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特表2024-516160α２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体のための発現系及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-04-12
(54)【発明の名称】α２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体のための発現系及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240405BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240405BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240405BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240405BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20240405BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240405BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240405BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240405BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12N5/10 ZNA
C12N15/54
C12Q1/04
C12Q1/48 Z
C12Q1/06
C12N9/10
C07K14/47
C07K14/705
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564526
(86)(22)【出願日】2022-04-22
(85)【翻訳文提出日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 EP2022060744
(87)【国際公開番号】W WO2022223806
(87)【国際公開日】2022-10-27
(31)【優先権主張番号】63/178,813
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】397060175
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ブレット，デイビッド エス．
(72)【発明者】
【氏名】グ，シェンヤン
(72)【発明者】
【氏名】オー’キャロル，ミン レイ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ26
4B063QQ79
4B063QR06
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR77
4B063QR80
4B063QR90
4B063QS36
4B063QS38
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
α２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞及びその使用方法が本明細書に開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された組換え細胞であって、ａ）ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα５サブユニットをコードする異種核酸と、
ｂ）膜貫通内耳発現タンパク質ＴＭＩＥ及びタンパク質ＦＡＭ１６３Ｂから選択されるシャペロンタンパク質をコードする異種核酸と、
を含む、単離された組換え細胞。
【請求項2】
ｃ）ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする異種核酸と、ｄ）ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする異種核酸と、
ｅ）ジアミンアセチルトランスフェラーゼ１（ＳＡＴ１）をコードする異種核酸と、
ｆ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）をコードする異種核酸と、
を更に含み、
ｎＡＣｈＲの前記α２、α５及びβ２サブユニットはα２α５β２型ｎＡＣｈＲを形成する、請求項１に記載の単離された組換え細胞。
【請求項3】
前記組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項１又は２に記載の単離された組換え細胞。
【請求項4】
前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された組換え細胞。
【請求項5】
前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの前記α２サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項6】
前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの前記α５サブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項7】
前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの前記β２サブユニットが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項8】
前記ＴＭＩＥが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項9】
前記ＦＡＭ１６３Ｂが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項10】
前記ＳＡＴ１が、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項11】
前記ＣＨＡＴが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～１０のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項12】
α５含有ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を同定するための方法であって、ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を作用物質と接触させる工程と、
ｂ）前記単離された組換え細胞の前記α５含有ｎＡＣｈＲの活性を決定する工程と、
を含み、前記単離された組換え細胞が前記作用物質と接触されなかった場合の前記α５含有ｎＡＣｈＲの活性と比較して、前記作用物質が前記α５含有ｎＡＣｈＲの活性を増強すれば、前記作用物質はアゴニスト又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）として同定され、前記作用物質が前記α５含有ｎＡＣｈＲの活性を減少させれば、前記作用物質はアンタゴニストとして同定される、方法。
【請求項13】
α２α５β２型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を同定するための方法であって、ａ）請求項２～１１のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を作用物質と接触させる工程と、
ｂ）前記単離された組換え細胞の前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を決定する工程と、
を含み、前記単離された組換え細胞が前記作用物質と接触されなかった場合の前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、前記作用物質が前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を増強すれば、前記作用物質はアゴニスト又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）として同定され、前記作用物質が前記α２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を減少させれば、前記作用物質はアンタゴニストとして同定される、方法。
【請求項14】
工程ｂ）が前記単離された組換え細胞のカルシウム流を決定することを含み、前記単離された組換え細胞が前記作用物質と接触されなかった場合の前記カルシウム流と比較して、前記作用物質が前記カルシウム流を増強すれば、前記作用物質はアゴニストとして同定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、前記単離された組換え細胞が前記作用物質と接触されなかった場合の前記カルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流と比較して、前記作用物質がカルシウム流を増強せず、前記ニコチン誘発性カルシウム流を増強すれば、前記作用物質がＰＡＭとして同定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、前記単離された組換え細胞が前記作用物質と接触されなかった場合の前記ニコチン誘発性カルシウム流と比較して、前記作用物質が前記ニコチン誘発性カルシウム流を減少させれば、前記作用物質がアンタゴニストとして同定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記単離された組換え細胞が、前記作用物質と接触される前に、約２５℃～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記作用物質が、小分子又はペプチドである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
（ｉ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０２１年４月２３日出願の米国特許仮出願第６３／１７８，８１３号の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０２１年４月２３日出願の米国特許仮出願第６３／１７８，８１３号の利益を主張する。
【0002】
（発明の分野）
本発明は、α２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞及びその使用方法が本明細書に関する。
本発明は、α２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞及びその使用方法が本明細書に関する。
