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特表2024-516159アルファ６ベータ４ニコチン性アセチルコリン受容体の発現系及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-12
(54)【発明の名称】アルファ６ベータ４ニコチン性アセチルコリン受容体の発現系及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240405BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240405BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12Q1/06
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564525
(86)(22)【出願日】2022-04-22
(85)【翻訳文提出日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 EP2022060765
(87)【国際公開番号】W WO2022223817
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】63/178,835
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】397060175
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ブレット，デイビッド エス．
(72)【発明者】
【氏名】グ，シェンヤン
(72)【発明者】
【氏名】マッタ，ホセ
(72)【発明者】
【氏名】ノウランド，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ダヴィニ，ウェストン
(72)【発明者】
【氏名】リンベリス，ジェイムス
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR90
4B063QS36
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA29
4B065CA46
4B065CA60
(57)【要約】
α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞、及びその使用方法が本明細書に開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された組換え細胞であって、ａ）α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα６サブユニットをコードする異種核酸と、
ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、
ｃ）ベータ関連調節タンパク質（ＢＡＲＰ）をコードする異種核酸、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）をコードする異種核酸、及びスルホトランスフェラーゼファミリー２Ｂメンバー１（ＳＵＬＴ２Ｂ１）をコードする異種核酸からなる群から選択される少なくとも１つの異種核酸と、を含む、単離された組換え細胞。
【請求項2】
前記組換え細胞が、前記ＢＡＲＰをコードする異種核酸、ＣＨＡＴをコードする異種核酸配列、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された組換え細胞。
【請求項3】
前記組換え細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１又は２に記載の単離された組換え細胞。
【請求項4】
前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された組換え細胞。
【請求項5】
前記α６β４ ｎＡＣｈＲの前記α６サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項6】
前記α６β４ ｎＡＣｈＲの前記β４サブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項7】
前記ＢＡＲＰが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項8】
前記ＣＨＡＴが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項9】
前記ＳＵＬＴ２Ｂ１が、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項10】
α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法であって、ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を作用物質と接触させることと、
ｂ）前記単離された組換え細胞の前記α６β４ ｎＡＣｈＲの活性を決定することとを含み、前記単離された組換え細胞を前記作用物質と接触させなかった場合のα６β４ ｎＡＣｈＲの活性と比較して、前記作用物質が前記α６β４ ｎＡＣｈＲの前記活性を増強する場合、前記作用物質はアゴニスト又は陽性アロステリック調節因子（ＰＡＭ）として同定され、前記作用物質が前記α６β４ ｎＡＣｈＲの前記活性を減少させる場合、前記作用物質はアンタゴニストとして同定される、方法。
【請求項11】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のカルシウム流を決定することを含み、前記単離された組換え細胞を前記作用物質と接触させなかった場合の前記カルシウム流と比較して、前記作用物質が前記カルシウム流を増強する場合、前記作用物質はアゴニストとして同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、前記単離された組換え細胞を前記作用物質と接触させなかった場合の前記カルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流と比較して、前記作用物質が前記カルシウム流を増強せず、前記ニコチン誘発性カルシウム流を増強する場合、前記作用物質はＰＡＭとして同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、前記単離された組換え細胞を前記作用物質と接触させなかった場合の前記ニコチン誘発性カルシウム流と比較して、前記作用物質が前記ニコチン誘発性カルシウム流を減少させる場合、前記作用物質はアンタゴニストとして同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記単離された組換え細胞を、前記作用物質と接触させる前に、約２５℃～３５℃で約２０～５０時間インキュベートする、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記作用物質が、小分子又はペプチドである、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
（ｉ）請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（発明の分野）
本発明は、α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor、ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞、及びその使用方法に関する。
本発明は、α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor、ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞、及びその使用方法に関する。
【0002】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０２１年４月２３日出願の米国特許仮出願第６３／１７８，８３５号の利益を主張するものである。
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０２１年４月２３日出願の米国特許仮出願第６３／１７８，８３５号の利益を主張するものである。
【0003】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年０２月２８日に作成され、名称はＰＲＤ４１２７ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，５７６バイトである。
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年０２月２８日に作成され、名称はＰＲＤ４１２７ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，５７６バイトである。
【0004】
（発明の背景）
