特表 2024-518634 マイクロキャリア、細胞複合体およびこれを含む医療用組成物、美容組成物、医療用品および美容用品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-01

(54)【発明の名称】マイクロキャリア、細胞複合体およびこれを含む医療用組成物、美容組成物、医療用品および美容用品

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/16 20060101AFI20240423BHJP

   A61K 47/30 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240423BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20240423BHJP

   A61K 8/65 20060101ALI20240423BHJP

【ＦＩ】

A61K9/16

A61K47/30

A61K47/36

A61K47/42

A61K8/73

A61K8/65

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572018

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2023-11-20

(86)【国際出願番号】 KR2022012636

(87)【国際公開番号】W WO2023054902

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0130366

(32)【優先日】2021-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500239823

【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100122161

【弁理士】

【氏名又は名称】渡部 崇

(72)【発明者】

【氏名】ユンソプ・キム

(72)【発明者】

【氏名】ジ・ソン・キム

【テーマコード（参考）】

4C076

4C083

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076EE37

4C076EE42

4C083AD331

4C083AD411

4C083DD16

(57)【要約】

本発明によれば、第１生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むコア；および前記コアの全部または一部を囲み、第２生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むシェル；を含む、コア－シェル構造を有する高分子マイクロ粒子、および前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成された細胞付着誘導層；を含む、マイクロキャリア、これを含む細胞複合体、医療用組成物、美容組成物、医療用品および美容用品に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むコア；および前記コアの全部または一部を囲み、第２生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むシェル；を含む、コア－シェル構造を有する高分子マイクロ粒子、および
前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成された細胞付着誘導層；を含む、マイクロキャリア。

【請求項2】

前記コアは、第１生体適合性高分子が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを含み、
前記シェルは、第２生体適合性高分子が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを含む、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項3】

前記第１生体適合性高分子は、ヒアルロン酸を含み、
前記第２生体適合性高分子は、ゼラチンを含む、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項4】

前記コアは、コアに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対して、
ヒアルロン酸が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％超で含む、請求項２に記載のマイクロキャリア。

【請求項5】

前記シェルは、シェルに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対して、
ゼラチンが金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％超で含む、請求項２に記載のマイクロキャリア。

【請求項6】

前記高分子マイクロ粒子は、蒸留水における平均直径が１μｍ以上である、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項7】

前記高分子マイクロ粒子の最長直径を有する断面を基準として、
前記シェルの厚さが前記高分子マイクロ粒子の最長直径の９５％以下である、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項8】

前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤は、
反応性官能基を１個以上含む炭素数１～３０の架橋剤を含む、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項9】

前記高分子マイクロ粒子は、
粒子平均直径の２５％水準に変形した時の平均圧縮強度が０．１ｍＮ以上である、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項10】

前記高分子マイクロ粒子は、
光学写真における任意の粒子の最も長い直径に対する最も短い直径の比率（長径比）である球形化度が０．９以上１．０以下である、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項11】

前記細胞付着誘導層は、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチンキトサン、ポリドーパミン、ポリＬ－リジン、ビトロネクチン、ＲＧＤを含むペプチド、ＲＧＤを含むアクリル系高分子、リグニン、陽イオン性デキストラン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上の細胞付着性物質を含む、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項12】

前記細胞付着誘導層は、１ｎｍ～１０，０００ｎｍの層厚さを有する、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項13】

前記マイクロキャリアは、１μｍ～１０００μｍの平均直径を有する、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項14】

前記マイクロキャリアは、下記の数式で計算される細胞付着性が２０００％以上である、請求項１に記載のマイクロキャリア：
［数式］
細胞付着性＝（マイクロキャリアを細胞培養液に投入して３７℃で７日間培養した後の細胞数／細胞培養液に最初に含まれる細胞数）×１００。

【請求項15】

前記マイクロキャリアは、細胞培養用マイクロキャリアである、請求項１に記載のマイクロキャリア。

【請求項16】

請求項１に記載のマイクロキャリア；および
前記マイクロキャリアの表面上に付着した細胞；を含む、細胞複合体。

【請求項17】

請求項１に記載のマイクロキャリア、または請求項１６に記載の細胞複合体のいずれか１つを含む、医療用組成物。

【請求項18】

請求項１に記載のマイクロキャリア、または請求項１６に記載の細胞複合体のいずれか１つを含む、美容組成物。

【請求項19】

請求項１７に記載の医療用組成物を含む、医療用品。

【請求項20】

請求項１８に記載の美容組成物を含む、美容用品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年９月３０日付の韓国特許出願第１０－２０２１－０１３０３６６号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。

【0002】

本発明は、優れた機械的強度および安定性を実現することができ、細胞脱着工程なしに３次元培養後すぐに体内注入が可能であり、付着性細胞に安定した環境を提供して細胞生存率が高くかつ高い体内移植率に寄与できるマイクロキャリア、およびこれを含む細胞複合体、医療用組成物、美容組成物、医療用品および美容用品に関する。

【背景技術】

【0003】

バイオ医薬品および再生医療分野が広がるにつれ、細胞、組織、微生物などを効率的に生産できる細胞大量培養技術の要求が増大している。

【0004】

付着性を有する細胞は、３Ｄバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）内でマイクロキャリアを用いて培養される。バイオリアクター内に細胞、培養液およびマイクロキャリアを入れて、培養液を撹拌して細胞およびマイクロキャリアを接触させることによって、細胞をマイクロキャリアの表面に付着させて培養する。この時、使用するマイクロキャリアは、細胞が付着して増殖できる高い表面積比率（ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ／ｖｏｌｕｍｅ）を提供するため、細胞の大量培養に適している。しかし、マイクロキャリアを用いて付着性細胞を拡張培養する場合、培養が終了した後の細胞脱着過程により細胞を回収する過程が必須的に伴う。前記細胞脱着過程は、タンパク質分解酵素を使用したり、温度を変化させて細胞の脱着を誘導するが、このような脱着工程が追加される場合、製造費用が増加して経済性が低下し、細胞損傷が誘発されうる問題点が存在していた。

【0005】

これを解決するための新たな素材や工程の開発が着実に進められており、特に、生体内細胞を注入する細胞治療剤の場合、細胞を培養するマイクロキャリアの生体適合性を確保して分離精製過程を省略しようとする努力がある。この場合、培養過程および生体注入後、キャリア周辺の流体によって加えられるストレスに耐えられる強度を実現する粒子が必要である。

【0006】

それだけでなく、薬物あるいは生理活性物質を捕集したマイクロキャリアをマイクロニードルに搭載して伝達する経皮型薬物伝達技術の場合、マイクロキャリアは、生体への適用に適した高分子を用いなければならず、皮膚の角質層（ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｌａｙｅｒ）を通過する過程で粒子の変形が起こらないように十分な強度を持たなければならない。安定的に経皮を透過したマイクロキャリアは、搭載された薬物を局所的（ｌｏｃａｌ）あるいは全身（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）に送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）して必要な病巣に作用することが可能になる。

【0007】

生体適合性物質として主に用いられるヒアルロン酸は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとＤ－グルクロン酸とからなり、前記繰り返し単位が線状に連結されている生体高分子物質である。眼球の硝子体液、関節の滑液および鶏冠などに多く存在する。ヒアルロン酸は、優れた生体適合性と粘弾性により生体注入型物質としてよく使用されるが、それ自体だけでは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または酸、アルカリなどの条件で分解されやすくて使用が限られている。また、マイクロキャリアに適用する場合、生体ｐＨ範囲でヒアルロン酸は負電荷を示し、これによって細胞付着性が顕著に低下する問題点があった。

【0008】

また、ゼラチンは、生体結合組織であるコラーゲンを加水分解した高分子であり、細胞培養用スキャフォールドとして活用される。細胞を捕集したり培養することができるが、その強度が弱く、温度に敏感で、化学的方法で官能基を導入してその強度を向上させようとする努力がある。

【0009】

そこで、生体に適していながらも、物理的強度、および熱と酵素に対する安定性など優れた物性と優れた安定性を有するマイクロキャリア、または高分子マイクロ粒子の開発が必要なのが現状である。

