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特表2024-523332多能性幹細胞からナチュラルキラー細胞を産生するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】多能性幹細胞からナチュラルキラー細胞を産生するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20240621BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240621BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N5/10
A61P35/00
A61P35/02
A61K35/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577490
(86)(22)【出願日】2022-06-14
(85)【翻訳文提出日】2024-02-13
(86)【国際出願番号】 IB2022055504
(87)【国際公開番号】W WO2022264033
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/210,683
(32)【優先日】2021-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】カオ、ラン
(72)【発明者】
【氏名】チャン、フイ－シン
(72)【発明者】
【氏名】フー、ジャンシン
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ユ
(72)【発明者】
【氏名】シ、シ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BB02
4B065BB19
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB64
4C087MA13
4C087MA16
4C087MA56
4C087MA66
4C087MA67
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
本開示は、とりわけ、人工多能性細胞からナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）で濃縮した細胞集団を効率的に産生するための方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法であって、（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞集団を培養するステップと、
（Ｂ）前記第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、
（Ｃ）前記第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによってＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記方法が、単離ステップを伴わずに行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（Ｂ）の後にＣＤ４－細胞を単離してから、前記単離した細胞をステップ（Ｃ）における前記第３の条件セットと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＣＤ４－細胞を前記単離することが、前記細胞集団からＣＤ４＋細胞を除去することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法であって、前記方法が、（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞集団を培養するステップと、
（Ｂ）前記第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、
（Ｃ）前記第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによってＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含み、前記方法が、単離ステップを伴わずに行われる、前記方法。
【請求項6】
少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む前記細胞集団が、少なくとも５％のＣＤ４＋細胞を更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
ＮＫ細胞で濃縮した前記細胞集団が、少なくとも３０％のＮＫ細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（Ｂ）における前記もたらされた細胞集団が、少なくとも１０％、１５％、または２０％のＣＤ４－細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
ステップ（Ｂ）における前記ＣＤ４－細胞が、ＣＤ８＋細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（Ｂ）における前記ＣＤ４－細胞が、ＣＤ８－細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（Ｂ）における前記もたらされた細胞集団が、２０～５５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記もたらされた細胞集団が、２５～５５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記第１の条件セットが、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記第１の条件セットが、ＢＭＰ４を５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＢＭＰ４が、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記第１の条件セットが、ＶＥＧＦを５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＶＥＧＦが、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記第１の条件セットが、ｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ｂＦＧＦが、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記第１の条件セットが、アスコルビン酸を５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記アスコルビン酸が、５０μｇ／ｍＬの濃度である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記第１の条件セットが、Ｆｌｔ３Ｌを１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記Ｆｌｔ３Ｌが、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記第１の条件セットが、ＴＰＯを１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項１５～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＴＰＯが、１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記第２の条件セットが、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記第２の条件セットが、アスコルビン酸を５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記アスコルビン酸が、５０μｇ／ｍＬの濃度である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記第２の条件セットが、ＳＣＦを５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記第２の条件セットが、ＩＬ－７を１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＩＬ－７が、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記第２の条件セットが、Ｆｌｔ３Ｌを１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記Ｆｌｔ３Ｌが、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第２の条件セットが、ＴＰＯを１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記ＴＰＯが、１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記第２の条件セットが、ｐ３８阻害剤を０．５μＭ～１００μＭの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ｐ３８阻害剤が、ＳＢ２０３５８０である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ＳＢ２０３５８０が、１５μＭの濃度である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記第２の条件セットが、ＳＤＦ－１を１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項２８～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＳＤＦ－１が、３０ｎＭの濃度である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記第３の条件セットが、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記第３の条件セットが、ＩＬ－２を１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記ＩＬ－２が、１０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記第３の条件セットが、ＩＬ－７を１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記ＩＬ－７が、１０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記培養するステップの各々が、約５％の酸素で行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記培養するステップの各々が、１４％超の酸素で行われる、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記培養するステップの各々が、大気中酸素で行われる、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記培養するステップの各々が、５％未満の酸素で行われる、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記第１の条件セットで多能性幹細胞を培養してＨＰＣバルクを得ることが、１０日を超えて持続する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記第１の条件セットで多能性幹細胞を培養してＨＰＣバルクを得ることが、１１～１５日間持続する、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記第１の条件セットで多能性幹細胞を培養してＨＰＣバルクを得ることが、１４日間持続する、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記ｉＰＳＣが、末梢血単核細胞から得られる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
産生された細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、またはそれ以上が、濃縮のステップを伴わないＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
産生された細胞の約２５％未満が、ＣＤ３＋細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
産生された細胞のパーセンテージが、フローサイトメトリーによって決定される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項60】
産生された細胞のパーセンテージが、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって決定される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項61】
ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を単離することを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記単離することが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気選別を含む、請求項３、４、及び６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
前記ＮＫ細胞が、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
抗原が、ＣＤ１９である、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記ＮＫ細胞が、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するように更に遺伝子改変されている、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項66】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ＮＫ細胞を産生する方法であって、以下の、（１）ｉＰＳＣを、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地を含む第１の条件セットで培養して、少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む集団を得るステップと、
（２）（１）で得られた前記ＨＰＣバルクを、アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含む培養培地を含む第２の条件セットで培養して、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（３）（２）からの前記細胞集団を、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む第３の条件セットで培養するステップと、を含む、前記方法。
【請求項67】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ＮＫ細胞を産生する方法であって、以下の、（１）造血前駆細胞（ＨＰＣバルク）を含むバルク細胞集団を、アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含む培養培地を含む第２の条件セットで培養して、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（２）（１）からの前記ＣＤ４－細胞を単離するステップと、
（３）前記単離したＣＤ４－細胞を、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含むＮＫ誘導培地で培養するステップと、を含む、前記方法。
【請求項68】
ステップ（１）で得られた前記細胞集団における約１５～３０％の前記細胞が、ＣＤ４－細胞である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項69】
ステップ（１）で得られた前記細胞集団における約２０％の前記細胞が、ＣＤ４－細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
ＣＤ４－細胞を含む前記細胞集団が、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項71】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法を使用して産生された、ＮＫ細胞集団。
【請求項72】
前記ＮＫ細胞集団が、凍結保存媒体中に凍結保存される、請求項７１に記載のＮＫ細胞集団。
【請求項73】
多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を、全多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋細胞の６０％以上の比率で含む、未選別細胞集団。
【請求項74】
前記未選別細胞集団における２５％未満の細胞が、ＣＤ３＋細胞である、請求項７３に記載の未選別細胞集団。
【請求項75】
前記未選別細胞集団における５％未満の細胞が、単球である、請求項７３または７４に記載の未選別細胞集団。
【請求項76】
前記未選別細胞集団における５％未満の細胞が、Ｂ細胞である、請求項７３または７４に記載の未選別細胞集団。
【請求項77】
前記未選別細胞集団における細胞のパーセンテージが、フローサイトメトリーによって決定される、請求項７３～７６のいずれか１項に記載の未選別集団。
【請求項78】
細胞のパーセンテージが、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって決定される、請求項７３～７６のいずれか１項に記載の未選別集団。
【請求項79】
細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に先行請求項のいずれか１項に記載のＮＫ細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項80】
前記対象が、がんを有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む細胞集団を産生する方法であって、多能性幹細胞の集団を、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地を含む第１の条件セットで培養して、ＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む集団を得ることを含む、前記方法。
【請求項83】
請求項８２に記載の方法によって産生されたＨＰＣを含む、細胞集団。
【請求項84】
前記細胞集団が、少なくとも２０％のＣＤ３４＋細胞を含む、請求項８３に記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年６月１５日に出願された米国仮出願第６３／２１０，６８３号の優先権を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年６月１５日に出願された米国仮出願第６３／２１０，６８３号の優先権を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫系の細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞は、がん性、病原体感染、その他の損傷を受けた細胞に対して細胞傷害性である。ＮＫ細胞は、自然リンパ球（ＩＬＣ）であり、特に免疫応答の自然アームと適応アームとを架橋する大きい顆粒状の細胞傷害性リンパ球である。それらは、末梢血中の循環リンパ球の１０～１５％を構成する。ＮＫ細胞はまた、免疫系内で最高レベルの細胞傷害性活性を呈する。したがって、ＮＫ細胞の機能及び数の変化は、感染及びがんに対する免疫系の機能に影響を与える。
【0003】
ＮＫ細胞は、特定の細胞表面抗原受容体を含まない。このため、ＮＫ細胞は、事前の感作なく、がん性の病原体感染細胞を死滅させ得、自然免疫応答の一部にし得る。それらはまた、適応免疫応答に直接影響を与えることにより、腫瘍免疫監視においてある役割を有する。これらの特徴及び他の特徴により、ＮＫ細胞は、養子細胞療法で使用するために、特に魅力的な細胞種となる。
【0004】
多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））または前駆細胞からＮＫ細胞を得るための様々なプロトコルが報告されている。しかし、既に報告されているプロトコルは、労力を要し、細胞単離のステップなど、時間を要する複数のステップを必要とし、ＮＫ細胞を産生するための製造／産生時間及び財政上のコストの増大となる。
【0005】
ＮＫ細胞ベースの療法の開発が勢いを増し始めており、かかる細胞療法を製造するためのより効率的で堅牢な方法が必要である。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、とりわけ、ＮＫ細胞を産生する改善された方法を提供する。ＮＫ細胞は、一般に、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞であることを特徴とする。本開示は、多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））に由来するバルク細胞集団からのＮＫ細胞の効率的で堅牢な産生の驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。ＮＫ細胞の産生のための本明細書で提供される方法は、単離ステップを伴わずに行われる方法、ならびに１つ以上の単離ステップが行われる方法を含む。本明細書に記載されるように、本開示は、系統に基づいた任意の細胞種の単離を必要とすることなく、バルク細胞集団からＮＫ細胞を首尾よく誘導することができることを予想外に示す。代替的に、いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の単離ステップを使用して行うことができる。本開示は、単に培養条件を変更することによるか、またはＮＫ細胞に分化する中間体としてＣＤ４－細胞を含む細胞集団を単離するいずれかによって、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をｉＰＳＣまたは造血前駆細胞（ＨＰＣ）バルクから誘導することができるという、予期せぬ驚くべき発見に基づいている。本明細書に記載の方法は、例えば、コスト及び時間の効率的手段で大量のＮＫ細胞をスケールアップ及び産生する能力を含む、ＮＫ細胞を産生する既存の方法を超える多くの利点を有する。したがって、本明細書に記載の方法は、ＮＫ細胞ベースの療法のための効率的で堅牢な製造プロセスを示す。
【0007】
本明細書に記載の方法によって産生されるｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞（本明細書では「ｉＮＫ細胞」とも称される）は、機能的であり、特定の細胞集団を標的とするＣＡＲの導入などを通じて、更に遺伝子改変することができる。
【0008】
いくつかの態様では、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法が提供され、方法は、
（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞集団を培養するステップと、
（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、
（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによって、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含む。
（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞集団を培養するステップと、
（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、
（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによって、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、方法は、単離ステップを伴わずに行われる。
【0010】
いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（Ｂ）の後にＣＤ４－細胞を単離してから、単離した細胞をステップ（Ｃ）における第３の条件セットと接触させることを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を単離するステップは、細胞集団からＣＤ４＋細胞を除去するか、または残りの細胞からＣＤ４＋細胞を分離し、ＣＤ４表面マーカーを本質的に欠く残存細胞をＮＫ細胞に分化させることを含む。
【0012】
いくつかの態様では、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法が提供され、方法は、
（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞集団を培養するステップと、
（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞ならびに少なくとも５％のＣＤ４＋細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、
（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによって、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含み、方法は、単離ステップを伴わずに行われる。
（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞集団を培養するステップと、
（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞ならびに少なくとも５％のＣＤ４＋細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、
（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによって、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含み、方法は、単離ステップを伴わずに行われる。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団は、少なくとも３０％のＮＫ細胞を含む。例えば、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５０％超のＮＫ細胞を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、少なくとも１０％、１５％、または２０％のＣＤ４－細胞を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、少なくとも１０％のＣＤ４－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、少なくとも１５％のＣＤ４－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ４－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団はまた、ＣＤ４＋細胞を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）におけるＣＤ４－細胞は、ＣＤ８＋細胞である。
【0016】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）におけるＣＤ４－細胞は、ＣＤ８－である。
【0017】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、２０～５５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、２０％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、２５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、３０％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、３５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、４０％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、４５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、５０％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、５５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、２５～５５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約２５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約３０％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約３５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約４０％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約４５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約５０％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、約５５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）でもたらされる細胞集団は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞及び／またはＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞である少なくとも５％の細胞を更に含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。
【0021】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【0022】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＢＭＰ４を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＶＥＧＦを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ｂＦＧＦを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、アスコルビン酸を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、Ｆｌｔ３Ｌを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＴＰＯを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＴＧＦβ阻害剤を含む培養培地を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＢＭＰ４を５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、第１の条件セットは、ＢＭＰ４を５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、または２５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0025】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＶＥＧＦを５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＶＥＧＦを５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、または２５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦは、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0027】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、または２５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦは、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0029】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、アスコルビン酸を５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、アスコルビン酸を５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、または２５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、アスコルビン酸は、５０μｇ／ｍＬの濃度である。
