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特表2024-520589タンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の同定及び定量
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】タンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の同定及び定量
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240517BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240517BHJP
C12Q 1/37 20060101ALN20240517BHJP
C12N 9/76 20060101ALN20240517BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240517BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N33/68
G01N27/62 X
C12Q1/37 ZNA
C12N9/76
C07K16/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023574130
(86)(22)【出願日】2022-06-03
(85)【翻訳文提出日】2024-01-18
(86)【国際出願番号】 US2022032099
(87)【国際公開番号】W WO2022256613
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】63/197,052
(32)【優先日】2021-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】514099673
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】グオ， チア
(72)【発明者】
【氏名】クーフェル， レジーナ
(72)【発明者】
【氏名】リー， デリア
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， フェン
(72)【発明者】
【氏名】ユク， イン ファム
(72)【発明者】
【氏名】チャン， チンホア
(72)【発明者】
【氏名】カダン， ランス ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ダイ， ルー
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA12
2G041GA09
2G041HA01
2G041JA02
2G041JA10
2G041LA08
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2G045BB04
2G045DA36
2G045FB06
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ30
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4H045AA30
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA50
4H045GA21
(57)【要約】
本開示は、試料中の１つ以上のタンパク質の同一性及び量を決定するための高感度方法に関する。例えば、本開示は、タンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の高感度の同定及び定量のための方法を提供し、この方法は、標的化又は標的非依存様式のいずれかでタンパク質を同定及び定量するように適合させることができ、別個の使用事例に適した感度の範囲を達成するように改変することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、ａ）前記試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下で前記試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）前記消化されたタンパク質を含む前記試料を還元条件及び加熱条件下でデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）と接触させることと、
ｃ）前記消化されたタンパク質を含む前記試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、
ｄ）前記クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して前記溶離液を分析して、前記試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳが、データ依存型取得（ＤＤＡ）モードで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記タンパク質が、宿主細胞タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記宿主細胞タンパク質が、酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記酵素が、加水分解酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記プロテアーゼが、トリプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比が、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記消化されたタンパク質試料を、約１％ｗ／ｖのＳＤＣと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記クロマトグラフィー支持体が、固相抽出支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記クロマトグラフィー支持体が、荷電表面ハイブリッド支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの検出限界（ＬＯＤ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記タンパク質産物が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
タンパク質産物を含む前記試料が、部分的に又は完全に精製された試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記部分的に又は完全に精製された試料が、精製プロセス内プール試料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記プロセス内プール試料が、限外濾過／透析濾過プール試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記プロセス内プール試料が、原薬試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記プロセス内プール試料が、製剤試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
前記試料中の前記タンパク質産物の負荷量が、約６μｇ～約３００μｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記試料を前記プロテアーゼと接触させる時間が、約２～約４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記試料をプロテアーゼと接触させるための温度が、約３７℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記消化されたタンパク質を含む前記試料をＳＤＣと接触させるための温度が、約９０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記消化されたタンパク質を含む前記試料をＳＤＣと接触させる時間が、約１０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
タンパク質産物を含む試料中の１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを決定するための方法であって、ａ）前記１つ以上の標的タンパク質を消化するのに十分な条件下で、前記試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）前記１つ以上の消化された標的タンパク質を含む前記試料を、還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）前記１つ以上の消化された標的タンパク質を含む前記試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、
ｄ）前記クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して前記溶離液を分析して、前記試料中の前記１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することであって、前記分析が、前記１つ以上の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルを決定することと、それらのシグナルを前記試料中の前記１つ以上の標的タンパク質について検出されたシグナルと比較することとを含む、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して前記溶離液を分析して、前記試料中の前記１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することと
を含む、方法。
【請求項24】
前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳが、並行反応モニタリング（ＰＲＭ）モードで実行される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記１つ以上の標的タンパク質が、宿主細胞タンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記宿主細胞タンパク質が、酵素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記酵素が、加水分解酵素である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記プロテアーゼが、トリプシンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項29】
前記試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比が、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である、請求項２３に記載の方法。
【請求項30】
前記１つ以上の消化された標的タンパク質試料を、約０．９％ｗ／ｖのＳＤＣと接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項31】
前記クロマトグラフィー支持体が、固相抽出支持体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項32】
前記クロマトグラフィー支持体が、荷電表面ハイブリッド支持体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項33】
約０．０１ｐｐｍのＬＯＱを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項34】
前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からのデータの正規化を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項35】
前記タンパク質産物が、抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項36】
タンパク質産物を含む前記試料が、部分的に又は完全に精製された試料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項37】
前記部分的に又は完全に精製された試料が、精製プロセス内プール試料である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記プロセス内プール試料が、限外濾過／透析濾過プール試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記プロセス内プール試料が、原薬試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記試料中の前記タンパク質産物の負荷量が、約６μｇ～約３００μｇである、請求項２３に記載の方法。
【請求項41】
前記試料を前記プロテアーゼと接触させる時間が、約２～約４時間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項42】
前記試料をプロテアーゼと接触させるための温度が、約３７℃である、請求項２３に記載の方法。
【請求項43】
前記消化されたタンパク質を含む前記試料をＳＤＣと接触させるための温度が、約９０℃である、請求項２３に記載の方法。
【請求項44】
前記消化されたタンパク質を含む前記試料をＳＤＣと接触させる時間が、約１０分間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項45】
タンパク質産物の試料負荷量を調整して所望の感度を達成することによって、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの所定の感度でタンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、ａ）タンパク質を含む試料を、前記試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）前記消化されたタンパク質を含む前記試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）前記消化されたタンパク質を含む前記試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｄ）前記クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）前記溶離液を再懸濁することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して前記再懸濁された溶離液の画分を分析して、前記試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む、方法。
【請求項46】
前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳが、ＤＤＡモードで実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記再懸濁された溶離液の前記画分が、約６μｇ、約３０μｇ、約６０μｇ、約１５０μｇ、又は約３００μｇのタンパク質産物を含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
前記タンパク質が、宿主細胞タンパク質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
前記宿主細胞タンパク質が、酵素である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記酵素が、加水分解酵素である、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記プロテアーゼが、トリプシンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項52】
前記試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比が、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である、請求項４５に記載の方法。
【請求項53】
前記消化されたタンパク質試料又は消化された標的タンパク質試料を、約０．９％ｗ／ｖのＳＤＣと接触させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項54】
前記クロマトグラフィー支持体が、固相抽出支持体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項55】
前記クロマトグラフィー支持体が、荷電表面ハイブリッド支持体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項56】
前記液体クロマトグラフィー／質量分析からのデータの正規化を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項57】
前記タンパク質産物が、抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項58】
タンパク質産物を含む前記試料が、部分的に又は完全に精製された試料である、請求項４５に記載の方法。
【請求項59】
前記部分的に又は完全に精製された試料が、精製プロセス内プール試料である、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記プロセス内プール試料が、抗体限外濾過／透析濾過プール試料である、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記プロセス内プール試料が、原薬試料である、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