ニコチンは、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）に対する作用により、鎮痛特性を有する（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８ Ａｐｒ；５９２（７）：１０４５－１０６２．ｄｏｉ：１０．１００２／１８７３－３４６８．１２８８４）。エピバチジンは、一般的なｎＡＣｈＲアゴニストであり、強力な鎮痛剤である（Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｆｒｏｇ Ｓｋｉｎ：ｔｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｅｐｉｂａｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ－Ｏｐｉｏｉｄ Ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ．２０００ Ａｐｒ；１７（２）：１３１－５．ｄｏｉ：１０．１０３９／ａ９００７２８ｈ）。更に、汎ｎＡＣｈＲアゴニストＡＢＴ－５９４は、第２相臨床試験において糖尿病性末梢神経障害に対して強い有効性を示した。残念ながら、ＡＢＴ－５９４は許容できない副作用を有し、その正確な分子標的は未知であった（Ｒｏｗｂｏｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＡＢＴ－５９４ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ，Ｐａｉｎ．２００９ Ｄｅｃ；１４６（３）：２４５－２５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐａｉｎ．２００９．０６．０１３．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｓｅｐ ２４）。その後、非近交系マウス系統からの後根神経節組織におけるｍＲＮＡ発現のゲノミクススクリーニングにより、α６ ｎＡＣｈＲサブユニットレベルがスペア神経損傷モデルにおける疼痛応答と逆相関することが同定された（Ｗｉｅｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃα６ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｃｒｏｓｓ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ２Ｘ２／３ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｍａｙ １３；７（２８７）：２８７ｒａ７２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９９８６）。したがって、炎症性損傷及び神経障害性損傷の両方の後のニコチンの鎮痛効果は、α６ノックアウトマウスにおいて存在しない。更に、ヒト手術後疼痛及び顎関節症は、ＣＨＲＮＡ６（α６）プロモータにおける多型によって影響を受ける（Ｗｉｅｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ α６ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｃｒｏｓｓ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ２Ｘ２／３ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｍａｙ １３；７（２８７）：２８７ｒａ７２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９９８６）。まとめると、これらの結果は、β４サブユニットと対になる脊髄ニューロンにおけるα６に対するアゴニズムが、神経障害性疼痛を軽減することができ、魅力的な非オピオイド標的であるという説得力のある証拠を提供する（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８ Ａｐｒ；５９２（７）：１０４５－１０６２．ｄｏｉ：１０．１００２／１８７３－３４６８．１２８８４）。
ニコチンは、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）に対する作用により、鎮痛特性を有する（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８ Ａｐｒ；５９２（７）：１０４５－１０６２．ｄｏｉ：１０．１００２／１８７３－３４６８．１２８８４）。エピバチジンは、一般的なｎＡＣｈＲアゴニストであり、強力な鎮痛剤である（Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｆｒｏｇ Ｓｋｉｎ：ｔｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｅｐｉｂａｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ－Ｏｐｉｏｉｄ Ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ．２０００ Ａｐｒ；１７（２）：１３１－５．ｄｏｉ：１０．１０３９／ａ９００７２８ｈ）。更に、汎ｎＡＣｈＲアゴニストＡＢＴ－５９４は、第２相臨床試験において糖尿病性末梢神経障害に対して強い有効性を示した。残念ながら、ＡＢＴ－５９４は許容できない副作用を有し、その正確な分子標的は未知であった（Ｒｏｗｂｏｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＡＢＴ－５９４ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ，Ｐａｉｎ．２００９ Ｄｅｃ；１４６（３）：２４５－２５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐａｉｎ．２００９．０６．０１３．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｓｅｐ ２４）。その後、非近交系マウス系統からの後根神経節組織におけるｍＲＮＡ発現のゲノミクススクリーニングにより、α６ ｎＡＣｈＲサブユニットレベルがスペア神経損傷モデルにおける疼痛応答と逆相関することが同定された（Ｗｉｅｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃα６ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｃｒｏｓｓ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ２Ｘ２／３ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｍａｙ １３；７（２８７）：２８７ｒａ７２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９９８６）。したがって、炎症性損傷及び神経障害性損傷の両方の後のニコチンの鎮痛効果は、α６ノックアウトマウスにおいて存在しない。更に、ヒト手術後疼痛及び顎関節症は、ＣＨＲＮＡ６（α６）プロモータにおける多型によって影響を受ける（Ｗｉｅｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ α６ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｃｒｏｓｓ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ２Ｘ２／３ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｍａｙ １３；７（２８７）：２８７ｒａ７２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９９８６）。まとめると、これらの結果は、β４サブユニットと対になる脊髄ニューロンにおけるα６に対するアゴニズムが、神経障害性疼痛を軽減することができ、魅力的な非オピオイド標的であるという説得力のある証拠を提供する（Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８ Ａｐｒ；５９２（７）：１０４５－１０６２．ｄｏｉ：１０．１００２／１８７３－３４６８．１２８８４）。
【0005】
しかしながら、ヒトα６β４受容体に対する薬物発見は、これらの受容体が組換え細胞株における発現に対して不応性であったので、可能ではなかった（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ α６－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎＡＣｈＲｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００９ Ｊｕｎ；３０（６）：７４０－７５１）。
【0006】
これらの受容体を強く発現し、薬物発見に使用することができる細胞株を開発する必要性が依然として存在する。
【0007】
（発明の簡単な概要）
本明細書では、ａ）α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、ｃ）ベータ関連調節タンパク質（beta associated regulatory protein、ＢＡＲＰ）をコードする異種核酸、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（choline O-acetyltransferase、ＣＨＡＴ）をコードする異種核酸、及びスルホトランスフェラーゼファミリー２Ｂメンバー１（sulfotransferase family 2B member 1、ＳＵＬＴ２Ｂ１）をコードする異種核酸からなる群から選択される少なくとも１つの異種核酸とを含む単離された組換え細胞が提供される。
本明細書では、ａ）α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、ｃ）ベータ関連調節タンパク質（beta associated regulatory protein、ＢＡＲＰ）をコードする異種核酸、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（choline O-acetyltransferase、ＣＨＡＴ）をコードする異種核酸、及びスルホトランスフェラーゼファミリー２Ｂメンバー１（sulfotransferase family 2B member 1、ＳＵＬＴ２Ｂ１）をコードする異種核酸からなる群から選択される少なくとも１つの異種核酸とを含む単離された組換え細胞が提供される。
【0008】
単離された組換え細胞の一実施形態では、組換え細胞は、ＢＡＲＰをコードする異種核酸、ＣＨＡＴをコードする異種核酸、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸を含む。
【0009】
単離された組換え細胞の更なる実施形態では、組換え細胞は哺乳動物細胞である。
【0010】
単離された組換え細胞のより更なる実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎２９３Ｔ（human embryonic kidney 293T、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（baby hamster kidney、ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される。
【0011】