【0010】

また、マイクロキャリアを用いて付着性細胞の大量拡張過程で既存の２次元培養の限界を克服するために表面効率を増加させることができる球状のマイクロキャリアが開発されて３次元的拡張培養に用いられており、培養終了後の細胞脱着過程により細胞を回収している従来技術上、脱着工程の追加による製造費用増加、細胞損傷誘発の問題があった。

【0011】

そして、注射型細胞治療剤の場合、主に液相に細胞が浮遊する状態で患部に注入することにより、付着性細胞の場合、生存に安定的でない環境と体内免疫反応により体内移植率および細胞生存率が低くなる限界があった。

【0012】

そこで、細胞脱着工程なしに３次元培養後すぐに体内注入が可能であり、付着性細胞に安定した環境を提供して細胞生存率が高くかつ高い体内移植率に寄与できるマイクロキャリアの開発が必要なのが現状である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、優れた機械的強度および安定性を実現することができ、細胞脱着工程なしに３次元培養後すぐに体内注入が可能であり、付着性細胞に安定した環境を提供して細胞生存率が高くかつ高い体内移植率に寄与できるマイクロキャリアを提供する。

【0014】

また、本発明は、前記マイクロキャリアを含む、細胞複合体を提供する。

【0015】

また、本発明は、前記のマイクロキャリア、または細胞複合体を含む医療用組成物を提供する。

【0016】

また、本発明は、前記のマイクロキャリア、または細胞複合体を含む美容組成物を提供する。

【0017】

また、本発明は、前記の医療用組成物を含む医療用品を提供する。

【0018】

また、本発明は、前記の美容組成物を含む美容用品を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本明細書においては、第１生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むコア；および前記コアの全部または一部を囲み、第２生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むシェル；を含む、コア－シェル構造を有する高分子マイクロ粒子、および前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成された細胞付着誘導層；を含む、マイクロキャリアが提供される。

【0020】

本明細書においてはまた、前記マイクロキャリア；および前記マイクロキャリアの表面上に付着した細胞；を含む、細胞複合体が提供される。

【0021】

本明細書においてはまた、前記のマイクロキャリア、または細胞複合体を含む、医療用組成物が提供される。

【0022】

本明細書においてはまた、前記のマイクロキャリア、または細胞複合体を含む、美容組成物が提供される。

【0023】

本明細書においてはまた、前記の医療用組成物を含む医療用品が提供される。

【0024】

本明細書においてはまた、前記の美容組成物を含む美容用品が提供される。

【0025】

以下、発明の具体的な実施形態によるマイクロキャリア、およびこれを含む細胞複合体、医療用組成物、美容組成物、医療用品および美容用品についてより詳細に説明する。

【0026】

本明細書において、明示的な言及がない限り、専門用語は単に特定の実施例を言及するためのものであり、本発明を限定することを意図しない。

【0027】

本明細書で使用される単数形態は、文言がこれと明確に反対の意味を示さない限り、複数形態も含む。

【0028】

本明細書で使用される「含む」の意味は、特定の特性、領域、整数、段階、動作、要素および／または成分を具体化し、他の特定の特性、領域、整数、段階、動作、要素、成分および／または群の存在や付加を除外させるわけではない。

【0029】

そして、本明細書において、「第１」および「第２」のように序数を含む用語は、１つの構成要素を他の構成要素から区別する目的で使用され、前記序数によって限定されない。例えば、本発明の権利範囲内で第１構成要素は第２構成要素と名付けられてもよく、類似して、第２構成要素は第１構成要素と名付けられてもよい。

【0030】

本明細書において、（共）重合体は、重合体または共重合体をすべて含む意味であり、前記重合体は、単一の繰り返し単位からなる単独重合体を意味し、共重合体は、２種以上の繰り返し単位を含む複合重合体を意味する。

【0031】

本発明は多様な変更が加えられ様々な形態を有することができるが、特定の実施例を例示して下記に詳細に説明する。しかし、これは本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするのではなく、前記思想および技術範囲に含まれるすべての変更、均等物乃至代替物を含むことが理解されなければならない。

【0032】

本明細書において、マイクロ粒子とは、粒子断面が円形または楕円形であり、粒子の短軸／長軸の比（球形化度）が０．７～１．０の範囲のものを意味する。粒子の短軸および長軸の長さは、粒子に対する光学写真を撮影し、光学写真における任意の粒子３０個～１００個の平均値を計算することによって導出される。

【0033】

本明細書において、直径（Ｄｎ）は、直径による粒子個数累積分布のｎ体積％地点での直径を意味する。つまり、Ｄ５０は、粒子の直径を昇順に累積させた時、粒子個数累積分布の５０％地点での直径であり、Ｄ９０は、直径による粒子個数累積分布の９０％地点での直径であり、Ｄ１０は、直径による粒子個数累積分布の１０％地点での直径である。

【0034】

前記Ｄｎは、レーザ回折法（ｌａｓｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定することができる。具体的には、測定対象粉末を分散媒中に分散させた後、市販のレーザ回折粒度測定装置（Ｈｏｒｉｂａ ＬＡ－９６０）に導入して、粒子がレーザビームを通過する時の粒子サイズによる回折パターンの差を測定して粒度分布を算出する。測定装置における直径による粒子個数累積分布の１０％、５０％および９０％になる地点での粒子直径を算出することによって、Ｄ１０、Ｄ５０およびＤ９０を測定することができる。より具体的には、本明細書において、直径は、Ｄ５０を意味することができる。

【0035】

本明細書において、エマルジョンとは、油相または水相の混ざらない液体の１つ以上を、微粒子状態（分散質）で他の液体（分散媒）に分散させた混合相を意味する。エマルジョンは、分散相の粒度サイズにより、通常、マクロエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョンに分けられる。

【0036】

以下、本発明をより詳しく説明する。

【0037】

１．マイクロキャリア
発明の一実施形態によれば、第１生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むコア；および前記コアの全部または一部を囲み、第２生体適合性高分子、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含むシェル；を含む、コア－シェル構造を有する高分子マイクロ粒子、および前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成された細胞付着誘導層；を含む、マイクロキャリアが提供される。

【0038】

本発明者らは、高分子マイクロ粒子に関する研究を進めて、上述のように金属イオンによって架橋反応させた後、追加の架橋反応を行うことによって、工程の効率性が最大化されると同時に、マイクロ粒子の機械的強度と細胞付着性が顕著に向上することを、実験を通して確認して、発明を完成した。

【0039】

また、前記一実施形態のマイクロキャリアは、前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成された細胞付着誘導層を含むことによって、細胞脱着工程なしに３次元培養後すぐに体内注入が可能であり、付着性細胞が安定的にマイクロキャリアと付着した状態で複合体を形成することによって、細胞生存率が高くかつ高い体内移植率を実現できることを、実験を通して確認して、発明を完成した。

【0040】

発明の一実施形態において、前記コアは、第１生体適合性高分子が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを含み、前記シェルは、第２生体適合性高分子が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを含むことができる。

【0041】

具体的には、前記高分子マトリックスは、生体適合性高分子が金属イオンを介して架橋された第１架橋領域；および生体適合性高分子が反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された第２架橋領域；を含むことができる。

【0042】

前記第１架橋領域は、生体適合性高分子と金属イオンとの架橋反応が進行して形成された架橋領域を意味し、前記第２架橋領域は、生体適合性高分子と金属イオンとの架橋反応の代わりに、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤と架橋反応が進行して形成された架橋領域、および第１架橋領域と反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤が追加の架橋反応により形成された架橋領域を意味することができる。つまり、前記実施形態の高分子マイクロ粒子は、金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を用いた架橋反応を経て製造できる。