前記プロセス内プール試料が、製剤試料である、請求項５９に記載の方法。
【請求項63】
前記試料を前記プロテアーゼと接触させる時間が、約２～約４時間である、請求項４５に記載の方法。
【請求項64】
前記試料を前記プロテアーゼと接触させるための温度が、約３７℃である、請求項４５に記載の方法。
【請求項65】
前記消化されたタンパク質を含む前記試料をＳＤＣと接触させるための温度が、約９０℃である、請求項４５に記載の方法。
【請求項66】
前記消化されたタンパク質を含む前記試料をＳＤＣと接触させる時間が、約１０分間である、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月４日に出願された米国仮出願第６３／１９７，０５２号の優先権を主張し、その内容全体が参照により組み込まれ、その優先権が主張される。
本出願は、２０２１年６月４日に出願された米国仮出願第６３／１９７，０５２号の優先権を主張し、その内容全体が参照により組み込まれ、その優先権が主張される。
【0002】
発明の分野
本開示は、試料中の１つ以上のタンパク質の同一性及び量を決定するための高感度方法に関する。例えば、本開示は、タンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の高感度の同定及び定量のための方法を提供し、この方法は、標的化様式又は標的非依存様式のいずれかでタンパク質を同定及び定量するように適合させることができ、別個の使用事例に適した感度の範囲を達成するように改変することができる。
本開示は、試料中の１つ以上のタンパク質の同一性及び量を決定するための高感度方法に関する。例えば、本開示は、タンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の高感度の同定及び定量のための方法を提供し、この方法は、標的化様式又は標的非依存様式のいずれかでタンパク質を同定及び定量するように適合させることができ、別個の使用事例に適した感度の範囲を達成するように改変することができる。
【背景技術】
【0003】
背景
ポリペプチドの大規模で経済的な精製は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な問題である。一般に、ポリペプチドは、そのポリペプチドの遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって目的のポリペプチドを産生するように操作された哺乳動物細胞株又は細菌細胞株のいずれかを使用して、細胞培養によって産生される。使用される細胞株は生きている生物であるため、目的のポリペプチドを、細胞に供給される化合物の混合物並びに細胞自体によって作られる内因性タンパク質（宿主細胞タンパク質又は「ＨＣＰ」）から分離することが望ましい。
ポリペプチドの大規模で経済的な精製は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な問題である。一般に、ポリペプチドは、そのポリペプチドの遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって目的のポリペプチドを産生するように操作された哺乳動物細胞株又は細菌細胞株のいずれかを使用して、細胞培養によって産生される。使用される細胞株は生きている生物であるため、目的のポリペプチドを、細胞に供給される化合物の混合物並びに細胞自体によって作られる内因性タンパク質（宿主細胞タンパク質又は「ＨＣＰ」）から分離することが望ましい。
【0004】
ＨＣＰからの目的のポリペプチドの分離は、通常、異なるクロマトグラフィー技術の組み合わせを使用して達成される。バイオテクノロジー産業で使用されるそのような高度な分離戦略は、ＨＣＰの非常に効率的な除去が可能であり、それによって目的のポリペプチドの精製調製物を提供するが、極めて低レベルのＨＣＰの定量は依然として非常に望ましい目標である。例えば、最終製品組成物、例えば限外濾過及び透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）プール、原薬（ＤＳ）及び／又は製剤（ＤＰ）中に存在する残留加水分解酵素（「加水分解酵素」）は、製剤中のポリソルベート（ＰＳ）分解を引き起こし、視覚的粒子（ＶＰ）及びサブビジブル粒子（ＳＶＰ）の懸念をもたらす可能性がある。これは、これらの加水分解酵素が極めて低いレベルで存在する場合でも当てはまる。したがって、低レベルのＨＣＰを同定及び定量するための効果的な戦略を有することは、生物製剤の製造を支援するためのプロセス開発又は研究に特に有用である。
【0005】
質量分析による脂肪酸（「ＦＡＭＳ」）分析又は活性に基づくアッセイ等の既存の解決策は、ＰＳ分解の特定の態様に対処するのに有効であったが、根本原因、すなわち最終生成物のＰＳ２０分解に寄与する加水分解酵素はほとんど知られていない。残留ＨＣＰの特定の同一性に関するこの知識の欠如は、特に制限された感度（通常５～１０ｐｐｍ）を示す現在の戦略では、定量化に関して特に扱いにくい問題を提示する。さらに、既存の解決策は、典型的には生物製剤開発に関連するタイムラインには役立たない。ＦＡＭＳは、例えば、遊離脂肪酸の産生に依存しており、典型的には、検出可能なＰＳ分解が起こるまでに２～４週間を必要とし、プロセス開発又は調査のための障害となり得る。したがって、タンパク質試料中のＨＣＰの高感度定量が可能な方法が当分野で必要とされている。特に、標的化様式（例えば、識別及び定量されるＨＣＰが予め決定されている場合）又は標的非依存様式（例えば、識別及び定量されるＨＣＰが予め決定されていない場合）のいずれかでＨＣＰのレベルを同定及び定量するように適合させることができ、異なるユースケースに適した感度の範囲を達成するように改変することができる方法が強く必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
第１の態様では、本開示は、タンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、ａ）試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下で試料をプロテアーゼと接触させることと、ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）と接触させることと、ｃ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと、を含む、方法に関する。特定の実施形態では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、データ依存型取得（ＤＤＡ）モードで実行される。
【0007】
特定の実施形態では、タンパク質は、宿主細胞タンパク質である。特定の実施形態では、宿主細胞タンパク質は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、加水分解酵素である。
【0008】
特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。特定の実施形態では、試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比は、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である。特定の実施形態では、消化されたタンパク質試料を、約１％ｗ／ｖのＳＤＣと接触させる。
【0009】
特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、固相抽出支持体である。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、帯電表面ハイブリッド支持体である。
【0010】
特定の実施形態では、本方法は、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの検出限界（ＬＯＤ）を有する。
【0011】
特定の実施形態では、タンパク質産物は、抗体である。特定の実施形態では、タンパク質産物を含む試料は、部分的に又は完全に精製された試料である。特定の実施形態では、部分的に又は完全に精製された試料は、精製プロセス内プール試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、限外濾過／透析濾過プール試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、原薬試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、製剤試料である。
【0012】
特定の実施形態では、試料中のタンパク質産物の負荷量は、約６μｇ～約３００μｇである。特定の実施形態では、試料をプロテアーゼと接触させる時間は、約２～約４時間である。特定の実施形態では、試料をプロテアーゼと接触させるための温度は、約３７℃である。特定の実施形態では、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させるための温度は、約９０℃である。特定の実施形態では、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させる時間は、約１０分間である。
【0013】
別の態様では、本開示は、タンパク質産物を含む試料中の１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを決定するための方法であって、ａ）１つ以上の標的タンパク質を消化するのに十分な条件下で、試料をプロテアーゼと接触させることと、ｂ）１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料を、還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、ｃ）１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することであって、当該分析が、１つ以上の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルを決定することと、それらのシグナルを試料中の１つ以上の標的タンパク質について検出されたシグナルと比較することとを含む、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することと、を含む、方法に関する。特定の実施形態では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、並行反応モニタリング（ＰＲＭ）モードで行われる。
【0014】
特定の実施形態では、１つ以上の標的タンパク質は、宿主細胞タンパク質である。特定の実施形態では、宿主細胞タンパク質は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、加水分解酵素である。
【0015】
特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。特定の実施形態では、試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比は、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である。特定の実施形態では、１つ以上の消化された標的タンパク質試料を、約０．９％ｗ／ｖでＳＤＣと接触させる。
【0016】
特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、固相抽出支持体である。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、帯電表面ハイブリッド支持体である。
【0017】
特定の実施形態では、本方法は、約０．０１ｐｐｍの検出限界（ＬＯＱ）を有する。
【0018】
特定の実施形態では、本方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からのデータの正規化を含む。
【0019】
特定の実施形態では、タンパク質産物は、抗体である。特定の実施形態では、タンパク質産物を含む試料は、部分的に又は完全に精製された試料である。特定の実施形態では、部分的に又は完全に精製された試料は、精製プロセス内プール試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、限外濾過／透析濾過プール試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、原薬試料である。
【0020】
特定の実施形態では、試料中のタンパク質産物の負荷量は、約６μｇ～約３００μｇである。特定の実施形態では、試料をプロテアーゼと接触させる時間は、約２～約４時間である。特定の実施形態では、試料をプロテアーゼと接触させるための温度は、約３７ｏＣである。特定の実施形態では、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させるための温度は、約９０℃である。特定の実施形態では、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させる時間は、約１０分間である。
【0021】
別の態様では、本開示は、タンパク質生成物の試料負荷量を調整して所望の感度を達成することにより、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの所定の感度でタンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、ａ）タンパク質を含む試料を、試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと接触させることと、ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）と接触させることと、ｃ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、ｅ）溶離液を再懸濁することと、ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して再懸濁された溶離液の画分を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと、を含む、方法に関する。特定の実施形態では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ＤＤＡモードで実行される。
【0022】
特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約６μｇ、約３０μｇ、約６０μｇ、約１５０μｇ、又は約３００μｇのタンパク質産物を含有する。
【0023】
特定の実施形態では、タンパク質は、宿主細胞タンパク質である。特定の実施形態では、宿主細胞タンパク質は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、加水分解酵素である。特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。特定の実施形態では、試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比は、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である。特定の実施形態では、消化されたタンパク質試料又は消化された標的タンパク質試料を、約０．９％ｗ／ｖのＳＤＣと接触させる。
【0024】
特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、固相抽出支持体である。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、帯電表面ハイブリッド支持体である。
【0025】
特定の実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィー／質量分析からのデータの正規化を含む。
【0026】
特定の実施形態では、タンパク質産物は、抗体である。
【0027】
特定の実施形態では、タンパク質産物を含む試料は、部分的に又は完全に精製された試料である。特定の実施形態では、部分的に又は完全に精製された試料は、精製プロセス内プール試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、抗体限外濾過／透析濾過プール試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、原薬試料である。特定の実施形態では、プロセス内プール試料は、製剤試料である。
【0028】
特定の実施形態では、試料をプロテアーゼと接触させる時間は、約２～約４時間である。特定の実施形態では、試料をプロテアーゼと接触させるための温度は、約３７ｏＣである。特定の実施形態では、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させるための温度は、約９０℃である。特定の実施形態では、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させる時間は、約１０分間である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】図１は、固相抽出（ＳＰＥ）工程の使用の有無にかかわらず、４つの異なるｍＡｂ－２ ＵＦ／ＤＦプール組成物において、以下の実施例２に記載される方法を使用して同定されたＨＣＰペプチド及びＨＣＰタンパク質の数を示す図である。４つの異なるＵＦＤＦプール組成物をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤで示す。ＳＰＥの使用は、方法においてＳＰＥが存在しないことと対比される（例えば、製剤組成物Ａ中のそれぞれ「Ａ＿ＳＰＥ」及び「Ａ」）。
