特表 2024-512382 ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240312BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240312BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 U

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P43/00 107

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61P35/04

A61P35/02

A61K47/68

A61K38/20

C07K16/46 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023555147

(86)(22)【出願日】2022-03-08

(85)【翻訳文提出日】2023-10-31

(86)【国際出願番号】 EP2022055796

(87)【国際公開番号】W WO2022189380

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】21161465.6

(32)【優先日】2021-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】コダッリ ディーク， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ニコリーニ， バレリア

(72)【発明者】

【氏名】ウマーニャ， パブロ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C084AA01

4C084AA02

4C084CA53

4C084DA14

4C084NA05

4C084NA07

4C084NA13

4C084ZB221

4C084ZB222

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA25

4C085BB11

4C085BB36

4C085CC21

4C085DD62

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、特異的ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと、ヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する特異的抗体との併用療法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんの治療における併用療法としての使用のための、転移の予防若しくは治療における併用療法としての使用のための、腫瘍免疫等の免疫関連疾患の治療若しくはその進行の遅延における併用療法としての使用のための、又はＴ細胞活性等の免疫応答若しくは機能の刺激における併用療法としての使用のための、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートであって、
前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む、
抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項2】

乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫のがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃癌腫のがん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療における使用のための、請求項１に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項3】

前記免疫コンジュゲートの抗体成分及び前記抗体が、ヒトＩｇＧ_１又はヒトＩｇＧ_４サブクラスのものであることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項4】

前記抗体が、低下した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項5】

前記最小のエフェクター機能が、エフェクターレスＦｃ変異に起因する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項6】

前記エフェクターレスＦｃ変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項7】

前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項8】

前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項9】

ｉ）腫瘍における腫瘍成長の阻害、並びに／又は
ｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／若しくは全生存率の向上
における使用のための、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートであって、
ＰＤ－１は、免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境内で提示され、
前記併用療法において使用される前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉ）配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｖ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
前記併用療法において使用される前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む第２の抗原結合部分、
ｉｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又は
ｉｖ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列
を含むことを特徴とする、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項10】

前記併用療法において使用される前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、前記併用療法において使用される前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【請求項11】

前記患者が免疫療法で治療されているか、又は免疫療法で前治療されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと、ヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体との併用療法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
がんは、経済的に発展した国における主要な死因であり、発展途上国における２番目に主要な死因である。化学療法の最近の進歩及びがん細胞における成長シグナルの伝達及び調節を妨害する分子レベルで標的化される薬剤の開発にもかかわらず、進行がんを有する患者の予後は一般に不良のままである。その結果、許容できない毒性を引き起こすことなく生存率を高めるために既存の治療に追加することができる新しい治療法を開発することに持続的且つ緊急の医学的必要性がある。

【0003】

インターロイキン２（ＩＬ－２）は、リンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化するサイトカインである。ＩＬ－２は抗腫瘍活性を有することが示されているが、高レベルのＩＬ－２は肺毒性をもたらし、ＩＬ－２の抗腫瘍活性はいくつかの阻害性フィードバックループによって制限される。

【0004】

その抗腫瘍有効性に基づいて、高用量ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）として市販されているアルデスロイキン）治療は、米国では転移性腎細胞癌腫（ＲＣＣ）及び悪性黒色腫の患者に、欧州連合では転移性ＲＣＣの患者に使用することが承認されている。しかしながら、ＩＬ－２の作用様式の結果として、ＩＬ－２の全身及び非標的適用は、Ｔ_ｒｅｇ細胞及びＡＩＣＤの誘導を介して抗腫瘍免疫をかなり損なう可能性がある。全身ＩＬ－２治療の更なる懸念は、静脈内投与時の重篤な副作用に関連しており、これには、重篤な心血管、肺水腫、肝臓、胃腸（ＧＩ）、神経学的及び血液学的事象（プロロイキン（アルデスロイキン）製品特性の概要［ＳｍＰＣ］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｅｍｃ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／１９３２２／ＳＰＣ／（２０１３年５月２７日にアクセス））が含まれる。低用量ＩＬ－２レジメンが患者において試験されているが、最適とはいえない治療結果であった。まとめると、ＩＬ－２を利用する治療アプローチは、その適用に関連する責任を克服することができる場合、がん治療に有用であり得る。ＰＤ－１標的化抗原結合部分及びＩＬ－２ベースのエフェクター部分を含む免疫コンジュゲートは、例えば国際公開第２０１８／１８４９６４号Ａ１に記載されている。

【0005】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＣＤ２７９）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ－１は、細胞表面受容体であり、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞で発現している（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ－１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様の細胞外ドメインと、免疫受容体阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンに基づくスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインとからなるモノマー型１膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化を下方制御することが示されているＰＤ－１の２種類のリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が特定されている（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔａｌ（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、両方ともＰＤ－１に結合するＢ７ホモログであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。ＰＤ－１の１つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１は、種々のヒトがんで豊富である（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用によって、腫瘍浸潤性リンパ球が減少し、Ｔ細胞受容体が介在する増殖が減少し、がん性細胞による免疫回避が減少する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌｌとの局所的相互作用を阻害することによって逆転させ得、その効果は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用も遮断される場合に相加的である（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ７．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ９９：１２２９３－７；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７－６６）。ＰＤ－１に結合する抗体は、例えば国際公開第２０１７／０５５４４３号Ａ１に記載されている。

【0006】

ＣＤ３（分化抗原群３）は、４つのサブユニット、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖からなるタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体及びζ鎖と会合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。

【0007】

ＣＤ３は、創薬標的として広く研究されている。ＣＤ３を標的とするモノクローナル抗体は、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患又は移植片拒絶反応の治療における免疫抑制療法として使用されてきた。ＣＤ３抗体ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）は、１９８５年にヒトでの臨床使用が承認された最初のモノクローナル抗体であった。

【0008】

ＣＤ３抗体の最近の応用は、一方でＣＤ３に結合し、他方で腫瘍細胞抗原に結合する二重特異性抗体の形をとっている（Ｃｌｙｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ（２０１９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．７０：４３７－５０）。そのような抗体が両方の標的に同時に結合すると、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化され、その後標的細胞が溶解する。この目的のため、ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原ＴＹＲＰ１に結合する二重特異性抗体が開発されており、例えば国際公開第２０２０／１２７６１９号Ａ１に記載されている。標的としてのＴＹＲＰ１は、黒色腫細胞及びメラニン合成に関与するメラノサイトに存在し、ヒトにおけるメラノサイトの増殖及び生存にも影響を及ぼす。ＴＹＲＰ １抗体は以前に記載されており（Ｂｏｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．１６０（２）：１５１－７）、臨床試験で試験されている（Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２（２１）：５２０４－５２１０）。マウスモデルにおける使用のため、ＴＹＲＰ１及びＴ細胞二重特異性サロゲート抗体が抗腫瘍有効性を媒介したが、長期応答／治癒を誘導することができなかったことが記載されている（Ｂｅｎｏｎｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２）：３１２－３２２；Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．７（１）：２４７６）。

【0009】

患者の治療に有意に寄与する可能性を有する新しい化合物及び組み合わせが依然として必要とされている。したがって、本発明者らは、本明細書において、ＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合するＰＤ１－ＩＬ２ｖ及び二重特異性抗体の新規併用療法を記載する。

【発明の概要】

【0010】

本発明は、がんの治療における併用療法としての使用のための、転移の予防若しくは治療における併用療法としての使用のための、腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延における併用療法としての使用のための、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能の刺激における併用療法としての使用のための、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との併用療法を含み、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列を含み、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む。

【0011】

一態様では、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫のがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃癌腫のがん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療における使用のためのものであり得る。

【0012】

好ましい態様では、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、黒色腫又はメラニン細胞起源のがんの治療における使用のためのものであり得る。好ましい態様では、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ＴＹＲＰ１発現がんの治療における使用のためのものであり得る。

【0013】

一態様では、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫コンジュゲートの抗体成分及び抗体がヒトＩｇＧ_１又はヒトＩｇＧ_４サブクラスのものであることを特徴とする。

【0014】

更なる態様では、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体の抗体成分が、低下した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする。

【0015】

一態様では、最小のエフェクター機能は、エフェクターレスＦｃ突然変異に起因する。

【0016】

一態様では、エフェクターレスＦｃ突然変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、又はＮ２９７Ａ、又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。

【0017】

特定の態様では、本発明は、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを提供し、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、ｉｉ）配列番号８及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又はｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列を含み、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む。

【0018】

より特定の態様では、本発明は、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを提供し、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、ｉｉ）配列番号８及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又はｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列を含み、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、ｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又はｉｉｉ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列を含む。

【0019】

一態様では、本発明は、ｉ）腫瘍における腫瘍成長の阻害、並びに／又はｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／若しくは全生存期間の向上における使用のための、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを提供し、ＰＤ－１は、免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境内に提示され、併用療法において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ｉ）配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列、ｉｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、ｉｉｉ）配列番号８のポリペプチド配列及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又はｉｖ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ｉ）配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分、ｉｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、ｉｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又はｉｖ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列を含むことを特徴とする。

