって、天然におけるその天然状態でポリマーに付随する構成要素の一部またはすべてと関連しない場合、ｂ）ポリマーが、天然においてそれを生成する種に由来する同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない場合、ｃ）天然においてポリマーを生成する種のものではない細胞または他の発現系に由来する構成要素によって発現されるか、またはさもなければそれらと関連する場合に「単離されている」とみなされる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、化学的に合成されるか、または天然においてポリペプチドを産生する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドであるとみなされる。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞に天然に付随する分子及び／または細胞成分から分離された「単離細胞」であり得る。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、１つ以上の精製技術に供されている細胞は、ａ）天然において細胞が会合し、及び／またはｂ）最初に産生された時に細胞が会合していた他の構成要素からその細胞が分離されている限り、「単離された」細胞であるとみなされ得る。
【0145】
リンカー：本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、２つ以上のポリペプチドまたは核酸を共有結合して互いに接続する官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を指す。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」とは、２つのタンパク質を一緒に結合する（例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインを結合する）ために使用される１つ以上のアミノ酸を指す。
【0146】
調節するまたはモジュレーター：本明細書で使用される場合、用語「調節する」または「モジュレーター」とは、関連する機能をプラスまたはマイナスに変化させる構成要素の能力を指す。例示的な調節には、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または約１００％の変化が含まれる。例えば、本明細書において、ＴＧＦβ受容体のシグナル伝達を変化させるかまたは阻害することができるＴＧＦＢシグナル伝達モジュレーターを提供する。当業者は、これが、ＴＧＦβＲのシグナル伝達を活性化するサイトカイン（すなわち、ＴＧＦβ）、または受容体自体（例えば、ＴＧＦβ抗体もしくはその断片、ＴＧＦＢＲ抗体もしくはその断片）のいずれかを結合することによって達成され得ることを理解するであろう。したがって、この用語は、ＴＧＦβに結合する分子とＴＧＦβＲに結合する分子の両方を包含する。一実施形態では、本開示のモジュレーターは、ＴＧＦβＲＩＩを介してＴＧＦβシグナル伝達を中和することができる。「中和する」とは、ＴＧＦβの存在がＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達に対して中立的な影響を与えるように、ＴＧＦβの正常なシグナル伝達効果が遮断されることを意味する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβモジュレーターは、宿主における免疫応答を改善する。
【0147】
核酸：本明細書で使用される場合、語句「核酸」とは、その最も広義にはオリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれる、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれる、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかとなる通り、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、それがホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それらを含むか、またはそれらからなり、「ペプチド核酸」は当技術分野で公知であり、ホスホジエステル結合の代わりに骨格内にペプチド結合を有し、これらは本発明の範囲内であるとみなされる。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、挿入塩基、及びこれらの組合せ）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸中の糖と比較した場合に１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的鋳型に基づく重合による酵素合成（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）、組換え細胞または系における再産生、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれ以上の残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は単鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の補体である、少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
【0148】
薬学的に許容されるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、１つ以上の治療用組成物の医薬送達に適した組成物及び製剤について記載している。一般に、担体の性質は、用いられている特定の投与方法に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的及び生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与する医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどを含有し得る。
【0149】
ポリペプチド：「ポリペプチド」は、一般的に言えば、ペプチド結合によって互いに結合される少なくとも２つの一連のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも３～５つのアミノ酸を含む場合があり、その各々は、少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合される。当業者は、ポリペプチドが「非天然」アミノ酸または他の実体を含む時もあり、それにもかかわらず、それらは任意でポリペプチド鎖内に組み込むことができると理解することになる。いくつかの実施形態では、用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの特定の機能クラス、例えば、抗体、キメラ抗原受容体、または共刺激ドメインポリペプチドなどを指すために使用される。そのような各クラスでは、本明細書は、クラス内の既知の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列に関するいくつかの例を提供し、及び／またはそれらは当技術分野によって認識され、いくつかの実施形態では、１つ以上のそのような既知のポリペプチドは、クラスの参照ポリペプチドである。そのような実施形態では、用語「ポリペプチド」とは、関連する参照ポリペプチドとの十分な配列相同性または同一性を示すクラスの任意のメンバーを指し、当業者は、それがクラス内に含まれるべきであると理解する。多くの実施形態では、代表的なクラスのメンバーはまた、参照ポリペプチドと顕著な活性を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、参照ポリペプチドとの配列相同性または同一性の全体的な程度を示し、それは少なくとも約３０～４０％であり、多くの場合に約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超もしくはそれを超え、及び／または多くの場合に９０％超もしくはさらに９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の非常に高い配列同一性を示す、少なくとも１つの領域（すなわち、多くの場合に特徴的な配列要素を含む、保存領域）を含む。そのような保存領域は通常、少なくとも３～４つ、多くの場合に最大で２０以上のアミノ酸を包含し、いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも一続きの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える連続アミノ酸を包含する。
【0150】
本発明の抗体及び抗原結合剤は、追加の保存的または非必須アミノ酸置換を有する場合があると理解されるが、これらはポリペプチド機能に実質的な影響を及ぼさない。特定の置換が許容されるか否か、すなわち、結合活性などの所望の生物学的特性に悪影響を与えないかは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ Ｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１３１０（１９９０）またはＰａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９（１９９５）に記載されるように決定され得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【0151】
予防：用語「予防」とは、本明細書で使用される場合、予防、疾患発現の回避、発症の遅延、及び／または特定の疾患、障害、もしくは病態（例えば、がん）の１つ以上の症状の頻度及び／または重症度の軽減を指す。いくつかの実施形態では、予防は、疾患、障害、または病態の１つ以上の症状の発生、頻度、及び／または強度における統計的に有意な減少が、疾患、障害、または病態に罹患しやすい集団で観察される場合、特定の疾患、障害、または病態を薬剤が「予防する」とみなされるように集団ベースで評価される。
【0152】
純度：本明細書で使用される場合、薬剤または実体が実質的に他の構成要素を含まない場合、それは「純粋」である。例えば、約９０％超の特定の薬剤または実体を含有する製剤は、通常、純粋な製剤であると考えられる。いくつかの実施形態では、薬剤または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％純粋である。
【0153】
組換え：本明細書で使用される場合、用語「組換え」とは、組換え手段によって設計、改変、調製、発現、作製、または単離されるポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるようなポリペプチド）、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現されるポリペプチド、組換えコンビナトリアルポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド、または選択された配列要素を互いにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離されるポリペプチドなどを指すことを意図する。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうち１つ以上が、天然に認められる。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素及び／またはそれらの組合せのうち１つ以上を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計する。いくつかの実施形態では、１つ以上のそのような選択された配列要素は、同じポリペプチド中には天然に存在しない複数（例えば、２つ以上）の既知の配列要素の組合せに由来する。
【0154】
参照：用語「参照」は、目的の薬剤、個体、集団、試料、配列、または値と比較する標準または対照薬剤、個体、集団、試料、配列、または値について記載するために、本明細書で多くの場合に使用される。いくつかの実施形態では、目的の薬剤、個体、集団、試料、配列、または値の試験または測定と実質的に同時に、参照の薬剤、個体、集団、試料、配列、または値を試験及び／または測定する。いくつかの実施形態では、参照薬剤、個体、集団、試料、配列、または値は、有形媒体に任意選択で具現化された、過去の参照である。一般的には、当業者によって理解されるように、目的の薬剤、個体、集団、試料、配列、または値を測定または特性評価するために利用される条件と同等の条件下で、参照の薬剤、個体、集団、試料、配列、または値を測定または特性評価する。
【0155】
単一ドメイン抗体：本明細書で使用される場合、用語「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」、「可変単一ドメイン」または「免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）」「単一重鎖可変ドメイン（ＶＨ）抗体」とは、標的抗原に結合する抗体の単一可変断片を指す。これらの用語は、本明細書では同じ意味で使用される。ｓｄＡｂは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する単一抗原結合ポリペプチドである。ｓｄＡｂは単独で、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対形成することなく抗原に結合することができる。いくつかの場合では、単一ドメイン抗体は、ラクダ科ＨＣＡｂから改変され、それらの重鎖可変ドメインは、「ＶＨＨ」と称される。いくつかのＶＨＨはまた、ナノボディとしても知られ得る。ラクダ科ｓｄＡｂは、既知の最小の抗原結合抗体断片の１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－８（１９９３）、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１６８－７３（１９９５）、Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ－Ｇｈａｓｓａｂｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３－２６（２０１３）を参照のこと）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端まで、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有し、構造中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、相補性決定領域１～３を指す。当技術分野で利用可能な標準的な技術に従ってラクダ科ＶＨＨドメインをヒト化してもよく、そのようなドメインは「ドメイン抗体」とみなされる。本明細書で使用される場合、ＶＨにはラクダ科のＶＨＨドメインが含まれ、ＶＨＨという用語は、重鎖のみを含むヒトまたはラクダ科起源のドメイン抗体を指すのに使用され得る。以下に説明するように、本発明の様々な態様のいくつかの実施形態は、軽鎖の非存在下でＴＧＦＢ抗原に結合する単一重鎖可変ドメイン抗体／免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインを含む結合剤に関する。
【0156】
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、ヒトを含む任意の哺乳類を意味する。本発明の特定の実施形態では、対象は、成人、青年、または乳幼児である。いくつかの実施形態では、用語「個体」または「患者」が使用され、それらは「対象」と同じ意味であることが意図されている。医薬組成物の投与及び／または子宮内での治療方法の実施もまた、本発明によって企図される。例えば、対象は、がん（例えば、胃腸起源の）、がん（細胞の少なくとも一部がＴＧＦβを発現する）の症状、またはがん（細胞の少なくとも一部がＴＧＦβを発現する）に対して素因を有する、患者（例えば、ヒト患者または動物患者）であり得る。本発明の用語「非ヒト動物」は、別段の注記がない限り、すべての非ヒト脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両性類、爬虫類などを含む。
【0157】
実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、目的となる特徴もしくは性質のすべてまたはほぼすべての範囲もしくは程度を表す定性的状態を指す。生物学分野における当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、あるとしてもめったに完全にまで至らないか及び／または完全性まで進まないかあるいは確かな結果に達しないまたはそれを回避しないものと理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に内在する完全性の欠如の可能性を表現するために使用される。
【0158】
治療剤：本明細書で使用される場合、用語「治療剤」とは、生物活性を有する薬剤（例えば、抗原結合剤）を指す。本用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質から作製された抽出物を示すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、治療剤は、抗がん剤または化学療法剤であってよい。本明細書で使用される場合、用語「抗がん剤」または「化学療法剤」とは、ヒトにおいて新生物、特に悪性（がん性）病変、例えば、がん腫、肉腫、リンパ腫、または白血病などの発症または進行を阻害する機能特性を有する薬剤を指す。転移または血管新生の阻害は、多くの場合、抗がん剤または化学療法剤の特性である。化学療法剤は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤であってよい。用語「細胞増殖抑制剤」とは、細胞増殖及び／または細胞の増殖を阻害または抑制する薬剤を指す。
【0159】
形質転換：本明細書で使用される場合、外来ＤＮＡが宿主細胞内に導入される任意のプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を使用して、自然条件下または人工条件下で起こり得る。形質転換は、外来核酸配列を原核生物または真核生物の宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に依存し得る。いくつかの実施形態では、特定の形質転換手法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、これとしては、ウイルス感染、エレクトロポレーション、交配、リポフェクションが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、「形質転換」細胞は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部としてのいずれかで複製可能という点で、安定に形質転換される。いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、導入された核酸を、限定的な期間にわたって一過性に発現する。
【0160】
トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦβ）：本明細書で使用する場合、用語「ＴＧＦ－β」、「ＴＧＦｂ」、「ＴＧＦβ」及び「トランスフォーミング成長因子－β」は、本明細書では同じ意味で使用され、前駆体及び成熟ＴＧＦ－βの会合型または非会合型複合体（「潜在型ＴＧＦ－β」）を含む、ヒト由来のＴＧＦ－βのいずれかの完全長の天然アミノ酸配列を有する分子のファミリーを指す。本明細書におけるそのようなＴＧＦ－βへの言及は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、及びＴＧＦ－β５、ならびにそれらの潜在的バージョンを含む現在同定されている形態のいずれか１つ、ならびに任意の既知のＴＧＦ－βの配列に由来し、その配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％相同であるポリペプチドを含む、将来同定されるヒトＴＧＦ－β種への言及であると理解されるであろう。特定の用語「ＴＧＦ－β１」、「ＴＧＦ－β２」、及び「ＴＧＦ－β３」、ならびに「ＴＧＦ－β４」及び「ＴＧＦ－β５」とは、文献、例えば、Ｄｅｒｙｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，前出、Ｓｅｙｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，前出、及びｄｅＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，前出で定義されているＴＧＦ－βを指す。用語「ＴＧＦ－β」とは、ヒトＴＧＦ－βをコードする遺伝子を指す。好ましいＴＧＦ－βは、天然配列のヒトＴＧＦ－βである。
【0161】
ＴＧＦ－βファミリーのメンバーは、分子の成熟部分に９個のシステイン残基を有し、成熟領域の他の既知のＴＧＦ－β配列と少なくとも６５％の相同性を共有し、同じ受容体をめぐって競合する可能性があるものとして定義される。さらに、それらはすべて、Ｎ末端付近の高い相同性領域を共有する、より大きな前駆体としてコードされていると考えられ、後でプロセシングによって除去される前駆体の部分に３つのシステイン残基が保存されていることを示している。さらに、ＴＧＦ－βは、４つまたは５つのアミノ酸を含むプロセシング部位を有するものと思われる。
【0162】
トランスフォーミング成長因子β受容体（ＴＧＦβＲ）：本明細書で使用される場合、用語「ＴＧＦ－ｂＲ」または「ＴＧＦ－ｂ受容体」または「ＴＧＦ－β受容体」または「ＴＧＦβＲ」とは、ＴＧＦβＲファミリーの３つのサブタイプ（すなわち、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＴＧＦβＲ３）のすべてを包含するために使用される。ＴＧＦβ受容体はセリン／スレオニンキナーゼ活性を特徴とし、ホモ二量体またはヘテロ二量体となり得るいくつかの異なるアイソフォームで存在する。
【0163】
ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターまたはＴＧＦβモジュレーター：本明細書で使用される場合、用語「ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーター」または「ＴＧＦβモジュレーター」とは、本明細書で同じ意味で使用される場合、ＴＧＦβシグナル伝達経路を調節することができる（例えば、阻害、遮断または中和作用を有する）分子（例えば、抗体またはその断片）を指し、これは、ＴＧＦβ自体に結合するか、または細胞上のＴＧＦβ受容体に結合し得る。いずれの場合でも、モジュレーターは、（例えば、サイトカイン（すなわち、ＴＧＦβ）自体に結合することによって）またはＴＧＦβの受容体に結合することによって、ＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害する。したがって、本用語は、ＴＧＦβに結合するモジュレーターとＴＧＦβ受容体に結合するモジュレーターの両方のタイプを包含する。本明細書に記載の様々な実施形態では、改変された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）中で、ＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターをキメラ抗原受容体と共に発現させる。そのようなＴＧＦβシグナル伝達経路モジュレーターを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を、本明細書ではＴＧＦβアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と称する。
【0164】
治療する、または治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」または「治療」とは、治療剤を、対象、例えば、患者に投与するか、または対象由来の単離組織もしくは細胞に、例えば、塗布し、これを対象へと戻すことによって投与することとして定義される。いくつかの実施形態では、治療剤はアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＴＧＦβモジュレーターを共発現する改変されたＣＡＲ－Ｔ細胞）である。治療は、障害、障害の症状または障害に対する素因、例えば、がんを治癒する、治す、軽減する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、緩和する、変化させる、修復する、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、軽減する（ｐａｌｌｉａｔｅ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）、またはこれに影響を及ぼすことであり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、治療は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の阻害、除去、もしくは死滅、またはさもなければ、細胞、例えば、異常細胞が障害、例えば、本明細書に記載されるような障害（例えば、がん）を媒介する能力の減少を引き起こすと考えられている。
【0165】
本明細書に記載の発明は、治療的、予防的、または予防的処置のために「有効量」で使用される。本明細書に記載のアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ及びＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを共発現する改変細胞）の治療有効量は、疾患（例えば、がん）の１つ以上の症状を改善もしくは軽減するか、または予防もしくは治癒するのに有効な量である。
【0166】
可変領域またはドメイン：本明細書で使用される場合、抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、一般的に、抗体の最も可変性の高い部分であり（同じクラスの他の抗体と比較して）、抗原結合部位を含む。重鎖のみ抗体は、単一の重鎖可変領域を有する。
【0167】
ベクター：本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、核酸分子が連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【発明を実施するための形態】
【0168】
本発明は、ＴＧＦβシグナル伝達を調節するポリペプチドでアーマー化された改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を使用して、がん及び病原体に対する免疫応答を増強するための方法及び組成物を提供する。本発明は、特定の方法、及び記載される実験条件に限定されないため、そのような方法及び条件は変動する場合がある。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される専門用語は、指示がない限り、特定の実施形態の記載のみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【0169】
ＴＧＦ－Ｂ／ＳＭＡＤシグナル伝達
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）は、もともと正常な線維芽細胞を足場非依存的な増殖が可能な細胞に形質転換する能力にちなんで名付けられた多機能サイトカインである。ＴＧＦ－βシグナル伝達は、増殖、分化、生存、遊走、及び上皮間葉転換などの多くの重要な細胞機能を制御する。それは、細胞外マトリックス形成、創傷治癒、胚発生、骨発生、造血、免疫応答及び炎症反応、ならびに悪性転換などの多様な生物学的プロセスを調節する。ＴＧＦ－βの調節不全は、先天異常、がん、慢性炎症、ならびに自己免疫疾患及び線維性疾患などの病理学的状態を引き起こす。
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）は、もともと正常な線維芽細胞を足場非依存的な増殖が可能な細胞に形質転換する能力にちなんで名付けられた多機能サイトカインである。ＴＧＦ－βシグナル伝達は、増殖、分化、生存、遊走、及び上皮間葉転換などの多くの重要な細胞機能を制御する。それは、細胞外マトリックス形成、創傷治癒、胚発生、骨発生、造血、免疫応答及び炎症反応、ならびに悪性転換などの多様な生物学的プロセスを調節する。ＴＧＦ－βの調節不全は、先天異常、がん、慢性炎症、ならびに自己免疫疾患及び線維性疾患などの病理学的状態を引き起こす。
【0170】
主に造血細胞及び腫瘍細胞によって産生されるＴＧＦ－βは、正常組織及び腫瘍組織の両方の起源の様々な細胞の増殖及び分化を調節、すなわち刺激または阻害することができ（Ｓｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：５３２（１９８６））、様々な間質成分の形成及び同化を刺激する。ＴＧＦ－βは、細胞の増殖及び分化、胚発生、細胞外マトリックスの形成、骨発生、創傷治癒、造血、ならびに免疫応答及び炎症反応など、多くの増殖性及び非増殖性の細胞プロセスに関与する。
【0171】
ＴＧＦ－βは、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の阻害、Ｂ細胞リンパ球生成及びκ軽鎖発現の抑制、造血の負の制御、腫瘍細胞上のＨＬＡ－ＤＲ発現の下方制御、ならびにＢ細胞増殖因子に応答した抗原活性化Ｂリンパ球の増殖の阻害などの免疫抑制活性も有する。多くのヒト腫瘍及び多くの腫瘍細胞株がＴＧＦ－βを産生するが、これは、これらの腫瘍が通常の免疫学的監視を回避する機構を有している可能性を示唆している。この負の免疫調節は、特定の形質転換細胞株が自己分泌的にＴＧＦ－βに応答する能力を失っていること、及びＴＧＦ－βが間質形成を刺激し、腫瘍の免疫監視を低下させるという観察と相まって、新生物の調節解除及び増殖の魅力的なモデルを示唆している。
【0172】
ＴＧＦ－βシグナル伝達は、健康な細胞とがんの制御の両方にとって重要であるため、ＴＧＦ－βを全身的に標的にすると、望ましくない副作用が生じ得る。特にがんに関しては、ＴＧＦ－βファミリーのメンバーは、腫瘍形成（血管形成を含む）及び転移に関連する多くの生物学的活性を有することが知られている。ＴＧＦ－βは、毛細血管内皮細胞や平滑筋細胞を含む多くの細胞型の増殖を阻害する。ＴＧＦ－βは、インテグリン発現（内皮細胞遊走に関与するα１β１、α２β１、及びαｖβ３）を下方制御する。インテグリンは、転移性細胞を含むすべての細胞の遊走に関与する。ＴＧＦ－βは、血管新生と転移の両方に必要なマトリックスメタロプロテイナーゼの発現を下方制御する。ＴＧＦ－βは、血管新生と転移に必要なプロテイナーゼカスケードを阻害するプラスミノーゲン活性化因子阻害因子を誘導する。ＴＧＦ－βは、正常細胞を誘導して形質転換細胞を阻害する。例えば、ＴＧＦ－βの調節解除が、がん及び線維症を含む様々な疾患の発症に関与していることを開示すると共に、がん治療薬、バイオマーカー／診断薬としてのＴＧＦ－βシグナル伝達阻害剤を評価するための理論的根拠、開発中の小分子阻害剤の構造、ならびにそれらの開発に適用されている標的創薬モデルを提示しているＹｉｎｇｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３（１２）：１０１１－１０２２（２００４）を参照されたい。
【0173】
本明細書で使用される場合、用語「ＴＧＦ－βシグナル伝達経路」は、ＴＧＦ－β及びＴＧＦ－β様リガンドに起因すると考えられる下流のシグナル伝達事象を記述するために使用される。例えば、あるシグナル伝達経路では、ＴＧＦ－βリガンドがＩＩ型ＴＧＦ－β受容体に結合して活性化する。ＩＩ型ＴＧＦ－β受容体は、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体を動員してヘテロ二量体を形成する。結果として生じるヘテロ二量体は、Ｉ型受容体のリン酸化を可能にし、それが今度はＳＭＡＤファミリーのタンパク質のメンバーをリン酸化して活性化させる。シグナル伝達カスケードが誘発され、これは当業者には周知であり、最終的には、細胞増殖、細胞分化、腫瘍形成、アポトーシス、及び細胞恒常性などに関与するメディエーターの発現が制御される。他のＴＧＦ－βシグナル伝達経路も、本明細書に記載の方法による操作のために企図される。
【0174】
ＴＧＦ－βシグナル伝達経路モジュレーター
本発明は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーター（例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチド、またはＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列）を含む免疫調節系を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦ－β受容体に結合すると細胞反応を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、細胞から分泌される。