【0003】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年０２月２８日に作成され、名称はＰＲＤ４１２８ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，５７６バイトである。
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年０２月２８日に作成され、名称はＰＲＤ４１２８ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，５７６バイトである。
【0004】
（発明の背景）
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、ニコチン中毒、疼痛及び精神病性障害を含むいくつかの神経学的及び精神医学的症状に関与している（Ｇｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００４ Ｄｅｃ；７４（６）：３６３－９６）。喫煙に伴うニコチン中毒は、肺癌の主な原因である。ゲノムワイド関連解析は、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットの配列における変化（Ｄ３９８Ｎ）をコードするヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ｒｓ１６９６９９６８が、ニコチン中毒に対する感受性を増加させることを示す。α５ ｎＡＣｈＲが特に濃縮されている手綱脚間路は、ニコチン摂取を調節する重要な神経回路である。これらの理由から、α５ ｎＡＣｈＲは、有益な薬物標的として提案されてきた（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｂｅｎｕｌａｒ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ α５＊ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎｔａｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｍａｒ ３１；４７１（７３４０）：５９７－６０１；Ｍａｓｋｏｓ，Ｔｈｅ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ５ ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒｓ１６９６９９６８ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０２０：１５４－２４１－２５０）。しかしながら、α５含有ｎＡＣｈＲ（α２α５β２型ｎＡＣｈＲなど）を調節する化合物の同定は、この受容体が創薬のために通例使用される組換え細胞株中で機能的に発現されないので、不可能であった。
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、ニコチン中毒、疼痛及び精神病性障害を含むいくつかの神経学的及び精神医学的症状に関与している（Ｇｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００４ Ｄｅｃ；７４（６）：３６３－９６）。喫煙に伴うニコチン中毒は、肺癌の主な原因である。ゲノムワイド関連解析は、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットの配列における変化（Ｄ３９８Ｎ）をコードするヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ｒｓ１６９６９９６８が、ニコチン中毒に対する感受性を増加させることを示す。α５ ｎＡＣｈＲが特に濃縮されている手綱脚間路は、ニコチン摂取を調節する重要な神経回路である。これらの理由から、α５ ｎＡＣｈＲは、有益な薬物標的として提案されてきた（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｂｅｎｕｌａｒ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ α５＊ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎｔａｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｍａｒ ３１；４７１（７３４０）：５９７－６０１；Ｍａｓｋｏｓ，Ｔｈｅ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ５ ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒｓ１６９６９９６８ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０２０：１５４－２４１－２５０）。しかしながら、α５含有ｎＡＣｈＲ（α２α５β２型ｎＡＣｈＲなど）を調節する化合物の同定は、この受容体が創薬のために通例使用される組換え細胞株中で機能的に発現されないので、不可能であった。
【0005】
ｎＡＣｈＲのα５サブユニットを強固に発現し、創薬のために使用することができる細胞株を開発する必要性が依然として存在する。
【0006】
（発明の簡単な概要）
ａ）ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα５サブユニットをコードする異種核酸をコードする異種核酸と、ｂ）膜貫通内耳発現タンパク質ＴＭＩＥ及びタンパク質ＦＡＭ１６３Ｂから選択されるシャペロンタンパク質をコードする異種核酸と、を含む単離された組換え細胞が本明細書において提供される。
ａ）ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα５サブユニットをコードする異種核酸をコードする異種核酸と、ｂ）膜貫通内耳発現タンパク質ＴＭＩＥ及びタンパク質ＦＡＭ１６３Ｂから選択されるシャペロンタンパク質をコードする異種核酸と、を含む単離された組換え細胞が本明細書において提供される。
【0007】
上で提供される単離された組換え細胞の一実施形態において、細胞は、ｃ）ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする異種核酸と、ｄ）ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする異種核酸と、ｅ）ジアミンアセチルトランスフェラーゼ１（ＳＡＴ１）をコードする異種核酸と、ｆ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）をコードする異種核酸と、を更に含み、ｎＡＣｈＲのα２、α５及びβ２サブユニットはα２α５β２型ｎＡＣｈＲを形成する。
【0008】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、組換え細胞は哺乳動物細胞である。
【0009】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（human embryonic kidney 293T、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎臓（baby hamster kidney、ＢＨＫ）細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される。
【0010】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0011】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα５サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0012】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、ＴＭＩＥは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0014】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、ＦＡＭ１６３Ｂは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0015】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、ＳＡＴ１は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0016】
単離された組換え細胞の更なる実施形態において、ＣＨＡＴは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0017】
α５含有ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト又は正のアロステリック調節因子を同定するための方法であって、ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を作用物質と接触させる工程と、ｂ）単離された組換え細胞のα５含有ｎＡＣｈＲの活性を決定する工程と、を含み、単離された組換え細胞が作用物質と接触されなかった場合のα５含有ｎＡＣｈＲの活性と比較して、作用物質がα５含有ｎＡＣｈＲの活性を増強すれば、作用物質はアゴニスト又は正のアロステリック調節因子（positive allosteric modulator、ＰＡＭ）として同定され、作用物質がα５含有ｎＡＣｈＲの活性を減少させれば、作用物質はアンタゴニストとして同定される、方法、が本明細書において更に提供される。
【0018】
α２α５β２型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト又は正のアロステリック調節因子を同定するための方法であって、ａ）請求項２～１１のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を作用物質と接触させる工程と、ｂ）単離された組換え細胞のα２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を決定する工程と、を含み、単離された組換え細胞が作用物質と接触されなかった場合のα２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、作用物質がα２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を増強すれば、作用物質はアゴニスト又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）として同定され、作用物質がα２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を減少させれば、作用物質はアンタゴニストとして同定される、方法、が本明細書において更に提供される。
【0019】