【0020】

一態様では、本発明は、併用療法において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを提供する。

【0021】

一態様では、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが患者に投与され、該患者は、免疫療法で治療されているか、又は免疫療法で前治療されている。当該免疫療法は、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞係合療法、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。養子細胞移入は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】単剤及び組み合わせとしてのｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ｍｕＦＡＰ－ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ－１及びｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢの生存グラフとして表される治療応答率を提示する。Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃダブルトランスフェクタント黒色腫細胞株をＢｌａｃｋ６アルビノマウスに静脈内注射して、肺転移性同系モデルにおける生存を研究した。マウス１匹あたりに注射される抗体の量（ｍｇ／ｋｇ）は以下の通りである：１ｍｇ／ｋｇ ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、１０ｍｇ／ｋｇ ｍｕＰＤ１、１．５ｍｇ／ｋｇ ｍｕＦＡＰ－ＩＬ２ｖ、及び１０ｍｇ／ｋｇ ｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢ。抗体を３週間にわたって週に１回静脈内注射した。試験した全ての他の単剤、組合せ及びビヒクル群と比較して、１ｍｇ／ｋｇのｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖと１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢとの組合せ群で有意に優れた生存期間中央値及び全生存期間が観察された。

【図2】単一薬剤として及び組み合わせて、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ｍｕＦＡＰ－ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ－１及びｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢを比較する有効性実験の結果を提示する。Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃダブルトランスフェクタント黒色腫細胞株をＢｌａｃｋ６アルビノマウスにｉ．ｖ．注射して、肺転移性同系モデルにおける生存を生物発光によって研究した。２４日目の最初の治療投与後と同じくらい早く、Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃ生物発光シグナルの減少が、いくつかのＴＹＲＰ１－ＴＣＢ治療群においてＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍによって検出された。ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖとｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢとの組み合わせのみが、実験の全期間にわたって持続する全てのマウスにおいてＢＬＩシグナルの完全な消失を示し、この組み合わせ群については６匹中６匹のマウスにおいて完全な応答が示された。

【発明を実施するための形態】

【0023】

発明の詳細な説明
ＩＬ－２経路
ＩＬ－２がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でリンパ球及びＮＫ細胞集団を拡大及び活性化する能力は、ＩＬ－２の抗腫瘍効果を説明する。しかしながら、過剰な免疫応答及び潜在的な自己免疫を防止するための調節機構として、ＩＬ－２は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をもたらし、活性化されたＴ細胞をＦａｓ媒介性アポトーシスに感受性にする。

【0024】

更に、ＩＬ－２は、末梢ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の維持及び拡大に関与している（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ＪＤ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ＪＰ，Ｇａｖｉｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｉｎ Ｆｏｘｐ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；６：１１４２－１１５１；Ｄ’Ｃｒｕｚ ＬＭ，Ｋｌｅｉｎ Ｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；６：１１５２ １１５９；Ｍａｌｏｙ ＫＪ，Ｐｏｗｒｉｅ Ｆ．Ｆｕｅｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ＩＬ－２ ｋｅｅｐｓ ＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇ ｃｅｌｌｓ ｆｉｔ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；６：１０７１－１０７２）。これらの細胞は、エフェクターＴ細胞が、細胞－細胞の接触によって、又は免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０若しくはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－βの放出によって、自己又は標的を破壊するのを抑制する。Ｔ_ｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ－２－誘導抗腫瘍免疫を増強することが示された（Ｉｍａｉ Ｈ，Ｓａｉｏ Ｍ，Ｎｏｎａｋａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２００７；９８：４１６－４２３）。

【0025】

ＩＬ－２はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の一次及び二次拡大中のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞分化において重要な役割を果たす。ＩＬ－２は、一次抗原チャレンジ後のエフェクター機能の最適な拡大及び生成に関与しているようである。ほとんどの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がアポトーシスによって消失する免疫応答の収縮期の間、ＩＬ－２シグナルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を細胞死から救済し、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の永続的増加を提供することができる。記憶段階において、ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度は、外因性ＩＬ－２の投与によって増強され得る。更に、初期プライミング中にＩＬ－２シグナルを受け取ったＣＤ８＋Ｔ細胞のみが、新たな抗原チャレンジ後に効率的な二次拡大を媒介することができる。したがって、免疫応答の異なる段階におけるＩＬ－２シグナルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能の最適化において重要であり、それにより、これらのＴ細胞の一次応答及び二次応答の両方に影響を及ぼす（Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２０１０；６８４：２８－４１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｉｎ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｏｙｍａｎ Ｏ１，Ｃｈｏ ＪＨ，Ｓｐｒｅｎｔ Ｊ）。

【0026】

その抗腫瘍有効性に基づいて、高用量ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）として市販されているアルデスロイキン）治療は、米国では転移性腎細胞癌腫（ＲＣＣ）及び悪性黒色腫の患者に、欧州連合では転移性ＲＣＣの患者に使用することが承認されている。しかしながら、ＩＬ－２の作用様式の結果として、ＩＬ－２の全身及び非標的適用は、Ｔ_ｒｅｇ細胞及びＡＩＣＤの誘導を介して抗腫瘍免疫をかなり損なう可能性がある。全身ＩＬ－２治療の更なる懸念は、静脈内投与時の重篤な副作用に関連しており、これには、重篤な心血管、肺水腫、肝臓、胃腸（ＧＩ）、神経学的及び血液学的事象（プロロイキン（アルデスロイキン）製品特性の概要［ＳｍＰＣ］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｅｍｃ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／１９３２２／ＳＰＣ／（２０１３年５月２７日にアクセス））が含まれる。低用量ＩＬ－２レジメンが患者において試験されているが、最適とはいえない治療結果であった。まとめると、ＩＬ－２を利用する治療アプローチは、その適用に関連する責任を克服することができる場合、がん治療に有用であり得る。

【0027】

ＰＤ－１標的化抗原結合部分及びＩＬ－２ベースのエフェクター部分を含む、例えば突然変異体ＩＬ－２を含む免疫コンジュゲートは、例えば国際公開第２０１８／１８４９６４号に記載されている。

【0028】

特に、突然変異体ＩＬ－２（例えば、ＩＬ－２ｑｍとして公知の四重バリアント）は、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）への結合を排除することによって、野生型ＩＬ－２（例えば、アルデスロイキン）又は第一世代ＩＬ－２ベースの免疫コンジュゲートの限界を克服するように設計されている。この突然変異体ＩＬ－２ｑｍは、国際公開第２０１２／１４６６２８号及び国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されている、ＣＥＡに対するヒト化抗体及びＦＡＰに対する抗体などの様々な腫瘍標的化抗体にカップリングされている。更に、抗体のＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑ複合体への結合を防止するように改変されている。得られた腫瘍標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート（例えば、ＣＥＡ標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及びＦＡＰ標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート）は、非臨床ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験において、腫瘍細胞を排除することができることが示されている。
したがって、得られた免疫コンジュゲートは、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）への結合を排除することによってＩＬ－２の欠点に対処する標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートのクラスを表す：

【0029】

「ＩＬ－２」又は「ヒトＩＬ－２」という用語は、例えばジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体の形成を回避するためのＣ１２５Ａ置換を有する配列番号３に示される、野生型及び野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列に１つ以上の突然変異を含むバリアントを含むヒトＩＬ－２タンパク質を指す。ＩＬ－２はまた、Ｎ－及び／又はＯ－グリコシル化部位を除去するように変異され得る。

【0030】

ＰＤ－１経路
Ｔ細胞活性化を調節する重要な負の共刺激シグナルは、プログラム死－１受容体（ＰＤ－１）（ＣＤ２７９）並びにそのリガンド結合パートナーＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）によって提供される。ＰＤ－１の負の調節的役割は、自己免疫を起こしやすいＰＤ－１ノックアウト（Ｐｄｃｄ１－／－）によって明らかにされた。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１－５１（１９９９）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９－２２（２００１）．ＰＤ－１はＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に関連するが、ホモ二量体化を可能にする膜近位システインを欠く。ＰＤ－１の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含有する。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２にのみ結合する。Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１－９（２０００）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１３６５－１３６９（１９９９）；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１－２６８（２００１）；Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：８３９－８４６（２００１）．

【0031】

ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化単球及び樹状細胞（ＤＣ）上で発現され得る。ＰＤ－１は、活性化されたヒトＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞によって発現されるが、刺激されていないヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞によって発現されない。これは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４のより制限された発現とは対照的である（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３－８０（１９９６）；Ｂｏｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：３５３２－４０（２００６））。（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２及び３又は（ｉｖ）エクソン２～４を欠く転写物を含む、活性化ヒトＴ細胞からクローニングされたＰＤ－１の少なくとも４つのバリアントが存在する（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３５：１０９－１６（２００５））。ＰＤ－１Δｅｘ３を除いて、全てのバリアントは、休止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の全長ＰＤ－１と同様のレベルで発現される。全てのバリアントの発現は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によるヒトＴ細胞の活性化時に有意に誘導される。ＰＤ－１Δｅｘ３バリアントは、膜貫通ドメインを欠き、自己免疫において重要な役割を果たす可溶性ＣＴＬＡ－４に似ている（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３：５０６－１１（２００３））。このバリアントは、関節リウマチ患者の滑液及び血清が豊富である。Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：８８４４－５０（２００６）．