【0031】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、Ｆｌｔ３Ｌを１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、Ｆｌｔ３Ｌを５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0033】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＴＰＯを１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＴＰＯを５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、ＴＰＯは、１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0035】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、アスコルビン酸を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＳＣＦを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＩＬ－７を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、Ｆｌｔ３Ｌを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＴＰＯを含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ｐ３８阻害剤を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＳＤＦ－１を含む培養培地を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、アスコルビン酸を５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、アスコルビン酸を５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、または２５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、アスコルビン酸は、５０μｇ／ｍＬの濃度である。
【0038】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＳＣＦを５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＳＣＦを５ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、ＳＣＦは、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0040】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＩＬ－７を１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＩＬ－７を１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－７は、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0042】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、Ｆｌｔ３Ｌを１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬを含む培養培地を含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌの濃度である。
【0044】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＴＰＯを１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＴＰＯを１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１２５ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＴＰＯは、１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0046】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ｐ３８阻害剤を０．５μＭ～１００μＭの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ｐ３８阻害剤を０．５μＭ～２５μＭ、０．５μＭ～５０μＭ、０．５μＭ～１００μＭの濃度で含む培養培地を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＳＢ２０３５８０である。
【0048】
いくつかの実施形態では、ＳＢ２０３５８０は、濃度１５μＭである。
【0049】
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＳＤＦ－１を１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、ＳＤＦ－１を１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１は、３０ｎＭの濃度である。
【0051】
いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＣＤ３活性化因子を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－２を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－７を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－２を１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。例えば、いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－２を１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0054】
いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－７を１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養培地を含む。例えば、いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－７を１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－７は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【0056】
いくつかの実施形態では、培養するステップの各々は、約５％の酸素で行われる。
【0057】
いくつかの実施形態では、培養するステップの各々は、１４％超の酸素で行われる。
【0058】
いくつかの実施形態では、培養するステップの各々は、大気中酸素で行われる。
【0059】
いくつかの実施形態では、培養するステップの各々は、５％未満の酸素で行われる。例えば、いくつかの実施形態では、培養するステップは、５％未満の酸素、４％未満の酸素、３％未満の酸素、２％未満の酸素、または１％未満の酸素で行われる。
【0060】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットで多能性幹細胞を培養してＨＰＣバルクを得ることは、１０日を超えて持続する。
【0061】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットで多能性幹細胞を培養してＨＰＣバルクを得ることは、１１～１５日間持続する。
【0062】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットで多能性幹細胞を培養してＨＰＣバルクを得ることは、１４日間持続する。
【0063】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血単核細胞から得られる。
【0064】
いくつかの実施形態では、産生された細胞集団における少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、またはそれ以上の細胞は、濃縮のステップを伴わないＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞である。
【0065】
いくつかの実施形態では、産生された細胞集団における約２５％未満の細胞が、ＣＤ３＋細胞である。
【0066】
いくつかの実施形態では、産生された細胞集団における細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定される。
【0067】
いくつかの実施形態では、産生された細胞集団における細胞のパーセンテージは、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって決定される。
【0068】
いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を単離することを更に含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、単離することは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気選別を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変される。
【0071】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲである。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するように更に遺伝子改変される。
【0073】
いくつかの態様では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ＮＫ細胞を産生する方法が提供され、方法は、以下の、
（１）ｉＰＳＣを、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地を含む第１の条件セットで培養して、少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む集団を得るステップと、
（２）（１）で得られたＨＰＣバルクを、アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含む培養培地を含む第２の条件セットで培養して、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（３）（２）からの細胞集団を、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む第３の条件セットで培養するステップと、を含む。
（１）ｉＰＳＣを、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地を含む第１の条件セットで培養して、少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む集団を得るステップと、
（２）（１）で得られたＨＰＣバルクを、アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含む培養培地を含む第２の条件セットで培養して、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（３）（２）からの細胞集団を、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む第３の条件セットで培養するステップと、を含む。
【0074】
いくつかの態様では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ＮＫ細胞を産生する方法が提供され、本方法は、以下の、
（１）造血前駆細胞（ＨＰＣバルク）を含むバルク細胞集団を、アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含む培養培地を含む第２の条件セットで培養して、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（２）（１）からＣＤ４－細胞を単離するステップと、
（３）単離したＣＤ４－細胞を、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含むＮＫ誘導培地で培養するステップと、を含む。
（１）造血前駆細胞（ＨＰＣバルク）を含むバルク細胞集団を、アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含む培養培地を含む第２の条件セットで培養して、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（２）（１）からＣＤ４－細胞を単離するステップと、
（３）単離したＣＤ４－細胞を、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含むＮＫ誘導培地で培養するステップと、を含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、ステップ（１）で得られた細胞集団における約１５～３０％の細胞は、ＣＤ４－細胞である。
【0076】
いくつかの実施形態では、ステップ（１）で得られた細胞集団における約２０％の細胞は、ＣＤ４－細胞である。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。
【0078】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法を使用して産生されたＮＫ細胞集団が提供される。
【0079】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して産生されたＮＫ細胞集団は、凍結保存媒体中に凍結保存される。
【0080】
いくつかの態様では、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を含む未選別細胞集団が提供され、本明細書に記載の方法に従って得られた全多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋細胞の少なくとも６０％の比率で存在する。
【0081】
いくつかの実施形態では、未選別細胞集団における２５％未満の細胞が、ＣＤ３＋細胞である。
【0082】
いくらかの実施形態では、未選別細胞集団における５％未満の細胞が、単球である。
【0083】
いくつかの実施形態では、未選別細胞集団における５％未満の細胞が、Ｂ細胞である。
【0084】
いくつかの実施形態では、未選別細胞集団における細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定される。
【0085】
いくつかの実施形態では、細胞のパーセンテージは、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって決定される。
【0086】
いくつかの態様では、細胞療法を必要とする対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に先行請求項のいずれか１項に記載のＮＫ細胞を投与することを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。
【0088】
いくつかの実施形態では、がんは、白血病またはリンパ腫である。
【0089】
いくつかの態様では、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む細胞集団を産生する方法が提供され、方法は、多能性幹細胞の集団を、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地を含む第１の条件セットで培養して、ＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む集団を得ることを含む。
【0090】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法によって産生されたＨＰＣを含む細胞集団が提供される。
【0091】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ３４＋細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図1】本明細書に記載の方法を使用して得られたＮＫ細胞バルク集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す一連のフローサイトメトリープロットである。簡潔に述べると、ｉＰＳ細胞は、中間の単離ステップなく、本明細書に記載の通り培養された。フローサイトメトリーグラフは、ＣＤ５６ｈｉｇｈであるＣＤ３陰性細胞の集団（ＮＫ細胞バルク集団のおよそ６３．５％）及びＣＤ５６ｄｉｍであるＣＤ３陰性細胞の集団（ＮＫ細胞バルク集団のおよそ２６．７％）の存在を示している。これらの集団は両方とも、ＮＫ細胞である。したがって、得られたＣＤ５６陽性、ＣＤ３陰性のＮＫ細胞集団の合計は、細胞集団全体の９０％を超えている。
【図2】本明細書に記載の方法を使用して得られたＮＫ細胞バルク集団のｓｃＲＮＡ分析の結果を示す。簡潔に述べると、ｉＰＳＣは、中間の単離ステップなく、本明細書に記載の通り培養された。細胞は、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ細胞の４つの細胞集団に分類した。ＮＫ細胞バルク集団中の細胞のおよそ７５％が、ＮＫ細胞として同定され（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞）、バルク細胞集団中の細胞の約２５％が、Ｔ細胞として同定された。本明細書に記載のＴ細胞は、ＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋細胞）を含み得る。
【図3】ルシフェラーゼ発現性Ｎａｌｍ６細胞を投与され、続いてｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞が投与されたＮＳＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ、ＩＬ－２Ｒガンマヌル）マウスにおける抗腫瘍活性アッセイの結果を示す一連の写真を示す。Ｎａｌｍ６細胞移植ＮＳＧマウスを（ａ）ＰＢＳ緩衝液（ｂ）ｉＮＫ－ＣＡＲ細胞で処理し、これらの処理の抗腫瘍有効性を観察した。データは、ｉＮＫ－ＣＡＲ細胞がＮａｌｍ６細胞の増殖を減少させたことを示す。
【0093】
定義
投与すること：本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」、「導入すること」、または「導入」という用語は、治療細胞、例えば、ｉＰＳＣまたはＨＰＣ由来ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞）を、かかる細胞の送達をもたらす方法または経路によって、対象に送達する文脈において互換的に使用される。例えば、静脈内、局所、経口、筋肉内、腹腔内、髄腔内、皮下または経皮など、細胞を投与するための様々な方法が当技術分野で知られている。細胞は、担体とともに、または伴わずに投与することができる。
投与すること：本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」、「導入すること」、または「導入」という用語は、治療細胞、例えば、ｉＰＳＣまたはＨＰＣ由来ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞）を、かかる細胞の送達をもたらす方法または経路によって、対象に送達する文脈において互換的に使用される。例えば、静脈内、局所、経口、筋肉内、腹腔内、髄腔内、皮下または経皮など、細胞を投与するための様々な方法が当技術分野で知られている。細胞は、担体とともに、または伴わずに投与することができる。
【0094】
養子細胞療法：本明細書で互換的に使用される場合、「養子細胞療法」または「養子細胞移植」または「細胞療法」または「ＡＣＴ」という用語は、細胞、例えば、本明細書に記載の方法を使用して生成され、それを必要とする対象または患者に投与されるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞の集団を移植することを指す。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の方法を使用して作製され、加えてＣＡＲを発現するＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞である。
【0095】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚、昆虫、及び／またはワームが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物及び／またはクローンであり得る。
【0096】
抗原特異的標的化ドメイン：「抗原特異的標的化ドメイン」は、目的の標的抗原に結合する能力をＣＡＲに提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的標的化ドメインは、腫瘍死滅をもたらすエフェクター免疫応答を誘発することが望ましいであろう、臨床的に関心のある抗原を標的とする。抗原特異的標的化ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体もしくは腫瘍タンパク質、またはそれらの成分）を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。抗原特異的標的化ドメインには、目的の生体分子に対する、任意の天然に存在するか、合成か、半合成か、または組換えで産生された結合パートナーが含まれる。
【0097】
例示的な抗原特異的標的化ドメインとしては、例えば、抗体もしくは抗体断片もしくは誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはその受容体結合ドメイン、及び腫瘍結合タンパク質が挙げられる。
【0098】
いくつかの実施形態では、抗原特異的標的化ドメインは、抗体であるか、または抗体に由来する。抗体由来標的化ドメインは、抗体の断片、または抗体の１つ以上の断片の遺伝子操作産物であり得、この断片は、抗原との結合に関与している。例としては、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、及びラクダ科抗体（ＶＨＨ）が挙げられる。
【0099】
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、マウス、ヒト、またはヒト化ｓｃＦｖであり得る。
【0100】
同種異系：本明細書で使用される「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するように遺伝的に十分に異なり得る。
【0101】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、１つ以上の目的の値に適用されるとき、「およそ」または「約」という用語は、明言された言及値と同様な値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限り、さもなければ文脈から明白な場合を除いて、明言された言及値をいずれかの向き（上回るかまたは下回る）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に含まれる値の範囲を指す（この数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。「約」または「およそ」という用語が、明言された言及値を修飾するために使用される場合、明言された言及値自体は、明言された言及値のいずれかの側で明言された言及値に近い値とともに網羅されることが理解される。
【0102】
アスコルビン酸またはビタミンＣ：本明細書で使用される場合、「アスコルビン酸」または「ビタミンＣ」は、Ｌ－アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、「Ｌ－アスコルビン酸誘導体」は、生体内で酵素反応によってビタミンＣになる誘導体を意味する。Ｌ－アスコルビン酸の誘導体の例としては、ビタミンＣホスフェート、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、アスコルビルテトラヘキシルデカノエート、アスコルビルステアレート、及びアスコルビル２－ホスフェート６－パルミテートが挙げられる。ビタミンＣホスフェートの例としては、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートの塩、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートＮａ及びＬ－アスコルビン酸ホスフェートＭｇなどが挙げられる。一実施形態では、ビタミンＣは、アスコルビン酸２－ホスフェートであることができる。
【0103】
バルク細胞集団：「バルク細胞集団」、「バルク細胞」などという用語は、細胞の異種集団を指す。いくつかの実施形態では、バルク細胞集団は、造血細胞を含む。いくつかの実施形態では、バルク細胞集団は、多能性細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から得られ得る。いくつかの実施形態では、バルク細胞集団は、ドナー組織、例えば、血液などから得られる。
【0104】
ＣＤ４－誘導培地または第２の条件セット：ＣＤ４－誘導培地という用語は、「第２の条件セット」と互換的に使用される。本明細書で使用されるこれらの用語は、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るために使用される細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、この培地は、ＨＰ細胞バルクを、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団に分化させるために使用される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－誘導培地は、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７、ＳＢ２０３５８０などのｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１αなどのＳＤＦ１のうちの１つ以上、または全てを含む。
【0105】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、細胞（例えば、ＮＫ細胞などの免疫細胞、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせなどのＴ細胞）に抗原特異性を付与することができる、操作された受容体である。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られている。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、抗原特異的標的化ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、所望の細胞表面抗原またはＭＨＣ－ペプチド複合体に対する特異性を再指示するように、本明細書に記載の方法を使用して作製されたＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞）に導入される。これらの合成受容体は、通常、単一の融合分子内の柔軟なリンカーを介して１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連する標的結合ドメインを含む。標的結合ドメインは、ＮＫ細胞を病理学的細胞（例えば、がん細胞）の表面上の特定の標的に向けるために使用され、シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞の活性化及び増殖のための分子機構を含む。通常、ＮＫ細胞膜を通過する（すなわち、膜貫通ドメインを形成する）可撓性リンカーは、ＣＡＲの標的結合ドメインの細胞膜ディスプレイを可能にする。ＣＡＲは、リンパ腫及び固形腫瘍を含む、様々な悪性腫瘍からの腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して免疫細胞を首尾よく再指向させることを可能にしている（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．，２１（１ Ｐｔ １）：１２７－３０、Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，１１６（７）：１０３５－４４）。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の可変重鎖領域と軽鎖領域との融合に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成されていてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。あるいは、（例えば、Ｆａｂライブラリから得られた抗体由来ではなく）Ｆａｂに由来するｓｃＦｖを使用してもよい。様々な実施形態では、このｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合され、次に細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。少なくとも３世代のＣＡＲが開発されている。第１世代のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域またはＦｃ受容体ガンマ鎖に由来するシグナル伝達ドメインに付着した標的結合ドメインで構成させた。第１世代のＣＡＲは、免疫細胞を選択された標的に首尾よく再指向することが示されたが、インビボでの長期拡張及び抗腫瘍活性を提供することはできなかった。第２世代及び第３世代のＣＡＲでは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの共刺激分子を含めることにより、改変細胞の生存率を高め、増殖を増加させることに重点を置いている。
【0106】
培養：「培養」または「細胞培養」または「培養すること」という用語は、インビトロ環境における細胞の維持、成長、及び／または分化を指す。本明細書に記載の様々な方法において、細胞は、ある種の細胞の異なる種の細胞への成長または分化を容易にするかまたは促進する特定の細胞培養培地（複数可）で培養される。例えば、本明細書に記載のある特定の実施形態では、細胞培養培地中でｉＰＳＣを培養することは、細胞集団全体の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％の細胞が、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＨＰＣ）になることをもたらす。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のＨＰＣを含む細胞集団を培養することは、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらす。更に他の実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞の細胞集団を培養することは、濃縮したＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞集団をもたらす（すなわち、全細胞集団における少なくとも５０％の細胞がＣＤ５６＋／ＣＤ３－である）。細胞培養培地は、栄養素、ホルモン、及び／または細胞の増殖及び／または維持に役立つ他の因子の供給源として作用する。
【0107】
分化すること：「分化すること」、「誘導すること」、「変換すること」、「由来すること」などという用語は、ある表現型の細胞が別の表現型の細胞に変化するプロセスを指す。
【0108】