本発明は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーター（例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチド、またはＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列）を含む免疫調節系を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦ－β受容体に結合すると細胞反応を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、細胞から分泌される。
【0175】
様々な実施形態において、本発明は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターと共にキメラ抗原受容体を発現する改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。そのようなモジュレーターは、ＴＧＦ－β自体またはＴＧＦ－β受容体に結合し得る。そのようなモジュレーターを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を、本明細書ではＴＧＦ－βアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と称する。
【0176】
抗ＴＧＦβ及び抗ＴＧＦβＲ２抗原結合分子
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ＴＧＦ－βに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦβＲ）（例えば、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２）に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ＴＧＦ－βに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦβＲ）（例えば、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２）に特異的に結合する。
【0177】
ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーター（例えば、抗ＴＧＦβ抗体分子または抗ＴＧＦβＲ抗体分子）は、本明細書に記載のＣＤＲまたは重鎖のすべて、または抗原結合サブセットを含み得る。可変領域を含む、本明細書に記載の抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ２抗原結合剤の例示的なアミノ酸配列を表１に示す。さらなる抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ２抗体は、米国特許第７，７２３，４８６号及び第９，７８３，６０４号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６００１７０２６Ａ１号及び第ＵＳ２０１８０１０５５９７号、第ＵＳ２０１９０１１９３８７号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２０１２０９３１２５Ａ１号、第ＷＯ２０１１／０１２６０９号、第ＷＯ２０１７／１４１２０８Ａ１号にも記載されており、これらのそれぞれの全体は、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載の免疫調節系において有用な抗原結合剤としては、抗原（例えば、ＴＧＦβＲエピトープ）と特異的に結合する、抗体、（Ｆａｂ’）２などの二価断片、Ｆａｂなどの一価断片、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0178】
いくつかの実施形態では、免疫調節系は、表１に示す配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーター（例えば、抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ２抗原結合剤）を含む。いくつかの実施形態では、免疫調節系は、表１に記載の抗体またはその断片の１つ以上のＣＤＲ配列を含むＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ－ｂシグナル伝達モジュレーターは、表１に示すＶＨ配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターのＶＨは、単一ドメイン抗体（ＶＨ）である。
【0179】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、リーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは単量体である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは二量体である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは三量体である。
【0180】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、ドメインをタンデムに接続するためのリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５９）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５９）を含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）を含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、表１に示すＶＬ配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＧＦβ抗原結合剤は、表１に示すＶＨ配列と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【0182】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、表１に示すｖＨ配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターは、表１に示すｖＨ配列と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターのＶＨ（例えば、単一ドメイン抗体）は、表１において少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるとするリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｖＨ抗ＴＧＦβ抗原結合剤（例えば、単一ドメイン抗体）は、表１に示すリーダー配列を含む。
【0184】
【表1-1】
【0185】
【表1-2】
【0186】
【表1-3】
【0187】
【表1-4】
【0188】
【表1-5】
【0189】
【表1-6】
【0190】
【表1-7】
【0191】
いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ抗原結合剤は抗体である。天然の哺乳類抗体の構造単位は、四量体が典型的である。各四量体は、２つのポリペプチド鎖対で構成され、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖及びλ軽鎖に分類され得る。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され得、それぞれ、抗体のアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖内において、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗ＴＧＦβ抗体分子の好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ免疫グロブリンであり、これは異なるγ重鎖を有する４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分類され得る。大半の治療用抗体が、ＩｇＧ１型のヒト、キメラ、またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体分子は、ＩｇＧ１アイソタイプを有する。
【0192】
各重鎖及び軽鎖対の可変領域は、抗原結合部位を形成する。したがって、インタクトなＩｇＧ抗体は、同一の２つの結合部位を有する。しかしながら、二機能性または二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有し、２つの異なる結合部位をもたらす人工的なハイブリッド構築物である。
【0193】
鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２本鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によってアラインされ、特異的エピトープとの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖の両方とも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）の定義に従う。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、重鎖（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び軽鎖（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）のそれぞれについて言及される。
【0194】
したがって、一実施形態では、抗体分子には以下の一方または両方が含まれる：
【0195】
（ａ）上記で参照したヒトハイブリドーマ、選択されたリンパ球、またはマウス抗体のうちの１つの１、２、３、または抗原結合数の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／またはＬＣＤＲ３）。実施形態では、ＣＤＲ（複数可）は、以下のようなＬＣＤＲ１～３の１つ以上またはすべてのアミノ酸配列を含み得る：ＬＣＤＲ１、または１～７個のアミノ酸が保存的に置換されている改変ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、または１つもしくは２つのアミノ酸が保存的に置換されている改変ＬＣＤＲ２）、あるいはＬＣＤＲ３、または１つもしくは２つのアミノ酸が保存的に置換されている改変ＬＣＤＲ３、ならびに
【0196】
（ｂ）上記で参照したヒトハイブリドーマ、選択されたリンパ球、またはマウス抗体のうちの１つの１、２、３、または抗原結合数の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／またはＨＣＤＲ３）。実施形態では、ＣＤＲ（複数可）は、以下のようなＨＣＤＲ１～３の１つ以上またはすべてのアミノ酸配列を含み得る：ＨＣＤＲ１、または１もしくは２個のアミノ酸が保存的に置換されている改変ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、または１つ～４つのアミノ酸が保存的に置換されている改変ＨＣＤＲ２、あるいはＨＣＤＲ３、または１つもしくは２つのアミノ酸が保存的に置換されている改変ＨＣＤＲ３。
【0197】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＧＦβ抗体分子または抗ＴＧＦβＲ（例えば抗ＴＧＦβＲ２）抗体分子は、ＴＧＦβを発現する細胞、例えば腫瘍細胞に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発することができる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを有する抗体は、Ｆｃ受容体と結合するそれらの能力ゆえに、抗体依存性細胞傷害能においてエフェクター機能を誘発するのに有用である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体は、Ｆｃ受容体と結合するそれらの能力が低いため、ＡＤＣＣ反応を最小限に抑えるのに有用である。関連する実施形態では、Ｆｃ領域に置換を導入し、あるいは、例えば改変された真核細胞株で増殖させることにより抗体のグリコシル化組成を変化させて、抗ＴＧＦβ抗体または抗ＴＧＦβＲ（例えば、抗ＴＧＦβＲ２）抗体が結合するＦｃ受容体の認識、結合、及び／または細胞傷害の媒介能力を増強することができる（例えば、米国特許第７，３１７，０９１号、同第５，６２４，８２１号、及びＷＯ００／４２０７２を含む公報、Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４（２００１）、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：４００５－４０１０（２００６）、Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１－１１７３（２００６）を参照のこと）。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片（例えば、ヒト起源の抗体、ヒト抗体）は、機能（例えば、エフェクター機能）を変化または調整するアミノ酸置換または置換えを含み得る。例えば、ヒト起源の定常領域（例えば、γ１定常領域、γ２定常領域）を設計して、補体活性化及び／またはＦｃ受容体結合を低下させることができる。（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６２４，８２１号（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第５，８３４，５９７号（Ｔｓｏ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと（その教示の全体が参照により本明細書に援用される））。好ましくは、そのようなアミノ酸置換または置換えを含有するヒト起源の定常領域のアミノ酸配列は、未変化のヒト起源定常領域のアミノ酸配列と全長にわたって少なくとも約９５％同一であり、より好ましくは、未変化のヒト起源定常領域のアミノ酸配列と全長にわたって少なくとも約９９％同一である。追加の抗ＴＧＦβ抗原結合分子は、米国特許第８，７８５，６００号（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）にさらに記載されており、その教示の全体が参照により本明細書に援用される。
【0198】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化パターンを調節することによってエフェクター機能を変化させることもできる。変化とは、抗体に認められる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。例えば、抗体のＦｃ領域に結合しているフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する、ＡＤＣＣ活性が増強した抗体が、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されている。米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照のこと。Ｇｌｙｃｏｆｉは、特定のグリコフォームの抗体を産生可能な酵母細胞株も開発した。
【0199】
さらにまたは代わりに、グリコシル化型が変化した抗体、例えば、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または二分化ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などを作製することができる。そのようなグリコシル化パターンの変化により、抗体のＡＤＣＣ能力が増加することが示されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を変化させた宿主細胞で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構を変化させた細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現するように改変した宿主細胞として使用することにより、グリコシル化を変化させた抗体を産生することができる。例えば、Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．によるＥＰ１，１７６，１９５には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載されており、この細胞株はフコシルトランスフェラーゼをコードするため、そのような細胞株で発現する抗体は、低フコシル化を示す。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合させる能力が低下しており、さらにその宿主細胞で発現する抗体の低フコシル化を生じさせるバリアントＣＨＯ細胞株のＬｅｃ１３細胞について記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照のこと）。Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、改変された細胞株で発現する抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分化ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように改変された細胞株について記載されている（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照のこと）。
【0200】
ヒト化抗体はまた、ＣＤＲ移植アプローチを使用して作製することもできる。そのようなヒト化抗体の生成技術は、当技術分野で公知である。一般的に、ヒト化抗体は、ＴＧＦβに結合する抗体の可変重鎖配列及び可変軽鎖配列をコードする核酸配列を取得し、可変重鎖配列及び可変軽鎖配列中の相補性決定領域、すなわち「ＣＤＲ」を同定し、ＣＤＲ核酸配列をヒトフレームワーク核酸配列上に移植することによって産生される。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び同第５，２２５，５３９号を参照のこと）。ＣＤＲ及びフレームワーク残基の位置は、決定することができる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照のこと）。
【0201】
いくつかの実施形態では、本発明の免疫調節系は、表１に記載の抗体分子由来ＣＤＲを含む抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ抗体分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法で使用するために、ＴＧＦβまたはＴＧＦβＲを認識する分子に表１の配列を組み込むことができる（例えば、免疫調節系、免疫応答性細胞、またはそれらを含む治療方法）。選択されるヒトフレームワークは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適したもの、すなわち、免疫原性を示さないものを意味する。例えば、そのような決定は、そのような抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用及びアミノ酸類似性の研究を含む以前の経験によって行われ得る。好適なフレームワーク領域は、ドナー抗体、例えば、抗ＴＧＦβ抗体分子の等価部分（例えば、フレームワーク領域）のアミノ酸配列内において、フレームワーク領域の長さにわたって少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するヒト起源の抗体から選択され得る。アミノ酸配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗなどの好適なアミノ酸配列アラインメントアルゴリズムを使用し、デフォルトパラメータを使用して決定され得る。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０（１９９４）。）
【0202】
ヒト化されているクローン化抗体のＣＤＲ及びＦＲが同定されると、ＣＤＲをコードするアミノ酸配列が同定され、対応する核酸配列が、選択されたヒトＦＲ上に移植される。これは、既知のプライマー及びリンカーを使用して行うことができ、その選択は当技術分野で公知である。特定のヒト抗体に関するすべてのＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えてもよく、またはＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置き換えてもよい。ヒト化抗体と所定の抗原との結合に必要なＣＤＲの数を置き換えることだけが必要である。ＣＤＲを、選択されたヒトＦＲ上に移植した後、得られる「ヒト化」可変重鎖及び可変軽鎖配列を発現させ、ＴＧＦβまたはＴＧＦβＲに結合するヒト化Ｆｖまたはヒト化抗体を産生する。好ましくは、ＣＤＲ移植（例えば、ヒト化）抗体は、ドナー抗体の親和性と同様の、実質的に同じ、またはより良好な親和性でＴＧＦβまたはＴＧＦβＲと結合する。通常、ヒト化可変重鎖及び軽鎖配列を、ヒト定常ドメイン配列との融合タンパク質として発現させるため、ＴＧＦβに結合するインタクトな抗体が得られる。しかしながら、定常配列を含有しないヒト化Ｆｖ抗体を産生することができる。
【0203】
特定のアミノ酸が置換、欠失または付加されているヒト化抗体もまた、本発明の範囲内である。特に、ヒト化抗体は、抗原への結合を改善するなどのために、フレームワーク領域内にアミノ酸置換を有し得る。例えば、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナーアミノ酸で置き換えることができる。置換の位置としては、ＣＤＲに隣接するか、またはＣＤＲと相互作用できるアミノ酸残基が挙げられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号または同第５，８５９，２０５号を参照のこと）。アクセプターフレームワークは、成熟ヒト抗体フレームワーク配列またはコンセンサス配列であり得る。本明細書で使用される場合、用語「コンセンサス配列」とは、最も頻繁に認められる配列、または関連ファミリーメンバー間の領域内における配列の各位置で最も一般的な残基から考案された配列を指す。ヒト可変領域の異なるサブグループのコンセンサス配列を含む、多数のヒト抗体コンセンサス配列が利用可能である（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベース及びそのアプリケーションは、例えば、米国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．のＩｇＢＬＡＳＴによってオンラインで自由に入手可能である（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：２０５－２０６（２００１）も参照のこと）。
【0204】
特定の実施形態では、ＴＧＦβまたはＴＧＦβＲ抗体分子は、ヒト抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ ＩｇＧ１抗体である。そのような抗体はＴＧＦβまたはＴＧＦβＲ分子に対して所望の結合を有するため、そのような抗体のいずれか１つが容易にアイソタイプスイッチし、例えば、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを生成し得るが、同じ可変領域（抗体の特異性及び親和性をある程度定義する）を依然として有している。したがって、上述のような所望の「構造」属性を満たす抗体候補を生成する場合、それらは一般に、アイソタイプスイッチングによって所望される少なくとも特定の追加の「機能」属性を有し得る。
【0205】
単鎖抗体
単鎖抗体は、その由来となる抗体全体の定常ドメインの一部またはすべてを欠いている。したがって、単鎖抗体は、抗体全体を使用することに付随する問題のいくつかを克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子との間の特定の望ましくない相互作用を起こさない傾向にある。さらに、単鎖抗体は抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも透過性が高いため、単鎖抗体は、より効率的に標的の抗原結合部位に局在化し、結合することができる。さらに、単鎖抗体のサイズは比較的小さいため、抗体全体に比べてレシピエントに望ましくない免疫応答を引き起こす可能性が低くなる。
単鎖抗体は、その由来となる抗体全体の定常ドメインの一部またはすべてを欠いている。したがって、単鎖抗体は、抗体全体を使用することに付随する問題のいくつかを克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子との間の特定の望ましくない相互作用を起こさない傾向にある。さらに、単鎖抗体は抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも透過性が高いため、単鎖抗体は、より効率的に標的の抗原結合部位に局在化し、結合することができる。さらに、単鎖抗体のサイズは比較的小さいため、抗体全体に比べてレシピエントに望ましくない免疫応答を引き起こす可能性が低くなる。
【0206】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦβに特異的に結合する単鎖抗原結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦ－Ｂ受容体（ＴＧＦβＲ）（例えば、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２）に特異的に結合する単鎖抗原結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【0207】
複数の単鎖抗体（各単鎖は、第１のペプチドリンカーによって共有結合した１つのＶＨドメイン及び１つのＶＬドメインを有する）は、少なくとも１つ以上のペプチドリンカーによって共有結合して、単一特異性または多重特異性であり得る多価単鎖抗体を形成することができる。多価単鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片及び可変重鎖断片を含み、ペプチドリンカーによって少なくとも１つの他の鎖と連結する。ペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸残基からなる。リンカーアミノ酸残基の最大数はおよそ１００である。
【0208】
２つの単鎖抗体を組み合わせて、二価二量体としても知られるダイアボディを形成することができる。ダイアボディは、２本の鎖と２つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であり得る。ダイアボディの各鎖には、ＶＬドメインに接続されたＶＨドメインが含まれている。これらのドメインは、同じ鎖上のドメイン間の対形成を防ぐのに十分な短いリンカーで接続されているため、異なる鎖上の相補的ドメイン間の対形成が促進され、２つの抗原結合部位が再形成される。
【0209】
３つの単鎖抗体を組み合わせて、三価三量体としても知られるトリアボディを形成することができる。トリアボディは、ＶＬまたはＶＨドメインのアミノ酸末端をＶＬまたはＶＨドメインのカルボキシル末端に直接融合して、すなわちリンカー配列を使用せずに構築される。トリアボディは、３つのＦｖヘッド部を有し、これらのポリペプチドは、環状に頭部から尾部へ向かって配置されている。トリアボディの考えられる立体構造は平面状であり、３つの結合部位が互いに１２０度の角度で平面内に位置する。トリアボディは、単一特異性、二重特異性、または三重特異性であり得る。
【0210】
単一ドメイン抗体
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体抗体可変ドメインを有することにより、従来の４鎖抗体とは異なる。例えば、ラクダ科動物及びサメは、重鎖のみの抗体（ＨｃＡｂ）という名称のｓｄＡｂを産生し、これは軽鎖を天然に欠いている。ラクダ科の重鎖のみ抗体の各アームにおける抗原結合断片は、単一重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有し、これは軽鎖の支援なしに抗原に対して高い親和性を有し得る。ラクダ科ＶＨＨは、およそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合断片として既知である。
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体抗体可変ドメインを有することにより、従来の４鎖抗体とは異なる。例えば、ラクダ科動物及びサメは、重鎖のみの抗体（ＨｃＡｂ）という名称のｓｄＡｂを産生し、これは軽鎖を天然に欠いている。ラクダ科の重鎖のみ抗体の各アームにおける抗原結合断片は、単一重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有し、これは軽鎖の支援なしに抗原に対して高い親和性を有し得る。ラクダ科ＶＨＨは、およそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合断片として既知である。
【0211】
本出願の一態様は、ヒトＴＧＦβＲ２などのＴＧＦβＲに特異的に結合する単離された単一ドメイン抗体（本明細書では「抗ＴＧＦβＲ ｓｄＡｂ」と称される）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβＲ ｓｄＡｂは、ＴＧＦβ活性を調節する。いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβ ｓｄＡｂはアンタゴニスト抗体である。本明細書に記載される抗ＴＧＦβＲ ｓｄＡｂのいずれか１つに由来する抗原結合断片、及び本明細書に記載される抗ＴＧＦβＲ ｓｄＡｂのいずれか１つを含む抗原結合タンパク質を、さらに提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβＲ ｓｄＡｂは、表１に示す１つ、２つ、及び／または３つのＣＤＲ配列を含む。例示的な抗ＴＧＦβＲ ｓｄＡｂを表１に示す。
【0212】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列の一部またはすべて、すなわち、重鎖を、別の抗原結合剤、例えば、ＣＤＲ移植抗体分子、ヒト化抗体分子、またはキメラ抗体分子に使用することができる。実施形態は、ＴＧＦβへの結合を可能にするのに十分なＣＤＲ、例えば、上述した重鎖可変領域の１つに由来する３つすべてのＣＤＲを含む抗体分子を含む。
【0213】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ、例えばすべてのＨＣＤＲを、ヒトまたはヒト由来のフレームワーク領域（複数可）に埋め込む。ヒトフレームワーク領域の例としては、ヒト生殖細胞系フレームワーク配列、親和性成熟した（ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで）ヒト生殖細胞系配列、または合成ヒト配列、例えば、コンセンサス配列が挙げられる。一実施形態では、重鎖フレームワークは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２フレームワークである。
【0214】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦβモジュレーターは、表１に示す重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβ抗原結合剤は、単一ドメイン重鎖のみ抗体（例えば、免疫グロブリン軽鎖を含まない抗原結合剤）である。
【0215】