【0032】

２つのＰＤ－１リガンドは、それらの発現パターンが異なる。ＰＤ－Ｌ１は、マウスＴ細胞及びマウスＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞及び骨髄由来肥満細胞上に構成的に発現される（Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５５３８－４５（２００２））。ＰＤ－Ｌ１は、広範囲の非造血細胞（例えば、角膜、肺、血管上皮、肝臓非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤合胞体栄養膜細胞、ケラチノサイトなど）上に発現し（Ｋｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７－７０４（２００８））、活性化後に多くの細胞型上で上方制御される。Ｉ型インターフェロンＩＦＮ及びＩＩ型インターフェロンＩＦＮの両方がＰＤ－Ｌ１を上方制御する（Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９：１３３－４５（２００２）；Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１７２－８２（２００４））。細胞株におけるＰＤ－Ｌ１発現は、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＭＥＫが阻害されると低下する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１０：２９６－３０４（２００７））。ＪＡＫ２はまた、ＰＤ－Ｌ１誘導に関与している（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８０：７５５－６２（２００６）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１０：２９６－３０４（２００７））。ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、すなわち、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びＡｋｔシグナル伝達を改変した細胞ホスファターゼの喪失又は阻害は、がんにおける転写後ＰＤ－Ｌ１発現を増加させた（Ｐａｒｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：８４－８８（２００７））。

【0033】

ＰＤ－Ｌ２発現はＰＤ－Ｌ１よりも制限されている。ＰＤ－Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、及び骨髄由来の肥満細胞上に誘導可能に発現される。ＰＤ－Ｌ２はまた、休止腹膜Ｂ１細胞の約半分～２／３で発現されるが、従来のＢ２Ｂ細胞では発現されない（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：２４０５－１０（２００７））。ＰＤ－Ｌ２＋Ｂ１細胞はホスファチジルコリンに結合し、細菌抗原に対する自然免疫応答に重要であり得る。ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ２の誘導は、ＮＦ－κＢに部分的に依存する（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：２７０６－１６（２００３））。ＰＤ－Ｌ２は、ＧＭ－ＣＦ、ＩＬ－４及びＩＦＮ－γによって単球及びマクロファージ上に誘導することもできる（Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５５３８－４５（２００２）；Ｌｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１００：５３３６－４１（２００３））。

【0034】

ＰＤ－１シグナル伝達は、典型的には、細胞増殖よりもサイトカイン産生に対してより大きな効果を有し、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－２産生に対して有意な効果を有する。ＰＤ－１媒介性阻害性シグナル伝達はまた、ＴＣＲシグナル伝達の強度に依存し、低レベルのＴＣＲ刺激でより大きな阻害が送達される。この減少は、ＣＤ２８による共刺激によって克服することができる（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７－３４（２０００））ｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＩＬ－２（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４－４３（２００２））。

【0035】

ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を介したシグナリングは双方向であり得ることが証明されている。すなわち、ＴＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達の改変に加えて、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を発現する細胞にシグナル伝達を戻し得る。ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の患者から単離された天然ヒト抗ＰＤ－Ｌ２抗体による樹状細胞の治療は、ＭＨＣ ＩＩ又はＢ７共刺激分子を上方制御することは見出されなかったが、そのような細胞は、より多くの炎症促進性サイトカイン、特にＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－６を産生し、Ｔ細胞増殖を刺激した（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１３９３－９８（２００２）。この抗体によるマウスの治療もまた、（１）移植されたｂ１６黒色腫に対する抵抗性を高め、腫瘍特異的ＣＴＬを迅速に誘導し（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１８３０－３８（２００３）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：４９６５－７２（２００４）；Ｈｅｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１８２７－３５（２００７））、（２）アレルギー性喘息のマウスモデルにおける気道炎症性疾患の発症を阻止した（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１３６０－６５（２００４）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：６６８－７４（２００５））。

【0036】

樹状細胞（「ＤＣ」）への逆シグナル伝達の更なる証拠は、可溶性ＰＤ－１（Ｉｇ定常領域に融合したＰＤ－１ ＥＣドメイン－「ｓ－ＰＤ－１」）と共に培養された骨髄由来ＤＣの研究から得られる（Ｋｕｉｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：２４７２－８２（２００６））。このｓＰＤ－１は、抗ＰＤ－１の投与によって可逆的に、ＤＣ活性化を阻害し、ＩＬ－１０産生を増加させた。

【0037】

更に、いくつかの研究は、ＰＤ－１とは独立したＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の受容体を示す。Ｂ７．１は、ＰＤ－Ｌ１の結合パートナーとして既に同定されている（Ｂｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７：１１１－２２（２００７））。化学的架橋研究は、ＰＤ－Ｌ１及びＢ７．１がそれらのＩｇＶ様ドメインを介して相互作用し得ることを示唆している。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用は、阻害シグナルをＴ細胞に誘導することができる。Ｂ７．１によるＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１のライゲーション又はＰＤ－Ｌ１によるＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＢ７．１のライゲーションは、阻害性シグナルを送達する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３＋Ｂ７．１被覆ビーズによって刺激された場合、増殖及びサイトカイン産生の減少を示す。Ｂ７．１の全ての受容体を欠くＴ細胞（すなわち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１）では、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生はもはや抗ＣＤ３＋Ｂ７．１被覆ビーズによって阻害されなかった。これは、Ｂ７．１がＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４の非存在下でＴ細胞上のＰＤ－Ｌ１を介して特異的に作用することを示している。同様に、ＰＤ－１を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３＋ＰＤ－Ｌ１被覆ビーズの存在下で刺激した場合に増殖及びサイトカイン産生の減少を示し、Ｔ細胞上のＢ７．１に対するＰＤ－Ｌ１ライゲーションの阻害効果を実証した。ＰＤ－Ｌ１の全ての既知の受容体を欠くＴ細胞（すなわち、ＰＤ－１及びＢ７．１は存在しない）の場合、Ｔ細胞増殖はもはや抗ＣＤ３＋ＰＤ－Ｌ１被覆ビーズによって損なわれなかった。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７．１又はＰＤ－１のいずれかを介してＴ細胞に対して阻害効果を発揮し得る。

【0038】

Ｂ７．１とＰＤ－Ｌ１との間の直接相互作用は、共刺激の現在の理解が不完全であることを示唆し、Ｔ細胞上のこれらの分子の発現に対する重要性を強調する。ＰＤ－Ｌ１^－／－Ｔ細胞の研究は、Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１がＴ細胞サイトカイン産生を下方制御できることを示している（Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１０６９１－９６（２００４））。ＰＤ－Ｌ１及びＢ７．１の両方がＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージ上で発現されるので、これらの細胞型上のＢ７．１とＰＤ－Ｌ１との間の方向性相互作用の可能性がある。更に、非造血細胞上のＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７．１並びにＰＤ－１と相互作用する可能性があり、ＰＤ－Ｌ１がそれらの調節に関与しているかどうかの疑問が提起されている。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害効果についての１つの可能な説明は、Ｔ細胞ＰＤ－Ｌ１がＡＰＣ Ｂ７．１をＣＤ２８との相互作用から捕捉又は分離し得ることである。

【0039】

結果として、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１、Ｂ７．１又は両方のいずれかと相互作用するのを遮断し、それによってＰＤ－Ｌ１がＴ細胞及び他の抗原提示細胞に負の共刺激シグナルを送るのを妨げることを含む、ＰＤ－Ｌ１を介したシグナル伝達の拮抗作用は、感染（例えば、急性及び慢性）及び腫瘍免疫に応答して免疫を増強する可能性がある。更に、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の他の成分のアンタゴニスト、例えばアンタゴニスト抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体と組み合わせてもよい。

【0040】

ＩＬ－２がリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を拡大及び活性化する能力は、ＩＬ－２の抗腫瘍活性の根底にある。ＩＬ－２のＩＬ－２αサブユニット（ＣＤ２５）への結合を排除するように設計されたＩＬ－２突然変異体は、ＩＬ－２の制限を克服し、ＣＥＡ標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート又はＦＡＰ標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートなどの腫瘍標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートの一部として、腫瘍細胞を排除することができることが示されている。

【0041】

免疫コンジュゲート及び抗体
本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ＰＤ－１発現免疫細胞、特にＴ細胞上、又は腫瘍細胞環境内、又はその抗原結合断片上のＰＤ－１に結合する抗体と、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する結合親和性が（野生型ＩＬ－２、例えば配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２と比較して）低下したＩＬ－２突然変異体、特にヒトＩＬ－２の突然変異体、例えばｉ）配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３つの位置（複数可）の１、２又は３つのアミノ酸置換（複数可）、例えば３つの位置の３つの置換、例えば特異的アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ、又はｉｉ）ｉ）で示される特徴に加えて、配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置におけるアミノ酸置換、例えば、特異的アミノ酸置換Ｔ３Ａ、又はｉｉｉ）配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置における４つのアミノ酸置換、例えば特異的アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むＩＬ－２とを含む。

【0042】

本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫細胞、特にＴ細胞上、又は腫瘍細胞環境内に提示されるＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインと、２つのサブユニットからなり、２つの非同一のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含むＦｃドメインと、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する結合親和性が（野生型ＩＬ－２、例えば配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２と比較して）低下したＩＬ－２突然変異体、特にヒトＩＬ－２の突然変異体、例えばｉ）配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３つの位置（複数可）の１、２又は３つのアミノ酸置換（複数可）、例えば３つの位置の３つの置換、例えば特異的アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ、又はｉｉ）ｉ）で示される特徴に加えて、配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置におけるアミノ酸置換、例えば、特異的アミノ酸置換Ｔ３Ａ、又はｉｉｉ）配列番号２２として示されるヒトＩＬ－２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置における４つのアミノ酸置換、例えば特異的アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むＩＬ－２とを含む。

【0043】

併用療法において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号８及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列を含み得る。