操作された：本明細書で使用されるとき、「操作された」という用語は、設計もしくは改変されており、及び／または存在及び産生が介入及び／または活性を必要とする、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明する。例えば、操作された細胞は、特定の効果を引き出すように意図的に設計されており、かつ同じ種の天然に存在する細胞の効果とは異なる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、本明細書に記載の方法を使用するｉＰＳＣまたはＨＰＣ由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞であり、キメラ抗原受容体を更に発現する。
【0109】
濃縮：特定の細胞種に関して本明細書で使用される「濃縮」という用語は、フローサイトメトリーまたは他の分析方法によって決定されたとき、細胞集団内に少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の特定の細胞種を有する細胞集団を意味する。
【0110】
エクスビボ：本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、細胞が生きた生物から取り出され、生物の外部で増殖されるプロセスを意味する（例えば、試験管内、培養バッグ内、バイオリアクター内）。
【0111】
機能的同等物または誘導体：本明細書で使用される場合、「機能的同等物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈において、元の配列と実質的に類似している生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持している分子を意味する。機能的誘導体または同等物は、天然の誘導体であり得るか、または合成的に調製される。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物学的活性が保存されているという条件で、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が挙げられる。置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸と類似の化学的物理的特性を有することが望ましい。望ましい類似の化学的物理的特性としては、電荷の類似性、かさ高さ、疎水性、親水性などが挙げられる。
【0112】
造血前駆細胞：「造血前駆細胞（複数可）」または「ＨＰＣ（複数可）」という用語は、造血系統に関与しているが、更なる造血分化が可能であり、造血幹細胞、多分化能造血幹細胞、骨髄球性共通前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、及びリンパ系前駆細胞を含むＣＤ３４＋細胞を指す。
【0113】
ＨＰＣバルク：「ＨＰＣバルク」、「造血前駆細胞バルク」、または「ＨＰ細胞バルク」という用語は、造血前駆細胞を含む異種細胞集団を意味する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、血液に由来する。
【0114】
ＨＰＣ由来ＮＫ細胞：「ＨＰＣ由来ＮＫ細胞」という用語は、細胞培養培地中で培養した後にＨＰＣバルク集団から得られるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞（例えば、ＮＫまたはＮＫ様細胞）を意味する。
【0115】
ＨＰＣ誘導培地及び第１の条件セット：本明細書で使用されるＨＰＣ誘導培地または「第１の条件セット」という用語は、出発細胞集団から造血細胞を含む細胞集団を生成するために使用される培養培地を指す。いくつかの実施形態では、出発細胞集団は、ｉＰＳＣを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、ＴＧＦβ阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦｌｔ３Ｌのうちの１つ以上を含む。
【0116】
免疫細胞：本明細書で使用される場合、「免疫細胞（複数可）」という用語は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、赤血球、単球、好塩基球、好中球、肥満細胞、好酸球、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、免疫系の細胞を指す。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して産生される免疫細胞は、ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を特徴とする。
【0117】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）：本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、例えば、１つ以上の遺伝子（限定されないが、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ：６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ：９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子ＩＤ：４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ：７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ：７９７２７）と組み合わせた（ＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ：５４６０）を含む）の発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成体細胞から人工的に引き出された（例えば、誘導された）多能性幹細胞を指す。幹細胞は、マーカーまたは遺伝子が培養の任意の段階まで保持されるように、マーカーまたは遺伝子を用いて任意の段階で遺伝子改変させ得る。マーカーは、培養の任意の段階で、分化したまたは未分化の幹細胞集団を精製または濃縮するために使用され得る。
【0118】
誘導培地：「誘導培地」という用語は、一般に、細胞集団を第１の細胞表現型から第２の細胞表現型に分化させるために使用される細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、第１の細胞表現型及び第２の細胞表現型は、異種細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、第１の細胞表現型は、異種細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞表現型は、異種細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、誘導培地は、異種細胞集団を実質的に同種である細胞の集団に分化させるために使用される。
【0119】
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物の内部ではなく人工環境、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養内などで生じる事象を指す。
【0120】
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベース系の文脈では、用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
【0121】
単離ステップ：本明細書で使用される「単離すること」、「単離するステップ」、「単離」、「単離ステップ」、または「細胞単離ステップ」という用語は、細胞の混合物から特定の細胞種を分離することを意味する。いくつかの実施形態では、細胞種は、特定の細胞種の細胞表面で存在、または非存在のいずれかである１つ以上のマーカーによって定義することができる。細胞の混合物から特定の細胞種を分離する様々な方法が当技術分野で知られており、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの磁気ビーズベースの選別戦略が挙げられる。
【0122】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー細胞」またはＮＫ細胞は、そのマーカー発現及び機能／活性によって定義されるリンパ系細胞である。例えば、ヒトでは、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現する（ＣＤ５６＋）。更なる実施形態では、かかるＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６を発現し得る（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。別の例では、かかるＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し得るが、ＣＤ３を発現しない（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－）。ＮＫ細胞は、様々なレベルのＣＤ５６を発現し得る。例えば、ＮＫ細胞は、「ＣＤ５６ｈｉｇｈ」であり得、これは、当技術分野の方法によって評価されたときに、例えばフローサイトメトリーによって評価されたときに、ＮＫ細胞が高レベルのＣＤ５６を発現することを意味する。別の例として、ＮＫ細胞は「ＣＤ５６ｄｉｍ」であり得、これは、当技術分野の方法によって評価されたときに、例えばフローサイトメトリーによって評価されたときに、ＮＫ細胞が低いが検出可能なレベルのＣＤ５６を発現することを意味する。
【0123】
ＮＫ誘導培地または第３の条件セット：いくつかの実施形態では、「ＮＫ誘導培地」または「第３の条件セット」という用語は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を含む細胞の集団を生成するために使用される細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞誘導培地は、ＩＬ－７、ＩＬ－２、及びＣＤ３活性化因子（例えば、抗ＣＤ３抗体）のうちの１つ以上を含む。
【0124】
ｉＰＳ ＮＫ細胞：本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ ＮＫ細胞」は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、例えば、出発物質としてのｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。かかるｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６（ＣＤ５６＋）を発現する。更なる実施形態では、かかるｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６を発現し得る（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。別の例では、かかるｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し得、ＣＤ３を発現し得ない（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－）。ｉＰＳ ＮＫ細胞は、本明細書では「ｉＮＫ細胞」とも称される。
【0125】
Ｔ細胞：本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」は、そのマーカー発現及び機能／活性によって定義されるリンパ系細胞である。例えば、ヒトでは、Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する。ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋細胞は、ＮＫＴ細胞として知られている。
【0126】
「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、直接的に、またはペプチドリンカー配列を介して、互いに接続されている軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む操作された抗体を指す。
【0127】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得、患者は、疾患の診断または治療のために医療提供者を訪れるヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書で「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に罹患しているか、またはそれに対して感受性であるが、疾患もしくは障害の症状を示し得るか、または示し得ない。
【0128】
罹患している：疾患、障害、及び／または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状を有すると診断されているか、またはそれらを示す。疾患は、がん、例えばリンパ腫及び白血病を含み得る。
【0129】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤（例えば、細胞療法）の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているかまたはそれらに感受性である対象へ投与するときに、疾患、障害、及び／または状態の症状（複数可）の発現を治療、診断、予防、及び／または遅延させるために十分な量（例えば、特定の細胞（複数可）の種（複数可）の特定のパーセンテージで濃縮された特定の数の細胞または細胞集団）を意味する。治療有効量は典型的に、少なくとも１単位用量を含む投与計画によって投与されるものであることが当業者によって認識されるであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、１つ以上の導入遺伝子を発現するように改変される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、例えばＣＤ１９などのキメラ抗原受容体を発現するように改変される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約１億～９億個のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約１億～７億個のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約１億～５億個のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約２億～９億個のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約２億～７億個のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約２億～５億個のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、それを必要とする対象に投与される。
【0130】
治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に軽減、改善、緩和、阻害、予防、それらの発症を遅延、それらの重症度を軽減、及び／またはそれらの発生率を低減するために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病状の発症リスクを低下させる目的で、疾患の兆候を示さない及び／または疾患の初期兆候のみを示す対象へも施され得る。
【0131】
本明細書での端点による数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれる全ての数値及び分数が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９、４、及び５が含まれる）。全ての数字及びその分数は、「約」という用語によって修飾されると推定されることも理解されるべきである。
【0132】
本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することは意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
【0133】
本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することは意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。
【発明を実施するための形態】
【0134】
本開示は、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞または造血前駆細胞（ＨＰＣ）バルクからＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法を提供する。ｉＰＳＣから産生されたＮＫ細胞は、本明細書では、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞、ｉＰＳ ＮＫ細胞、またはｉＮＫ細胞と称される。本開示は、単離ステップを必要とせずに、ｉＰＳＣなどの多能性細胞またはＨＰＣなどの前駆細胞をＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞に高効率で分化させることができる細胞培養方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、単離ステップを含む。単離ステップにおいて、ＣＤ４－（例えば、ＣＤ４－／ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４－／ＣＤ８－を含むなど、ＣＤ４＋細胞以外の細胞集団）である細胞は単離され得、その後、ＮＫ細胞に分化される。本開示はまた、本明細書に記載の方法を使用して得られたｉＰＳ ＮＫ細胞が機能的であり、例えば、がんなどの様々な疾患または障害の治療に有用なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入を通じて、更に遺伝子改変することができることを実証する。
【0135】
ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞（ＮＫ細胞）の様々な産生方法については、以下に更に詳述する。
【0136】
ＮＫまたはｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を産生する方法
培養方法の概説
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法が提供され、方法は、（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞の集団を培養するステップと、（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによってＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含む。
培養方法の概説
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する方法が提供され、方法は、（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞の集団を培養するステップと、（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによってＮＫ細胞で濃縮した細胞集団をもたらすステップと、を含む。
【0137】
いくつかの実施形態では、方法は、単離ステップを伴わずに行われる。このシナリオでは、ステップ（Ｂ）の後にＣＤ４－細胞の単離はない。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞で濃縮された細胞集団を産生する方法が提供され、方法は、（Ａ）少なくとも２０％のＣＤ３４＋ＨＰＣ（ＨＰＣバルク）を含む細胞集団をもたらす第１の条件セット下で多能性幹細胞の集団を培養するステップと、（Ｂ）第１の条件セットを第２の条件セットに変更し、それによって少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらすステップと、（Ｃ）第２の条件セットを第３の条件セットに変更し、それによってＮＫ細胞で濃縮された細胞集団をもたらすステップと、を含み、方法は、単離ステップを伴わずに行われる。
【0138】
ＣＤ４－細胞を含む細胞集団はまた、ＣＤ４＋細胞を含み得ることに留意されたい。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも５％のＣＤ４－細胞を含む細胞集団はまた、少なくとも５％のＣＤ４＋細胞を含む。
【0139】
本明細書に記載の方法は、単離ステップを伴うかまたは伴わないいずれかで、ＮＫ細胞の濃縮した集団をもたらす。いくつかの実施形態では、濃縮した細胞の集団は、少なくとも３０％のＮＫ細胞、少なくとも４０％のＮＫ細胞、または少なくとも５０％のＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－である。
【0140】
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）からもたらされる細胞集団は、ＣＤ４－細胞の集団を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）からもたらされる細胞集団は、少なくとも１０％、１５％、または２０％のＣＤ４－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）からもたらされる集団は、ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞は、ＣＤ８＋である。ステップ（Ｂ）からもたらされる細胞集団は、約２０～５５％のＣＤ４－／ＣＤ８＋である。
【0141】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞は、ＣＤ８－である。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）からもたらされる細胞集団は、約２０～５５％のＣＤ４－／ＣＤ８－細胞である。
【0142】
いくつかの実施形態では、方法における多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）から得られる。
【0143】
ＨＰＣバルクを得る第１の条件セットは、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む。
【0144】
ＣＤ４－細胞を含む集団を得る第２の条件セットは、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む培養培地を含む。
【0145】
ステップ（Ｂ）に続いて、方法は、細胞単離ステップを伴うか、または細胞単離ステップを伴わない、いずれかで進め得る。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の細胞単離ステップを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む集団は、ステップ（Ｂ）の後に単離される。続いて、ステップ（Ｂ）から単離されたＣＤ４－細胞を第３の条件セットに配置して、ＮＫ細胞で濃縮した細胞集団を産生する。
【0146】
ＮＫ細胞を産生する方法の期間中に、方法のステップの各々に存在する細胞表現型を決定することができる。細胞分化プロセスは、当該技術分野で既知の様々な手段によって評価することができる。例えば、いくつかの実施形態では、培養した細胞の細胞分化は、培養した細胞の試料を得、その培養した細胞の試料を１つ以上の分析方法に供して、細胞の細胞表現型を確認することによって評価することができる。細胞表現型を確認する既知の方法として、例えば、フローサイトメトリー及び免疫蛍光イメージングが挙げられる。任意の好適なサンプリング及び表現型アッセイを、本明細書に記載の細胞培養方法とともに使用して、細胞分化プロセスの進行を確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞表現型を所与の時期に決定するための１つ以上のサンプリングステップを含む。
【0147】
ｉＰＳＣからＨＰＣバルクへの概要
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣなどの多能性細胞は、第１の条件セットで培養され、ＨＰＣバルクを含む集団を産生する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクを得るために、第１の条件セットでｉＰＳＣを培養することは、ＨＰＣ誘導培地中でｉＰＳＣを培養することを含む。第１の条件セットは、ＨＰ細胞バルクの産生を可能にする様々な成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つ以上の化合物を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ＴＧＦβを含む。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣなどの多能性細胞は、第１の条件セットで培養され、ＨＰＣバルクを含む集団を産生する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクを得るために、第１の条件セットでｉＰＳＣを培養することは、ＨＰＣ誘導培地中でｉＰＳＣを培養することを含む。第１の条件セットは、ＨＰ細胞バルクの産生を可能にする様々な成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つ以上の化合物を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導する第１の条件セットは、ＴＧＦβを含む。
【0148】
ｉＰＳＣは、第１の条件セットで、ＨＰＣバルクを生成するのに十分な期間培養される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、第１の条件セットで、約７～２１日、または１０～１８日、または大体１４日の期間培養される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、第１の条件セットで、約１３日の期間培養される。
【0149】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約３％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約４％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６％Ｏ２で培養される。
【0150】
ＨＰＣバルクからＣＤ４－細胞集団を得る概要
いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルク、またはそれ以外で得られたＨＰＣ、例えば、ヒトドナーから単離された一次ＨＰＣ、または胚性幹細胞由来などの他の幹細胞源／種から分化したＨＰＣを、培地中でいかなる介在する単離ステップを伴わずに更に培養して、ＣＤ４－細胞を含む細胞の集団（ＣＤ４－細胞集団）を得る。ステップ（Ｂ）の後に本方法によって得られた細胞集団は、例えば、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む、ＣＤ４－細胞を含むことを理解されたい。ステップ（Ｂ）の後に得られた集団はまた、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含むＣＤ４＋細胞を含み得る。細胞集団には、例えば、リンパ球が含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、フィブロネクチンまたはそのバリアント、ノッチリガンド（例えば、Ｊａｇ－１、Ｊａｇ－２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、ＤＬＬ－４）、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有する培地を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、アスコルビン酸を含む第２の条件セットで培養され、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ＳＣＦを含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ＩＬ－７を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、Ｆｌｔ３Ｌを含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ｐ３８阻害剤を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ＳＤＦ－１を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルク、またはそれ以外で得られたＨＰＣ、例えば、ヒトドナーから単離された一次ＨＰＣ、または胚性幹細胞由来などの他の幹細胞源／種から分化したＨＰＣを、培地中でいかなる介在する単離ステップを伴わずに更に培養して、ＣＤ４－細胞を含む細胞の集団（ＣＤ４－細胞集団）を得る。ステップ（Ｂ）の後に本方法によって得られた細胞集団は、例えば、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む、ＣＤ４－細胞を含むことを理解されたい。ステップ（Ｂ）の後に得られた集団はまた、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含むＣＤ４＋細胞を含み得る。細胞集団には、例えば、リンパ球が含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、フィブロネクチンまたはそのバリアント、ノッチリガンド（例えば、Ｊａｇ－１、Ｊａｇ－２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、ＤＬＬ－４）、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有する培地を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、アスコルビン酸を含む第２の条件セットで培養され、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ＳＣＦを含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ＩＬ－７を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、Ｆｌｔ３Ｌを含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ｐ３８阻害剤を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ＳＤＦ－１を含む第２の条件セットで培養し、ＣＤ４－細胞を含む集団を得る。
【0151】
培養期間は、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団を得るのに好適な期間である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞の集団を得るためのＨＰＣバルクの培養は、約２～６週間、３～５週間、または大体３週間である。したがって、いくつかの実施形態では、細胞培養期間は、約２～６週間である。いくつかの実施形態では、細胞培養期間は、約３～５週間である。いくつかの実施形態では、細胞培養期間は、約３週間である。
【0152】
いくつかの実施形態では、もたらされる細胞集団におけるＣＤ４－細胞のパーセンテージが少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％超であるとき、第２の条件セットは第３の条件セットに変更される。
【0153】
いくつかの実施形態では、もたらされる細胞集団におけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージが少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、または２０％超であるとき、第２の条件セットは第３の条件セットに変更される。
【0154】
いくつかの実施形態では、もたらされる細胞集団におけるＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または５５％超であるとき、第２の条件セットは第３の条件セットに変更される。
【0155】
いくつかの実施形態では、もたらされる細胞集団におけるＣＤ４－／ＣＤ８－細胞のパーセンテージが少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または５５％超であるとき、第２の条件セットは第３の条件セットに変更される。
【0156】
いくつかの実施形態では、もたらされる細胞集団におけるＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞のパーセンテージが少なくとも約１％、３％、５％、１０％、１５％、または１５％超であるとき、第２の条件セットは第３の条件セットに変更される。
【0157】
いくつかの実施形態では、もたらされる細胞集団におけるＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが少なくとも約１％、３％、５％、１０％、または１０％超であるとき、第２の条件セットは第３の条件セットに変更される。