【0043】

具体的には、前記生体適合性高分子とは、人体に適用される有効物質を伝達するために、人体内に直接注入可能な高分子を意味する。具体的には、前記生体適合性高分子は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）、カルボキシメチルセルロース（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：ＣＭＣ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ペクチン、カラギーナン、コンドロイチン（スルフェート）、デキストラン（スルフェート）、キトサン、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルキチン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｉｎ）、フィブリン、アガロース、プルラン、ポリラクチド、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド－グリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、ポリエーテルエステル（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｓｔｅｒ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリエステルアミド（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｍｉｄｅ）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリウレタン、ポリアクリレート、エチレン－ビニルアセテート重合体、アクリル置換セルロースアセテート、非－分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、ポリビニルフルオライド、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ ｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎｓ）、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメタクリレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、シクロデキストリン、およびこのような高分子を形成する単量体の共重合体およびセルロースからなる群より選択された１つ以上の高分子であってもよい。

【0044】

より具体的には、前記生体適合性高分子は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）およびゼラチンの混合物であってもよい。

【0045】

ヒアルロン酸のみを用いて製造された高分子マイクロ粒子は、それ自体だけでは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または酸、アルカリなどの条件で分解されやすくて使用が限られているだけでなく、細胞付着性が顕著に低下し、ゼラチンのみを用いて製造された高分子マイクロ粒子は、機械的物性が顕著に低下する。

【0046】

そこで、生体適合性高分子としてヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）およびゼラチンの混合物を使用することによって、優れた細胞付着性と同時に、機械的物性を実現することができる。

【0047】

具体的には、前記第１生体適合性高分子は、ヒアルロン酸を含み、前記第２生体適合性高分子は、ゼラチンを含むことができる。

【0048】

本明細書において、ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体とヒアルロン酸塩をすべて含む意味であってもよい。これによって、ヒアルロン酸水溶液は、ヒアルロン酸の水溶液、ヒアルロン酸塩の水溶液、およびヒアルロン酸とヒアルロン酸塩との混合水溶液をすべて含む概念であってもよい。前記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトなどの無機塩と、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムなどの有機塩、およびその混合物であってもよい。

【0049】

発明の一実施形態において、ヒアルロン酸の分子量は特に制限されるわけではないが、多様な物性と生体適合性を実現するために、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下であることが好ましい。

【0050】

本明細書において、ゼラチンは、動物に由来するコラーゲンを酸またはアルカリで処理し、後続して抽出して得られるタンパク質を意味することができる。

【0051】

発明の一実施形態において、ゼラチンの分子量は特に制限されるわけではないが、多様な物性と生体適合性を実現するために、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下であることが好ましい。

【0052】

一方、前記高分子マイクロ粒子は、コア－シェル構造を有することができる。前記コア－シェル構造は、高分子マイクロ粒子に含まれる高分子マトリックスが２種以上の生体適合性高分子を含むことによって、生体適合性高分子と金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤間の反応性の差などによって実現できる。

【0053】

前記コア－シェル構造において、前記コアは、コアに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対して、ヒアルロン酸が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％超、６０体積％以上、７０体積％以上、または７５体積％以上で含むことができる。また、１００体積％以下、１００体積％未満、９５体積％以下、または９０体積％以下で含むことができる。また、５０体積％超１００体積％以下、５０体積％超１００体積％未満、６０体積％以上１００体積％未満、６０体積％以上９５体積％以下、７０体積％以上９５体積％以下、７０体積％以上９０体積％以下、または７５体積％以上９０体積％以下で含むことができる。つまり、前記コアは、ゼラチンに対して過剰のヒアルロン酸を含むことができる。

【0054】

コアに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対して、ヒアルロン酸が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％超で含むことは、当該領域が全体面積の５０％を超えて分布することを視覚的または測定装置により確認して知ることができる。

【0055】

具体的には、前記コアに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対するヒアルロン酸が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスの体積比率の計算は大きく制限されず、通常の測定方法によって計算することができる。例えば、製造された高分子マイクロ粒子のゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）に対して相対化したヒアルロン酸の特性ピーク（１０８０ｃｍ^－１）に対するＩＲ写真を撮影して確認することができる。

【0056】

前記コア－シェル構造において、前記シェルは、シェルに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対して、ゼラチンが金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％超、６０体積％以上、７０体積％以上、または７５体積％以上で含むことができる。また、１００体積％以下、１００体積％未満、９５体積％以下、または９０体積％以下で含むことができる。また、５０体積％超１００体積％以下、５０体積％超１００体積％未満、６０体積％以上１００体積％未満、６０体積％以上９５体積％以下、７０体積％以上９５体積％以下、７０体積％以上９０体積％以下、または７５体積％以上９０体積％以下で含むことができる。つまり、前記シェルは、ヒアルロン酸に対して過剰のゼラチンを含むことができる。

【0057】

シェルに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対して、ゼラチンが金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％超で含むことは、当該領域が全体面積の５０％を超えて分布することを視覚的または測定装置により確認して知ることができる。

【0058】

前記シェルに含まれる高分子マトリックス全体の体積に対するゼラチンが金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスの体積比率の計算は大きく制限されず、通常の測定方法によって計算することができる。例えば、製造された高分子マイクロ粒子のゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）に対するＩＲ写真を撮影して確認することができる。

【0059】

ヒアルロン酸が金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％以上含むコアと、ゼラチンが金属イオンおよび反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を介して架橋された高分子マトリックスを５０体積％以上含むシェルとを含むコア－シェル構造は、溶解度、温度反応性、イオン結合性など物理化学的原因により実現できる。より具体的には、高分子マイクロ粒子製造工程において、エタノールなどの極性溶媒に対する溶解度が低く温度反応性が高いゼラチンは、流動性が低下して粒子表面に固定して存在してシェルを形成することができ、これによって、相対的に粒子内部にヒアルロン酸がより多く分布してコアを形成することができる。

【0060】

特に、後述する高分子マイクロ粒子の製造方法において、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒上で高分子架橋粒子を追加架橋する段階の前に、生体適合性高分子および金属イオンを含む混合物を反応して高分子架橋粒子を形成する段階を含むことによって、金属イオンとヒアルロン酸に含まれているカルボキシル基との間のイオン結合によってコア－シェル構造がより明確になる。

【0061】

一方、前記高分子マイクロ粒子は、蒸留水における平均直径が１μｍ以上、１μｍ以上４５０μｍ以下、１００μｍ以上４５０μｍ以下、または２００μｍ以上４００μｍ以下、または３００μｍ以上４００μｍ以下であってもよいが、高分子マイクロ粒子の平均直径が上述した範囲を満足する場合、細胞付着および培養性能に優れている。

【0062】

前記平均直径とは、直径による粒子個数累積分布の５０体積％地点での直径を意味することができる。

【0063】

前記高分子マイクロ粒子において、前記高分子マイクロ粒子の最長直径を有する断面を基準として、前記シェルの厚さが前記高分子マイクロ粒子の最長直径の９５％以下、９０％以下、８０％以下、７５％以下、５０％以下、３０％以下、２５％以下、または２０％以下であってもよい。また、前記高分子マイクロ粒子の最長直径を有する断面を基準として、前記シェルの厚さが前記高分子マイクロ粒子の最長直径の０．０１％以上、１％以上、または５％以上であってもよい。

【0064】

また、前記高分子マイクロ粒子において、前記高分子マイクロ粒子の最長直径を有する断面を基準として、前記コアの厚さが前記高分子マイクロ粒子の最長直径の５％以上、１０％以上、２０％以上、２５％以上、５０％以上、７０％以上、７５％以上、または８０％以上であってもよい。さらに、前記高分子マイクロ粒子の最長直径を有する断面を基準として、前記コアの厚さが前記高分子マイクロ粒子の最長直径の９９．９９％以下、９９％以下、または９５％以下であってもよい。

【0065】

また、前記高分子マイクロ粒子は、０．９以上１．０以下、０．９３以上１．０以下、０．９４以上０．９９以下、または０．９４以上０．９８以下の球形化度を有することができる。前記球形化度は、高分子マイクロ粒子の光学写真を撮影し、光学写真における任意の粒子３０個～１００個の平均値を計算することによって得ることができる。