【0044】

いくつかの実施形態では、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列を含む。

【0045】

これらのＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、抗原結合部分、Ｆｃドメイン及びエフェクター部分のそれらの構成部分と共に、国際公開第２０１８／１８４９６４号に記載されている免疫コンジュゲートの例として記載されている。例えば、抗ＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１及びＩＬ－２四重突然変異体（ｑｍ）に基づく特定の免疫サイトカイン「ＰＤ－１標的化ＩｇＧ－ＩＬ－２ｑｍ融合タンパク質」は、例えば国際公開第２０１８／１８４９６４号の実施例１及び２に記載されている。
国際公開第２０１８／１８４９６４号に記載されている特定のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、本明細書に記載の以下のポリペプチド配列を含むことを特徴とする：

【0046】

国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、ＩＬ－２突然変異体は、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する結合親和性が低下している。βサブユニット及びγサブユニット（それぞれＣＤ１２２及びＣＤ１３２としても知られる）と共に、αサブユニット（ＣＤ２５としても知られる）はヘテロ三量体高親和性ＩＬ－２受容体を形成し、βサブユニット及びγサブユニットのみからなる二量体受容体は中間親和性ＩＬ－２受容体と呼ばれる。国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットへの結合が低下したＩＬ－２突然変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、制御性Ｔ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達誘導能が低下しており、Ｔ細胞における活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）の誘導が少なく、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロファイルが低下している。毒性が低下したそのようなＩＬ－２突然変異体の使用は、Ｆｃドメインの存在に起因して長い血清半減期を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートにおいて特に有利である。ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニットに対するＩＬ－２突然変異体の親和性を低下させるか又は消失させるが、中間親和性ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２受容体のβサブユニット及びγサブユニットからなる）に対するＩＬ－２突然変異体の親和性を維持する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み得る。１つ以上のアミノ酸変異は、アミノ酸置換であり得る。ＩＬ－２突然変異体は、ヒトＩＬ－２（配列番号２２として示されている）の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１つ、２つ又は３つの位置に１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含み得る。ＩＬ－２突然変異体は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置に３つのアミノ酸置換を含み得る。ＩＬ－２突然変異体は、ヒトＩＬ－２の突然変異体であり得る。ＩＬ－２突然変異体は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ－２であり得る。ＩＬ－２突然変異体は、ＩＬ－２のＯ－グリコシル化部位を排除するヒトＩＬ－２の３位に対応する位置にアミノ酸変異を更に含み得る。特に、当該追加のアミノ酸変異は、トレオニン残基をアラニン残基で置き換えるアミノ酸置換である。本発明において有用な特定のＩＬ－２突然変異体は、ヒトＩＬ－２（配列番号２２として示されている）の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置に４つのアミノ酸置換を含む。具体的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。国際公開第２０１２／１４６６２８号の実施例で実証されているように、当該四重突然変異体ＩＬ－２ポリペプチド（ＩＬ－２ｑｍ）は、ＣＤ２５への検出可能な結合を示さず、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導する能力の低下、Ｔ_ｒｅｇ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力の低下、及びｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロファイルの低下を示す。しかしながら、それは、エフェクター細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を活性化する能力、エフェクター細胞の増殖を誘導する能力、及びＮＫ細胞により二次サイトカインとしてＩＦＮ－γを生成する能力を保持している。上記の説明のいずれかによるＩＬ－２突然変異体は、発現又は安定性の増加などの更なる利点を提供する更なる変異を含み得る。例えば、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体の形成を回避するために、位置１２５のシステインをアラニンなどの中性アミノ酸で置き換えてもよい。したがって、ＩＬ－２突然変異体は、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置に追加のアミノ酸変異を含み得る。当該追加のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａであり得る。ＩＬ－２突然変異体は、配列番号３のポリペプチド配列を含み得る。

【0047】

好ましい実施形態では、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２突然バリアント免疫コンジュゲートのＰＤ－１標的化は、国際公開第２０１８／１１８４９６４号に記載されているように、ＰＤ－１を標的化することによって達成され得る。ＰＤ－１標的化は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片を用いて達成され得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１の配列又は機能性を保持するそのバリアントと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含み得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号２の配列又は機能性を保持するそのバリアントと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含み得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するそのバリアント、及び配列番号２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含み得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１の重鎖可変領域配列及び配列番号２の軽鎖可変領域配列を含み得る。

【0048】

ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択されるポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ＰＤ－１に特異的なＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド配列を含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ＰＤ－１に特異的なＦａｂ軽鎖を含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号１０のポリペプチド配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含み得る。ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合していてもよい。Ｆｃドメインポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇと呼ばれ得る）を含み得る。

【0049】

国際公開第２０１８／１８４９６４号に記載されているように、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号８、９及び１０として示されている配列（例えば国際公開第２０１８／１８４９６４号の実施例１に記載される）を有するＰＤ－１標的化ＩｇＧ－ＩＬ－２ｑｍ融合タンパク質であり得る。配列番号８、９及び１０として示される配列を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを、本明細書では「ＰＤ１－ＩＬ２ｖ」と呼ぶ。配列番号１１、１２及び１３として示される配列を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、本明細書では「ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ」と呼ばれ、これはマウスサロゲートである。

【0050】

本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫細胞、特にＴ細胞上、又は腫瘍細胞環境内に提示される抗原に結合する抗体、及びＩＬ－２受容体のサブユニットに対する結合親和性が低下したＩＬ－２突然変異体を含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫細胞、特にＴ細胞上、又は腫瘍細胞環境内に提示されたＰＤ－１に結合する抗体と、ＩＬ－２受容体のサブユニットに対する結合親和性が低下したＩＬ－２突然変異体とから本質的になり得る。抗体はＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体であってもよい。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ＩＬ－２受容体のサブユニットに対する結合親和性が低下した単一のＩＬ－２突然変異体を含み得る（すなわち、１つ以下のＩＬ－２突然変異部分が存在する）。

【0051】

抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２０２０／１２７６１９号Ａ１に記載されている。

【0052】

本明細書に記載の併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＴＹＲＰ１に結合することができる第１の抗原結合部分と、ＣＤ３に結合することができる第２の抗原結合部分とを含む。本明細書に記載の併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列又は機能性を保持するそのバリアントと、配列番号５の配列と少なくとも約８０％ ８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持するそのバリアントとを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列又は機能性を保持するそのバリアントと、配列番号７と少なくとも少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持するそのバリアントとを含む第２の抗原結合部分とを含み得る。本明細書に記載の併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含み得る。

【0053】

本明細書に記載の併用療法で使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の抗原結合部分と同一の第３の抗原結合部分を含み得る。一実施形態では、ＴＹＲＰ１に結合する第１の抗原結合部分及び第３の抗原部分は従来のＦａｂ分子である。そのような実施形態では、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬが互いに交換／置き換えられたＦａｂ分子である。

【0054】

併用療法で使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、そこに含まれるＦａｂ分子にアミノ酸置換を含んでもよく、軽鎖と一致しない重鎖とのミスペアリング（ベンス・ジョーンズ型副産物）を減少させるのに特に有効であり、これは、結合アームの１つ（２つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合は２つ以上）でＶＨ／ＶＬ交換を伴うＦａｂベースの多重特異性抗体の産生で発生する可能性がある（ＰＣＴ公開番号の国際公開第２０１５／１５０４４７号も参照されたい。特にその中の例は、その全体が本明細書に特にその中の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。望ましくない副生成物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型副生成物と比較した、所望の（多重特異性）抗体の比を、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置と反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。

【0055】

したがって、（多重特異性）抗体の第１の抗原結合部分及び第２（及び、存在する場合、第３）の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、一方の抗原結合部分（特に第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、第１（及び、存在する場合、第３）の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸及び位置２１３のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸で置換されていてもよく（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、第１（及び、存在する場合、第３）の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸及び位置２１３のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸で置換されていてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられていない（すなわち、交換されないままである）。定常ドメインＣＬの位置１２４のアミノ酸及び位置２１３のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）によって独立して置換されてもよく、定常ドメインＣＨ１の位置１４７のアミノ酸及び位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されてもよい。併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１（及び、存在する場合、第３）の抗原結合部分の第１２４アミノ酸の定常ドメインＣＬにおいてリジン（Ｋ）に置換され（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、第１２３アミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換され（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、第１（及び、存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において第１４７アミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換され（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、第２１３アミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。

【0056】

本明細書に記載の併用療法で使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１４、１５、１６及び１７として示される配列、又は機能性を保持するそのバリアントを有し得る。

【0057】

配列番号１４、１５、１６及び１７として示される配列を有する抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を、本明細書では「ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ」又は「ＴＹＲＰ１－ＴＣＢ」と呼ぶ。配列番号１８、１９、２０及び２１として示される配列を有する抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書では「ｍｕＴＹＲＰ１ ＴＣＢ」と呼ばれ、これはマウスサロゲートである。