【0158】
ＣＤ４－細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーなどの当該技術分野における既知の方法によって、ステップ（Ｂ）中または後に当業者によって容易に決定することができる。
【0159】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約４％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約５％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。
【0160】
ＣＤ４－細胞からＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞への概要
上述のＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、細胞培養培地中で更に培養して、ＮＫ細胞の集団を得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、ステップ（Ｂ）後に本方法から単離される。任意の単離形態は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び／または磁気ベースの細胞選別（ＭＡＣＳ）を含む、これらの方法を用いて使用することができる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞単離ステップを含まない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞を得る培養培地は、第３の条件セットを含む。いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－７、ＩＬ－２、及びＣＤ３活性化因子、例えば、抗ＣＤ３抗体のうちの１つ以上を含む。
上述のＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、細胞培養培地中で更に培養して、ＮＫ細胞の集団を得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、ステップ（Ｂ）後に本方法から単離される。任意の単離形態は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び／または磁気ベースの細胞選別（ＭＡＣＳ）を含む、これらの方法を用いて使用することができる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞単離ステップを含まない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞を得る培養培地は、第３の条件セットを含む。いくつかの実施形態では、第３の条件セットは、ＩＬ－７、ＩＬ－２、及びＣＤ３活性化因子、例えば、抗ＣＤ３抗体のうちの１つ以上を含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団を、介在する単離ステップを伴わず、培養培地中で更に培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞で濃縮した細胞集団を得る。かかるＣＤ５６＋細胞には、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む集団は、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２、及び／またはＩＬ－７を含む培地で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む集団は、ＣＤ３活性化因子を含む培地で培養される。ＣＤ３活性化因子には、当技術分野で既知であり、例えば、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８表面リガンドに結合する抗体複合体が含まれる。ＣＤ３活性化因子には、例えば、抗ＣＤ３抗体またはそれに結合した断片が含まれ、使用することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体が使用される場合、抗ＣＤ３抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＧの任意の免疫グロブリンクラスに属していてもよい。様々な種類の抗ＣＤ３抗体を使用することができ、例えば、ＯＫＴ３クローンまたはＵＣＨＴ１クローンから産生された抗体を使用することができる。培地中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌである。
【0162】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む集団は、ＩＬ－２を含む培地で培養される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む集団は、ＩＬ－７を含む培地で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約３％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約４％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６％Ｏ２で培養される。
【0163】
ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、第３の条件セットで更に培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞の集団を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＩＬ－７及び／またはＩＬ－１５を含む第３の条件セットで培養して、ＣＤ５６＋細胞を更に濃縮することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＩＬ－７を含む第３の条件セットで培養される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＩＬ－１５を含む第３の条件セットで培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、産生されたＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、ＮＫ細胞である。産生された細胞集団におけるＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞のパーセンテージは、少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超である。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約５０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約５５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約６０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約６５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約７０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約７５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約８０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約８５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約９０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約９５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、９５％超のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。
【0164】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して得られた濃縮ＮＫ細胞集団はまた、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、この培養方法によって産生された細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または約３０％は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の５％未満が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約５％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約１０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約１５％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約２０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約２５％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約３０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。
【0165】
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞で濃縮した集団は、当技術分野で既知の方法によって単離される。かかる方法には、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ベースの選別方法及び磁気ベースの選別方法（ＭＡＣＳ）が含まれる。
【0166】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む集団からＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を得るために培養する期間は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８日である。いくつかの実施形態では、培養する期間は、約７日である。
【0167】
いくつかの実施形態では、濃縮されたＣＤ５６＋細胞集団は、ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３－細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。
【0168】
ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞への分化にとって好適である多能性細胞
いくつかの実施形態では、任意の多能性、多分化能、またはドナー由来ＨＰＣは、本明細書に記載の方法とともに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、成体幹細胞である。様々な成体幹細胞が当技術分野で既知であり、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯由来細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。したがって、本明細書に記載の方法に従って産生されるＮＫ細胞は、任意の多能性、多分化能、またはドナーに直接由来する一次ＨＰＣなどの患者由来のＨＰＣから作製することができる。
いくつかの実施形態では、任意の多能性、多分化能、またはドナー由来ＨＰＣは、本明細書に記載の方法とともに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、成体幹細胞である。様々な成体幹細胞が当技術分野で既知であり、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯由来細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。したがって、本明細書に記載の方法に従って産生されるＮＫ細胞は、任意の多能性、多分化能、またはドナーに直接由来する一次ＨＰＣなどの患者由来のＨＰＣから作製することができる。
【0169】
いくつかの実施形態では、多能性細胞は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植によって得られたクローン化胚に由来する胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、生殖幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、ｉＰＳ細胞、及び培養線維芽細胞または骨髄幹細胞（ミューズ細胞）に由来する多能性細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、健康な個体の末梢血単核細胞に由来することができる。ｉＰＳ細胞を産生するための方法は、当該技術分野で既知である。これらの細胞は、任意の体細胞に再プログラミング因子を導入することによって産生することができる。本明細書における再プログラミング因子の例としては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘｌ ７、Ｋｉｆ ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｅｌ１、ベータカテニン、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌｌ、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３、及びＧｌｉｓｌなどの遺伝子、及びそれらの遺伝子産物が挙げられる。これらの再プログラミング因子は、個別に使用することも、２つ以上を組み合わせて使用することもできる。再プログラミング因子の組み合わせの例としては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５－７９７、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２６：２４６７－２４７４、Ｅｌｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８－５７４、Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２－１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．１０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ． ４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ Ｊ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．６：１６７－７４、Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３－７２０、及びＭａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５－９に記載されているものが挙げられる。
【0170】
ｉＰＳＣは、任意の好適な組織から得ることができる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血単核細胞から得られる。
【0171】
造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、及び巨核球などの血液細胞に分化できる細胞である。造血前駆細胞または造血幹細胞は、例えば、ＣＤ３４及び／またはＣＤ４３表面抗原の存在に基づいて、同定することができる。
【0172】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、細胞分化の任意の段階で、遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞は、所望のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または他の操作したタンパク質を含むように遺伝子改変される。
【0173】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多能性、多分化能、または単能性の段階で遺伝子改変されている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多能性段階で遺伝子改変される。例えば、細胞は、胚性幹細胞段階またはｉＰＳＣ幹細胞段階で遺伝子改変することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多分化能段階で遺伝子改変される。例えば、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）段階で遺伝子改変することができる。
【0174】
培養条件－ｉＰＳＣからＨＰＣバルクへ
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣから造血前駆細胞を産生するための培地（すなわち、ＨＰＣ誘導培地）は、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製され得る。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地のうちの２つ以上の混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含有する。いくつかの実施形態では、培地は、無血清である。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣから造血前駆細胞を産生するための培地（すなわち、ＨＰＣ誘導培地）は、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製され得る。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地のうちの２つ以上の混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含有する。いくつかの実施形態では、培地は、無血清である。
【0175】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４を含み得る。ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４は、培養中のヒト造血細胞の発達を支持するために処方される無血清培地である。
【0176】
必要に応じて、いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、アルブミン、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、セレンまたはセレン酸ナトリウム、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、α－モノチオグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩、及びサイトカインなどの１つ以上物質を含み得る。
【0177】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、血清、インスリン、トランスフェリン、セレン、チオールグリセロールまたはα－モノチオグリセロール、Ｌ－グルタミン、及びアスコルビン酸を含有するＩＭＤＭ培地を含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ＢＭＰ４が含まれるが、これに限定されない。
【0179】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ＶＥＧＦが含まれるが、これに限定されない。
【0180】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ｂＦＧＦ及びＦＧＦ２が含まれるが、これらに限定されない。
【0181】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ＳＣＦが含まれるが、これに限定されない。
【0182】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、Ｆｌｔ３リガンドシグナル経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）が含まれるが、これに限定されない）。
【0183】
いくつかの実施形態では、第１の条件セットは、トロンボポエチンシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ＴＰＯが含まれるが、これに限定されない。
【0184】
ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβファミリーのシグナル伝達を妨げる低分子阻害剤であり、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（両方ともＲ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２：２０（２００３））、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などが挙げられる。
【0185】
ＳＢ４３１５４２は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーＩ型アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の強力かつ特異的な阻害剤である。
【0186】
例えば、ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である場合、培地中のその濃度は、好ましくは、０．５μＭ～１００μＭである。
【0187】
ＨＰ細胞バルク集団の産生のための第１の条件セットは、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、及びＦｌｔ３Ｌ（Ｆｌｔ３リガンド）からなる群から選択されるサイトカイン（複数可）で更に補充され得る。
【0188】
一実施形態では、第１の条件セットは、ヒトインスリン（約１０μｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（約５．５μｇ／ｍｌ）、セレン酸ナトリウム（約６．７ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ－グルタミン（約２ｍＭ）、α－モノチオグリセロール（約０．４ｍＭ）、及びＳＢ４３１５４２（約６μＭ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４を含み得る。
【0189】
いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培養期間中、４日ごと、３日ごと、２日ごと、または毎日添加することができる。培地へのビタミンＣの添加は、約５μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌに対応する量で実行することができる。いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培地中に約５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌで存在する。
【0190】
本明細書では、「ビタミンＣ」とは、Ｌ－アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、「Ｌ－アスコルビン酸誘導体」とは、生体内で酵素反応によりビタミンＣとなる誘導体を意味する。Ｌ－アスコルビン酸の誘導体の例としては、ビタミンＣホスフェート（例えば、アスコルビン酸２－ホスフェート）、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、アスコルビルテトラヘキシルデカノエート、アスコルビルステアレート、及びアスコルビル２－ホスフェート６－パルミテートが挙げられる。好ましいのは、ビタミンＣホスフェートである。ビタミンＣホスフェート（例えば、アスコルビン酸２－ホスフェート）の例としては、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートＮａ及びＬ－アスコルビン酸ホスフェートＭｇなどのＬ－アスコルビン酸ホスフェートの塩が挙げられる。
【0191】
いくつかの実施形態では、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＢＭＰ４である場合、造血前駆細胞の産生のためのＨＰＣ誘導培地中のＢＭＰ４の濃度は、約５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、または５００ｎｇ／ｍＬである。
【0192】
いくつかの実施形態では、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＶＥＧＦである場合、造血前駆細胞の産生のためのＨＰＣ誘導培地中のＶＥＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、または５００ｎｇ／ｍＬである。
【0193】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）経路のシグナル伝達を引き起こす物質がｂＦＧＦである場合、造血前駆細胞の産生のためのＨＰＣ誘導培地中のｂＦＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、または５００ｎｇ／ｍＬである。
【0194】
いくつかの実施形態では、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＳＣＲである場合、造血前駆細胞の産生のためのＨＰＣ誘導培地中のＳＣＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬである。
【0195】
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＦｌｔ３Ｌである場合、造血前駆細胞の産生のためのＨＰＣ誘導培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬである。
【0196】
いくつかの実施形態では、トロンボポエチンシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＴＰＯである場合、造血前駆細胞の産生のためのＨＰＣ誘導培地中のＴＰＯの濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、または２００ｎｇ／ｍＬである。
【0197】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、付着培養または浮遊培養によって培養され得る。付着培養の場合、培養は、コーティング剤でコーティングされた培養容器内で実行してもよく、及び／または他の細胞と共培養してもよい。共培養のための他の細胞の例としては、Ｃ３Ｈ１０Ｔｌ／２（Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２８１７－２８３０，２０１０）及び異なる種に由来する間質細胞（Ｎｉｗａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｎｏｖ；２２１（２）：３６７－７７）が挙げられる。コーティング剤の例としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｎｉｖｅａ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（７）：ｅ２２２６１，２０１１））、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ２０１２；３：１２３６）、ゼラチン、コラーゲン、エラスチンなど、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチンなどのグルコサミノグリカン及びプロテオグリカン、フィブロネクチンまたはそのバリアント、ビトロネクチン、ラミニンなどの細胞付着タンパク質などが挙げられる。浮遊培養の方法の例としては、Ｃｈａｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００３，１０２：９０６－１５、Ｖｉｊａｙａｒａｇａｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００９，４：２４８－６２、及びＳａｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００９，２７：５９－６７に記載の方法が挙げられる。
【0198】
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクはまた、多能性幹細胞の培養によって得られたネット様構造（これは、ＥＳ－ｓａｃまたはｉＰＳ－ｓａｃとも呼ばれる）から調製され得る。本明細書における「ネット様構造」は、多能性幹細胞に由来する三次元の嚢状構造（内部に空間を有する）である。この構造は、内皮細胞集団内で形成されており、内部に造血前駆細胞を含む。
【0199】
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの産生のための培養での温度条件は、約３７℃～約４２℃である。いくつかの実施形態では、温度は、例えば、約３７℃～約４２℃、好ましくは約３７～約３９℃である。培養期間は、造血前駆細胞及び／または類似細胞の数などを監視することによって、表現型分析のために細胞培養から試料を得ることによって、当業者によって適切に決定され得る。細胞試料の表現型分析に関連する様々な種類の方法が当技術分野で知られており、例えば、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法が挙げられる。
【0200】
ＨＰ細胞バルクを得るための培養期間は異なり得、例えば、６～１４日間を含む。培養期間の例としては、少なくとも６日、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、及び１４日以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、この培養期間は、６日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、７日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、８日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、９日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１０日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１０日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１１日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１２日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１３日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１４日間である。いくつかの実施形態では、培養期間は、１４日間を超える。培養は、低酸素条件下で実行され得る。低酸素条件の例としては、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％またはそれ以下が挙げられる。培地交換の頻度は、当業者によって決定することができる。いくつかの実施形態では、培地は、２日ごとに交換できる。いくつかの他の実施形態では、培地は、３日ごとに交換できる。いくつかの実施形態では、培地は、毎日交換される。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクを産生するための培養は、上記の条件のうちの１つ以上を組み合わせることによって実行される。例えば、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰ細胞バルクを得る方法は、（ｉ）多能性幹細胞を低酸素条件下でビタミンＣを補充した基礎培地においてＣ３Ｈ１０Ｔｌ／２で培養することと、（ｉｉ）（ｉ）の培養液にＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦｌｔ３Ｌを更に添加して、通常の酸素条件下で細胞を培養することと、を含む。ステップ（ｉ）が実行される期間は、少なくとも６日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは７日である。ステップ（ｉｉ）が実行される期間は、少なくとも６日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは７日である。