【0066】

さらに、前記高分子マイクロ粒子は、蒸留水で２４時間以上膨潤した粒子に対して平均直径の２５％水準に変形した時の平均圧縮強度が０．１ｍＮ以上、０．１ｍＮ以上１００ｍＮ以下、０．３ｍＮ以上１００ｍＮ以下、０．３５ｍＮ以上１００ｍＮ以下、０．３５ｍＮ以上３０ｍＮ以下、０．３５ｍＮ以上１０ｍＮ以下、または０．３５ｍＮ以上３ｍＮ以下であってもよい。前記平均圧縮強度は、前記高分子マイクロ粒子ｎ個に対して、平均直径の２５％水準に変形した時の圧縮強度をｎで割った値であってもよい。

【0067】

例えば、本明細書において、前記平均圧縮強度は、前記高分子マイクロ粒子３０個に対して、平均直径の２５％水準に変形した時の圧縮強度を３０で割った値であってもよい。

【0068】

前記高分子マイクロ粒子の平均圧縮強度が０．１ｍＮ未満の場合、高分子マイクロ粒子の機械的強度に劣り安定性が低下する技術的問題点が発生しうる。

【0069】

一方、前記一実施形態のマイクロキャリアに含まれている高分子マイクロ粒子を製造する方法の例が大きく限定されるものではないが、例えば、生体適合性高分子および金属イオンを含む混合物を反応して高分子架橋粒子を形成する段階；および反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒上で前記高分子架橋粒子を追加架橋する段階；を含む、高分子マイクロ粒子の製造方法が用いられる。

【0070】

従来の高分子マイクロ粒子は、オイルを用いるＷ／Ｏエマルジョンを形成した後、架橋されることによってオイル洗浄工程が必須的に伴い、工程の効率性が良くないだけでなく、残留オイルの除去が難しい技術的問題があった。

【0071】

そこで、本発明者らは、前記高分子マイクロ粒子の製造方法のように、金属イオンによって架橋させた後、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を用いた追加の架橋反応を行うことによって、工程の効率性が最大化されると同時に、マイクロ粒子の機械的強度と安定性が顕著に向上することを、実験を通して確認して、発明を完成した。

【0072】

具体的には、前記生体適合性高分子とは、人体に適用される有効物質を伝達するために、人体内に直接注入可能な高分子を意味する。具体的には、前記生体適合性高分子は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）、カルボキシメチルセルロース（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：ＣＭＣ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ペクチン、カラギーナン、コンドロイチン（スルフェート）、デキストラン（スルフェート）、キトサン、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルキチン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｉｎ）、フィブリン、アガロース、プルラン、ポリラクチド、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド－グリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、ポリエーテルエステル（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｓｔｅｒ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリエステルアミド（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｍｉｄｅ）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリウレタン、ポリアクリレート、エチレン－ビニルアセテート重合体、アクリル置換セルロースアセテート、非－分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、ポリビニルフルオライド、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ ｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎｓ）、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメタクリレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、シクロデキストリンおよびこのような高分子を形成する単量体の共重合体およびセルロースからなる群より選択された１つ以上の高分子であってもよい。

【0073】

より具体的には、前記生体適合性高分子は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）およびゼラチンの混合物であってもよい。

【0074】

ヒアルロン酸のみを用いて製造された高分子マイクロ粒子は、それ自体だけでは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または酸、アルカリなどの条件で分解されやすくて使用が限られているだけでなく、細胞付着性が顕著に低下し、ゼラチンのみを用いて製造された高分子マイクロ粒子は、機械的物性が顕著に低下する。

【0075】

そこで、生体適合性高分子としてヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）およびゼラチンの混合物を使用することによって、優れた細胞付着性と同時に、機械的物性を実現することができる。

【0076】

本明細書において、ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体とヒアルロン酸塩をすべて含む意味であってもよい。これによって、ヒアルロン酸水溶液は、ヒアルロン酸の水溶液、ヒアルロン酸塩の水溶液、およびヒアルロン酸とヒアルロン酸塩との混合水溶液をすべて含む概念であってもよい。前記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトなどの無機塩と、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムなどの有機塩、およびその混合物であってもよい。

【0077】

発明の一実施形態において、ヒアルロン酸の分子量は特に制限されるわけではないが、多様な物性と生体適合性を実現するために、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下であることが好ましい。

【0078】

本明細書において、ゼラチンは、動物に由来するコラーゲンを酸またはアルカリで処理し、後続して抽出して得られるタンパク質を意味することができる。

【0079】

発明の一実施形態において、ゼラチンの分子量は特に制限されるわけではないが、多様な物性と生体適合性を実現するために、１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ以下であることが好ましい。

【0080】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法において、前記ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）およびゼラチンの混合物は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）１００重量部に対して、ゼラチンを５０重量部以上５００重量部以下、１００重量部以上５００重量部以下、または１００重量部以上３００重量部以下で含むことができる。

【0081】

ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）１００重量部に対して、ゼラチンを５０重量部未満で含む場合、製造される高分子マイクロ粒子の細胞付着性が不良になり、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）１００重量部に対して、ゼラチンを５００重量部超で含む場合、製造される高分子マイクロ粒子の機械的物性が低下することがある。つまり、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）およびゼラチンの混合物は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡ）１００重量部に対して、ゼラチンを５０重量部以上５００重量部以下で含むことによって、優れた細胞付着性と同時に、機械的物性を実現可能な高分子マイクロ粒子が製造できる。

【0082】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法において、金属イオンは、鉄イオン（Ｆｅ^３＋）、アルミニウムイオン（Ａｌ^３＋）、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、鉄イオン（Ｆｅ^２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）、バリウムイオン（Ｂａ^２＋）、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）などからなる群より選択された１つを含むことができる。より具体的には、前記金属イオンは、鉄イオン、アルミニウムイオン、またはそれらの混合物であってもよい。

【0083】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法において、前記生体適合性高分子および金属イオンを含む混合物を反応して高分子架橋粒子を形成する段階は、前記生体適合性高分子を溶かした水溶液を形成する段階；前記金属イオンを含む化合物を極性溶媒に添加して金属イオンを含む溶液を形成する段階；および前記生体適合性高分子を溶かした水溶液液滴と前記金属イオンを含む溶液とを混合して混合溶液を形成する段階；を含むことができる。

【0084】

具体的には、前記生体適合性高分子を溶かした水溶液を形成する段階において、前記生体適合性高分子を溶かした水溶液は、全体生体適合性高分子を溶かした水溶液の重量に対して、前記生体適合性高分子を０．０１重量％以上１０重量％以下、０．０１重量％以上５重量％以下、１重量％以上５重量％以下、１重量％以上３重量％以下、２重量％以上３重量％以下、２重量％以上２．５重量％以下で含むことができる。

【0085】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法のように、金属イオンによって架橋反応させた後、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤によって追加の架橋反応を行うことによって、従来のようにＷ／Ｏエマルジョンを形成した後に架橋反応させる場合と比較して、前記のように０．０１重量％以上１０重量％以下の少ない含有量の生体適合性高分子でも機械的強度と安定性に優れたマイクロ粒子を製造することができる。

【0086】

前記金属イオンを含む化合物を極性溶媒に添加して金属イオンを含む溶液を形成する段階は、大きく制限されないが、例えば、金属イオンを含む化合物をエタノールなどの極性溶媒に分散させて形成することができる。

【0087】

また、前記生体適合性高分子を溶かした水溶液液滴と前記金属イオンを含む溶液とを混合して混合溶液を形成する段階において、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）（ＢＵＣＨＩ、Ｂ－３９０）機器を用いて、粒子の大きさを適切に制御することができる。

【0088】

前記生体適合性高分子を溶かした水溶液液滴と前記金属イオンを含む溶液とを混合して混合溶液を形成する段階を含むことによって、前記生体適合性高分子に金属イオンがキレートされながら金属イオンを介して生体適合性高分子が架橋構造を形成することができる。

【0089】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法のように、生体適合性高分子および金属イオンを含む混合物を反応して高分子架橋粒子を形成する段階を含むことによって、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤のみを用いて架橋反応を行う場合と比較して、オイルの使用なしに極性溶媒上でマイクロ粒子の製造が可能で、オイル洗浄工程が省略されて工程の効率性に優れるという効果が実現できる。