単離された組換え細胞のより更なる実施形態では、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0012】
単離された組換え細胞のより更なる実施形態では、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
単離された組換え細胞のより更なる実施形態では、ＢＡＲＰは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0014】
単離された組換え細胞のより更なる実施形態では、ＣＨＡＴは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0015】
単離された組換え細胞のより更なる実施形態では、ＳＵＬＴ２Ｂ１は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0016】
更に、α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法であって、ａ）上記の単離された組換え細胞を作用物質と接触させること、及びｂ）単離された組換え細胞のα６β４ ｎＡＣｈＲの活性を決定すること、を含み、ここで、単離された組換え細胞を作用物質と接触させなかった場合のα６β４ ｎＡＣｈＲの活性と比較して、作用物質がα６β４ ｎＡＣｈＲの活性を増強する場合、作用物質はアゴニスト又は陽性アロステリック調節因子（positive allosteric modulator、ＰＡＭ）として同定され、作用物質がα６β４ ｎＡＣｈＲの活性を減少させる場合、作用物質はアンタゴニストとして同定される、方法が本明細書において提供される。
【0017】
方法の更なる実施形態では、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のカルシウム流を決定することを含み、ここで、単離された組換え細胞を作用物質と接触させなかった場合のカルシウム流と比較して、この作用物質がこのカルシウム流を増強する場合、作用物質はアゴニストとして同定される。
【0018】
方法のより更なる実施形態では、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、ここで、単離された組換え細胞をこの作用物質と接触させなかった場合のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流と比較して、この作用物質がカルシウム流を増強せず、かつニコチン誘発性カルシウム流を増強する場合、作用物質はＰＡＭとして同定される。
【0019】
方法のより更なる実施形態では、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のニコチン誘発性カルシウム流を決定することを包み、ここで、単離された組換え細胞をこの作用物質と接触させなかった場合のニコチン誘発性カルシウム流と比較して、この作用物質がニコチン誘発性カルシウム流を減少させる場合、作用物質はアンタゴニストとして同定される。
【0020】
方法のより更なる実施形態では、単離された組換え細胞は、作用物質と接触させる前に、約２５℃～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる。
【0021】
方法のより更なる実施形態では、作用物質は、小分子又はペプチドである。
【0022】
更に、（ｉ）上記の単離された組換え細胞及び（ｉｉ）使用説明書を含むキットが本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】様々な濃度のα６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニストとともにインキュベートした後の組換え細胞のＦＬＩＰＲシグナルのプロットである。
【図2】様々な濃度のメチルリカコニチン（methyllycaconitine、ＭＬＡ）（α６β４ ｎＡＣｈＲの既知のアンタゴニスト）との第１のインキュベーション及びニコチンとの第２のインキュベーション後の組換え細胞のＦＬＩＰＲシグナルのプロットである。
【図3】異なるシャペロンタンパク質と共発現させた場合のα６β４ ｎＡＣｈＲの機能発現を示すグラフである。
【0024】
（発明の詳細な記述）
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の文脈を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の文脈を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0025】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
【0026】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0027】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、通常、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【0028】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0029】
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって満たされる。
【0030】
本明細書に使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１の要素及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、意味の範疇に含まれ、したがって、本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味の範疇に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
【0031】
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」、又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されないことを示す。
【0032】
本明細書で使用されるとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」、又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§ ２ １１１．０３．を参照されたい。
【0033】
好ましい本発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【0034】
２つ若しくは３つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「同一である」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ若しくは３つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0035】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）を参照されたい）、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
【0036】
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（high scoring sequence pair、ＨＳＰ）を同定することを含む。上記のＴは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
【0037】
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ又は２つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝３、期待値（Ｅ）＝１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい）。
【0038】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
【0039】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【0040】
本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ若しくは２つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。
【0041】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲートを包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ又は２つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
【0042】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0043】
単離された組換え細胞及び組換え細胞を作製する方法
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的に、細胞において特定のシャペロンタンパク質をα６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）と共発現させることにより、α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を高度に発現する細胞が生成され、その細胞が薬物発見に有用になるという予想外の知見に基づく。本明細書では、α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を発現する組換え細胞を作製する方法、及びα６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞が提供される。
