特表 2024-520035 細胞培養用マイクロキャリア、その製造方法、およびこれを用いた細胞培養組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】細胞培養用マイクロキャリア、その製造方法、およびこれを用いた細胞培養組成物

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240514BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12N5/07

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572938

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2023-11-24

(86)【国際出願番号】 KR2022014551

(87)【国際公開番号】W WO2023055068

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0128333

(32)【優先日】2021-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0112921

(32)【優先日】2022-09-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500239823

【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100122161

【弁理士】

【氏名又は名称】渡部 崇

(72)【発明者】

【氏名】ミンチェ・キム

(72)【発明者】

【氏名】ジ・ソン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ユンソプ・キム

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA21

4B029AA27

4B029BB11

4B029BB12

4B029DG08

4B029DG10

4B029GA08

4B029GB09

4B029GB10

4B065AA90X

4B065AB10

4B065AC20

4B065BB40

4B065BC41

4B065CA44

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；を含むポリスチレン系粒子を含む、細胞培養用マイクロキャリア、その製造方法、およびこれを用いた細胞培養組成物に関するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；を含むポリスチレン系粒子を含む、細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項2】

前記磁性粒子は、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を含む、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項3】

前記磁性粒子は磁性粒子表面に疎水性官能基を含む疎水性リガンドを含み、
前記疎水性リガンドは炭素数２～２０の脂肪酸またはその誘導体、および炭素数２～２０の脂肪酸アミンまたはその誘導体からなる群より選択された１種以上のリガンドを含む、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項4】

前記磁性粒子は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）およびスズ（Ｓｎ）からなる群より選択される１種以上の金属またはその酸化物を含む、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項5】

前記炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上の内部に磁性粒子が分散した状態で存在する、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項6】

前記マイクロキャリアの見掛け密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０５ｇ／ｃｍ^３以下である、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項7】

前記マイクロキャリアの平均直径が５０μｍ以上４００μｍ以下であり、
マイクロキャリアの比表面積が２００ｃｍ^２／ｇ以上１０００ｃｍ^２／ｇ以下である、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項8】

前記空隙の直径が０．１μｍ以上５μｍ以下である、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項9】

前記炭化水素オイルの密度が０．７５ｇ／ｃｍ^３以上０．８０ｇ／ｃｍ^３以下である、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項10】

前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下である、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項11】

前記炭化水素オイルは、炭素数１２以上５０以下である直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素化合物を含む、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項12】

前記ポリスチレン系粒子は、
炭素数１２以上である炭化水素オイル、磁性粒子およびスチレン単量体が含有された単量体組成物の懸濁重合反応結果物を含む、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項13】

前記単量体組成物は炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、
磁性粒子を０．０１重量部以上５重量部以下で含む、請求項１２に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項14】

前記単量体組成物は、スチレン単量体１重量部に対して、
エチレン系不飽和架橋剤を０．０３３重量部超３重量部未満で含む、請求項１２に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項15】

前記ポリスチレン系粒子表面に、プライマー高分子層、細胞付着誘導層、またはこれらの組み合わせ層がさらに含まれる、請求項１に記載の細胞培養用マイクロキャリア。

【請求項16】

炭素数１２以上である炭化水素オイルの存在下で、磁性粒子およびスチレン単量体が含有された単量体組成物の懸濁重合反応を行う段階を含む、細胞培養用マイクロキャリアの製造方法。

【請求項17】

前記磁性粒子は、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を含む、請求項１６に記載の細胞培養用マイクロキャリアの製造方法。

【請求項18】

細胞および請求項１から１５のいずれか一項に記載の細胞培養用マイクロキャリアを含む、細胞培養組成物。

【請求項19】

前記細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３、ベロ細胞（ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）、ＢＨＫ２１、ＭＤＣＫからなる群より選択された１種以上の化合物を含む、請求項１８に記載の細胞培養組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互引用
本出願は２０２１年９月２８日付韓国特許出願第１０－２０２１－０１２８３３３号、および２０２２年９月６日付韓国特許出願第１０－２０２２－０１１２９２１号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。

【0002】

本発明は、細胞培養用マイクロキャリア、その製造方法、およびこれを用いた細胞培養組成物に関するものである。

【背景技術】

【0003】

バイオ医薬品および再生医療分野が拡張されるにつれて、細胞、組織、微生物などを効率的に生産することができる細胞大量培養技術に対する要求が増大している。

【0004】

付着性を有する細胞は、３Ｄバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）内でマイクロキャリアを用いて培養される。バイオリアクター内に細胞、培養液、およびマイクロキャリアを入れ、培養液を攪拌して細胞およびマイクロキャリアを接触させることによって、細胞をマイクロキャリアの表面に付着させて培養することになる。この時使用するマイクロキャリアは細胞が付着して増殖できる高い表面積比率（ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ／ｖｏｌｕｍｅ）を提供するため、細胞の大量培養に適合する。

【0005】

現在商業的に用いられるマイクロキャリアは密度が約１．１～１．３ｇ／ｃｍ^３であり、細胞の密度は約１．２ｇ／ｃｍ^３程度である。この場合、バイオリアクター内で培養初期の細胞を付着するのには有利であるが、培養後細胞分離回収時、遠心分離が難しく、マイクロキャリアと細胞の大きさに基づいたフィルタリング方法を使用しなければならない。しかし、このような場合、フィルターが詰まるか工程時間が長くかかり、細胞の物理的損傷および汚染が発生しやすく、細胞の損失が発生することがある問題がある。

【0006】

したがって、細胞培養が可能なように低密度を有しながら、細胞培養後マイクロキャリアと細胞の分離回収時より容易に分離できる新たなマイクロキャリアの開発が要求されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、細胞培養が可能なように低密度を有しながら、細胞培養後マイクロキャリアと細胞の分離回収時より容易に分離できる細胞培養用マイクロキャリアを提供するためのものである。

【0008】

また、本発明は、前記細胞培養用マイクロキャリアの製造方法を提供するためのものである。

【0009】

また、本発明は、前記細胞培養用マイクロキャリアを用いた細胞培養組成物に関するものである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記課題を解決するために、本明細書では、炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；を含むポリスチレン系粒子を含む、細胞培養用マイクロキャリアを提供する。

【0011】

本明細書ではまた、炭素数１２以上である炭化水素オイルの存在下で、磁性粒子およびスチレン単量体が含有された単量体組成物の懸濁重合反応を行う段階を含む、細胞培養用マイクロキャリアの製造方法が提供される。

【0012】

本明細書ではまた、細胞および前記細胞培養用マイクロキャリアを含む、細胞培養組成物が提供される。

【0013】

以下、発明の具体的な実施形態による細胞培養用マイクロキャリア、その製造方法、およびこれを用いた細胞培養組成物についてより詳細に説明する。

【0014】

本明細書で明示的な言及がない限り、専門用語は単に特定の実施例を言及するためのものであり、本発明を限定することを意図しない。

【0015】

本明細書で使用される単数形態は、文句がこれと明確に反対の意味を示さない限り複数形態も含む。

【0016】

本明細書で使用される「含む」の意味は特定の特性、領域、整数、段階、動作、要素および／または成分を具体化し、他の特定の特性、領域、整数、段階、動作、要素、成分および／または群の存在や付加を除外させるのではない。

【0017】

そして、本明細書で「第１」および「第２」のように序数を含む用語は一つの構成要素を他の構成要素から区別する目的で使用され、前記序数によって限定されない。例えば、本発明の権利範囲内で第１構成要素は第２構成要素にも命名することができ、同様に第２構成要素は第１構成要素に命名することができる。

【0018】

以下、本発明をより詳しく説明する。

【0019】

発明の一実施形態によれば、炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；を含むポリスチレン系粒子を含む、細胞培養用マイクロキャリアが提供できる。

【0020】

本発明者らは、前記一実施形態の細胞培養用マイクロキャリアの場合、ポリスチレン系粒子内部に炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上が含まれて、細胞培養用マイクロキャリアの密度を下げることができるだけでなく、均質な球形形状のマイクロキャリアを高い収率で確保することができるという点を実験を通じて確認して発明を完成した。

【0021】

また、本発明者らは、前記一実施形態の細胞培養用マイクロキャリアの場合、磁性粒子が含まれて、細胞培養後マイクロキャリアと細胞の分離回収時、磁性を用いてより容易に分離精製することができるという点を実験を通じて確認して発明を完成した。