【0090】

つまり、生体適合性高分子に金属イオンがキレートされながら金属イオンを介して生体適合性高分子が架橋構造を形成することによって、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤のみを用いて架橋反応を行う場合と比較して、オイルの使用なしに極性溶媒上でマイクロ粒子の製造が可能で、オイル洗浄工程が省略されて工程の効率性に優れるという効果が実現できる。

【0091】

また、前記金属イオンを含む化合物は、前記生体適合性高分子１００重量部に対して、２００重量部以上１０００重量部以下、３００重量部以上１０００重量部以下、または５００重量部以上１０００重量部以下で含まれる。

【0092】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法は、上述のように、金属イオンによる架橋反応後に追加の架橋反応を行うことによって、前記生体適合性高分子１００重量部に対して、２００重量部以上１０００重量部以下で金属イオンを含む混合物を少量添加しても十分な機械的強度および球形化度を実現する高分子マイクロ粒子を製造することができる。

【0093】

前記金属イオンを含む化合物の含有量が前記生体適合性高分子１００重量部に対して、１０００重量部を超えて添加される場合、残量の金属イオンが架橋粒子に残存する技術的問題点が発生しうる。

【0094】

前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤は、反応性官能基を１個以上含む炭素数１～３０の架橋剤を含むことができる。

【0095】

上述のように、金属イオンによって架橋させた後、反応性官能基を１個以上含む炭素数１～３０の架橋剤を用いた追加の架橋反応を行うことによって、工程の効率性が最大化されると同時に、マイクロ粒子の機械的強度と安定性が顕著に向上できる。

【0096】

前記反応性官能基の種類が大きく制限されないが、例えば、ヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基、（メタ）アクリレート基、ニトリル基、チオール基、アルデヒド基、またはビニル基が挙げられる。

【0097】

具体的には、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤は、ホルミル基またはエポキシ基を１個以上、または２個以上含むことができる。前記ホルミル基またはエポキシ基は、上述した生体適合性高分子と反応して架橋粒子を形成する、架橋性官能基であってもよい。

【0098】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法において、反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤は、その例が大きく制限されるわけではない。具体的には、前記架橋剤は、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＥＧＤＧＥ）、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６－ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（ｔｒｉ－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ビスエポキシプロポキシエチレン（１，２－（ｂｉｓ（２，３－ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）およびソルビトールポリグリシジルエーテル（ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ジビニルスルホン（ｄｉｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）、エピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）からなる群より選択された１つを含むことができる。

【0099】

より具体的には、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤は、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）またはブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＢＤＤＥ）であってもよい。

【0100】

一方、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒上で前記高分子架橋粒子を追加架橋する段階において、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤は、前記生体適合性高分子１００重量部に対して、１５０重量部以上１０００重量部以下、２００重量部以上１０００重量部以下、３００重量部以上８００重量部以下、４００重量部以上５００重量部以下で含まれる。

【0101】

前記高分子マイクロ粒子の製造方法は、上述のように、架橋反応後に追加の架橋反応を行うことによって、前記生体適合性高分子１００重量部に対して、１５０重量部以上１０００重量部以下で反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を少量添加しても十分な機械的強度および球形化度を実現する高分子マイクロ粒子を製造することができる。

【0102】

反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤の含有量が前記生体適合性高分子１００重量部に対して１０００重量部を超えて添加される場合、残量の未反応架橋剤が架橋粒子に残存する技術的問題が発生しうる。

【0103】

一方、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒上で前記高分子架橋粒子を追加架橋する段階において、前記極性溶媒は大きく制限されないが、例えば、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ－メチルカプロラクタム、２－ピロリドン、Ｎ－エチルピロリドン、Ｎ－ビニルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラメチルウレア、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルスルホキシド、ガンマ－ブチロラクトン、３－メトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパンアミド、３－エトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパンアミド、３－ブトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパンアミド、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、エチルアミルケトン、メチルノニルケトン、メチルエチルケトン、メチルイソアミルケトン、メチルイソプロピルケトン、シクロヘキサノン、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジグリム、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノプロピルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテルアセテート、エチレングリコールモノイソプロピルエーテル、エチレングリコールモノイソプロピルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテルアセテートからなる群より選択された１つであってもよい。

【0104】

また、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒上で前記高分子架橋粒子を追加架橋する段階において、前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒は、アルカリ性混合溶媒であってもよい。

【0105】

つまり、極性溶媒にアルカリ水溶液を混合したアルカリ性混合溶媒上で本発明の追加の架橋反応が行われる。前記アルカリ水溶液の例は大きく制限されないが、例えば、水酸化ナトリウム水溶液などであってもよい。

【0106】

前記反応性官能基を１個以上含む有機架橋剤を含む極性溶媒がアルカリ性混合溶媒であることによって、求核性置換反応（Ｓ_Ｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に有利な環境を作り、架橋反応の効率を増加させることができる。

【0107】

一方、前記一実施形態のマイクロキャリアは、前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成された細胞付着誘導層；を含むことができる。前記細胞付着誘導層は、細胞付着性物質で構成され、付着性細胞が安定的に付着、スプレディング（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）および培養できるようにする。

【0108】

前記細胞付着誘導層は、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）キトサン、ポリドーパミン、ポリＬ－リジン、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＲＧＤを含むペプチド、ＲＧＤを含むアクリル系高分子、リグニン（ｌｉｇｎｉｎ）、陽イオン性デキストラン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上の細胞付着性物質を含むことができる。つまり、前記細胞付着誘導層は、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）キトサン、ポリドーパミン、ポリＬ－リジン、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＲＧＤを含むペプチド、ＲＧＤを含むアクリル系高分子、リグニン（ｌｉｇｎｉｎ）、陽イオン性デキストラン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される１種、またはこれらの２種以上の混合物を含む細胞付着性物質を含むことができる。

【0109】

前記細胞付着誘導層は、前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成される。つまり、前記高分子マイクロ粒子の表面に前記細胞付着誘導層が直接接触したり、あるいは前記高分子マイクロ粒子の表面に接触したその他の層の表面に前記細胞付着誘導層が接触することができる。

【0110】

一例として、前記マイクロキャリアは、高分子マイクロ粒子の表面に直接接触するように形成される細胞付着誘導層を含み、マイクロキャリアの表面に細胞付着誘導層を導入して培養液内でマイクロキャリアの浮遊度が調節可能であり、細胞を安定的に付着培養する効果を有することができる。

【0111】

前記細胞付着誘導層は、１ｎｍ～１０，０００ｎｍ、または１０ｎｍ～１０００ｎｍ、または５０ｎｍ～５００ｎｍ、または８０ｎｍ～２００ｎｍの層厚さを有することができ、前記細胞付着誘導層の層厚さは、前記マイクロキャリア全体の半径から内部の高分子マイクロ粒子の半径を引いた値により求められる。前記半径は、直径の１／２値を意味する。前記直径を測定する方法の例が大きく限定されるものではないが、一例を挙げると、共焦点蛍光顕微鏡、電子透過顕微鏡（ＴＥＭ）または断面ＩＲ、断面ＳＥＭイメージにより測定可能である。

【0112】

前記マイクロキャリアは、１μｍ～１，０００μｍ、または１０μｍ～１０００μｍ、または１００μｍ～１，０００μｍ、または１００μｍ～８００μｍの平均直径を有することができる。前記直径を測定する方法の例が大きく限定されるものではないが、一例を挙げると、光学顕微鏡により測定可能である。

【0113】

一方、前記高分子マイクロ粒子の半径と細胞付着誘導層の厚さとの比率は、１：０．００００１～１：０．１、または１：０．０００１～１：０．０１であってもよい。

【0114】

前記高分子マイクロ粒子の半径と細胞付着誘導層の厚さとの比率が１：０．００００１未満の場合、前記高分子マイクロ粒子に比べて細胞付着誘導層が過度に薄くて、細胞培養時に細胞とマイクロキャリアとの付着度が減少する恐れがあり、１：０．１を超える場合、前記高分子マイクロ粒子に比べて細胞付着誘導層が厚くなって、高分子マイクロ粒子の親水性度などの物性を変化させて分散性を低下させる問題が発生しうる。

【0115】

前記マイクロキャリアは、下記の数式で計算される細胞付着性が２０００％以上、または２５００％以上、または２９００％以上、または４０００％以下、または２０００％～４０００％、または２５００％～４０００％、または２９００％～４０００％であってもよい。