【図2】図２Ａ～図２Ｃは、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）添加の有無にかかわらず、及びＳＤＣ添加のタイミングに関して、以下の実施例３に記載される方法を使用して同定された目的のペプチド及び関連タンパク質の数を示す。図２Ａは、ＢＥＨカラムを使用して、５つの組換えヒドロラーゼ（ＬＰＬ、ＰＬＢＬ２、ＳＭＰＤ１、ＰＰＴ１及びＬｉｐＡ）のそれぞれに１百万分率（ｐｐｍ）をスパイクしたｍＡｂ－１ ＵＦ／ＤＦプールの消化、一晩の消化、１：４００トリプシン対タンパク質比の結果を示す。図２Ｂは、ＣＳＨカラム、２時間の消化物、１：２０００のトリプシン対タンパク質比を使用した、８つの組換えヒドロラーゼのそれぞれ０．１ｐｐｍをスパイクしたｍＡｂ－１ ＵＦ／ＤＦプールの消化の結果を示す図である。結果の再現性を評価するために、複製１（Ｒｅｐｌ．１）及び複製２（Ｒｅｐｌ．２）で示される２連で試験を実施した。図２Ｃは、還元及び加熱工程（「ＳＤＣ＿ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ１」及び「ＳＤＣ＿ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ２」）の間、又は還元及び加熱前の消化（「ＳＤＣ＿ｄｉｇｅｓｔ１」及び「ＳＤＣ＿ｄｉｇｅｓｔ２」）のいずれかに、５ｐｐｍの９つの同定されたタンパク質でスパイクしたｍＡｂ－２の消化の結果を示す。
【図3】図３は、以下の実施例４に記載される方法を使用したｍＡｂ－１ ＵＦ／ＤＦプール組成物中の目的の４つのＨＣＰの同定を示す図である。実施例４に概説されるように、１：４００、１：２０００、１：５０００及び１：１００００のトリプシン対タンパク質比を２５ｇ／ＬのｍＡｂ－１タンパク質濃度で使用した。
【図4】図４Ａ～図４Ｂは、異なるトリプシン消化条件でｍＡｂ－１ ＵＦ／ＤＦプール組成物にスパイクされた８つの組換えヒドロラーゼの同定を示す。図４Ａは、３０μｇの試料負荷量（注：３０μｇの試料負荷量は、２ｍｇ ｍＡｂ－１製剤組成物の出発物質からの１００μＬの再懸濁消化物から１．５μＬを負荷することを指す）でのｍＡｂ－１中の約１ｐｐｍ（０．５８～１．２２ｐｐｍ）の８つのスパイクされたヒドロラーゼの結果を示す。図４Ｂは、４００μｇの試料負荷量でのｍＡｂ－１中の約０．１ｐｐｍ（０．０５８～０．２７ｐｐｍ）の８つのスパイクされたヒドロラーゼの結果を示す。結果の再現性を評価するために、複製１（Ｒｅｐｌ．１）及び複製２（Ｒｅｐｌ．２）で示される２連で試験を実施した。
【図5】図５は、異なる試料負荷量で同定されたスパイクインタンパク質の数を示す。８つの組換えヒドロラーゼを、０．１～５ ｐｐｍの範囲の異なるレベルでスパイクした。予想される感度の必要性に基づいて様々な試料負荷量を選択し、例えば、実施例５に概説されるように、１ｐｐｍのスパイク試料に対して３０μｇの出発物質負荷量を選択した。結果は、試料負荷が消化時にＵＦ／ＤＦプール組成物の１０ｇ／Ｌタンパク質濃度で感受性をうまく調節することを示している。結果の再現性を評価するために、複製１（Ｒｅｐｌ．１）及び複製２（Ｒｅｐｌ．２）で示される２連で試験を行い、各試験試料に対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ注入も（Ａ及びＢによって示されるように）２連で行った。
【図6】図６Ａ～図６Ｂは、実施例６の結果を示し、固有のペプチド数によるスパイクイン組換えヒドロラーゼの同定に対する消化時のトリプシン消化時間及びタンパク質濃度の影響を実証する。低レベル（０．０５８～０．２７ｐｐｍ）でスパイクされた８つの組換え加水分解酵素の同定の感度及び方法のロバスト性を高めるために、トリプシン消化時間を更に微調整した。図６Ａは、１０ｇ／Ｌタンパク質濃度での２時間、３時間、及び４時間のトリプシン消化の影響を示す。図６Ｂは、消化時のタンパク質濃度（１０ｇ／Ｌ対２５ｇ／Ｌ）の影響を示す。結果の再現性を評価するために、複製１（Ｒｅｐｌ．１）及び複製２（Ｒｅｐｌ．２）で示される２連で試験を実施した。
【発明を実施するための形態】
【0030】
詳細な説明
本開示は、試料中の１つ以上のタンパク質の同一性及び量を決定するための高感度方法に関する。例えば、本開示の主題は、生物製剤製造中に産生されたタンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の高感度の同定及び定量のための方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、所定のタンパク質（すなわち、定量のために標的化される特定のタンパク質）、例えば「標的タンパク質」又は「標的化タンパク質」のレベルを同定及び定量するように適合させることができる。特定の実施形態では、そのような方法は、定量のための標的として事前に決定されなかったか又は事前に選択されなかったタンパク質、例えば「非標的化タンパク質」のレベルを同定及び定量するために、標的非依存様式で実行されるように適合させることができる。特定の実施形態では、そのような方法は、別個の使用事例に適した感度の範囲を達成するように修正することができる。
本開示は、試料中の１つ以上のタンパク質の同一性及び量を決定するための高感度方法に関する。例えば、本開示の主題は、生物製剤製造中に産生されたタンパク質試料中の残存宿主細胞タンパク質の高感度の同定及び定量のための方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、所定のタンパク質（すなわち、定量のために標的化される特定のタンパク質）、例えば「標的タンパク質」又は「標的化タンパク質」のレベルを同定及び定量するように適合させることができる。特定の実施形態では、そのような方法は、定量のための標的として事前に決定されなかったか又は事前に選択されなかったタンパク質、例えば「非標的化タンパク質」のレベルを同定及び定量するために、標的非依存様式で実行されるように適合させることができる。特定の実施形態では、そのような方法は、別個の使用事例に適した感度の範囲を達成するように修正することができる。
【0031】
明確にするために、ただし限定するものではないが、本発明に開示される主題の詳細な説明は、以下のセクションに分けられる：
１．定義；
２．タンパク質を同定するための標的非依存方法：
３．タンパク質を定量するための標的化方法；及び
４．試料負荷量を変更することによる感度の調節。
１．定義；
２．タンパク質を同定するための標的非依存方法：
３．タンパク質を定量するための標的化方法；及び
４．試料負荷量を変更することによる感度の調節。
【0032】
１．定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本開示の文脈内で、かつ、各用語が使用される具体的な文脈においての、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語を以下で、又は、本明細書の他の箇所にて論じ、本開示の組成物及び方法、並びに、それらの作製及び使用方法について記載する、実践者向けの追加の案内を示す。
本明細書中で使用される用語は一般に、本開示の文脈内で、かつ、各用語が使用される具体的な文脈においての、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語を以下で、又は、本明細書の他の箇所にて論じ、本開示の組成物及び方法、並びに、それらの作製及び使用方法について記載する、実践者向けの追加の案内を示す。
【0033】
本明細書で使用される場合、特許請求の範囲、及び／又は明細書内で、「を含む」という用語と共に用いられる場合、語句「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、これは「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。
【0034】
本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）／ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｈａｓ）」、「することができる」、「を含有する」という用語、及びこれらの変形は、追加の作用又は構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、又は単語であることが意図される。また、本開示では、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素を「含む」、それら「から成る」、及びそれら「から本質的に成る」他の実施形態も企図されている。
【0035】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内であることを意味し、これは、一部には、値を測定又は決定する方法、すなわち、測定システムの制限に依存するものである。例えば、「約」は、当技術分野の慣例によって、３以内又は３を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の、最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、更により好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。或いは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、更に好ましくは２倍以内を意味し得る。
【0036】
細胞を「培養すること」とは、細胞を、細胞の生残及び／又は成長及び／又は増殖に好適な条件下にて、細胞培養培地と接触させることを意味する。
【0037】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、任意の適切な原核細胞又は真核細胞を指す。例えば、適切な真核細胞には、動物細胞、例えば哺乳動物細胞が含まれる。特定の実施形態では、適切な細胞は、培養細胞である。特定の実施形態では、適切な細胞は、宿主細胞、組換え細胞、及び組換え宿主細胞である。特定の実施形態では、好適な細胞は、適切な栄養素及び／又は成長因子を含有する培地に配置されたときに、増殖及び生残可能な哺乳動物組織から入手される、又はその組織に由来する細胞株である。
【0038】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸を引き続いて導入して組換え細胞を作製することができる細胞及びその子孫を指す。これらの宿主細胞はまた、特定の内因性宿主細胞タンパク質の発現を変化又は欠失させるように改変（すなわち、操作）されていてもよい。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一である必要はないが、変異を含むことができる。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。これらの宿主細胞への外因性核酸（例えば、トランスフェクションによって）の導入は、元の「宿主細胞」、「宿主細胞株」又は「宿主細胞株」に由来する組換え細胞を作製するであろう。「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語はまた、そのような組換え細胞及びそれらの子孫を指し得る。
【0039】
「組換え細胞」、「組換え細胞株」及び「組換え細胞培養物」という用語は互換的に使用され、目的の組換え産物の発現を可能にするために外因性核酸が導入された細胞及びその子孫を指す。「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語はまた、そのような組換え細胞及びそれらの子孫を指し得る。そのような細胞によって発現される組換え産物は、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子又は組換えウイルスベクターであり得る。
【0040】
「哺乳動物宿主細胞」又は「哺乳動物細胞」という用語は、適切な栄養素及び成長因子を含有する培地内の、単一層培養液又は懸濁培養液のいずれかに配置したときに、増殖及び生残可能な哺乳動物に由来する細胞株を意味する。特定の細胞株に必要な増殖因子は、例えばＭａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９８４），ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０）Ｃｅｌｌ，２２：６４９）に記載されているように、過度な実験をすることなく、実験により速やかに決定される。典型的には、細胞は、目的の、多量の特定のタンパク質、例えば糖タンパク質を、培地中に発現させて分泌させることができる。本開示との関連で好適な哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に出版された欧州特許第３０７，２４７号）；ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－６１）；ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞、又は、懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９ １９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１ １９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８ １９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）を挙げることができる。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３０７，２４７号）を含む。
【0041】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、概して、約１０より多くのアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。ポリペプチドは、宿主細胞と相同であり得るか、又は好ましくは外因性であってよく、これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生されるヒトタンパク質、又は哺乳動物細胞によって産生される酵母ポリペプチド等、利用されている宿主細胞に対して異種、すなわち外来であることを意味する。ある特定の実施形態では、哺乳動物ポリペプチド（もともと哺乳類生物から誘導されるポリペプチド）が用いられ、より好ましくは、培地に直接分泌されるものが用いられる。
【0042】
「タンパク質」という用語は、鎖長が、より高度の三級及び／又は四級構造を産生するのに十分であるアミノ酸の配列を指すことを意味する。これは、「ペプチド」、又は、このような構造を有しない他の低分子量薬剤から、区別するためのものである。典型的には、本明細書のタンパク質は、少なくとも約１５～２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有する。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例としては、宿主細胞タンパク質、並びに全ての哺乳動物タンパク質、特に、治療用及び診断用抗体等の治療用及び診断用タンパク質、並びに、１つ以上の鎖間及び／又は鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、１つ以上のジスルフィド結合を含有する一般的なタンパク質が挙げられる。
【0043】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体（例えば、単一の重鎖配列と単一の軽鎖配列から成る抗体（そのようなペアリングの多量体を含む））、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【0044】
「宿主細胞タンパク質」 という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、外因性核酸（例えば、目的のポリペプチドを産生するため）の発現に使用される細胞によって産生される内因性タンパク質を包含する。一般に、目的のポリペプチドは、組換え細胞（例えば、そのポリペプチドに対する遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって目的のポリペプチドを産生するように操作された哺乳動物又は細菌細胞株）を培養することによって産生される。使用される培養細胞は生きている生物であるため、目的の外因的に導入されたポリペプチドに加えて内因性タンパク質も産生する。したがって、細胞培養生産プロセスの終わりに、細胞培養物回収物は、細胞自体によって作製されたタンパク質（宿主細胞タンパク質又は「ＨＣＰ」）と目的のポリペプチド（例えば、抗体）との複合混合物である。
【0045】
「残存宿主細胞タンパク質」という用語は、細胞培養収穫物が下流処理によって精製され、精製プロセス内プール中及び／又は生物製剤製造プロセス中（例えば、原薬及び／又は製剤中）を超えて残った後に持続する宿主細胞タンパク質を指すために使用される。
【0046】
「産物」、「タンパク質産物」及び「組換えタンパク質産物」という用語は互換的に使用され、組換え技術によって導入された外因性核酸を発現する宿主細胞又は組換え細胞によって産生される組換え産物を指す。そのような細胞によって発現される組換え産物は、組換えタンパク質（例えば、抗体）、組換えウイルス粒子又は組換えウイルスベクターであり得る。
【0047】
２．タンパク質を同定するための標的非依存方法
一態様では、本開示の主題は、例えば同定されたタンパク質が予め決定されていない場合、標的非依存アプローチを使用して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、液体クロマトグラフィー／質量分析からのデータの正規化を含む、試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。
一態様では、本開示の主題は、例えば同定されたタンパク質が予め決定されていない場合、標的非依存アプローチを使用して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、液体クロマトグラフィー／質量分析からのデータの正規化を含む、試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。
【0048】
特定の実施形態では、本開示は、抗体を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。特定の実施形態では、抗体を含む試料は、部分的に精製された試料である。特定の実施形態では、抗体を含む試料は、抗体限外濾過／透析濾過プール試料等の精製プロセス内プール試料である。特定の実施形態では、抗体を含む試料が原薬又は製剤試料である。