【0058】

本明細書に記載されるように、本明細書に記載される併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインと、２つのサブユニットからなり、２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含むＦｃドメインとを含み得る。本明細書に記載される併用療法において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の重鎖可変ドメイン及びノブ突然変異を含むＦｃドメインサブユニットと、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の重鎖可変ドメイン及びホール突然変異を含むＦｃドメインサブユニットと、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の軽鎖可変ドメインと、ＩＬ－２受容体のサブユニットに対する結合親和性が低下したＩＬ－２突然変異体とを含み得る。したがって、免疫コンジュゲートは、２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含むＦｃドメインを含み得る。「修飾促進ヘテロ二量体化」は、ポリペプチドが同一のポリペプチドと会合してホモ二量体を形成することを低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はポリペプチドの翻訳後修飾である。本明細書で使用される場合、修飾促進ヘテロ二量体化は、特に、二量体を形成することが望ましい２つのポリペプチドの各々に対して行われる別個の修飾を含み，この修飾は、２つのポリペプチドの会合を促進するように、互いに対して相補性である。例えば、修飾促進ヘテロ二量体化は、ポリペプチドの会合をそれぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにするように、二量体を形成することが望ましいポリペプチドの一方又は両方の構造又は電荷を変化させ得る。ヘテロ二量体化は、２つの非同一ポリペプチド間、例えばＦｃドメインの２つのサブユニット間で起こり、各サブユニットに融合した更なる免疫コンジュゲート成分（例えば、抗原結合部分、エフェクター部分）は同じではない。本発明による免疫コンジュゲートにおいて、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、Ｆｃドメイン中に存在する。いくつかの実施形態では、修飾促進ヘテロ二量体化は、アミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのポリペプチド鎖間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施形態では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。具体的な実施形態では、当該修飾は、「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方に「ホール」修飾を含む。

【0059】

ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成を生じ、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。Ｆｃ領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１．に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

【0060】

代替的な実施形態では、２つの非同一ポリペプチド鎖の修飾促進ヘテロ二量体化は、例えば国際公開第２００９／０８９００４号に記載さているように、静電的操縦効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電的に有利になるように、２つのポリペプチド鎖の接触面にある１つ以上のアミノ酸残基を、帯電したアミノ酸残基で置き換えることを含む。

【0061】

ＩＬ－２受容体のサブユニットに対する結合親和性が低下したＩＬ－２突然変異体は、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへのＩＬ－２突然変異体の融合は、２つのＩＬ－２突然変異体ポリペプチドを含むホモ二量体免疫コンジュゲートの生成を更に最小限に抑える（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。

【0062】

免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体のＦｃドメインは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が変化するように、具体的にはＦｃγ受容体に対する結合親和性が変化するように操作され得る。補体成分、特にＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合は、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように変化され得る。Ｆｃドメインは、免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。しかしながら、同時に、該Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への望ましくない標的化をもたらす可能性がある。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出に繋がることがあり、これはエフェクター部分と、長い半減期の免疫コンジュゲートと組み合わさり、全身投与すると、サイトカイン受容体の過剰な活性化、及び重篤な副作用をもたらす。これと一致して、従来のＩｇＧ－ＩＬ－２免疫コンジュゲートは、注入反応と関係があることが記載されている（例えば、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２、４４６３－４４７３（２００４）を参照）。

【0063】

したがって、免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下するように操作され得る。そのような一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一実施形態では、当該アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１低下させる。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる、２以上のアミノ酸変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又は更には少なくとも５０分の１低下させ得る。一実施形態では、操作されたＦｃドメインを含む免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より詳細には５％未満を示す。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、具体的にはＦｃγ ＲＩＩＩａ、Ｆｃγ ＲＩ又はＦｃγ ＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの各受容体への結合が低下する。いくつかの実施形態では、相補性成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。一実施形態では、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち、当該受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又はＦｃドメインを含む免疫コンジュゲート）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又はＦｃドメインの非操作形態を含む免疫コンジュゲート）の約７０％超の結合親和性をＦｃＲｎに示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体は、約８０％超、更には約９０％超のそのような親和性を呈し得る。一実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４、及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。より特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。アミノ酸置換のこの組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、そのような突然変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。Ｆｃ領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１．に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。

【0064】

突然変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知であり、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているような遺伝的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変によって調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。

【0065】

一実施形態では、Ｆｃドメインは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、非操作Ｆｃドメインと比較して、低下したエフェクター機能を有するように操作されている。エフェクター機能の低下は、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の減少、標的結合抗体の架橋の減少、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１つ以上を含み得る。

【0066】

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体へのその結合親和性及び／又はエフェクター機能を更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５、及びＰ３２９にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを含む。そのようなＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン突然変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、欧州特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。

【0067】

本発明の実施形態では、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、ａ）配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号８及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、併用療法において使用されるヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体は、ａ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列を含むことを特徴とする。

【0068】

定義
以下で別段の定義がない限り、本明細書では当技術分野で一般的に使用される用語を使用する。

【0069】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。

【0070】

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」、「抗原結合ドメイン」、又は「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の一部を指す。したがって、この用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の標準的な定義及び／又は「超可変ループ」由来の残基に従って決定される。「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。

【0071】

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるＣＥＡ又はヒトＰＤ－Ｌ１などの抗原のタンパク質決定基を表す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、エピトープは、特異的な三次元構造特性及び特異的な電荷特性を有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で、立体構造エピトープに対する結合が失われるが、非立体構造エピトープに対する結合は失われないことから区別される。

【0072】

「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域が含まれる。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで延びるよう規定されている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしてなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。抗体のＦｃドメインは、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。「抗体のＦｃドメイン」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。抗体又は免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、及びＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２に分けられ得る。重鎖定常領域によれば、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃドメインは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃドメインへの補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃドメインにおける画定された結合部位によって引き起こされる。そのような結合部位は、技術水準において公知であり、例えば、Ｂｏａｃｋｌｅ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８２（１９７９）７４２－７４３；Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（２００１）１２１６１－１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４、及び欧州特許第０３０７４３４号において記載されている。そのような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．のＥＵインデックスによるナンバリング、上記を参照）。サブクラスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２及びＩｇＧ_３の抗体は、通常、補体活性化並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、ＩｇＧ_４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。

【0073】

本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」という用語は、少なくとも１つのＩＬ－２分子と少なくとも１つの抗体とを含むポリペプチド分子を指す。ＩＬ－２分子は、種々の相互作用によって、本明細書に記載の種々の構成で、抗体に接続することができる。特定の実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーを介して抗体に融合される。本発明による特定の免疫コンジュゲートは、１つ以上のリンカー配列によって接続する、１つのＩＬ－２分子と、抗体から本質的になる。

【0074】

「融合」とは、成分（例えば、抗体及びＩＬ－２分子）が、直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介したペプチド結合によって連結されることを意味する。

【0075】

本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインサブユニット等に関する「第１」及び「第２」の用語は、それぞれの種類の部分が１つより多く存在する場合に、区別するのが簡便なように使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、免疫コンジュゲートの特定の順序又は向きを与えることを意図していない。

【0076】

一実施形態では、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は抗体の抗体成分は、ヒト起源に由来するＦｃドメイン、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。本明細書で使用される場合、「ヒト起源由来のＦｃドメイン」という用語は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４のサブクラスのヒト抗体のＦｃドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ_１サブクラス由来のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異型Ｆｃドメイン（一実施形態ではＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに突然変異を有する）、ヒトＩｇＧ_４サブクラス由来のＦｃドメイン又はヒトＩｇＧ_４サブクラス由来の変異型Ｆｃドメイン（一実施形態ではＳ２２８Ｐに突然変異を有する）のいずれかであるＦｃドメインを表す。一実施形態では、当該抗体は、低下した又は最小のエフェクター機能を有する。一実施形態では、最小のエフェクター機能は、エフェクターレスＦｃ突然変異に起因する。一実施形態では、エフェクターレスＦｃ突然変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。一実施形態では、エフェクターレスＦｃ突然変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ及びＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵナンバリング）を含む（からなる）群から、それぞれの抗体について互いに独立して選択される。

【0077】

一実施形態では、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は抗体の抗体成分は、ヒトＩｇＧクラス（すなわち、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４サブクラス）のものである。

【0078】

好ましい実施形態では、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は抗体の抗体成分は、ヒトＩｇＧ_１サブクラス又はヒトＩｇＧ_４サブクラスのものである。一実施形態では、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は抗体の抗体成分は、ヒトＩｇＧ_１サブクラスのものである。一実施形態では、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は抗体の抗体成分は、ヒトＩｇＧ_４サブクラスのものである。

【0079】

一実施形態では、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は抗体の抗体成分は、定常鎖がヒト由来であることを特徴とする。そのような定常鎖は、最新技術で周知であり、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８）を参照）に記載されている。

【0080】

本明細書で使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0081】

本出願において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシアルファ－アミノ酸の群を示す。

【0082】

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここに米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステムにおける使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂとの対照での、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂに対し、アミノ酸配列Ｂと、又はアミノ酸配列Ｂとの対照で、特定のアミノ酸配列同一性％を有するか若しくは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述することができる）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ａ対Ｂのアミノ酸配列同一性％は、Ｂ対Ａのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ以上の連続した群として散在してもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。

【0083】

本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は二重特異性抗体を生産する方法であって、本明細書に記載の免疫コンジュゲート又は二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該免疫コンジュゲート又は二重特異性抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び該免疫コンジュゲート又は二重特異性抗体を該宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む方法を提供する。

【0084】

免疫コンジュゲート又は二重特異性抗体の成分は、遺伝的に互いに融合している。免疫コンジュゲート又は二重特異性抗体は、その成分が互いに直接又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定してもよく、有効性について試験してもよい。融合の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を必要に応じて含めてもよい。

【0085】

免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に存在するか又は天然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそれらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照）。抗原結合部分及びそれらを生成するための方法はまた、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０２０７８３号に詳細に記載されている。

【0086】

抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域の任意の動物種を、本明細書に記載の免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体において使用することができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト起源のものとすることができる。免疫コンジュゲートがヒトへの使用を意図したものである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）に更に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の種々の技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得て、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリ（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、一般的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。ファージディスプレイによる免疫コンジュゲートのための抗原結合部分の調製の詳細な記載は、国際公開第２０１１／０２０７８３号の実施例に見出すことができる。