この方法の一実施形態において、工程ｂ）は単離された組換え細胞のカルシウム流を決定することを含み、単離された組換え細胞が作用物質と接触されなかった場合のカルシウム流と比較して、作用物質がカルシウム流を増強すれば、作用物質はアゴニストとして同定される。
【0020】
この方法の更なる実施形態において、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、単離された組換え細胞が作用物質と接触されなかった場合のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流と比較して、作用物質がカルシウム流を増強せず、ニコチン誘発性カルシウム流を増強すれば、作用物質はＰＡＭとして同定される。
【0021】
この方法のなお更なる実施形態において、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、単離された組換え細胞が作用物質と接触されなかった場合のニコチン誘発性カルシウム流と比較して、作用物質がニコチン誘発性カルシウム流を減少させれば、作用物質はアンタゴニストとして同定される。
【0022】
この方法のなお更なる実施形態において、単離された組換え細胞は、作用物質と接触される前に、約２５℃～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる。
【0023】
この方法のなお更なる実施形態において、作用物質は、小分子又はペプチドである。
【0024】
（ｉ）上で提供される単離された組換え細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットが本明細書において更に提供される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】異なるシャペロンタンパク質と同時発現された場合のα２β２型ｎＡＣｈＲ及びα２α５β２型ｎＡＣｈＲの機能的発現を示すグラフである。
【図2】異なるシャペロンタンパク質と同時発現された場合のα２β２型ｎＡＣｈＲ及びα２α５β２型ｎＡＣｈＲのニコチン誘発性活性化についての濃度応答曲線である。
【0026】
（発明の詳細な記述）
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0027】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
【0028】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0029】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、通常、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【0030】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0031】
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが暗示されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって満たされる。
【0032】
本明細書に使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１の要素及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、意味の範疇に含まれ、したがって、本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味の範疇に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
【0033】
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」、又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されないことを示す。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる（consists essentially of）」、又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体を通じて使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造又は組成物の基本的な又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２ １１１．０３を参照されたい。
【0035】
好ましい本発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最下位桁は変化しない変形形態を含む。
【0036】
２つ若しくは３つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「同一である」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、
一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ若しくは３つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ若しくは３つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0037】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
【0038】
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（high scoring sequence pair、ＨＳＰ）を同定することを含む。上記のＴは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
【0039】
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ又は複数の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝３、期待値（Ｅ）＝１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい）。
【0040】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
【0041】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１核酸によりコードされるポリペプチドが、第２核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【0042】
本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ若しくは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。
【0043】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲートを包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
【0044】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0045】
単離された組換え細胞及び組換え細胞を作製する方法
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的には、細胞中である種のシャペロンタンパク質をα５含有ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）（α２α５β２型ｎＡＣｈＲなど）と同時発現させることにより、α５含有ｎＡＣｈＲを高度に発現する細胞が生成され、細胞を創薬に有用なものとしたという予想外の知見に基づく。ｎＡＣｈＲのα５サブユニットを発現する組換え細胞及びｎＡＣｈＲのα５サブユニットの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法が本明細書において提供される。α２α５β２型ｎＡＣｈＲを発現する組換え細胞及びα２α５β２型ｎＡＣｈＲの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法も本明細書において提供される。
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的には、細胞中である種のシャペロンタンパク質をα５含有ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）（α２α５β２型ｎＡＣｈＲなど）と同時発現させることにより、α５含有ｎＡＣｈＲを高度に発現する細胞が生成され、細胞を創薬に有用なものとしたという予想外の知見に基づく。ｎＡＣｈＲのα５サブユニットを発現する組換え細胞及びｎＡＣｈＲのα５サブユニットの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法が本明細書において提供される。α２α５β２型ｎＡＣｈＲを発現する組換え細胞及びα２α５β２型ｎＡＣｈＲの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法も本明細書において提供される。
【0046】
本明細書で使用される場合、「α２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体」、「α２α５β２型ｎＡＣｈＲ」、「アルファ２アルファ５ベータ２型ニコチン性アセチルコリン受容体」及び「アルファ２アルファ５ベータ２型ｎＡＣｈＲ」という用語は、互換的に使用され、コリン作動性受容体のタンパク質ファミリーのメンバーであるα２α５β２型ニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質、好ましくはヒトα２α５β２型ｎＡＣｈＲを指す。
【0047】
α２α５β２型ｎＡＣｈＲは、α２、α５及びβ２サブユニットから構成されるリガンド開口型イオンチャネルである。α２サブユニットは遺伝子ＣＨＲＮＡ２（ＮＭ＿０００７４２）によってコードされ、α５サブユニットは遺伝子ＣＨＲＮＡ５（ＮＭ＿０００７４５）によってコードされ、β２サブユニットは遺伝子ＣＨＲＮＢ２（ＮＭ＿０００７４８）によってコードされる。一緒に発現されると、サブユニットは会合してα２α５β２型ｎＡＣｈＲを形成し、α２α５β２型ｎＡＣｈＲはニワトリでは視葉に、哺乳動物では手綱脚間系に特に濃縮されている（例えば、Ｂａｌｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｃｋ Ｏｐｔｉｃ Ｌｏｂｅ Ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ α２α５β２ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｅ，ＭＯＬ ５８：３００－３１１，２０００／１／８４１７８７ ａｎｄ Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ，“Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈａｂｅｎｕｌｏ－Ｉｎｔｅｒｐｅｄｕｎｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｒｅ Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｉｎ Ｍｉｃｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：３０１４－１８，２００９を参照されたい）。