ｉｎ ｖｉｖｏ治療または診断用途のための抗体断片は、それらの血清半減期を改善する修飾から恩恵を受けることができる。抗体のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の増加が意図される好適な有機部分としては、親水性ポリマー基（例えば、直鎖もしくは分岐ポリマー（例えば、ポリアルカングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコールなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド及びポリビニルピロリドン）、脂肪酸基（例えば、モノカルボン酸もしくはジカルボン酸）、脂肪酸エステル基、脂質基（例えば、ジアシルグリセロール基、スフィンゴ脂質基（例えば、セラミジル））またはリン脂質基（例えば、ホスファチジルエタノールアミン基）から選択される１つ、２つまたはそれを超える直鎖または分岐鎖部分が挙げられ得る。好ましくは、有機部分によって、得られる免疫複合体の機能が非複合化抗体部分と比較して損なわれない（例えば、抗原結合親和性を低下させない）所定の部位に、有機部分を結合させる。有機部分は、約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａ、好ましくは約２０００、５０００、１０，０００、または２０，０００Ｄａの分子量を有し得る。ポリペプチド、例えば、抗体を有機部分で修飾するための例及び方法は、例えば、米国特許第４，１７９，３３７号及び同第５，６１２，４６０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０６０５８号及び同第ＷＯ００／２６２５６号、ならびに米国特許出願公開第２００３００２６８０５号に見出され得る。
【0216】
ＴＧＦβＲ細胞外ドメイン
本明細書に記載の免疫調節系での使用が企図されるＴＧＦ－β受容体は、アクチビン様キナーゼファミリー（ＡＬＫ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリー、結節性ファミリー、増殖分化因子ファミリー（ＧＤＦ）、ならびに受容体のＴＧＦ－β受容体ファミリー由来のものを含む任意のＴＧＦ－β受容体であり得る。ＴＧＦ－β受容体は、細胞内の様々な増殖及び分化経路に影響を与えるセリン／スレオニンキナーゼ受容体である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２）の改変された組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫調節系に有用なＴＧＦ－β受容体は、ＩＩ型ＴＧＦ－β受容体（例えば、ＴＧＦ－βＲ２）である。
本明細書に記載の免疫調節系での使用が企図されるＴＧＦ－β受容体は、アクチビン様キナーゼファミリー（ＡＬＫ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリー、結節性ファミリー、増殖分化因子ファミリー（ＧＤＦ）、ならびに受容体のＴＧＦ－β受容体ファミリー由来のものを含む任意のＴＧＦ－β受容体であり得る。ＴＧＦ－β受容体は、細胞内の様々な増殖及び分化経路に影響を与えるセリン／スレオニンキナーゼ受容体である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２）の改変された組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫調節系に有用なＴＧＦ－β受容体は、ＩＩ型ＴＧＦ－β受容体（例えば、ＴＧＦ－βＲ２）である。
【0217】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβモジュレーターは、表２に示すＴＧＦβＲを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβモジュレーターは、表２に示す配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0218】
【表2-1】
【0219】
【表2-2】
【0220】
キメラ抗原受容体
いくつかの態様では、本発明は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーター（例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチド、またはＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列）及び目的の抗原に結合することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫調節系を提供する。ＣＡＲは、３つの必須ユニット：（１）細胞外抗原結合モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、及び（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフを含むハイブリッド分子である（Ｌｏｎｇ Ａ Ｈ，Ｈａｓｏ Ｗ Ｍ，Ｏｒｅｎｔａｓ Ｒ Ｊ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３；２（４）：ｅ２３６２１ いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチドまたはリーダーペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び／またはヒンジドメイン、共刺激ドメイン、ならびに細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは「第１世代ＣＡＲ」であり、これには、例えば、抗原結合時にＣＤ３ζシグナルのみを提供するＣＡＲが含まれ、「第２世代」ＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するＣＡＲが含まれる。「第３世代」ＣＡＲには、複数の共刺激（ＣＤ２８及びＣＤ１３７）ならびに活性化（ＣＤ３）を提供するＣＡＲが含まれる。様々な実施形態において、ＣＡＲは、抗原に対して高い親和性または結合活性を有するように選択される。
いくつかの態様では、本発明は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーター（例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチド、またはＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列）及び目的の抗原に結合することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫調節系を提供する。ＣＡＲは、３つの必須ユニット：（１）細胞外抗原結合モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、及び（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフを含むハイブリッド分子である（Ｌｏｎｇ Ａ Ｈ，Ｈａｓｏ Ｗ Ｍ，Ｏｒｅｎｔａｓ Ｒ Ｊ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３；２（４）：ｅ２３６２１ いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチドまたはリーダーペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び／またはヒンジドメイン、共刺激ドメイン、ならびに細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは「第１世代ＣＡＲ」であり、これには、例えば、抗原結合時にＣＤ３ζシグナルのみを提供するＣＡＲが含まれ、「第２世代」ＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するＣＡＲが含まれる。「第３世代」ＣＡＲには、複数の共刺激（ＣＤ２８及びＣＤ１３７）ならびに活性化（ＣＤ３）を提供するＣＡＲが含まれる。様々な実施形態において、ＣＡＲは、抗原に対して高い親和性または結合活性を有するように選択される。
【0221】
ＣＡＲの抗原結合モチーフは一般に、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、すなわち、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最小結合ドメインまたは単一ドメイン抗体の後に形成される（例えば、ＷＯ２０１８／０２８６４７Ａ１）。受容体リガンド（すなわち、ＩＬ－１３が腫瘍発現ＩＬ－１３受容体と結合するように設計されている）、インタクトな免疫受容体、ライブラリ由来のペプチド、及び自然免疫系エフェクター分子（ＮＫＧ２Ｄなど）などの代替抗原結合モチーフも設計されている。ＣＡＲ発現のための代替の細胞標的（ＮＫ細胞またはγδＴ細胞など）も開発中である（Ｂｒｏｗｎ Ｃ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２；１８（８）：２１９９－２０９；Ｌｅｈｎｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（２）：ｅ３１２１０）。
【0222】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは単鎖可変断片である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは単鎖ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルまたはリーダーペプチド、ｖＨ、ＣＤ２８膜貫通及びヒンジ、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。
【0223】
ＣＡＲの連結モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定した構造ドメインとするか、または拡張された柔軟なリンカーとなるように設計することができる。構造モチーフ、例えば、ＩｇＧ定常ドメインに由来する構造モチーフを使用して、Ｔ細胞原形質膜表面から離れるようにＳｃＦｖ結合ドメインを拡張することができる。これは、結合ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近接している一部の腫瘍標的にとって重要な場合がある（ジシアロガングリオシドＧＤ２に対するものなど、Ｏｒｅｎｔａｓ ｅｔ ａｌ．、未発表の観察結果）。今日まで、ＣＡＲに使用されるシグナル伝達モチーフが常にＣＤ３－ζ鎖を含むのは、そのコアモチーフがＴ細胞活性化の重要なシグナルだからである。最初に報告された第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達モチーフを含有する第３世代ＣＡＲでも同様に使用された（Ｚｈａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３（９）：５５６３－７４）。新規技術の出現によって、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体に連結したビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８からの古典的な「シグナル２」の存在は、もはやＣＡＲ自体によってコードされる必要がなくなった。ビーズ活性化を使用した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは第３世代ベクターが第２世代ベクターよりも優れていなかったことが判明し、それらは白血病のマウスモデルでは第２世代ベクターよりも明らかな利益はなかった（Ｈａｓｏ Ｗ，Ｌｅｅ Ｄ Ｗ，Ｓｈａｈ Ｎ Ｎ，Ｓｔｅｔｌｅｒ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ，Ｙｕａｎ Ｃ Ｍ，Ｐａｓｔａｎ Ｉ Ｈ，Ｄｉｍｉｔｒｏｖ Ｄ Ｓ，Ｍｏｒｇａｎ Ｒ Ａ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ Ｄ Ｊ，Ｂａｒｒｅｔｔ Ｄ Ｍ，Ｗａｙｎｅ Ａ Ｓ，Ｍａｃｋａｌｌ Ｃ Ｌ，Ｏｒｅｎｔａｓ Ｒ Ｊ．Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（７）：１１６５－７４、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ Ｊ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９－２０）。これは、第２世代ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ（Ｌｅｅ Ｄ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌａ．；Ｄｅｃ．７－１０，２０１３）及びＣＤ１３７／ＣＤ３－ζシグナル伝達型（Ｐｏｒｔｅｒ Ｄ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１；３６５（８）：７２５－３３）におけるＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床的成功によって裏付けられている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞において重要な持続シグナルを提供できる（Ｙｖｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１５（１８）：５８５２－６０）。同様に重要なのは、ＣＡＲ Ｔ細胞集団を培養した培養条件である。
【0224】
ＣＡＲの特徴としては、Ｔ細胞の特異性及び反応性をＭＨＣに拘束されない手法で選択された標的に再誘導するそれらの能力、ならびにモノクローナル抗体の抗原結合特性を利用することが挙げられる。非ＭＨＣ拘束性の抗原認識により、抗原プロセシングに依存しない抗原認識能力が、ＣＡＲを発現するＴ細胞に付与されるため、腫瘍エスケープの主要な機構が回避される。さらに、Ｔ細胞において発現する場合、ＣＡＲは、利点として、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖及びβ鎖と二量体化することがない。
【0225】
細胞外ドメイン
本明細書に記載されるように、ＣＡＲは、別の方法では抗原結合ドメインまたは部分と称される標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、リガンドの種類及び数によって異なり、これにより、標的細胞の表面が規定される。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態（例えば、がん）と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンド（例えば、がん抗原）を認識するように選択してもよい。したがって、ＣＡＲの抗原結合ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するＣＡＲが挙げられる。
本明細書に記載されるように、ＣＡＲは、別の方法では抗原結合ドメインまたは部分と称される標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、リガンドの種類及び数によって異なり、これにより、標的細胞の表面が規定される。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態（例えば、がん）と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンド（例えば、がん抗原）を認識するように選択してもよい。したがって、ＣＡＲの抗原結合ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するＣＡＲが挙げられる。
【0226】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、がん抗原に特異的に結合する抗原結合剤を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に結合する。任意の腫瘍抗原（抗原ペプチド）を、本明細書に記載の腫瘍関連の実施形態において使用することができる。抗原の供給源には、がんタンパク質が含まれるが、これに限定されない。抗原は、ペプチドとして、またはインタクトなタンパク質もしくはその一部として発現させることができる。インタクトなタンパク質またはその一部は、天然の、または突然変異誘発されたものであり得る。腫瘍抗原の非限定的な例としては、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４（ｅｒｂ－Ｂ２，３，４）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＩＴＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒｃｘ２）、ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ，１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ムチン１（ＭＵＣ１）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳ０－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＫ７ ＲＯＲ１、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、及びウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、ＢＣＭＡ、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ ＣＣＲ４、ＣＤ５、ＣＤ３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＩＭ－３、インテグリンＢ７、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＣＤ７０、Ｔｉｍ３、ＣＬＥＣ１２Ａ、及びＥＲＢＢが挙げられる。
【0227】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ポリペプチドに結合する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒトＣＤ１９ポリペプチドに結合する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表３に示す配列を含む。
【0228】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＧＣＣポリペプチドに結合する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒトＧＣＣポリペプチドに結合する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＧＣＣタンパク質の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態では、抗ＧＣＣ ＣＡＲは、表３に示す配列を含む。
【0229】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、メソセリンポリペプチドに結合する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒトメソセリンポリペプチドに結合する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、メソセリンタンパク質の細胞外ドメインに結合する。
【0230】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、例えば免疫不全の対象における病原体感染または他の感染症の治療及び／または予防に使用するために、病原体抗原に結合する。病原体の非限定的な例としては、疾患を引き起こす可能性のあるウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び原生動物が挙げられる。
【0231】
ウイルスの非限定的な例としては、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１（ＨＤＴＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶＥ、もしくはＨＴＬＶ－ＩＩＥＬＡＶ、またはＨＩＶ－ＩＩＩとも呼ばれる）、及びＨＩＶ－ＬＰなどの他の分離株、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）、コロノウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブンガウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、及びナイラウイルス）、アリーナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オービウイルス、及びロタウイルス）、ビルナウイルス科ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、及びイリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）、ならびに未分類ウイルス（例えば、Ｄ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられている）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝体内感染、クラス２＝非経口感染（すなわちＣ型肝炎））、ノーウォークウイルス及び関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられる。
【0232】
細菌の非限定的な例としては、Ｐａｓｔｅｕｒ ｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【0233】
特定の実施形態では、病原体抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である。
【0234】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５９）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５９）を含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）を含む。
【0235】
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、二重または多重特異性抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、単離ＣＤＲまたはそれらのセット、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ラクダ抗体、マスク抗体、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖、タンデムダイアボディ、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ナノボディ、ｈｕｍａｂｏｄｙ、ミニボディ、ＢｉＴＥ、アンキリンリピートタンパク質、ＤＡＲＰＩＮ、アビマー、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ、Ａｆｆｉｌｉｎ、トランスボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＴｒｉｍｅｒＸ、マイクロタンパク質、Ｆｙｎｏｍｅｒ、センチリン、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ、またはそれらの断片を含む。
【0236】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、
【0237】
膜貫通ドメイン
本明細書に記載されるように、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに融合した１つ以上の膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然の場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
本明細書に記載されるように、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに融合した１つ以上の膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然の場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
【0238】
本明細書に記載されるＣＡＲにおける特定の用途の膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成によるものであってもよく、その場合、それは主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に結合を形成する場合がある。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリン二重リンカーまたは三重アラニンリンカーである。
【0239】
いくつかの実施形態では、上記の膜貫通ドメインに加えて、ＣＡＲのドメインのうちの１つと天然に会合する膜貫通ドメインを使用する。いくつかの実施形態では、そのようなドメインと、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を避けて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインをアミノ酸置換によって選択することができる。
【0240】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４２）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３個の修飾（例えば、置換）、ただし２０、１０、もしくは５個以下の修飾（例えば、置換）を有する配列、または配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。
【0241】
ＣＡＲでは、ヒンジドメインとも称されるスペーサードメインが、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、膜貫通ドメインを細胞外ドメインと、及び／または膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。
【0242】
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合、エフェクター分子または検出可能マーカーと抗体または抗原結合断片との間の距離が増加するように、リンカーのサイズを増加させるスペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは当業者に公知であり、それらとしては、米国特許第７，９６４，５６６号、同第７，４９８，２９８号、同第６，８８４，８６９号、同第６，３２３，３１５号、同第６，２３９，１０４号、同第６，０３４，０６５号、同第５，７８０，５８８号、同第５，６６５，８６０号、同第５，６６３，１４９号、同第５，６３５，４８３号、同第５，５９９，９０２号、同第５，５５４，７２５号、同第５，５３０，０９７号、同第５，５２１，２８４号、同第５，５０４，１９１号、同第５，４１０，０２４号、同第５，１３８，０３６号、同第５，０７６，９７３号、同第４，９８６，９８８号、同第４，９７８，７４４号、同第４，８７９，２７８号、同第４，８１６，４４４号、及び同第４，４８６，４１４号に加えて、米国特許公開第２０１１０２１２０８８号及び同第２０１１００７０２４８号（その各々の全体が参照により本明細書に援用される）に列挙されるものが挙げられる。
【0243】
スペーサードメインは、ＣＡＲと抗原との結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を増強する配列を有することが好ましい。結合を促進することが期待されるアミノ酸の例としては、荷電アミノ酸であるシステイン、ならびに潜在的なグリコシル化部位のセリン及びスレオニンが挙げられ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。
【0244】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４１）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの修飾（例えば、置換）を有するが、２０、１０もしくは５つ以下の修飾（例えば、置換）を有する配列または配列番号４１のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
【0245】
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインと膜貫通ドメインは、同じ分子に由来する。他の実施形態では、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインは、異なる分子に由来する（例えば、ＣＤ２８に融合したＣＤ８）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４３）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列の少なくとも１、２、または３個の修飾（例えば、置換）、ただし２０、１０、または５個以下の修飾（例えば、置換）を有する配列を含む。
【0246】
細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を細胞に実施するように促すタンパク質の一部を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用する限り、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分をインタクトな鎖の代わりに使用してもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を細胞に実施するように促すタンパク質の一部を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用する限り、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分をインタクトな鎖の代わりに使用してもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
【0247】
ＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体の結合後、シグナル伝達を開始するように協働して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共受容体の細胞質配列に加えて、同じ機能的能力を有する、それらの配列及び任意の合成配列の任意の誘導体またはバリアントが挙げられる。ＴＣＲのみによって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次または共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：すなわち、ＴＣＲによって抗原依存性一次活性化を開始する配列（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的手法で作用し、二次または共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
【0248】
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的様式、または阻害的様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激的様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有する場合がある。本明細書に開示されるＣＡＲにおいて特定の用途を有するＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲζ（ＣＤ３ζ）、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。ＩＴＡＭの特定の非限定的な例としては、ＣＤ３．ζ．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４、Ｆｃ．ε．ＲＩ．γ．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、Ｆｃ．ε．ＲＩ．β．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３．γ．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３．δ．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３．ε．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、００２２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、及びＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するものと同じ機能を有するそれらのバリアントが挙げられる。本明細書に記載されるＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、ＣＡＲ内の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