【0087】

特定の実施形態では、抗体は、例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０２０７８３号（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。免疫コンジュゲート及び二重特異性抗体が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ １００システムで分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、又は従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定してもよい。特定の実施形態では、そのような競合抗体は、参照抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗体と、抗原への結合について第１の抗体と競合する能力について試験されている第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化された抗原を、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に会合した標識の量が測定される。固定化抗原に関連付けられる標識の量がコントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体が、抗原への結合について第１の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。

【0088】

本明細書に記載されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、国際公開第２０１８／１８４９６４号の実施例に記載されるように調製され得る。本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２０２０／１２７６１９号の実施例に記載されているように調製され得る。

【0089】

本明細書に記載の抗体は、好ましくは組換え手段によって産生される。そのような方法は、当技術分野で広く知られており、原核生物及び真核生物細胞におけるタンパク質発現と、それに続く抗体ポリぺプチドの単離、及び通常は薬学的に許容され得る純度への精製を含む。タンパク質発現のため、軽鎖及び重鎖又はそれらの断片をコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの適切な原核又は真核宿主細胞で行われ、抗体は細胞から（上清又は細胞溶解後に）回収される。

【0090】

抗体の組換え産生は、技術水準において周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３－２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．等のＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１－２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１－１６１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０－８８０の総説に記載されている。

【0091】

抗体は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために行われる。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。

【0092】

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９－１２３；Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１－２７０に記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３－３８３７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５－４２８９；Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７－８７に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１－８３により記載され、またＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．によるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１－１９９に記載されている。

【0093】

本発明による重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わされて、発現ベクターコンストラクトを形成する。重鎖発現コンストラクト及び軽鎖発現コンストラクトを、単一のベクターに組み合わせることができ、共トランスフェクトすることができ、連続トランスフェクトすることができ、又は宿主細胞に別々にトランスフェクトすることができ、次いでそれらを融合させて、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。

【0094】

例えば、原核生物に好適な制御配列には、プロモーター、任意にオペレータ配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

【0095】

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれると「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響する場合に、コード配列に作動可能に連結され、或いはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合に、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合は隣接していてリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーが従来の慣例に従って使用される。

【0096】

モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として機能することができる。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入され得、その後、宿主細胞、例えば、免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。

【0097】

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのそのような表記は子孫を含む。このため、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、移行の数にかかわらず初代対象細胞及びそれ由来の培養物を含む。また、全ての子孫は、意図的な、又は想定外の突然変異に起因して、ＤＮＡ含量において厳密に同一でない場合があることが理解される。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。

【0098】

治療方法及び組成物
本発明は、治療を必要とする患者を治療する方法であって、治療有効量のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との併用療法を患者に投与することを特徴とする方法を含む。

【0099】

本発明は、記載される併用療法のための本発明による抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体とのＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートの使用を含む。

【0100】

本発明の好ましい一実施形態は、がん又は腫瘍の治療における使用のための本発明の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体とのＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートの併用療法である。したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体と組み合わせてがん又は腫瘍の治療における使用のための本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートである。本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせた腫瘍のがんの治療における使用のための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体である。

【0101】

がん又は腫瘍は、腫瘍細胞環境、例えばＰＤ－１＋Ｔ細胞上に抗原を提示し得る。併用療法の標的としてのＰＤ－１は、腫瘍細胞環境、例えばＰＤ－１＋Ｔ細胞に提示され得る。治療は、固形腫瘍の治療であり得る。治療は、癌腫の治療であり得る。がんは、結腸直腸がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん及び胃がんからなる群から選択され得る。がんは、肺がん、結腸がん、胃がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がん、肝臓がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん及び骨格筋のがんからなる群から選択され得る。

【0102】

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺細気管支肺胞がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部若しくは頸部のがん、皮膚若しくは眼内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形膠芽細胞腫、星細胞種、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ球性白血病（上述のがんのいずれかの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ以上の組み合わせであってもよい。好ましい一実施形態では、そのようながんは、乳がん、結腸直腸がん、黒色腫、頭頸部がん、肺がん又は前立腺がんである。好ましい一実施形態では、そのようながんは、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん又は前立腺がんである。別の好ましい実施形態では、そのようながんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫のがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃癌腫のがん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫である。好ましい一実施形態では、そのようながんは、ＴＹＲＰ１発現がんである。

【0103】

本発明の一実施形態は、上記のがん又は腫瘍のいずれかの治療における使用のための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートである。本発明の別の実施形態は、上記のがん又は腫瘍のいずれかの治療における使用のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせた、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。本発明は、がんの治療のための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートとの併用療法を含む。本発明は、転移の予防又は治療のための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートとの併用療法を含む。

【0104】

本発明は、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体との併用療法を含む。

【0105】

本発明は、それを必要とする患者におけるがんの治療のための方法であって、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする方法を含む。本発明は、それを必要とする患者における転移の予防又は治療のための方法であって、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び本明細書に記載されている抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする方法を含む。本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、免疫応答又は機能、例えばＴ細胞活性を、それを必要とする患者において刺激するための方法を含む。

【0106】

本発明は、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたがんの治療における使用のための、或いは本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたがんの治療のための医薬品の製造のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを含む。

【0107】

本発明は、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた転移の予防若しくは治療における使用のための、或いは本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた転移の予防若しくは治療のための医薬品の製造のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを含む。

【0108】

本発明は、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答若しくは機能の刺激における使用のための、或いは本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答若しくは機能の刺激における使用のための医薬品を製造するための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを含む。

【0109】

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせたがんの治療における使用のための、或いは本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせたがんの治療のための医薬品を製造するための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む。

【0110】

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせた転移の予防若しくは治療における使用のための、或いは本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせた転移の予防若しくは治療のための医薬品を製造するための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む。

【0111】

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答若しくは機能の刺激における使用のための、或いは本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答若しくは機能の刺激における使用のための医薬品を製造するための、本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む。

【0112】

本発明の好ましい実施形態では、異なる疾患の上記の併用治療及び医学的使用において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートは、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列を含むことを特徴とするＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートであり、そのような併用治療において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列を含むことを特徴とする。

【0113】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と共に製剤化された、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと、ヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３又は本明細書に記載のその抗原結合部分に結合する抗体とを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。

【0114】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収／再吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は注射又は注入に適している。

【0115】

本発明の組成物は、当技術分野で知られている種々の方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は態様は、所望な結果に依存して変わり得る。

【0116】

薬学的に許容され得る担体としては、滅菌された水溶液又は分散液、及び滅菌された注射可能な溶液又は分散液を調製するための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。水に加えて、担体は、例えば、等張緩衝生理食塩水であり得る。

【0117】

選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容され得る剤形に製剤化される。

【0118】

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性になることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量（有効量）を得るように変化し得る。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む種々の薬物動態学的因子に依存する。

【0119】

一態様では、本発明は、疾患の治療を意図したキットであって、（ａ）本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと、（ｂ）本明細書に記載のヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する抗体とを同じ容器内又は別個の容器内に含み、任意に、（ｃ）疾患を治療するための方法としての併用治療の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書を更に含むキットを提供する。更に、キットは、（ａ）組成物が含有された第１の容器であって、該組成物が、本明細書に記載されるヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）組成物が含有された第２の容器であって、該組成物が、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを含む、第２の容器と、任意に、（ｃ）組成物が含有された第３の容器であって、該組成物が更なる細胞毒性薬又は他の治療薬を含む、第３の容器とを含んでもよい。本発明のこの実施形態におけるキットは、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。代替的又は追加的に、本キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容され得る緩衝液を含む第３（又は第４）の容器を更に含んでもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。

【0120】

一態様では、本発明は、（ａ）本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを含む容器、及び（ｂ）疾患を治療する方法として本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体との併用療法におけるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートの使用を指示する説明書を含む添付文書を含む、疾患の治療を意図したキットを提供する。

【0121】

別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に記載の抗ＴＹＲＰ１／ＣＤ３抗体を含む容器、及び（ｂ）疾患を治療するための方法として本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートとの併用療法における抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体の使用を指示する添付文書を含む、疾患の治療を意図したキットを提供する。

【0122】

更なる態様では、本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを含む、疾患の治療を意図した医薬品を提供し、当該医薬品は、本明細書に記載のヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する抗体との併用療法における使用のためのものであり、任意に、疾患を治療するための方法としての併用治療の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書を含む。

【0123】

なお更なる態様では、本発明は、本明細書に記載されるヒトＴＹＲＰ１及びＣＤ３に結合する抗体を含む、疾患の治療を意図した医薬品を提供し、当該医薬品は、本明細書に記載されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートとの併用療法における使用のためのものであり、任意に、疾患を治療するための方法としての併用治療の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書を含む。

【0124】

「治療する方法」という用語又はその同等物は、例えばがんに適用される場合、患者のがん細胞の数を減少させるか若しくは排除するか、又はがんの症候を緩和するように設計された手順又は一連の作用を指す。がん又は別の増殖性障害を「治療する方法」は、がん細胞若しくは他の障害が実際に排除されること、細胞障害の数が実際に減少すること、又はがん若しくは他の障害の症候が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。多くの場合、がんを治療する方法は、成功の可能性が低い場合であっても実施されるが、患者の病歴及び推定生存予想を考慮すると、それにもかかわらず、全体的に有益な一連の作用を誘導すると考えられる。