【0022】

具体的に、前記細胞培養用マイクロキャリアは、炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；を含むポリスチレン系粒子を含むことができる。即ち、前記ポリスチレン系粒子は、炭素数１２以上である炭化水素オイル１種、炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導された空隙１種、あるいはこれら２種の混合物を含むことができる。

【0023】

前記ポリスチレン系粒子が炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導された空隙１種を含むか、あるいは炭素数１２以上である炭化水素オイルおよび炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導された空隙を全て含む場合、前記ポリスチレン系粒子は多孔性ポリスチレン系粒子に該当し得る。

【0024】

前記ポリスチレン系粒子は、後述する他の実施形態の製造方法のように炭化水素オイル存在下で懸濁重合によってポリスチレン粒子合成を行って炭化水素オイルがポリスチレン粒子内部に閉じ込められた状態で残留し続けるか、高速の懸濁重合攪拌条件によって閉じ込められていた炭化水素オイルの一部あるいは全体が抜け出てポリスチレン粒子内部に空隙が形成され得る。

【0025】

前記空隙とはポリスチレン系粒子内部の空の空間を意味し、気孔、ハロー（ｈｏｌｌｏｗ）、孔、ボイド（ｖｏｉｄ）などの意味として使用できる。

【0026】

前記空隙は、炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導されたものであってもよい。具体的に、前記空隙は、炭素数１２以上である炭化水素オイルが懸濁重合の途中にポリスチレンと相分離されながら形成された空間に該当する。

【0027】

したがって、前記ポリスチレン系粒子が炭素数１２以上である炭化水素オイル１種のみを含むことは、重合過程で炭化水素オイルが完全に相分離されたが、重合および洗浄工程中に粒子外部に消失していないことを意味し、前記ポリスチレン系粒子が炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導された空隙１種のみを含むことは、重合過程で炭化水素オイルが完全に相分離されたが、重合および洗浄工程中に粒子外部に消失した状態を意味する。また、前記ポリスチレン系粒子が炭素数１２以上である炭化水素オイルおよび炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導された空隙を全て含むことは、炭化水素オイルが重合過程で一部相分離されて消失し、一部は残留する状態を意味する。

【0028】

具体的に、前記空隙の直径は０．１μｍ以上５μｍ以下であってもよい。より具体的に、前記空隙の直径は０．１μｍ以上、０．５μｍ以上、１μｍ以上であってもよく、５μｍ以下、４μｍ以下、３μｍ以下であってもよく、０．１μｍ以上５μｍ以下、０．５μｍ以上５μｍ以下、１μｍ以上５μｍ以下、０．１μｍ以上４μｍ以下、０．５μｍ以上４μｍ以下、１μｍ以上４μｍ以下、０．１μｍ以上３μｍ以下、０．５μｍ以上３μｍ以下、１μｍ以上３μｍ以下であってもよい。

【0029】

前記空隙の直径を測定する方法は大きく制限されないが、例えば、細胞培養用マイクロキャリアをエポキシに組み込み（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した後、イオンミリング（ｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ）を通じて断面を製造した後、粒子断面の形状をＳＥＭで確認して粒子内部空隙の直径を測定することができる。

【0030】

前述のように、前記空隙は炭素数１２以上である炭化水素オイルから誘導されたものであることにより、前記空隙の直径は０．１μｍ以上５μｍ以下で小さな大きさの空隙を実現することができ、これにより、マイクロキャリアの密度を容易に調節することができる。

【0031】

従来はポリスチレン粒子の密度を下げるためにポリスチレン重合過程中に低沸点の発泡剤を投入した後、追加発泡工程を通じて発泡スチレンを製造してきたが、このような場合、数十μｍの大きさの大きな空隙が形成されて、マイクロキャリアの密度調節が難しい。

【0032】

前記炭化水素オイルの炭素数は、１２以上、または１２以上５０以下、または１２以上１６以下であってもよい。前記炭化水素オイルの炭素数が１２未満に過度に減少するようになれば、懸濁重合中に炭化水素オイルとポリスチレンの相分離速度の減少によって粒子表面が均一でなく凹んだ形状の粒子が複数製造される限界がある。

【0033】

具体的に、前記炭化水素オイルは、炭素数１２以上５０以下の直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素化合物を含むことができる。前記炭素数１２以上５０以下の直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素化合物は単独または混合して使用することができ、前記炭素数１２以上５０以下の直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素化合物の例としては炭素数１２以上１６以下のノルマルアルカン、炭素数１２以上１６以下のイソアルカン、またはこれらの混合物が挙げられる。

【0034】

より具体的に、前記炭化水素オイルとしては炭素数１２のドデカン、炭素数１６のヘキサデカン、またはＩｓｏｐａｒ Ｍ（炭素数１２以上１４以下のイソアルカンと炭素数１３以上１６以下のイソアルカンの混合物）を使用することができる。

【0035】

前記炭化水素オイルは、スチレンモノマーを含む分散相組成物全体重量（１００％重量）を基準にして３０重量％以下、または１０重量％以上３０重量％以下で含むことができる。具体的に、前記炭化水素オイルの含量下限は１０重量％以上、または１１重量％以上、または１２重量％以上、または１３重量％以上、または１４重量％以上であり、その上限は例えば、３０重量％以下、または２５重量％以下、または２１重量％以下であってもよい。

【0036】

より具体的に、前記炭化水素オイルはスチレンモノマーを含む分散相組成物全体重量（１００％重量）を基準にして、１０重量％以上３０重量％以下、１１重量％以上３０重量％以下、１２重量％以上３０重量％以下、１３重量％以上３０重量％以下、１４重量％以上３０重量％以下、１０重量％以上２５重量％以下、１１重量％以上２５重量％以下、１２重量％以上２５重量％以下、１３重量％以上２５重量％以下、１４重量％以上２５重量％以下、１０重量％以上２０重量％以下、１１重量％以上２０重量％以下、１２重量％以上２０重量％以下、１３重量％以上２０重量％以下、１４重量％以上２０重量％以下で含まれてもよい。

【0037】

前記炭化水素オイルの含量が前記含量範囲未満で使用される場合、低密度特性のキャリア粒子を確保しにくく、前記含量範囲を過度に超過する場合、ポリスチレン系粒子の形状が球形を有しにくくなって製造される粒子の均一性が減少するようになる。

【0038】

前記炭化水素オイルの密度は０．７５ｇ／ｃｍ^３以上０．８０ｇ／ｃｍ^３以下、０．７５ｇ／ｃｍ^３以上０．７９５ｇ／ｃｍ^３以下、または０．７５ｇ／ｃｍ^３以上０．７９１ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。前記炭化水素オイルの密度が前述の範囲であって非常に低いため、これによってポリスチレン系粒子の密度を顕著に下げることができる。

【0039】

但し、前記炭化水素オイルの密度が０．７５ｇ／ｃｍ^３未満に過度に減少するようになれば、懸濁重合中に炭化水素オイルとポリスチレンの相分離速度の減少によって粒子表面が均一でなく凹んだ形状の粒子が多数製造される限界がある。

【0040】

前記マイクロキャリアの見かけ密度は０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０５ｇ／ｃｍ^３未満であってもよい。具体的に、前記マイクロキャリアの見掛け密度は０．９５ｇ／ｃｍ^３以上、０．９９ｇ／ｃｍ^３以上、０．９９５ｇ／ｃｍ^３以上、０．９９６ｇ／ｃｍ^３以上であってもよく、１．０５ｇ／ｃｍ^３未満、１．０４９ｇ／ｃｍ^３以下、１．０４ｇ／ｃｍ^３以下、１．０３ｇ／ｃｍ^３以下であってもよく、０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０５ｇ／ｃｍ^３未満、０．９９ｇ／ｃｍ^３以上１．０５ｇ／ｃｍ^３未満、０．９９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０５ｇ／ｃｍ^３未満、０．９９６ｇ／ｃｍ^３以上１．０５ｇ／ｃｍ^３未満、０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０４９ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９ｇ／ｃｍ^３以上１．０４９ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０４９ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９６ｇ／ｃｍ^３以上１．０４９ｇ／ｃｍ^３以下、０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０４ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９ｇ／ｃｍ^３以上１．０４ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０４ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９６ｇ／ｃｍ^３以上１．０４ｇ／ｃｍ^３以下、０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０３ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９ｇ／ｃｍ^３以上１．０３ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９５ｇ／ｃｍ^３以上１．０３ｇ／ｃｍ^３以下、０．９９６ｇ／ｃｍ^３以上１．０３ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。