【0202】
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク中で得られた造血前駆細胞は、更なる使用前に単離され得る。いくつかの他の実施形態では、得られた造血前駆細胞は、他の細胞種も含む細胞集団（ＨＰ細胞バルク）として使用され得る。ＨＰ細胞バルク集団は、未分離細胞調製物である。いくつかの実施形態では、方法は、単離ステップを含まない。
【0203】
培養条件－ＨＰ細胞バルクからＣＤ４－細胞集団まで
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、例えば、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞などのＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらす。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）の後にもたらされる細胞集団はまた、ＣＤ４＋細胞を含む。
いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、例えば、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞などのＣＤ４－細胞を含む細胞集団をもたらす。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）の後にもたらされる細胞集団はまた、ＣＤ４＋細胞を含む。
【0204】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞に分化するように誘導することができる。
【0205】
いくつかの実施形態では、他の細胞の中でも、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団は、ビタミンＣを補充した培地で造血前駆細胞またはＨＰ細胞バルクを培養するステップを含む方法によって産生することができる。基礎培地に添加されるビタミンＣは、ＨＰ細胞バルクの上記の誘導におけるものと同じである。
【0206】
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクからＣＤ４－細胞を含む細胞集団を産生するために使用される培地は、第２の条件セットである。いくつかの実施形態では、第２の条件セットは、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製され得る。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｉｂｃｏ））、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地のうちの２つ以上の混合物が挙げられる。培地は、血清を含めてもよく、無血清を含まなくてもよい。
【0207】
必要に応じて、基礎培地はまた、アルブミン、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、セレンまたはセレン酸ナトリウム、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝液、無機塩、及びサイトカインなどの物質のうちの１つ以上を含み得る。
【0208】
他の細胞の中でも、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生のための第２の条件セットは、アスコルビン酸、ＳＣＦ、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、フィブロネクチンまたはそのバリアント、ノッチリガンド、ｐ３８阻害剤、及びＳＤＦ－１からなる群から選択されるサイトカイン（複数可）で更に補充され得る。
【0209】
いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培養期間中、４日ごと、３日ごと、２日ごと、または毎日添加することができる。培地へのビタミンＣの添加は、約５μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬに相当する量で実行することができる。いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培地中に約５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬで存在する。
【0210】
いくつかの実施形態では、基礎培地は、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ＳＣＦが含まれるが、これに限定されない。
【0211】
いくつかの実施形態では、基礎培地は、Ｆｌｔ３リガンドのシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）が含まれるが、これに限定されない。
【0212】
いくつかの実施形態では、基礎培地は、トロンボポエチンのシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。かかる物質には、ＴＰＯが含まれるが、これに限定されない。
【0213】
いくつかの実施形態では、基礎培地は、ｐ３８α及びｐ３８βの阻害剤である１つ以上のｐ３８阻害剤を含み、これは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ－２及び熱ショックタンパク質２７の下流の活性化を抑制する。本発明で使用されるｐ３８の化学的阻害剤の例としては、ＳＢ２０３５８０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルホニルフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、及びその誘導体、ＳＢ２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）及びその誘導体、ＳＢ２３９０６３（トランス－４－［４－（４－フルオロフェニル）－５－（２－メトキシ－４－ピリミジニル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル］シクロヘキサノール）及びその誘導体、ＳＢ２２００２５及びその誘導体、ＰＤ１６９３１６、ＲＰＲ２００７６５Ａ、ＡＭＧ－５４８、ＢＩＲＢ－７９６、ＳＣｌＯ－４６９、ＳＣＩＯ－３２３、ＶＸ－７０２及びＦＲ１６７６５３が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えば、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＳＣ２３９０６３、ＳＢ２２００２５及びＰＤ１６９３１６は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能であり、ＳＣｌＯ－４６９及びＳＣＩＯ－３２３は、Ｓｃｉｏｓなどから入手可能である。ｐ３８阻害剤の他の例としては、ｐ３８のＤＮＡ結合領域に位置する１８０位スレオニンのアラニンへの点突然変異によって得られるｐ３８Ｔ１８０Ａ、ヒト及びマウスにおけるｐ３８の１８２位チロシンのフェニルアラニンへの点突然変異によって得られるｐ３８Ｙ１８２Ｆなどを含むｐ３８のドミナント陰性突然変異体が含まれる。ｐ３８阻害剤は、例えば、約０．５μＭ～約５０μＭで培地に含有される。
【0214】
いくつかの実施形態では、基礎培地は、ＳＤＦ－１を含む。
【0215】
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１は、ＳＤＦ－１αまたはその成熟形態のみだけでなく、ＳＤＦ－１β、ＳＤＦ－１γ、ＳＤＦ－１δ、ＳＤＦ－１ε、ＳＤＦ－１φなどのアイソフォームもしくはそれらの成熟形態、またはそれらの任意の比率での混合物であり得る。好ましくは、ＳＤＦ－１αが使用される。ＳＤＦ－１は、ＣＸＣＬ－１２またはＰＢＳＦと称されることもある。
【0216】
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１のアミノ酸配列中の１つまたはいくつかのアミノ酸は、ケモカインとしての活性を有する限り、置換され、欠失され、及び／または付加され得る。同様に糖鎖は、置換され、欠失され、及び／または付加され得る。少なくとも４つのシステイン残基（ヒトＳＤＦ－１αにおけるＣｙｓ３０、Ｃｙｓ３２、Ｃｙｓ５５、及びＣｙｓ７１）が維持され、天然物質のアミノ酸配列と９０％以上の同一性が示される限り、アミノ酸突然変異は許容される。ＳＤＦ－１は、哺乳動物、例えば、ヒト、またはサル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト哺乳動物から得ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９５４６３７として登録されているタンパク質は、ヒトＳＤＦ－１αとして使用でき、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００６００として登録されているタンパク質は、ＳＤＦ－１βとして使用できる。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＦｌｔ３Ｌである場合、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生のための培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＳＣＦである場合、ＳＣＦは、上記と同じ条件下で、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生に使用される。
【0217】
いくつかの実施形態では、トロンボポエチンシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＴＰＯである場合、ＴＰＯは、上記と同じ条件下で、ＣＤ４－細胞を含む産生細胞集団のために使用される。
【0218】
本発明で使用されるフィブロネクチンまたはそのバリアントは、それがＣＤ３陽性細胞に結合することができる分子である限り、特に限定されない。フィブロネクチンのバリアントは、それがＣＤ３陽性細胞の表面で、ＶＬＡ－５及びＶＬＡ－４に結合できる分子である限り、特に限定されず、その例としては、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが挙げられる。フィブロネクチン及びそのバリアントは、培地中に任意の形態で存在し得る。例えば、それらは、培養中に培地に含有され得るか、または培養容器に固定化され得、好ましくは培養容器に固定化される。
【0219】
フィブロネクチンまたはそのバリアントが培地中に含有される場合、フィブロネクチンまたはそのバリアントの濃度の下限は、１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ以上であり得、上限は、１００００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは、１０００μｇ／ｍｌ以下であり得る。
【0220】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生に使用される培地中のＩＬ－７の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬである。
【0221】
ＳＤＦ－１は、市販され得る、自然界から精製され得る、またはペプチド合成もしくは遺伝子工学技術によって産生され得る。ＳＤＦ－１は、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲内で培地に含有される。加えて、ＳＤＦ－１のような活性を有するＳＤＦ－１代替物も、ＳＤＦ－１の代わりに使用することができる。かかるＳＤＦ－１代替物の例としては、ＣＸＣＲ４アゴニストが挙げられ、ＣＸＣＲ４アゴニスト活性などを有する低分子量化合物を、ＳＤＦ－１の代わりに培地に添加し得る。
【0222】
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１がＳＤＦ１αである場合、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生のための培地中のＳＤＦ－１αの濃度は、約１ｎＭ～１００ｎＭ、例えば、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、または１００ｎＭである。
【0223】
いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤がＳＢ２０３５８０である場合、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生のための培地中のＳＢ２０３５８０の濃度は、約０．５μＭ～１００μＭ、例えば、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、または５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、または１００μＭである。
【0224】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生のための基礎培地には、約１５％のＦＢＳ、約４ｍＭのＬ－グルタミン、約１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、約１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、約５５μＭの２－メルカプトエタノール、約５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、約１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、約５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、約６．７ｎｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム、約５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、約５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、約１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、約１５μＭのＳＢ２０３５８０、約３０ｎＭのＳＤＦ－１αを補充したαＭＥＭ培地が含まれる。
【0225】
ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生において、造血前駆細胞は、付着培養または浮遊培養によって培養され得る。いくつかの実施形態では、培養培地または培養容器／ディッシュは、ノッチ活性化剤を含む。ノッチ活性化剤には、ノッチ受容体のアゴニストが含まれるが、これに限定されない。ノッチアゴニストは、ノッチ受容体に結合し、同様に、例えば、ノッチの細胞内ドメインを切断して核に移動させるなど、ノッチ受容体に関連するシグナル伝達事象を開始または媒介する。ノッチ活性化剤は、Ｊａｇｌ、Ｊａｇ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、及びＤＬＬ４を含むが、これらに限定されない１つ以上のノッチリガンドを含む。いくつかの実施形態では、ノッチリガンド（複数可）のうちの１つ以上は、可溶性ペプチドとして導入するか、または固体材料上に固定することができる。固体材料には、ポリスチレンプレート、またはビーズが含まれ得るが、これらに限定されない。ノッチリガンド固定化のための例示的なビーズとしては、アガロースビーズ、磁性ビーズ、及びラテックスビーズが挙げられる。いくつかの実施形態では、ノッチリガンドペプチドは、ビーズにコンジュゲート化／固定化される。いくつかの他の実施形態では、ノッチリガンドペプチドは、ポリスチレンプレートの表面にコンジュゲート化／固定化される。いくつかの実施形態では、ノッチリガンドの固定化は、非共有結合である。いくつかの他の実施形態では、ノッチリガンドペプチドは、細胞によって提示される。更に他の実施形態では、培養容器／ディッシュは、ノッチリガンドでコーティングされる。
【0226】
いくつかの実施形態では、培養容器／ディッシュは、ＤＬＬ１もしくはＤＬＬ４、またはＤＬＬ４もしくはＤＬＬ１の融合タンパク質、及びＦｃなどでコーティングされている。ＤＬＬ１またはＤＬＬ４は、組換えヒト（ｒｈ）－ＤＬＬ１またはｒｈ－ＤＬＬ４であり得る。いくつかの実施形態では、培養容器／ディッシュは、ｒｈ－ＤＬＬ４／Ｆｃ キメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）でコーティングされている。付着培養の場合、コーティングされた培養容器を使用してもよく、及び／または造血前駆細胞は、フィーダー細胞などと共培養してもよい。共培養用のフィーダー細胞の例としては、骨髄間質細胞株、ＯＰ９細胞（Ｒｉｋｅｎ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能）が挙げられる。ＯＰ９細胞は、好ましくは、Ｄｌｌｌを絶えず発現するＯＰ－ＤＬ１細胞（Ｈｏｌｍｅｓ Ｒ Ｉ ａｎｄ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ ＪＣ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９（２））であり得る。いくつかの実施形態では、ＯＰ９細胞が、フィーダー細胞、別々に調製されたＤｌｌｌまたはＤｌｌｌとＦｃなどとの融合タンパク質として使用される場合、培地に添加されて、共培養を行い得る。いくつかの実施形態では、Ｄｌｌｌは、ヒトの場合、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＃００５６１８、マウスの場合、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＃００７８６５のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質及びこれらのタンパク質に対して高い配列同一性（例えば、９０％以上の配列同一性を有する）を有し、同等の機能を有する天然に存在する突然変異体を含むことができる。フィーダー細胞がＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生に使用される場合、フィーダー細胞は、培養期間中に適切に置き換えることができる。フィーダー細胞の交換は、培養されている対象細胞を、予備的にプレーティングされたフィーダー細胞に移すことによって実行することができる。交換は、５日ごと、４日ごと、３日ごと、または２日ごとに実行することができる。
【0227】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－細胞を含む細胞集団の産生のためのＨＰ細胞バルクの培養での培養温度条件は、約３７℃～約４２℃、及び約３７℃～約３９℃である。いくつかの実施形態では、培養は、低酸素条件下で実行され得る。低酸素状態の例としては、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、及びこれらより低い酸素濃度が挙げられる。培養期間は、ＣＤ４－細胞及び／または類似細胞を含む異なる種の細胞の数を監視することによって、当業者によって適切に決定され得る。培養期間の例としては、１０日以上、１２日以上、１４日以上、１６日以上、１８日以上、２０日以上、２１日以上、２３日以上、２５日以上、２８日以上、３０日以上、３５日以上、または４２日以上が挙げられる。
【0228】
ステップ（Ｂ）の後の細胞集団からの特定の細胞種（例えば、ＣＤ４－細胞）の集団が単離される場合、単離される細胞種に応じて、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、及びＣＤ４５を含むがこれらに限定されない任意の１つの指標を使用して単離を実行し得る。単離方法は、当業者に周知の方法、例えば、細胞を特定の抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、またはＣＤ４５抗体）で標識し、次いで、フローサイトメータを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化するアフィニティーカラムなどを使用して細胞を精製する方法であり得る。
【0229】
ＣＤ４－細胞を含む細胞集団からＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を誘導するステップ
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。
【0230】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ビタミンＣを補充した培地中でＣＤ４－細胞を含む細胞集団を培養するステップを含む方法によって産生される。いくつかの実施形態では、第３の条件セットを使用して、ＮＫ細胞を産生する。
【0231】
いくつかの実施形態では、培地は、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製する。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地のうちの２つ以上の混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は、無血清である。必要に応じて、基礎培地はまた、アルブミン、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、セレンまたはセレン酸ナトリウム、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝液、無機塩、及びサイトカインなどの物質のうちの１つ以上を含み得る。
【0232】
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞の産生に使用される培地は、抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）及びサイトカインを更に含む。好適なサイトカインの例としては、ＩＬ－２及びＩＬ－７が挙げられる。
【0233】
ＣＤ３抗体は、ＣＤ３を特異的に認識する限り制限されない。いくつかの実施形態では、第３の条件セットにおけるＣＤ３抗体の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、または１０００ｎｇ／ｍＬである。
【0234】
いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、上記と同じ条件下でＣＤ５６陽性Ｋ細胞を産生するために使用される。
【0235】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の産生のための第３の条件セットにおけるＩＬ－２の濃度は、約１Ｕ／ｍＬ～１０００Ｕ／ｍＬ、例えば、約１Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、６０Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、８０Ｕ／ｍＬ、９０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、または１０００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞の産生のためのＮＫ誘導培地中のＩＬ－２の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬである。
【0236】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の産生のための第３の条件セットにおけるＩＬ－７の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬである。
【0237】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の産生のためのＣＤ４－細胞を含む集団の培養での培養温度条件は、約３７℃～約４２℃、または約３７～約３９℃である。培養期間は、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞及び／または類似細胞の数を監視することによって、当業者によって適切に決定され得る。培養の日数は、ＮＫ細胞を得ることができる限り制限されない。培養期間の例としては、少なくとも１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上が挙げられる。
【0238】
いくつかの実施形態では、得られたＮＫ細胞は、更なる使用の前に単離され得る。いくつかの他の実施形態では、得られたＣＤ５６陽性ＮＫ細胞は、Ｔ細胞（ＮＫ細胞バルク）など、他の細胞種も含む細胞集団として使用され得る。
【0239】
いくつかの実施形態では、第３の条件セットまたはＮＫ細胞バルクにおいてＣＤ４－細胞を含む細胞集団を培養することによって得られるもたらされる細胞集団は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％超のＮＫ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクは、約７５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞及び約２５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクはまた、Ｂ細胞及び単球を含み得る。
【0240】
ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が単離される場合、単離方法は、当技術分野で周知の方法、例えば、細胞を抗ＣＤ５６抗体及び抗ＣＤ３抗体で標識し、次に、フローサイトメータ（蛍光活性化細胞選別）を使用して単離する方法、または所望の抗原を固定化するアフィニティーカラムなどを使用して細胞を精製する方法であり得る。
【0241】
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋である。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－である。
【0242】
ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１つ以上の導入遺伝子を含むように操作される。例えば、ＮＫ細胞は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作することができ、それによって抗腫瘍エフェクター細胞を産生する。一例では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞への細胞前駆体は、ＣＡＲを発現するように操作される。例えば、いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク中の細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。更に、いくつかの実施形態では、これらのトランスジェニック受容体は、タンパク質由来ではない腫瘍関連抗原に指向させることができる。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを含むように改変される。いくつかの実施形態では、単一のＣＡＲは、２つ以上の抗原を標的とする。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１つ以上の導入遺伝子を含むように操作される。例えば、ＮＫ細胞は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作することができ、それによって抗腫瘍エフェクター細胞を産生する。一例では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞への細胞前駆体は、ＣＡＲを発現するように操作される。例えば、いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク中の細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。更に、いくつかの実施形態では、これらのトランスジェニック受容体は、タンパク質由来ではない腫瘍関連抗原に指向させることができる。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを含むように改変される。いくつかの実施形態では、単一のＣＡＲは、２つ以上の抗原を標的とする。
【0243】
いくつかの実施形態では、ｉＮＫ細胞は、キメラであり、非天然であり、操作された受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の成分を有し、いくつかの実施形態では、１つ以上の成分は、１つ以上の腫瘍抗原含有がん細胞へのリンパ球の標的化または結合を促進する。
【0244】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、一般に、少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも１つの膜貫通ポリペプチド及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチドを含み、これにより、ポリペプチドが互いに集合して、キメラ抗原受容体を形成する。
【0245】
本明細書で使用される「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合することができるオリゴまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞で細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。
【0246】
特に、細胞外リガンド結合ドメインは、標的の抗原に対する抗体に由来する抗原結合ドメインを含むことができる。
【0247】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変させ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、以下のうちの１つ以上から選択される腫瘍抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを含む：ＣＤ４４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ８９、ＣＤ１２３、ＣＳ－１、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＧＤ－２、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡ、ＢＣＭＡ。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。
【0248】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、柔軟なリンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）可変断片及び重鎖（ＶＨ）可変断片を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。
【0249】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にストーク領域を更に含む。本明細書で使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインにより多くの柔軟性及びアクセス可能性を付与するために使用される。ストーク領域は、最大３００アミノ酸、１０～１００アミノ酸、及び／または２５～５０アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、ＣＤ８、ＣＤ４、またはＣＤ２８の細胞外領域の全部または一部、あるいは抗体定常領域の全部または一部など、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。代替的に、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。好ましい実施形態では、上記ストーク領域は、ヒトＣＤ８アルファ鎖の一部である。
【0250】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合後の細胞内シグナル伝達に寄与し、ｉＰＳ ＮＫ細胞の活性化及び免疫応答をもたらすシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ ＮＫ細胞は、シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを有する。
【0251】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するように遺伝子改変されている。
【0252】
いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、免疫細胞の表面に、例えば、ｉＰＳ ＮＫ細胞上に発現し、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指示するために合わせて相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの異なる膜貫通ポリペプチドは、一緒に相互作用して、標的リガンドとの結合後にシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
【0253】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現するためのＮＫ細胞の遺伝子改変は、（１）特定のＣＡＲに対応する遺伝子を合成するステップと、（２）ＣＡＲに対応する遺伝子を含むベクターを調製するステップと、（３）ＣＡＲ遺伝子を含むベクターでＣＤ５６＋ＮＫ細胞を形質導入するステップと、を含むことができる。
【0254】
ＣＡＲをコードする発現ベクターは、１つ以上のＤＮＡ分子または構築物として導入することができ、構築物（複数可）を含む宿主細胞の選択を可能にするであろう少なくとも１つのマーカーが存在し得る。
【0255】
構築物は、遺伝子及び調節領域を適宜、単離し、ライゲートし、適切なクローニング宿主にクローン化し、制限もしくは配列決定、または他の簡便な手段によって分析し得る従来の方法で調製することができる。特に、ＰＣＲを使用して、機能ユニットの全部または一部を含む個々の断片を単離することができ、必要に応じて、「プライマー修復」、ライゲーション、インビトロ突然変異誘発などを使用して、１つ以上の突然変異を導入することができる。完成し、適切な配列を有することが実証された構築物（複数可）は、その後、任意の簡便な手段によってＣＴＬに導入することができる。構築物は、感染または細胞への形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）または他のもの（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）のような非複製欠陥ウイルスゲノムに組み込み、パッケージ化され得る。構築物は、所望に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入され得る。宿主細胞は、構築物（複数可）の導入前に培養物中で成長及び拡大され得、その後、構築物（複数可）の導入及び構築物（複数可）の組み込みのための適切な処理を行う。次に、細胞は、構築物中に存在するマーカーによって拡大され、スクリーニングされる。上手く使用できる様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれる。
【0256】
場合によっては、構築物が特定の遺伝子座に組み込まれることが望ましい、相同組換えの標的部位を有し得る。例えば、これは、内因性遺伝子をノックアウトし、それを相同組換えについて当技術分野で知られている物質及び方法を使用して、構築物によってコードされる遺伝子に（同じ遺伝子座または他の場所で）置き換えることができる。相同組換えのために、ＯＭＥＧＡまたはＯ－ベクターのいずれかを使用することができる。
【0257】
構築物は、少なくともＣＡＲ及び任意選択的に別の遺伝子をコードする単一のＤＮＡ分子、または１つ以上の遺伝子を有する異なるＤＮＡ分子として導入することができる。他の遺伝子としては、例えば、治療用分子または自殺遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる。構築物は、それぞれ、同じまたは異なるマーカーで、同時にまたは連続して導入することができる。
【0258】
構築物ＤＮＡのストックを調製するために、及びトランスフェクションを実行するために使用され得る、細菌または酵母の複製起点、選択可能及び／または増幅可能なマーカー、原核生物または真核生物での発現のためのプロモーター／エンハンサーエレメントなど、有用なエレメントを含むベクターは、当技術分野で周知であり、多くは市販されている。
【0259】
使用方法
本発明による細胞は、がん、ウイルス感染または自己免疫障害の治療を必要とする患者において、がん、ウイルス感染または自己免疫障害を治療するために使用することができる。別の実施形態では、本発明による上記単離された細胞は、がん、自己免疫障害のウイルス感染症の治療を必要とする患者における、それらの治療のための医薬品の製造において使用することができる。
本発明による細胞は、がん、ウイルス感染または自己免疫障害の治療を必要とする患者において、がん、ウイルス感染または自己免疫障害を治療するために使用することができる。別の実施形態では、本発明による上記単離された細胞は、がん、自己免疫障害のウイルス感染症の治療を必要とする患者における、それらの治療のための医薬品の製造において使用することができる。
【0260】
本発明は、治療を必要とする患者を治療するための方法に依存し、上記方法は、以下の、（ａ）本発明によるキメラ抗原受容体細胞を提供するステップ、及び（ｂ）上記患者に細胞を投与するステップの少なくとも１つを含む。
【0261】
上記治療は、改善、治癒、または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法治療の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者の治療に使用される細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、患者の治療に使用される細胞または細胞集団が、上記患者に由来するのではなく、ドナーに由来することを意味する。
【0262】
いくつかの実施形態では、記載された細胞は同種異系である。いくつかの実施形態では、記載された細胞は、自己由来である。
【0263】
治療は、がん、ウイルス感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と診断された患者を治療するために使用できる。治療され得るがんとしては、血管新生されていない、または実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生された腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病及びリンパ腫などの血液腫瘍）を含めてもよく、または固形腫瘍を含めてもよい。本発明のＣＡＲで治療されるがんの種類としては、これらに限定されないが、がん腫、芽細胞腫、及び肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、ならびに肉腫、がん腫、及び黒色腫などの悪性腫瘍が挙げられる。成人腫瘍／がん及び小児腫瘍／がんも含まれる。
【0264】
いくつかの実施形態では、治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法及び放射線療法の群から選択される、がんに対する１つ以上の療法と組み合わせる。
【0265】
いくつかの実施形態では、上記治療は、免疫抑制治療を受けている患者に投与することができる。
【0266】
更なる実施形態では、細胞組成物は、１つ以上の追加の療法と組み合わせて患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法及びその後の末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖した細胞は、外科手術の前または後に投与される。本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって得られる上記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を治療するための本発明の特定の態様において使用することができる。したがって、本発明の範囲は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を治療する方法であり、本方法は、不活化ＴＣＲアルファ遺伝子及び／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を上記患者に投与することによって上記患者を治療することを含む。
【0267】
細胞の投与
いくつかの実施形態では、細胞は、多種多様な方法で、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入することができる。細胞は、特定の実施形態では、腫瘍の部位に導入され得るが、代替の実施形態では、細胞はがんに進行するか、またはがんに進行するように改変される。使用される細胞の数は、複数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコル、例えば、投与回数、細胞が増殖する能力、組換え構築物などの安定性に依存する。細胞は、分散液として適用してもよく、一般に、目的の部位またはその近くに注入される。細胞は、生理学的に許容される培地中にあり得る。一例では、本発明のＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または高親和性ＣＤ１６など、任意の他の操作されたタンパク質もしくはポリペプチドドメインを発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫認識を阻害するために内包化され、腫瘍の部位に配置される。
いくつかの実施形態では、細胞は、多種多様な方法で、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入することができる。細胞は、特定の実施形態では、腫瘍の部位に導入され得るが、代替の実施形態では、細胞はがんに進行するか、またはがんに進行するように改変される。使用される細胞の数は、複数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコル、例えば、投与回数、細胞が増殖する能力、組換え構築物などの安定性に依存する。細胞は、分散液として適用してもよく、一般に、目的の部位またはその近くに注入される。細胞は、生理学的に許容される培地中にあり得る。一例では、本発明のＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または高親和性ＣＤ１６など、任意の他の操作されたタンパク質もしくはポリペプチドドメインを発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫認識を阻害するために内包化され、腫瘍の部位に配置される。
【0268】
細胞は、必要に応じて投与することができる。所望の応答、投与方法、細胞の寿命、存在する細胞の数に応じて、様々なプロトコルが用いられ得る。投与回数は、少なくとも部分的に上記の要因に依存する。
【0269】
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）など、任意の簡便な方法で実行され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射による、または腹腔内での投与が可能である。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
【0270】
核酸ベースの発現系
いくつかの実施形態では、本発明のＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または高親和性ＣＤ１６またはＣＤ１９などの任意の他の操作されたタンパク質またはポリペプチドドメインを発現するように操作される。これらのポリペプチドを含む発現ベクターを生成するための組換え技術は、当技術分野で周知であり、以下に一般的に記載される。
いくつかの実施形態では、本発明のＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または高親和性ＣＤ１６またはＣＤ１９などの任意の他の操作されたタンパク質またはポリペプチドドメインを発現するように操作される。これらのポリペプチドを含む発現ベクターを生成するための組換え技術は、当技術分野で周知であり、以下に一般的に記載される。
【0271】
ベクター
「ベクター」という用語は、複製することができる細胞に導入するために核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外因性」であり得、これは、ベクターが導入されている細胞にとって外来性であるか、または配列が細胞内の配列と相同であるが、通常、配列が発見されない宿主細胞の核酸内の任意の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、及びウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を挙げられる。当技術分野の技術のうちの１つは、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するために十分に装備されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照、これらは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。
「ベクター」という用語は、複製することができる細胞に導入するために核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外因性」であり得、これは、ベクターが導入されている細胞にとって外来性であるか、または配列が細胞内の配列と相同であるが、通常、配列が発見されない宿主細胞の核酸内の任意の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、及びウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を挙げられる。当技術分野の技術のうちの１つは、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するために十分に装備されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照、これらは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。
【0272】
「発現ベクター」という用語は、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生においては、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含むことができ、これは、特定の宿主細胞における操作可能に連結されたコード配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能にも役立つ核酸配列を含み得、以下に記載される。
【0273】
プロモーター及びエンハンサー
「プロモーター」は、その場所で転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。この配列は、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して、核酸配列の特定の転写を開始し得る遺伝子エレメントを含み得る。「操作可能に位置付けられた」、「操作可能に連結された」、「制御下にある」、及び「転写制御下にある」という句は、プロモーターが正しい機能的場所、及び／または転写開始及び／またはその配列の発現を制御するために、核酸配列に関連する配向にあることを意味する。
「プロモーター」は、その場所で転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。この配列は、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して、核酸配列の特定の転写を開始し得る遺伝子エレメントを含み得る。「操作可能に位置付けられた」、「操作可能に連結された」、「制御下にある」、及び「転写制御下にある」という句は、プロモーターが正しい機能的場所、及び／または転写開始及び／またはその配列の発現を制御するために、核酸配列に関連する配向にあることを意味する。
【0274】
プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置付けるように機能する配列を含む。この最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを含まない一部のプロモーター、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位に重なる個別のエレメント自体が、開始場所の固定に役立つ。追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０ １１０ｂｐ上流の領域に位置するが、複数のプロモーターが、開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターの「制御下にある」コード配列をもたらすために、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を位置付ける。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促す。
【0275】
プロモーターエレメント間の間隔は、多くの場合、順応性があるため、エレメントが互いに反転する、または移動したときにプロモーター機能が保持されるようになる。ｔｋプロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を長くして、５０ｂｐ離すことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調してまたは独立して機能し、転写を活性化できると考えられる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用されてもされなくてもよい。
【0276】
プロモーターは、コードセグメント及び／またはエクソンの上流に位置する５プライム’非コード配列を単離することによって得ることができるので、核酸配列に自然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列に自然に関連するものであり得る。あるいは、特定の利点は、組換えまたは異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを位置付けることによって得られる。これは、通常、その自然環境では核酸配列と関連しないプロモーターを指す。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その自然環境において、核酸配列に通常は関連しないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー、及び他のウイルス、または原核生物もしくは真核生物細胞から単離されたプロモーターもしくはエンハンサー、及び「天然に存在しない」、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントを含むプロモーターもしくはエンハンサー、及び／または発現を変える突然変異が含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡ構築物で最も一般的に使用されるプロモーターとして、ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成で産生することに加えて、配列は、本明細書に開示の組成物に関連する組換えクローニング及び／またはＰＣＲ（商標）などの核酸増幅技術を使用して産生され得る（各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号及び同第５，９２８，９０６号を参照）。更に、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内の配列の転写及び／または発現を指示する制御配列も同様に使用できることが企図されている。
【0277】
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞種、組織、器官、または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／またはエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学の当業者であれば、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞種の組み合わせの使用を認識している（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性であり、及び／または組換えタンパク質及び／またはペプチドの大規模生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するために、適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは、異種または内因性であり得る。
【0278】
更に、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを使用して、発現を駆動することもできる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核生物細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として、または追加の遺伝子発現構築物として提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写をサポートすることができる。
【0279】
組織特異的プロモーターまたはエレメントの同一性、ならびにそれらの活性の特徴を明らかにするためのアッセイは、当業者に周知である。
【0280】
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要になり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含められる。ＡＴＧ開始コドンなどの外因性翻訳制御シグナルを提供する必要があり得る。当業者であれば、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。
【0281】
本発明のある特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多遺伝子またはポリシストロン性のメッセージを創出するために使用され、これらは、本発明において使用され得る。
【0282】
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、これらのいずれも、ベクターを消化するための標準的組換え技術と併用して使用することができる。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の位置でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは、市販されている。かかる酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。多くの場合、ベクターは、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して、線形化または断片化され、外因性配列をベクターにライゲーションすることができる。「ライゲーション」とは、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指し、これは、互いに隣接している場合と隣接していない場合とがある。制限酵素及びライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の当業者によく知られている。
【0283】
スプライシング部位、終結シグナル、複製起点、及び選択可能なマーカーも使用することができる。
【0284】
プラスミドベクター
ある特定の実施形態では、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用が企図される。一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。非限定的な例では、Ｅ．ｃｏｌｉは、多くの場合、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２には、アンピシリン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子が含まれているため、形質転換細胞を容易に同定する手段をもたらす。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージもまた、例えば、微生物がそれ自体のタンパク質の発現のために使用することができるプロモーターを含むか、または含むように改変される必要がある。
ある特定の実施形態では、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用が企図される。一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。非限定的な例では、Ｅ．ｃｏｌｉは、多くの場合、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２には、アンピシリン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子が含まれているため、形質転換細胞を容易に同定する手段をもたらす。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージもまた、例えば、微生物がそれ自体のタンパク質の発現のために使用することができるプロモーターを含むか、または含むように改変される必要がある。
【0285】
加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージラムダＧＥＭ（商標）１１が、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えファージベクターを作製する際に利用され得る。
【0286】
更に有用なプラスミドベクターとしては、その後の精製及び分離または切断のために、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の生成に使用するためのｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５）及びｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な融合タンパク質は、ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを有するものである。
【0287】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、複数の好適な培地のいずれか、例えば、ＬＢで成長させる。特定のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当業者によって理解されるように、宿主細胞を特定のプロモーターに特異的な剤と接触させることによって、例えば、培地にＩＰＴＧを加えることによって、またはインキュベーションを高温に切り替えることによって誘導され得る。細菌を更に一定期間（通常は２～２４時間）培養後、細胞を遠心分離によって収集し、洗浄して、残留培地を除去する。
【0288】
ウイルスベクター
特定のウイルスが受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に感染するかまたは細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力により、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移すための魅力的な候補となっている。本発明の成分は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または本発明の高親和性ＣＤ１６などの他の任意の操作されたタンパク質またはポリペプチドドメインをコードするウイルスベクターであり得る。本発明の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
特定のウイルスが受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に感染するかまたは細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力により、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移すための魅力的な候補となっている。本発明の成分は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または本発明の高親和性ＣＤ１６などの他の任意の操作されたタンパク質またはポリペプチドドメインをコードするウイルスベクターであり得る。本発明の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
【0289】
アデノウイルスベクター
核酸を送達するための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターを使用することを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに組み込むには、能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる高効率の遺伝子導入によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングをサポートする、及び（ｂ）クローン化された組織または細胞特異的構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むものを意味する。遺伝子構成またはアデノウイルス、３６ｋｂ、直鎖、二本鎖ＤＮＡウイルスに関する知識により、大きな片のアデノウイルスＤＮＡを最大７ｋｂの外来配列に置換できる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
核酸を送達するための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターを使用することを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに組み込むには、能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる高効率の遺伝子導入によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングをサポートする、及び（ｂ）クローン化された組織または細胞特異的構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むものを意味する。遺伝子構成またはアデノウイルス、３６ｋｂ、直鎖、二本鎖ＤＮＡウイルスに関する知識により、大きな片のアデノウイルスＤＮＡを最大７ｋｂの外来配列に置換できる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
【0290】
ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを用いて、細胞に導入させ得る。アデノウイルス連結系を使用した細胞系では、トランスフェクション効率の向上が報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，１９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高い組み込み頻度を有し、非分裂細胞に感染し得るため、本発明の細胞内で使用するための魅力的なベクター系であり、したがって、例えば、組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶは、感染性について広い宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、各々が参照により本明細書に組み込まれる。
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを用いて、細胞に導入させ得る。アデノウイルス連結系を使用した細胞系では、トランスフェクション効率の向上が報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，１９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高い組み込み頻度を有し、非分裂細胞に感染し得るため、本発明の細胞内で使用するための魅力的なベクター系であり、したがって、例えば、組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶは、感染性について広い宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【0291】
レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移し、広範囲の種及び細胞種に感染させ、特殊な細胞株にパッケージングするその能力により、送達ベクターとして有用である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移し、広範囲の種及び細胞種に感染させ、特殊な細胞株にパッケージングするその能力により、送達ベクターとして有用である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【0292】
レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列の代わりに、核酸（例えば、所望の配列をコードするもの）をウイルスゲノムに挿入して、複製に欠陥のあるウイルスを産生させる。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列とともに、ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが特別な細胞株に導入されたときに（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物は、ウイルス粒子にパッケージングさせ得、次いで、培養培地に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。次に、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意により濃縮し、遺伝子導入のために使用される。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞種に感染し得る。しかし、組み込み及び安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。
【0293】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を含む他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照）。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及びサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成され、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆが欠失し、これにより、ベクターが生物学的に安全になる。
【0294】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方での遺伝子導入及び核酸配列の発現に使用可能である。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスでは、好適な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、ならびにｒｅｖ及びｔａｔを担持する２つ以上のベクターでトランスフェクトされることが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。特定の細胞種の受容体を標的とするために、エンベロープタンパク質を抗体または特定のリガンドと連結させることによって、組換えウイルスを標的にすることができる。特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子とともに、目的の配列（調節領域を含む）をウイルスベクターに挿入することにより、例えば、ここでは、ベクターは、標的特異的となる。
【0295】
組み合わせ療法
本発明のある特定の実施形態では、臨床的態様のための本発明の方法は、抗がん剤など、過剰増殖性疾患の治療において有効な他の剤と組み合わされる。「抗がん剤」剤は、例えば、がん細胞を死滅させること、がん細胞にアポトーシスを誘導すること、がん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率または数を減少させること、腫瘍サイズを減少させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍またはがん細胞への血液供給を減少させること、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防することもしくは阻害すること、またはがんを有する対象の寿命を延長させることにより、対象において、がんに悪影響を与え得る。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるまたは細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供されるであろう。このプロセスは、がん細胞を発現構築物及び剤（複数可）または複数の因子と同時に接触させることを含み得る。これは、細胞を単一の組成物または両方の剤を含む薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を２つの別個の組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成することができ、ここで、一方の組成物は、発現構築物を含み、他方の組成物は、第２の剤（複数可）を含む。
本発明のある特定の実施形態では、臨床的態様のための本発明の方法は、抗がん剤など、過剰増殖性疾患の治療において有効な他の剤と組み合わされる。「抗がん剤」剤は、例えば、がん細胞を死滅させること、がん細胞にアポトーシスを誘導すること、がん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率または数を減少させること、腫瘍サイズを減少させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍またはがん細胞への血液供給を減少させること、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防することもしくは阻害すること、またはがんを有する対象の寿命を延長させることにより、対象において、がんに悪影響を与え得る。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるまたは細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供されるであろう。このプロセスは、がん細胞を発現構築物及び剤（複数可）または複数の因子と同時に接触させることを含み得る。これは、細胞を単一の組成物または両方の剤を含む薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を２つの別個の組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成することができ、ここで、一方の組成物は、発現構築物を含み、他方の組成物は、第２の剤（複数可）を含む。
【0296】
化学療法剤及び放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学において主要な問題である。現在のがん研究の１つの目標は、１つの治療法を他の治療法と組み合わせることにより、化学療法及び放射線療法の有効性を改善する方法を見つけることである。本発明の文脈において、細胞療法は、化学療法、放射線療法、または免疫療法の介入の併用、ならびにアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤と同様に使用することができると考えている。
【0297】
あるいは、治療法は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の剤治療の前にまたは後に行うことができる。他の剤及び本発明が個体に別々に適用される実施形態では、確実に、それぞれの送達時間の間に、有意な期間が終了することがなく、これにより、剤及び本発明の治療法は、依然として、細胞に対して有利に組み合わされた効果を発揮できるようになる。このような場合、これらが、両方のモダリティで、互いに約１２～２４時間以内に、より好ましくは、互いに約６～１２時間以内に、細胞に接触し得ることを企図している。状況によっては、治療期間を有意に延長させることが望ましい場合があり得るが、この場合、それぞれの投与と投与の間に、数日（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週）経過する。
【0298】
いくつかの実施形態では、治療サイクルは、必要に応じて繰り返される。様々な標準治療、ならびに外科的介入が、本発明の細胞療法と組み合わせて適用され得ることもまた企図される。
【0299】
化学療法
がん治療には、化学療法剤及び放射線治療の両方をベースにした治療との様々な組み合わせ療法も含む。組み合わせ化学療法としては、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデックス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、またはそれらの任意の類似物または誘導バリアント及びそれらの組み合わせが挙げられる。
がん治療には、化学療法剤及び放射線治療の両方をベースにした治療との様々な組み合わせ療法も含む。組み合わせ化学療法としては、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデックス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、またはそれらの任意の類似物または誘導バリアント及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【0300】
特定の実施形態では、個体のための化学療法は、本発明と併用して、例えば、本発明の投与前、本発明の投与中、及び／または本発明の投与後に、使用される。
【0301】
放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く使用されている他の因子としては、一般に、ガンマ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達である。マイクロ波及び紫外線照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も考えられる。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体のアセンブリング及び維持に対して、広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）では１日線量５０～２００レントゲン、単回線量では２０００～６０００レントゲンの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、幅広く異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く使用されている他の因子としては、一般に、ガンマ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達である。マイクロ波及び紫外線照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も考えられる。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体のアセンブリング及び維持に対して、広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）では１日線量５０～２００レントゲン、単回線量では２０００～６０００レントゲンの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、幅広く異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【0302】
用語「接触させる」及び「曝露させる」は、細胞に適用されるときに、治療用構築物及び化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、もしくは標的細胞と直接並置される処理を説明するために本明細書で使用される。細胞死滅または停滞を達成するために、例えば、両方の剤が、細胞を死滅させる、または細胞の分裂を防ぐために有効な組み合わせ量で、細胞に送達される。
【0303】
免疫療法
免疫療法は一般に、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存して、がん細胞を標的として破壊する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体のみが治療のエフェクターとして作用し得る、または他の細胞を動員させて、実際に細胞を死滅させ得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合させて、単に標的剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
免疫療法は一般に、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存して、がん細胞を標的として破壊する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体のみが治療のエフェクターとして作用し得る、または他の細胞を動員させて、実際に細胞を死滅させ得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合させて、単に標的剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
【0304】
したがって、本明細書に記載の本発明の療法以外の免疫療法は、本細胞療法と併用して、組み合わせ療法の一部として使用できる。組み合わせ療法の一般的なアプローチについては、以下に論ずる。一般に、腫瘍細胞は、標的化に対応する、すなわち他の細胞の大部分には存在しない多少のマーカーを保持している必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本発明の文脈において、標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、がん胚性抗原、前立腺特異抗原、尿路腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ及びｐ１５５が挙げられる。
【0305】
遺伝子
更に別の実施形態では、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドが、本発明の臨床実施形態の前、後、または同時に投与される遺伝子療法である。細胞増殖の誘導物質、細胞増殖の阻害剤、またはプログラム細胞死の調節因子など、様々な発現産物が本発明に含まれる。
更に別の実施形態では、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドが、本発明の臨床実施形態の前、後、または同時に投与される遺伝子療法である。細胞増殖の誘導物質、細胞増殖の阻害剤、またはプログラム細胞死の調節因子など、様々な発現産物が本発明に含まれる。
【0306】
外科手術
がん患者のおよそ６０％は、予防的、診断的または病期分類、治癒的及び姑息的手術など、ある種の外科手術を受ける。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法などの他の療法と併用して使用され得るがん治療である。
がん患者のおよそ６０％は、予防的、診断的または病期分類、治癒的及び姑息的手術など、ある種の外科手術を受ける。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法などの他の療法と併用して使用され得るがん治療である。
【0307】
治癒的手術としては、がん性組織の全部または一部を物理的に除去する、摘出すること、及び／または破壊すること、切除することを含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。外科手術による治療としては、腫瘍の切除に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気外科、及び顕微鏡制御手術（モース術）が挙げられる。更に、本発明は、表在性がん、前がん、または付随的な量の正常組織の除去と併用して、使用され得ることが企図される。
【0308】
全てのがん性細胞、組織、または腫瘍の一部を切除したときに、身体内に空洞が形成され得る。治療は、灌流、直接注射、または追加の抗がん療法を伴うその領域の局所適用によって達成することができる。このような治療は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日ごと、または１週、２週、３週、４週、及び５週ごと、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月ごとに繰り返してもよい。これらの治療は、投薬量も変動し得る。
【0309】
ＮＫ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞の凍結保存
本明細書に開示されるＮＫ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞は、凍結保存して、解凍後に細胞表現型を維持することができる。
本明細書に開示されるＮＫ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞は、凍結保存して、解凍後に細胞表現型を維持することができる。
【0310】
細胞の凍結保存のための組成物
免疫細胞のための任意の好適な凍結保存媒体には、限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる、出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１３５９１号に記載されるものを使用することができる。いくつかの態様では、凍結保存媒体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、二糖、サイトカインを含む。いくつかの態様では、凍結保存媒体はまた、ヒト血清アルブミンまたはヒト血清を含む。
免疫細胞のための任意の好適な凍結保存媒体には、限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる、出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１３５９１号に記載されるものを使用することができる。いくつかの態様では、凍結保存媒体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、二糖、サイトカインを含む。いくつかの態様では、凍結保存媒体はまた、ヒト血清アルブミンまたはヒト血清を含む。
【0311】
ＮＫ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用
本明細書に記載される方法で産生されるＮＫ細胞は、様々な適用に使用することができる。例えば、本明細書に記載の凍結保存媒体内に含有されるＣＡＲ－ＮＫ細胞組成物を含む、本明細書に記載の組成物は、養子細胞療法に好適である。養子細胞療法は、例えば、がんを含む様々な疾患を治療するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される凍結保存媒体内に含有されるＣＡＲ－ＮＫ細胞組成物は、がんまたは腫瘍の治療に有用である。ある特定の実施形態では、がんは、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、及び肝臓の腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。いくつかの実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）である。
本明細書に記載される方法で産生されるＮＫ細胞は、様々な適用に使用することができる。例えば、本明細書に記載の凍結保存媒体内に含有されるＣＡＲ－ＮＫ細胞組成物を含む、本明細書に記載の組成物は、養子細胞療法に好適である。養子細胞療法は、例えば、がんを含む様々な疾患を治療するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される凍結保存媒体内に含有されるＣＡＲ－ＮＫ細胞組成物は、がんまたは腫瘍の治療に有用である。ある特定の実施形態では、がんは、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、及び肝臓の腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。いくつかの実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）である。
【0312】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の凍結保存媒体を使用して、養子細胞療法に使用される細胞を懸濁させる。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞組成物は、本明細書に記載の凍結保存媒体に懸濁される。
【0313】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の凍結保存媒体に懸濁したＣＡＲ－ＮＫ細胞組成物を使用して、がんを有する対象を治療する。いくつかの実施形態では、対象は本明細書に記載の凍結保存媒体内にＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む組成物を投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子、ＩＬ－１５遺伝子、及びｉカスパーゼ９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、それを必要とする対象に投与する前に洗浄されない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、それを必要とする対象に投与する前に、凍結保存媒体で洗浄される。いくつかの実施形態では、解凍した細胞は、それを必要とする患者に、細胞を解凍してから約３０分及び２時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、対象への静脈内注入の速度は、約２～３分である。
【0314】
いくつかの実施形態では、養子細胞療法は、１つ以上の追加のがん治療、例えば、リンパ枯渇化学療法と組み合わせて使用される。したがって、いくつかの実施形態では、がんを有する対象は、本明細書に記載の凍結保存媒体に製剤化されたＣＡＲ－ＮＫ細胞療法生成物の投与前にリンパ枯渇化学療法を受ける。
【0315】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法生成物は、本明細書に記載されるように凍結保存され、その後解凍され、それからそれを必要とする患者に投与される。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ－ＮＫ細胞療法生成物は、凍結保存され、輸送され、解凍され、本明細書に記載のように、それを必要とする患者に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法生成物は、本明細書に記載のように製剤中に凍結保存され、その後解凍され、それからＢ細胞悪性腫瘍の治療のために患者に投与される。
【0316】
いくつかの実施形態では、凍結したＣＡＲ－ＮＫ細胞療法生成物は、本明細書に記載の凍結保存媒体中で、本明細書に記載の方法を使用して、バイアル（例えば、５０ｍｌのＡＴバイアル）中に凍結され、－１４０℃～－１９６℃の範囲の温度で同じバイアル内で患者が位置する場所に輸送または出荷され、その結果、患者が位置する場所で細胞を解凍し、バイアルアダプタでバイアルに接続されたシリンジ（すなわち、バイアルから静脈への移送）を使用して患者に直接無菌的に投与することができる。例えば、いくらかの実施形態では、細胞療法生成物を輸送する方法は、（ａ）本明細書に記載の凍結保存媒体中にＣＡＲ－ＮＫ細胞を提供することと、（ｂ）ＣＡＲ－ＮＫ細胞を－８０℃の温度に冷却し、それによって哺乳動物細胞を凍結保存することと、（ｃ）凍結保存した哺乳動物細胞を、約－２０℃～約－１４０℃以下の温度で異なる場所に輸送することと、を含む。したがって、いくつかの実施形態では、凍結保存した哺乳動物細胞は、－１４０℃以下の温度で維持された容器中で、異なる場所に輸送される。いくつかの実施形態では、凍結保存した哺乳動物細胞は、－１４０℃～－１９６℃の温度で維持された容器中で、異なる場所に輸送される。いくつかの実施形態では、凍結保存した哺乳動物細胞は、クライオシッパー内で異なる場所に輸送される。いくつかの実施形態では、輸送された細胞は、患者への投与までクライオシッパーに保存され得る。いくつかの実施形態では、輸送された細胞は、－１４０℃以下の温度で異なる場所に保存される。いくつかの実施形態では、輸送された細胞は、－１４０℃～－１９６℃の温度で異なる場所に保存される。いくつかの実施形態では、輸送された細胞は、異なる場所で受領時から将来の使用時まで液体窒素気相で保存される。したがって、保存は、臨床サイト冷凍庫または液体窒素の気相中で－１４０℃以下の温度を維持するタンクを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、ＩＬ－１５及びｉカスパーゼ９を更に含むＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、１ミリリットル当たり約６００万～１億２０００万個の細胞の濃度で容器内に凍結保存される。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、１ミリリットル当たり約６００万～１億２０００万個の細胞の濃度で５０ｍＬ容器内に凍結保存される。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、１ミリリットル当たり約３００万～１億５０００万個の細胞の濃度で５０ｍＬ容器内に凍結保存される。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、１ミリリットル当たり約１００万～２億５０００万個の細胞の濃度で５０ｍＬ容器内に凍結保存される。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、１ミリリットル当たり約１００万～３億５０００万個の細胞の濃度で５０ｍＬ容器内に凍結保存される。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、１ミリリットル当たり約１００万～５億個の細胞の濃度で５０ｍＬ容器内に凍結保存される。
【0317】
いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約２０×１０６～１００×１０７個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約１００×１０６～９００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約５０×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約１００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約２００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約２００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約３００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約４００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約５００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約６００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約７００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約８００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約９００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約１０００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約１５００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約２０００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約２５００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約３０００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約３５００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約４０００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約４５００×１０６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約５０００×１０６個の細胞を含む。
【0318】
いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約２０～４５ｍＬの充填体積で含まれる。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍＬ容器に、約３６ｍＬの充填体積で含まれる。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞などの免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、１つ以上の導入遺伝子、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むように操作される。いくつかの実施形態では、細胞はＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、ＣＤ１９－ＣＡＲ、ＩＬ－１５導入遺伝子、及びｉカスパーゼ９を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、約１００×１０６～９００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、２００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、３００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、４００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、５００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、６００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、７００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、８００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。いくつかの実施形態では、存在する細胞療法生成物は、５０ｍｌ容器に、９００×１０６個のＣＡＲ－ＮＫ＋細胞である。
【0319】
輸送された細胞療法生成物を、本明細書に記載されるように解凍し、続いてそれを必要とする患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、患者のベッドサイドで解凍される。いくつかの実施形態では、細胞療法生成物は、それを必要とする患者への投与前に洗浄されない。
【0320】
いくつかの実施形態では、輸送された細胞療法生成物は、異なる場所での更なる保存のために凍結されたままである。いくつかの実施形態では、解凍した細胞は、細胞と凍結保存溶液とを分離することなく、それを必要とする対象に導入される。したがって、いくつかの実施形態では、解凍した細胞は、使用前に洗浄されない。解凍した細胞及び付随する凍結保存溶液は、好ましくは、対象への導入前に、体温（すなわち、約３７℃）まで加温される。かかる状況では、細胞の用量は、凍結前細胞数に基づく。
【0321】
いくつかの実施形態では、解凍した細胞は更に培養される。いくつかの実施形態では、培養することは、細胞をインキュベーターに配置することと、緩衝溶液を除去することと、緩衝溶液を、細胞の増殖及び／または分化のために設計された培養培地で置き換えることと、を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、インキュベーター内で約６～７時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、細胞の増殖及び／または分化のために設計された培養培地は、クボタの培地及び／または細胞の分化のためのホルモンによって定義された培地（ＨＤＭ）を含む。
【0322】
解凍した細胞の生存率は、当該技術分野で既知の様々な方法を使用して、インビトロならびにインビボで評価することができる。いくつかの実施形態では、インビトロ細胞生存率試験は、トリパンブルー除外アッセイを含む。いくつかの実施形態では、他の分析方法、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲなどの使用を介した遺伝子発現を使用して、異なる凍結保存媒体で凍結されていて解凍された細胞の細胞生存率を評価することができる。当業者であれば、他の新鮮な細胞の細胞生存率を評価するために適用することができる、解凍した細胞の生存率を評価するための任意の分析方法を選択することができる。
【0323】