【0049】
例えば、限定されないが、試料、例えば組換えタンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための本明細書に開示される標的非依存方法は、
ａ）タンパク質含有試料を、該試料中のタンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）試料からＳＤＣ、未消化タンパク質、及び変性タンパク質を分離することと、
ｄ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｅ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｆ）例えばデータ依存型取得（ＤＤＡ）モードで、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、方法検出限界（ＬＯＤ）レベル以上で提示される試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含み得る。
ａ）タンパク質含有試料を、該試料中のタンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）試料からＳＤＣ、未消化タンパク質、及び変性タンパク質を分離することと、
ｄ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｅ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｆ）例えばデータ依存型取得（ＤＤＡ）モードで、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、方法検出限界（ＬＯＤ）レベル以上で提示される試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含み得る。
【0050】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に未消化タンパク質をネイティブ消化プロセスから効果的に除去すると、未消化タンパク質を除去しないままにしておくと、カラム詰まりを引き起こし、ＬＣカラムの寿命を低下させる可能性があるため、分析のロバスト性を改善することができる。本開示の主題は、消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させる工程が、ペプチドからのより効果的なタンパク質除去を可能にし、したがってＬＣ－ＭＳ分析のロバスト性の向上を可能にするという発見に少なくとも部分的に基づく。したがって、特定の実施形態では、本開示の方法は、消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去する工程を含む。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、帯電表面ハイブリッド支持体である。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、ＳＰＥ支持体である。
【0051】
しかしながら、ネイティブ消化戦略は、ｍＡｂ産物等の組換えポリペプチド産物に関連するタンパク質、例えばＨＣＰを見逃す可能性があり、したがって元のタンパク質組成物、例えばｍＡｂ製剤組成物中に存在するが、沈殿中に除去される。本開示の主題は、ＳＤＣ添加が、例えば、組換えポリペプチド、例えばｍＡｂ産物に関連するものを含む低存在量ＨＣＰについて、本明細書に記載の方法の検出感度を向上させるという発見に少なくとも部分的に基づく。いかなる理論にも従うことなく、ＳＤＣ添加による改良されたペプチド、例えばＨＣＰペプチドの同定は、タンパク質、例えばＨＣＰと、最終製剤中に存在する残留タンパク質、例えばＨＣＰに寄与し得るｍＡｂ産物等の組換えポリペプチド産物との間の強い相互作用を破壊するＳＤＣの能力によって説明され得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、消化されたタンパク質産物を含む試料を還元及び加熱条件下でＳＤＣと接触させる工程を含む。図２Ｃに示すように、還元及び加熱条件下で、消化されたタンパク質産物を含む試料をＳＤＣと接触させることを含む方法は、還元前のＳＤＣの添加と比較して低レベルのＨＣＰの同定を増加させた。理論に束縛されるものではないが、この改善は、還元及び加熱条件下でＳＤＣを添加すると天然の消化条件が維持されるが、還元前にＳＤＣを添加すると「ネイティブ消化が「変性」消化になるためであり得る。変性消化は、元のネイティブ消化条件と比較して、ｍＡｂの消化を増加させ、ＨＣＰ同定を減少させることができる。特定の実施形態では、ＳＤＣは約０．９％ｗ／ｖである。
【0052】
特定の実施形態では、本開示の方法は、酵素消化のための特に適切な酵素対タンパク質比、例えばプロテアーゼ対タンパク質産物比に関し、タンパク質は、分析される試料中の組換えタンパク質産物、例えばｍＡｂ生成物の濃度を指す。例えば、特定の実施形態では、特定の酵素対タンパク質比を使用して、消化のための全体的な試料体積を減少させることができる。特定の実施形態では、消化物中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：２００である。特定の実施形態では、消化物中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：４００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：８００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：４０００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：２０００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：２００～約１：４０００である。特定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。
【0053】
特定の実施形態では、消化されたタンパク質は、試料中の組換えタンパク質産物の２．５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌの範囲の濃度に希釈される。特定の実施形態では、タンパク質産物を、２．５ｇ／Ｌの濃度に希釈する。特定の実施形態では、タンパク質産物を、５ｇ／Ｌの濃度に希釈する。特定の実施形態では、タンパク質産物を、１０ｇ／Ｌの濃度に希釈する。特定の実施形態では、タンパク質産物を、２５ｇ／Ｌの濃度に希釈する。
【0054】
特定の実施形態では、本開示の方法は、酵素消化のための酵素対タンパク質比、例えばプロテアーゼ対タンパク質産物比が、消化時の組換えタンパク質産物濃度に関連することを提供する。特定の実施形態では、対応するトリプシン対タンパク質比での消化時の異なるタンパク質産物濃度は、感度の増加を提供する。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：２００であり、消化されたタンパク質産物は２．５ｇ／Ｌの濃度に希釈される。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：４００であり、タンパク質産物は５ｇ／Ｌの濃度に希釈される。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：８００であり、タンパク質産物は１０ｇ／Ｌの濃度に希釈される。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：２０００であり、タンパク質産物は２５ｇ／Ｌの濃度に希釈される。
【0055】
特定の実施形態では、ここに開示される主題は、タンパク質を約２～約４時間消化するのに十分な条件下でタンパク質含有試料をプロテアーゼと接触させることを含む、試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約２時間接触させる。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約３時間接触させる。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約４時間接触させる。
【0056】
特定の実施形態では、本開示の主題は、１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法であって、約０．１百万分率（ｐｐｍ）の検出限界（ＬＯＤ）を有する方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、約０．２ ｐｐｍのＬＯＤを有する。特定の実施形態では、本方法は、約０．５ｐｐｍのＬＯＤを有する。特定の実施形態では、本方法は、約１ｐｐｍのＬＯＤを有する。特定の実施形態では、本方法は、約５ｐｐｍのＬＯＤを有する。
【0057】
３．タンパク質を定量するための標的化方法
別の態様では、本開示の主題は、試料中の１つ以上の標的化タンパク質を同定及び定量するための方法を提供する。特定の実施形態では、１つ以上の標的化タンパク質の定量は、１つ以上の標的化タンパク質のｐｐｍレベルを決定することを含む。
別の態様では、本開示の主題は、試料中の１つ以上の標的化タンパク質を同定及び定量するための方法を提供する。特定の実施形態では、１つ以上の標的化タンパク質の定量は、１つ以上の標的化タンパク質のｐｐｍレベルを決定することを含む。
【0058】
特定の実施形態では、試料中の１つ以上の標的化タンパク質は、宿主細胞酵素等の宿主細胞タンパク質である。特定の実施形態では、試料中の１つ以上の標的化タンパク質は、加水分解酵素である。
【0059】
特定の実施形態では、標的化タンパク質は、以下からなる群から選択される：Ｎ－アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ１（酸性セラミダーゼ）（ＡＳＡＨ１）；パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ（ＳＭＰＤ１）；リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）；リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）；リパーゼＡ（ＬＩＰＡ）；推定ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）；及びホスホリパーゼＤファミリーメンバー３（ＰＬＤ３）。
【0060】
特定の実施形態では、標的化タンパク質は、以下からなる群から選択される：ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；セロトランスフェリン（アポトランスフェリン）；血清アルブミン；カタラーゼ；ヒスチジル－ｔＲＮＡシンテターゼ；抗トロンビン－ＩＩＩ；微小管結合タンパク質タウ；クレアチンキナーゼＭ型；低分子ユビキチン様修飾因子１（ＳＵＭＯ－１）；アネキシンＡ５；ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）１；炭酸脱水酵素２；炭酸脱水酵素１；リボシルジヒドロニコチンアミドデヒドロゲナーゼ；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＡ１（ＧＳＴ Ａ１）；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＰ（ＧＳＴ－Ｐ）；Ｃ反応性タンパク質；ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｅ１（ＵｂｃＨ６）；ＢＨ３相互作用ドメイン死アゴニスト（ＢＩＤ）；ペルオキシレドキシン１；ＧＴＰアーゼＨＲａｓ（Ｒａｓタンパク質）；レチノール結合タンパク質；ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵｂｃＨ１０）；ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＡ；ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｉ（ＵｂｃＨ９）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）；ミオグロビンＣ；インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）；レプチン；シトクロムｂ５；ヘモグロビンベータ鎖；スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ－Ｚｎ）；ガンマシヌクレイン；ヘモグロビンアルファ鎖；脂肪酸結合タンパク質；リゾチームＣ；アルファ－ラクトアルブミン；チオレドキシン；血小板由来増殖因子Ｂ鎖；ベータ－２－ミクログロブリン；シトクロムｃ（アポシトクロムｃ）；ユビキチン；ネジリン（Ｎｅｄｄ８）；補体Ｃ５（補体Ｃ５ａ）；インターロイキン－８；インスリン様成長因子ＩＩ；及び表皮成長因子。
【0061】
特定の実施形態では、本開示は、抗体を含む試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量するための方法を提供する。特定の実施形態では、抗体を含む試料は、部分的に精製された試料である。特定の実施形態では、抗体を含む試料は、抗体限外濾過／透析濾過プール試料等の精製プロセス内プール試料である。特定の実施形態では、抗体を含む試料が原薬又は製剤試料である。
【0062】
特定の実施形態では、本開示は、試料、例えばタンパク質産物を含む試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量するための方法であって、
ａ）試料中に存在する１つ以上の標的タンパク質を消化するのに十分な条件下で、試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化された標的タンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）試料からＳＤＣ、未消化タンパク質、及び変性タンパク質を分離することと、
ｄ）消化された標的タンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｅ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、例えば並行反応モニタリング（ＰＲＭ）モードで溶離液を分析し、そのような分析の結果を１つ以上の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルと比較し、試料中の１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを同定及び定量することと
を含む。
ａ）試料中に存在する１つ以上の標的タンパク質を消化するのに十分な条件下で、試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化された標的タンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）試料からＳＤＣ、未消化タンパク質、及び変性タンパク質を分離することと、
ｄ）消化された標的タンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｅ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、例えば並行反応モニタリング（ＰＲＭ）モードで溶離液を分析し、そのような分析の結果を１つ以上の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルと比較し、試料中の１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを同定及び定量することと
を含む。
【0063】
特定の実施形態では、本開示の方法は、１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料を、クロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去する工程を含む。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、帯電表面ハイブリッド支持体である。特定の実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、ＳＰＥ支持体である。
【0064】
特定の実施形態では、１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料を還元及び加熱条件下でＳＤＣと接触させる工程を含む本開示の方法が実施される。特定の実施形態では、ＳＤＣは約０．９％ｗ／ｖである。
【0065】
特定の実施形態では、本開示の方法は、酵素消化及び全体的な感度を改善するための所定の酵素対タンパク質比、例えばプロテアーゼ対タンパク質産物比に関する。例えば、特定の実施形態では、特定の酵素対タンパク質比を使用して、消化のための全体的な試料体積を減少させることができる。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：２００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：４００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：８００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：４０００である。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は、約１：２０００である。特定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。
【0066】