【0041】

上述の低密度範囲を有することによって、細胞培養後マイクロキャリアと細胞を分離回収時、重力による沈降速度差を通じて細胞とマイクロキャリアを容易に分離することができる。

【0042】

前記マイクロキャリアの見掛け密度を測定する方法は大きく制限されないが、例えば、乾燥過程が完了した条件のマイクロキャリア試料を密度を調節したエタノール水溶液と蒸留水にそれぞれ添加して粒子が浮遊または沈降するか確認して見掛け密度を測定することができる。

【0043】

より具体的に、常温（２５℃）および常圧（１ａｔｍ）条件で乾燥過程が完了した条件のマイクロキャリア試料を、密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３、０．９７ｇ／ｃｍ^３、０．９８ｇ／ｃｍ^３または０．９９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液と、密度が１ｇ／ｃｍ^３である蒸留水（ＤＩＷ）にそれぞれ添加して、粒子が浮遊または沈降するか確認して見掛け密度を評価することができる。

【0044】

例えば、密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で浮遊する場合、マイクロキャリアの見掛け密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３未満であり、密度が１ｇ／ｃｍ^３である蒸留水（ＤＩＷ）で沈降する場合、マイクロキャリアの見掛け密度が１ｇ／ｃｍ^３超過であり、密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で沈降し、密度が１ｇ／ｃｍ^３である蒸留水（ＤＩＷ）で浮遊する場合、マイクロキャリアの見掛け密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１ｇ／ｃｍ^３未満であり、密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で沈降し、密度が０．９７ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で浮遊する場合、マイクロキャリアの見掛け密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３以上０．９７ｇ／ｃｍ^３未満であり、密度が０．９８ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で沈降し、密度が０．９９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で浮遊する場合、マイクロキャリアの見掛け密度が０．９８ｇ／ｃｍ^３以上０．９９５ｇ／ｃｍ^３未満であると評価することができる。

【0045】

前記マイクロキャリアの密度が１．０５ｇ／ｃｍ^３を超過する場合、細胞とマイクロキャリアの密度差が少なくて培養後細胞分離回収時に遠心分離が難しいことがあり、０．９５ｇ／ｃｍ^３未満の場合、培養初期にマイクロキャリアが培養液表面のみで浮遊して細胞を付着しにくい問題が発生することがある。

【0046】

前記実施形態の細胞培養用マイクロキャリアが適用される細胞は付着性動物細胞であって、その例が大きく限定されるのではないが、例えば、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、肝細胞、ヒト由来臍帯血細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＭＤＣＫ、ベロ細胞（ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）など）、またはこれらの２種以上の混合物であってもよい。

【0047】

前記細胞の密度は１．０２ｇ／ｃｍ^３以上１．１ｇ／ｃｍ^３未満であってもよい。

【0048】

また、前記細胞培養用マイクロキャリアと前記細胞の密度差が０．０２ｇ／ｃｍ^３以上０．２０ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。前記細胞培養用マイクロキャリアと前記細胞の密度差が０．０２ｇ／ｃｍ^３以上０．２０ｇ／ｃｍ^３以下であって密度差が大きく出なくても、前記磁性粒子を含むことによって細胞とマイクロキャリアを容易に分離することができる。

【0049】

一方、前記磁性粒子は、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を含むことができる。前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は、磁性粒子の表面に疎水性官能基が結合された磁性粒子を意味することができる。

【0050】

具体的に、表面処理とは、磁性粒子の凝集を防止し分散性を向上させるために、磁性粒子と疎水性官能基を含む化合物を反応させて磁性粒子の表面に疎水性官能基を結合させることを意味する。

【0051】

前記実施形態で、前記磁性粒子とは、磁気的性質を示す粒子を意味する。全ての物質は磁場（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ）と相互作用して引力（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）または斥力（ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）が発生する。即ち、物質に磁場を加えると磁化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）され、前記物体が磁化される様相によって強磁性体、常磁性体、反磁性体、フェリ磁性体などに区分される。

【0052】

前記磁性粒子は溶液合成、共同沈殿、ゾル－ゲル方法、高エネルギー粉砕、水熱合成、マイクロエマルジョン合成、熱分解による合成または、音波化学的合成によって製造できるが、これらに対し限定されるのではない。

【0053】

前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の直径は、０．１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であってもよい。即ち、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は、疎水性官能基で表面処理された磁性ナノ粒子であってもよい。

【0054】

前記ナノ粒子はナノメートル（ｎｍ）の大きさを有する粒子を意味する。ナノメートルの大きさとは、マイクロメートル（１０^－６）の大きさを１，０００分の１に縮小したものであって、物質の大きさがナノメートル水準に小さくなれば、多様で特異な物理的、化学的、機械的および電子的特性を示すようになる。

【0055】

磁性物質の大きさがナノメートルに小さくなるとそれぞれの粒子が磁気的単一区域を形成するようになり、このような粒子のコロイド溶液は各粒子の熱揺らぎ（ｔｈｅｒｍａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）によって磁気双極子の方向がそれぞれ不特定な方向に配向するようになって外形的に示される純磁気力（ｎｅｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）は「０」と示されるようになる。しかし、外部から内部の熱的エネルギーより大きい磁場を加えると、粒子の磁気双極子は一方向に整列するようになって磁性体に変わるようになる。

【0056】

前記磁性粒子の種類は大きく制限されず金属ナノ粒子を使用することができる。例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、およびスズ（Ｓｎ）からなる群より選択される１種以上の金属またはその酸化物を含むことができる。具体的に、前記磁性粒子は鉄（Ｆｅ）粒子を含むことができる。

【0057】

前記磁性粒子は、磁性粒子表面に疎水性官能基を含む疎水性リガンドを含むことができる。即ち、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は、磁性粒子表面に疎水性官能基を含有した疎水性リガンドを含むことができる。

【0058】

前記マイクロキャリアが疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を含むことにより、表面処理されていない磁性粒子を含むマイクロキャリアと比較して、金属粒子が独立分散して粒子の固まりが防止されるだけでなく酸化安定性が向上できる。

【0059】

前記リガンドは配位結合している化合物の中心金属イオンの周囲に結合している分子やイオンを意味し、錯化合物で中心金属原子に電子対を提供しながら配位結合を形成する原子または原子団を意味することができる。

【0060】

即ち、前記疎水性リガンドは、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の中心磁性粒子イオンの周囲に結合している疎水性分子または疎水性イオンを意味することができる。

【0061】

具体的に、前記疎水性リガンドは、炭素数２～２０の脂肪酸またはその誘導体および炭素数２～２０の脂肪酸アミンまたはその誘導体からなる群より選択された１種以上のリガンドを含むことができる。

【0062】

前記脂肪酸誘導体は脂肪酸イオンを含むことができ、脂肪酸アミン誘導体は脂肪酸アミンイオンを含むことができる。

【0063】

前記脂肪酸は炭化水素鎖およびその末端にはカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を含む化合物であって、炭化水素鎖は疎水性を有するが、末端のカルボキシル基を通じて親水性である物質と相互作用できる。前記脂肪酸は、不飽和脂肪酸または飽和脂肪酸であってもよい。

【0064】

前記不飽和脂肪酸は二重結合を１つ以上有している脂肪酸であって、末端にある－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ^－は磁性粒子表面に露出されている親水性基および／または磁性粒子の不飽和配位サイトなどと水素結合、イオン結合、共有結合などを形成することができる。

【0065】

前記不飽和脂肪酸が二重結合を含むことによって、不飽和脂肪酸の曲がった炭化水素鎖が磁性粒子の外側に配向されながら、疎水性チャンネルを形成することができる。

【0066】

即ち、前述の前記疎水性官能基は、炭素数２～２０の脂肪酸またはその誘導体、または炭素数２～２０の脂肪酸アミン、またはその誘導体に由来した炭化水素鎖を含むことができる。より具体的に、前記疎水性官能基は炭素数２～５０のアルキル基、または炭素数２～５０のアルケニル基を含むことができる。

【0067】

これにより、前記疎水性リガンドは、前記疎水性官能基とその末端に結合した－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ^－を含むことができる。