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的に、細胞において特定のシャペロンタンパク質をα６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）と共発現させることにより、α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を高度に発現する細胞が生成され、その細胞が薬物発見に有用になるという予想外の知見に基づく。本明細書では、α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を発現する組換え細胞を作製する方法、及びα６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞が提供される。
【0044】
本明細書で使用される場合、「α６β４ニコチン性アセチルコリン受容体」、「α６β４ ｎＡＣｈＲ」、「アルファ６ベータ４ニコチン性アセチルコリン受容体」、及び「アルファ６ベータ４ ｎＡＣｈＲ」という用語は、互換的に使用され、コリン作動性受容体のタンパク質ファミリーのメンバーであるα６β４ニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質、好ましくはヒトα６β４ ｎＡＣｈＲを指す。
【0045】
α６β４ ｎＡＣｈＲは、α６及びβ４サブユニットから構成されるリガンド依存性イオンチャネルである。α６サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＡ６（ＮＭ＿００４１９８）によりコード化され、β４サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＢ４（ＮＭ＿０００７５０）によりコード化される。一緒に発現されると、サブユニットは共集合してヘテロマーｎＡＣｈＲを形成する（例えば、Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅα６β４＊ ｓｕｂｔｙｐｅ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１２；２６（２）：９１７－９２６を参照されたい）。
【0046】
「組換え細胞」とは、１つ又は２つ以上の個々の細胞、及び細胞がタンパク質を異種発現している組換え細胞株を指す。本明細書中で使用される場合、細胞におけるタンパク質の「異種発現」とは、外因性核酸（例えば、発現されるべきタンパク質をコードする外因性核酸）を細胞に導入することによって、タンパク質を発現するように細胞を修飾することをいう。「異種核酸」は、細胞に導入される、細胞にとって外因性の核酸を指す。いくつかの実施形態では、異種核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、異種核酸は、ＲＮＡである。細胞におけるタンパク質の異種発現は、種々の方法を使用して達成され得る。例えば、タンパク質の発現を駆動することができるプロモータ（例えば、構成的プロモータ）をコードする核酸に作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入することができる。
【0047】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に包含する。
【0048】
一般的な態様において、本発明は、薬物発見に有用なα６β４ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を発現する細胞を作製又は生成する方法に関する。一実施形態では、方法は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする核酸、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする核酸、並びにベータ関連調節タンパク質（ＢＡＲＰ）、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、及びスルホトランスフェラーゼファミリー２Ｂメンバー１（ＳＵＬＴ２Ｂ１）から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含む。α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニット、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及び／又はＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸は、発現ベクター中（例えば、単一の発現ベクター中又は別々の発現ベクター中）に存在し得る。いくつかの実施形態では、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニット、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及び／又はＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸は、各々のタンパク質の発現を駆動することができるプロモータに作動可能に連結されている。いくつかの他の実施形態では、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニット、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸の各々は、各々のタンパク質の発現を駆動することができるプロモータに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータである。
【0049】
別の態様では、方法は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする核酸、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする核酸、並びにＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含み、本方法によって生成された細胞は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする核酸、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする核酸、及び少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が導入されていない同じ細胞と比較して、α６β４ ｎＡＣｈＲ及び／又は少なくとも１つのタンパク質を増加したレベルで発現する。
【0050】
別の態様では、本発明は、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現するように遺伝子修飾された細胞であって、遺伝子修飾細胞が、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非修飾細胞における同じタンパク質の発現と比較して増加したレベルで少なくとも１つのタンパク質を発現する、細胞に関する。一実施形態では、細胞は、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ及びＳＵＬＴ２Ｂ１の各々を発現するように遺伝子修飾され、ここで、遺伝子修飾細胞は、同じ（又は実質的に同じ）条件下で、非修飾細胞におけるＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ及びＳＵＬＴ２Ｂ１の各々の発現と比較して増加したレベルでＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ及びＳＵＬＴ２Ｂ１を発現する。
【0051】
別の態様では、本発明は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニット、並びにＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現するように遺伝子修飾された細胞であって、遺伝子修飾細胞が、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非修飾細胞における同じタンパク質の発現と比較して増加したレベルで少なくとも１つのタンパク質を発現する、細胞に関する。一実施形態では、細胞は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニット、並びにＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１のそれぞれを発現するように遺伝子修飾され、遺伝子修飾細胞は、同じ（又は実質的に同じ）条件下で、非修飾細胞におけるＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１の各々の発現と比較して、増加したレベルでＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１を発現する。
【0052】
別の態様では、本発明は、ＢＡＲＰをコードする核酸配列を含む発現ベクター、ＣＨＡＴをコードする核酸配列を含む発現ベクター、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸配列を含む発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つの発現ベクターを含む単離された組換え細胞に関する。一実施形態では、本発明は、β関連調節タンパク質（ＢＡＲＰ）をコードする核酸配列を含む発現ベクター、コリン０－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）をコードする核酸配列を含む発現ベクター、及びスルホトランスフェラーゼファミリー２Ｂメンバー１（ＳＵＬＴ２Ｂ１）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む単離された組換え細胞に関する。
【0053】
別の態様では、本発明は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクター、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクター、並びにＢＡＲＰをコードする核酸を含む発現ベクター、ＣＨＡＴをコードする核酸を含む発現ベクター、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸を含む発現ベクターからなる群から選択される少なくとも１つの発現ベクターを含む単離された組換え細胞に関する。一実施形態では、本発明は、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクター、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクター、ＢＡＲＰをコードする核酸を含む発現ベクター、ＣＨＡＴをコードする核酸を含む発現ベクター、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸を含む発現ベクターを含む単離された組換え細胞に関する。