【0048】
「組換え細胞」とは、１つ又は複数の個々の細胞及び細胞が（１つ又は複数の）タンパク質を異種性に発現している組換え細胞株を指す。本明細書中で使用される場合、細胞におけるタンパク質の「異種発現」とは、外因性核酸、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする外因性核酸を細胞に導入することによって、タンパク質を発現するように細胞を改変することを指す。「異種核酸」は、細胞内に導入される、細胞にとって外因性の核酸を指す。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＲＮＡである。細胞におけるタンパク質の異種発現は、種々の方法を使用して達成されることができる。例えば、タンパク質の発現を駆動することができるプロモーター（例えば、構成的プロモーター）をコードする核酸に機能的に連結されているタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入してもよい。
【0049】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に包含する。
【0050】
一般的な局面において、本発明は、創薬に有用なα５含有ｎＡＣｈＲ（α２α５β２型ｎＡＣｈＲなど）を発現する細胞を作製又は生成する方法に関する。一実施形態において、本方法は、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸と、膜貫通内耳発現タンパク質ＴＭＩＥ及びタンパク質ＦＡＭ１６３Ｂから選択されるシャペロンタンパク質をコードする核酸とを細胞に導入することを含む。ｎＡＣｈＲのα５サブユニット及びシャペロンタンパク質（すなわち、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂ）をコードする（１つ又は複数の）核酸は、発現ベクター中（例えば、単一の発現ベクター中又は別々の発現ベクター中）に存在することができる。いくつかの実施形態において、ｎＡＣｈＲのα５サブユニット及びシャペロンタンパク質（すなわち、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂ）をコードする核酸は、それぞれのタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの他の実施形態において、ｎＡＣｈＲのα５サブユニット及びシャペロンタンパク質（すなわち、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂ）をコードする核酸の各々は、それぞれのタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。
【0051】
一態様において、本発明は、創薬に有用なα２α５β２型ｎＡＣｈＲを発現する細胞を作製又は生成する方法に関する。一実施形態において、本方法は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする核酸、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする核酸、ジアミンアセチルトランスフェラーゼ１（ＳＡＴ１）をコードする核酸、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）をコードする核酸、並びにＴＭＩＥをコードする核酸及びＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸の一方又は両方を細胞に導入することを含む。α２、α５及びβ２サブユニットα２α５β２型ｎＡＣｈＲ、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ並びにＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂから選択される１つをコードする（１つ又は複数の）核酸は、発現ベクター中（例えば、単一の発現ベクター中又は別々の発現ベクター中）に存在することができる。いくつかの実施形態において、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２、α５及びβ２サブユニット、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、並びにＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂの一方又は両方をコードする核酸は、それぞれのタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの他の実施形態において、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２、α５及びβ２サブユニット、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、並びにＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂの一方又は両方をコードする核酸の各々は、それぞれのタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。
【0052】
別の局面において、本方法は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする核酸、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする核酸、ＳＡＴ１をコードする核酸、ＣＨＡＴをコードする核酸、並びにＴＭＩＥをコードする核酸及びＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸の一方又は両方を細胞に導入することを含み、本方法によって生成された細胞は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２、α５、β２サブユニットをコードする核酸、及びＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸なしの同じ細胞と比較して、α２α５β２型ｎＡＣｈＲを増加したレベルで発現する。
【0053】
別の態様において、本発明は、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂを発現するように遺伝子改変された細胞であって、遺伝子改変された細胞は、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非改変細胞における同じタンパク質の発現と比較して増加したレベルで少なくとも１つのタンパク質を発現する、遺伝子改変された細胞に関する。一実施形態において、細胞は、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、並びにＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂから選択される一方又は両方を発現するように遺伝子改変されており、遺伝子改変された細胞は、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非改変細胞における、それぞれＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、並びにＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂから選択される一方又は両方の発現と比較して増加したレベルで、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、並びにＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂから選択される一方又は両方を発現する。
【0054】
別の局面において、本発明は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２、α５及びβ２サブユニット、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、並びにＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂを発現するように遺伝子改変された細胞であって、遺伝子改変された細胞は、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非改変細胞における同じタンパク質の発現と比較して増加したレベルでこれらのタンパク質タンパク質を発現する、遺伝子改変された細胞に関する。一実施形態において、細胞は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのα２、α５及びβ２サブユニット、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、ＴＭＩＥ、ＦＡＭ１６３Ｂを発現するように遺伝子改変されており、遺伝子改変された細胞は、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非改変細胞における同じタンパク質の発現と比較して増加したレベルでこれらのタンパク質タンパク質を発現する。
【0055】
別の局面において、本発明は、ＳＡＴ１をコードする核酸配列を含む発現ベクターと、ＣＨＡＴをコードする核酸配列を含む発現ベクターと、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸配列を含む発現ベクターと、からなる群から選択される少なくとも１つの発現ベクターを含む単離された組換え細胞に関する。一実施形態において、本発明は、ＳＡＴ１をコードする核酸配列を含む発現ベクターと、ＣＨＡＴをコードする核酸配列を含む発現ベクターと、ＴＭＩＥをコードする核酸配列を含む発現ベクターと、ＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸配列を含む発現ベクターと、からなる群から選択される少なくとも１つの発現ベクターを含む単離された組換え細胞に関する。
【0056】