【0068】

前記炭素数２～２０の脂肪酸の種類は大きく制限されないが、例えば、オレイン酸、カプロン酸、ステアリン酸のうちのいずれか一つを含むことができる。

【0069】

また、前記炭素数２～２０の脂肪酸アミンの種類は大きく制限されないが、例えば、オレイルアミン、ブチルアミン、オクチルアミンのうちのいずれか一つを含むことができる。

【0070】

例えば、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は、図１に示されたような結合構造を有することができる。

【0071】

前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子製造時、炭素数２～２０の脂肪酸を塩基性水溶液に添加して、炭素数２～２０の脂肪酸イオンを形成した後、磁性ナノ粒子と反応させることによって炭素数２～２０の脂肪酸末端に含まれている－ＣＯＯ^－と磁性ナノ粒子の間の配位結合が図１のように形成できる。

【0072】

一方、前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。即ち、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。

【0073】

具体的に、前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上、５．１ｇ／ｃｍ^３以上、５．１５ｇ／ｃｍ^３以上または６ｇ／ｃｍ^３以下、５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５．５ｇ／ｃｍ^３以下、５．３ｇ／ｃｍ^３以下、または５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下、５ｇ／ｃｍ^３以上５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５ｇ／ｃｍ^３以上５．５ｇ／ｃｍ^３以下、５ｇ／ｃｍ^３以上５．３ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上５．５ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上５．３ｇ／ｃｍ^３以下、５．１５ｇ／ｃｍ^３以上５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５．１５ｇ／ｃｍ^３以上５．５ｇ／ｃｍ^３以下、５．１５ｇ／ｃｍ^３以上５．３ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。

【0074】

前述のように、前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下であることにより、炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を５重量部超で過度に添加する場合、密度の大きい磁性粒子を過量含むことによって粒子の全体的な密度が高まって培養器内で粒子が円滑に浮遊しないだけでなく細胞毒性を示すことがある。

【0075】

また、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の直径が１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下であってもよい。前記磁性粒子の直径測定方法は大きく制限されないが、例えば、動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）などを用いて測定することができる。

【0076】

具体的に、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の直径が１００ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、または２０００ｎｍ以下、１５００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、または１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上８００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上６００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上８００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上６００ｎｍ以下、または５００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上８００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上６００ｎｍ以下であってもよい。

【0077】

前記ポリスチレン系粒子は、炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；が内部に分散したポリスチレン系高分子を含むことができる。

【0078】

即ち、前記ポリスチレン系粒子は、ポリスチレン系高分子マトリックスと、前記ポリスチレン系高分子マトリックス内部に分散した炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上；および磁性粒子；を含むことができる。

【0079】

具体的に、前記細胞培養用マイクロキャリアは、前記炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上の内部に磁性粒子が分散した状態で存在し得る。

【0080】

前述のように、前記細胞培養用マイクロキャリアは、炭素数１２以上である炭化水素オイル、磁性粒子およびスチレン単量体が含まれている単量体組成物の懸濁重合反応結果物を含み、炭素数１２以上である炭化水素オイルが懸濁重合途中にポリスチレンと相分離されながら形成された空間である空隙を含むことができる。

【0081】

したがって、単量体組成物に磁性粒子が含まれることによって、炭素数１２以上である炭化水素オイル、またはこれから誘導された空隙のうちの少なくとも一つ以上の内部に磁性粒子が分散した状態で存在し得る。

【0082】

具体的に、前記ポリスチレン系粒子は、炭素数１２以上である炭化水素オイル、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子およびスチレン単量体が含まれている単量体組成物の懸濁重合反応結果物を含むことができる。

【0083】

前記単量体組成物は炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を０．０１重量部以上５重量部以下で含むことができる。具体的に、前記単量体組成物は炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を０．０１重量部以上、０．０２重量部以上、０．０４重量部以上で含むことができ、５重量部以下、４重量部以下で含むことができ、０．０１重量部以上５重量部以下、０．０２重量部以上５重量部以下、０．０２重量部以上４重量部以下、０．０４重量部以上４重量部以下で含むことができる。

【0084】

炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を０．０１重量部未満に過度に減少する場合、前記マイクロキャリアの磁性が十分に実現されなくて、細胞培養後マイクロキャリアと細胞の分離回収時、分離精製が容易でないだけでなく、回収工程が追加的に伴われて工程が複雑になる限界がある。

【0085】

反面、炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を５重量部超過で過度に添加する場合、密度の大きい磁性粒子を過量含むことによって粒子の全体的な密度が高まって培養器内で粒子が円滑に浮遊しないだけでなく細胞毒性を示すことがある。

【0086】

また、前記単量体組成物は、スチレン単量体１重量部に対してエチレン系不飽和架橋剤を０．０３３重量部超３重量部未満で含むことができる。

【0087】

具体的に、スチレン単量体１重量部に対して、エチレン系不飽和架橋剤を０．０３３重量部未満に過度に減少する場合、前記ポリスチレン系高分子の架橋密度が減少することにより炭化水素オイルによって生成された空隙が安定的に製造されにくくてポリスチレン系粒子の密度を十分に下げにくい限界がある。

【0088】

反面、スチレン単量体１重量部に対して、エチレン系不飽和架橋剤を３重量部以上に過度に増加する場合、前記ポリスチレン系高分子の架橋密度が増加しながら、ポリスチレン系粒子の全体的な密度が目標にした水準まで下がりにくい限界がある。

【0089】

また、前記単量体組成物全体重量に対して前記炭化水素オイルの含量が１０重量％以上３０重量％以下、または１４重量％以上２１重量％以下であってもよい。前記炭化水素オイルの含量が過度に減少する場合、炭化水素オイルが粒子内部に含浸される量が減少してポリスチレン系粒子の密度が十分に低まりにくい。また、前記炭化水素オイルの含量が過度に増加する場合、ポリスチレン系粒子の形状が球形を成しにくくなって製造される粒子の均一性が減少するようになる。

【0090】

前記エチレン系不飽和架橋剤の例としてはジビニルベンゼンが挙げられる。

【0091】

前記ポリスチレン系粒子の全体表面積を基準にして、前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積の比率が０．０１％未満であってもよい。前記ポリスチレン系粒子の全体表面積はポリスチレン系粒子の最外殻で空気中に露出された表面積の合計を意味し、前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積は前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアがポリスチレン系粒子の最外殻表面と接触する表面積の合計を意味する。また、前記マイクロポアとは、最大直径がマイクロメートルサイズである空隙であって、例えば１μｍ以上５００μｍ以下の最大直径を有する空隙を意味する。

【0092】

より具体的に、前記ポリスチレン系粒子の全体表面積を基準にして、前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積の比率は下記数式１を通じて求めることができる。

【0093】

［数式１］
前記ポリスチレン系粒子の全体表面積を基準にして、前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積の比率（％）＝［（前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積）／（前記ポリスチレン系粒子の全体表面積）］×１００

【0094】

前記ポリスチレン系粒子の全体表面積を基準にして、前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積の比率が０．０１％未満というのは、前記ポリスチレン系粒子の表面に存在するマイクロサイズポアが全くないか、殆どないと見ることができる程度に極めて少ないということを意味する。即ち、前記ポリスチレン系粒子表面にはマイクロポアが存在しないことがある。

【0095】

従来はポリスチレン粒子の密度を下げるために発泡剤を投入して発泡スチレンを製造してきたが、この場合、ポリスチレン粒子の直径範囲と密度範囲の分布が過度に広くなることにより細胞培養用マイクロキャリアとして適用可能な範囲の収率を確保するのに困難があった。

【0096】

反面、前記ポリスチレン系粒子は、前記ポリスチレン系粒子の全体表面積を基準にして、前記ポリスチレン系粒子表面に存在するマイクロポアと接触する前記ポリスチレン系粒子の表面積の比率が０．０１％未満であるので、従来の発泡スチレンと異なり発泡剤による発泡工程が全く行われなくて、ポリスチレン粒子の直径範囲と密度範囲の分布をより精密に調節することができる長所がある。