【0249】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、またはＣＡＲとの関連において有用な任意の他の、所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。そのような共刺激分子の特定の非限定的な例としては、ＣＤ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８．α．（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７、及びＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するものと同じ機能を有するそれらのバリアントが挙げられる。したがって、本明細書の開示は、共刺激シグナル伝達エレメントとして主に４－１ＢＢによって例示されるが、他の共刺激エレメントも本開示の範囲内である。
【0250】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結させてよい。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、結合を形成する場合がある。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリン二重リンカーまたは三重アラニンリンカーである。
【0251】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号４４）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0252】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計する。
【0253】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、１つ以上の改変された免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するＣＤ３ζを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、「１ＸＸ」と命名された、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のうちの１番目に非改変型ＩＴＡＭ、ならびに２番目及び３番目に改変されたＩＴＡＭを有するＣＤ３ζを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号４５）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0254】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、天然ＩＴＡＭ１、天然ＢＲＳ１、天然ＢＲＳ２、天然ＢＲＳ３、２つの機能喪失変異を有するＩＴＡＭ２バリアント、及び２つの機能喪失変異を有するＩＴＡＭ３バリアントを含む修飾ＣＤ３ｚポリペプチド（例えば、修飾ヒトＣＤ３ｚポリペプチド）、ならびにＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８ポリペプチド）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0255】
別の実施形態では、細胞内ドメインを、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインを、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。
【0256】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインを、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。
【0257】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、表３に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0258】
【表3-1】
【0259】
【表3-2】
【0260】
【表3-3】
【0261】
【表3-4】
【0262】
【表3-5】
【0263】
ＣＡＲの機能的特徴
本明細書に開示されるＣＡＲの機能部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能部分」とは、ＣＡＲに関連して使用される場合、本明細書に開示されるＣＡＲのうちの１つ以上の任意の部分または断片を指し、その部分または断片は、それが一部となっているＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物活性を保持している。機能部分は、例えば、親ＣＡＲと同様の程度、同程度、またはより高い程度で標的細胞を認識するか、または疾患を検出、治療、もしくは予防する能力を保持するＣＡＲの部分を包含する。親ＣＡＲに関連して、機能部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含み得る。
本明細書に開示されるＣＡＲの機能部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能部分」とは、ＣＡＲに関連して使用される場合、本明細書に開示されるＣＡＲのうちの１つ以上の任意の部分または断片を指し、その部分または断片は、それが一部となっているＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物活性を保持している。機能部分は、例えば、親ＣＡＲと同様の程度、同程度、またはより高い程度で標的細胞を認識するか、または疾患を検出、治療、もしくは予防する能力を保持するＣＡＲの部分を包含する。親ＣＡＲに関連して、機能部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含み得る。
【0264】
機能部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または両方の末端に追加のアミノ酸を含み得、その追加のアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列には認められないアミノ酸である。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能部分の生物学的機能、例えば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの治療または予防などを妨害しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＣＡＲの生物活性と比較した場合に、生物活性を増強する。
【0265】
本明細書に開示されるＣＡＲの機能的バリアントは、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用される場合、親ＣＡＲと実質的または有意な配列同一性または類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、その機能的バリアントは、そのバリアントであるＣＡＲの生物活性を保持している。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと同様の程度、同程度、またはより高い程度で標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関連して、機能的バリアントは、例えば、アミノ酸配列において親ＣＡＲと少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％、またはそれ以上同一であり得る。
【0266】
機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいはまたはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。その場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物活性を妨害または阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物活性を増強する場合があり、それにより、機能的バリアントの生物活性は、親ＣＡＲと比較して増加する。
【0267】
ＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は当技術分野で公知であり、これには、特定の物理的及び／または化学的特性を有する１つのアミノ酸を、同じまたは類似した化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換するアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、別の酸性／負荷電極性アミノ酸と置換される酸性／負荷電極性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）、非極性側鎖を有する別のアミノ酸と置換される非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）、別の塩基性／正荷電極性アミノ酸と置換される塩基性／正荷電極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸と置換される極性側鎖を有する非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）、β分岐側鎖を有する別のアミノ酸と置換されるβ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｅ、Ｔｈｒ、及びＶａｌ）、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸と置換される芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）などであり得る。
【0268】
ＣＡＲは、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸が機能的バリアントの生物活性を実質的に変化させないように、特定のアミノ酸配列または本明細書に記載される配列から本質的になり得る。
【0269】
ＣＡＲ（機能部分及び機能的バリアントを含む）は、ＣＡＲ（またはその機能部分もしくは機能的バリアント）が、それらの生物活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳類における疾患細胞の検出能力、または哺乳類における疾患の治療もしくは予防能力などが保持されている限り、任意の長さであり得、すなわち、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。
【0270】
ＣＡＲ（本発明の機能部分及び機能的バリアントを含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、ｔｒａｎｓ－３－及びｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オミチン、－アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、ならびにａ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。
【0271】
ＣＡＲ（機能部分及び機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えば、ジスルフィド架橋による環化、あるいは酸付加塩に変換及び／または任意選択で二量体化もしくは重合化、または複合化され得る。
【0272】
置換及びバリアント
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基からの欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有する限りにおいて、最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行うことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基からの欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有する限りにおいて、最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行うことができる。
【0273】
ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供する。置換変異誘発の目的の部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。アミノ酸側鎖のクラスに関して、以下にさらに記載する。目的の抗体内にアミノ酸置換を導入し、その生成物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングしてもよい。
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供する。置換変異誘発の目的の部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。アミノ酸側鎖のクラスに関して、以下にさらに記載する。目的の抗体内にアミノ酸置換を導入し、その生成物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングしてもよい。
【0274】
アミノ酸を、共通の側鎖特性に従って分類してもよい：
【0275】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
【0276】
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
【0277】
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
【0278】
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
【0279】
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
【0280】
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0281】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【0282】
ある種類の置換型変異形は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、得られるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性に改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的な置換バリアントは親和性成熟抗体であり、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術、例えば、本明細書に記載されるものなどを使用して簡便に生成され得る。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させて、バリアント抗体がファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【0283】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて改変（例えば、置換）を行ってもよい。そのような改変を、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異するコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照のこと）、及び／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において実施し、得られたバリアントＶＨまたはＶＬを、結合親和性について試験してもよい。二次ライブラリの構築及びそこからの再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子中に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリを作製する。次いで、ライブラリをスクリーニングし、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６つの残基）を無作為化するＨＶＲ特異的アプローチを伴う。例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、抗原結合に関与するＨＶＲ残基を特異的に同定してもよい。多くの場合、特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされる。
【0284】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失を、そのような改変が抗原と結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で行ってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）を、ＨＶＲにおいて行ってもよい。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＣＤＲの外側であってもよい。上記のバリアントＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは、非改変であるか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
【0285】
変異誘発のために標的とされ得る、抗体の残基または領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５によって記載されるような、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれている。本方法では、標的残基の残基または群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）を同定して、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置換し、抗体と抗原との相互作用に影響を及ぼすかどうかを判定する。最初の置換に対して機能感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入してもよい。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基を、置換の候補として標的とするか、または排除してもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を有するかどうかを判定してもよい。
【0286】
アミノ酸配列の挿入には、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端への１残基～１００残基以上を含有するポリペプチドの長さの範囲の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、抗体のＮ末端もしくはＣ末端と酵素との融合体（例えば、ＡＤＥＰＴのための）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合体が挙げられる。
【0287】
ｂ）グリコシル化バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体を、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変する。抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって簡便に行ってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体を、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変する。抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって簡便に行ってもよい。
【0288】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を改変してもよい。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、通常、一般にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって結合する、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸に加えて、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合するフコースが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために、本出願の抗体中のオリゴ糖の修飾を行ってもよい。
【0289】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に結合する（直接的または間接的に）フコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントを提供する。例えば、そのような抗体のフコース量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％であってよい。フコース量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定する場合、Ａｓｎ２９７に結合するすべての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計と比較した、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における軽微な配列多様性に起因して、２９７位から約±３アミノ酸だけ上流または下流に、すなわち、２９４～３００位の間に位置する場合もある。そのようなフコシル化バリアントは、改善したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠いているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．）、ならびにノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、すなわち、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）などが挙げられる。
【0290】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を有する抗体バリアントをさらに提供する。そのような抗体バリアントは、減少したフコシル化及び／または改善したＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合するオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供する。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【0291】
ＣＡＲ（その機能部分及び機能的バリアントを含む）は、当技術分野で公知の方法によって取得することができる。ＣＡＲは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の好適な方法によって作製され得る。ポリペプチド及びタンパク質を新規合成する好適な方法は、参考文献、例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１、及び米国特許第５，４４９，７５２号などに記載されている。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え方法を使用し、本明細書に記載される核酸を使用して組換え産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照のこと。さらに、ＣＡＲ（その機能部分及び機能的バリアントを含む）の一部は、供給源、例えば、植物、細菌、昆虫、哺乳類、例えば、ラット、ヒトなどから単離及び／または精製され得る。単離及び精製の方法は、当技術分野において周知である。あるいは、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能部分及び機能的バリアントを含む）は、企業によって商業的に合成され得る。この点に関して、ＣＡＲは、合成、組換え、単離、及び／または精製され得る。
【0292】
検出可能なマーカー及びタグ
本明細書に開示される抗原の１つ以上に特異的なＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、モノクローナル抗体、その抗原結合断片は、タグタンパク質と共に発現（例えば、共発現）させることができる。いくつかの実施形態では、フューリン認識部位及び下流の２Ａリボソーム配列を、タグ配列とＣＡＲ配列の同時バイシストロニック発現のために設計する。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ 配列番号５８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フューリン及びＰ２Ａ配列は、配列番号５８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａタグは、配列番号５８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示される抗原の１つ以上に特異的なＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、モノクローナル抗体、その抗原結合断片は、タグタンパク質と共に発現（例えば、共発現）させることができる。いくつかの実施形態では、フューリン認識部位及び下流の２Ａリボソーム配列を、タグ配列とＣＡＲ配列の同時バイシストロニック発現のために設計する。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ 配列番号５８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フューリン及びＰ２Ａ配列は、配列番号５８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａタグは、配列番号５８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【0293】
本明細書に開示される抗原の１つ以上に特異的なＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、モノクローナル抗体、その抗原結合断片を、検出可能なマーカー、例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術（コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、コンピュータ横断断層（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影法（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー検査、及び腹腔鏡検査など）によって検出可能な検出可能なマーカーと複合化することもできる。検出可能なマーカーの特定の非限定的な例としては、フルオロフォア、化学発光剤、酵素結合、放射性同位体及び重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出を目的とした超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が挙げられる。例えば、有用な検出可能なマーカーとしては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含む、蛍光化合物が挙げられる。生物発光マーカー、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）なども有用である。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、検出に有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどと複合化することもできる。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分を検出可能な酵素と複合化する場合、それは、区別され得る反応生成物を生成するために酵素が使用する追加の試薬を添加することによって検出され得る。例えば、作用因子の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加によって、視覚的に検出可能な着色反応生成物が得られる。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、ビオチンと複合化させて、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接測定によって検出してもよい。アビジン自体は、酵素または蛍光標識と複合化され得ることに留意すべきである。
【0294】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分を、ガドリニウムなどの常磁性体と複合化させてもよい。超常磁性酸化鉄などの常磁性体も標識として有用である。抗体はまた、ランタニド（ユウロピウム及びジスプロシウムなど）、ならびにマンガンと複合化させることもできる。抗体または抗原結合断片はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）で標識してもよい。
【0295】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、放射性標識アミノ酸と複合化させることもできる。放射性標識は、診断目的及び治療目的の両方に使用され得る。例えば、放射性標識は、本明細書に開示される抗原及び抗原発現細胞のうち１つ以上をＸ線、発光スペクトル、または他の診断技術によって検出するために使用され得る。さらに、放射性標識は、対象における腫瘍の治療、例えば、神経芽細胞腫の治療のために毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドの標識の例としては、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
【0296】
そのような検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者には周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、放出された照明を検出する光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は通常、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生成される反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色した標識を可視化するだけで検出される。
【0297】
免疫応答性細胞及び宿主細胞
本出願の一態様は、改変された免疫エフェクター細胞（例えば、免疫応答性細胞）を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫応答性細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、もしくはその前駆細胞、または子孫細胞を指す。いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、本明細書に記載の免疫調節系（例えば、腫瘍関連抗原またはストレスリガンドに対する特異性を有する標的化剤、及びＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞）を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、本明細書に記載の免疫調節系（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、及びＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列）を含む。