【0125】

「と組み合わせて投与される」又は「同時投与」、「同時投与する」、「併用療法」又は「併用治療」という用語は、本明細書に記載されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び本明細書に記載される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の、例えば別個の製剤／用途（又は単一の製剤／用途）としての投与を指す。同時投与は、同時であっても順次であってもよく、好ましくは、両方（又は全て）の活性剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する期間が存在する。当該活性剤は、連続注入により同時又は逐次（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．））のいずれかで同時投与される。両方の治療剤が順次に同時投与される場合、用量は２回の別々の投与で同じ日に投与されるか、又は薬剤の１つが１日目に投与され、２番目が２日目～７日目、好ましくは２日目～４日目に同時投与される。したがって、一実施形態では、「順次」という用語は、第１の成分の服用後７日以内、好ましくは、第１の成分の服用後４日以内を意味し、「同時に」という用語は同じ時を意味する。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び／又は抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体の維持用量に関する「同時投与」という用語は、治療サイクルが両方の薬物に適切である場合、例えば毎週、維持用量を同時に同時投与することができることを意味する。又は維持用量を連続的に同時投与し、例えば、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体の用量を交互の週に投与する。

【0126】

抗体が、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって求められている組織、システム、動物又は人間の生物学的又は医学的応答を誘発するそれぞれの化合物又は組み合わせの量である「治療有効量」（又は単に「有効量」）で患者に投与されることは自明である。

【0127】

同時投与の量及び同時投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（種、性別、年齢、体重など）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重症度に依存するであろう。当該ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び／又は抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体は、１回又は一連の治療にわたって、例えば同日又は翌日又は毎週間隔で患者に適切に同時投与される。

【0128】

抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートに加えて、化学療法剤も投与することができる。

【0129】

一実施形態では、本明細書に記載されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫細胞免疫コンジュゲート及び本明細書に記載される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体と共に投与され得るそのような追加の化学療法剤としては、限定されないが、以下を含むアルキル化剤を含む抗新生物剤が挙げられる：メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）等のニトロソ尿素；Ｔｅｍｏｄａｌ（商標）（テモゾールアミド）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファン等のアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等のトリアジン；メトトレキサート及びトリメトレキセートなどの葉酸類似体、５－フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザシチジン、２，２’－ジフルオロデオキシシチジンなどのピリミジン類似体、６－メルカプトプリン、６－チオグアン、アザチオプリン、Ｔ－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ）などのプリン類似体を含む代謝拮抗剤；パクリタキセルなどの抗有糸分裂薬、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む天然産物；エトポシド及びテニポシドなどのピポドフィロトキシン；アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ及びアクチノマイシン等の抗生物質；Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素；インターフェロン－アルファ、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦなどの生物学的応答調節物質；オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；プレドニゾン及び同等物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質ステロイド拮抗薬を含むホルモン及び拮抗薬；Ｇｅｍｚａｒ（商標）（ゲムシタビン）、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール等のプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物等のエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリド等の抗アンドロゲン；並びにフルタミド等の非ステロイド性抗アンドロゲン。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えば、Ｖｉｄａｚａ）及び転写抑制の解除（ＡＴＲＡ）療法を含むがこれらに限定されないエピジェネティック機構を標的とする治療法もまた、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施形態では、化学療法剤は、タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、改変パクリタキセル（例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ及びＯｐａｘｉｏ）など）、ドキソルビシン、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）及び他のマルチキナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン及びビンブラスチンからなる群から選択される。一実施形態では、化学療法剤は、タキサン（例えば、タキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、改変パクリタキセル（例えばＡｂｒａｘａｎｅ及びＯｐａｘｉｏ）などからなる群から選択される。一実施形態では、追加の化学療法剤は、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン又はオキサリプラチンから選択される。一実施形態では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル、ロイコボリン及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施形態では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。

【0130】

追加の化学療法剤との併用療法の具体例としては、例えば、乳がんの治療のためのタキサン（例えば、ドセタキセル又はパクリタキセル）又は改変パクリタキセル（例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ又はＯｐａｘｉｏ）、ドキソルビシン）、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）療法；卵巣がんに対するカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は改変ドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ又はＤｏｘｉｌ））、又はトポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）による治療法、腎臓がんの治療のためのマルチキナーゼ阻害剤、ＭＫＩ（Ｓｕｔｅｎｔ、Ｎｅｘａｖａｒ、又は７０６）及び／又はドキソルビシンによる治療法；扁平上皮癌腫の治療に対するオキサリプラチン、シスプラチン及び／又は放射線による治療法；肺がんの治療のためのタキソール及び／又はカルボプラチンによる治療法が挙げられる。

【0131】

したがって、一実施形態では、追加の化学療法剤は、乳がんの治療のためのタキサン（ドセタキセル若しくはパクリタキセル又は改変パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ又はＯｐａｘｉｏ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブの群から選択される。

【0132】

一実施形態では、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体の併用療法は、化学療法剤を投与しないものである。

【0133】

本発明はまた、本明細書に記載のような疾患に罹患している患者を治療するための方法も含む。

【0134】

本発明は更に、有効量の本明細書に記載の本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び本明細書に記載の本発明による抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体を薬学的に許容され得る担体と共に含む医薬組成物を製造するための方法、並びにそのような方法のための本明細書に記載の本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体の使用を提供する。

【0135】

本発明は更に、好ましくは薬学的に許容され得る担体と共に、がんに罹患している患者を治療するための医薬品の製造のための有効量での、本明細書に記載される本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート及び本明細書に記載される本発明による抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３抗体の使用を提供する。

【0136】

細胞療法
いくつかの実施形態では、免疫療法は活性化免疫療法である。いくつかの実施形態では、免疫療法はがん治療として提供される。いくつかの実施形態では、免疫療法は養子細胞移入を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、養子細胞移入は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の投与を含む。当業者は、ＣＡＲが、細胞外腫瘍結合部分、最も一般的にはモノクローナル抗体からの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインから構成される抗原標的化受容体の一種であることを理解するであろう。

【0138】

ＣＡＲは、ＭＨＣ媒介提示とは無関係に細胞表面抗原を直接認識し、全ての患者において任意の所与の抗原に特異的な単一の受容体コンストラクトの使用を可能にする。初期ＣＡＲは、抗原認識ドメインをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３活性化鎖に融合した。これらの第一世代ＣＡＲはｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞エフェクター機能を誘導したが、それらはｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果が低いことによって大きく制限された。その後のＣＡＲ反復は、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子からの細胞内ドメインを含む、ＣＤ３と並行した二次共刺激シグナルを含んでいた。更に、第３世代受容体は、ＣＤ３に加えて、最も一般的にはＣＤ２８及び４－１ＢＢからの２つの共刺激シグナルを含む。第２世代ＣＡＲ及び第３世代ＣＡＲは抗腫瘍効果を劇的に改善し、場合によっては進行がんを有する患者において完全寛解を誘導する。一実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲがその抗原に結合すると活性化されるＣＡＲを発現するように改変された免疫応答性細胞である。

【0139】

一実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、その受容体がその抗原に結合すると活性化される抗原受容体を含む免疫応答性細胞である。一実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第一世代ＣＡＲ Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第３世代ＣＡＲ Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第４世代ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0140】

いくつかの実施形態では、養子細胞移入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞を投与することを含む。当業者は、ＴＣＲ改変Ｔ細胞が、腫瘍組織からＴ細胞を単離し、それらのＴＣＲａ鎖及びＴＣＲβ鎖を単離することによって製造されることを理解するであろう。これらのＴＣＲａ及びＴＣＲβは、後にクローン化され、末梢血から単離されたＴ細胞にトランスフェクトされ、次いで、腫瘍を認識するＴ細胞からＴＣＲａ及びＴＣＲβを発現する。

【0141】

いくつかの実施形態では、養子細胞移入は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、養子細胞移入は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変ＮＫ細胞を投与することを含む。当業者は、ＣＡＲ改変ＮＫ細胞が、患者から単離されたＮＫ細胞、又は腫瘍特異的タンパク質を認識するＣＡＲを発現するように操作された市販のＮＫ細胞を含むことを理解するであろう。

【0142】

いくつかの実施形態では、養子細胞移入は、樹状細胞を投与することを含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、免疫療法は、がんワクチンの投与を含む。当業者は、がんワクチンが免疫系をがん特異的抗原及びアジュバントに曝露することを理解するであろう。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、シプリューセル－Ｔ（ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ）、ＧＶＡＸ、ＡＤＸＳ１１－００１、ＡＤＸＳ３１－００１、ＡＤＸＳ３１－１６４、ＡＬＶＡＣ－ＣＥＡワクチン、ＡＣワクチン、タリモジーン・ラハーパレプベック（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、ＢｉｏｖａｘＩＤ、Ｐｒｏｓｔｖａｃ、ＣＤＸ１１０、ＣＤＸ１３０７、ＣＤＸ１４０１、ＣｉｍａＶａｘ－ＥＧＦ、ＣＶ９１０４、ＤＮＤＮ、ＮｅｕＶａｘ、Ａｅ－３７、ＧＲＮＶＡＣ、タルモゲン、ＧＩ－４０００、ＧＩ－６２０７、ＧＩ－６３０１、ＩｍＰＡＣＴ療法、ＩＭＡ９０１、ヘプコルテスペンリジムト－Ｌ（ｈｅｐｃｏｒｔｅｓｐｅｎｌｉｓｉｍｕｔ－Ｌ）、スチムバックス（Ｓｔｉｍｕｖａｘ）、ＤＣＶａｘ－Ｌ、ＤＣＶａｘ－Ｄｉｒｅｃｔ、ＤＣＶａｘプロステート（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、ＣＢＬＩ、Ｃｖａｃ、ＲＧＳＨ４Ｋ、ＳＣＩＢ１、ＮＣＴ０１７５８３２８、及びＰＶＸ－４１０を含む群から選択される。