【0116】

［数式］
細胞付着性＝（マイクロキャリアを細胞培養液に投入して３７℃で７日間培養した後の細胞数／細胞培養液に最初に含まれる細胞数）×１００

【0117】

前記細胞培養液、細胞、培養条件については特に限定されず、従来知られた多様な細胞培養液、細胞、培養条件を制限なく適用可能である。そして、前記細胞数を測定する方法も特に限定されず、従来知られた多様な細胞数の測定方法を制限なく適用可能である。

【0118】

前記マイクロキャリアは、下記の数式で計算される細胞付着性が２０００％以上、または２５００％以上、または２９００％以上、または４０００％以下、または２０００％～４０００％、または２５００％～４０００％、または２９００％～４０００％を満足することによって、マイクロキャリアの細胞付着力が向上し、これによって、３次元的拡張培養により表面効率を増加させて付着性細胞の大量拡張が可能というメリットがある。

【0119】

これに対し、前記マイクロキャリアは、下記の数式で計算される細胞付着性が上述した範囲に及ばない場合、マイクロキャリアの表面の細胞付着力が弱くて、３次元的拡張培養が十分に行われにくい限界がある。

【0120】

一方、前記マイクロキャリアは、前記高分子マイクロ粒子の表面上に形成されたプライマー高分子層をさらに含むことができる。

【0121】

つまり、前記高分子マイクロ粒子の表面に、プライマー高分子層１種と細胞付着誘導層１種との混合層がさらに含まれる。プライマー高分子層１種と細胞付着誘導層１種との混合層においてこれらの積層順序は特に限定されず、プライマー高分子層上に細胞付着誘導層が積層された構造、あるいは細胞付着誘導層上にプライマー高分子層が積層された構造をすべて適用可能である。

【0122】

一方、前記プライマー高分子層は、前記高分子マイクロ粒子の表面に機能性高分子を導入できる粘着層の役割を果たし、これによって、マイクロキャリアの表面に細胞付着のための高分子層が効果的に導入され、培養中にも安定的に維持できるようにする。

【0123】

前記プライマー高分子層は、その例が大きく限定されるものではないが、水相接着を誘導できるカテコール誘導体として、Ｌ－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ポリドーパミン、ノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、およびこれらの誘導体からなる群より選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。

【0124】

前記マイクロキャリアは、細胞培養用マイクロキャリアであってもよい。

【0125】

２．細胞複合体
本発明の他の実施形態によれば、前記一実施形態のマイクロキャリア；および前記マイクロキャリアの表面上に付着した細胞；を含む、細胞複合体が提供される。前記マイクロキャリアに関する内容は、前記一実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。

【0126】

前記他の実施形態の細胞複合体は、細胞が安定的にマイクロキャリアと付着した状態で複合体を形成することによって、細胞生存率が高くかつ高い体内移植率を実現することができる。

【0127】

前記細胞は、付着性動物細胞にその例が大きく限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、肝細胞、ヒト由来臍帯血細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＭＤＣＫ、ベロ細胞（ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）など）、またはこれらの２種以上の混合物であってもよい。

【0128】

前記細胞の密度は、１．０２ｇ／ｃｍ^３以上１．１ｇ／ｃｍ^３未満であってもよい。

【0129】

前記細胞は、前記マイクロキャリアの表面上に付着できる。つまり、前記マイクロキャリアの表面に細胞が直接接触したり、あるいは前記マイクロキャリアの表面に接触したその他の層の表面に細胞が接触することができる。

【0130】

３．医療用組成物
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記一実施形態のマイクロキャリア、または前記他の実施形態の細胞複合体を含む医療用組成物が提供される。前記マイクロキャリアに関する内容は、前記一実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。前記細胞複合体に関する内容は、前記他の実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。

【0131】

前記薬学有効物質は、前記高分子マイクロ粒子内に含まれた状態で存在することができる。

【0132】

前記薬学有効物質の例は大きく限定されず、前記一実施形態の高分子マイクロ粒子の適用用途に応じて、当該用途に適した有効物質を制限なく適用可能である。つまり、前記薬学的有効物質の具体例は限定されず、アンフェタミニル（ａｍｐｅｔａｍｉｎｉｌ）、アレコリン（ａｒｅｃｏｌｉｎ）、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）、ブプラノロール（ｂｕｐｒａｎｏｌｏｌ）、ブプレノルフィン（ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ）、カプサイシン（ｃａｐｓａｉｃｉｎ）、カリソプロドール（ｃａｒｉｓｏｐｒｏｄｏｌ）、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、シクロピロクスオラミン（ｃｉｃｌｏｐｉｒｏｘ ｏｌａｍｉｎｅ）、コカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）、デシプラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）、ジクロニン（ｄｙｃｌｏｎｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、フルオキセチン（ｆｌｏｘｅｔｉｎｅ）、ヒドロモルヒネ（ｈｙｄｒｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）、イミプラミン（ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、メタンフェタミン（ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）、メルプロ酸（ｍｅｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、メチルフェニデート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｉｄａｔｅ）、モルヒネ（ｍｏｒｐｈｉｎｅ）、オキシブチニン（ｏｘｉｂｕｔｙｎｉｎ）、ナドロール（ｎａｄｏｌｏｌ）、ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）、ニトログリセリン（ｎｉｔｒｏｇｌｙｃｅｒｉｎ）、ピンドロール（ｐｉｎｄｏｌｏｌ）、プリロカイン（ｐｒｉｌｏｃａｉｎｅ）、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、スコポラミン（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）、セレギリン（ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）、ツロブテロール（ｔｕｌｏｂｕｔｅｒｏｌ）、バルプロ酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）などからなる群より選択される薬物、およびＥＰＯ（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）、インスリン、ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、エストロゲン、プロゲステロンパラサイロイドホルモン（ＰＴＨ）などからなる群より選択されるペプチドまたはタンパク質系の薬物などがあり、薬理効果が立証されたすべての薬理物質が制限なく適用可能である。

【0133】

前記薬学有効物質の添加量も大きく限定されず、適用用途と対象に応じて含有量を制限なく使用可能である。例えば、前記有効物質は、前記高分子マイクロ粒子１００重量部に対して０．０００１重量部以上１００００００重量部以下で、高分子マイクロ粒子に対して少量でも過剰量でも制限なく含まれる。

【0134】

４．美容組成物
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記一実施形態のマイクロキャリア、または前記他の実施形態の細胞複合体を含む美容組成物が提供される。前記マイクロキャリアに関する内容は、前記一実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。前記細胞複合体に関する内容は、前記他の実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。

【0135】

前記美容有効物質は、前記高分子マイクロ粒子内に含まれた状態で存在することができる。

【0136】

前記美容有効物質の例は大きく限定されず、前記一実施形態の高分子マイクロ粒子の適用用途に応じて、当該用途に適した有効物質を制限なく適用可能である。つまり、前記美容有効物質の具体例は限定されず、天然抽出物、タンパク質、ビタミン、酵素、抗酸化剤などがあり、美容効果が立証されたすべての物質が制限なく適用可能である。

【0137】

前記美容有効物質の添加量も大きく限定されず、適用用途と対象に応じて含有量を制限なく使用可能である。例えば、前記美容有効物質は、前記高分子マイクロ粒子１００重量部に対して０．０００１重量部以上１００００００重量部以下で、高分子マイクロ粒子に対して少量でも過剰量でも制限なく含まれる。

【0138】

５．医療用品
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記他の実施形態の医療用組成物を含む医療用品が提供される。前記医療用組成物に関する内容は、前記他の実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。

【0139】

前記医療用品の例が大きく限定されないが、本発明の特性が実現されるためには、体内に挿入されて使用されたり、あるいは長期間強度が維持されなければならない場合に適しており、例えば、体内補形物、体内挿入型薬物伝達体、経皮パッチ、創傷治療剤などが挙げられる。

【0140】

６．美容用品
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明は、前記他の実施形態の美容組成物を含む美容用品が提供される。前記美容組成物に関する内容は、前記他の実施形態において上述したすべての内容を含むことができる。