一局面において、本発明は、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする異種核酸と、膜貫通内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）及びタンパク質ＦＡＭ１６３Ｂから選択されるシャペロンタンパク質をコードする異種核酸とを含む単離された組換え細胞に関する。一実施形態において、異種核酸は、発現ベクターの形態で組換え細胞に導入される。一実施形態において、本明細書に開示される単離された組換え細胞は、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂから選択されるシャペロンタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターとを含む。一実施形態において、本明細書に開示される単離された組換え細胞は、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＴＭＩＥをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸を含む発現ベクターとを含む。
【0057】
更なる局面において、本発明は、ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする異種核酸と、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする異種核酸と、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする異種核酸と、ジアミンアセチルトランスフェラーゼ１（ＳＡＴ１）をコードする異種核酸と、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）をコードする異種核酸と、ＴＭＩＥ及び／又はＦＡＭ１６３Ｂをコードする異種核酸とを含む単離された組換え細胞であって、α２、α５及びβ２サブユニットは、α２α５β２型ｎＡＣｈＲを形成する、単離された組換え細胞に関する。一実施形態において、異種核酸は、発現ベクターの形態で組換え細胞に導入される。一実施形態において、本明細書に開示される単離された組換え細胞は、ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＳＡＴ１をコードする核酸を含む発現ベクターと、ＣＨＡＴをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸を含む発現ベクターとを含む。一実施形態において、本明細書に開示される単離された組換え細胞は、ｎＡＣｈＲのα２サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＳＡＴ１をコードする核酸を含む発現ベクターと、ＣＨＡＴをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＴＭＩＥをコードする核酸を含む発現ベクターと、ＦＡＭ１６３Ｂをコードする核酸を含む発現ベクターとを含む。
【0058】
本明細書に記載される実施形態の任意の１つにおいて、α２、α５及びβ２サブユニットｎＡＣｈＲ、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、ＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂの任意の１つ又は複数をコードする核酸は、単一の発現ベクター中に又は別個の発現ベクター中に存在することができる。
【0059】
一実施形態において、ｎＡＣｈＲのα２サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0060】
配列番号１：
ＭＧＰＳＣＰＶＦＬＳＦＴＫＬＳＬＷＷＬＬＬＴＰＡＧＧＥＥＡＫＲＰＰＰＲＡＰＧＤＰＬＳＳＰＳＰＴＡＬＰＱＧＧＳＨＴＥＴＥＤＲＬＦＫＨＬＦＲＧＹＮＲＷＡＲＰＶＰＮＴＳＤＶＶＩＶＲＦＧＬＳＩＡＱＬＩＤＶＤＥＫＮＱＭＭＴＴＮＶＷＬＫＱＥＷＳＤＹＫＬＲＷＮＰＴＤＦＧＮＩＴＳＬＲＶＰＳＥＭＩＷＩＰＤＩＶＬＹＮＮＡＤＧＥＦＡＶＴＨＭＴＫＡＨＬＦＳＴＧＴＶＨＷＶＰＰＡＩＹＫＳＳＣＳＩＤＶＴＦＦＰＦＤＱＱＮＣＫＭＫＦＧＳＷＴＹＤＫＡＫＩＤＬＥＱＭＥＱＴＶＤＬＫＤＹＷＥＳＧＥＷＡＩＶＮＡＴＧＴＹＮＳＫＫＹＤＣＣＡＥＩＹＰＤＶＴＹＡＦＶＩＲＲＬＰＬＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＬＬＩＳＣＬＴＶＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＩＴＬＣＩＳＶＬＬＳＬＴＶＦＬＬＬＩＴＥＩＩＰＳＴＳＬＶＩＰＬＩＧＥＹＬＬＦＴＭＩＦＶＴＬＳＩＶＩＴＶＦＶＬＮＶＨＨＲＳＰＳＴＨＴＭＰＨＷＶＲＧＡＬＬＧＣＶＰＲＷＬＬＭＮＲＰＰＰＰＶＥＬＣＨＰＬＲＬＫＬＳＰＳＹＨＷＬＥＳＮＶＤＡＥＥＲＥＶＶＶＥＥＥＤＲＷＡＣＡＧＨＶＡＰＳＶＧＴＬＣＳＨＧＨＬＨＳＧＡＳＧＰＫＡＥＡＬＬＱＥＧＥＬＬＬＳＰＨＭＱＫＡＬＥＧＶＨＹＩＡＤＨＬＲＳＥＤＡＤＳＳＶＫＥＤＷＫＹＶＡＭＶＩＤＲＩＦＬＷＬＦＩＩＶＣＦＬＧＴＩＧＬＦＬＰＰＦＬＡＧＭＩ
ＭＧＰＳＣＰＶＦＬＳＦＴＫＬＳＬＷＷＬＬＬＴＰＡＧＧＥＥＡＫＲＰＰＰＲＡＰＧＤＰＬＳＳＰＳＰＴＡＬＰＱＧＧＳＨＴＥＴＥＤＲＬＦＫＨＬＦＲＧＹＮＲＷＡＲＰＶＰＮＴＳＤＶＶＩＶＲＦＧＬＳＩＡＱＬＩＤＶＤＥＫＮＱＭＭＴＴＮＶＷＬＫＱＥＷＳＤＹＫＬＲＷＮＰＴＤＦＧＮＩＴＳＬＲＶＰＳＥＭＩＷＩＰＤＩＶＬＹＮＮＡＤＧＥＦＡＶＴＨＭＴＫＡＨＬＦＳＴＧＴＶＨＷＶＰＰＡＩＹＫＳＳＣＳＩＤＶＴＦＦＰＦＤＱＱＮＣＫＭＫＦＧＳＷＴＹＤＫＡＫＩＤＬＥＱＭＥＱＴＶＤＬＫＤＹＷＥＳＧＥＷＡＩＶＮＡＴＧＴＹＮＳＫＫＹＤＣＣＡＥＩＹＰＤＶＴＹＡＦＶＩＲＲＬＰＬＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＬＬＩＳＣＬＴＶＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＩＴＬＣＩＳＶＬＬＳＬＴＶＦＬＬＬＩＴＥＩＩＰＳＴＳＬＶＩＰＬＩＧＥＹＬＬＦＴＭＩＦＶＴＬＳＩＶＩＴＶＦＶＬＮＶＨＨＲＳＰＳＴＨＴＭＰＨＷＶＲＧＡＬＬＧＣＶＰＲＷＬＬＭＮＲＰＰＰＰＶＥＬＣＨＰＬＲＬＫＬＳＰＳＹＨＷＬＥＳＮＶＤＡＥＥＲＥＶＶＶＥＥＥＤＲＷＡＣＡＧＨＶＡＰＳＶＧＴＬＣＳＨＧＨＬＨＳＧＡＳＧＰＫＡＥＡＬＬＱＥＧＥＬＬＬＳＰＨＭＱＫＡＬＥＧＶＨＹＩＡＤＨＬＲＳＥＤＡＤＳＳＶＫＥＤＷＫＹＶＡＭＶＩＤＲＩＦＬＷＬＦＩＩＶＣＦＬＧＴＩＧＬＦＬＰＰＦＬＡＧＭＩ
【0061】
一実施形態において、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0062】
配列番号２
ＭＡＡＲＧＳＧＰＲＡＬＲＬＬＬＬＶＱＬＶＡＧＲＣＧＬＡＧＡＡＧＧＡＱＲＧＬＳＥＰＳＳＩＡＫＨＥＤＳＬＬＫＤＬＦＱＤＹＥＲＷＶＲＰＶＥＨＬＮＤＫＩＫＩＫＦＧＬＡＩＳＱＬＶＤＶＤＥＫＮＱＬＭＴＴＮＶＷＬＫＱＥＷＩＤＶＫＬＲＷＮＰＤＤＹＧＧＩＫＶＩＲＶＰＳＤＳＶＷＴＰＤＩＶＬＦＤＮＡＤＧＲＦＥＧＴＳＴＫＴＶＩＲＹＮＧＴＶＴＷＴＰＰＡＮＹＫＳＳＣＴＩＤＶＴＦＦＰＦＤＬＱＮＣＳＭＫＦＧＳＷＴＹＤＧＳＱＶＤＩＩＬＥＤＱＤＶＤＫＲＤＦＦＤＮＧＥＷＥＩＶＳＡＴＧＳＫＧＮＲＴＤＳＣＣＷＹＰＹＶＴＹＳＦＶＩＫＲＬＰＬＦＹＴＬＦＬＩＩＰＣＩＧＬＳＦＬＴＶＬＶＦＹＬＰＳＮＥＧＥＫＩＣＬＣＴＳＶＬＶＳＬＴＶＦＬＬＶＩＥＥＩＩＰＳＳＳＫＶＩＰＬＩＧＥＹＬＶＦＴＭＩＦＶＴＬＳＩＭＶＴＶＦＡＩＮＩＨＨＲＳＳＳＴＨＮＡＭＡＰＬＶＲＫＩＦＬＨＴＬＰＫＬＬＣＭＲＳＨＶＤＲＹＦＴＱＫＥＥＴＥＳＧＳＧＰＫＳＳＲＮＴＬＥＡＡＬＤＳＩＲＹＩＴＲＨＩＭＫＥＮＤＶＲＥＶＶＥＤＷＫＦＩＡＱＶＬＤＲＭＦＬＷＴＦＬＦＶＳＩＶＧＳＬＧＬＦＶＰＶＩＹＫＷＡＮＩＬＩＰＶＨＩＧＮＡＮＫ
ＭＡＡＲＧＳＧＰＲＡＬＲＬＬＬＬＶＱＬＶＡＧＲＣＧＬＡＧＡＡＧＧＡＱＲＧＬＳＥＰＳＳＩＡＫＨＥＤＳＬＬＫＤＬＦＱＤＹＥＲＷＶＲＰＶＥＨＬＮＤＫＩＫＩＫＦＧＬＡＩＳＱＬＶＤＶＤＥＫＮＱＬＭＴＴＮＶＷＬＫＱＥＷＩＤＶＫＬＲＷＮＰＤＤＹＧＧＩＫＶＩＲＶＰＳＤＳＶＷＴＰＤＩＶＬＦＤＮＡＤＧＲＦＥＧＴＳＴＫＴＶＩＲＹＮＧＴＶＴＷＴＰＰＡＮＹＫＳＳＣＴＩＤＶＴＦＦＰＦＤＬＱＮＣＳＭＫＦＧＳＷＴＹＤＧＳＱＶＤＩＩＬＥＤＱＤＶＤＫＲＤＦＦＤＮＧＥＷＥＩＶＳＡＴＧＳＫＧＮＲＴＤＳＣＣＷＹＰＹＶＴＹＳＦＶＩＫＲＬＰＬＦＹＴＬＦＬＩＩＰＣＩＧＬＳＦＬＴＶＬＶＦＹＬＰＳＮＥＧＥＫＩＣＬＣＴＳＶＬＶＳＬＴＶＦＬＬＶＩＥＥＩＩＰＳＳＳＫＶＩＰＬＩＧＥＹＬＶＦＴＭＩＦＶＴＬＳＩＭＶＴＶＦＡＩＮＩＨＨＲＳＳＳＴＨＮＡＭＡＰＬＶＲＫＩＦＬＨＴＬＰＫＬＬＣＭＲＳＨＶＤＲＹＦＴＱＫＥＥＴＥＳＧＳＧＰＫＳＳＲＮＴＬＥＡＡＬＤＳＩＲＹＩＴＲＨＩＭＫＥＮＤＶＲＥＶＶＥＤＷＫＦＩＡＱＶＬＤＲＭＦＬＷＴＦＬＦＶＳＩＶＧＳＬＧＬＦＶＰＶＩＹＫＷＡＮＩＬＩＰＶＨＩＧＮＡＮＫ
【0063】
一実施形態において、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0064】
配列番号３
ＭＡＲＲＣＧＰＶＡＬＬＬＧＦＧＬＬＲＬＣＳＧＶＷＧＴＤＴＥＥＲＬＶＥＨＬＬＤＰＳＲＹＮＫＬＩＲＰＡＴＮＧＳＥＬＶＴＶＱＬＭＶＳＬＡＱＬＩＳＶＨＥＲＥＱＩＭＴＴＮＶＷＬＴＱＥＷＥＤＹＲＬＴＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨＩＷＬＰＤＶＶＬＹＮＮＡＤＧＭＹＥＶＳＦＹＳＮＡＶＶＳＹＤＧＳＩＦＷＬＰＰＡＩＹＫＳＡＣＫＩＥＶＫＨＦＰＦＤＱＱＮＣＴＭＫＦＲＳＷＴＹＤＲＴＥＩＤＬＶＬＫＳＥＶＡＳＬＤＤＦＴＰＳＧＥＷＤＩＶＡＬＰＧＲＲＮＥＮＰＤＤＳＴＹＶＤＩＴＹＤＦＩＩＲＲＫＰＬＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＶＬＩＴＳＬＡＩＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＭＴＬＣＩＳＶＬＬＡＬＴＶＦＬＬＬＩＳＫＩＶＰＰＴＳＬＤＶＰＬＶＧＫＹＬＭＦＴＭＶＬＶＴＦＳＩＶＴＳＶＣＶＬＮＶＨＨＲＳＰＴＴＨＴＭＡＰＷＶＫＶＶＦＬＥＫＬＰＡＬＬＦＭＱＱＰＲＨＨＣＡＲＱＲＬＲＬＲＲＲＱＲＥＲＥＧＡＧＡＬＦＦＲＥＡＰＧＡＤＳＣＴＣＦＶＮＲＡＳＶＱＧＬＡＧＡＦＧＡＥＰＡＰＶＡＧＰＧＲＳＧＥＰＣＧＣＧＬＲＥＡＶＤＧＶＲＦＩＡＤＨＭＲＳＥＤＤＤＱＳＶＳＥＤＷＫＹＶＡＭＶＩＤＲＬＦＬＷＩＦＶＦＶＣＶＦＧＴＩＧＭＦＬＱＰＬＦＱＮＹＴＴＴＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ
ＭＡＲＲＣＧＰＶＡＬＬＬＧＦＧＬＬＲＬＣＳＧＶＷＧＴＤＴＥＥＲＬＶＥＨＬＬＤＰＳＲＹＮＫＬＩＲＰＡＴＮＧＳＥＬＶＴＶＱＬＭＶＳＬＡＱＬＩＳＶＨＥＲＥＱＩＭＴＴＮＶＷＬＴＱＥＷＥＤＹＲＬＴＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨＩＷＬＰＤＶＶＬＹＮＮＡＤＧＭＹＥＶＳＦＹＳＮＡＶＶＳＹＤＧＳＩＦＷＬＰＰＡＩＹＫＳＡＣＫＩＥＶＫＨＦＰＦＤＱＱＮＣＴＭＫＦＲＳＷＴＹＤＲＴＥＩＤＬＶＬＫＳＥＶＡＳＬＤＤＦＴＰＳＧＥＷＤＩＶＡＬＰＧＲＲＮＥＮＰＤＤＳＴＹＶＤＩＴＹＤＦＩＩＲＲＫＰＬＦＹＴＩＮＬＩＩＰＣＶＬＩＴＳＬＡＩＬＶＦＹＬＰＳＤＣＧＥＫＭＴＬＣＩＳＶＬＬＡＬＴＶＦＬＬＬＩＳＫＩＶＰＰＴＳＬＤＶＰＬＶＧＫＹＬＭＦＴＭＶＬＶＴＦＳＩＶＴＳＶＣＶＬＮＶＨＨＲＳＰＴＴＨＴＭＡＰＷＶＫＶＶＦＬＥＫＬＰＡＬＬＦＭＱＱＰＲＨＨＣＡＲＱＲＬＲＬＲＲＲＱＲＥＲＥＧＡＧＡＬＦＦＲＥＡＰＧＡＤＳＣＴＣＦＶＮＲＡＳＶＱＧＬＡＧＡＦＧＡＥＰＡＰＶＡＧＰＧＲＳＧＥＰＣＧＣＧＬＲＥＡＶＤＧＶＲＦＩＡＤＨＭＲＳＥＤＤＤＱＳＶＳＥＤＷＫＹＶＡＭＶＩＤＲＬＦＬＷＩＦＶＦＶＣＶＦＧＴＩＧＭＦＬＱＰＬＦＱＮＹＴＴＴＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ
【0065】
一実施形態において、ＴＭＩＥは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、ＴＭＩＥは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットの発現を増強するという特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0066】
配列番号４
ＭＡＧＷＰＧＡＧＰＬＣＶＬＧＧＡＡＬＧＶＣＬＡＧＶＡＧＱＬＶＥＰＳＴＡＰＰＫＰＫＰＰＰＬＴＫＥＴＶＶＦＷＤＭＲＬＷＨＶＶＧＩＦＳＬＦＶＬＳＩＩＩＴＬＣＣＶＦＮＣＲＶＰＲＴＲＫＥＩＥＡＲＹＬＱＲＫＡＡＫＭＹＴＤＫＬＥＴＶＰＰＬＮＥＬＴＥＶＰＧＥＤＫＫＫＫＫＫＫＫＫＤＳＶＤＴＶＡＩＫＶＥＥＤＥＫＮＥＡＫＫＫＫＧＥＫ
ＭＡＧＷＰＧＡＧＰＬＣＶＬＧＧＡＡＬＧＶＣＬＡＧＶＡＧＱＬＶＥＰＳＴＡＰＰＫＰＫＰＰＰＬＴＫＥＴＶＶＦＷＤＭＲＬＷＨＶＶＧＩＦＳＬＦＶＬＳＩＩＩＴＬＣＣＶＦＮＣＲＶＰＲＴＲＫＥＩＥＡＲＹＬＱＲＫＡＡＫＭＹＴＤＫＬＥＴＶＰＰＬＮＥＬＴＥＶＰＧＥＤＫＫＫＫＫＫＫＫＫＤＳＶＤＴＶＡＩＫＶＥＥＤＥＫＮＥＡＫＫＫＫＧＥＫ
【0067】
一実施形態において、ＦＡＭ１６３Ｂは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、ＦＡＭ１６３Ｂは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα５サブユニットの発現を増強するという特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0068】
配列番号５
ＭＴＡＧＴＶＶＩＴＧＧＩＬＡＴＶＩＬＬＣＩＩＡＶＬＣＹＣＲＬＱＹＹＣＣＫＫＤＥＳＥＥＤＥＥＥＰＤＦＡＶＨＳＨＬＰＰＬＨＳＮＲＮＬＶＬＴＮＧＰＡＬＹＰＴＡＳＴＳＦＳＱＫＳＰＱＡＲＡＬＣＲＳＣＳＨＣＥＰＰＴＦＦＬＱＥＰＰＥＥＥＥＤＶＬＮＧＧＥＲＶＬＹＫＳＶＳＱＥＤＶＥＬＰＰＧＧＦＧＧＬＱＡＬＮＰＮＲＬＳＡＭＲＥＡＦＡＲＳＲＳＩＳＴＤＶ
ＭＴＡＧＴＶＶＩＴＧＧＩＬＡＴＶＩＬＬＣＩＩＡＶＬＣＹＣＲＬＱＹＹＣＣＫＫＤＥＳＥＥＤＥＥＥＰＤＦＡＶＨＳＨＬＰＰＬＨＳＮＲＮＬＶＬＴＮＧＰＡＬＹＰＴＡＳＴＳＦＳＱＫＳＰＱＡＲＡＬＣＲＳＣＳＨＣＥＰＰＴＦＦＬＱＥＰＰＥＥＥＥＤＶＬＮＧＧＥＲＶＬＹＫＳＶＳＱＥＤＶＥＬＰＰＧＧＦＧＧＬＱＡＬＮＰＮＲＬＳＡＭＲＥＡＦＡＲＳＲＳＩＳＴＤＶ
【0069】
一実施形態において、ＳＡＴ１は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、ＳＡＴ１は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα２及びβ２サブユニットの発現を増強するという特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0070】
配列番号６
ＭＡＫＦＶＩＲＰＡＴＡＡＤＣＳＤＩＬＲＬＩＫＥＬＡＫＹＥＹＭＥＥＱＶＩＬＴＥＫＤＬＬＥＤＧＦＧＥＨＰＦＹＨＣＬＶＡＥＶＰＫＥＨＷＴＰＥＧＨＳＩＶＧＦＡＭＹＹＦＴＹＤＰＷＩＧＫＬＬＹＬＥＤＦＦＶＭＳＤＹＲＧＦＧＩＧＳＥＩＬＫＮＬＳＱＶＡＭＲＣＲＣＳＳＭＨＦＬＶＡＥＷＮＥＰＳＩＮＦＹＫＲＲＧＡＳＤＬＳＳＥＥＧＷＲＬＦＫＩＤＫＥＹＬＬＫＭＡＴＥＥ
ＭＡＫＦＶＩＲＰＡＴＡＡＤＣＳＤＩＬＲＬＩＫＥＬＡＫＹＥＹＭＥＥＱＶＩＬＴＥＫＤＬＬＥＤＧＦＧＥＨＰＦＹＨＣＬＶＡＥＶＰＫＥＨＷＴＰＥＧＨＳＩＶＧＦＡＭＹＹＦＴＹＤＰＷＩＧＫＬＬＹＬＥＤＦＦＶＭＳＤＹＲＧＦＧＩＧＳＥＩＬＫＮＬＳＱＶＡＭＲＣＲＣＳＳＭＨＦＬＶＡＥＷＮＥＰＳＩＮＦＹＫＲＲＧＡＳＤＬＳＳＥＥＧＷＲＬＦＫＩＤＫＥＹＬＬＫＭＡＴＥＥ
【0071】
一実施形態において、ＣＨＡＴは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、ＣＨＡＴは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα２及びβ２サブユニットの発現を増強するという特性を含むタンパク質シャペロン特性を有する。
【0072】
配列番号７
ＭＡＡＫＴＰＳＳＥＥＳＧＬＰＫＬＰＶＰＰＬＱＱＴＬＡＴＹＬＱＣＭＲＨＬＶＳＥＥＱＦＲＫＳＱＡＩＶＱＱＦＧＡＰＧＧＬＧＥＴＬＱＱＫＬＬＥＲＱＥＫＴＡＮＷＶＳＥＹＷＬＮＤＭＹＬＮＮＲＬＡＬＰＶＮＳＳＰＡＶＩＦＡＲＱＨＦＰＧＴＤＤＱＬＲＦＡＡＳＬＩＳＧＶＬＳＹＫＡＬＬＤＳＨＳＩＰＴＤＣＡＫＧＱＬＳＧＱＰＬＣＭＫＱＹＹＧＬＦＳＳＹＲＬＰＧＨＴＱＤＴＬＶＡＱＮＳＳＩＭＰＥＰＥＨＶＩＶＡＣＣＮＱＦＦＶＬＤＶＶＩＮＦＲＲＬＳＥＧＤＬＦＴＱＬＲＫＩＶＫＭＡＳＮＥＤＥＲＬＰＰＩＧＬＬＴＳＤＧＲＳＥＷＡＥＡＲＴＶＬＶＫＤＳＴＮＲＤＳＬＤＭＩＥＲＣＩＣＬＶＣＬＤＡＰＧＧＶＥＬＳＤＴＨＲＡＬＱＬＬＨＧＧＧＹＳＫＮＧＡＮＲＷＹＤＫＳＬＱＦＶＶＧＲＤＧＴＣＧＶＶＣＥＨＳＰＦＤＧＩＶＬＶＱＣＴＥＨＬＬＫＨＭＴＱＳＳＲＫＬＩＲＡＤＳＶＳＥＬＰＡＰＲＲＬＲＷＫＣＳＰＥＩＱＧＨＬＡＳＳＡＥＫＬＱＲＩＶＫＮＬＤＦＩＶＹＫＦＤＮＹＧＫＴＦＩＫＫＱＫＣＳＰＤＡＦＩＱＶＡＬＱＬＡＦＹＲＬＨＲＲＬＶＰＴＹＥＳＡＳＩＲＲＦＱＥＧＲＶＤＮＩＲＳＡＴＰＥＡＬＡＦＶＲＡＶＴＤＨＫＡＡＶＰＡＳＥＫＬＬＬＬＫＤＡＩＲＡＱＴＡＹＴＶＭＡＩＴＧＭＡＩＤＮＨＬＬＡＬＲＥＬＡＲＡＭＣＫＥＬＰＥＭＦＭＤＥＴＹＬＭＳＮＲＦＶＬＳＴＳＱＶＰＴＴＴＥＭＦＣＣＹＧＰＶＶＰＮＧＹＧＡＣＹＮＰＱＰＥＴＩＬＦＣＩＳＳＦＨＳＣＫＥＴＳＳＳＫＦＡＫＡＶＥＥＳＬＩＤＭＲＤＬＣＳＬＬＰＰＴＥＳＫＰＬＡＴＫＥＫＡＴＲＰＳＱＧＨＱＰ
ＭＡＡＫＴＰＳＳＥＥＳＧＬＰＫＬＰＶＰＰＬＱＱＴＬＡＴＹＬＱＣＭＲＨＬＶＳＥＥＱＦＲＫＳＱＡＩＶＱＱＦＧＡＰＧＧＬＧＥＴＬＱＱＫＬＬＥＲＱＥＫＴＡＮＷＶＳＥＹＷＬＮＤＭＹＬＮＮＲＬＡＬＰＶＮＳＳＰＡＶＩＦＡＲＱＨＦＰＧＴＤＤＱＬＲＦＡＡＳＬＩＳＧＶＬＳＹＫＡＬＬＤＳＨＳＩＰＴＤＣＡＫＧＱＬＳＧＱＰＬＣＭＫＱＹＹＧＬＦＳＳＹＲＬＰＧＨＴＱＤＴＬＶＡＱＮＳＳＩＭＰＥＰＥＨＶＩＶＡＣＣＮＱＦＦＶＬＤＶＶＩＮＦＲＲＬＳＥＧＤＬＦＴＱＬＲＫＩＶＫＭＡＳＮＥＤＥＲＬＰＰＩＧＬＬＴＳＤＧＲＳＥＷＡＥＡＲＴＶＬＶＫＤＳＴＮＲＤＳＬＤＭＩＥＲＣＩＣＬＶＣＬＤＡＰＧＧＶＥＬＳＤＴＨＲＡＬＱＬＬＨＧＧＧＹＳＫＮＧＡＮＲＷＹＤＫＳＬＱＦＶＶＧＲＤＧＴＣＧＶＶＣＥＨＳＰＦＤＧＩＶＬＶＱＣＴＥＨＬＬＫＨＭＴＱＳＳＲＫＬＩＲＡＤＳＶＳＥＬＰＡＰＲＲＬＲＷＫＣＳＰＥＩＱＧＨＬＡＳＳＡＥＫＬＱＲＩＶＫＮＬＤＦＩＶＹＫＦＤＮＹＧＫＴＦＩＫＫＱＫＣＳＰＤＡＦＩＱＶＡＬＱＬＡＦＹＲＬＨＲＲＬＶＰＴＹＥＳＡＳＩＲＲＦＱＥＧＲＶＤＮＩＲＳＡＴＰＥＡＬＡＦＶＲＡＶＴＤＨＫＡＡＶＰＡＳＥＫＬＬＬＬＫＤＡＩＲＡＱＴＡＹＴＶＭＡＩＴＧＭＡＩＤＮＨＬＬＡＬＲＥＬＡＲＡＭＣＫＥＬＰＥＭＦＭＤＥＴＹＬＭＳＮＲＦＶＬＳＴＳＱＶＰＴＴＴＥＭＦＣＣＹＧＰＶＶＰＮＧＹＧＡＣＹＮＰＱＰＥＴＩＬＦＣＩＳＳＦＨＳＣＫＥＴＳＳＳＫＦＡＫＡＶＥＥＳＬＩＤＭＲＤＬＣＳＬＬＰＰＴＥＳＫＰＬＡＴＫＥＫＡＴＲＰＳＱＧＨＱＰ
【0073】
本明細書で開示される組換え細胞を調製するために、（例えば、ＤＮＡベクターを介した）ＤＮＡ形質移入及びＲＮＡ形質導入などの、異種核酸を細胞に導入するための任意の適切な手段を本明細書で使用することができる。一実施形態において、組換え細胞を生成するために細胞に導入される異種核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターを使用することによって調製される。用語「ベクター」は、連結されたもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは環状２本鎖ＤＮＡループを指し、追加のＤＮＡセグメントをその中に挿入することができる。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる。発現ベクターは、発現ベクターが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができるベクターである。本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で、タンパク質配列をコードする核酸を含む。従って、発現ベクターは、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現されるべき核酸配列に機能的に連結された、プロモーターなどの１つ又は複数の制御配列を含むことができる。発現ベクターに関して使用される場合、「機能的に連結された」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを指すことが意図される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現のレベル及びベクターの意図される使用などの因子に依存し得るということが、当業者によって理解されるであろう。
【0074】
本開示を考慮して、プラスミド、コスミド、ファージベクター又はウイルスベクターなどの、当業者に知られている任意のベクターを使用することができる。一実施形態において、ベクターは、プラスミドなどの発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において知られており、本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った発現ベクターを生成することができる。
【0075】
本開示を考慮して、当業者に知られている任意の細胞を、ｎＡＣｈＲのα２、α５、β２サブユニット、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ、ＴＭＩＥ及びＦＡＭ１６３Ｂの組換え発現のために使用することができる。一実施形態において、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞及びＣｏｓ７細胞から選択されてもよい。
【0076】
α２α５β２型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を同定する方法
α２α５β２型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）を同定する方法が本明細書において更に提供される。ＰＡＭは、活性部位以外のタンパク質表面上の部位で結合し、したがって、タンパク質結合部位の立体構造を変化させる化合物である。
α２α５β２型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）を同定する方法が本明細書において更に提供される。ＰＡＭは、活性部位以外のタンパク質表面上の部位で結合し、したがって、タンパク質結合部位の立体構造を変化させる化合物である。
【0077】