【0144】

以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。

【0145】

以下の記述では、本発明の実施形態を説明する。

【0146】

１．がんの治療における併用療法としての使用のための、転移の予防若しくは治療における併用療法としての使用のための、腫瘍免疫等の免疫関連疾患の治療若しくはその進行の遅延における併用療法としての使用のための、又はＴ細胞活性等の免疫応答若しくは機能の刺激における併用療法としての使用のための、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートであって、
前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0147】

２．乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫のがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃癌腫のがん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療における使用のための、先行する実施形態に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0148】

３．前記免疫コンジュゲートの抗体成分及び前記抗体が、ヒトＩｇＧ_１又はヒトＩｇＧ_４サブクラスのものであることを特徴とする、先行する実施形態のいずれかに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0149】

４．前記抗体が、低下した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0150】

５．前記最小のエフェクター機能が、エフェクターレスＦｃ突然変異に起因する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0151】

６．前記エフェクターレスＦｃ突然変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0152】

７．前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0153】

８．前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0154】

９．ｉ）腫瘍における腫瘍成長の阻害、並びに／又は
ｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／若しくは全生存期間の向上
における使用のための、抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートであって、
ＰＤ－１は、免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境内で提示され、
前記併用療法において使用される前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉ）配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列、
ｉｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｖ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１２のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
前記併用療法において使用される抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む第２の抗原結合部分、
ｉｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又は
ｉｖ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列を含む
ことを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0155】

１０．前記併用療法において使用される前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、前記併用療法において使用される前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0156】

１１．前記患者が免疫療法で治療されているか、又は免疫療法で前治療されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0157】

１２．前記免疫療法が、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞係合療法、又はそれらの任意の組み合わせを含む、先行する実施形態に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0158】

１３．前記養子細胞移入が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、先行する実施形態に記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0159】

１４．（ａ）ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートと、（ｂ）抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む併用療法を対象に投与することを含む治療方法であって、前記併用療法が、がんの治療、転移の予防若しくは治療、腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療若しくは進行の遅延、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能の刺激のためのものであり、
前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0160】

１５．前記がんが、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫のがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃癌腫のがん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫からなる群から選択される、先行する実施形態に記載の方法。

【0161】

１６．前記免疫コンジュゲートの抗体成分及び前記抗体が、ヒトＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４サブクラスのものである、先行する実施形態に記載の方法。

【0162】

１７．前記抗体が、低下したエフェクター機能又は最小のエフェクター機能を有する、先行する実施形態に記載の方法。

【0163】

１８．前記最小のエフェクター機能が、エフェクターレスＦｃ突然変異に起因する、先行する実施形態に記載の方法。

【0164】

１９．前記エフェクターレスＦｃ突然変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである、先行する実施形態に記載の方法。

【0165】

２０．前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｉｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第２の抗原結合部分とを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0166】

２１．前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｉｖ）配列番号８若しくは配列番号８若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｖ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｖｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列
を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
ｉｖ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、
ｖ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又は
ｖｉ）配列番号１８及び配列番号１８及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0167】

２２．（ｉ）腫瘍における腫瘍成長を阻害するための、及び／又は（ｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／若しくは全生存期間を向上するための治療方法であって、ＰＤ－１が免疫細胞、特にＴ細胞上又は腫瘍細胞環境内に提示され、前記方法が、（ａ）ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートを、（ｂ）抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて含む併用療法を対象に投与することを含み、
前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、
ｖ）配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号３のポリペプチド配列、
ｖｉ）配列番号８若しくは配列番号９若しくは配列番号１０のポリペプチド配列、
ｖｉｉ）配列番号８、及び配列番号９及び配列番号１０のポリペプチド配列、又は
ｖｉｉｉ）配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３のポリペプチド配列を含み、
前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、
ｖ）配列番号４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５の軽鎖可変ドメインＶＬを含む第１の抗原結合部分と、配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む第２の抗原結合部分、
ｖｉ）配列番号１４若しくは配列番号１５若しくは配列番号１６若しくは配列番号１７のポリペプチド配列、
ｖｉｉ）配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列、又は
ｖｉｉｉ）配列番号１８及び配列番号１９及び配列番号２０及び配列番号２１のポリペプチド配列
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲート。

【0168】

２３．前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２バリアント免疫コンジュゲートが、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のポリペプチド配列を含み、前記抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６及び配列番号１７のポリペプチド配列を含む、実施形態２２に記載の方法。

【0169】

２４．患者が免疫療法で治療されるか、又は免疫療法で前治療された、実施形態２３に記載の方法。

【0170】

２５．前記免疫療法が、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞係合療法、又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２４に記載の方法。

【0171】

２６．前記養子細胞移入が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、実施形態２５に記載の方法。

【実施例】

【0172】

実施例
Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃ転移性黒色腫同系モデル
ＰＤ１－ＩＬ２ｖ免疫コンジュゲート単独及び抗ＴＹＲＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＴＹＲＰ１－ＴＣＢ）と組み合わせたＰＤ１－ＩＬ２ｖ免疫コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、マウス腫瘍細胞株の同系モデルにおいて抗腫瘍有効性について試験した。マウスサロゲートＰＤ１－ＩＬ２ｖ免疫コンジュゲート（配列番号１１、１２及び１３）、マウスサロゲートＴＹＲＰ１－ＴＣＢ（配列番号１８、１９、２０及び２１）、マウスサロゲートＦＡＰ－ＩＬ２ｖ（配列番号２４、２５及び２６）及びマウスサロゲート抗ＰＤ１（配列番号２７及び２８）を、Ｂｌａｃｋ６アルビノに静脈内注射したマウス黒色腫Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃ二重トランスフェクタント細胞株において試験した。

【0173】

Ｂ１６細胞（マウス黒色腫）を最初にＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス）から得て、増殖後にＲｏｃｈｅ－Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託した。Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃ細胞株を、カルシウムトランスフェクション及びサブクローニング技術によって自社で作製した。Ｂ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃを、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、２００μｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ、０．７５μｇ／ｍｌピューロマイシン及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を、５％ＣＯ_２の水飽和雰囲気中、３７℃で培養した。継代１３を移植に使用した。細胞生存度は、９６．１％であった。０．３ｍｌツベルクリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ国）を用いて、動物あたり２×１０^５個の細胞を静脈内注射した。２００マイクロリットル（ＲＰＭＩ培地中２×１０^５個のＢ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃ細胞）の細胞懸濁液を尾静脈に注射した。

【0174】

実験開始時の１０週齢～１２週齢の雌性Ｂｌａｃｋ６アルビノマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ、フランス国リヨン）を、義務付けられたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明期／１２時間暗期の毎日のサイクルで特定病原体を含まない条件下で維持した。実験的研究プロトコルは、現地政府によって審査及び承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。

【0175】

マウスに、研究０日目に、２×１０^５個のＢ１６－ｍｕＦＡＰ－Ｆｌｕｃ細胞を静脈内注射し、ランダム化し、秤量した。腫瘍細胞注射の１８日後、マウスに、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ１又はｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢの単剤を週１回、３週間ｉ．ｖ．注射し、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋ｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢ、ｍｕＦＡＰ－ＩＬ２ｖ＋ｍｕＰＤ１、ｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢ＋ｍｕＰＤ１及びｍｕＦＡＰ－ＩＬ２ｖ＋ｍｕＰＤ１＋ｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢの組み合わせと比較した。

【0176】

全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジン緩衝液を注射し、治療群には１ｍｇ／ｋｇのｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＰＤ１、１．５ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＡＰ－ＩＬ２ｖ及び１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢを注射した。２００μｌあたり所望の量の免疫コンジュゲートを得るために、原液を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。

【表1】

【0177】

図１及び表２は、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖとｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢとの組み合わせが、他の全ての治療群及びビヒクル群と比較して、生存期間中央値及び全生存期間の向上に関して有意に優れた有効性を媒介することを示す。ペアワイズログランク検定（多重検定レベル＝０．００１７９）を統計分析に使用した。カイ二乗値は６６．０７２０であり、Ｐｒｏｂ＞ＣｈｉＳｑは＜０００１^＊であった。

【表2】

【0178】

ＩＶＩＳ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＵＭによるバイオルミネセンス画像化のため、バイオルミネセンス画像化取得（ＢＬＩ）の１０分前にマウスの皮下に１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンを注射し、その後４％イソフルランで麻酔する。その後、マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）スペクトルに位置する単離チャンバに移す。ｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩ取得は、１０～５０秒間発光シグナルを取得することによって行う。データは、放射輝度（光子）／秒／ｃｍ^２／ｓｒとして記憶される。ｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩデータ分析を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）４．４ソフトウェアを用いて行い、腫瘍阻害曲線によって表す。

【0179】

図２は、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋ｍｕＴＹＲＰ１－ＴＣＢの組み合わせが、他の全ての単一薬剤群、ビヒクル群及び組み合わせ群と比較して、生物発光シグナル（光子／秒）を減少させる点で優れた効力を媒介することを示す。腫瘍細胞がルシフェラーゼを発現するように操作されていることから、生物発光シグナルの減少は、腫瘍負荷量の減少の読み出しである。

【図1】

【図2】

【配列表】

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【国際調査報告】