特定の実施形態では、本開示の方法は、酵素消化のための酵素対タンパク質比、例えばプロテアーゼ対タンパク質産物比が、消化時の組換えタンパク質産物濃度に関連することを提供する。特定の実施形態では、対応するトリプシン対タンパク質比での消化時の異なるタンパク質産物濃度は、感度の増加を提供する。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：２００であり、タンパク質産物は２．５ｇ／Ｌの濃度に希釈される。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：４００であり、タンパク質産物は５ｇ／Ｌの濃度に希釈される。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：８００であり、タンパク質産物は１０ｇ／Ｌの濃度に希釈される。特定の実施形態では、試料中の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比は約１：２０００であり、タンパク質産物は２５ｇ／Ｌの濃度に希釈される。
【0067】
特定の実施形態では、本開示の主題は、タンパク質を約２～約４時間消化するのに十分な条件下で組換えタンパク質含有試料をプロテアーゼと接触させることを含む、試料中の１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを同定及び定量するための方法を提供する。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約２時間接触させる。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約３時間接触させる。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約４時間接触させる。
【0068】
特定の実施形態では、ここに開示される主題は、１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを同定及び定量するための方法であって、約０．０１ｐｐｍの定量限界（ＬＯＱ）を有する方法を提供する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分の分析は、試料中の標的タンパク質のｐｐｍレベルを決定するためにＰＲＭモードでＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用することを含むことができ、既知の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルを決定し、それらのシグナルを試料中の既知の標的タンパク質について検出されたシグナルと比較して、それにより０．０１ｐｐｍの定量感度を達成することを含むことができる。
【0069】
４．試料負荷量を変更することによる感度の調節
別の態様において、本開示の主題は、本明細書に記載の同定及び定量戦略の感度を調節するための方法を提供する。特定の実施形態では、そのような感受性の調節は、本開示の方法に関連して消化される試料中の特定の量のタンパク質、例えば組換えタンパク質産物の量を選択することによって達成することができる。例えば、限定されないが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注入される試料中に存在する組換えタンパク質産物の量は、出発物質の量に基づくことができ、例えば、３０μｇの試料負荷量は、２ｍｇの出発物質消化物からの１００μＬの再懸濁消化物から１．５μＬを負荷することを意味する。
別の態様において、本開示の主題は、本明細書に記載の同定及び定量戦略の感度を調節するための方法を提供する。特定の実施形態では、そのような感受性の調節は、本開示の方法に関連して消化される試料中の特定の量のタンパク質、例えば組換えタンパク質産物の量を選択することによって達成することができる。例えば、限定されないが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注入される試料中に存在する組換えタンパク質産物の量は、出発物質の量に基づくことができ、例えば、３０μｇの試料負荷量は、２ｍｇの出発物質消化物からの１００μＬの再懸濁消化物から１．５μＬを負荷することを意味する。
【0070】
特定の実施形態では、本開示は、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの所定の感度で試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。特定の実施形態では、本開示の所定の感度で試料中の１つ以上のタンパク質を同定する標的非依存的方法は、
ａ）タンパク質を消化するのに十分な条件下で、予め選択されたタンパク質産物濃度のタンパク質含有試料をプロテアーゼと接触させること、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）試料からＳＤＣ、未消化タンパク質、及び変性タンパク質を分離することと、
ｄ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｅ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを、例えばＤＤＡモードで使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む。
ａ）タンパク質を消化するのに十分な条件下で、予め選択されたタンパク質産物濃度のタンパク質含有試料をプロテアーゼと接触させること、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）試料からＳＤＣ、未消化タンパク質、及び変性タンパク質を分離することと、
ｄ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｅ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを、例えばＤＤＡモードで使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む。
【0071】
特定の実施形態では、本開示は、液体クロマトグラフィー／質量分析を介して所定量の組換えタンパク質産物を有する再懸濁された溶離液の画分を分析して、試料中のタンパク質の濃度を決定することにより、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの所定の感度で試料中のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。上記のように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注入された試料中に存在する組換えタンパク質産物の量は、出発物質の量に基づいて決定することができ、例えば、３０μｇの試料負荷量は、２ｍｇの出発物質消化物から１００μＬの再懸濁消化物から１．５μＬを負荷することを意味する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約６μｇ、約３０μｇ、約６０μｇ、約１５０μｇ、又は約３００μｇのタンパク質産物を含有する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約６μｇのタンパク質産物を含有する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約３０μｇのタンパク質産物を含有する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約６０μｇのタンパク質産物を含有する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約１５０μｇのタンパク質産物を含有する。特定の実施形態では、再懸濁された溶離液の画分は、約３００μｇのタンパク質産物を含有する。
【0072】
特定の実施形態では、本開示の主題は、約２～約４時間、タンパク質を消化するのに十分な条件下で、タンパク質含有試料をプロテアーゼと接触させることを含む、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの所定の感度で試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための標的非依存方法を提供する。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約２時間接触させる。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約３時間接触させる。特定の実施形態では、タンパク質含有試料を、タンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと約４時間接触させる。
【0073】
５．例示的な非限定的実施形態
Ａ．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、
ａ）試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下で試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）と接触させることと、
ｃ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、
ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む方法に関する。
Ａ．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、
ａ）試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下で試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）と接触させることと、
ｃ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、
ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む方法に関する。
【0074】
Ａ１．特定の実施形態では、本開示は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳがデータ依存型取得（ＤＤＡ）モードで実行される、Ａの方法に関する。
【0075】
Ａ２．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質が宿主細胞タンパク質である、Ａの方法に関する。
【0076】
Ａ３．特定の実施形態では、本開示は、宿主細胞タンパク質が酵素である、Ａ２の方法に関する。
【0077】
Ａ４．特定の実施形態では、本開示は、酵素が加水分解酵素である、Ａ３の方法に関する。
【0078】
Ａ５．特定の実施形態では、本開示は、プロテアーゼがトリプシンである、Ａの方法に関する。
【0079】
Ａ６．特定の実施形態では、本開示は、試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比が約１：２０００、約１：８００、約１：４００又は約１：２００である、Ａの方法に関する。
【0080】
Ａ７．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質試料を約１％ｗ／ｖでＳＤＣと接触させる、Ａの方法に関する。
【0081】
Ａ８．特定の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー支持体が固相抽出支持体である、Ａの方法に関する。
【0082】
Ａ９．特定の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー支持体が荷電表面ハイブリッド支持体である、Ａの方法に関する。
【0083】
Ａ１０．特定の実施形態では、本開示は、約０．１ ｐｐｍ～約５ ｐｐｍの検出限界（ＬＯＤ）を有する、Ａの方法に関する。
【0084】
Ａ１１．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物が抗体である、Ａの方法に関する。
【0085】
Ａ１２．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物を含む試料が、部分的又は完全に精製された試料である、Ａの方法に関する。
【0086】
Ａ１３．特定の実施形態では、本開示は、部分的又は完全に精製された試料が、精製プロセス内プール試料である、Ａ１２の方法に関する。
【0087】
Ａ１４．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料は、限外濾過／透析濾過プール試料である、Ａ１３の方法に関する。
【0088】
Ａ１５．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料が原薬試料である、Ａ１３の方法に関する。
【0089】
Ａ１６．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料が製剤試料である、請求項Ａ１３に記載の方法に関する。
【0090】
Ａ１７．特定の実施形態では、本開示は、試料中のタンパク質産物の負荷量が約６μｇ～約３００μｇである、Ａの方法に関する。
【0091】
Ａ１８．特定の実施形態では、本開示は、試料をプロテアーゼと接触させる時間が約２～約４時間である、Ａの方法に関する。
【0092】
Ａ１９．特定の実施形態では、本開示は、試料をプロテアーゼと接触させるための温度が約３７℃である、Ａの方法に関する。
【0093】
Ａ２０．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させるための温度が約９０℃である、Ａの方法に関する。
【0094】
Ａ２１．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させる時間が約１０分間である、Ａの方法に関する。
【0095】
Ｂ．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物を含む試料中の１つ以上の標的タンパク質のｐｐｍレベルを決定するための方法であって、
ａ）１つ以上の標的タンパク質を消化するのに十分な条件下で、試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料を、還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、
ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することであって、当該分析が、１つ以上の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルを決定することと、それらのシグナルを試料中の１つ以上の標的タンパク質について検出されたシグナルと比較することとを含む、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することと
を含む、方法に関する。
ａ）１つ以上の標的タンパク質を消化するのに十分な条件下で、試料をプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料を、還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）１つ以上の消化された標的タンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を除去することと、
ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することであって、当該分析が、１つ以上の標的タンパク質の複数の標準ｐｐｍレベルに関連するシグナルを決定することと、それらのシグナルを試料中の１つ以上の標的タンパク質について検出されたシグナルと比較することとを含む、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して溶離液を分析して、試料中の１つ以上の標的タンパク質を同定及び定量することと
を含む、方法に関する。
【0096】
Ｂ１．特定の実施形態では、本開示は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳが並行反応モニタリング（ＰＲＭ）モードで実行される、Ｂの方法に関する。
【0097】
Ｂ２．特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の標的タンパク質が宿主細胞タンパク質である、Ｂの方法に関する。
【0098】
Ｂ３．特定の実施形態では、本開示は、宿主細胞タンパク質が酵素である、Ｂ２の方法に関する。
【0099】
Ｂ４．特定の実施形態では、本開示は、酵素が加水分解酵素である、Ｂ３の方法に関する。
【0100】
Ｂ５．特定の実施形態では、本開示は、プロテアーゼがトリプシンである、Ｂの方法に関する。
【0101】
Ｂ６．試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比が、約１：２０００、約１：８００、約１：４００、又は約１：２００である、Ｂに記載の方法。
【0102】
Ｂ７．特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の消化された標的タンパク質試料を約０．９％ｗ／ｖでＳＤＣと接触させる、Ｂの方法に関する。
【0103】
Ｂ８．特定の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー支持体が固相抽出支持体である、Ｂの方法に関する。
【0104】
Ｂ９．特定の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー支持体が荷電表面ハイブリッド支持体である、Ｂの方法に関する。
【0105】
Ｂ１０．特定の実施形態では、本開示は、約０．０１ｐｐｍのＬＯＱを有する、Ｂの方法に関する。
【0106】
Ｂ１１．特定の実施形態では、本開示は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からのデータの正規化を更に含む、Ｂの方法に関する。
【0107】
Ｂ１２．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物が抗体である、Ｂの方法に関する。
【0108】
Ｂ１３．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物を含む試料が、部分的又は完全に精製された試料である、Ｂの方法に関する。
【0109】