【0141】

前記美容用品の例が大きく限定されないが、本発明の特性が実現されるためには、例えば、美容クリーム、ローション、ヘアジェル、パックなどが挙げられる。

【0142】

前記美容パックの構造が大きく限定されるものではないが、例えば、支持体と、前記支持体上に形成され、前記他の実施形態の高分子マイクロ粒子を含む美容的有効物質伝達層とを含むことができる。前記支持体の例としては、織布、不織布、シリコーン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、金属網、ポリエステルなどが挙げられる。

【発明の効果】

【0143】

本発明によれば、優れた機械的強度および安定性を実現することができ、細胞脱着工程なしに３次元培養後すぐに体内注入が可能であり、付着性細胞に安定した環境を提供して細胞生存率が高くかつ高い体内移植率に寄与できるマイクロキャリア、これを含む細胞複合体、医療用組成物、美容組成物、医療用品および美容用品が提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0144】

【図1】実施例１の高分子マイクロ粒子に対する光学顕微鏡（ＯＭ）写真である。

【図2】実施例１の高分子マイクロ粒子のゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）に対するＩＲ写真である。

【図3】実施例１の高分子マイクロ粒子のゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）に対して相対化したヒアルロン酸の特性ピーク（１０８０ｃｍ^－１）に対するＩＲ写真である。

【発明を実施するための形態】

【0145】

発明を下記の実施例でより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。

【0146】

＜実施例：高分子マイクロ粒子および細胞培養用マイクロキャリアの製造＞
実施例１
（１）高分子マイクロ粒子の製造
０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液にヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）２００ｍｇを２ｗｔ．％で溶かし、蒸留水にゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）２５０ｍｇを２．５ｗｔ．％で溶かしたそれぞれの溶液１０ｍＬを混合して２０ｍＬを製造した後、これを鉄イオン（Ｆｅ^３＋）を含む化合物であるＦｅＣｌ_３が４ｇ添加されたエタノール溶液８０ｍＬに、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）機器を用いて形成された液滴を添加し、４℃で２時間架橋反応させた後、エタノールで洗浄して架橋粒子を製造した。

【0147】

０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を２０％含有している８０％エタノール溶液に１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を２．２ｇ混合した後、前記架橋粒子を添加し、常温で３日間架橋反応させて、高分子マイクロ粒子を製造した。製造された粒子をエタノール、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0148】

製造された高分子マイクロ粒子に対して撮影した光学顕微鏡（ＯＭ）写真を図１に示した。

【0149】

製造された高分子マイクロ粒子のゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）に対するＩＲ写真を図２に示した。ゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の差によりゼラチンが含まれている部分が明るく表示されて、ゼラチンが製造された高分子マイクロ粒子のシェルに分布することを確認した。

【0150】

製造された高分子マイクロ粒子のゼラチンの特性ピーク（１６５０ｃｍ^－１）に対して相対化したヒアルロン酸の特性ピーク（１０８０ｃｍ^－１）に対するＩＲ写真を図３に示した。ヒアルロン酸がゼラチンに対して高い相対量で含まれている部分が明るく表示されて、製造された高分子マイクロ粒子のコアに、ゼラチンと比較してヒアルロン酸が高い相対量で分布することを確認した。

【0151】

（２）細胞培養用マイクロキャリアの製造
回収された粒子をドーパミンが１ｍｇ／ｍＬで溶解したトリス緩衝液（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．０）に浸漬して、撹拌下、常温で２時間コーティングした。過剰のコーティング物質をエタノールで洗浄後、４５μｍのシーブ（ｓｉｅｖｅ）に粒子をろ過した後、細胞培養用マイクロキャリアとして使用した。

【0152】

実施例２
鉄イオン（Ｆｅ^３＋）を含む化合物であるＦｅＣｌ_３が４ｇ添加されたエタノール溶液の代わりに、アルミニウムイオン（Ａｌ^３＋）を含む化合物であるＡｌＣｌ_３が４ｇ添加されたエタノール溶液を用いたことを除き、前記実施例１と同様の方法で高分子マイクロ粒子および細胞培養用マイクロキャリアを製造した。

【0153】

実施例３
１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）２．２ｇの代わりに、５０％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）２．２ｇを添加したことを除き、前記実施例１と同様の方法で高分子マイクロ粒子および細胞培養用マイクロキャリアを製造した。

【0154】

＜比較例＞
比較例１：高分子マイクロ粒子の製造
ヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）およびゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）をそれぞれ蒸留水に２ｗｔ．％、２０ｗｔ．％で溶かして５ｍｌずつ製造した後、これら２つの溶液を混合した溶液を液体パラフィン溶液と混合して、マイクロエマルジョンを含む混合液を製造した。以後、前記混合液に、架橋剤として１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を２．２ｇ添加し、常温で５日間架橋反応させて、高分子マイクロ粒子を製造した。製造された粒子をアセトン、ジクロロメタン、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0155】

比較例２：高分子マイクロ粒子の製造
０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液にヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）を２ｗｔ．％で溶かし、蒸留水にゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）を２．５ｗｔ．％で溶かしたそれぞれの溶液１０ｍＬを混合して２０ｍＬを製造した後、これを鉄イオン（Ｆｅ^３＋）を含む化合物であるＦｅＣｌ_３が４ｇ添加されたエタノール溶液８０ｍＬに、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）機器を用いて形成された液滴を添加し、４℃で２時間架橋反応させた後、エタノールおよび蒸留水で洗浄して架橋粒子を製造した。製造された架橋粒子を篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0156】

比較例３：高分子マイクロ粒子の製造
ヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）２００ｍｇを０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に２ｗｔ．％の濃度で、ゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）２５０ｍｇを蒸留水に２．５ｗｔ．％の濃度でそれぞれ溶かして１０ｍｌずつ製造した後、これら２つの溶液を混合した溶液を液体パラフィン溶液と混合して、マイクロエマルジョンを含む混合液を製造した。以後、前記混合液に、架橋剤として１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を２．２ｇ添加し、常温で５日間架橋反応させた。これをアセトン、ジクロロメタン、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0157】

比較例４：高分子マイクロ粒子の製造
ヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）を０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に２ｗｔ．％の濃度で、ゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）を蒸留水に２．５ｗｔ．％の濃度でそれぞれ溶かして５ｍｌずつ製造した後、これら２つの溶液を混合した溶液を液体パラフィン溶液と混合して、マイクロエマルジョンを含む混合液を製造した。以後、前記混合液に、架橋剤として１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を２．２ｇ添加し、常温で５日間架橋反応させた。これをアセトン、ジクロロメタン、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0158】

比較例５：高分子マイクロ粒子の製造
ヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）およびゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）をそれぞれ蒸留水に２ｗｔ．％、２．５ｗｔ．％で溶かして５ｍｌずつ製造した後、これら２つの溶液を混合した溶液を液体パラフィン溶液と混合して、マイクロエマルジョンを含む混合液を製造した。以後、前記混合液に、架橋剤として１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を２．２ｇ添加し、常温で５日間架橋反応させた。これをアセトン、ジクロロメタン、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0159】

比較例６：高分子マイクロ粒子の製造
アルギネートおよびセルロースをそれぞれ蒸留水に２．５ｗｔ．％で溶かしたそれぞれの溶液１０ｍＬを混合して２０ｍＬを製造した後、これをカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）を含む化合物であるＣａＣｌ_２が４ｇ添加されたエタノール溶液８０ｍＬに、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）機器を用いて形成された液滴を添加し、常温で２時間架橋反応させた後、エタノールで洗浄して架橋粒子を製造した。

【0160】

０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を２０％含有している８０％エタノール溶液に１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－Ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を２．２ｇ混合した後、前記架橋粒子を添加し、常温で３日間架橋反応させて、高分子マイクロ粒子を製造した。製造された粒子をエタノール、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0161】