【0097】

前記マイクロキャリアの平均直径が５０μｍ以上４００μｍ以下であってもよい。

【0098】

具体的に、前記マイクロキャリアの平均直径は５０μｍ以上、７５μｍ以上、１００μｍ以上、１２０μｍ以上、または４００μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、または５０μｍ以上４００μｍ以下、５０μｍ以上３００μｍ以下、５０μｍ以上２５０μｍ以下、５０μｍ以上２００μｍ以下、５０μｍ以上４００μｍ以下、７５μｍ以上３００μｍ以下、７５μｍ以上２５０μｍ以下、７５μｍ以上２００μｍ以下、１００μｍ以上４００μｍ以下、１００μｍ以上３００μｍ以下、１００μｍ以上２５０μｍ以下、１００μｍ以上２００μｍ以下、１２０μｍ以上４００μｍ以下、１２０μｍ以上３００μｍ以下、５０μｍ以上１２０μｍ以下、５０μｍ以上１２０μｍ以下であってもよい。前記マイクロキャリアの平均直径が上述の範囲を満足する場合、細胞付着および培養性能に優れる。一方、前記マイクロキャリアの平均直径が５０μｍ未満である場合、細胞培養の可能な表面積が小さくて培養効率が低下する問題点が発生する恐れがあり、４００μｍ超過である場合、付着細胞間相互作用が低下し、培養器内細胞密度が下がって、細胞培養効率が低下する問題が発生することがある。

【0099】

前記マイクロキャリアの直径は前記マイクロキャリアの重心点を通過する直線がマイクロキャリアの最外殻表面と接する二地点間の距離を意味し、前記マイクロキャリアの平均直径は光学顕微鏡を通じて前記細胞培養用マイクロキャリアに含まれる全体粒子の直径を確認して求めることができる。また、前記マイクロキャリアの平均粒径は、前記マイクロキャリアの製造過程で得られる全体マイクロキャリアの直径やこれらの平均直径を通じても確認可能である。

【0100】

前記マイクロキャリアは５０μｍ以上４００μｍ以下の平均直径を有する個別粒子の群（ｇｒｏｕｐ）であってもよく、このような群（ｇｒｏｕｐ）に含まれる個別微粒子は平均的に５０μｍ以上４００μｍ以下の直径を有することができる。より具体的に、前記群（ｇｒｏｕｐ）に含まれる個別微粒子の９５％、または９９％が５０μｍ以上４００μｍ以下の直径を有することができる。

【0101】

また、前記マイクロキャリアは、比表面積が２００ｃｍ^２／ｇ以上１０００ｃｍ^２／ｇ以下であってもよい。具体的に、前記マイクロキャリアは比表面積が２００ｃｍ^２／ｇ以上、３００ｃｍ^２／ｇ以上、３３０ｃｍ^２／ｇ以上、３５０ｃｍ^２／ｇ以上であってもよく、１０００ｃｍ^２／ｇ以下、５００ｃｍ^２／ｇ以下、４５０ｃｍ^２／ｇ以下であってもよく、２００ｃｍ^２／ｇ以上１０００ｃｍ^２／ｇ以下、３００ｃｍ^２／ｇ以上１０００ｃｍ^２／ｇ以下、３００ｃｍ^２／ｇ以上５００ｃｍ^２／ｇ以下、３００ｃｍ^２／ｇ以上４５０ｃｍ^２／ｇ以下、３３０ｃｍ^２／ｇ以上４５０ｃｍ^２／ｇ以下、３５０ｃｍ^２／ｇ以上４５０ｃｍ^２／ｇ以下であってもよい。

【0102】

前記比表面積の測定方法は大きく制限されないが、例えば見掛け密度から、下記数式を用いてマイクロキャリアの比表面積を計算することができる。

【0103】

［数式］
マイクロキャリアの比表面積（ｃｍ^２／ｇ）＝３／（ｒ×ρ）

【0104】

上記数式中、ｒはマイクロキャリアの平均半径を意味し、ρはマイクロキャリアの見掛け密度を意味する。

【0105】

前記ポリスチレン系粒子表面に、プライマー高分子層、細胞付着誘導層、またはこれらの組み合わせ層がさらに含まれてもよい。即ち、前記ポリスチレン系粒子表面に、プライマー高分子層１種、細胞付着誘導層１種、またはプライマー高分子層１種と細胞付着誘導層１種の混合層がさらに含まれてもよい。プライマー高分子層１種と細胞付着誘導層１種の混合層でこれらの積層順序は特に限定されず、プライマー高分子層上に細胞付着誘導層が積層された構造、あるいは細胞付着誘導層上にプライマー高分子層が積層された構造を全て適用可能である。

【0106】

一方、前記プライマー高分子層は官能基がないポリスチレン系粒子表面に機能性高分子を導入することができる粘着層の役割を果たし、これによってマイクロキャリア表面に細胞付着のための高分子層が効果的に導入され培養中にも安定的に維持されるようにする。

【0107】

前記プライマー高分子層はその例が大きく限定されるのではないが、水相接着を誘導することができるカテコール誘導体であってＬ－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ポリドーパミン、ノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、およびこれらの誘導体からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことができる。

【0108】

一方、前記細胞付着誘導層は細胞付着性物質から構成され、これらは細胞の膜貫通タンパク質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合できる場所を提供する役割を果たして、付着性細胞が安定的に付着、スプレディング（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）および培養されるようにする。

【0109】

前記細胞付着誘導層を形成する高分子はその例が大きく限定されるのではないが、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）キトサン、ポリドーパミン、ポリＬ－リシン、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＲＧＤを含むペプチド、ＲＧＤを含むアクリル系高分子、リグニン（ｌｉｇｎｉｎ）、陽イオン性デキストランおよびこれらの誘導体からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことができる。

【0110】

一例として、前記マイクロキャリアはポリスチレン系粒子の表面に形成されるプライマー高分子層を含んで、マイクロキャリアの表面を親水性に改質することを通じて水分散され、前記プライマー高分子層表面に細胞付着誘導層を導入して培養液内でマイクロキャリアの浮遊度が調節でき、細胞を安定的に付着培養する効果を有することができる。

【0111】

一方、前記ポリスチレン系粒子の半径とプライマー高分子層の厚さの比率は１：０．００００１～１：０．０１、または１：０．０００１～１：０．００１であってもよい。

【0112】

ポリスチレン系粒子の半径と表面コーティング層の厚さの比率が１：０．００００１未満である場合、ポリスチレン系粒子に対比してプライマー高分子層が過度に薄くてマイクロキャリア表面が親水性に改質する効果が微小であり、１：０．０１を超過する場合、ポリスチレン系粒子に対比してプライマー高分子層が厚くなって、細胞培養時、細胞とマイクロキャリアの付着度が減少する恐れがある。

【0113】

発明の他の実施形態によれば、炭素数１２以上である炭化水素オイルの存在下で、磁性粒子およびスチレン単量体が含有された単量体組成物の懸濁重合反応を行う段階を含む、細胞培養用マイクロキャリアの製造方法を提供することができる。

【0114】

前記炭化水素オイル、磁性粒子、スチレン単量体に関する内容は前記一実施形態で前述した内容を全て含む。即ち、前記磁性粒子は疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を含むことができる。

【0115】

前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は、磁性粒子の表面に疎水性官能基が結合された磁性粒子を意味することができる。

【0116】

具体的に、表面処理とは、磁性粒子の凝集を防止し分散性を向上させるために、磁性粒子と疎水性官能基を含む化合物を反応させて磁性粒子の表面に疎水性官能基を結合させることを意味する。

【0117】

前記実施形態で、前記磁性粒子とは、磁気的な性質を示す粒子を意味する。全ての物質は磁場（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ）と相互作用して引力（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）または、斥力（ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）が発生する。即ち、物質に磁場を加えると磁化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）され、前記物体が磁化される様相によって強磁性体、常磁性体、反磁性体、フェリ磁性体などに区分される。

【0118】

前記磁性粒子は溶液合成、共同沈殿、ゾル－ゲル方法、高エネルギー粉砕、水熱合成、マイクロエマルジョン合成、熱分解による合成または音波化学的合成によって製造することができるが、これらに限定されるのではない。

【0119】

前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の直径は０．１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であってもよい。即ち、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は疎水性官能基で表面処理された磁性ナノ粒子であってもよい。

【0120】

前記ナノ粒子はナノメートルの大きさを有する粒子を意味する。ナノメートルの大きさとはマイクロメートル（１０^－６）の大きさを１，０００分の１に縮小したものであって、物質の大きさがナノメートル水準に小さくなると多様で特異な物理的、化学的、機械的および電子的特性を示すことになる。