一般に、インビボでの細胞の生存率は、インビボで投与された細胞の機能特性を評価することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、細胞のインビボ生存率は、必要とする対象に導入されている細胞の細胞数を評価することによって評価することができる。細胞を追跡し、投与された細胞の生存率を決定するための様々な方法が、当該技術分野で知られている。
【0324】
本明細書に記載の凍結保存媒体を使用して凍結保存及び解凍した細胞は、一次細胞または新鮮な細胞単離物が有することができる任意の目的のために細胞を使用することを可能にする。凍結保存及び解凍した細胞は、高い生存率（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超）を保持し、それらの天然状態の生理学的特性を保持し、細胞の遺伝子操作のため、及び例えば、養子細胞療法用途などの細胞療法目的のためなど、様々な用途に使用することを可能にする。
【0325】
ＣＡＲ－ＮＫ細胞の投与
本発明のＣＡＲ改変ＮＫ細胞は、単独で、あるいは希釈剤及び／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインなどの他の成分または細胞集団と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで投与され得る。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
本発明のＣＡＲ改変ＮＫ細胞は、単独で、あるいは希釈剤及び／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインなどの他の成分または細胞集団と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで投与され得る。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【0326】
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）される疾患に適した手法で投与されてよい。投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定され得る。
【0327】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、及び状態における個体差を考慮して、医師によって決定することができる。本明細書に記載されるＮＫ細胞を含む医薬組成物は、細胞約１０４～１０９個／ｋｇ体重、例えば、細胞約１０５～１０６個／ｋｇ体重の投与量で投与され得ると一般に明言することができる。ＮＫ細胞組成物も、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技法を使用することによって投与することができる。特定の患者に最適な投与量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患の兆候について監視し、適宜に治療を調整することによって、医学分野の技術者によって容易に決定され得る。
【0328】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、移植、または移植によるなど、任意の簡便な方法で実行され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下で、皮内で、腫瘍内で、結節内で、髄内で、筋肉内で、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内で、投与され得る。一実施形態では、本発明のＮＫ細胞組成物は、患者に、皮内または皮下注射によって投与される。別の実施形態では、本発明のＮＫ細胞組成物は、好ましくはｉ．ｖ．注射によって投与される。ＮＫ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射され得る。
【0329】
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して活性化及び増殖された細胞は、患者に、抗ウイルス療法、シドフォビル及びインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）またはナタリジトマブ（ｎａｔａｌｉｚｉｔｍａｂ）治療もしくはエファイイズマブ（ｅｆａｉｉｚｕｍａｂ）治療などの薬剤による治療を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する治療モダリティと併せて（例えば、前、同時、または後のいずれか）投与される。更なる実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭ ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フリイダリビン（ｆｌｉｉｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び照射などの他の免疫除去剤と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、患者に、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどのいずれかを使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）投与される。いくつかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法後に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、高用量化学療法及びその後の末梢血幹細胞移植による標準治療を受け得る。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖した細胞は、外科手術の前または後に投与される。
【0330】
患者に投与される上記治療の投与量は、治療される状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって異なるであろう。ヒト投与のための投与量の増減は、当技術分野で認められている慣行に従って行うことができる。いくつかの実施形態では、約１～約１００ｍｇの用量が、成人患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法は、１～３０日の期間、毎日投与される。いくつかの実施形態では、１日当たり１～１０ｍｇが、毎日投与される。いくつかの実施形態では、１日当たり約４０ｍｇが投与される。
【実施例】
【0331】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の実施例において明らかである。しかしながら、本発明の実施形態を示しながら、実施例が、限定ではなく、例示としてのみ、与えられることを理解するべきである。実施例から、本発明の範囲内での様々な変更及び修正が、当業者に明らかになるであろう。
【0332】
実施例１．ｉＰＳ細胞のＨＰ細胞バルクへの分化
ｉＰＳ細胞株であるＦｆＩ－０１ｓ０４株は、健康な個体の末梢血単核細胞に由来した。ＳｔｅｍＦｉｔ完全培地に分散したＦｆＩ－０１ｓ０４細胞を、低酸素（５％Ｏ２）条件下で、超低接着処理した６ウェルプレートに細胞６×１０５個／ウェルで播種した（「０日目」）。ＳｔｅｍＦｉｔ完全培地は、１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１及び５０μＭ Ｙ－２７６３２を含んだ。翌日（すなわち、１日目）に、ＦｆＩ－０１ｓ０４細胞を、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、及びアスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍＬ）を含有する造血前駆細胞（ＨＰＣ）分化培地に分散させた。ＨＰＣ誘導培地は、ヒトインスリン（１０μｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（５．５μｇ／ｍＬ）、セレン酸ナトリウム（６．７ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、及びα－モノチオグリセロール（０．４ｍＭ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４を含んだ。２日目に、ＳＢ４３１５４２（培地中６μＭ）を培養培地（すなわち、細胞を含むＨＰＣ分化培地）に添加し、細胞を２日間培養した。４日目に、細胞を、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、及びアスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍＬ）を含有する別の培地中に再分散させ、更に３日間培養した。７日目に、細胞を、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＦｌｔ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する別の培地に曝露し、この培地を使用して更に７日間培養した。この７日間の培養期間中、培地は、２～３日ごとに交換した。
ｉＰＳ細胞株であるＦｆＩ－０１ｓ０４株は、健康な個体の末梢血単核細胞に由来した。ＳｔｅｍＦｉｔ完全培地に分散したＦｆＩ－０１ｓ０４細胞を、低酸素（５％Ｏ２）条件下で、超低接着処理した６ウェルプレートに細胞６×１０５個／ウェルで播種した（「０日目」）。ＳｔｅｍＦｉｔ完全培地は、１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１及び５０μＭ Ｙ－２７６３２を含んだ。翌日（すなわち、１日目）に、ＦｆＩ－０１ｓ０４細胞を、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、及びアスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍＬ）を含有する造血前駆細胞（ＨＰＣ）分化培地に分散させた。ＨＰＣ誘導培地は、ヒトインスリン（１０μｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（５．５μｇ／ｍＬ）、セレン酸ナトリウム（６．７ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、及びα－モノチオグリセロール（０．４ｍＭ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４を含んだ。２日目に、ＳＢ４３１５４２（培地中６μＭ）を培養培地（すなわち、細胞を含むＨＰＣ分化培地）に添加し、細胞を２日間培養した。４日目に、細胞を、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、及びアスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍＬ）を含有する別の培地中に再分散させ、更に３日間培養した。７日目に、細胞を、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＦｌｔ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する別の培地に曝露し、この培地を使用して更に７日間培養した。この７日間の培養期間中、培地は、２～３日ごとに交換した。
【0333】
実施例２．ＣＤ４－細胞を含む集団へのＨＰ細胞バルクの分化
１４日目に、実施例１から得られた細胞集団をいかなる細胞単離も行うことなく（「ＨＰ細胞バルク」）、１５ｃｍディッシュに細胞３．１２×１０６個／ディッシュで播種し、５％Ｏ２下、３７℃で培養した。様々な播種密度を使用してよく、前述の播種密度は、一実施形態であることに留意されたい。各１５ｃｍディッシュは、ｒｈ－ＤＬＬ４／Ｆｃ キメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）でコーティングした。この培養期間中、培地は２～３日ごとに交換した。１５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５５μＭの２－メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１５μＭのＳＢ２０３５８０、３０ｎＭのＳＤＦ－１αを補充したＭＥＭα（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｉｂｃｏ））を、これらの細胞を培養する培地として使用した。２１日目に、新たにｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングした新しい１５ｃｍディッシュに細胞を継代させた。２８日目に、新たにｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングした新しい１５ｃｍディッシュに細胞を更に継代させた。３５日目に、とりわけ、ＣＤ４－細胞を含む全ての細胞を回収した。
１４日目に、実施例１から得られた細胞集団をいかなる細胞単離も行うことなく（「ＨＰ細胞バルク」）、１５ｃｍディッシュに細胞３．１２×１０６個／ディッシュで播種し、５％Ｏ２下、３７℃で培養した。様々な播種密度を使用してよく、前述の播種密度は、一実施形態であることに留意されたい。各１５ｃｍディッシュは、ｒｈ－ＤＬＬ４／Ｆｃ キメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）でコーティングした。この培養期間中、培地は２～３日ごとに交換した。１５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５５μＭの２－メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１５μＭのＳＢ２０３５８０、３０ｎＭのＳＤＦ－１αを補充したＭＥＭα（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｉｂｃｏ））を、これらの細胞を培養する培地として使用した。２１日目に、新たにｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングした新しい１５ｃｍディッシュに細胞を継代させた。２８日目に、新たにｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングした新しい１５ｃｍディッシュに細胞を更に継代させた。３５日目に、とりわけ、ＣＤ４－細胞を含む全ての細胞を回収した。
【0334】
実施例３．ＮＫ細胞バルクへのバルクの分化
３５日目に、ＣＤ４－細胞、すなわち、いかなる細胞単離も行わずに実施例２から得られた細胞を含む集団を、４８ウェルプレートに細胞１×１０６個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で３日間培養した。１５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム、５００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充したＭＥＭα培地を培地として使用した。３８日目に、細胞を、１５％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充した別のＭＥＭα培地に分散させ、培養培地として使用した。４２日目に、ＮＫ細胞を含む全ての細胞（「ＮＫ細胞バルク」）を回収した。
３５日目に、ＣＤ４－細胞、すなわち、いかなる細胞単離も行わずに実施例２から得られた細胞を含む集団を、４８ウェルプレートに細胞１×１０６個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で３日間培養した。１５％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム、５００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充したＭＥＭα培地を培地として使用した。３８日目に、細胞を、１５％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充した別のＭＥＭα培地に分散させ、培養培地として使用した。４２日目に、ＮＫ細胞を含む全ての細胞（「ＮＫ細胞バルク」）を回収した。
【0335】
実施例４．ＮＫ細胞バルクへのバルクの分化－ＣＤ４－細胞濃縮
いくつかの実施形態では、実施例２から得られた細胞の集団は、ＣＤ４－である細胞について濃縮するように処理される。これは、例えば、ＣＤ４＋細胞を枯渇させる方法（すなわち、ＣＤ４＋細胞枯渇）で行うことができる。例示的な方法について後述する。
いくつかの実施形態では、実施例２から得られた細胞の集団は、ＣＤ４－である細胞について濃縮するように処理される。これは、例えば、ＣＤ４＋細胞を枯渇させる方法（すなわち、ＣＤ４＋細胞枯渇）で行うことができる。例示的な方法について後述する。
【0336】
ＣＤ４＋細胞枯渇
いくつかの実施形態では、３５日目に、実施例２で得られた集団は、ＣＤ４抗原を発現する細胞を枯渇させる。具体的には、実施例２から得られた細胞集団を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気ベースの選別方法（ＭＡＣＳ）などの細胞枯渇方法に供して、ＣＤ４抗原を発現する集団中の細胞を枯渇させ、それによって、実施例２から得られた細胞集団におけるＣＤ４＋細胞を枯渇させる。この手段で、細胞は、ＣＤ４－細胞について濃縮したものが得られる。
いくつかの実施形態では、３５日目に、実施例２で得られた集団は、ＣＤ４抗原を発現する細胞を枯渇させる。具体的には、実施例２から得られた細胞集団を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気ベースの選別方法（ＭＡＣＳ）などの細胞枯渇方法に供して、ＣＤ４抗原を発現する集団中の細胞を枯渇させ、それによって、実施例２から得られた細胞集団におけるＣＤ４＋細胞を枯渇させる。この手段で、細胞は、ＣＤ４－細胞について濃縮したものが得られる。
【0337】
ＣＤ４＋細胞枯渇後、濃縮したＣＤ４－細胞を４８ウェルプレートに細胞１×１０６個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で３日間培養する。１５％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム、５００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充したＭＥＭα培地を培養培地として使用する。３８日目に、細胞を、１５％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充した別のＭＥＭα培地に分散させ、培養培地として使用する。４２日目に、ＮＫ細胞を含む全ての細胞（「ＮＫ細胞バルク」）を回収する。
【0338】
実施例５．フローサイトメトリー分析
次に、ＮＫ細胞バルクを表１に列挙した抗体のセットで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１に示されるように、ＣＤ３陰性ＮＫ細胞バルクの一部は、ＣＤ５６を発現した（「ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞」）。ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。したがって、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、ｉＰＳＣ（ＦｆＩ－０１ｓ０４株）から誘導されたＨＰＣバルクから調製した。上記のプロセスで得られたＣＤ５６を発現する細胞は、ｉＰＳ ＮＫ細胞と呼ばれることもある。フローサイトメトリーに使用した抗体を表１に示す。
次に、ＮＫ細胞バルクを表１に列挙した抗体のセットで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１に示されるように、ＣＤ３陰性ＮＫ細胞バルクの一部は、ＣＤ５６を発現した（「ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞」）。ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。したがって、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、ｉＰＳＣ（ＦｆＩ－０１ｓ０４株）から誘導されたＨＰＣバルクから調製した。上記のプロセスで得られたＣＤ５６を発現する細胞は、ｉＰＳ ＮＫ細胞と呼ばれることもある。フローサイトメトリーに使用した抗体を表１に示す。
【0339】
【表1】
【0340】
実施例６．単一細胞ＲＮＡ配列（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）分析
ＮＫ細胞バルク集団（すなわち、実施例３または実施例４で得られた細胞）における異なる細胞種を特定するために、非線形次元削減技法（単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）に基づく均一多様体近似及び投影（ＵＭＡＰ））を適用した。
ＮＫ細胞バルク集団（すなわち、実施例３または実施例４で得られた細胞）における異なる細胞種を特定するために、非線形次元削減技法（単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）に基づく均一多様体近似及び投影（ＵＭＡＰ））を適用した。
【0341】
ＧｅｎｅｗｉｚのＩＩｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００で、ＮＫ細胞バルクの１万個の細胞に対して、単一細胞ＲＮＡ配列決定を行った。ＳｉｎｇｌｅＲアルゴリズム及び手動クラスターラベリングを使用して、事象を４つの幅広い細胞集団（ＰＢＭＣサンプル中の単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ細胞）に分類した。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから無料で入手できるＰＢＭＣのデータセットを、データ分析の対照として使用した。
【0342】
図２に示されるように、ＮＫ細胞バルク中の約７５％の細胞が、ＮＫ細胞として特定され、ＮＫ細胞バルク中の約２５％の細胞が、Ｔ細胞として特定された。したがって、ＮＫ細胞バルクには、単一細胞ＲＮＡ配列決定によるｍＲＮＡプロファイリングに基づいて、ＮＫ細胞及びＴ細胞の両方が含まれていた。
【0343】
実施例７．ＣＡＲ－ＮＫ細胞調製
ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲを発現するように更に改変させた。ＮＫ細胞の改変は、（１）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を合成するステップと、（２）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターを調製するステップと、（３）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターでＮＫ細胞を形質導入するステップと、を含む。
ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲを発現するように更に改変させた。ＮＫ細胞の改変は、（１）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を合成するステップと、（２）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターを調製するステップと、（３）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターでＮＫ細胞を形質導入するステップと、を含む。
【0344】
ＣＡＲ／ＩＬ１５－ＮＫ細胞の調製
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子は、表２に示されるように、Ｎ末端から配置されるように設計されるオリゴペプチドを合成することによって調製した。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子は、表２に示されるように、Ｎ末端から配置されるように設計されるオリゴペプチドを合成することによって調製した。
【0345】
【表2】
【0346】
抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＷＯ２０１４／１５３２７０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に従って構築した。
【0347】
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子の調製
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子は、Ｎ末端から配置されるように設計されるオリゴペプチドを合成することによって調製した。ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５は、Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２８１，Ｎｏ ３，ｐａｇｅｓ １６１２－１６１９，Ｊａｎｕａｒｙ ２０，２００６、Ｃｈｅｒｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８８，Ｎｏ．２５，Ｐａｇｅｓ １８０９３－１８１０３，Ｊｕｎｅ ２１，２０１３、及びＲｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；３９（２）：４９１－５０６（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に従って構築した。
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子は、Ｎ末端から配置されるように設計されるオリゴペプチドを合成することによって調製した。ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５は、Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２８１，Ｎｏ ３，ｐａｇｅｓ １６１２－１６１９，Ｊａｎｕａｒｙ ２０，２００６、Ｃｈｅｒｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８８，Ｎｏ．２５，Ｐａｇｅｓ １８０９３－１８１０３，Ｊｕｎｅ ２１，２０１３、及びＲｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；３９（２）：４９１－５０６（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に従って構築した。
【0348】
【表3】
【0349】
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含むレトロウイルスベクターの調製
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子は、ｐＭＹレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に組み込ませた。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを産生するために、ＦＲＹ－ＲＤ１８細胞を使用して生成した。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子は、ｐＭＹレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に組み込ませた。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを産生するために、ＦＲＹ－ＲＤ１８細胞を使用して生成した。
【0350】
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターの調製
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子は、別のｐＭＹレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に組み込ませた。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを生産するために、ＦＲＹ－ＲＤ１８細胞を使用して生成した。
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子は、別のｐＭＹレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に組み込ませた。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを生産するために、ＦＲＹ－ＲＤ１８細胞を使用して生成した。
【0351】
抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子のｉＰＳ ＮＫ細胞への形質導入
ｉＰＳ ＮＫ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含むレトロウイルスベクター、及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質導入させて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ｉＰＳ ＮＫ細胞（「ｉＮＫ－ＣＡＲ１９」）を生成した。
ｉＰＳ ＮＫ細胞は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含むレトロウイルスベクター、及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質導入させて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ｉＰＳ ＮＫ細胞（「ｉＮＫ－ＣＡＲ１９」）を生成した。
【0352】
実施例８．ｉＮＫ－ＣＡＲ１９のインビボ抗腫瘍活性
ルシフェラーゼ発現性Ｎａｌｍ６細胞（ＡＴＣＣ、がん細胞）（５×１０５細胞）を、尾静脈を介して、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ、ＩＬ－２Ｒガンマヌルマウス（「ＮＳＧマウス」）に移植した。ＮＳＧマウス（雄、４～５週齢）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｎａｌｍ６細胞移植の４日後、０．２ｍｌのＰＢＳまたは細胞を含まないわずか０．２ｍｌのＰＢＳに分散させたｉＮＫ－ＣＡＲ１９（１×１０７細胞）を、尾静脈を介してＮａｌｍ６移植ＮＳＧマウスに投与した。ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞またはＰＢＳを投与後、尾静脈を介してルシフェリンをマウスに投与した。ルシフェラーゼ活性は、ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、７０日以上測定した。
ルシフェラーゼ発現性Ｎａｌｍ６細胞（ＡＴＣＣ、がん細胞）（５×１０５細胞）を、尾静脈を介して、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ、ＩＬ－２Ｒガンマヌルマウス（「ＮＳＧマウス」）に移植した。ＮＳＧマウス（雄、４～５週齢）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｎａｌｍ６細胞移植の４日後、０．２ｍｌのＰＢＳまたは細胞を含まないわずか０．２ｍｌのＰＢＳに分散させたｉＮＫ－ＣＡＲ１９（１×１０７細胞）を、尾静脈を介してＮａｌｍ６移植ＮＳＧマウスに投与した。ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞またはＰＢＳを投与後、尾静脈を介してルシフェリンをマウスに投与した。ルシフェラーゼ活性は、ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、７０日以上測定した。
【0353】
図３は、未処置（緩衝液のみで処置）及びｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞処置したＮａｌｍ６移植ＮＳＧマウスの抗腫瘍効果を示す。３日後、Ｄ－ＰＢＳ緩衝液で処理した全てのマウスにおいて、発光が検出された。対照的に、他のマウス（初代ＣＡＲ Ｔ細胞またはｉＮＫ－ＣＡＲ細胞のいずれかで処理）では、投与後２８日まで、発光は検出されず、また、処理後７０日目でも、ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞で処理された１匹のマウスでは、発光は検出されなかった。したがって、ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞は、Ｎａｌｍ６がん細胞に対する増強した毒性を明確に実証した。
【0354】
等価物及び範囲
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載される通りである。
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載される通りである。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】