Ｂ１４．特定の実施形態では、本開示は、部分的又は完全に精製された試料が、精製プロセス内プール試料である、Ｂ１３の方法に関する。
【0110】
Ｂ１５．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料は、限外濾過／透析濾過プール試料である、Ｂ１４の方法に関する。
【0111】
Ｂ１６．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料が原薬試料である、Ｂ１４の方法に関する。
【0112】
Ｂ１７．特定の実施形態では、本開示は、試料中のタンパク質産物の負荷量が約６μｇ～約３００μｇである、Ｂの方法に関する。
【0113】
Ｂ１８．特定の実施形態では、本開示は、試料をプロテアーゼと接触させる時間が約２～約４時間である、Ｂの方法に関する。
【0114】
Ｂ１９．特定の実施形態では、本開示は、試料をプロテアーゼと接触させるための温度が約３７℃である、Ｂの方法に関する。
【0115】
Ｂ２０．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させるための温度が約９０℃である、Ｂの方法に関する。
【0116】
Ｂ２１．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させる時間が約１０分間である、Ｂの方法に関する。
【0117】
Ｃ．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物の試料負荷量を調整して所望の感度を達成することによって、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの所定の感度でタンパク質産物を含む試料中の１つ以上のタンパク質を同定するための方法であって、
ａ）タンパク質を含む試料を、試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）溶離液を再懸濁することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して再懸濁された溶離液の画分を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む、方法に関する。
ａ）タンパク質を含む試料を、試料中に存在するタンパク質を消化するのに十分な条件下でプロテアーゼと接触させることと、
ｂ）消化されたタンパク質を含む試料を還元条件及び加熱条件下でＳＤＣと接触させることと、
ｃ）消化されたタンパク質を含む試料をクロマトグラフィー支持体に接触させて、未消化タンパク質を更に除去することと、
ｄ）クロマトグラフィー支持体を移動相と接触させ、溶離液を収集することと、
ｅ）溶離液を再懸濁することと、
ｆ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して再懸濁された溶離液の画分を分析して、試料中の１つ以上のタンパク質を同定することと
を含む、方法に関する。
【0118】
Ｃ１．特定の実施形態では、本開示は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳがＤＤＡモードで行われる、Ｃの方法に関する。
【0119】
Ｃ２．特定の実施形態では、本開示は、Ｃの方法に関し、その中で、再懸濁された溶離液の画分は、約６μｇ、約３０μｇ、約６０μｇ、約１５０μｇ又は約３００μｇのタンパク質産物を含有する。
【0120】
Ｃ３．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質が宿主細胞タンパク質である、Ｃの方法に関する。
【0121】
Ｃ４．特定の実施形態では、本開示は、宿主細胞タンパク質が酵素である、Ｃ３の方法に関する。
【0122】
Ｃ５．特定の実施形態では、本開示は、酵素が加水分解酵素である、Ｃ４の方法に関する。
【0123】
Ｃ６．プロテアーゼが、トリプシンである、Ｃに記載の方法
【0124】
Ｃ７．特定の実施形態では、本開示は、試料中のプロテアーゼ対タンパク質産物のｗ／ｗ比が約１：２０００、約１：８００、約１：４００又は約１：２００である、Ｃの方法に関する。
【0125】
Ｃ８．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質試料又は消化された標的タンパク質試料を、約０．９％ｗ／ｖでＳＤＣと接触させる、Ｃの方法に関する。
【0126】
Ｃ９．特定の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー支持体が固相抽出支持体である、Ｃの方法に関する。
【0127】
Ｃ１０．特定の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー支持体が荷電表面ハイブリッド支持体である、Ｃの方法に関する。
【0128】
Ｃ１１．特定の実施形態では、本開示は、液体クロマトグラフィー／質量分析からのデータの正規化を含む、Ｃの方法に関する。
【0129】
Ｃ１２．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物が抗体である、Ｃの方法に関する。
【0130】
Ｃ１３．特定の実施形態では、本開示は、タンパク質産物を含む試料が、部分的又は完全に精製された試料である、Ｃの方法に関する。
【0131】
Ｃ１４．特定の実施形態では、本開示は、部分的又は完全に精製された試料が、精製プロセス内プール試料である、Ｃ１３の方法に関する。
【0132】
Ｃ１５．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料は、抗体限外濾過／透析濾過プール試料である、Ｃ１４の方法に関する。
【0133】
Ｃ１６．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料が原薬試料である、Ｃ１４の方法に関する。
【0134】
Ｃ１７．特定の実施形態では、本開示は、プロセス内プール試料が製剤試料である、Ｃ１４の方法に関する。
【0135】
Ｃ１８．特定の実施形態では、本開示は、試料をプロテアーゼと接触させる時間が約２～約４時間である、Ｃの方法に関する。
【0136】
Ｃ１９．特定の実施形態では、本開示は、試料をプロテアーゼと接触させるための温度が約３７℃である、Ｃの方法に関する。
【0137】
Ｃ２０．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させるための温度が約９０℃である、Ｃの方法に関する。
【0138】
Ｃ２１．特定の実施形態では、本開示は、消化されたタンパク質を含む試料をＳＤＣと接触させる時間が約１０分で間ある、Ｃの方法に関する。
【実施例】
【0139】
材料及び方法
材料
全長ｍＡｂ－１（ＩｇＧ１、全長）、ｍＡｂ－２（ＩｇＧ１ Ｆａｂ）及びｍＡｂ－３（ＩｇＧ１、全長）製剤組成物を社内で製造した。組換えヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。他の７つの組換えヒドロラーゼはいずれも、Ｃ末端６ｘＨｉｓ－又は二重６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇエピトープを精製タグとして各ヒドロラーゼに融合することによって産生された。発現コンストラクトをＤＮＡ配列決定によって検証し、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの１０日後に組換え酵素を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡ、サイズ排除及び抗Ｈｉｓアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。７つの組換えヒドロラーゼを組換えＬＰＬと組み合わせて、ヒドロラーゼ標準（ＳＴＤ）を生成した。これらの酵素の社内で製造されたｍＡｂ－１製剤組成物（「ｍＡｂ－１中の内因性レベル」）における、本明細書に記載の任意の添加前の、名称、分子量（ＭＷ）、組換え標準の純度、及び百万分率（ｐｐｍ）で測定されたレベルを表１に列挙する。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄ １（ＵＰＳ－１）を購入し（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、これは、既知の等モル濃度及び６．３～８２．９ｋＤａの範囲のＭＷの４８の組換えタンパク質の混合物を含有する。ヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体標準ＲＭ ８６７１は、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）から購入した。組換えウシトリプシンは、Ｒｏｃｈｅ製であった。全ての試薬原液をＬＣＭＳグレードの水中で調製した。
＊ 組換えヒトＬＰＬをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入し、製造業者によって提供された分析証明書によると約９５％純粋であった。他の７つの組換えヒドロラーゼはＣＨＯ由来タンパク質であり、それらの純度をサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。
＊ＰＰＴ１、ＳＭＰＤ１、ＬＰＬＡ１、ＬｉｐＡ及びＰＬＤ３は、ｍＡｂ－１製剤中に検出されなかった（ＮＤ）。
材料
全長ｍＡｂ－１（ＩｇＧ１、全長）、ｍＡｂ－２（ＩｇＧ１ Ｆａｂ）及びｍＡｂ－３（ＩｇＧ１、全長）製剤組成物を社内で製造した。組換えヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。他の７つの組換えヒドロラーゼはいずれも、Ｃ末端６ｘＨｉｓ－又は二重６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇエピトープを精製タグとして各ヒドロラーゼに融合することによって産生された。発現コンストラクトをＤＮＡ配列決定によって検証し、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの１０日後に組換え酵素を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡ、サイズ排除及び抗Ｈｉｓアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。７つの組換えヒドロラーゼを組換えＬＰＬと組み合わせて、ヒドロラーゼ標準（ＳＴＤ）を生成した。これらの酵素の社内で製造されたｍＡｂ－１製剤組成物（「ｍＡｂ－１中の内因性レベル」）における、本明細書に記載の任意の添加前の、名称、分子量（ＭＷ）、組換え標準の純度、及び百万分率（ｐｐｍ）で測定されたレベルを表１に列挙する。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄ １（ＵＰＳ－１）を購入し（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、これは、既知の等モル濃度及び６．３～８２．９ｋＤａの範囲のＭＷの４８の組換えタンパク質の混合物を含有する。ヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体標準ＲＭ ８６７１は、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）から購入した。組換えウシトリプシンは、Ｒｏｃｈｅ製であった。全ての試薬原液をＬＣＭＳグレードの水中で調製した。
【表1】
＊ＰＰＴ１、ＳＭＰＤ１、ＬＰＬＡ１、ＬｉｐＡ及びＰＬＤ３は、ｍＡｂ－１製剤中に検出されなかった（ＮＤ）。
【0140】
機器
試料調製時には、３７℃保持可能な水浴（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ １２３５又は同等品）、９０℃保持可能な乾式浴（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ ＢＳＨ ２００又は同等品）、高速・温調可能な遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｍｏｄｅｌ ５４２４ Ｒ又は同等品）を用いた。
試料調製時には、３７℃保持可能な水浴（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ １２３５又は同等品）、９０℃保持可能な乾式浴（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｏｄｅｌ ＢＳＨ ２００又は同等品）、高速・温調可能な遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｍｏｄｅｌ ５４２４ Ｒ又は同等品）を用いた。
【0141】
ＨＣＰモデル試料の調製
製剤中の低レベルＨＣＰのモデルは、ヒドロラーゼＳＴＤ又はＵＰＳ－１タンパク質標準溶液のいずれかを定義されたｐｐｍレベルで特異的ｍＡｂにスパイクすることによって調製した（ｐｐｍは抗体の重量に対する各タンパク質の重量を表す）。
製剤中の低レベルＨＣＰのモデルは、ヒドロラーゼＳＴＤ又はＵＰＳ－１タンパク質標準溶液のいずれかを定義されたｐｐｍレベルで特異的ｍＡｂにスパイクすることによって調製した（ｐｐｍは抗体の重量に対する各タンパク質の重量を表す）。
【0142】
ネイティブ消化
抗体試料の２ｍｇアリコートを水及び１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２．５、５、１０及び２５ｇ／Ｌの範囲の所望のタンパク質濃度に希釈し、それぞれ３７℃で１：２００、１：４００、１：８００及び１：２０００の酵素対タンパク質比（ｗ／ｗ）でウシトリプシンで消化し、次いで０．９％ｗ／ｖデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）の存在下で１１ｍＭ ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｎｄｂｒｅａｋｅｒ（商標）ＴＣＥＰ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、７７７２０年）で２時間還元し、９０℃乾燥浴で１０分間加熱した。試料を室温に冷却し、次いで、７％ギ酸（ＦＡ）でｐＨ＜２に酸性化して消化をクエンチし、ＳＤＣを沈殿させる。ＳＤＣ沈殿物並びに未消化及び変性タンパク質を、２０，０００ｇ及び４℃での３０分間の遠心分離工程によってペレット化した。遠心分離工程からの上清アリコートを新しい１．５ｍＬ低結合微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）ＬｏＢｉｎｄ ０２２４３１０８１、又は同等品）に移し、２０，０００ｇ及び４℃で更に１０分間遠心分離した。最終上清をＯａｓｉｓ ＨＬＢ μＥｌｕｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅによって洗浄し、２０μＬの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で溶出し、乾燥させ、水中０．１％ギ酸１００μＬに再懸濁した。各処理試料を３００μＬコニカルバイアル（Ｗａｔｅｒｓ ＱｕａｎＲｅｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ＭａｘＰｅａｋ、１８６００９１８６、又は同等品）に移した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注入された試料は、出発物質の量に基づいており、例えば、３０μｇの試料負荷量は、２ｍｇの出発物質からの１００μＬの再懸濁消化物から１．５μＬを負荷することを意味することに留意されたい。
抗体試料の２ｍｇアリコートを水及び１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２．５、５、１０及び２５ｇ／Ｌの範囲の所望のタンパク質濃度に希釈し、それぞれ３７℃で１：２００、１：４００、１：８００及び１：２０００の酵素対タンパク質比（ｗ／ｗ）でウシトリプシンで消化し、次いで０．９％ｗ／ｖデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）の存在下で１１ｍＭ ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｎｄｂｒｅａｋｅｒ（商標）ＴＣＥＰ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、７７７２０年）で２時間還元し、９０℃乾燥浴で１０分間加熱した。試料を室温に冷却し、次いで、７％ギ酸（ＦＡ）でｐＨ＜２に酸性化して消化をクエンチし、ＳＤＣを沈殿させる。ＳＤＣ沈殿物並びに未消化及び変性タンパク質を、２０，０００ｇ及び４℃での３０分間の遠心分離工程によってペレット化した。遠心分離工程からの上清アリコートを新しい１．５ｍＬ低結合微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）ＬｏＢｉｎｄ ０２２４３１０８１、又は同等品）に移し、２０，０００ｇ及び４℃で更に１０分間遠心分離した。最終上清をＯａｓｉｓ ＨＬＢ μＥｌｕｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅによって洗浄し、２０μＬの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で溶出し、乾燥させ、水中０．１％ギ酸１００μＬに再懸濁した。各処理試料を３００μＬコニカルバイアル（Ｗａｔｅｒｓ ＱｕａｎＲｅｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ＭａｘＰｅａｋ、１８６００９１８６、又は同等品）に移した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注入された試料は、出発物質の量に基づいており、例えば、３０μｇの試料負荷量は、２ｍｇの出発物質からの１００μＬの再懸濁消化物から１．５μＬを負荷することを意味することに留意されたい。
【0143】
ナノフローＲＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ（商標）４８０質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステムで行った。ＣｏＡｎｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ワシントン州リッチランド）からの特注のＣＳＨ Ｃ１８（１３０Å、１．７μｍ、７５μｍ×５０ｃｍ）カラムを用いてペプチドを分離した。移動相は、水中０．１％ＦＡ（移動相Ａ、ｐＨ約２．７）及びＡＣＮ中０．１％ＦＡ（移動相Ｂ）であった。全ての分離勾配を流速２５０ｎＬ／分及びカラム温度６０℃で実行し、試料をオートサンプラー内で６℃に維持した。消化物に０％Ｂを５μｌ／分でオンラインＷａｔｅｒｓ ＮａｎｏＥａｓｅ Ｍ／Ｚ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム、１００Å、５μｍ、１８０μｍ×２ｃｍトラップカラムに負荷し、０％移動相Ｂで１０分間洗浄した後、１７２分ＬＣ勾配（２５０ｎＬ／分）：１分で１％から５％Ｂ、６分で５％から８％Ｂ、４２分で８％から１５％Ｂ、８１分で１５％から２４％Ｂ、３１分で２４％から３２％Ｂ、５分で３２％から４０％Ｂ、５分で４０％から５０％、１分で５０％から１％Ｂによって分離した。各ＬＣ勾配の後、３３分間の１％Ｂナノカラム平衡化も行う。質量分析計を、１２個の最も強いイオンについてデータ依存モードで操作した。６０，０００の分解能での各フルＭＳスキャンについて３０％の正規化された衝突エネルギー（ＮＣＥ）、３００％の正規化された自動利得制御（ＡＧＣ）標的、１００ｍｓの最大注入時間、ｍ／ｚ３００～１５００、及び正規化されたＡＧＣ標的の１００％の１００ｍｓの最大注入時間での１５，０００の分解能でのＭＳ／ＭＳ事象による高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションにペプチドを供した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ（商標）４８０質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステムで行った。ＣｏＡｎｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ワシントン州リッチランド）からの特注のＣＳＨ Ｃ１８（１３０Å、１．７μｍ、７５μｍ×５０ｃｍ）カラムを用いてペプチドを分離した。移動相は、水中０．１％ＦＡ（移動相Ａ、ｐＨ約２．７）及びＡＣＮ中０．１％ＦＡ（移動相Ｂ）であった。全ての分離勾配を流速２５０ｎＬ／分及びカラム温度６０℃で実行し、試料をオートサンプラー内で６℃に維持した。消化物に０％Ｂを５μｌ／分でオンラインＷａｔｅｒｓ ＮａｎｏＥａｓｅ Ｍ／Ｚ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム、１００Å、５μｍ、１８０μｍ×２ｃｍトラップカラムに負荷し、０％移動相Ｂで１０分間洗浄した後、１７２分ＬＣ勾配（２５０ｎＬ／分）：１分で１％から５％Ｂ、６分で５％から８％Ｂ、４２分で８％から１５％Ｂ、８１分で１５％から２４％Ｂ、３１分で２４％から３２％Ｂ、５分で３２％から４０％Ｂ、５分で４０％から５０％、１分で５０％から１％Ｂによって分離した。各ＬＣ勾配の後、３３分間の１％Ｂナノカラム平衡化も行う。質量分析計を、１２個の最も強いイオンについてデータ依存モードで操作した。６０，０００の分解能での各フルＭＳスキャンについて３０％の正規化された衝突エネルギー（ＮＣＥ）、３００％の正規化された自動利得制御（ＡＧＣ）標的、１００ｍｓの最大注入時間、ｍ／ｚ３００～１５００、及び正規化されたＡＧＣ標的の１００％の１００ｍｓの最大注入時間での１５，０００の分解能でのＭＳ／ＭＳ事象による高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションにペプチドを供した。
【0144】
ＨＣＰ同定のためのデータ分析
ＨＣＰ同定のために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータファイルを、関連する生物治療製品の配列、並びにＵｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇからのＣＨＯ Ｃａｎｏｎｉｃａｌ及びＩｓｏｆｏｒｍデータベース（３５，２５６エントリ）、並びに他のヒト汚染物質に連結された全てのスパイクされたタンパク質標準の配列を含むデータベースに対して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン１．４）をＳＥＱＵＥＳＴ検索と共に使用して検索した。Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ（２０２１年２月版；１７，０６８エントリ）からのマウス（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースに連結されたＮＩＳＴ ｍＡｂ配列を含むデータベースを、ＮＩＳＴ ｍＡｂにおけるＨＣＰ分析に使用した。タンパク質は、陽性同定のために２つの固有のペプチド（デコイデータベース検索で評価したペプチドの偽発見率５％）を有する必要がある。
ＨＣＰ同定のために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータファイルを、関連する生物治療製品の配列、並びにＵｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇからのＣＨＯ Ｃａｎｏｎｉｃａｌ及びＩｓｏｆｏｒｍデータベース（３５，２５６エントリ）、並びに他のヒト汚染物質に連結された全てのスパイクされたタンパク質標準の配列を含むデータベースに対して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン１．４）をＳＥＱＵＥＳＴ検索と共に使用して検索した。Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ（２０２１年２月版；１７，０６８エントリ）からのマウス（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースに連結されたＮＩＳＴ ｍＡｂ配列を含むデータベースを、ＮＩＳＴ ｍＡｂにおけるＨＣＰ分析に使用した。タンパク質は、陽性同定のために２つの固有のペプチド（デコイデータベース検索で評価したペプチドの偽発見率５％）を有する必要がある。
【0145】
実施例１：１Ｄ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳワークフローに基づく高感度でロバストなネイティブ消化の開発
典型的なネイティブ消化ベースのワークフローは、以下の４つの重要な工程を含む：１）非変性条件下でのトリプシン消化、２）還元及び加熱、３）遠心分離による未消化抗体（主にＦａｂ及びＦｃドメイン断片）の除去、並びに４）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のための上清の除去。
典型的なネイティブ消化ベースのワークフローは、以下の４つの重要な工程を含む：１）非変性条件下でのトリプシン消化、２）還元及び加熱、３）遠心分離による未消化抗体（主にＦａｂ及びＦｃドメイン断片）の除去、並びに４）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のための上清の除去。
【0146】
この研究の下での複数の研究を可能にするために、特に明記しない限り、製剤ｍＡｂ－１にスパイクされた８つの精製組換えヒドロラーゼタンパク質を使用して、トリプシン消化条件及び高感度でロバストなＨＣＰの同定及び定量に影響を及ぼす他の試料調製工程のパラメータを評価した。これらのタンパク質は異なるレベルの純度を有し、それらの一部は製剤にスパイクされる前に非常に低い内因性レベルで存在するため（表１「内因性レベル」）、スパイクした後のそれらの最終スパイクレベルは、それらが同じ標的レベルでスパイクされた場合でも異なり、８つのヒドロラーゼのうち５つのみが標的化スパイクレベル以上である。例えば、０．１ｐｐｍスパイク試料では、８つの加水分解酵素の実際のレベルは０．０５８～０．２６７ｐｐｍの範囲であり、８つのタンパク質のうち５つのみが目標の０．１ｐｐｍスパイクレベル以上である。
【0147】
実施例２：方法のロバスト性のためのオフラインＳＰＥクリーンアップ
未消化ｍＡｂをネイティブ消化物から効果的に除去することは、分析のロバスト性を確実にするためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に重要である。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析から、２０，０００ｇでの２回の反復遠心分離後でさえ、未消化のｍＡｂは依然として完全には除去されず、構築されたカラム圧力又はカラム性能の大幅な低下によって示されるように、カラム詰まり又はカラム寿命の短縮のいずれかを引き起こすことが観察された。分析のロバスト性を高め、試料中に残った未消化ｍＡｂを更に除去するために、改善された溶出条件でＳＰＥ工程を実施した。８０％及び５０％ ＡＣＮ溶出条件（ｎ＝２）の両方で溶出した試料は透明な溶液であった。しかしながら、ＡＣＮ除去のための適切な体積まで試料を乾燥させた後、８０％ＡＣＮ溶出を有する試料について少量の沈殿物が観察され、５０％ ＡＣＮ溶出試料は透明のままであった。一部の変性ｍＡｂは、遠心分離後に溶液中に残存していた可能性があり、８０％ＡＣＮを含むＳＰＥから溶出し、次いで、ＳｐｅｅｄＶａｃによってＡＣＮがほとんど除去された後に沈殿した。したがって、より低いレベルのＡＣＮ（５０％）を有する溶出条件をＳＰＥ浄化のために選択した。ほとんどのペプチドは通常２５％未満のＡＣＮでＲＰカラムから溶出するので、この５０％ＡＣＮレベルは所望の消化されたＨＣＰペプチドを回収するのに十分であり、それでもなお比較的大きく疎水性の未消化ｍＡｂは依然としてＳＰＥに保持され得る。
未消化ｍＡｂをネイティブ消化物から効果的に除去することは、分析のロバスト性を確実にするためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に重要である。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析から、２０，０００ｇでの２回の反復遠心分離後でさえ、未消化のｍＡｂは依然として完全には除去されず、構築されたカラム圧力又はカラム性能の大幅な低下によって示されるように、カラム詰まり又はカラム寿命の短縮のいずれかを引き起こすことが観察された。分析のロバスト性を高め、試料中に残った未消化ｍＡｂを更に除去するために、改善された溶出条件でＳＰＥ工程を実施した。８０％及び５０％ ＡＣＮ溶出条件（ｎ＝２）の両方で溶出した試料は透明な溶液であった。しかしながら、ＡＣＮ除去のための適切な体積まで試料を乾燥させた後、８０％ＡＣＮ溶出を有する試料について少量の沈殿物が観察され、５０％ ＡＣＮ溶出試料は透明のままであった。一部の変性ｍＡｂは、遠心分離後に溶液中に残存していた可能性があり、８０％ＡＣＮを含むＳＰＥから溶出し、次いで、ＳｐｅｅｄＶａｃによってＡＣＮがほとんど除去された後に沈殿した。したがって、より低いレベルのＡＣＮ（５０％）を有する溶出条件をＳＰＥ浄化のために選択した。ほとんどのペプチドは通常２５％未満のＡＣＮでＲＰカラムから溶出するので、この５０％ＡＣＮレベルは所望の消化されたＨＣＰペプチドを回収するのに十分であり、それでもなお比較的大きく疎水性の未消化ｍＡｂは依然としてＳＰＥに保持され得る。
【0148】
図１に示されるように、全体として、更なるＳＰＥ浄化を伴う方法は、ｍＡｂ－２における４つの異なるＵＦＤＦプール試料から一貫して、ＳＰＥを伴わないものと同等の数のタンパク質及びわずかにより多くのペプチドを同定した。最も重要なことに、追加のＳＰＥ浄化は、長いカラム寿命及び複数の試料負荷の後のより一貫したカラム圧力をもたらし、これらはロバストなアッセイにおける重要な特徴である。
【0149】
実施例３：低レベルＨＣＰの検出感度を向上させるためのＳＤＣ付加
図２Ａに示されるように、１ｐｐｍの７つのＨＣＰでスパイクした全長ｍＡｂ－１試料について、還元／加熱工程でのＳＤＣ（０．９％）の添加は、ｍＡｂ－１における１ｐｐｍの５つでスパイクしたＨＣＰ（ＬＰＬＡ２、ＳＭＰＤ１、ＰＰＴ１、ＰＬＤ３及びＬｉｐＡ）及び３つの内因性ＨＣＰ（ＬＰＬ、ＰＬＢＬ２、ＡＳＡＨ１）について同定されたペプチド（１６対１１）及びタンパク質（５対３）の総数を増加させた。したがって、ＳＤＣ添加をネイティブ消化プロトコルに対して実施した。ＳＤＣは、タンパク質沈殿のための同じ工程で除去することができる。０．１ｐｐｍの低レベル残留ＨＣＰを検出するために、ＳＤＣ添加法の利点を更に評価した。ＳＤＣ添加は、８スパイク加水分解酵素のペプチド同定を０．０５８から０．２６７ ｐｐｍのレベルで増加させ（図２Ｂ）、０．１ｐｐｍ未満でＰＳ分解を引き起こすことが報告されており、したがって検出及び定量するための高感度方法を必要とする追加のタンパク質ＬＰＬＡ２を同定した（ｎ＝２）。表２は、ＳＤＣ添加アプローチが、ｍＡｂ－３において０．１～１．３ｐｐｍレベルでスパイクされたＵＰＳ－１タンパク質の全体的なペプチド同定を増加させたことを示す更なる実験を示し、これは、低レベルタンパク質同定のための方法ロバスト性を追加する。
図２Ａに示されるように、１ｐｐｍの７つのＨＣＰでスパイクした全長ｍＡｂ－１試料について、還元／加熱工程でのＳＤＣ（０．９％）の添加は、ｍＡｂ－１における１ｐｐｍの５つでスパイクしたＨＣＰ（ＬＰＬＡ２、ＳＭＰＤ１、ＰＰＴ１、ＰＬＤ３及びＬｉｐＡ）及び３つの内因性ＨＣＰ（ＬＰＬ、ＰＬＢＬ２、ＡＳＡＨ１）について同定されたペプチド（１６対１１）及びタンパク質（５対３）の総数を増加させた。したがって、ＳＤＣ添加をネイティブ消化プロトコルに対して実施した。ＳＤＣは、タンパク質沈殿のための同じ工程で除去することができる。０．１ｐｐｍの低レベル残留ＨＣＰを検出するために、ＳＤＣ添加法の利点を更に評価した。ＳＤＣ添加は、８スパイク加水分解酵素のペプチド同定を０．０５８から０．２６７ ｐｐｍのレベルで増加させ（図２Ｂ）、０．１ｐｐｍ未満でＰＳ分解を引き起こすことが報告されており、したがって検出及び定量するための高感度方法を必要とする追加のタンパク質ＬＰＬＡ２を同定した（ｎ＝２）。表２は、ＳＤＣ添加アプローチが、ｍＡｂ－３において０．１～１．３ｐｐｍレベルでスパイクされたＵＰＳ－１タンパク質の全体的なペプチド同定を増加させたことを示す更なる実験を示し、これは、低レベルタンパク質同定のための方法ロバスト性を追加する。
【表2】
【0150】
ＳＤＣ添加による改善されたＨＣＰ／ペプチド同定は、最終製剤中に存在する残留ＨＣＰに大きく寄与したＨＣＰとｍＡｂとの間の強い相互作用を破壊するＳＤＣの能力によって説明できる可能性が高い。以前の研究は、どのようにネイティブ消化がｍＡｂと関連し、したがって沈殿中に除去されるＨＣＰを見逃すことができるかを強調しており、これはＳＤＣあり及びなしの本結果によって更に確認された（図２Ｂ）。さらに、ＳＤＣ追加のタイミングは、低レベルＨＣＰの識別に影響を及ぼし得る。例えば、５ｐｐｍの９つのタンパク質をスパイクしたｍＡｂ－２を用い、還元及び加熱工程中（「ＳＤＣ＿ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ１」及び「ＳＤＣ＿ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ２」）又は還元及び加熱前の消化物（「ＳＤＣ＿ｄｉｇｅｓｔ１」及び「ＳＤＣ＿ｄｉｇｅｓｔ２」）のいずれかにＳＤＣを添加して、実験を行った。図２Ｃに示すように、還元及び加熱条件下でのＳＤＣの添加は、還元前のＳＤＣの添加と比較して低レベルＨＣＰの同定を増加させた。本発明者らの発見は、ＳＤＣがネイティブ消化条件下で低レベルＨＣＰの回収を改善するのに驚くほど効果的な役割を果たすことを示している。
【0151】
実施例４：タンパク質濃度及びトリプシン比
トリプシン消化を増強するために、トリプシン対タンパク質比及び消化時間を評価することができる。以前の研究は、５ｇ／Ｌタンパク質濃度で元のネイティブ消化プロトコルで使用されるトリプシン対タンパク質比１：４００での一晩と比較した２時間の消化時間の利点を示した。分析フローＬＣ－ＭＳ分析を最初に使用したとき、低レベル（０．１ｐｐｍ以上）のＨＣＰを検出するために大量の出発物質（約２０ｍｇ）が必要であった。したがって、消化のための試料体積及び試料負荷量を減少させるために、トリプシン対タンパク質比を、２時間の消化時間で５ｇ／Ｌの代わりに２５ｇ／Ｌのより高いタンパク質濃度で試験した。図３は、異なるトリプシン対タンパク質比を有するｍＡｂ－１で同定された標的タンパク質（ヒドロラーゼ）のペプチドの数を示す図である。４つの標的タンパク質からのほとんどのペプチドは、トリプシン消化における２５ｇ／Ｌタンパク質濃度について１：２０００のトリプシン対タンパク質比で得られた。０．１～１．３ｐｐｍのＵＰＳ－１スパイクｍＡｂ－１を用いた実験により、１：２０００のトリプシン対タンパク質比が、２５ｇ／Ｌタンパク質濃度で１：４００の比よりも１つ多い（３５対３４）ＵＰＳ－１タンパク質及び６０個多い（２６６対２０６）ＵＰＳ－１ペプチドを同定したことも確認された。
トリプシン消化を増強するために、トリプシン対タンパク質比及び消化時間を評価することができる。以前の研究は、５ｇ／Ｌタンパク質濃度で元のネイティブ消化プロトコルで使用されるトリプシン対タンパク質比１：４００での一晩と比較した２時間の消化時間の利点を示した。分析フローＬＣ－ＭＳ分析を最初に使用したとき、低レベル（０．１ｐｐｍ以上）のＨＣＰを検出するために大量の出発物質（約２０ｍｇ）が必要であった。したがって、消化のための試料体積及び試料負荷量を減少させるために、トリプシン対タンパク質比を、２時間の消化時間で５ｇ／Ｌの代わりに２５ｇ／Ｌのより高いタンパク質濃度で試験した。図３は、異なるトリプシン対タンパク質比を有するｍＡｂ－１で同定された標的タンパク質（ヒドロラーゼ）のペプチドの数を示す図である。４つの標的タンパク質からのほとんどのペプチドは、トリプシン消化における２５ｇ／Ｌタンパク質濃度について１：２０００のトリプシン対タンパク質比で得られた。０．１～１．３ｐｐｍのＵＰＳ－１スパイクｍＡｂ－１を用いた実験により、１：２０００のトリプシン対タンパク質比が、２５ｇ／Ｌタンパク質濃度で１：４００の比よりも１つ多い（３５対３４）ＵＰＳ－１タンパク質及び６０個多い（２６６対２０６）ＵＰＳ－１ペプチドを同定したことも確認された。
【0152】