【0054】
本明細書に記載の実施形態のいずれか１つにおいて、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニット、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１のいずれか１つ又は２つ以上をコードする核酸は、単一の発現ベクター中にあってもよく、別々の発現ベクター中にあってもよい。
【0055】
別の態様では、本発明は、ａ）α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、ｃ）ＢＡＲＰをコードする異種核酸、ＣＨＡＴをコードする異種核酸、及びＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸からなる群より選択される少なくとも１つの異種核酸を含む、単離された組換え細胞に関する。
【0056】
一実施形態では、本発明は、ａ）α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、ｃ）ＢＡＲＰをコードする異種核酸と、ｄ）ＣＨＡＴをコードする異種核酸とを含む、単離された組換え細胞に関する。
【0057】
一実施形態では、本発明は、ａ）α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、ｃ）ＢＡＲＰをコードする異種核酸と、ｄ）ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸とを含む、単離された組換え細胞に関する。
【0058】
一実施形態では、本発明は、ａ）α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットをコードする異種核酸と、ｃ）ＢＡＲＰをコードする異種核酸と、ｄ）ＣＨＡＴをコードする異種核酸と、ｅ）ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸とを含む、単離された組換え細胞に関する。
【0059】
一実施形態では、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0060】
配列番号１
ＭＬＴＳＫＧＱＧＦＬＨＧＧＬＣＬＷＬＣＶＦＴＰＦＦＫＧＣＶＧＣＡＴＥＥＲＬＦＨＫＬＦＳＨＹＮＱＦＩＲＰＶＥＮＶＳＤＰＶＴＶＨＦＥＶＡＩＴＱＬＡＮＶＤＥＶＮＱＩＭＥＴＮＬＷＬＲＨＩＷＮＤＹＫＬＲＷＤＰＭＥＹＤＧＩＥＴＬＲＶＰＡＤＫＩＷＫＰＤＩＶＬＹＮＮＡＶＧＤＦＱＶＥＧＫＴＫＡＬＬＫＹＮＧＭＩＴＷＴＰＰＡＩＦＫＳＳＣＰＭＤＩＴＦＦＰＦＤＨＱＮＣＳＬＫＦＧＳＷＴＹＤＫＡＥＩＤＬＬＩＩＧＳＫＶＤＭＮＤＦＷＥＮＳＥＷＥＩＩＤＡＳＧＹＫＨＤＩＫＹＮＣＣＥＥＩＹＴＤＩＴＹＳＦＹＩＲＲＬＰＭＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＬＦＩＳＦＬＴＶＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＶＴＬＣＩＳＶＬＬＳＬＴＶＦＬＬＶＩＴＥＴＩＰＳＴＳＬＶＶＰＬＶＧＥＹＬＬＦＴＭＩＦＶＴＬＳＩＶＶＴＶＦＶＬＮＩＨＹＲＴＰＴＴＨＴＭＰＲＷＶＫＴＶＦＬＫＬＬＰＱＶＬＬＭＲＷＰＬＤＫＴＲＧＴＧＳＤＡＶＰＲＧＬＡＲＲＰＡＫＧＫＬＡＳＨＧＥＰＲＨＬＫＥＣＦＨＣＨＫＳＮＥＬＡＴＳＫＲＲＬＳＨＱＰＬＱＷＶＶＥＮＳＥＨＳＰＥＶＥＤＶＩＮＳＶＱＦＩＡＥＮＭＫＳＨＮＥＴＫＥＶＥＤＤＷＫＹＶＡＭＶＶＤＲＶＦＬＷＶＦＩＩＶＣＶＦＧＴＡＧＬＦＬＱＰＬＬＧＮＴＧＫＳ
ＭＬＴＳＫＧＱＧＦＬＨＧＧＬＣＬＷＬＣＶＦＴＰＦＦＫＧＣＶＧＣＡＴＥＥＲＬＦＨＫＬＦＳＨＹＮＱＦＩＲＰＶＥＮＶＳＤＰＶＴＶＨＦＥＶＡＩＴＱＬＡＮＶＤＥＶＮＱＩＭＥＴＮＬＷＬＲＨＩＷＮＤＹＫＬＲＷＤＰＭＥＹＤＧＩＥＴＬＲＶＰＡＤＫＩＷＫＰＤＩＶＬＹＮＮＡＶＧＤＦＱＶＥＧＫＴＫＡＬＬＫＹＮＧＭＩＴＷＴＰＰＡＩＦＫＳＳＣＰＭＤＩＴＦＦＰＦＤＨＱＮＣＳＬＫＦＧＳＷＴＹＤＫＡＥＩＤＬＬＩＩＧＳＫＶＤＭＮＤＦＷＥＮＳＥＷＥＩＩＤＡＳＧＹＫＨＤＩＫＹＮＣＣＥＥＩＹＴＤＩＴＹＳＦＹＩＲＲＬＰＭＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＬＦＩＳＦＬＴＶＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＶＴＬＣＩＳＶＬＬＳＬＴＶＦＬＬＶＩＴＥＴＩＰＳＴＳＬＶＶＰＬＶＧＥＹＬＬＦＴＭＩＦＶＴＬＳＩＶＶＴＶＦＶＬＮＩＨＹＲＴＰＴＴＨＴＭＰＲＷＶＫＴＶＦＬＫＬＬＰＱＶＬＬＭＲＷＰＬＤＫＴＲＧＴＧＳＤＡＶＰＲＧＬＡＲＲＰＡＫＧＫＬＡＳＨＧＥＰＲＨＬＫＥＣＦＨＣＨＫＳＮＥＬＡＴＳＫＲＲＬＳＨＱＰＬＱＷＶＶＥＮＳＥＨＳＰＥＶＥＤＶＩＮＳＶＱＦＩＡＥＮＭＫＳＨＮＥＴＫＥＶＥＤＤＷＫＹＶＡＭＶＶＤＲＶＦＬＷＶＦＩＩＶＣＶＦＧＴＡＧＬＦＬＱＰＬＬＧＮＴＧＫＳ
【0061】
一実施形態では、α６β４ ｎＡＣｈＲのβ４サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0062】
配列番号２
ＭＲＲＡＰＳＬＶＬＦＦＬＶＡＬＣＧＲＧＮＣＲＶＡＮＡＥＥＫＬＭＤＤＬＬＮＫＴＲＹＮＮＬＩＲＰＡＴＳＳＳＱＬＩＳＩＫＬＱＬＳＬＡＱＬＩＳＶＮＥＲＥＱＩＭＴＴＮＶＷＬＫＱＥＷＴＤＹＲＬＴＷＮＳＳＲＹＥＧＶＮＩＬＲＩＰＡＫＲＩＷＬＰＤＩＶＬＹＮＮＡＤＧＴＹＥＶＳＶＹＴＮＬＩＶＲＳＮＧＳＶＬＷＬＰＰＡＩＹＫＳＡＣＫＩＥＶＫＹＦＰＦＤＱＱＮＣＴＬＫＦＲＳＷＴＹＤＨＴＥＩＤＭＶＬＭＴＰＴＡＳＭＤＤＦＴＰＳＧＥＷＤＩＶＡＬＰＧＲＲＴＶＮＰＱＤＰＳＹＶＤＶＴＹＤＦＩＩＫＲＫＰＬＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＶＬＴＴＬＬＡＩＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＭＴＬＣＩＳＶＬＬＡＬＴＦＦＬＬＬＩＳＫＩＶＰＰＴＳＬＤＶＰＬＩＧＫＹＬＭＦＴＭＶＬＶＴＦＳＩＶＴＳＶＣＶＬＮＶＨＨＲＳＰＳＴＨＴＭＡＰＷＶＫＲＣＦＬＨＫＬＰＴＦＬＦＭＫＲＰＧＰＤＳＳＰＡＲＡＦＰＰＳＫＳＣＶＴＫＰＥＡＴＡＴＳＴＳＰＳＮＦＹＧＮＳＭＹＦＶＮＰＡＳＡＡＳＫＳＰＡＧＳＴＰＶＡＩＰＲＤＦＷＬＲＳＳＧＲＦＲＱＤＶＱＥＡＬＥＧＶＳＦＩＡＱＨＭＫＮＤＤＥＤＱＳＶＶＥＤＷＫＹＶＡＭＶＶＤＲＬＦＬＷＶＦＭＦＶＣＶＬＧＴＶＧＬＦＬＰＰＬＦＱＴＨＡＡＳＥＧＰＹＡＡＱＲＤ
ＭＲＲＡＰＳＬＶＬＦＦＬＶＡＬＣＧＲＧＮＣＲＶＡＮＡＥＥＫＬＭＤＤＬＬＮＫＴＲＹＮＮＬＩＲＰＡＴＳＳＳＱＬＩＳＩＫＬＱＬＳＬＡＱＬＩＳＶＮＥＲＥＱＩＭＴＴＮＶＷＬＫＱＥＷＴＤＹＲＬＴＷＮＳＳＲＹＥＧＶＮＩＬＲＩＰＡＫＲＩＷＬＰＤＩＶＬＹＮＮＡＤＧＴＹＥＶＳＶＹＴＮＬＩＶＲＳＮＧＳＶＬＷＬＰＰＡＩＹＫＳＡＣＫＩＥＶＫＹＦＰＦＤＱＱＮＣＴＬＫＦＲＳＷＴＹＤＨＴＥＩＤＭＶＬＭＴＰＴＡＳＭＤＤＦＴＰＳＧＥＷＤＩＶＡＬＰＧＲＲＴＶＮＰＱＤＰＳＹＶＤＶＴＹＤＦＩＩＫＲＫＰＬＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＶＬＴＴＬＬＡＩＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＭＴＬＣＩＳＶＬＬＡＬＴＦＦＬＬＬＩＳＫＩＶＰＰＴＳＬＤＶＰＬＩＧＫＹＬＭＦＴＭＶＬＶＴＦＳＩＶＴＳＶＣＶＬＮＶＨＨＲＳＰＳＴＨＴＭＡＰＷＶＫＲＣＦＬＨＫＬＰＴＦＬＦＭＫＲＰＧＰＤＳＳＰＡＲＡＦＰＰＳＫＳＣＶＴＫＰＥＡＴＡＴＳＴＳＰＳＮＦＹＧＮＳＭＹＦＶＮＰＡＳＡＡＳＫＳＰＡＧＳＴＰＶＡＩＰＲＤＦＷＬＲＳＳＧＲＦＲＱＤＶＱＥＡＬＥＧＶＳＦＩＡＱＨＭＫＮＤＤＥＤＱＳＶＶＥＤＷＫＹＶＡＭＶＶＤＲＬＦＬＷＶＦＭＦＶＣＶＬＧＴＶＧＬＦＬＰＰＬＦＱＴＨＡＡＳＥＧＰＹＡＡＱＲＤ
【0063】
一実施形態では、ＢＡＲＰは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＢＡＲＰは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６及びβ４サブユニットの発現を増強する特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0064】
配列番号３
ＭＱＰＴＡＴＭＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＶＡＬＴＴＳＷＤＮＡＴＧＲＰＴＡＥＰＤＰＩＬＤＮＹＶＬＬＶＶＶＭＳＬＦＶＧＧＴＬＶＶＬＳＧＶＬＬＬＣＫＲＣＷＤＶＨＱＲＬＮＲＡＭＥＥＡＥＫＴＴＴＴＹＬＤＮＧＴＨＰＡＱＤＰＤＦＲＧＥＤＰＥＣＱＤＡＥＴＥＲＦＬＳＴＳＳＴＧＲＲＶＳＦＮＥＡＡＬＦＥＱＳＲＫＴＱＤＫＧＲＲＹＴＬＴＥＧＤＦＨＨＬＫＮＡＲＬＴＨＬＨＬＰＰＬＫＩＶＴＩＨＥＣＤＳＧＥＡＳＳＡＴＴＰＨＰＡＴＳＰＫＡＴＬＡＩＦＱＰＰＧＫＡＬＴＧＲＳＶＧＰＳＳＡＬＰＧＤＰＹＮＳＡＡＧＡＴＤＦＡＥＩＳＰＳＡＳＳＤＳＧＥＧＴＳＬＤＡＧＴＲＳＴＫＡＧＧＰＧＡＡＡＧＰＧＥＡＧＰＧＳＧＡＧＴＶＬＱＦＬＴＲＬＲＲＨＡＳＬＤＧＡＳＰＹＦＫＶＫＫＷＫＬＥＰＳＱＲＡＡＳＬＤＴＲＧＳＰＫＲＨＨＦＱＲＱＲＡＡＳＥＳＴＥＱＥＥＧＤＡＰＱＥＤＦＩＱＹＩＡＲＡＧＤＡＶＡＦＰＨＰＲＰＦＬＡＳＰＰＰＡＬＧＲＬＥＡＡＥＡＡＧＧＡＳＰＤＳＰＰＥＲＧＡＧＳＡＧＰＥＱＱＱＰＰＬＥＰＤＡＥＲＤＡＧＰＥＱＡＱＴＳＹＲＤＬＷＳＬＲＡＳＬＥＬＨＡＡＡＳＤＨＳＳＳＧＮＤＲＤＳＶＲＳＧＤＳＳＧＳＧＳＧＧＡＡＰＡＦＰＰＰＳＰＰＡＰＲＰＫＤＧＥＡＲＲＬＬＱＭＤＳＧＹＡＳＩＥＧＲＧＡＧＤＤＴＥＰＰＡＡＰＡＲＰＲＳＰＲＡＷＰＲＲＰＲＲＤＹＳＩＤＥＫＴＤＡＬＦＨＥＦＬＲＨＤＰＨＦＤＤＴＰＡＡＡＲＨＲＡＲＡＨＰＨＡＲＫＱＷＱＲＧＲＱＨＳＤＰＧＡＲＡＡＰＡＬＡＧＴＰＡＰＰＡＧＡＡＲＰＡＲＡＰＬＲＲＧＤＳＶＤＧＰＰＤＧＲＴＬＧＧＡＧＤＤＰＡＩＰＶＩＥＥＥＰＧＧＧＧＣＰＧＳＧＬＣＶＬＰＳＧＳＶＬＤＫＬＡＡＧＬＤＥＲＬＦＰＰＲＬＡＥＰＶＶＡＴＰＡＬＶＡＡＡＰＴＳＰＤＨＳＰＡ
ＭＱＰＴＡＴＭＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＶＡＬＴＴＳＷＤＮＡＴＧＲＰＴＡＥＰＤＰＩＬＤＮＹＶＬＬＶＶＶＭＳＬＦＶＧＧＴＬＶＶＬＳＧＶＬＬＬＣＫＲＣＷＤＶＨＱＲＬＮＲＡＭＥＥＡＥＫＴＴＴＴＹＬＤＮＧＴＨＰＡＱＤＰＤＦＲＧＥＤＰＥＣＱＤＡＥＴＥＲＦＬＳＴＳＳＴＧＲＲＶＳＦＮＥＡＡＬＦＥＱＳＲＫＴＱＤＫＧＲＲＹＴＬＴＥＧＤＦＨＨＬＫＮＡＲＬＴＨＬＨＬＰＰＬＫＩＶＴＩＨＥＣＤＳＧＥＡＳＳＡＴＴＰＨＰＡＴＳＰＫＡＴＬＡＩＦＱＰＰＧＫＡＬＴＧＲＳＶＧＰＳＳＡＬＰＧＤＰＹＮＳＡＡＧＡＴＤＦＡＥＩＳＰＳＡＳＳＤＳＧＥＧＴＳＬＤＡＧＴＲＳＴＫＡＧＧＰＧＡＡＡＧＰＧＥＡＧＰＧＳＧＡＧＴＶＬＱＦＬＴＲＬＲＲＨＡＳＬＤＧＡＳＰＹＦＫＶＫＫＷＫＬＥＰＳＱＲＡＡＳＬＤＴＲＧＳＰＫＲＨＨＦＱＲＱＲＡＡＳＥＳＴＥＱＥＥＧＤＡＰＱＥＤＦＩＱＹＩＡＲＡＧＤＡＶＡＦＰＨＰＲＰＦＬＡＳＰＰＰＡＬＧＲＬＥＡＡＥＡＡＧＧＡＳＰＤＳＰＰＥＲＧＡＧＳＡＧＰＥＱＱＱＰＰＬＥＰＤＡＥＲＤＡＧＰＥＱＡＱＴＳＹＲＤＬＷＳＬＲＡＳＬＥＬＨＡＡＡＳＤＨＳＳＳＧＮＤＲＤＳＶＲＳＧＤＳＳＧＳＧＳＧＧＡＡＰＡＦＰＰＰＳＰＰＡＰＲＰＫＤＧＥＡＲＲＬＬＱＭＤＳＧＹＡＳＩＥＧＲＧＡＧＤＤＴＥＰＰＡＡＰＡＲＰＲＳＰＲＡＷＰＲＲＰＲＲＤＹＳＩＤＥＫＴＤＡＬＦＨＥＦＬＲＨＤＰＨＦＤＤＴＰＡＡＡＲＨＲＡＲＡＨＰＨＡＲＫＱＷＱＲＧＲＱＨＳＤＰＧＡＲＡＡＰＡＬＡＧＴＰＡＰＰＡＧＡＡＲＰＡＲＡＰＬＲＲＧＤＳＶＤＧＰＰＤＧＲＴＬＧＧＡＧＤＤＰＡＩＰＶＩＥＥＥＰＧＧＧＧＣＰＧＳＧＬＣＶＬＰＳＧＳＶＬＤＫＬＡＡＧＬＤＥＲＬＦＰＰＲＬＡＥＰＶＶＡＴＰＡＬＶＡＡＡＰＴＳＰＤＨＳＰＡ
【0065】
一実施形態では、ＣＨＡＴは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＣＨＡＴは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６及びβ４サブユニットの発現を増強する特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0066】
配列番号４
ＭＡＡＫＴＰＳＳＥＥＳＧＬＰＫＬＰＶＰＰＬＱＱＴＬＡＴＹＬＱＣＭＲＨＬＶＳＥＥＱＦＲＫＳＱＡＩＶＱＱＦＧＡＰＧＧＬＧＥＴＬＱＱＫＬＬＥＲＱＥＫＴＡＮＷＶＳＥＹＷＬＮＤＭＹＬＮＮＲＬＡＬＰＶＮＳＳＰＡＶＩＦＡＲＱＨＦＰＧＴＤＤＱＬＲＦＡＡＳＬＩＳＧＶＬＳＹＫＡＬＬＤＳＨＳＩＰＴＤＣＡＫＧＱＬＳＧＱＰＬＣＭＫＱＹＹＧＬＦＳＳＹＲＬＰＧＨＴＱＤＴＬＶＡＱＮＳＳＩＭＰＥＰＥＨＶＩＶＡＣＣＮＱＦＦＶＬＤＶＶＩＮＦＲＲＬＳＥＧＤＬＦＴＱＬＲＫＩＶＫＭＡＳＮＥＤＥＲＬＰＰＩＧＬＬＴＳＤＧＲＳＥＷＡＥＡＲＴＶＬＶＫＤＳＴＮＲＤＳＬＤＭＩＥＲＣＩＣＬＶＣＬＤＡＰＧＧＶＥＬＳＤＴＨＲＡＬＱＬＬＨＧＧＧＹＳＫＮＧＡＮＲＷＹＤＫＳＬＱＦＶＶＧＲＤＧＴＣＧＶＶＣＥＨＳＰＦＤＧＩＶＬＶＱＣＴＥＨＬＬＫＨＭＴＱＳＳＲＫＬＩＲＡＤＳＶＳＥＬＰＡＰＲＲＬＲＷＫＣＳＰＥＩＱＧＨＬＡＳＳＡＥＫＬＱＲＩＶＫＮＬＤＦＩＶＹＫＦＤＮＹＧＫＴＦＩＫＫＱＫＣＳＰＤＡＦＩＱＶＡＬＱＬＡＦＹＲＬＨＲＲＬＶＰＴＹＥＳＡＳＩＲＲＦＱＥＧＲＶＤＮＩＲＳＡＴＰＥＡＬＡＦＶＲＡＶＴＤＨＫＡＡＶＰＡＳＥＫＬＬＬＬＫＤＡＩＲＡＱＴＡＹＴＶＭＡＩＴＧＭＡＩＤＮＨＬＬＡＬＲＥＬＡＲＡＭＣＫＥＬＰＥＭＦＭＤＥＴＹＬＭＳＮＲＦＶＬＳＴＳＱＶＰＴＴＴＥＭＦＣＣＹＧＰＶＶＰＮＧＹＧＡＣＹＮＰＱＰＥＴＩＬＦＣＩＳＳＦＨＳＣＫＥＴＳＳＳＫＦＡＫＡＶＥＥＳＬＩＤＭＲＤＬＣＳＬＬＰＰＴＥＳＫＰＬＡＴＫＥＫＡＴＲＰＳＱＧＨＱＰ
ＭＡＡＫＴＰＳＳＥＥＳＧＬＰＫＬＰＶＰＰＬＱＱＴＬＡＴＹＬＱＣＭＲＨＬＶＳＥＥＱＦＲＫＳＱＡＩＶＱＱＦＧＡＰＧＧＬＧＥＴＬＱＱＫＬＬＥＲＱＥＫＴＡＮＷＶＳＥＹＷＬＮＤＭＹＬＮＮＲＬＡＬＰＶＮＳＳＰＡＶＩＦＡＲＱＨＦＰＧＴＤＤＱＬＲＦＡＡＳＬＩＳＧＶＬＳＹＫＡＬＬＤＳＨＳＩＰＴＤＣＡＫＧＱＬＳＧＱＰＬＣＭＫＱＹＹＧＬＦＳＳＹＲＬＰＧＨＴＱＤＴＬＶＡＱＮＳＳＩＭＰＥＰＥＨＶＩＶＡＣＣＮＱＦＦＶＬＤＶＶＩＮＦＲＲＬＳＥＧＤＬＦＴＱＬＲＫＩＶＫＭＡＳＮＥＤＥＲＬＰＰＩＧＬＬＴＳＤＧＲＳＥＷＡＥＡＲＴＶＬＶＫＤＳＴＮＲＤＳＬＤＭＩＥＲＣＩＣＬＶＣＬＤＡＰＧＧＶＥＬＳＤＴＨＲＡＬＱＬＬＨＧＧＧＹＳＫＮＧＡＮＲＷＹＤＫＳＬＱＦＶＶＧＲＤＧＴＣＧＶＶＣＥＨＳＰＦＤＧＩＶＬＶＱＣＴＥＨＬＬＫＨＭＴＱＳＳＲＫＬＩＲＡＤＳＶＳＥＬＰＡＰＲＲＬＲＷＫＣＳＰＥＩＱＧＨＬＡＳＳＡＥＫＬＱＲＩＶＫＮＬＤＦＩＶＹＫＦＤＮＹＧＫＴＦＩＫＫＱＫＣＳＰＤＡＦＩＱＶＡＬＱＬＡＦＹＲＬＨＲＲＬＶＰＴＹＥＳＡＳＩＲＲＦＱＥＧＲＶＤＮＩＲＳＡＴＰＥＡＬＡＦＶＲＡＶＴＤＨＫＡＡＶＰＡＳＥＫＬＬＬＬＫＤＡＩＲＡＱＴＡＹＴＶＭＡＩＴＧＭＡＩＤＮＨＬＬＡＬＲＥＬＡＲＡＭＣＫＥＬＰＥＭＦＭＤＥＴＹＬＭＳＮＲＦＶＬＳＴＳＱＶＰＴＴＴＥＭＦＣＣＹＧＰＶＶＰＮＧＹＧＡＣＹＮＰＱＰＥＴＩＬＦＣＩＳＳＦＨＳＣＫＥＴＳＳＳＫＦＡＫＡＶＥＥＳＬＩＤＭＲＤＬＣＳＬＬＰＰＴＥＳＫＰＬＡＴＫＥＫＡＴＲＰＳＱＧＨＱＰ
【0067】
一実施形態では、ＳＵＬＴ２Ｂ１は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＳＵＬＴ２Ｂ１は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、α６β４ ｎＡＣｈＲのα６及びβ４サブユニットの発現を増強する特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0068】
配列番号５
ＭＤＧＰＡＥＰＱＩＰＧＬＷＤＴＹＥＤＤＩＳＥＩＳＱＫＬＰＧＥＹＦＲＹＫＧＶＰＦＰＶＧＬＹＳＬＥＳＩＳＬＡＥＮＴＱＤＶＲＤＤＤＩＦＩＩＴＹＰＫＳＧＴＴＷＭＩＥＩＩＣＬＩＬＫＥＧＤＰＳＷＩＲＳＶＰＩＷＥＲＡＰＷＣＥＴＩＶＧＡＦＳＬＰＤＱＹＳＰＲＬＭＳＳＨＬＰＩＱＩＦＴＫＡＦＦＳＳＫＡＫＶＩＹＭＧＲＮＰＲＤＶＶＶＳＬＹＨＹＳＫＩＡＧＱＬＫＤＰＧＴＰＤＱＦＬＲＤＦＬＫＧＥＶＱＦＧＳＷＦＤＨＩＫＧＷＬＲＭＫＧＫＤＮＦＬＦＩＴＹＥＥＬＱＱＤＬＱＧＳＶＥＲＩＣＧＦＬＧＲＰＬＧＫＥＡＬＧＳＶＶＡＨＳＴＦＳＡＭＫＡＮＴＭＳＮＹＴＬＬＰＰＳＬＬＤＨＲＲＧＡＦＬＲＫＧＶＣＧＤＷＫＮＨＦＴＶＡＱＳＥＡＦＤＲＡＹＲＫＱＭＲＧＭＰＴＦＰＷＤＥＤＰＥＥＤＧＳＰＤＰＥＰＳＰＥＰＥＰＫＰＳＬＥＰＮＴＳＬＥＲＥＰＲＰＮＳＳＰＳＰＳＰＧＱＡＳＥＴＰＨＰＲＰＳ
ＭＤＧＰＡＥＰＱＩＰＧＬＷＤＴＹＥＤＤＩＳＥＩＳＱＫＬＰＧＥＹＦＲＹＫＧＶＰＦＰＶＧＬＹＳＬＥＳＩＳＬＡＥＮＴＱＤＶＲＤＤＤＩＦＩＩＴＹＰＫＳＧＴＴＷＭＩＥＩＩＣＬＩＬＫＥＧＤＰＳＷＩＲＳＶＰＩＷＥＲＡＰＷＣＥＴＩＶＧＡＦＳＬＰＤＱＹＳＰＲＬＭＳＳＨＬＰＩＱＩＦＴＫＡＦＦＳＳＫＡＫＶＩＹＭＧＲＮＰＲＤＶＶＶＳＬＹＨＹＳＫＩＡＧＱＬＫＤＰＧＴＰＤＱＦＬＲＤＦＬＫＧＥＶＱＦＧＳＷＦＤＨＩＫＧＷＬＲＭＫＧＫＤＮＦＬＦＩＴＹＥＥＬＱＱＤＬＱＧＳＶＥＲＩＣＧＦＬＧＲＰＬＧＫＥＡＬＧＳＶＶＡＨＳＴＦＳＡＭＫＡＮＴＭＳＮＹＴＬＬＰＰＳＬＬＤＨＲＲＧＡＦＬＲＫＧＶＣＧＤＷＫＮＨＦＴＶＡＱＳＥＡＦＤＲＡＹＲＫＱＭＲＧＭＰＴＦＰＷＤＥＤＰＥＥＤＧＳＰＤＰＥＰＳＰＥＰＥＰＫＰＳＬＥＰＮＴＳＬＥＲＥＰＲＰＮＳＳＰＳＰＳＰＧＱＡＳＥＴＰＨＰＲＰＳ
【0069】
ＤＮＡトランスフェクション（例えば、ＤＮＡベクターを介して）及びＲＮＡ形質導入などの、異種核酸を細胞に導入するための任意の適切な手段を本明細書で使用して、本明細書で開示される組換え細胞を調製することができる。一実施形態では、組換え細胞を生成するために細胞に導入される異種核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターを使用することによって調製される。用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの一のタイプであるプラスミドは、環状２本鎖ＤＮＡループを意味し、追加のＤＮＡセグメントがこれに挿入され得る。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがこれに挿入され得る。発現ベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を指向することができる、これらのベクターである。本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態のタンパク質配列をコードする核酸を含む。したがって、発現ベクターは、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ又は２つ以上の調節配列（例えば、プロモータ）を含み得る。発現ベクターに関して使用される場合、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）調節配列に連結されることを意味することが意図される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベル、及びベクターの使用目的などの因子に依存し得るということを、当業者は理解するであろう。
【0070】
本開示を考慮して、当業者に既知である任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターを使用することができる。一実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において知られており、本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。
【0071】
本開示を考慮して、当業者に知られている任意の細胞を、α６β４ ｎＡＣｈＲ、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１の組換え発現に使用することができる。一実施形態では、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択することができる。
【0072】
α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法
また、α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子（ＰＡＭ）を同定する方法も明細書に提供される。ＰＡＭは、活性部位以外のタンパク質表面上の部位で結合し、したがって、タンパク質結合部位の立体構造を変化させる化合物である。
また、α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子（ＰＡＭ）を同定する方法も明細書に提供される。ＰＡＭは、活性部位以外のタンパク質表面上の部位で結合し、したがって、タンパク質結合部位の立体構造を変化させる化合物である。
【0073】