【0121】

磁性物質の大きさがナノメートルに小さくなるとそれぞれの粒子が磁気的単一区域を形成するようになり、このような粒子のコロイド溶液は各粒子の熱揺らぎ（ｔｈｅｒｍａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）によって磁気双極子の方向がそれぞれ不特定の方向に配向するようになって外形的に現れる純磁気力（ｎｅｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）は「０」として現れるようになる。しかし、外部から内部の熱的エネルギーより大きい磁場を加えると、粒子の磁気双極子は一方向に整列するようになって磁性体に変わるようになる。

【0122】

前記磁性粒子の種類は大きく制限されず、金属ナノ粒子を使用することができる。例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）およびスズ（Ｓｎ）からなる群より選択される１種以上の金属またはその酸化物を含むことができる。具体的に、前記磁性粒子は鉄（Ｆｅ）粒子を含むことができる。

【0123】

前記磁性粒子は、磁性粒子表面に疎水性官能基を含有した疎水性リガンドを含むことができる。即ち、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は磁性粒子表面に疎水性官能基を含有した疎水性リガンドを含むことができる。

【0124】

前記マイクロキャリアの製造方法が疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を含むことにより、表面処理されていない磁性粒子を含む場合と比較して、最終製造されるマイクロキャリア上で金属粒子が独立分散して粒子の固まりが防止されるだけでなく酸化安定性が向上できる。

【0125】

前記リガンドは配位結合している化合物の中心金属イオンの周囲に結合している分子やイオンを意味し、錯化合物で中心金属原子に電子対を提供しながら配位結合を形成する原子または原子団を意味することができる。

【0126】

即ち、前記疎水性リガンドは、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の中心磁性粒子イオンの周囲に結合している疎水性分子または疎水性イオンを意味することができる。

【0127】

具体的に、前記疎水性リガンドは、炭素数２～２０の脂肪酸またはその誘導体、または炭素数２～２０の脂肪酸アミン、またはその誘導体を含むことができる。

【0128】

前記脂肪酸誘導体は脂肪酸イオンを含むことができ、脂肪酸アミン誘導体は脂肪酸アミンイオンを含むことができる。

【0129】

前記脂肪酸は炭化水素鎖およびその末端にはカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を含む化合物であって、炭化水素鎖は疎水性を有するが末端のカルボキシル基を通じて親水性である物質と相互作用できる。前記脂肪酸は不飽和脂肪酸または飽和脂肪酸であってもよい。

【0130】

前記不飽和脂肪酸は二重結合を１つ以上有している脂肪酸であって、末端にある－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ^－は磁性粒子表面に露出されている親水性基および／または磁性粒子の不飽和配位サイトなどと水素結合、イオン結合、共有結合などを形成することができる。

【0131】

前記不飽和脂肪酸が二重結合を含むことにより、不飽和脂肪酸の曲がった炭化水素鎖が磁性粒子の外側に配向されながら、疎水性チャンネルを形成することができる。

【0132】

即ち、前述の前記疎水性官能基は、炭素数２～２０の脂肪酸またはその誘導体、または炭素数２～２０の脂肪酸アミン、またはその誘導体に由来した炭化水素鎖を含むことができる。より具体的に、前記疎水性官能基は、炭素数２～５０のアルキル基、または炭素数２～５０のアルケニル基を含むことができる。

【0133】

これにより、前記疎水性リガンドは、前記疎水性官能基とその末端に結合した－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ^－を含むことができる。

【0134】

前記炭素数２～２０の脂肪酸の種類は大きく制限されないが、例えば、オレイン酸、カプロン酸、ステアリン酸のうちのいずれか一つを含むことができる。

【0135】

また、前記炭素数２～２０の脂肪酸アミンの種類は大きく制限されないが、例えば、オレイルアミン、ブチルアミン、オクチルアミンのうちのいずれか一つを含むことができる。

【0136】

例えば、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子は、図１に示されているような結合構造を有することができる。

【0137】

前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子製造時、炭素数２～２０の脂肪酸を塩基性水溶液に添加して、炭素数２～２０の脂肪酸イオンを形成した後、磁性ナノ粒子と反応させることにより、炭素数２～２０の脂肪酸末端に含まれている－ＣＯＯ^－と磁性ナノ粒子の間の配位結合が図１のように形成できる。

【0138】

一方、前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。即ち、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。

【0139】

具体的に、前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上、５．１ｇ／ｃｍ^３以上、５．１５ｇ／ｃｍ^３以上、または６ｇ／ｃｍ^３以下、５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５．５ｇ／ｃｍ^３以下、５．３ｇ／ｃｍ^３以下、または５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下、５ｇ／ｃｍ^３以上５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上５．８ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上５．５ｇ／ｃｍ^３以下、５．１ｇ／ｃｍ^３以上５．３ｇ／ｃｍ^３以下、５．１５ｇ／ｃｍ^３以上５．３ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。

【0140】

前述のように、前記磁性粒子の密度が５ｇ／ｃｍ^３以上６ｇ／ｃｍ^３以下であることにより、炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を５重量部超で過度に添加する場合、密度の大きい磁性粒子を過量含むことにより、粒子の全体的な密度が高まって培養器内で粒子が円滑に浮遊しないだけでなく細胞毒性を示すことがある。

【0141】

また、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の直径が１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下であってもよい。

【0142】

具体的に、前記疎水性官能基で表面処理された磁性粒子の直径が１００ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、または２０００ｎｍ以下、１５００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、または１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上８００ｎｍ以下、１００ｎｍ以上６００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上８００ｎｍ以下、３００ｎｍ以上６００ｎｍ以下、または５００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上８００ｎｍ以下、５００ｎｍ以上６００ｎｍ以下であってもよい。

【0143】

前記単量体組成物は、炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を０．０１重量部以上５重量部以下で含むことができる。具体的に、前記単量体組成物は、炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を０．０１重量部以上、０．０２重量部以上、０．０４重量部以上で含むことができ、５重量部以下、４重量部以下で含むことができ、０．０１重量部以上５重量部以下、０．０２重量部以上５重量部以下、０．０２重量部以上４重量部以下、０．０４重量部以上４重量部以下で含むことができる。

【0144】

炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を０．０１重量部未満に過度に減少する場合、前記マイクロキャリアの磁性が十分に実現されなくて、細胞培養後マイクロキャリアと細胞の分離回収時、分離精製が容易でないだけでなく、回収工程が追加的に伴われて工程が複雑になる限界がある。

【0145】

反面、炭素数１２以上である炭化水素オイル１００重量部に対して、磁性粒子を５重量部超で過度に添加する場合、密度の大きい磁性粒子を過量含むことにより粒子の全体的な密度が高まって培養器内で粒子が円滑に浮遊しないだけでなく細胞毒性を示すことがある。

【0146】

また、前記単量体組成物は、スチレン単量体１重量部に対してエチレン系不飽和架橋剤を０．０３３重量部超３重量部未満で含むことができる。

【0147】

具体的に、スチレン単量体１重量部に対して、エチレン系不飽和架橋剤０．０３３重量部未満に過度に減少する場合、前記ポリスチレン系高分子の架橋密度が減少することにより炭化水素オイルによって生成された空隙が安定的に製造されにくくてポリスチレン系粒子の密度を十分に下げにくい限界がある。

【0148】

反面、スチレン単量体１重量部に対して、エチレン系不飽和架橋剤３重量部以上に過度に増加する場合、前記ポリスチレン系高分子の架橋密度が増加しながら、ポリスチレン系粒子の全体的な密度が目標にした水準まで下がりにくい限界がある。

【0149】

また、前記単量体組成物全体重量に対して前記炭化水素オイルの含量が１０重量％以上３０重量％以下、または１４重量％以上２１重量％以下であってもよい。前記炭化水素オイルの含量が過度に減少する場合、炭化水素オイルが粒子内部に含浸される量が減少してポリスチレン系粒子の密度が十分に下がりにくい。また、前記炭化水素オイルの含量が過度に増加する場合、ポリスチレン系粒子の形状が球形を有しにくくなって製造される粒子の均一性が減少するようになる。

【0150】

より具体的に、前記単量体組成物の懸濁重合反応は、前記単量体組成物を水系分散液に混合しせん断力を加えて前記単量体組成物を水系分散液に液滴形態に均質化する段階；および前記均質化された単量体組成物を３００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下の攪拌速度で懸濁重合する段階を含むことができる。