一実施形態において、方法は、本明細書に開示される単離された組換え細胞を、組換え細胞が増殖する条件下で培養する工程と、組換え細胞を作用物質と接触させる工程と、作用物質がα２α５β２型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト又はＰＡＭであるかどうかを決定する工程とを含み、アゴニスト又はＰＡＭは、作用物質と接触されなかった組換え細胞におけるα２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、α２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を増強し、アンタゴニストは、α２α５β２型ｎＡＣｈＲの活性を減少させる。本明細書で使用する場合、アゴニストは、α２α５β２型ｎＡＣｈＲの機能を増強する働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用する場合、ＰＡＭは、受容体を直接活性化させることなく、リガンドに対するα２α５β２型ｎＡＣｈＲの応答の効果を増強する分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用する場合、用語「増強する」、「増強された」、「増加する」、又は「増加された」は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲ活性に関して使用されるときには、アゴニスト又はＰＡＭが投与されていない細胞において観察される対応するシグナル伝達に対して、受容体を通じたシグナル伝達が増加していることを指す。本明細書で使用する場合、アンタゴニストは、α２α５β２型ｎＡＣｈＲの機能を遮断させたり、減少させたり、又は減衰させたりする働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。ある特定の実施形態では、薬剤は、小分子又はペプチドである。
【0078】
一実施形態において、α２α５β２型ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流のアゴニストを同定するために、ＦＬＩＰＲアッセイが使用される。このアッセイでは、組換え細胞は、カルシウム感受性色素（Ｃａ５など）と共にインキュベートされ、試験化合物に曝露され、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによってカルシウム流が画像化される。
【0079】
一実施形態において、ニコチン誘発性α２α５β２型ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流のアンタゴニストを同定するために、ＦＬＩＰＲアッセイが使用される。このアッセイでは、組換え細胞は、カルシウム感受性色素（Ｃａ５など）と共にインキュベートされる。二重添加プロトコールを使用して、組換え細胞は、第１の期間中に試験化合物に曝露され、第２の期間中にニコチン（例えば、ＥＣ８０（１μＭ）で）に曝露される。その後、カルシウム流は、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化される。図２に示されるように、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのアンタゴニストは、カルシウム流を低下させる。
【0080】
一実施形態において、ニコチン誘発性α２α５β２型ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流を正に調節又は強化する化合物を同定するために、ＦＬＩＰＲアッセイが使用される。このアッセイでは、組換え細胞は、カルシウム感受性色素（Ｃａ５など）と共にインキュベートされる。二重添加プロトコールを使用して、組換え細胞は、第１の期間中に試験化合物に曝露され、第２の期間中にニコチン（例えば、ＥＣ８０（１μＭ）で）に曝露される。その後、カルシウム流は、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化される。試験化合物がニコチン誘発性α２α５β２型ｎＡＣｈＲ媒介性カルシウム流を増強するが、アゴニストとしてカルシウム流を増強しなければ（上記のように決定される）、試験化合物は、α２α５β２型ｎＡＣｈＲの正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）又は増強物質と呼ばれる。
【0081】
好ましい実施形態において、細胞は、ＦＬＩＰＲアッセイ又はα２α５β２型ｎＡＣｈＲ活性を測定するための他のアッセイの前に、約２５～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、細胞は、アッセイの前に、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃又は約３５℃で、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間又は約５０時間インキュベートされる。
【0082】
発現系及びキット
単離された組換え細胞を含む発現系及びキットが、本明細書において更に提供される。発現系及びキットは、使用説明書を更に含んでもよい。
単離された組換え細胞を含む発現系及びキットが、本明細書において更に提供される。発現系及びキットは、使用説明書を更に含んでもよい。
【実施例】
【0083】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明した実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義される本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【0084】
【表1】
【0085】
細胞株
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｒ７９００７）
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｒ７９００７）
【0086】
ベクター構築物
・ｐｃＤＮＡ３．１－α２
・ｐｃＤＮＡ３．１－α５
・ｐｃＤＮＡ３．１－β２
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＴ１
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＨＡＴ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＭＩＥ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＦＡＭ１６３Ｂ
・ｐｃＤＮＡ３．１－α２
・ｐｃＤＮＡ３．１－α５
・ｐｃＤＮＡ３．１－β２
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＴ１
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＨＡＴ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＭＩＥ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＦＡＭ１６３Ｂ
【0087】
培養培地
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地
【0088】
形質移入試薬
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬
【0089】
栽植培地
・ＤＭＥＭ
・１０％ＦＢＳ
・１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ
・ＤＭＥＭ
・１０％ＦＢＳ
・１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ
【0090】
化合物希釈／Ｃａ５緩衝液
・１ｍＭ Ｍｇ２＋及び２ｍＭ Ｃａ２＋が補充されたＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液（５００ｍＬ）
・１ｍＭ Ｍｇ２＋及び２ｍＭ Ｃａ２＋が補充されたＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液（５００ｍＬ）
【0091】
カルシウム５（Ｃａ５）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
・カルシウム色素をハンクス緩衝塩溶液中に２５倍濃度に希釈した。色素を、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で１倍に希釈した。
・カルシウム色素をハンクス緩衝塩溶液中に２５倍濃度に希釈した。色素を、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で１倍に希釈した。
【0092】
方法及び手順
１日目細胞調製
・細胞を遠心分離し、新鮮な予め加温された培地中に再懸濁することによって、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製する；
・１９００ｍＬの細胞を振盪しながら、５０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ培地中で以下の形質移入ミックスを調製する；
・２．５ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬を、空の５０ｍＬチューブに対して４７．５ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに添加する；
・第２の５０ｍＬチューブ中で、２．５ｍｇの全ＤＮＡ（３：３：３：３：１：２の比率でα２、α５、β２、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ及びＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂ）をＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ中に、５０ｍＬの最終体積になるように添加し、穏やかにボルテックス撹拌する；
・希釈されたＤＮＡをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬に移し、溶液を直ちに穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートする；
・１００ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ／ＤＮＡ形質移入ミックスを細胞に移し、培養物をホモジナイズする；
・８％ ＣＯ２と共に３７℃で１時間インキュベートする；
・無菌５００ｍＬチューブの中に細胞を注ぐ；
・１０００ｒｐｍで７分間回転させる；
・上清を除去する；
・細胞を凍結培地中に再懸濁し、一定分量をクライオチューブ中に入れ、－８０℃で凍結する。
１日目細胞調製
・細胞を遠心分離し、新鮮な予め加温された培地中に再懸濁することによって、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製する；