一実施形態では、方法は、本明細書に開示される単離された組換え細胞を、組換え細胞が増殖する条件下で培養することと、組換え細胞を作用物質と接触させることと、作用物質がα６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又はＰＡＭであるかどうかを決定することとを含み、ここで、アゴニスト又はＰＡＭは、作用物質と接触させなかった組換え細胞におけるα６β４ ｎＡＣｈＲの活性と比較して、α６β４ ｎＡＣｈＲの活性を増強し、アンタゴニストはα６β４ ｎＡＣｈＲの活性を低下させる。本明細書で使用するとき、アゴニストは、α６β４ ｎＡＣｈＲの機能を増強する働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用するとき、ＰＡＭは、受容体を直接活性化させることなく、リガンドに対するα６β４ ｎＡＣｈＲの反応の効果を増強する分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用する場合、用語「増強する」、「増強された」、「増加する」、又は「増加した」がα６β４ ｎＡＣｈＲ活性に関して使用されるときには、アゴニスト又はＰＡＭが投与されていない細胞において観察される対応するシグナル伝達に対して、受容体を通じたシグナル伝達が増加していることを指す。本明細書で使用するとき、アンタゴニストは、α６β４ ｎＡＣｈＲの機能を遮断、減少、又は減衰させる働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。ある特定の実施形態では、作用物質は、小分子又はペプチドである。
【0074】
一実施形態では、ＦＬＩＰＲアッセイは、α６β４ ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流のアゴニストを同定するために使用される。このアッセイでは、組換え細胞をカルシウム感受性色素（Ｃａ５など）とともにインキュベートし、試験化合物に曝露し、カルシウム流をＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化する。図１に示すように、α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニストは、カルシウム流を増強する。
【0075】
一実施形態では、ニコチン誘発性α６β４ ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流のアンタゴニストを同定するために、ＦＬＩＰＲアッセイを使用する。このアッセイでは、組換え細胞をカルシウム感受性色素（Ｃａ５など）とともにインキュベートする。二重添加プロトコールを使用して、組換え細胞を、第１の期間中に試験化合物に曝露し、第２の期間中にニコチン（例えば、ＥＣ８０（１５μｍ）で）に曝露する。その後、カルシウム流をＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化する。図２に示すように、α６β４ ｎＡＣｈＲのアンタゴニストは、カルシウム流を減少させる。
【0076】
一実施形態では、ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、ニコチン誘発性α６β４ ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流を正に調節又は増強する化合物を同定する。このアッセイでは、組換え細胞をカルシウム感受性色素（Ｃａ５など）とともにインキュベートする。二重添加プロトコールを使用して、組換え細胞を、第１の期間中に試験化合物に曝露し、第２の期間中にニコチン（例えば、ＥＣ８０（１５μｍ）で）に曝露する。その後、カルシウム流をＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化する。試験化合物がニコチン誘発性α６β４ ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流を増強するが、アゴニストとしてのカルシウム流を増強しない場合（上記のように決定される）、試験化合物は、α６β４ ｎＡＣｈＲの陽性アロステリック調節因子（ＰＡＭ）又は増強剤と呼ばれる。
【0077】
好ましい実施形態では、ＦＬＩＰＲアッセイ又はα６β４ ｎＡＣｈＲ活性を測定するための他のアッセイの前に、細胞を約２５～３５℃で約２０～５０時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、細胞は、アッセイの前に、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、又は約３５℃で、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、又は約５０時間インキュベートされる。
【0078】
発現系及びキット
単離された組換え細胞を含む発現系及びキットが、本明細書において更に提供される。発現系及びキットは、使用説明書を更に含んでもよい。
単離された組換え細胞を含む発現系及びキットが、本明細書において更に提供される。発現系及びキットは、使用説明書を更に含んでもよい。
【実施例】
【0079】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【0080】
【表1】
【0081】
細胞株
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｒ７９００７）
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｒ７９００７）
【0082】
ベクター構築物
・ｐｃＤＮＡ３．１－α６
・ｐｃＤＮＡ３．１－β４
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＢＡＲＰ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＵＬＴ２Ｂ１
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＨＡＴ
・ｐｃＤＮＡ３．１－α６
・ｐｃＤＮＡ３．１－β４
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＢＡＲＰ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＵＬＴ２Ｂ１
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＨＡＴ
【0083】
培養培地
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ
・トランスフェクション試薬
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ
・トランスフェクション試薬
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬
【0084】
植え付け培地
・ＤＭＥＭ
・１０％ＦＢＳ
・１％ペニシリン（ｐｅｎ）－ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐ）
・ＤＭＥＭ
・１０％ＦＢＳ
・１％ペニシリン（ｐｅｎ）－ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐ）
【0085】
化合物希釈／Ｃａ５緩衝液
・１ｍＭ Ｍｇ２＋及び２ｍＭ Ｃａ２＋を補充したＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液５００ｍＬ）
・１ｍＭ Ｍｇ２＋及び２ｍＭ Ｃａ２＋を補充したＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液５００ｍＬ）
【0086】
カルシウム５（Ｃａ５）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
・カルシウム色素をハンクス緩衝塩溶液中で２５倍濃度に希釈した。２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で１倍に希釈した色素。
・カルシウム色素をハンクス緩衝塩溶液中で２５倍濃度に希釈した。２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で１倍に希釈した色素。
【0087】
方法及び手順
１日目細胞調製
・細胞を遠心分離し、新鮮な予熱した培地に再懸濁することによって、１ｍＬ当たり１×１０６細胞の細胞懸濁液を調製する。
・１９００ｍＬの細胞を振盪しながら、５０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ培地中で以下のトランスフェクション混合物を調製する。
・２．５ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬を４７．５ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに加え、５０ｍｌの空チューブに入れる。
・第２の５０ｍｌチューブに、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ中の２．５ｍｇの全ＤＮＡ（１：１：２：１：１の比のα６、β４、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１）を５０ｍｌの最終体積まで添加し、穏やかにボルテックスする。
・希釈したＤＮＡをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬に移し、直ちに溶液を穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートする。
・１００ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ／ＤＮＡトランスフェクション混合物を細胞に移し、培養物をホモジナイズする。
・８％ＣＯ２と３７℃で１時間インキュベートする。
・滅菌５００ｍＬチューブに細胞を注ぐ。
・１０００ｒｐｍで７分間遠心分離する。
・上清を除去する。
・播種培地中に細胞を再懸濁する。
１日目細胞調製
・細胞を遠心分離し、新鮮な予熱した培地に再懸濁することによって、１ｍＬ当たり１×１０６細胞の細胞懸濁液を調製する。
・１９００ｍＬの細胞を振盪しながら、５０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ培地中で以下のトランスフェクション混合物を調製する。