【0151】

前記均質化された単量体組成物を３００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下、または４００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍ以下の攪拌速度で懸濁重合する段階でポリスチレンと炭化水素オイルの粒子構造形成中にポリスチレンと炭化水素オイルの相分離によって内部空隙を形成しながら細胞培養用マイクロキャリアの密度をより下げることができながらも、球形粒子比率の高い細胞培養用マイクロキャリア製造が可能である。

【0152】

前記均質化された単量体組成物を３００ｒｐｍ以上１０００ｒｐｍ以下、または４００ｒｐｍ以上８００ｒｐｍ以下の攪拌速度で懸濁重合する段階で前記懸濁重合条件の例が大きく限定されるのではないが、例えば、５０℃以上１００℃の温度で３時間以上１８時間以下で行うことができる。

【0153】

一方、前記細胞培養用マイクロキャリアの製造方法は、前記懸濁重合反応を行う段階以後に、懸濁重合反応結果物を洗浄する段階および乾燥する段階をさらに含むことができる。

【0154】

具体的に、前記懸濁重合反応結果物を洗浄する段階は、懸濁重合反応結果物を１０μｍ以上１００μｍ以下のシーブ（ｓｉｅｖｅ）にかけた後、エタノール１００％および／または５０℃以上８０℃以下の高温の蒸留水に５－７回常温攪拌する段階を含むことができる。

【0155】

前記懸濁重合反応結果物を乾燥する段階は、真空オーブンに入れて常温で真空乾燥する段階を含む。但し、これに限定されるのではなく、通常使用されると知られた乾燥方法を別段の制限なく使用することができる。

【0156】

一方、前記他の実施形態の細胞培養用マイクロキャリアの製造方法は、前記懸濁重合反応を行う段階以後に、前記懸濁重合反応結果物の表面にプライマー高分子層、細胞付着誘導層、またはこれらの組み合わせ層を塗布する段階をさらに含むことができる。

【0157】

前記プライマー高分子層、細胞付着誘導層に関する内容は前記一実施形態で前述した内容を全て含む。

【0158】

発明のまた他の実施形態によれば、細胞および前記一実施形態の細胞培養用マイクロキャリアを含む細胞培養組成物を提供することができる。前記細胞培養用マイクロキャリアに関する内容は前記一実施形態で前述した内容を全て含む。

【0159】

前記細胞は付着性動物細胞であって、その例が大きく限定されるのではないが、例えば、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、肝細胞、ヒト由来臍帯血細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＭＤＣＫ、ベロ細胞（ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）など）、またはこれらの２種以上の混合物であってもよい。

【0160】

前記細胞の密度は、１．０２ｇ／ｃｍ^３以上１．１ｇ／ｃｍ^３未満であってもよい。

【0161】

また、前記細胞培養用マイクロキャリアと前記細胞の密度差が０．０２ｇ／ｃｍ^３以上０．２０ｇ／ｃｍ^３以下であってもよい。前記細胞培養用マイクロキャリアと前記細胞の密度差が０．０２ｇ／ｃｍ^３以上０．２０ｇ／ｃｍ^３以下であって密度差が大きく出なくても、磁性粒子を含むことにより細胞とマイクロキャリアを容易に分離することができる。

【0162】

前記細胞培養組成物は、培地溶液をさらに含むことができる。前記培地溶液は血しょうやリンパ液などの体液に基づいた生体の条件に近い栄養分とｐＨ、温度、浸透圧などの環境条件を十分に満足させるための各種添加剤を含むことができ、これは細胞培養関連技術分野で広く知られた多様な物質を制限なく使用することができる。

【0163】

一例として、前記一実施形態の細胞培養用マイクロキャリアは培地溶液より小さい密度を有して、培地溶液内に注入されて攪拌条件下で培地溶液内部で浮遊するようになる。その後、低密度のマイクロキャリアの表面に付着される細胞の数が増加することによって、細胞が付着されたマイクロキャリア（以下、「マイクロキャリア－細胞結合体」という）の密度は次第に増加して培地溶液内で次第に沈むようになる。

【0164】

よって、細胞が付着されたマイクロキャリア（マイクロキャリア－細胞結合体）を細胞脱着酵素添加処理後、遠心分離を通じて分離して、マイクロキャリア－細胞結合体から細胞を分離させることによって培養された細胞を容易に確保することができる。

【発明の効果】

【0165】

本発明によれば、細胞培養が可能なように低密度を有しながら、細胞培養後マイクロキャリアと細胞の分離回収時より容易に分離することができる細胞培養用マイクロキャリア、その製造方法、およびこれを用いる細胞培養方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0166】

【図1】疎水性官能基で表面処理された磁性粒子を示したものである。

【図2】実施例１から得られた細胞培養用マイクロキャリアのＳＥＭイメージを示したものである。

【図3】実施例１から得られた細胞培養用マイクロキャリアの粒子断面形状ＳＥＭイメージを示したものである。

【図4】実施例１から得られた細胞培養用マイクロキャリアの粒子表面形状ＳＥＭイメージを示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0167】

発明を下記の実施例でより詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。

【実施例】

【0168】

＜製造例：磁性粒子の製造＞
蒸留水１３０ｍｌにＦｅ^３＋（Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ） ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、５．４１ｇ）およびＦｅ^２＋塩（ｓａｌｔ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ） ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ、１．９８ｇ）を添加して４００～６００ｒｐｍで攪拌して磁性粒子水溶液を製造した。

【0169】

オレイン酸（２ｇ）およびアセトン１３ｍｌを混合した後、前記磁性粒子水溶液に添加した。

【0170】

３０分間攪拌した後、水酸化アンモニウム水溶液（固形分含量２５ｗｔ％）１５ｍｌを徐々に添加した。

【0171】

８０℃～９０℃に昇温して１時間以上攪拌した後、６５℃～７５℃に温度を下げ、１ Ｎ ＨＣｌを反応物のｐＨが２になるまで添加した。

【0172】

最終反応物のｐＨが７になるまで蒸留水で洗浄した後、常温で２日以上乾燥して表面処理された磁性粒子（粒子直径：５００～６００ｎｍ、粒子密度：５．１５ｇ／ｃｍ^３）を製造した。前記磁性粒子の直径は動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を用いて測定した。

【0173】

前記磁性粒子の密度（真密度；ｔｒｕｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）はピクノメータ（ｐｙｃｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定した。

【0174】

＜実施例：細胞培養用マイクロキャリアの製造＞
実施例１
（１）分散相（ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ ｐｈａｓｅ）の製造
下記表１に記載された含量でスチレンモノマー（ｓｔｙｒｅｎｅ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｓｔ）、架橋剤であるジビニルベンゼン（ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｚｅｎｅ、ＤＶＢ）、前記製造例の磁性粒子および低密度オイル（Ｉｓｏｐａｒ Ｍ、密度０．７９１ｇ／ｃｍ^３）の混合物を１００ｍｌバイアルで攪拌した。その後、熱開始剤であるベンゾイルペルオキシド（ｂｅｎｚｏｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ、ＢＰＯ、２．１重量％）とｔｅｒｔ－ブチルペルオキシベンゾエート（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｐｅｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、ｔ－ＢＰ、０．３重量％）をバイアルに追加投入し、５分～１０分間常温で攪拌した。各成分間含量は表１に記載した。

【0175】

（２）連続相（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｈａｓｅ）の製造
重量平均分子量が８５，０００～１２５，０００範囲内であり、加水分解率が８７～８９％であるＰＶＡ６ｇを蒸留水６００ｇに溶解した。詳しい含量は表１のとおりである。

【0176】

（３）懸濁重合による粒子製造
６００ｇの１％ＰＶＡ水溶液を分散相と混合して均一分散液になるまでオイルバス（ｏｉｌ ｂａｔｈ）内で攪拌した。具体的に、常温で４００～５００ｒｐｍで攪拌しながらオイルバスを次第に昇温させ、８０℃～９０℃の温度および４００～６００ｒｐｍ速度条件下で懸濁重合を行った。前記重合は窒素パージ下で実施した。

【0177】

（４）粒子収得
反応４時間後、４５μｍのシーブ（ｓｉｅｖｅ）を通じて製造された粒子を回収し、エタノールで３回、７０℃以上８０℃以下の高温蒸留水で３回洗浄した後、８０℃オーブンで乾燥した。