本出願の一態様は、改変された免疫エフェクター細胞（例えば、免疫応答性細胞）を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫応答性細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、もしくはその前駆細胞、または子孫細胞を指す。いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、本明細書に記載の免疫調節系（例えば、腫瘍関連抗原またはストレスリガンドに対する特異性を有する標的化剤、及びＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞）を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞は、本明細書に記載の免疫調節系（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、及びＴＧＦ－βシグナル伝達を調節するポリペプチドをコードする核酸配列）を含む。
【0298】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、免疫応答性細胞はＴ細胞である。
【0299】
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株に由来するＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など、あるいは哺乳類から取得したＴ細胞などであり得る。哺乳類から取得する場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含むが、これらに限定されない多数の供給源から取得することができる。Ｔ細胞はまた、濃縮または精製され得る。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は任意のＴ細胞型であり得、任意の発達段階のものであり得、例えば、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞、すなわち、Ｔｓｃｍ、ナイーブＴ細胞などが含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。
【0300】
一実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＡＲを、好適な非Ｔ細胞に使用することができる。そのような細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、ＮＫ細胞、及び多能性幹細胞から生成されたＴ様細胞などである。
【0301】
実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の細胞型を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、もしくは藻類であり得るか、または原核細胞、例えば、細菌もしくは原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、生物、例えば、ヒトから直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は当技術分野で公知であり、例えば、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組換え発現ベクターを増幅または複製する目的では、宿主細胞は原核細胞、例えばＤＨ５ａ細胞であってもよい。組換えＣＡＲを産生する目的では、宿主細胞は哺乳類細胞であってもよい。宿主細胞はヒト細胞であってもよい。宿主細胞は、任意の細胞型のものであり得、任意の組織型に由来し得、任意の発達段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であってもよい。宿主細胞はＴ細胞であってもよい。
【0302】
また、一実施形態により、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団を提供する。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞、例えば、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）に加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む異種集団であり得、これは組換え発現ベクターのいずれか、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞などを含まない。あるいは、細胞集団は、実質的に均一集団であり得、その場合に集団は、組換え発現ベクターを含む（例えば、本質的にそれからなる）宿主細胞を主に含む。集団はまた、クローン細胞集団であり得、その場合、集団のすべての細胞が、組換え発現ベクターを含む単一宿主細胞のクローンであり、その結果、集団のすべての細胞がその組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞集団は、本明細書に記載されるような組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【0303】
ＣＡＲ（その機能部分及びバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、ならびに抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離及び／または精製され得る。例えば、精製した（または単離した）宿主細胞調製物は、宿主細胞が、体内の細胞の自然環境における細胞よりも純粋な調製物である。そのような宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞の調製物は、宿主細胞が調製物の全細胞含有量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％に相当するように精製される。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％、もしくは約８０％超であり得るか、または約１００％であり得る。
【0304】
核酸及び発現ベクター
さらに、本発明の実施形態により、本明細書に記載のＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合部分（その機能部分及び機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
さらに、本発明の実施形態により、本明細書に記載のＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合部分（その機能部分及び機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【0305】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列を、コドン改変してもよい。特定の理論に束縛されるものではないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳効率を増加させると考えられている。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然コドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドンに置換することを含み得るが、細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳されることにより、翻訳効率が向上し得る。ヌクレオチド配列の最適化は、翻訳を妨害する二次ｍＲＮＡ構造も減少させることにより、翻訳効率が向上する場合がある。
【0306】
本発明の一実施形態では、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードするコドン改変ヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能部分及び機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするコドン改変ヌクレオチド配列を含み得る。
【0307】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。簡便なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターであり、任意のＶＨ配列またはＶＬ配列が容易に挿入され、発現可能であるように適切な制限酵素部位が設けられている。そのようなベクターでは、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域のスプライスドナー部位とヒトＣ領域前のスプライスアクセプター部位との間、及びヒトＣＨエクソン内で生じるスプライス領域でも行われる。好適な発現ベクターは、多数の構成要素、例えば、複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１つ以上の発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくはターミネーター）など、及び／または１つ以上の翻訳シグナル、シグナル配列もしくはリーダー配列などを含有し得る。ポリアデニル化及び転写終結は、コード領域の下流の天然染色体部位で行われる。得られたキメラ抗体を、任意の強力なプロモーターに結合させてもよい。使用可能な好適なベクターの例としては、哺乳類宿主に適していて、ウイルス複製系、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、パポーバウイルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）、またはマウス及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、天然Ｉｇプロモーターなどに基づくものが挙げられる。種々の好適なベクターが、当技術分野で公知であり、単一コピーもしくは複数のコピーで維持されるか、または例えば、ＬＴＲを介して、もしくは複数の組込み部位で改変された人工染色体を介して宿主細胞染色体中に組み込まれるベクターが挙げられる（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１７２（２００４）、Ｋｅｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｏｎｌｉｎｅ Ｍａｙ ２０，２００９）。好適なベクターのさらなる例を、後の節に列挙する。
【0308】
したがって、本発明は、抗体、抗体の抗原結合断片（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ抗体もしくは前述のいずれかの抗原結合断片）、抗体鎖（例えば、重鎖、軽鎖）またはＴＧＦβもしくはＴＧＦβＲと結合する抗体鎖の抗原結合部分をコードする核酸を含む１つ以上の発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＧＦβＲの核酸細胞外ドメインを含む１つ以上の発現ベクターを提供する。
【0309】
真核宿主細胞での発現は、そのような細胞が原核細胞よりも、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が高いため、有用である。しかしながら、不適切な折り畳みのために不活性である産生されたいずれの抗体も、公知の方法に従って再生可能な場合がある（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ”，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１，ｐｐ．４５９－８９（１９８２））。宿主細胞が、軽鎖二量体または重鎖二量体などのインタクトな抗体の一部を産生する可能性があり、これらは本発明による抗体相同体でもある。
【0310】
また、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物をコードする核酸のいずれかと少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【0311】
一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に組み込まれ得る。この点に関して、実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを細胞内で発現させるのに十分な条件下でベクターを細胞と接触させる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターは、全体として天然に存在するものではない。
【0312】
しかしながら、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、これらに限定されない任意の種類のヌクレオチドを含み得、これらは単鎖または二本鎖であり、天然源から部分的に合成または取得され得、天然、非天然、または改変されたヌクレオチドを含有し得る。組換え発現ベクターは、天然もしくは非天然のヌクレオチド間結合、または両方の種類の結合を含み得る。好ましくは、非天然もしくは改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製を妨げない。
【0313】
一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。好適なベクターとしては、伝播及び増殖のために、もしくは発現のために、またはその両方のために設計されるベクター、例えば、プラスミド及びウイルスが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択され得る。
【0314】
λ、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４、及びλＮＭＩ１４９などのバクテリオファージベクターも使用され得る。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯ１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯ１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターであり、特にＭｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）で提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、例えば、限定されないが、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ｐｌｃのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが挙げられる。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には公知であろう。
【0315】
多数のトランスフェクション技術が、一般に当技術分野で公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６－４６７（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３：９７（１９８１）を参照のこと。
【0316】
トランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，上記を参照のこと）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，２２：４７９－４８８（１９８０）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２－７５１（１９８８）を参照のこと）、リポソーム媒介遺伝子導入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２－６９０（１９８８）を参照のこと）、脂質媒介形質導入（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３－７４１７（１９８７）を参照のこと）、及び高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０－７３（１９８７）を参照のこと）が挙げられる。
【0317】
一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または線状である発現ベクターの構築物は、原核または真核宿主細胞で機能する複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
【0318】
組換え発現ベクターは、転写及び翻訳開始コドン及び終止コドンなどの調節配列を含む場合があり、これらは、ベクターが適宜導入される宿主細胞型（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的であり、また、ベクターがＤＮＡベースであるか、またはＲＮＡベースであるかが考慮に入れられる。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするために制限酵素部位を含み得る。
【0319】
組換え発現ベクターは、１つ以上のマーカー遺伝子を含み得、これらは形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、栄養要求性宿主における原栄養性を提供するための相補性などが挙げられる。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【0320】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能部分及び機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に相補的であるか、もしくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結する天然または非天然プロモーターを含み得る。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的なプロモーターの選択は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組合せも、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復配列に認められるプロモーターであり得る。
【0321】
組換え発現ベクターは、一過性発現、安定発現、またはその両方のいずれかのために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導発現のために作製され得る。
【0322】
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用される場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子が発現する細胞に薬剤、例えば、薬物に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触するか、または薬剤に曝露される場合に細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照のこと）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンダミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【0323】
治療方法
本発明は、抗ＴＧＦβ、抗ＴＧＦβＲ抗原結合分子、またはＴＧＦβＲの細胞外ドメインを対象に投与することを含む治療方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ及び抗原結合分子は、哺乳動物の疾患を治療または予防する方法に使用され得る。この点に関して、一実施形態は、哺乳類におけるがんの治療方法または予防方法を提供し、本方法は、哺乳類にＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体及び／またはその抗原結合部分、及び／または哺乳類のがんを治療もしくは予防するのに効果的な量の医薬組成物を投与することを含む。
本発明は、抗ＴＧＦβ、抗ＴＧＦβＲ抗原結合分子、またはＴＧＦβＲの細胞外ドメインを対象に投与することを含む治療方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ及び抗原結合分子は、哺乳動物の疾患を治療または予防する方法に使用され得る。この点に関して、一実施形態は、哺乳類におけるがんの治療方法または予防方法を提供し、本方法は、哺乳類にＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体及び／またはその抗原結合部分、及び／または哺乳類のがんを治療もしくは予防するのに効果的な量の医薬組成物を投与することを含む。
【0324】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ドナー細胞上で発現し、これらの細胞から、抗ＴＧＦβ、抗ＴＧＦβＲ抗原結合分子、またはＴＧＦβＲの細胞外ドメインが分泌される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞療法に使用するためのドナーＴ細胞を、患者から採取する（例えば、自己Ｔ細胞療法のために）。他の実施形態では、Ｔ細胞療法に使用するためのドナーＴ細胞を、患者ではない対象から採取する（例えば、同種異系Ｔ細胞療法のために）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、治療有効量で投与してもよい。例えば、Ｔ細胞の治療有効量は、少なくとも約１０４細胞、少なくとも約１０５細胞、少なくとも約１０６細胞、少なくとも約１０７細胞、少なくとも約１０８細胞、少なくとも約１０９、または少なくとも約１０１０であってよい。
【0325】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の治療有効量は、約１０４細胞、約１０５細胞、約１０６細胞、約１０７細胞、または約１０８細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約２×１０７細胞／ｋｇ、約３×１０７細胞／ｋｇ、約４×１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約６×１０７細胞／ｋｇ、約７×１０７細胞／ｋｇ、約８×１０７細胞／ｋｇ、または約９×１０７細胞／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞の治療有効量は、約１×１０６～約２×１０６のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞／ｋｇ体重から、最大で最高用量の約１×１０８のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞である。
【0326】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞の治療有効量は、約０．２５×１０６～２×１０６である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞の治療有効量は、約０．２５×１０６、０．３×１０６、０．４×１０６、約０．５×１０６、約０．６×１０６、約０．７×１０６、約０．８×１０６、約０．９×１０６、約１．０×１０６、約１．１×１０６、約１．２×１０６、約１．３×１０６、約１．４×１０６、約１．５×１０６、約１．６×１０６、約１．７×１０６、約１．８×１０６、約１．９×１０６、または約２．０×１０６のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞である。
【0327】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞の治療有効量は、約０．４×１０８～約２×１０８のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞の治療有効量は、約０．４×１０８、約０．５×１０８、約０．６×１０８、約０．７×１０８、約０．８×１０８、約０．９×１０８、約１．０×１０８、約１．１×１０８、約１．２×１０８、約１．３×１０８、約１．４×１０８、約１．５×１０８、約１．６×１０８、約１．７×１０８、約１．８×１０８、約１．９×１０８、または約２．０×１０８のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞である。
【0328】
一実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲを投与する前に、哺乳類でリンパ球枯渇させることをさらに含む。リンパ球枯渇の例としては、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、全身照射などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0329】
宿主細胞または細胞集団を投与する方法を目的として、細胞は、哺乳類にとって同種異系または自家の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類にとって自家である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類にとって同種異系である。本明細書で使用される場合、同種異系とは、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質を意味する。１箇所以上の遺伝子座の遺伝子が同一ではない場合、２つ以上の個体は、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同種の個体に由来する同種異系の物質は、抗原的に相互作用するために遺伝的に十分に異なり得る。本明細書で使用される場合、用語「自家」とは、任意の物質が後に個体に再導入される場合の同じ個体に由来する任意の物質を意味する。
【0330】
本明細書で言及される哺乳類は、任意の哺乳類であり得る。本明細書で使用される場合、用語「哺乳類」とは、マウス及びハムスターなどの齧歯目の哺乳類、ならびにウサギなどのウサギ目の哺乳類を含むが、これらに限定されない任意の哺乳類を指す。哺乳類は、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む、食肉目由来の哺乳類であってよい。哺乳類は、ウシ科（ウシ）及びブタ（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目由来の哺乳類であってもよい。哺乳類は、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ目、もしくはＳｉｍｏｉｄ目（サル）、または真猿亜目（ヒト及び類人猿）の哺乳類であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。
【0331】
本方法に関して、がんは、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱癌（例えば、膀胱癌腫）、骨癌、脳癌（例えば、髄芽腫）、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌及び肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、Ｂ慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、バーキットリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、網癌、及び腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、ならびに尿管癌のいずれかを含む、任意のがんであり得る。
【0332】
特定の実施形態では、がんは胃腸癌である。いくつかの実施形態では、がんは胃癌である。いくつかの実施形態では、がんは結腸直腸癌である。いくつかの実施形態では、がんは結腸癌である。いくつかの実施形態では、がんは、異常なＴＧＦβ発現または異常なＴＧＦβシグナル伝達を有する。
【0333】
用語「治療する」、及び「予防する」、ならびにそれらに由来する単語は、本明細書で使用される場合、必ずしも１００％または完全な治療または予防を示唆するとは限らない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療または予防が存在する。この点に関して、本方法は、哺乳類におけるがんの任意の量または任意のレベルの治療または予防を提供し得る。
【0334】
さらに、本方法によって提供される治療または予防は、治療または予防される疾患、例えば、がんの１つ以上の病態または症状の治療または予防を含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは病態の発症を遅延させることを包含し得る。
【0335】
標的細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３：５０７－５１３（１９９９）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ－α）またはインターロイキン２（ＩＬ－２））の放出を測定する方法について教示している。さらに、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：４４１５－４４２３（２００５）に記載されているように、細胞傷害の測定によってＣＡＲ機能を評価することができる。
【0336】
別の実施形態は、哺乳類における増殖性障害、例えば、がんの治療または予防のための、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体、もしくはその抗原結合部分、及び／または医薬組成物の使用を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれであってもよい。
【0337】
開示される治療剤には、局所投与及び全身投与を含む任意の投与方法を使用することができる。例えば、局所、経口、静脈内などの血管内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔内、及び皮下投与を使用することができる。特定の投与様式及び投与レジメンは、症例の詳細（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、及び治療が予防的かどうか）を考慮して、担当臨床医によって選択される。２つ以上の薬剤または組成物を投与する場合、１つ以上の投与経路を使用してもよく、例えば、化学療法剤を経口投与してもよく、抗体または抗原結合断片または複合体または組成物を、静脈内投与してもよい。投与方法には、注射が含まれ、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞、複合体、抗体、抗原結合断片、または組成物が、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、固定油、オレイン酸エチル、またはリポソームなどの非毒性の薬学的に許容される担体中に提供される。いくつかの実施形態では、開示される化合物の局所投与は、例えば、抗体または抗原結合断片を、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍が発生しやすいと疑われる領域に塗布することによって使用され得る。いくつかの実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合断片を含む医薬調製物の持続的な腫瘍内（または腫瘍近傍での）放出が有効であり得る。他の例では、複合体を点眼薬として角膜に局所的に、または硝子体内に塗布する。
【0338】
開示される治療剤は、正確な用量の個別投与に適した単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示される治療剤は、単回用量または複数回用量のスケジュールで投与してもよい。複数回の投与スケジュールとは、一次治療経過が、複数回の別個の用量、例えば、１～１０回の投与、続いて必要に応じて、その後の時間間隔で他の投与を行い、組成物の作用を維持または補強し得るスケジュールである。治療は、数日から数か月、またはさらに数年間にわたる化合物（複数可）の１日用量または複数日用量を含み得る。したがって、投与レジメンはまた、少なくとも部分的に、治療される対象の特定の必要性に基づいて決定され、投与施術者の判断に依存することになる。
【0339】