２時間の消化を伴うトリプシン対タンパク質比（２５ｇ／Ｌタンパク質濃度については１：２０００比、５ｇ／Ｌタンパク質濃度については１：４００比）は、消化時のタンパク質濃度に関連するようである。仮説を試験するため、また広範囲の濃度を有する代表的な原薬又は製剤試料の予測可能な消化条件を確立するため、消化時の異なるタンパク質濃度（２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌ）とそれらの対応するトリプシン対タンパク質比（１：２００、１：４００、１：８００及び１：２０００の比）との組み合わせ、及びＨＣＰ同定に対するそれらの影響を評価した。
【0153】
各消化条件下で約１ｐｐｍの８つの組換えヒドロラーゼ（実際のレベルは０．５８４～１．１２２ ｐｐｍの範囲）でスパイクした試料についてデータを生成した（ｎ＝２）。図４Ａに示すように、全ての消化条件は、３０μｇの試料負荷量でこれらの８つのスパイクされたタンパク質全てを同定することができた。これは、タンパク質対トリプシン比が消化時のタンパク質濃度に対して逆直線的に増加する場合、同様の分析感度が達成され得ることを確認する。したがって、試料の元のタンパク質濃度に基づいて１ｐｐｍレベルの感度を達成するために、消化時のタンパク質濃度とそれらの対応するトリプシン対タンパク質比との試験された組み合わせを使用して、異なる消化戦略を採用することができる。
【0154】
４００μｇの試料負荷量で約０．１ｐｐｍ（実際のレベルは０．０５８～０．２６７ｐｐｍの範囲であり、５つのタンパク質は０．１ｐｐｍ又はそれ以上であった）でスパイクした８つの組換えヒドロラーゼについて同じ実験を繰り返した。図４Ｂに示すように、全ての条件は、８つの加水分解酵素のうち４～６つを特定した。消化時のより高い（１０ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌ）タンパク質濃度は、２．５ｇ／Ｌ及び５ｇ／Ｌ条件と比較して、両方のプロセス複製物においてより多くのペプチドを同定した。両方の実験結果からの結果を考慮して、１０ｇ／Ｌタンパク質濃度を、試料負荷による感受性の調節を試験するために消化時に１：８００のトリプシン対タンパク質比で選択した。
【0155】
実施例５：試料負荷変調方法感度
３０μｇの出発物質分析は１ｐｐｍの感度を示したため（図４Ａ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の許容範囲内の試料負荷が感度を比例的に調節することができるという仮説を試験した、すなわち同じ消化物から、６μｇ負荷量は５ｐｐｍの感度を示すと予想され、３００μｇ負荷量は０．１ｐｐｍの感度を示すと予想される。０．１～５ｐｐｍの範囲の異なるスパイクレベルを有する試料を消化し、予想される感度の必要性に応じて異なる試料負荷量を選択した。例えば、１ｐｐｍスパイク試料について３０μｇの出発物質負荷量を選択した。長さ５０ｃｍのナノフローＣＳＨカラムを使用して、分析フローＣＳＨカラムを用いた以前の報告に基づいて、良好なピーク分解能を維持しながら、より高い試料負荷量で感度を高めることができた。図５に示すように、０．５～５ｐｐｍの感度の試料負荷条件（６～６０μｇの出発物質）で、８つ全てのタンパク質を、２つのプロセス複製物のそれぞれから少なくとも一回同定した。標的感受性レベル以上の５つのタンパク質は全て、両方のプロセス複製物で同定された。予測された０．１ｐｐｍ及び０．２ｐｐｍの感度はまた、試験した試料負荷量で、標的感度レベル以上の５つのヒドロラーゼのうちの４つ、及び合計８つのヒドロラーゼのうちの標的化レベル未満の３つのうちの２つを一貫して同定することによって実証された。
３０μｇの出発物質分析は１ｐｐｍの感度を示したため（図４Ａ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の許容範囲内の試料負荷が感度を比例的に調節することができるという仮説を試験した、すなわち同じ消化物から、６μｇ負荷量は５ｐｐｍの感度を示すと予想され、３００μｇ負荷量は０．１ｐｐｍの感度を示すと予想される。０．１～５ｐｐｍの範囲の異なるスパイクレベルを有する試料を消化し、予想される感度の必要性に応じて異なる試料負荷量を選択した。例えば、１ｐｐｍスパイク試料について３０μｇの出発物質負荷量を選択した。長さ５０ｃｍのナノフローＣＳＨカラムを使用して、分析フローＣＳＨカラムを用いた以前の報告に基づいて、良好なピーク分解能を維持しながら、より高い試料負荷量で感度を高めることができた。図５に示すように、０．５～５ｐｐｍの感度の試料負荷条件（６～６０μｇの出発物質）で、８つ全てのタンパク質を、２つのプロセス複製物のそれぞれから少なくとも一回同定した。標的感受性レベル以上の５つのタンパク質は全て、両方のプロセス複製物で同定された。予測された０．１ｐｐｍ及び０．２ｐｐｍの感度はまた、試験した試料負荷量で、標的感度レベル以上の５つのヒドロラーゼのうちの４つ、及び合計８つのヒドロラーゼのうちの標的化レベル未満の３つのうちの２つを一貫して同定することによって実証された。
【0156】
ＬＣ－ＭＳ分析の感度が高いほど、より多くの残留ＨＣＰが同定される。各ＨＣＰのレベルはまた、関連する安全リスクを評価する前に決定する必要がある。調節された感度は、より標的化された定量化努力がなされる前に、同定されたＨＣＰのレベルを迅速に推定するためのツールを提供する。例えば、タンパク質のＸ、Ｙ及びＺ数が６μｇ、３０μｇ及び３００μｇの負荷分析で特定される場合、対応するタンパク質がそれぞれ５ｐｐｍ、１ｐｐｍ及び０．１ｐｐｍ以上で提示される可能性が最も高いことを示唆する。Ｘ及びＹ個のタンパク質が同定された試料では、異なる（すなわち、重なり合わない）タンパク質が１～５ｐｐｍで存在する可能性がある。同様に、Ｙ及びＺ数のタンパク質が同定された試料の場合、異なるタンパク質は潜在的に０．１～１ｐｐｍで存在する。この情報は、同定された各タンパク質のレベルを推定し、正確なＨＣＰ測定値を得るための更なる標的化定量の必要性に関する決定を支援する。
【0157】
実施例６：０．１ｐｐｍレベルの感度及びロバスト性の改善
低レベル（０．１ｐｐｍ）の感度を更に微調整し、方法のロバスト性を高めるために、次に１０ｇ／Ｌでのトリプシン消化時間を評価した。４時間の消化時間は、両方のプロセス複製物において最低レベルのスパイクされたタンパク質ＬｉｐＡ（０．０５８ｐｐｍ）及び少なくとも１回の８つ全てのタンパク質を同定し、したがって最良の条件と考えられた（図６Ａ）。消化時の２５ｇ／Ｌタンパク質濃度は一貫してＬＰＬＡ２のより良好な検出を示したため、２５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌタンパク質濃度の４時間トリプシン消化物を更に比較した。図６Ｂは、２５ｇ／Ｌの４時間の条件が、全ての試験条件下で、０．１ｐｐｍ以上で５つ全てのスパイクされたタンパク質を同定し、０．１ｐｐｍ未満で３つの添加タンパク質のうち２つを同定したが、１０ｇ／Ｌは０．１ｐｐｍでＬＰＬＡ２を同定することができず、同定されたペプチド及びタンパク質が全体的に少なかったことを示す。図７は、ＬｉｐＡに対する一貫した０．０５８ｐｐｍの感度及び０．１ｐｐｍ以上の他のヒドロラーゼを同定するためのロバスト性を実証する（ｎ＝３）。この方法によるこれらの結果は、現在の最先端の方法に比べて感度の著しい改善、すなわち、ネイティブ消化法を用いた最近の報告と比較して、以前に報告された方法感度（１０ｐｐｍ）の大部分よりも１００倍超の感度向上及び約１０倍の感度向上を表す。
低レベル（０．１ｐｐｍ）の感度を更に微調整し、方法のロバスト性を高めるために、次に１０ｇ／Ｌでのトリプシン消化時間を評価した。４時間の消化時間は、両方のプロセス複製物において最低レベルのスパイクされたタンパク質ＬｉｐＡ（０．０５８ｐｐｍ）及び少なくとも１回の８つ全てのタンパク質を同定し、したがって最良の条件と考えられた（図６Ａ）。消化時の２５ｇ／Ｌタンパク質濃度は一貫してＬＰＬＡ２のより良好な検出を示したため、２５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌタンパク質濃度の４時間トリプシン消化物を更に比較した。図６Ｂは、２５ｇ／Ｌの４時間の条件が、全ての試験条件下で、０．１ｐｐｍ以上で５つ全てのスパイクされたタンパク質を同定し、０．１ｐｐｍ未満で３つの添加タンパク質のうち２つを同定したが、１０ｇ／Ｌは０．１ｐｐｍでＬＰＬＡ２を同定することができず、同定されたペプチド及びタンパク質が全体的に少なかったことを示す。図７は、ＬｉｐＡに対する一貫した０．０５８ｐｐｍの感度及び０．１ｐｐｍ以上の他のヒドロラーゼを同定するためのロバスト性を実証する（ｎ＝３）。この方法によるこれらの結果は、現在の最先端の方法に比べて感度の著しい改善、すなわち、ネイティブ消化法を用いた最近の報告と比較して、以前に報告された方法感度（１０ｐｐｍ）の大部分よりも１００倍超の感度向上及び約１０倍の感度向上を表す。
【0158】
実施例７：ｍＡｂ－３にスパイクされたＵＰＳ－１タンパク質の同定
タンパク質同定の所望の感度を達成するために試料負荷を調節する有効性を更に確認するため、微量レベルのＨＣＰをシミュレートするために既知レベルの４８個のＵＰＳ－１タンパク質をスパイクしたｍＡｂ－３試料を分析した。０．１０～１．３４ｐｐｍレベルの間でスパイクされたＵＰＳ－１タンパク質を有するｍＡｂ－３試料を使用して、０．１ｐｐｍ感受性を確認した。表３は、４１（８５．４％）以上のＵＰＳ－１タンパク質が、３００μｇ試料負荷量で０．１ｐｐｍ以上（それぞれ約４．８フェムトモル）で一貫して同定されたことを示しており、広いＭＷ範囲のタンパク質（６．３～８２．９ｋＤａ ＭＷ）にわたって予想される感度（ｎ＝２）を実証している。同様に、０．１６～２．２１ｐｐｍの範囲でＵＰＳ－１タンパク質を含有する別のｍＡｂ－３試料を使用して、３０μｇの出発物質からの消化物を使用して１ｐｐｍの感度を確認した。０．５９ｐｐｍ～２．２１ｐｐｍレベルの１６のＵＰＳ－１タンパク質が全て同定され（ｎ＝２）（表４）、所望の１ｐｐｍ感度が確認された。
タンパク質同定の所望の感度を達成するために試料負荷を調節する有効性を更に確認するため、微量レベルのＨＣＰをシミュレートするために既知レベルの４８個のＵＰＳ－１タンパク質をスパイクしたｍＡｂ－３試料を分析した。０．１０～１．３４ｐｐｍレベルの間でスパイクされたＵＰＳ－１タンパク質を有するｍＡｂ－３試料を使用して、０．１ｐｐｍ感受性を確認した。表３は、４１（８５．４％）以上のＵＰＳ－１タンパク質が、３００μｇ試料負荷量で０．１ｐｐｍ以上（それぞれ約４．８フェムトモル）で一貫して同定されたことを示しており、広いＭＷ範囲のタンパク質（６．３～８２．９ｋＤａ ＭＷ）にわたって予想される感度（ｎ＝２）を実証している。同様に、０．１６～２．２１ｐｐｍの範囲でＵＰＳ－１タンパク質を含有する別のｍＡｂ－３試料を使用して、３０μｇの出発物質からの消化物を使用して１ｐｐｍの感度を確認した。０．５９ｐｐｍ～２．２１ｐｐｍレベルの１６のＵＰＳ－１タンパク質が全て同定され（ｎ＝２）（表４）、所望の１ｐｐｍ感度が確認された。
【表3】
【表4】
【0159】
実施例８：ＲＭ８６７１ ＮＩＳＴ ｍＡｂにおいて同定されたＨＣＰ
タンパク質、例えば、残留ＨＣＰを同定するための標的非依存方法の感度及びロバスト性を更に実証するために、及び最近の報告との比較を可能にするために、ＲＭ８６７１ ＮＩＳＴ抗体について分析を行った。この方法は、これらの試料中のこれらの特定のＨＣＰの存在の先験的な知識に依存しないため、標的非依存的アプローチと考えられる。本明細書に記載の方法に基づいて、平均５９９．５個のタンパク質及び３５８９．５個のユニークなペプチド（３０μｇ負荷分析）並びに７２２個のタンパク質及び４３６３．５個の固有のペプチド（３００μｇ負荷分析）を同定した（表５）。本分析は、ＲＭ８６７１ ＮＩＳＴ抗体におけるＨＣＰについて報告された最良の結果（６０２のタンパク質について２７２５のペプチド）よりも多くの固有のペプチド及びタンパク質を同定し、ＨＣＰ分析のための本方法の高い感度及びロバスト性を更に確認した。さらに、平均９０％（３０μｇ負荷）及び８８％（３００μｇ負荷）のタンパク質が、プロセス複製分析において一般的であり、分析の高い再現性を示した。予想通り、３０μｇ負荷分析からのタンパク質の９３％超が３００μｇ負荷の分析でも見出され、３００μｇ負荷分析のより高い感度を確認した。３０μｇ負荷分析と比較して３００μｇ負荷分析から同定された追加のタンパク質は、０．１～１ ｐｐｍのレベルで存在する可能性が高い。
タンパク質、例えば、残留ＨＣＰを同定するための標的非依存方法の感度及びロバスト性を更に実証するために、及び最近の報告との比較を可能にするために、ＲＭ８６７１ ＮＩＳＴ抗体について分析を行った。この方法は、これらの試料中のこれらの特定のＨＣＰの存在の先験的な知識に依存しないため、標的非依存的アプローチと考えられる。本明細書に記載の方法に基づいて、平均５９９．５個のタンパク質及び３５８９．５個のユニークなペプチド（３０μｇ負荷分析）並びに７２２個のタンパク質及び４３６３．５個の固有のペプチド（３００μｇ負荷分析）を同定した（表５）。本分析は、ＲＭ８６７１ ＮＩＳＴ抗体におけるＨＣＰについて報告された最良の結果（６０２のタンパク質について２７２５のペプチド）よりも多くの固有のペプチド及びタンパク質を同定し、ＨＣＰ分析のための本方法の高い感度及びロバスト性を更に確認した。さらに、平均９０％（３０μｇ負荷）及び８８％（３００μｇ負荷）のタンパク質が、プロセス複製分析において一般的であり、分析の高い再現性を示した。予想通り、３０μｇ負荷分析からのタンパク質の９３％超が３００μｇ負荷の分析でも見出され、３００μｇ負荷分析のより高い感度を確認した。３０μｇ負荷分析と比較して３００μｇ負荷分析から同定された追加のタンパク質は、０．１～１ ｐｐｍのレベルで存在する可能性が高い。
【表5】
【0160】
３０μｇ及び３００μｇの試料負荷量で、本研究は、元のネイティブ消化法においてＲＭ ８６７０ ＮＩＳＴ ｍＡｂについて報告された６０のタンパク質のうち５８～５９を同定した。本開示では、それぞれ３０μｇ及び３００μｇの負荷分析から、報告された６０２のタンパク質のうち平均４２１（約７０％）及び４６６．５（約７７％）のタンパク質が同定された。さらに、６０２のタンパク質の上位１９９（それぞれ５以上のペプチド数）の９５％もまた、本発明者らの３００μｇ負荷分析によって見出された。タンパク質同定の違いは、方法の違いによる可能性があり、以前の報告では、ネイティブ消化条件に追加のプロテインＡ枯渇及びＦＡＩＭＳ気相分離を適用した。
【0161】
ネイティブ消化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳワークフローの様々な態様の評価を通して、本方法は、ＤＤＡ法によるＨＣＰ検出について最も高い感度（０．１ｐｐｍ）及びＲＭ８６７１ＮＩＳＴ ｍＡｂについて最も高いＨＣＰカバー率（合計８４５のタンパク質）を示す。消化時に５ｇ／Ｌタンパク質濃度で酵素比を同定した以前の研究とは対照的に、本研究は、低レベルＨＣＰの同定及び定量においてより高いタンパク質濃度の利点を示した。本研究はまた、予測可能な消化条件が広範囲の濃度（２．５～２５ｇ／Ｌ）を有する代表的な製剤試料について確立され得ることを示す最初の研究である。この方法を並行反応モニタリング（ＰＲＭ）と組み合わせると、本研究では、元の精製プロセス（ＬｉｐＡ及びＳＭＰＤ１等）を使用して、ｍＡｂ－１中０．０１ｐｐｍ（表７）という低いレベルで提示された加水分解酵素を同定及び定量することができたが、これらは極めて低いレベルであるためにＤＤＡからは同定されなかった。標的加水分解酵素のレベルは、元の精製プロセスを改変した後に低下した。精製修飾は、追加の精製工程を追加することによってＨＣＰ除去を改善するように設計されたため、結果は、バイオプロセス開発を支援するために既知の標的加水分解酵素のクリアランスを監視するための本方法の有用性を示す。
＊標準添加ベースのアプローチを使用して、ｍＡｂ－１の精製プロセスに改変を適用する前後のヒドロラーゼクリアランスを監視した。最初に、０ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ及び１ｐｐｍの加水分解酵素標準をそれぞれ添加することによって、各試験試料について一連の標準添加試料を作成した。次いで、各標準添加試料を本明細書に記載のネイティブ消化プロトコルに供し、各加水分解酵素について２つのトップ応答ペプチドを用いてＰＲＭ分析に供した。Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアを使用してデータ分析を行い、次いで、Ｓｐｉｋｅｄ ＨＣＰレベル（ｐｐｍ）をＸ軸とし、標的化ペプチドの全フラグメントイオンの合計ピーク面積をＹ軸として、各タンパク質の標的化ペプチドの標準添加プロットを作成した。各関数Ｙ＝ｍＸ＋ｂについて、試験試料中の標的ＨＣＰのｐｐｍレベルはｂ／ｍに等しく、純度が＜１００％である場合、元のスパイクされたタンパク質ストック標準の純度パーセントを掛けたものである。タンパク質の２つのペプチドが異なる数を示した場合、ＨＣＰ定量のために最高レベル（太字）を採用した。ペプチドが検出されなかった場合、それをＮＤと表記した。
【表7】
【0162】
本開示は、組換えｍＡｂ治療薬の精製プロセス内プール、原薬又は製剤試料中の広範囲のタンパク質サイズにわたって０．１ｐｐｍ以上の残留ＨＣＰを高感度かつロバストに同定するためのネイティブ消化物ベースのワークフローの改善を実証する。本研究では、固相抽出（ＳＰＥ）工程が、ＬＣ－ＭＳ分析のロバスト性のためにペプチドから未消化ｍＡｂをより確実に除去するために有益であることが見出された。本開示はまた、低レベルの残留ＨＣＰの回収、同定、及び定量における消化でのＳＤＣ添加、改善されたウシトリプシン対タンパク質比及び高タンパク質濃度（２５ｇ／Ｌ）の有効性を実証した。この改善されたワークフローにより、最大約３００μｇの出発物質からのネイティブ消化物を、高感度でロバストなＨＣＰ分析に適用することができる。本明細書に記載の方法は、試料負荷の量を比例的に調整することによって、０．１～５ｐｐｍの範囲の所望の感度を達成するように調節できることも示された。この調節された戦略は、安全性リスク評価からバイオプロセス開発にまで及ぶ広範囲のＨＣＰアッセイの必要性に対処するための単一の簡単で柔軟なアッセイの使用を可能にする。さらに、ワークフローは、未知のタンパク質同定のためのＤＤＡ、又は更に高い感度（０．０１ｐｐｍ）での目的のタンパク質の標的化分析のいずれかで使用することができる。
【0163】
本明細書で引用される全ての公報、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が本開示に組み込まれている。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】