【0178】

（５）粒子表面処理
重合後、常温乾燥した粒子をドーパミン塩酸塩（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が１ｍｇ／ｍＬで溶解されたトリス緩衝液（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．０）に浸漬し、常温で１時間以上攪拌して粒子表面にポリドーパミン層を導入した。反応後、４５μｍのシーブ（ｓｉｅｖｅ）を通じて粒子を回収し、エタノールで３回洗浄した後、８０℃オーブンで乾燥した。

【0179】

実施例２～実施例４
下記表１のように分散相と連続相の組成を調節したことを除いて、実施例１と同一な過程を経て粒子を得た。

【0180】

比較例１
磁性粒子を添加しないことを除いて、実施例１と同一な過程を経て粒子を収得した。

【0181】

比較例２、３
下記の表１のように分散相と連続相の組成を調節し、低密度オイルを添加しないことを除いて、実施例１と同一な過程を経て粒子を得た。

【0182】

参考例１
製造例の磁性粒子の代わりにオレイン酸で表面を疎水性に改質していない磁性粒子を添加したことを除いて、実施例１と同一な過程を経て粒子を得た。

【0183】

【表1】

【0184】

＜実験例：細胞培養用マイクロキャリアの物性測定＞
前記実施例、比較例および参考例から得られた細胞培養用マイクロキャリアに対して、下記方法で物性を測定し、その結果を表２に示した。

【0185】

１．粒子の大きさ
前記実施例、比較例および参考例から得られた細胞培養用マイクロキャリアに対して、光学顕微鏡を通じて１００個の粒子直径を測定し、これらの算術平均値を求めた。

【0186】

実施例１から得られた細胞培養用マイクロキャリアのＳＥＭイメージを図２に示した。

【0187】

２．粒子内部構造および空隙直径
（１）粒子内部構造
前記実施例１から得られた細胞培養用マイクロキャリアに対して、ＳＥＭを通じて粒子内部構造を確認した。具体的に、粒子をエポキシに組み込み（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した後、イオンミリング（ｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ）を通じて断面を製造した後、粒子断面の形状をＳＥＭを通じて確認し、これを図３に示した。

【0188】

（２）空隙直径
前記実施例および比較例から得られた細胞培養用マイクロキャリアをエポキシに組み込み（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した後、イオンミリング（ｉｏｎ ｍｉｌｌｉｎｇ）を通じて断面を製造した後、粒子断面の形状をＳＥＭで確認して粒子内部空隙のうち最小直径と最大直径を求めた。

【0189】

３．見掛け密度
前記実施例、比較例および参考例から得られた細胞培養用マイクロキャリアに対して、乾燥過程が完了した条件の試料を準備し、前記試料を常温（２５℃）および常圧（１ａｔｍ）条件で、密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３、０．９７ｇ／ｃｍ^３、０．９８ｇ／ｃｍ^３または０．９９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液と、密度が１ｇ／ｃｍ^３である蒸留水（ＤＩＷ）にそれぞれ添加して粒子が浮遊または沈降するか確認して以下の基準下で見掛け密度を評価した。

【0190】

１）密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で浮遊：０．９５ｇ／ｃｍ^３未満
２）密度が１ｇ／ｃｍ^３である蒸留水（ＤＩＷ）で沈降：１ｇ／ｃｍ^３超過
３）密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で沈降し、密度が１ｇ／ｃｍ^３である蒸留水（ＤＩＷ）で浮遊：０．９５ｇ／ｃｍ^３以上１ｇ／ｃｍ^３未満
４）密度が０．９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で沈降し、密度が０．９７ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で浮遊：０．９５ｇ／ｃｍ^３以上０．９７ｇ／ｃｍ^３未満
５）密度が０．９８ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で沈降し、密度が０．９９５ｇ／ｃｍ^３であるエタノール水溶液で浮遊：０．９８ｇ／ｃｍ^３以上０．９９５ｇ／ｃｍ^３未満

【0191】

４．比表面積
前記得られた見掛け密度から、下記数式を用いて細胞培養用マイクロキャリアの比表面積を計算した。

【0192】

［数式］
マイクロキャリアの比表面積（ｃｍ^２／ｇ）＝３／（ｒ×ρ）

【0193】

上記数式中、ｒはマイクロキャリアの平均半径を意味し、ρはマイクロキャリアの見掛け密度を意味する。

【0194】

５．細胞培養効率
１００ｍＬ バイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に間葉系幹細胞（密度：１．０５ｇ／ｃｍ^３）を含む培養液を満たし、前記実施例および比較例から得られた細胞培養用マイクロキャリア１ｇ～１．５ｇを入れて２５ｒｐｍで攪拌した。この時、培養液の温度は３７℃を維持し、５日間培養して以下の基準によってマイクロキャリアの細胞培養効率を評価した。

【0195】

上：細胞培養時細胞培養効率が８０％以上
下：細胞培養時細胞培養効率が８０％未満

【0196】

６．磁性分離効率
前記実施例、比較例および参考例から得られた細胞培養用マイクロキャリアが分散した溶液が入っているバイアルの一側面に強力磁石を接触させて、細胞培養用マイクロキャリアが移動するか否かを肉眼で確認した。

【0197】

細胞培養用マイクロキャリアが９０％以上磁石が接触された面方向に移動する場合に「優秀」、９０％以下に移動する場合「不良」で評価した。

【0198】

７．空隙成分分析
前記実施例、比較例および参考例から得られた細胞培養用マイクロキャリアに対して、内部空隙に含まれている成分を分析するために、細胞培養用マイクロキャリアを凍結粉砕しクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）に溶かして未反応残留化合物を抽出し、ＧＣ／ＦＩＤ（ガスクロマトグラフィー－火炎イオン化検出器）を通じて細部成分を定性、定量分析した。

【0199】

具体的に、クロロホルムとメタノールを１：２体積比で混合した溶媒に濃度別にスチレン（１／４０００ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ）、ジビニルベンゼン（１／１００００ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ）、Ｉｓｏｐａｒ Ｍ（１／４００ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ）の標準試料を製造した。ＧＣ／ＦＩＤ機器に１ｕＬの標準試料を注入し検量線を作成した。表１の試料を１ｕＬ注入し検量線を用いて含量を計算した。ＧＣ／ＦＩＤ測定は内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、フィルム厚さ５μｍのＲｔｘ（スチレン、Ｉｓｏｐａｒ Ｍ）またはワックス（ｗａｘ）（ジビニルベンゼン）上のカラムを使用し、初期オーブン温度５０℃で開始して１０℃／ｍｉｎ速度で２５０℃まで昇温した。移動相気体は１５ｍＬ／ｍｉｎのヘリウム気体を使用した。

【0200】

この時、オイルまたはこれに由来した成分が検出される場合を「Ｏ」、オイルまたはこれに由来した成分が検出されない場合を「×」と表示した。

【0201】

【表2】

【0202】

上記表２に示されているように、実施例の細胞培養用マイクロキャリアは１．０５ｇ／ｃｍ^３未満の低密度を満足しながらも、細胞培養条件でキャリア培養が効果的に行われ、磁性分離効率も優れていることを確認することができた。

【0203】

反面、比較例１の細胞培養用マイクロキャリアは、磁性粒子を含んでいなくて、磁性分離効率が下がる問題があった。

【0204】

また、比較例２の細胞培養用マイクロキャリアは、粒子の密度が１．０５ｇ／ｃｍ^３超であって細胞との密度差によって培養器内で円滑な攪拌が行われなくて細胞付着性が減少する問題があった。

【0205】

また、比較例３の細胞培養用マイクロキャリアは、粒子の密度が１．０５ｇ／ｃｍ^３超であって細胞との密度差によって培養器内で円滑な攪拌が行われなくて細胞付着性が減少して細胞培養が不可能な程度に細胞培養効率が下がる問題があった。

【0206】

また、参考例１の細胞培養用マイクロキャリアは疎水性官能基で表面処理されていない磁性粒子を含むことにより、水分散磁性粒子がスチレンモノマーを含む分散相で均等に分散せず、重合時水分散磁性粒子同士が固まるのを確認することができた。また、このように製造された粒子の場合、粒度分布が大きく磁性分離効率が下がる問題があった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】