抗体または複合体の典型的な用量は、約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇなどの範囲であり得る。
【0340】
特定の例では、対象に、複合体、抗体、組成物、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞、または追加の薬剤のうちの１つ以上を含む治療用組成物を、複数日の、例えば、少なくとも２日連続、１０日連続などの投薬スケジュールで、例えば、数週間、数か月間、または数年間投与する。一例では、対象に、少なくとも３０日間、例えば、少なくとも２か月、少なくとも４か月、少なくとも６か月、少なくとも１２か月、少なくとも２４か月、または少なくとも３６か月などの期間、複合体、抗体、組成物、または追加の薬剤を投与する。
【0341】
いくつかの実施形態では、開示される方法は、開示される抗体、抗原結合断片、複合体、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて（例えば、順次、実質的に同時に、または同時に）、外科手術、放射線療法、及び／または化学療法薬を対象に提供することを含む。そのような薬剤及び治療の方法及び治療用量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医によって決定され得る。追加の薬剤の調製及び投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って、または当業者によって経験的に決定されるように使用してもよい。そのような化学療法の調製及び投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９２）Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄにも記載されている。
【0342】
いくつかの実施形態では、併用療法は、治療有効量の追加のがん抑制剤を対象に投与することを含み得る。併用療法と共に使用され得る追加の治療剤の非限定的な例としては、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたは架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ及びＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節剤、ならびに血管新生阻害剤が挙げられる。これらの薬剤（治療有効量で投与する）及び治療は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の好適な抗がん剤または抗血管新生剤を、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗体、抗原結合断片、または複合体と組み合わせて投与することができる。そのような薬剤の方法及び治療用量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医によって決定され得る。
【0343】
追加の化学療法剤としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、及びメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、及びストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、及びＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、ならびにウラムスチンなど、代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、及びラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、及びチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、ならびにゲムシタビンなど、植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、及びテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセル及びパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）など、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシ尿素、ならびにマイトマイシンなど、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカン及びイリノテカンなど、モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブなど、光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、及びベルテポルフィンなど、ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフィニブ、バンデタニブ、及びトレチノインなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような薬剤の選択及び治療用量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医によって決定され得る。
【0344】
併用療法は相乗効果をもたらし、相乗的であることを証明し得る、すなわち、活性成分が共に使用される場合に達成される効果は、化合物を別々に使用することから生じる効果の総和を上回る。相乗効果は、活性成分を（１）共製剤化し、投与するか、もしくは組み合わせた単位剤形で同時に送達するか、（２）別個の製剤として交互に、もしくは並行して送達するか、または（３）いくつかの他のレジメンによる場合に達成され得る。交互に送達する場合、相乗効果は、化合物が、例えば、別個のシリンジによる異なる注射によって順次投与または送達する場合に達成され得る。一般に、交互に投与する間、有効用量の各活性成分を順次、すなわち、連続して投与する一方で、併用療法では、有効用量の２つ以上の活性成分を一緒に投与する。
【0345】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるようなＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを含む免疫調節系は、対象に少なくとも１つの追加の薬剤を投与することをさらに含む一連の治療に含まれ得る。様々な実施形態では、本明細書に記載されるようなＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを含む免疫調節系と組み合わせて投与する追加の薬剤は、化学療法剤であってもよい。様々な実施形態では、本明細書に記載されるような抗原結合剤と組み合わせて投与する追加の薬剤は、炎症を抑制する薬剤であってもよい。
【0346】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ヒトＴＧＦβに対する特異性を有する単一ドメイン抗体または分泌性ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、ヒトＴＧＦβＲに対する特異性を有する単一ドメイン抗体または分泌性ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターは、がん細胞に結合し、がん細胞に治療剤を送達し、ヒトＴＧＦβを発現するがん細胞を死滅させるために、治療剤（例えば、化学療法剤及び放射性原子）に複合化（例えば、連結）され得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを、治療剤に連結する。いくつかの実施形態では、治療剤は、化学療法剤、サイトカイン、放射性原子、ｓｉＲＮＡ、または毒素である。いくつかの実施形態では、治療剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は放射性原子である。
【0347】
いくつかの実施形態では、本方法を、ＴＧＦβシグナル伝達異常を伴う障害に対して、他の療法と併用して実施することができる。例えば、組成物を、化学療法と同時に、その前に、またはその後に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物を、養子療法と同時に、その前に、またはその後に対象に投与することができる。
【0348】
様々な実施形態において、本明細書に記載のＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターを含む免疫調節系と併用して投与する追加の薬剤を、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターと同時に、同じ日に、または同じ週に投与してもよい。様々な実施形態では、本明細書に記載されるようなＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターと併用して投与する追加の薬剤を、単一の製剤中で免疫調節系と共に投与してもよい。特定の実施形態では、追加の薬剤を、本明細書に記載されるようなＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターの投与とは時間的に離れた様式で、例えば、ＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターの投与の１時間以上前もしくは後に、１日以上前もしくは後に、１週間以上前もしくは後に、または１か月以上前もしくは後に投与する。様々な実施形態では、１つ以上の追加の薬剤の投与頻度は、本明細書に記載されるようなＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターの投与頻度と同じか、それと同様か、またはそれとは異なり得る。
【0349】
いくつかの実施形態では、組成物を、１つ以上の追加の治療剤、例えば、対象におけるＴＧＦβ関連障害（例えば、がんまたは自己免疫障害）を治療または予防するための追加の療法と共に製剤化することができる。対象におけるＴＧＦβ関連障害を治療するための追加の薬剤は、治療しようとする特定の障害に応じて異なるが、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、オスファミド（ｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルボプラチン、エトポシド、デキサメタゾン、シタラビン、シスプラチン、シクロホスファミド、またはフルダラビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0350】
組成物
遺伝子治療、免疫療法及び／または細胞療法に使用するために、組成物を本明細書で提供し、組成物は、開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、複合体、ＣＡＲ、または本明細書で開示される１つ以上の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうちの１つ以上を、担体（薬学的に許容される担体など）内に含む。組成物は、対象に投与するための単位剤形で調製され得る。投与の量及びタイミングは、所望の結果を達成するために、治療する臨床医の裁量による。組成物は、全身（静脈内など）または局所（腫瘍内など）投与用に製剤化され得る。一例では、開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、複合体を、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化する。本明細書に開示されるようなＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、複合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物は、例えば、腫瘍、例えば、限定されないが、神経芽細胞腫の治療及び検出に有用である。いくつかの例では、組成物は、がん腫の治療または検出に有用である。本明細書に開示されるようなＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、複合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物はまた、例えば、病的血管新生の検出に有用である。
遺伝子治療、免疫療法及び／または細胞療法に使用するために、組成物を本明細書で提供し、組成物は、開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、複合体、ＣＡＲ、または本明細書で開示される１つ以上の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうちの１つ以上を、担体（薬学的に許容される担体など）内に含む。組成物は、対象に投与するための単位剤形で調製され得る。投与の量及びタイミングは、所望の結果を達成するために、治療する臨床医の裁量による。組成物は、全身（静脈内など）または局所（腫瘍内など）投与用に製剤化され得る。一例では、開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、複合体を、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化する。本明細書に開示されるようなＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、複合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物は、例えば、腫瘍、例えば、限定されないが、神経芽細胞腫の治療及び検出に有用である。いくつかの例では、組成物は、がん腫の治療または検出に有用である。本明細書に開示されるようなＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、複合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物はまた、例えば、病的血管新生の検出に有用である。
【0351】
投与用の組成物は、水性担体などの薬学的に許容される担体中に溶解されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、複合体、抗体、または抗原結合断片の溶液を含み得る。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。それらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物を、従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。組成物は、おおよその生理学的条件に必要な場合に、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤中におけるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合断片または複合体の濃度は、幅広く変動し得、選択された特定の投与様式及び対象の要望に従って、主に、液量、粘度、体重などに基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法及び／または細胞療法に使用するためのそのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または当業者には明らかである。
【0352】
静脈内投与用の典型的な組成物は、１対象につき１日あたり約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇの抗体もしくは抗原結合断片または複合体（あるいは対応する用量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合断片を含む複合体）を含む。投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または当業者には明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）などの刊行物でさらに詳細に記載されている。
【0353】
制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または微粒子系として作製され得る。タンパク質送達系の広範な概要については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９５）を参照のこと。微粒子系としては、マイクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、及びナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは、治療用タンパク質、例えば、細胞毒または薬物などを中核として含有する。マイクロスフェアでは、治療薬が粒子全体に分散している。約１μｍよりも小さい粒子、マイクロスフェア、及びマイクロカプセルは一般に、それぞれナノ粒子、ナノスフェア、及びナノカプセルと称される。毛細血管の直径はおよそ５μｍであるため、ナノ粒子のみが静脈内投与される。微粒子は通常、直径約１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２１９－３４２（１９９４）、及びＴｉｃｅ＆Ｔａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３１５－３３９，（１９９２）を参照のこと。
【0354】
本明細書に開示されるＣＡＲ、もしくはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合断片または複合体組成物のイオン制御放出のために、ポリマーを使用することができる。制御された薬物送達に使用するための様々な分解性及び非分解性ポリマーマトリックスが、当技術分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７－５４２，１９９３）。例えば、ブロックコポリマーであるポラキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温では粘性だが流動性液体として存在する一方で、体温では半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン－２及びウレアーゼの製剤化及び持続送達のための効果的なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５－４３４，１９９２、及びＰｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８－６５，１９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５－２２４，１９９４）。さらに別の態様では、リポソームを、脂質カプセル化薬物の制御放出及び薬物標的化のために使用する（Ｂｅｔａｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．（１９９３））。治療用タンパク質の制御送達を目的とした多数の追加の系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号、同第５，１８８，８３７号、同第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９５７，７３５号、同第５，０１９，３６９号、同第５，０５５，３０３号、同第５，５１４，６７０号、同第５，４１３，７９７号、同第５，２６８，１６４号、同第５，００４，６９７号、同第４，９０２，５０５号、同第５，５０６，２０６号、同第５，２７１，９６１号、同第５，２５４，３４２号、及び同第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
【0355】
キット
一態様では、本明細書に開示されるＣＡＲを用いるキットも提供する。例えば、対象の腫瘍を治療するためのキット、または本明細書に開示されるＣＡＲのうちの１つ以上を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製するためのキット。キットは通常、開示される抗体、抗原結合断片、複合体、核酸分子、本明細書に開示されるようなＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示される抗体、抗原結合断片、複合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうちの複数が、キット内に含まれ得る。
一態様では、本明細書に開示されるＣＡＲを用いるキットも提供する。例えば、対象の腫瘍を治療するためのキット、または本明細書に開示されるＣＡＲのうちの１つ以上を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製するためのキット。キットは通常、開示される抗体、抗原結合断片、複合体、核酸分子、本明細書に開示されるようなＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示される抗体、抗原結合断片、複合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうちの複数が、キット内に含まれ得る。
【0356】
キットは、容器及び容器上の、または容器と関連するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は通常、開示される抗体、抗原結合断片、複合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうちの１つ以上を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを有する場合がある（例えば、容器は、静脈内輸液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物を特定の病態を治療するために使用することを示す。
【0357】
ラベルまたは添付文書は通常、例えば、腫瘍の治療方法もしくは予防方法、またはＣＡＲ Ｔ細胞の作製方法における開示される抗体、抗原結合断片、複合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用説明書をさらに含む。添付文書は、通常、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用、用量、投与、禁忌、及び／または警告についての情報を含有する、治療用製品の商業用パッケージに通例含まれる説明書を含む。説明書は、電子形式（コンピュータディスケットもしくはコンパクトディスクなど）で記載され得るか、または視覚的形式（ビデオファイルなど）であり得る。キットはまた、キットが設計された特定の用途を容易にするための追加の構成要素も含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含み得る。キットには、特定の方法の実施に日常的に使用される緩衝液及び他の試薬がさらに含まれていてもよい。そのようなキット及び適切な内容物は、当業者には周知である。
【0358】
別段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語ならびに語句は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様の、または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に援用される。
【0359】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換に標準的な技術を使用してもよい（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応及び精製技術を、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般に行われるように、または本明細書に記載されるように実施してもよい。前述の技術及び手順は一般に、当技術分野において周知の従来方法に従って、また本明細書全体を通して引用かつ議論される様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように実施してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照し、これはあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【0360】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により援用される。本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解される。
【実施例】
【0361】
これらの実施例は、本発明の理解を補助するために記載されるが、本発明の範囲を制限することを決して意図するものではなく、またそのように解釈されるべきではない。実施例は、当業者に周知であろう従来の方法（分子クローニング技術など）の詳細な説明を含まない。
【0362】
実施例１． キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＧＦ－Ｂシグナル伝達モジュレーターを共発現する免疫応答性細胞
本実施例は、ヒトＴ細胞における免疫調節系を使用したＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターとＣＡＲの共発現を示す。ＴＧＦ－Ｂシグナル伝達モジュレーター（例えば、抗ＴＧＦβ及び抗ＴＧＦβＲ２）及び抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ（ＳＪ２５Ｃ１細胞外抗原結合ドメイン）をコードする免疫調節構築物を、レトロウイルス送達用にパッケージ化した。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａレトロウイルスパッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、ＤＭＥＭ ２０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン中で５０～７０％コンフルエントになるまで増殖させた。ＴＧＦ－Ｂシグナル伝達モジュレーター及びＣＡＲ構築物をコードするそれぞれのプラスミド、ヘルパープラスミドｇａｇ－ｐｏｌ及びｐＶＳＶＧ、ならびに形質導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、ＤＮＡ複合体を調製した。トランスフェクションの２０～４８時間後、ウイルス上清を採取し、等分して、さらなる使用のために凍結した。
本実施例は、ヒトＴ細胞における免疫調節系を使用したＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターとＣＡＲの共発現を示す。ＴＧＦ－Ｂシグナル伝達モジュレーター（例えば、抗ＴＧＦβ及び抗ＴＧＦβＲ２）及び抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ（ＳＪ２５Ｃ１細胞外抗原結合ドメイン）をコードする免疫調節構築物を、レトロウイルス送達用にパッケージ化した。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａレトロウイルスパッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、ＤＭＥＭ ２０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン中で５０～７０％コンフルエントになるまで増殖させた。ＴＧＦ－Ｂシグナル伝達モジュレーター及びＣＡＲ構築物をコードするそれぞれのプラスミド、ヘルパープラスミドｇａｇ－ｐｏｌ及びｐＶＳＶＧ、ならびに形質導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、ＤＮＡ複合体を調製した。トランスフェクションの２０～４８時間後、ウイルス上清を採取し、等分して、さらなる使用のために凍結した。
【0363】
ヒトＰＢＭＣを、密度勾配を使用してＬｅｕｋｏｐａｋｓから単離し、さらに使用するまで凍結した。事前に凍結させたＰＢＭＣから、ヒトＴ細胞を磁気選択（Ｔ細胞分離キット、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）によって分離した。精製ヒトＴ細胞を、２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＴ細胞Ｔｒａｎｓａｃｔビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有する完全オプティマイザー培地（オプティマイザー基礎培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ１０２２１－０１）＋２６ｍｌ ＯｐｔｉＭｉｚｅｒ サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ１０４８４－０２）＋２０ｍｌ ＩＣＳＲ（ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ２５９６１－０１）＋１０ｍｌの２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、（Ｇｉｂｃｏ ２５０３０－０８１）＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ、（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２））中で２日間培養した。
【0364】
Ｔ細胞をレトロネクチンでコーティングしたプレート（Ｔａｋａｒａ、４０ｕｇ／ｍｌレトロネクチン）に移し、適切な量のウイルスでスピン形質導入した。形質導入は、様々な時点でフローサイトメトリーによって確認し、定量した。簡潔に述べると、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２５０ｎｇのｈＣＤ１９－ｈＦｃタンパク質（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または社内で生成したｈＧＣＣ－Ｆｃタンパク質と共に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をヒトＦＣに対する二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて室温で２０分間再懸濁した。いくつかの実験では、ＣＤ４、ＣＤ８、または他の表面マーカーに対する抗体を加えた。ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、死細胞を分析から除外した。細胞をＰＢＳ ２％ＦＣＳ ４％ホルムアルデヒドで固定した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。形質導入効率を、ＣＡＲ染色陽性の生細胞（％）として示す。フローサイトメトリーの結果は、８７．６％のリンパ球、７６．１％のシングレット、７８．３％の生ＣＤ３＋細胞の集団を示し、７５．８％の細胞がＣＡＲ発現を示した（図１Ａ～１Ｄ）。形質導入効率を、ＣＡＲ染色陽性の生細胞（％）として示す（図１Ｅ）。
【0365】
実施例２． ＴＧＦ－β調節ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅
本実施例は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを共発現するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅を示す。アーマー化ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅は、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等である。
本実施例は、ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを共発現するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅を示す。アーマー化ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅は、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と同等である。
【0366】
Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＤ１９陽性）またはＲａｊｉ ＣＤ１９ｋｏ（ヒトＣＤ１９陰性）細胞を、製造業者のプロトコルに従って増殖色素ｅｆｌｕｏｒ ４５０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、実施例１に記載のＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加する少なくとも２時間前に９６ウェルプレートにプレーティングした。ＣＡＲ－Ｔ細胞をエフェクター：標的比０：１、０．３：１、１：１、３：１、９：１で添加し、Ｔ細胞のみを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＣＲ α／β（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びヒトＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する蛍光標識抗体を使用してＦＡＣＳ染色を実施した。製造業者のプロトコルに従って、細胞を抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した。Ｃ細胞を１×Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣで染色した。細胞を、ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した後、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ＴＧＦ－β調節性ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ細胞に対して標的特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅を示したが（図２Ａ）、ＣＤ１９陰性対照細胞（Ｒａｊｉ ＣＤ１９ｋｏ）に対しては示さなかった（図２Ｂ）。
【0367】
実施例３． 免疫応答性細胞からのＴＧＦ－βモジュレーターの分泌
本実施例は、ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞が、共発現させたＴＧＦ－βモジュレーター（例えば、ＴＧＦ－βに結合する抗ＴＧＦ－β及びＴＧＦβＲ２に結合する抗ＴＧＦβＲ２）を分泌することを示す。
本実施例は、ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞が、共発現させたＴＧＦ－βモジュレーター（例えば、ＴＧＦ－βに結合する抗ＴＧＦ－β及びＴＧＦβＲ２に結合する抗ＴＧＦβＲ２）を分泌することを示す。
【0368】
ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞由来の上清をＥＬＩＳＡによってアッセイして、抗ＴＧＦ－β抗体及び抗ＴＧＦβＲ２抗体を検出した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、１００μｌのコーティング緩衝液中の組換えヒトＴＧＦ－β（４μｇ／ｍｌ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍ）またはｈＴＧＦβＲ２－Ｆｃ（０．１ｍｇ／ｍｌ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍ）で４℃にて一晩コーティングした。プレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、試薬希釈液を用いて室温で１時間ブロッキングした。ＣＡＲ－Ｔ上清、組換えＴＧＦβＲ２－ｆｌａｇ、または組換えＴＧＦ－β－ｆｌａｇ抗体を添加し、室温で２時間インキュベートした。
【0369】
もう１回洗浄ステップを行った後、ＨＲＰ複合化ｆｌａｇタグ抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を１０～２０分間添加した。停止試薬を使用して反応を停止させ、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ Ｐｌａｔｅリーダーを使用してプレートを４５０ｎｍで読み取った。コーティングされたＴＧＦ－ｂを用いたＥＬＩＳＡでは、結合剤検出のための抗ｆｌａｇタグＨＲＰ抗体を用いたＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較して、高レベルのＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１及びＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ２が検出された（図３Ａ）。コーティングされたＴＧＦｂＲ２－Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡでは、ヒトＣＡＲ－Ｔから高レベルのＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ、ＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ及びｈＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１が検出されたが、ｍＴＧＦｂＲ２ ＶＨ１は検出することができなかった（図３Ｂ）。ＴＧＦ－β結合剤及びＴＧＦβＲ２結合剤は、ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌され、それらの同族抗原に結合する。
【0370】
実施例４． ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞はＴＧＦ－β／ＴＧＦβＲ２に対する中和抗体を分泌する
本実施例は、ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ上清中にＴＧＦ－β／ＴＧＦβＲ２に対する中和抗体が存在することを示す。
本実施例は、ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ上清中にＴＧＦ－β／ＴＧＦβＲ２に対する中和抗体が存在することを示す。
【0371】
ＴＧＦ－β／ＳＭＡＤシグナル伝達経路の活性をモニタリングするために設計されたＳＢＥ－Ｌｕｃレポーター細胞（Ｓｍａｄ結合エレメント（ＳＢＥ）（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の制御下でホタルルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３細胞）を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の上清中のＴＧＦ－βブロッキング結合剤の機能評価を実施した。ＴＧＦ－βタンパク質は、細胞表面の同族受容体に結合し、シグナル伝達カスケードを開始させ、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３をリン酸化し、活性化し、次いでＳＭＡＤ４と複合体を形成させることをもたらす。ＳＭＡＤ複合体は核に移行し、ＳＭＡＤ結合エレメント（ＳＢＥ）に結合し、ＴＧＦ－β／ＳＭＡＤ応答性遺伝子の転写及び発現を引き起こす。ブロッキング結合剤の存在は、ＳＢＥ－Ｌｕｃレポーター細胞におけるＴＧＦ－βにより誘導されるルシフェラーゼ発現を阻害する能力によって検出された。ＴＧＦ－βにより誘導されるレポーター活性を阻害する能力を評価するための例示的なアッセイを以下のように実施した。
【0372】
ＳＢＥ－Ｌｕｃ細胞を、Ｐｏｌｙ－Ｄリジンでコーティングした９６ウェルプレートに、１００μｌの新鮮な培地（１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＸ－ＶＩＶＯ１５）中、１×１０５細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。ＣＡＲ－Ｔ細胞由来の上清またはその希釈液を等量のＴＧＦ－β（Ｘ－ＶＩＶＯ１５中４ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温で１５分間インキュベートして、ＴＧＦ－βをＣＡＲ－Ｔ上清中に含まれるＴＧＦ－ｂと複合化させた。１００μｌの混合物をＳＢＥ－Ｌｕｃレポーター細胞に２つ組で添加し、３７℃及び５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。ＴＧＦ－βの最終濃度は１ｎｇ／ｍｌであった。各実験には、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βの存在下でのＴＧＦ－β抗体（１Ｄ１１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）またはＴＧＦ－β結合剤またはＴＧＦβＲ２結合剤）の段階的希釈の滴定曲線が含まれていた。
【0373】
翌日、１００μｌの培養上清を除去し、１００μｌのルシフェリン－Ｄ含有検出試薬（ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を添加した。細胞を再懸濁し、白色検出プレートに移し、Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーを使用して発光を測定した。ルシフェラーゼ活性をＣＰＭとして記録した。ＭＳ ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄプリズムを使用してデータを解析した。Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムの用量反応シグモイド曲線（可変傾き）を使用して非線形回帰フィッティングを実行した。ＩＣ５０値を計算した。
【0374】
阻害活性（％）は、次式を使用して計算した。
阻害（％）＝（１－試料のＣＰＭ／ＴＧＦ－β（１ｎｇ／ｍｌ）処理試料の最大ＣＰＭ）×１００
阻害（％）＝（１－試料のＣＰＭ／ＴＧＦ－β（１ｎｇ／ｍｌ）処理試料の最大ＣＰＭ）×１００
【0375】
結果からは、構築物ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１（配列番号１）及びＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ２（配列番号２）を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞由来の上清が、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害することが示された（図４）。追加の構築物を設計し、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦβＲ２に対する多量体結合剤の分泌についてのルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してスクリーニングした（図５及び図６）。ＴＧＦ－β及びＴＧＦβＲ２に対する多量体抗体を分泌した、ＴＧＦ－β調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞が同定された。多量体ＴＧＦ－ｂ結合剤は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞によって分泌され、リンカーに関係なくＴＧＦ－ｂシグナル伝達を阻害する。以下の図に示すように、４つの異なるリンカーを分析した。同様の結果が、ヒト抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して観察された（データは示さず）。
【0376】
実施例５． ＴＧＦ－Ｂ調節性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦβＲ２に対する多量体結合剤を分泌する
本実施例は、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦβＲ２に対する多量体結合剤を分泌するマウスＣＡＲ－Ｔ細胞のスクリーニング及び同定を説明する。マウスＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ レトロウイルスパッケージング細胞株をＤＭＥＭ ２０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン中で５０～７０％コンフルエントになるまで増殖させた。ＣＡＲ構築物及びＴＧＦＢモジュレーター（例えば、抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ単量体、抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ二量体）をコードする免疫調節系プラスミド、パッケージング構築物、及び形質導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡ複合体を調製した。溶液を混合し、室温で１０分間インキュベートし、細胞の１０ｃｍ２ディッシュあたり８５０μｌの複合体を添加した。マウスＴ細胞を、それぞれＢａｌｂ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からＴ細胞分離キットを使用して磁気選択によって分離した。精製マウスＴ細胞を、ＲＰＭＩ １０％熱不活化ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びマウスＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ）中でマウスＴ細胞活性化ビーズ（１：１比）と共に２日間培養した。トランスフェクションの約４８時間後にウイルスを回収し、０．４μｍシリンジフィルターで濾過した。Ｔ細胞をレトロネクチン（製造業者のプロトコルに従って４０μｇ／ｍｌのレトロネクチンでコーティング）コーティングしたプレートに移し、適切な量のウイルスでスピン形質導入した。形質導入は、様々な時点でフローサイトメトリーによって確認し、定量した。
本実施例は、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦβＲ２に対する多量体結合剤を分泌するマウスＣＡＲ－Ｔ細胞のスクリーニング及び同定を説明する。マウスＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ レトロウイルスパッケージング細胞株をＤＭＥＭ ２０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン中で５０～７０％コンフルエントになるまで増殖させた。ＣＡＲ構築物及びＴＧＦＢモジュレーター（例えば、抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ単量体、抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ二量体）をコードする免疫調節系プラスミド、パッケージング構築物、及び形質導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡ複合体を調製した。溶液を混合し、室温で１０分間インキュベートし、細胞の１０ｃｍ２ディッシュあたり８５０μｌの複合体を添加した。マウスＴ細胞を、それぞれＢａｌｂ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からＴ細胞分離キットを使用して磁気選択によって分離した。精製マウスＴ細胞を、ＲＰＭＩ １０％熱不活化ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びマウスＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ）中でマウスＴ細胞活性化ビーズ（１：１比）と共に２日間培養した。トランスフェクションの約４８時間後にウイルスを回収し、０．４μｍシリンジフィルターで濾過した。Ｔ細胞をレトロネクチン（製造業者のプロトコルに従って４０μｇ／ｍｌのレトロネクチンでコーティング）コーティングしたプレートに移し、適切な量のウイルスでスピン形質導入した。形質導入は、様々な時点でフローサイトメトリーによって確認し、定量した。
【0377】
細胞をＦＡＣＳ緩衝液中の２５０ｎｇのｈＣＤ１９－ｈＦｃタンパク質と共に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をヒトＦＣに対する二次抗体を用いて室温で２０分間再懸濁した。いくつかの実験では、ＣＤ４、ＣＤ８、または他の表面マーカーに対する抗体を加えた。ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅを使用して死細胞を分析から除外した。細胞をＰＢＳ ２％ＦＣＳ ４％ホルムアルデヒドで固定した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）によって分析した。形質導入効率を、ＣＡＲ染色陽性の生細胞の割合（％）として示す。
【0378】
フローサイトメトリーの結果から、非アーマー化Ｔ細胞、ＴＧＦ－β単量体、ＴＧＦ－β二量体、及び非形質導入細胞の相対的な割合が示された。形質導入後２日目に採取したマウスＣＡＲ－Ｔ細胞由来の上清を、ＴＧＦ－ｂシグナル伝達の阻害について、ＳＢＥ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－ｂレポーターアッセイ（実施例４に記載の方法）において調べた。ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ単量体及び二量体を分泌するマウスＣＡＲ－Ｔ由来の上清は、ルシフェラーゼレポーター活性に基づいてＴＧＦ－ｂシグナル伝達を阻害した。ＴＧＦ－β及びＴＧＦβＲ２に対する多量体抗体を分泌した、マウスＣＡＲ－Ｔ細胞が同定された。
【0379】
形質導入の２日後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡに使用するまで－８０℃で凍結した。ＥＬＩＳＡを実施例３に記載のように行った。ヒトＴＧＦｂＲ２に対する結合剤を捕捉するためにヒト組換えＴＧＦｂＲ２－Ｆｃタンパク質を使用し、マウスＴＧＦｂＲ２へのＴＧＦｂＲ２結合剤の結合を調べるためにマウス組換えＴＧＦｂＲ２－Ｆｃタンパク質を使用した。抗ｆｌａｇ ＨＲＰ抗体及びそれぞれの基質を使用して、結合を検出した。図７に示すように、結合剤ｈＴＧＦｂＲ２－ＶＨ２及びｈＴＧＦｂＲ２－ＶＨ３単量体及び二量体、ならびにＴＧＦｂＲ２ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ単量体及び二量体の分泌、ならびにそれらのヒトＴＧＦｂＲ２への結合を示す。試験した上清由来の結合剤は、いずれもマウスＴＧＦｂＲ２に結合せず、ヒトＴＧＦＢＲ２に対する特異性が確認された。
【0380】
実施例６． ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
本実施例は、抗ＴＧＦ－β ｍＡｂ分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。マウスのアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＧＦｂシグナル伝達モジュレーターを共発現する）は、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも同系ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９腫瘍の増殖を阻害する。さらに、アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞は、肝臓と肺の転移を軽減する。ＣＡＲ－Ｔ標的抗原としてヒトＣＤ１９とホタルルシフェラーゼを過剰発現するＥＭＴ６乳癌細胞株を生成した。ＥＦ１ａプロモーター制御下のヒトＣＤ１９及びピューロマイシン耐性をコードするプラスミドを保有するウイルスをＥＭＴ６細胞に形質導入した。ピューロマイシンを使用してＥＭＴ６－ｈＣＤ１９細胞を陽性選択し、ＦＡＣＳソーティングによってさらに精製した。ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９細胞に、ＥＦ１ａプロモーター制御下のホタルルシフェラーゼ及びネオマイシン耐性をコードするプラスミドを保有するウイルス（Ａｍｓｂｉｏ）を５×１０７ＩＦＵ／ｍＬで形質導入した（ＭＯＩ＝１０、ポリブレン存在下）。Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を使用してＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ細胞を陽性選択した。
本実施例は、抗ＴＧＦ－β ｍＡｂ分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。マウスのアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＧＦｂシグナル伝達モジュレーターを共発現する）は、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも同系ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９腫瘍の増殖を阻害する。さらに、アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞は、肝臓と肺の転移を軽減する。ＣＡＲ－Ｔ標的抗原としてヒトＣＤ１９とホタルルシフェラーゼを過剰発現するＥＭＴ６乳癌細胞株を生成した。ＥＦ１ａプロモーター制御下のヒトＣＤ１９及びピューロマイシン耐性をコードするプラスミドを保有するウイルスをＥＭＴ６細胞に形質導入した。ピューロマイシンを使用してＥＭＴ６－ｈＣＤ１９細胞を陽性選択し、ＦＡＣＳソーティングによってさらに精製した。ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９細胞に、ＥＦ１ａプロモーター制御下のホタルルシフェラーゼ及びネオマイシン耐性をコードするプラスミドを保有するウイルス（Ａｍｓｂｉｏ）を５×１０７ＩＦＵ／ｍＬで形質導入した（ＭＯＩ＝１０、ポリブレン存在下）。Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を使用してＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ細胞を陽性選択した。
【0381】
６～１６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）の乳房脂肪体（同所性）に０．２×１０６個の生存可能なＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞を接種した。移植の６日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３）を有する処置群に無作為に割り付け、シクロホスファミド（ＣＰＡ、２００ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で処置した。翌日、類遺伝子性のＣＤ４５．１ Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の５００，０００個のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入Ｔ細胞を投与し、群２にはＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３には抗ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。
【0382】
腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した（図８）。２０００ｍｍ３を上回る腫瘍または潰瘍化腫瘍を有するマウスはすべて殺処分した。抗腫瘍効果を、非形質導入Ｔ細胞を注射した対照マウスと比較した腫瘍サイズの減少として評価した。完全レスポンダーは、検出可能な腫瘍を有していないマウスとして定義した。
【0383】
ＴＧＦ－β結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞は、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、高い抗腫瘍効果を示した。ルシフェリンの注射及びＩＶＩＳによる画像化によって、ホタルルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞について、肝臓と肺を画像化した。Ｄ－ルシフェリン溶液（Ｄ－ルシフェリン、カリウム塩 Ｖｉｖｏ Ｇｌｏ ｔｍ ルシフェリン）を１５ｍｇ／ｍｌで調製し、１５０ｍｇ／ｋｇで使用した。ＴＧＦ－β結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスは、肝臓及び肺の転移を減少させることができた（図８Ａ～８Ｅ）。
【0384】
ＴＧＦ－β（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１）に対する阻害抗体を分泌するヒトＣＤ１９に対するマウスＣＡＲ－Ｔは、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも同系ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９腫瘍の増殖を阻害し、肝臓及び肺への転移を減少させる。アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性の向上を識別するために、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔに対して次善の効果を与えるようにＣＡＲ－Ｔ細胞の数を事前に滴定した。
【0385】
実施例７． ＴＧＦｂＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を分泌するアーマー化マウスＣＡＲ－Ｔ細胞はＴＧＦｂシグナル伝達を阻害する
異なるＴＧＦ－βリガンドトラップ（ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１～ＴＧＦｂＲ２ ＥＣＤ単量体、ホモ二量体（図９Ａ）及びヘテロ二量体（図９Ｂ）を分泌するアーマー化マウスＣＡＲ－Ｔ由来の上清を、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔと比較するＳＢＥ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－βレポーターアッセイを実施した。ＳＢＥ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－βレポーターアッセイは、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）二量体を分泌するヒトＣＤ１９に対するアーマー化マウスＣＡＲ－Ｔ由来の上清が良好に阻害し、ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１二量体と同等の阻害を示すが、単量体はそうではなかったことを示した。形質導入の２日後に上清を回収した。ＴＧＦβＲ２ ＥＣＤ及びＴＧＦβＲ１ ＥＣＤを含むＴＧＦβＲ２ ＥＣＤヘテロ二量体の阻害を評価した。ＴＧＦ－β ｓｃＦＶ ＶＨ－ＶＬ１よりも強力にＴＧＦ－ｂシグナル伝達を阻害するＴＧＦβＲ２ ＥＣＤヘテロ二量体を同定した。例示的なＴＧＦβＲ２ ＥＣＤ配列を表４に示す。
異なるＴＧＦ－βリガンドトラップ（ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１～ＴＧＦｂＲ２ ＥＣＤ単量体、ホモ二量体（図９Ａ）及びヘテロ二量体（図９Ｂ）を分泌するアーマー化マウスＣＡＲ－Ｔ由来の上清を、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔと比較するＳＢＥ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－βレポーターアッセイを実施した。ＳＢＥ－Ｌｕｃ ＴＧＦ－βレポーターアッセイは、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）二量体を分泌するヒトＣＤ１９に対するアーマー化マウスＣＡＲ－Ｔ由来の上清が良好に阻害し、ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１二量体と同等の阻害を示すが、単量体はそうではなかったことを示した。形質導入の２日後に上清を回収した。ＴＧＦβＲ２ ＥＣＤ及びＴＧＦβＲ１ ＥＣＤを含むＴＧＦβＲ２ ＥＣＤヘテロ二量体の阻害を評価した。ＴＧＦ－β ｓｃＦＶ ＶＨ－ＶＬ１よりも強力にＴＧＦ－ｂシグナル伝達を阻害するＴＧＦβＲ２ ＥＣＤヘテロ二量体を同定した。例示的なＴＧＦβＲ２ ＥＣＤ配列を表４に示す。
【0386】
【表4-1】
【0387】
【表4-2】
【0388】
実施例８． ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを分泌するアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果
本実施例は、抗ＴＧＦβ ｍＡｂまたはＴＧＦβ Ｒ２－ＥＣＤ分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞の相対的なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。
本実施例は、抗ＴＧＦβ ｍＡｂまたはＴＧＦβ Ｒ２－ＥＣＤ分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞の相対的なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。
【0389】
ＴＧＦβＲ２ ＥＣＤ１＋２二量体を分泌するマウスＣＡＲ－Ｔは、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍機能の向上を示す。６～１６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）の乳房脂肪体（同所性）に０．２×１０６個の生存可能なＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞を接種した。移植の６日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝８）を有する処置群に無作為に割り付け、シクロホスファミド（ＣＰＡ、２００ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で処置した。翌日、類遺伝子性のＣＤ４５．１ Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の２百万個のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入対照Ｔ細胞を投与し、群２には非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３にはＴＧＦｂＲ１＋２ ＥＣＤ二量体分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群４には全身性抗ＴＧＦ－β抗体（クローン１Ｄ１１．１６．８、１０ｍｇ／ｋｇ、注射３回／週、静脈内）を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。２０００ｍｍ３を上回る腫瘍または潰瘍化腫瘍を有するマウスはすべて、研究所の動物衛生プロトコルに従って殺処分した。抗腫瘍効果を、非形質導入Ｔ細胞を注射した対照マウスと比較した腫瘍サイズの減少として評価した。完全レスポンダーは、検出可能な腫瘍を有していないマウスとして定義した。
【0390】
ＴＧＦ－βリガンドトラップ（ｍＴＧＦｂＲ２ ＥＣＤ１＋２二量体１）を分泌するヒトＣＤ１９に対するマウスＣＡＲ－Ｔは、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも同系ＥＭＴ６－ｈＣＤ１９腫瘍の増殖を阻害し、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞もしくは非形質導入Ｔ細胞を投与するか、または全身性抗ＴＧＦ－β抗体（１Ｄ１１、１０ｍｇ／ｋｇ、週３回静脈内投与）で処置した対照マウスでは完全奏効がなかったのに対して、３つの完全奏効を誘導した。（図１０）
【0391】
実施例９．同系腫瘍モデル（ＭＣ３８－ｈＣＤ１９）におけるＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを分泌するアーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果
本実施例は、抗ＴＧＦβ ｍＡｂまたはＴＧＦβ Ｒ２－ＥＣＤ分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞の相対的なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。異なる同系腫瘍モデル（ＭＣ３８－ｈＣＤ１９）での、抗ＴＧＦ－ｂ ｍＡｂ（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１）でアーマー化されたマウスＣＡＲ－Ｔ細胞の機能の向上。