・２．５ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬を４７．５ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに加え、５０ｍｌの空チューブに入れる。
・第２の５０ｍｌチューブに、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ中の２．５ｍｇの全ＤＮＡ（１：１：２：１：１の比のα６、β４、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、及びＳＵＬＴ２Ｂ１）を５０ｍｌの最終体積まで添加し、穏やかにボルテックスする。
・希釈したＤＮＡをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬に移し、直ちに溶液を穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートする。
・１００ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ／ＤＮＡトランスフェクション混合物を細胞に移し、培養物をホモジナイズする。
・８％ＣＯ２と３７℃で１時間インキュベートする。
・滅菌５００ｍＬチューブに細胞を注ぐ。
・１０００ｒｐｍで７分間遠心分離する。
・上清を除去する。
・播種培地中に細胞を再懸濁する。
【0088】
２日目細胞を播種する
・除染するためのエタノールバイアル。
・細胞を５０ｍｌコニカルチューブに注ぐ。
・１０ｍｌの加温した播種培地をゆっくり滴下する。
・存在する場合、ペレットを取り除くために数回ピペットで静かに上下させる。
・１０００ＲＰＭで７分間遠心分離し、上清を吸引し、２５ｍｌのプレートに再懸濁する。
・３５μＬ中に３５，０００細胞／ウェルを播種する（１．０×１０６細胞／ｍＬ）。
・プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、プレートを５％ＣＯ２を含む３０℃の加湿雰囲気に２４～４８時間移す。
・除染するためのエタノールバイアル。
・細胞を５０ｍｌコニカルチューブに注ぐ。
・１０ｍｌの加温した播種培地をゆっくり滴下する。
・存在する場合、ペレットを取り除くために数回ピペットで静かに上下させる。
・１０００ＲＰＭで７分間遠心分離し、上清を吸引し、２５ｍｌのプレートに再懸濁する。
・３５μＬ中に３５，０００細胞／ウェルを播種する（１．０×１０６細胞／ｍＬ）。
・プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、プレートを５％ＣＯ２を含む３０℃の加湿雰囲気に２４～４８時間移す。
【0089】
３日目ＦＬＩＰＲアッセイ
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに２５μＬを残す。
・２５μＬの２倍Ｃａ６色素を各ウェルに添加する。
・室温で１時間インキュベートする。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに５０μＬを残す。
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに２５μＬを残す。
・２５μＬの２倍Ｃａ６色素を各ウェルに添加する。
・室温で１時間インキュベートする。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに５０μＬを残す。
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。
【0090】
α６β４ ｎＡＣｈＲのアゴニスト誘発活性についての濃度反応曲線
α６β４ ｎＡＣｈＲのヒトα６及びβ４サブユニットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、及びＣＨＡＴとコトランスフェクトし、３０℃で２４～４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞をＣａ５色素とともに室温で１時間インキュベートし、続いてアゴニストで３．５分間刺激した。アゴニスト誘発性カルシウム流を、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡイメージャを使用して測定し、最終ＦＬＩＰＲシグナルを平均化し、プロットした（図１）。示されるように、試験されたアゴニスト（エピバチジン、ＡＢＴ－５９４、Ａ－８５３８０、ニコチン、ＡＢＴ－８９４、バレニクリン、及びシチシン）の各々は、用量依存的様式でカルシウム流を増強する。
α６β４ ｎＡＣｈＲのヒトα６及びβ４サブユニットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、及びＣＨＡＴとコトランスフェクトし、３０℃で２４～４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞をＣａ５色素とともに室温で１時間インキュベートし、続いてアゴニストで３．５分間刺激した。アゴニスト誘発性カルシウム流を、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡイメージャを使用して測定し、最終ＦＬＩＰＲシグナルを平均化し、プロットした（図１）。示されるように、試験されたアゴニスト（エピバチジン、ＡＢＴ－５９４、Ａ－８５３８０、ニコチン、ＡＢＴ－８９４、バレニクリン、及びシチシン）の各々は、用量依存的様式でカルシウム流を増強する。
【0091】
α６β４ ｎＡＣｈＲのニコチン誘発活性に対するアンタゴニストの濃度反応曲線
α６β４ ｎＡＣｈＲのヒトα６及びβ４サブユニットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、及びＣＨＡＴとコトランスフェクトし、３０℃で２４～４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞を、Ｃａ５色素とともに室温で１時間インキュベートし、続いて２回添加プロトコールを使用して刺激した（１回目の添加：種々の濃度のメチルリカコニチン（methyllycacaconitine、ＭＬＡ）を用いて３分間、２回目の添加：ニコチンを用いて（ＥＣ８０、１５μＭ）、３．５分間）。次いで、ニコチン誘発性カルシウム流を、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡイメージャを使用して測定し、最終ＦＬＩＰＲシグナルを平均化し、プロットした（図２）。示されるように、ＭＬＡ（α６β４ ｎＡＣｈＲの既知のアゴニスト）は、用量依存様式でニコチン誘発性カルシウム流を減少させる。
α６β４ ｎＡＣｈＲのヒトα６及びβ４サブユニットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、及びＣＨＡＴとコトランスフェクトし、３０℃で２４～４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞を、Ｃａ５色素とともに室温で１時間インキュベートし、続いて２回添加プロトコールを使用して刺激した（１回目の添加：種々の濃度のメチルリカコニチン（methyllycacaconitine、ＭＬＡ）を用いて３分間、２回目の添加：ニコチンを用いて（ＥＣ８０、１５μＭ）、３．５分間）。次いで、ニコチン誘発性カルシウム流を、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡイメージャを使用して測定し、最終ＦＬＩＰＲシグナルを平均化し、プロットした（図２）。示されるように、ＭＬＡ（α６β４ ｎＡＣｈＲの既知のアゴニスト）は、用量依存様式でニコチン誘発性カルシウム流を減少させる。
【0092】
α６β４ ｎＡＣｈＲの機能発現
α６β４ ｎＡＣｈＲのヒトα６及びβ４サブユニットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡの特定の組合せでコトランスフェクトし、３０℃又は３７℃のいずれかで２４～４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞をＣａ５色素とともに室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（６６μＭ）で刺激した。トランスフェクトされたニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図３にグラフで示す。示されるように、３７℃でのインキュベーションにより、ＢＡＲＰ及びＣＨＡＴ、又はＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ及びＳＵＬＴ２Ｂ１でのコトランスフェクションは、α６β４ ｎＡＣｈＲの機能発現を増強する。３０℃でのインキュベーションにより、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、又はＳＵＬＴ２Ｂ１の両方を個々に又は組み合わせてコトランスフェクションすると、α６β４ ｎＡＣｈＲの機能的発現が増強される。
α６β４ ｎＡＣｈＲのヒトα６及びβ４サブユニットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡの特定の組合せでコトランスフェクトし、３０℃又は３７℃のいずれかで２４～４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞をＣａ５色素とともに室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（６６μＭ）で刺激した。トランスフェクトされたニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図３にグラフで示す。示されるように、３７℃でのインキュベーションにより、ＢＡＲＰ及びＣＨＡＴ、又はＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ及びＳＵＬＴ２Ｂ１でのコトランスフェクションは、α６β４ ｎＡＣｈＲの機能発現を増強する。３０℃でのインキュベーションにより、ＢＡＲＰ、ＣＨＡＴ、又はＳＵＬＴ２Ｂ１の両方を個々に又は組み合わせてコトランスフェクションすると、α６β４ ｎＡＣｈＲの機能的発現が増強される。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】