・１９００ｍＬの細胞を振盪しながら、５０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ培地中で以下の形質移入ミックスを調製する；
・２．５ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬を、空の５０ｍＬチューブに対して４７．５ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに添加する；
・第２の５０ｍＬチューブ中で、２．５ｍｇの全ＤＮＡ（３：３：３：３：１：２の比率でα２、α５、β２、ＳＡＴ１、ＣＨＡＴ及びＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂ）をＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ中に、５０ｍＬの最終体積になるように添加し、穏やかにボルテックス撹拌する；
・希釈されたＤＮＡをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬に移し、溶液を直ちに穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートする；
・１００ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ／ＤＮＡ形質移入ミックスを細胞に移し、培養物をホモジナイズする；
・８％ ＣＯ２と共に３７℃で１時間インキュベートする；
・無菌５００ｍＬチューブの中に細胞を注ぐ；
・１０００ｒｐｍで７分間回転させる；
・上清を除去する；
・細胞を凍結培地中に再懸濁し、一定分量をクライオチューブ中に入れ、－８０℃で凍結する。
【0093】
２日目細胞を播種する
・除染するためのエタノールバイアル；
・細胞を５０ｍＬのコニカルチューブに注ぐ；
・１０ｍＬの加温されたプレーティング培地を滴下してゆっくり添加する；
・ペレットが存在する場合、ペレットから取り外すために、上下に穏やかに数回ピペット操作する；
・１０００ＲＰＭで７分間回転させ、上清を吸引し、２５ｍＬの播種中に再懸濁する；
・３５μＬ中３５，０００細胞／ウェル（１．０×１０６細胞／ｍＬ）を播種する；
・プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、プレートを、加湿された雰囲気中５％ＣＯ２で３０℃に２４～４８時間移す。
・除染するためのエタノールバイアル；
・細胞を５０ｍＬのコニカルチューブに注ぐ；
・１０ｍＬの加温されたプレーティング培地を滴下してゆっくり添加する；
・ペレットが存在する場合、ペレットから取り外すために、上下に穏やかに数回ピペット操作する；
・１０００ＲＰＭで７分間回転させ、上清を吸引し、２５ｍＬの播種中に再懸濁する；
・３５μＬ中３５，０００細胞／ウェル（１．０×１０６細胞／ｍＬ）を播種する；
・プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、プレートを、加湿された雰囲気中５％ＣＯ２で３０℃に２４～４８時間移す。
【0094】
３日目ＦＬＩＰＲアッセイ
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回の洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェル中に２５μＬを残す；
・２５μＬの２×Ｃａ５色素を各ウェルに添加する；
・室温で１時間インキュベートする；
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回の洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェル中に５０μＬを残す；
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回の洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェル中に２５μＬを残す；
・２５μＬの２×Ｃａ５色素を各ウェルに添加する；
・室温で１時間インキュベートする；
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回の洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェル中に５０μＬを残す；
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。
【0095】
α２β２型ｎＡＣｈＲ及びα２α５β２型ｎＡＣｈＲの機能的発現
α２β２型ｎＡＣｈＲのヒトα２及びβ２サブユニットを、ｃＤＮＡの指定された組み合わせ（ベクター単独；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＴＭＩＥ又はＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＦＡＭ１６３Ｂ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入し、３７℃で一晩、続いて３０℃で２４～４８時間インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（３３μＭ）で刺激した。形質移入されたもののニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１（左）にグラフで示す。示されているように、ＳＡＴ１及びＣＨＡＴでの同時形質移入は、α２β２型ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強するが、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂでの同時形質移入は、α２β２型ｎＡＣｈＲ機能に影響を及ぼさない。
α２β２型ｎＡＣｈＲのヒトα２及びβ２サブユニットを、ｃＤＮＡの指定された組み合わせ（ベクター単独；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＴＭＩＥ又はＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＦＡＭ１６３Ｂ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入し、３７℃で一晩、続いて３０℃で２４～４８時間インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（３３μＭ）で刺激した。形質移入されたもののニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１（左）にグラフで示す。示されているように、ＳＡＴ１及びＣＨＡＴでの同時形質移入は、α２β２型ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強するが、ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂでの同時形質移入は、α２β２型ｎＡＣｈＲ機能に影響を及ぼさない。
【0096】
別個に、α２α５β２型ｎＡＣｈＲのヒトα２、α５及びβ２サブユニットを、ｃＤＮＡの指定された組み合わせ（ベクター単独；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＴＭＩＥ又はＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＦＡＭ１６３Ｂ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入し、３７℃で一晩、続いて３０℃で２４～４８時間インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（３３μＭ）で刺激した。形質移入されたもののニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１（右）にグラフで示す。示されているように、（ＳＡＴ１及びＣＨＡＴの存在下での）ＴＭＩＥ又はＦＡＭ１６３Ｂ同時形質移入は、α２β２α５型ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を劇的に増強する。
【0097】
α２β２型ｎＡＣｈＲ及びα２α５β２型ｎＡＣｈＲのニコチン誘発性活性に対するアンタゴニストの濃度応答曲線
α５あり又はなしのヒトｎＡＣｈＲサブユニットα２及びβ２サブユニットを、ｃＤＮＡの指定された組み合わせ（ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＴＭＩＥ又はＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＦＡＭ１６３Ｂ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。３７℃での一晩のインキュベーション後、細胞を３０℃で更に２４～４８時間インキュベートした。次いで、細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、種々の濃度のニコチンで刺激した。ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ画像装置を使用して、ニコチン誘発性カルシウム流を記録した。ＦＬＩＰＲシグナルを平均し、各形質移入ごとに最大応答に対するパーセンテージでプロットした。図２に示されているように、ＦＡＭ１６３Ｂ又はＴＭＩＥとの同時形質移入は、α２β２型ｎＡＣｈＲ及びα２β２α５型ｎＡＣｈＲの両方に対するニコチン作用強度を左にシフトさせた。
α５あり又はなしのヒトｎＡＣｈＲサブユニットα２及びβ２サブユニットを、ｃＤＮＡの指定された組み合わせ（ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ；ＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＴＭＩＥ又はＳＡＴ１＋ＣＨＡＴ＋ＦＡＭ１６３Ｂ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。３７℃での一晩のインキュベーション後、細胞を３０℃で更に２４～４８時間インキュベートした。次いで、細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、種々の濃度のニコチンで刺激した。ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ画像装置を使用して、ニコチン誘発性カルシウム流を記録した。ＦＬＩＰＲシグナルを平均し、各形質移入ごとに最大応答に対するパーセンテージでプロットした。図２に示されているように、ＦＡＭ１６３Ｂ又はＴＭＩＥとの同時形質移入は、α２β２型ｎＡＣｈＲ及びα２β２α５型ｎＡＣｈＲの両方に対するニコチン作用強度を左にシフトさせた。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】