比較例７：高分子マイクロ粒子の製造
ヒアルロン酸塩（重量平均分子量：５００ｋＤａ）２００ｍｇを０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に２ｗｔ．％の濃度で、ゼラチン（ゲル強度：３００ｇ Ｂｌｏｏｍ）２５０ｍｇを蒸留水に２．５ｗｔ．％の濃度で溶かしたそれぞれの溶液１０ｍＬを混合して２０ｍＬを製造した後、これを鉄イオン（Ｆｅ^３＋）を含む化合物であるＦｅＣｌ_３が４ｇ添加されたエタノール溶液８０ｍＬに、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）（ＢＵＣＨＩ、Ｂ－３９０）機器を用いて形成された液滴を添加し、４℃で２時間架橋反応させた後、エタノールで洗浄して架橋粒子を製造した。

【0162】

前記架橋粒子をカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）を含む化合物であるＣａＣｌ_２が４ｇ添加されたエタノール溶液８０ｍＬに添加し、４℃で２時間架橋反応させた後、高分子マイクロ粒子を製造した。製造された粒子をエタノール、蒸留水の順に洗浄した後、篩目の大きさが４５μｍの網篩を用いて製造された架橋粒子を回収した。回収された架橋粒子を篩目の大きさが５００μｍの網篩でろ過して残った架橋粒子を分析した。

【0163】

比較例８：細胞培養用マイクロキャリアの製造
実施例１の（１）で得られた高分子マイクロ粒子を細胞培養用マイクロキャリアとして使用した。

【0164】

＜実験例１＞
前記実施例および比較例で製造された高分子マイクロ粒子に対して、次の方法で高分子マイクロ粒子の平均直径、球形化度、強度、細胞培養適合性、安定性を評価した。

【0165】

１．平均直径
前記実施例および比較例の高分子マイクロ粒子の蒸留水における平均直径は、レーザ粒度分析器（Ｈｏｒｉｂａ、Ｐａｒｔｉｃａ ＬＡ－９６０）装置を用いて測定した。

【0166】

２．球形化度
前記実施例および比較例の高分子マイクロ粒子の光学（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５３）写真を撮影し、これから球形化度を計算した。

【0167】

本発明による球形化度は、光学写真における任意の３０個の粒子の最も長い直径に対する最も短い直径の比率（長径比）の平均値として計算した。

【0168】

この時、球形化度値が１に近いほど球形に近いことを意味する。

【0169】

３．強度
前記実施例および比較例の高分子マイクロ粒子に対して、Ｔｅｘｔｕｒｅ ａｎａｌｙｚｅｒ装置を用いて、マイクロ粒子の強度を測定した。５Ｎロードセル（ｌｏａｄ ｃｅｌｌ）が装着された装置のｆｌａｔ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｐｒｏｂｅの下領域に、蒸留水で２４時間膨潤したマイクロ粒子３０個を単層として載せた。初期ｔｒｉｇｇｅｒ ｆｏｒｃｅは１ｍＮに設定し、１ｍｍ／ｓの速度で粒子を圧縮した。粒子平均直径の２５％水準に変形した時の力を圧縮力として定めた。

【0170】

平均圧縮強度は、前記圧縮力を測定対象のマイクロ粒子の個数である３０で割って計算した。

【0171】

４．細胞培養適合性
６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に細胞培養液を満たし、高分子マイクロ粒子と細胞を入れて、ｐｌａｔｅ－ｒｏｃｋｉｎｇ方式で細胞を培養した。この時、培養液の温度は３７℃を維持し、３日間培養して高分子マイクロ粒子で培養された細胞数を確認した。

【0172】

この時、細胞培養適合性は以下の基準で評価した。

【0173】

適合：投入された細胞数に対して培養された細胞数が１００％以上の場合
不適合：投入された細胞数に対して培養された細胞数が１００％未満であるか、培養中にマイクロ粒子が分解される場合

【0174】

５．安定性
高温高圧方式の滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）の使用により、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）溶液に含まれた高分子マイクロ粒子の滅菌処理時の安定性および長期間培養による粒子安定性を以下の基準で評価した。

【0175】

適合：滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）の使用前と後の乾燥した高分子マイクロ粒子の重量減少率２０％以下の場合
不適合：滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）の使用前と後の乾燥した高分子マイクロ粒子の重量減少率２０％超の場合

【0176】

【表1】

【0177】

前記表１に示されているように、実施例の高分子マイクロ粒子は、まず、投入された細胞数に対して培養された細胞数が１００％以上で細胞培養に適しているだけでなく、滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）処理前と後の乾燥した高分子マイクロ粒子の重量減少率２０％以下となって滅菌処理および長期間培養に適していることを確認することができた。それだけでなく、実施例の高分子マイクロ粒子は、平均圧縮強度が０．３７ｍＮ以上となって優れた機械的物性を実現すると同時に、高い架橋密度を示す粒子の比率が高いことを確認することができた。つまり、実施例の高分子マイクロ粒子は、細胞培養、滅菌処理および長期間培養に適していながらも、優れた架橋密度および機械的物性を実現することを確認した。これに対し、比較例１の高分子マイクロ粒子は、滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）処理前と後の乾燥した高分子マイクロ粒子の重量減少率２０％超となって滅菌処理および長期間培養に適さないだけでなく、平均圧縮強度が０．２３ｍＮとなって劣る機械的物性を示し、低い架橋密度を示す粒子の比率が高いことを確認することができた。

【0178】

そして、比較例２の高分子マイクロ粒子は、蒸留水洗浄段階で架橋されない高分子が溶解して粒子が収縮することが観察された。また、細胞培養中にマイクロ粒子が分解されて、投入された細胞数に対して培養された細胞数が１００％未満で細胞培養に適さないだけでなく、滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）処理前と後の乾燥した高分子マイクロ粒子の重量減少率２０％超過となって滅菌処理および長期間培養に適さないことを確認することができた。また、平均圧縮強度が０．１ｍＮとなって劣る機械的物性を示すことを確認することができた。

【0179】

また、比較例３～５の高分子マイクロ粒子は、比較例１とは異なり、生体適合性高分子を溶かした水溶液の濃度を実施例１と同一の水準に調節することによって、高分子マイクロ粒子が形成されず、実施例の場合に、低い生体適合性高分子濃度でも高分子マイクロ粒子の形成が可能であることを確認することができた。

【0180】

比較例６の高分子マイクロ粒子は、架橋剤による化学的架橋によって蒸留水状態で０．２９ｍＮの平均圧縮強度を示したが、生体適合性高分子として細胞付着性のないアルギネートとセルロースを使用することによって、細胞培養に適さないことを確認することができた。また、金属イオンとしてカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）を用いて架橋することによって、細胞培養液に存在するカルシウムイオンと可逆的に反応可能で、細胞培養時に粒子強度が低くなりうる。

【0181】

比較例７の高分子マイクロ粒子は、イオン架橋だけを経て製造されることによって、滅菌処理および細胞培養中に一部のマイクロ粒子が分解されて細胞培養に適さないことを確認することができた。

【0182】

＜実験例２＞
前記実施例１および比較例８で製造された細胞培養用マイクロキャリアに対して、次の方法で物性を測定し、表２に記載した。

【0183】

６．コーティング層の厚さ
細胞培養用マイクロキャリア内の高分子マイクロ粒子の表面に形成されたコーティング層の厚さは断面ＴＥＭイメージにより測定した。

【0184】

７．細胞付着性
１００ｍＬ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｗｈｅｅｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＰＢＳ社）に間葉系幹細胞（密度：１．０５ｇ／ｃｍ^３）を含む培養液を満たし、前記細胞培養用マイクロキャリアを培養液に注入して撹拌した。３７℃で７日間培養した後、細胞培養用マイクロキャリアで培養した細胞数を確認した。そして、下記の数式のように、初期投入された細胞数と比較してマイクロキャリアの細胞付着性を評価した。

【0185】

細胞付着性＝（マイクロキャリアを細胞培養液に投入して３７℃で７日間培養した後の細胞数／細胞培養液に最初に含まれる細胞数）×１００

【0186】

【表2】

【0187】

前記表２に示されているように、実施例１の細胞培養用マイクロキャリアは、高分子マイクロ粒子の表面に０．１μｍの細胞付着性物質コーティング層を含むことによって、細胞付着性が比較例８に比べて顕著に向上したことを確認することができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】