本実施例は、抗ＴＧＦβ ｍＡｂまたはＴＧＦβ Ｒ２－ＥＣＤ分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞の相対的なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。異なる同系腫瘍モデル（ＭＣ３８－ｈＣＤ１９）での、抗ＴＧＦ－ｂ ｍＡｂ（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１）でアーマー化されたマウスＣＡＲ－Ｔ細胞の機能の向上。
【0392】
ＣＡＲ－Ｔ標的抗原としてのヒトＣＤ１９、及びホタルルシフェラーゼを過剰発現するＭＣ３８結腸直腸癌細胞株を生成し、画像化に使用した。簡潔に述べると、ＥＦ１ａプロモーター制御下のヒトＣＤ１９、及びピューロマイシン耐性をコードするプラスミドを保有するウイルス（ＣＤ１９＿ＦＬ＿ＷＴ＿ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ）をＭＣ３８細胞に形質導入した。ＭＣ３８－ｈＣＤ１９細胞をピューロマイシンを使用して陽性選択した。ＭＣ３８－ｈＣＤ１９細胞に、ＥＦ１ａプロモーター制御下のホタルルシフェラーゼ、及びネオマイシン耐性をコードするプラスミドを保有するウイルス（Ａｍｓｂｉｏ、カタログ番号ＬＶＰ４３５－ＰＢＳ、５×１０＾７ＩＦＵ／ｍＬ、ＭＯＩ＝１０）をポリブレンの存在下で形質導入した。ＭＣ３８－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ細胞を、Ｇ４１８（ジェネティシン）を使用して陽性選択した。
【0393】
６～１６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に、０．２×１０６個の生存可能なＭＣ３８－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞を皮下接種した。移植の７日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝８）の処置群に無作為に割り付け、シクロホスファミド（ＣＰＡ、２００ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で処置した。翌日、類遺伝子性のＣＤ４５．１ Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の１００，０００個のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞（または陰性対照としての非形質導入Ｔ細胞）を尾静脈に注射した。群１には、非形質導入Ｔ細胞を投与した。群２には、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。群３には、抗ＴＧＦ－β分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１）を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。２０００ｍｍ３を上回る腫瘍または潰瘍化腫瘍を有するマウスはすべて、研究所の動物衛生プロトコルに従って殺処分した。抗腫瘍効果を、非形質導入Ｔ細胞を注射した対照マウスと比較した腫瘍サイズの減少として評価した。完全レスポンダーは、検出可能な腫瘍を有していないマウスとして定義した。
【0394】
ＴＧＦ－βに対する阻害結合剤（ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１）を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞は、非アーマー化ＣＡＲ－Ｔよりも優れた有効性を示し、等量の非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞のいずれかを投与した対照群では完全奏効がなかったのに対し、８匹の処置マウスのうち、７匹で完全奏効を誘導した。（図１１）
【0395】
実施例１０． ＴＧＦ－βシグナル伝達モジュレーターを分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞は宿主免疫応答の活性化を増強する
本実施例は、ＴＧＦ－βに対する結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞によって、宿主の免疫応答の活性化が増強されることがＲＮＡ Ｓｅｑで示されたことを示す。
本実施例は、ＴＧＦ－βに対する結合剤を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞によって、宿主の免疫応答の活性化が増強されることがＲＮＡ Ｓｅｑで示されたことを示す。
【0396】
６～１６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）の乳房脂肪体（同所性）に０．２×１０６個の生存可能なＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞を接種した。移植の６日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝８）を有する処置群に無作為に割り付け、シクロホスファミド（ＣＰＡ、２００ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で処置した。翌日、類遺伝子性のＣＤ４５．１ Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の２百万個のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入対照Ｔ細胞を投与し、群２には非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３には抗ＴＧＦ－βｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１分泌ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。群４は全身性抗ＴＧＦ－β抗体（クローン１Ｄ１１．１６．８、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、週３回、静脈内）で処置し、群５にはアイソタイプ対照抗体（クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、週３回、静脈内）を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。
【0397】
マウスを＋１２日目に安楽死させ、腫瘍を採取し、急速冷凍して－８０℃で保存した。図１２に示すように、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ－Ｓｅｑとそれに続く計算分析を行った。
【0398】
ＴＧＦ－βｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１を分泌するＣＡＲ－Ｔを投与したマウス由来の腫瘍は、他の群のマウスに比べて、腫瘍浸潤性Ｔ細胞（ＣＤ３ｄ＋、ＣＤ３ｅ＋、ＣＤ３ｇ＋）、特にＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８ａ＋）、及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＧｚｍＢ＋）について、スコアが有意に増加していた（図１３）。
【0399】
ｓｓＧＳＥＡ濃縮スコアでは、ＴＧＦ－βｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１を分泌するＣＡＲ－Ｔを投与したマウス由来の腫瘍において、Ｔ細胞シグネチャー及びＩＦＮｇシグネチャーの増加が示され、ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤の増加及び／または内在性免疫系の活性化が示された。ＴＧＦ－βｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１を分泌するＣＡＲ－Ｔを投与したマウス由来の腫瘍における内皮活性化、共刺激、及び抗原提示のシグネチャーの増加は、内在性免疫系の活性化を明らかに示している。したがって、遮断抗体（または他の結合剤）によるＣＡＲ－Ｔ細胞のアーマー化は、内在性免疫応答を向上させることによって、少なくとも部分的にＴＧＦ－β経路の抗腫瘍効果を阻害する（図１４）。
【0400】
実施例１１． 非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したＥＭＴ６－ｈＣＤ１９マウス由来の腫瘍試料のＦＡＣＳ
６～１６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）の乳房脂肪体（同所性）に０．２×１０６個の生存可能なＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞を接種した。移植の６日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝８）を有する処置群に無作為に割り付け、シクロホスファミド（ＣＰＡ、２００ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で処置した。翌日、類遺伝子性のＣＤ４５．１ Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の２百万個のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入対照Ｔ細胞を投与し、群２には非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３には抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１単量体を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。
６～１６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）の乳房脂肪体（同所性）に０．２×１０６個の生存可能なＥＭＴ６－ｈＣＤ１９－Ｆｌｕｃ腫瘍細胞を接種した。移植の６日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝８）を有する処置群に無作為に割り付け、シクロホスファミド（ＣＰＡ、２００ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）で処置した。翌日、類遺伝子性のＣＤ４５．１ Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の２百万個のマウスＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入対照Ｔ細胞を投与し、群２には非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３には抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１単量体を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。
【0401】
マウスを＋７日目に安楽死させ、腫瘍を採取し、重量を測定し、ＦＡＣＳ分析のために処理した。簡潔に述べると、腫瘍を小片に切断し、マウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造業者の指示に従って使用して消化した。試料をＰＢＳ ２％ＦＣＳに再懸濁し、濾過し、ＦＡＣＳ染色のために９６ウェルプレートにプレーティングした。Ｆｃ受容体をブロッキングし（ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（抗マウスＣＤ１６／３２）抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＡＲをｒｈｕＣＤ１９（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して４℃で１時間標識し、その後、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、ＴＣＲａ／ｂ、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５．１、及びＣＤ４５を含む表面マーカーを使用してｈＣＤ１９－Ｆｃについて標識し、固定可能な生死判定色素（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して生細胞を染色し、ＧｚｍＢ、Ｋｉ６７、及びＦｏｘＰ３を含む細胞内抗原をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して染色した。試料を濾過し、フローサイトメーターＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得した。
【0402】
図１５に示すように、ＦＡＣＳ染色では、非形質導入細胞または非アーマー化ＣＡＲ－Ｔを投与した対照と比較して、ＴＧＦ－β ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ分泌ＣＡＲ－Ｔを投与したマウス由来の試料において、ｈＣＤ１９＋腫瘍細胞の減少と、Ｔ細胞浸潤の増加（ｍｇ腫瘍組織あたり）が示された。ＣＤ４５．１＋及びＣＤ４５．１－ Ｔ細胞のゲーティングでは、特に内在性Ｔ細胞浸潤（ＣＤ４５．１－）の増加が示される。これらの試料から移入されたＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋）はより高いＣＡＲ発現レベルを示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、より高いＣＤ２５発現を示し、活性化の増加を示した。宿主Ｔ細胞（ＣＤ４５．１－）由来のＣＤ８＋Ｔ細胞ではＧｚｍＢの発現が高かったが、これは細胞傷害性が高いことを示している。まとめると、これらのＦＡＣＳデータは、ＴＧＦ－βに対する結合剤によるＣＡＲ－Ｔ細胞のアーマー化がＣＡＲ－Ｔ細胞の機能及び内在性免疫応答を増強することを示している。
【0403】
実施例１２．異種移植モデルは、抗ＴＧＦ－βまたは抗ＴＧＦβＲ２遮断抗体でアーマー化したヒトＧＣＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能の向上を示す
６～１６週齢のメスのＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に２×１０６個の生存可能なＧＳＵ腫瘍細胞を皮下接種した。移植の７日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝６）を有する処置群に無作為に割り付けた。翌日、５００，０００個または１００，０００個のヒトＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入対照Ｔ細胞を投与し、群２には非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３には抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１単量体を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群４には抗ＴＧＦβＲ２ ＶＨ３単量体を投与し、群５には抗ＴＧＦβＲ２ ＶＨＨ二量体を分泌するＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。抗ＴＧＦ－βまたは抗ＴＧＦβＲ２遮断抗体でアーマー化したＧＣＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、５００，０００個の移入細胞において非アーマー化対照ＣＡＲ－Ｔよりも速い応答を示し、１００，０００個の移入ＣＡＲ－Ｔ細胞においては、抗腫瘍効果の向上を示した。（図１６）。
６～１６週齢のメスのＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に２×１０６個の生存可能なＧＳＵ腫瘍細胞を皮下接種した。移植の７日後、腫瘍サイズは約５０ｍｍ３に達し、マウスを同様の平均腫瘍サイズ（平均約５０ｍｍ３、群あたりｎ＝６）を有する処置群に無作為に割り付けた。翌日、５００，０００個または１００，０００個のヒトＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注射した。群１には非形質導入対照Ｔ細胞を投与し、群２には非アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群３には抗ＴＧＦ－ｂ ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ１単量体を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、群４には抗ＴＧＦβＲ２ ＶＨ３単量体を投与し、群５には抗ＴＧＦβＲ２ ＶＨＨ二量体を分泌するＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。体重を週２回測定して、毒性をモニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して計算した。抗ＴＧＦ－βまたは抗ＴＧＦβＲ２遮断抗体でアーマー化したＧＣＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、５００，０００個の移入細胞において非アーマー化対照ＣＡＲ－Ｔよりも速い応答を示し、１００，０００個の移入ＣＡＲ－Ｔ細胞においては、抗腫瘍効果の向上を示した。（図１６）。
【0404】
ＴＧＦβモジュレーターの腫瘍濃度及び血漿濃度を、抗Ｆｌａｇ免疫捕捉ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して測定した。図１７Ａ～１７Ｄに示すように、アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスの循環中に分泌されたＴＧＦ－β抗体または抗ＴＧＦｂＲ２抗体は少量であった。示された量のアーマー化または非アーマー化抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスから、ＥＤＴＡチューブを使用して血漿を採取した。
【0405】
図２０Ａ～２０Ｃに示すように、アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、ＧＣＣ陽性ＧＳＵ、ＨＴ５５、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＦＰ４ Ｌｕｃ異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。
【0406】
ＨＴ５５腫瘍細胞の脾臓内注射とその後のＣＡＲ－Ｔ細胞の静脈内注射を使用して肝転移を評価した。アーマー化ＣＡＲ－Ｔ細胞は、アイソタイプ対照と比較して肝臓への転移を遅延させた（図２１Ａ～２１Ｃ）
【0407】
実施例１３．ＧＣＣ陽性腫瘍における抗原刺激の繰り返し
１００，０００個の非アーマー化またはアーマー化された抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＧＣＣ ＣＡＲ及びＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２－ＶＨＨ）を共発現する）を、ＴＧＦ－β（１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、２００，０００個のＨＴ２９－ＧＣＣまたはＨＴ２９親（ＧＣＣ陰性）腫瘍細胞と共に２つ組で共培養した。３～４日ごとに、ウェルあたり半分のＣＡＲ－Ｔ細胞を、同じ条件下（ＴＧＦ－β １ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌの存在下または非存在下）で新しい腫瘍細胞のプレートに移した。上清を採取し、後の評価のために凍結させた。細胞を、細胞計数、及びＦＡＣＳ染色分析で評価した。
１００，０００個の非アーマー化またはアーマー化された抗ＧＣＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＧＣＣ ＣＡＲ及びＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２－ＶＨＨ）を共発現する）を、ＴＧＦ－β（１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、２００，０００個のＨＴ２９－ＧＣＣまたはＨＴ２９親（ＧＣＣ陰性）腫瘍細胞と共に２つ組で共培養した。３～４日ごとに、ウェルあたり半分のＣＡＲ－Ｔ細胞を、同じ条件下（ＴＧＦ－β １ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌの存在下または非存在下）で新しい腫瘍細胞のプレートに移した。上清を採取し、後の評価のために凍結させた。細胞を、細胞計数、及びＦＡＣＳ染色分析で評価した。
【0408】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、腫瘍細胞を評価した。Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーを使用してプレートを分析した。死滅率は、次式を使用して評価した：
死滅率（％）＝（１－（試験ウェルからのシグナル／対照ウェルからのシグナル））＊１００
死滅率（％）＝（１－（試験ウェルからのシグナル／対照ウェルからのシグナル））＊１００
【0409】
対照ウェルには、ＣＡＲ－Ｔ細胞に使用したものと同じドナー由来の非形質導入Ｔ細胞と共培養した腫瘍細胞が含まれていた。ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５に対する蛍光標識抗体、ならびに枯渇マーカーＰＤ－１、ＴＩＭ－３、Ｌａｇ－３、及びＴＩＧＩＴ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＦＡＣＳ染色を週１回実施した。固定可能な生死判定色素ｅｆｌｕｏｒ５０６（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、製造業者のプロトコルに従って）を使用して死細胞を除外した。ＣＡＲ発現細胞をＧＣＣ－ｈＦｃと共に４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ ２％ＦＣＳで洗浄し、マウス抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出した（３０分、４℃）。
【0410】
慢性的な抗原活性化をシミュレートする標的細胞による数回の再刺激の後、ＴＧＦ－βは、ＣＡＲ－Ｔ細胞機能の阻害を誘導する。ＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２ ＶＨＨ二量体）を分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞のみが、ＴＧＦ－β（１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌ）刺激の阻害効果から保護される（図１８Ａ～１８Ｃ）。ＣＡＲ－Ｔ死滅に対する阻害効果は、増殖の阻害及び疲労マーカーＬａｇ３の誘導と相関する。
【0411】
実施例１４．メソテリン（Ｍｓｌｎ）陽性腫瘍における抗原刺激の繰り返し
Ｍｓｌｎに対するＣＡＲ及びＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２－ＶＨもしくはｄｎＴＧＦｂＲ２）、またはＧＦＰに対する対照ＶＨ（Ｍｓｌｎ対照ＶＨ）を共発現する、およそ１００，０００個のｉＰＳＣ由来抗Ｍｓｌｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＴＧＦ－β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ヒトＭｓｌｎを過剰発現する４０，０００個のＭｉａＰａｃａ－２腫瘍細胞と共に２つ組で共培養した。ＴＧＦβＲ２－ＶＨは、ＣＡＲ－Ｔ細胞から分泌され、ｄｎＴＧＦｂＲ２は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の膜に結合した。３～４日ごとに、ウェルあたり半分のＣＡＲ－Ｔ細胞を、同じ条件下（ＴＧＦ－β １０ｎｇ／ｍｌの存在下または非存在下）で新しい腫瘍細胞のプレートに移した。上清を採取し、後の評価のために凍結させた。選択された時点でＣＡＲ－Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって計数し、ＦＡＣＳ表現型解析を実施した（図２２Ａ）。
Ｍｓｌｎに対するＣＡＲ及びＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２－ＶＨもしくはｄｎＴＧＦｂＲ２）、またはＧＦＰに対する対照ＶＨ（Ｍｓｌｎ対照ＶＨ）を共発現する、およそ１００，０００個のｉＰＳＣ由来抗Ｍｓｌｎ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＴＧＦ－β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ヒトＭｓｌｎを過剰発現する４０，０００個のＭｉａＰａｃａ－２腫瘍細胞と共に２つ組で共培養した。ＴＧＦβＲ２－ＶＨは、ＣＡＲ－Ｔ細胞から分泌され、ｄｎＴＧＦｂＲ２は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の膜に結合した。３～４日ごとに、ウェルあたり半分のＣＡＲ－Ｔ細胞を、同じ条件下（ＴＧＦ－β １０ｎｇ／ｍｌの存在下または非存在下）で新しい腫瘍細胞のプレートに移した。上清を採取し、後の評価のために凍結させた。選択された時点でＣＡＲ－Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって計数し、ＦＡＣＳ表現型解析を実施した（図２２Ａ）。
【0412】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、腫瘍細胞の生存率を評価した。Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーを使用してプレートを分析した。死滅率は、次式を使用して評価した：
【0413】
【数1】
【0414】
対照ウェルには、エフェクター（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ）細胞は含まれず、腫瘍細胞のみが含まれていた。細胞傷害率を図２２Ｂに示す。
Ｓｙｔｏｘ Ｒｅｄ色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、製造業者のプロトコルに従って）を使用して死細胞を除外することによって細胞数を計測し、ＨＴＳユニットを使用してＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で等量の細胞懸濁液を取得した。生存ＣＡＲ－Ｔ細胞を、生存細胞、単一細胞、及びサイズをゲーティングすることによって計数した。結果を外挿してウェルあたりの細胞数を取得した。
Ｓｙｔｏｘ Ｒｅｄ色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、製造業者のプロトコルに従って）を使用して死細胞を除外することによって細胞数を計測し、ＨＴＳユニットを使用してＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で等量の細胞懸濁液を取得した。生存ＣＡＲ－Ｔ細胞を、生存細胞、単一細胞、及びサイズをゲーティングすることによって計数した。結果を外挿してウェルあたりの細胞数を取得した。
【0415】
慢性抗原活性化をシミュレートする標的細胞による数回の再刺激の後、ＴＧＦ－βが、ＣＡＲ－Ｔ細胞機能の阻害（すなわち死滅）を誘導し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を阻害したことが観察された。ＴＧＦβモジュレーター（例えば、ＴＧＦβＲ２ ＶＨ二量体の分泌または膜結合ｄｎＴＧＦｂＲ２の発現）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のみが、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の阻害効果から保護され、対照ＶＨは保護されなかった。
【0416】
配列表
以下の表５は、分類記載及び本明細書に開示される配列を示す。
以下の表５は、分類記載及び本明細書に開示される配列を示す。
【0417】
【表5-1】
【0418】
【表5-2】
【0419】
【表5-3】
【0420】
【表5-4】
【0421】
【表5-5】
【0422】
【表5-6】
【0423】
【表5-7】
【0424】
【表5-8】
【0425】
【表5-9】
【0426】
【表5-10】
【0427】
【表5-11】
【0428】
【表5-12】
【0429】
均等物及び範囲
当業者は、ただの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
当業者は、ただの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
【0430】
このように、本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様について記載してきたが、当業者には様々な変更、修正、及び改善が容易に明らかとなることが十分に理解される。そのような変更、修正、及び改善は、本開示の一部であることを意図し、本発明の趣旨及び範囲内であることを意図する。したがって、前述の記載及び図面は単なる一例にすぎず、本発明は以下の特許請求の範囲によって詳細に記載される。
【0431】
本請求要素を修正するために、特許請求の範囲内における「第１」、「第２」、「第３」などの通常用語の使用は、それ自体が、１つの請求要素の任意の優先度、優先権、もしくは順序を別の請求要素に対して暗示するものではないか、または方法のその行為が行われる時間的順序を暗示するものでもないが、ある特定の名称を有する１つの請求要素を、同じ名称を有する（通常用語の使用を別として）別の請求要素と区別し、当該請求要素を区別するための単なる標識として使用される。
【0432】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、特に明確な反対の指示がない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、特に反対の指示がない限り、さもなければ文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうち１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の生成物またはプロセス中に存在するか、それに用いられるか、さもなければそれに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在するか、それに用いられるか、さもなければそれに関連する実施形態を含む。本発明はまた、群のメンバーのうち２つ以上、または全体が、所与の生成物またはプロセス中に存在するか、それに用いられるか、さもなければそれに関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、列挙されている請求項のうち１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または関連するような、任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入されるすべての変更、組合せ、及び順列を包含すると理解されるべきである。要素が一覧表として（例えば、マーカッシュ群または同様の形式で）提示される場合、その要素の各部分群も開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ることが理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとみなされる場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になると理解されるべきである。簡潔にするために、それらの実施形態は、いずれの場合においても本明細書では多数の用語で具体的に記載されているわけではない。特定の除外が本明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様が、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。本発明の背景を記載し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で言及される刊行物、ウェブサイト及び他の参考資料は、参照によって本明細書に援用される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図22】
【国際調査報告】