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▶ メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】抗ＰＲＯＴＡＣ抗体および複合体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20240709BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240709BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240709BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240709BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240709BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240709BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240709BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240709BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240709BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C07K16/46
A61K39/395 N
A61K47/68
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
G01N33/53 D
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023580720
(86)(22)【出願日】2022-07-01
(85)【翻訳文提出日】2024-02-27
(86)【国際出願番号】 EP2022068347
(87)【国際公開番号】W WO2023275394
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】21183460.1
(32)【優先日】2021-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591032596
【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】リーカー，マルセル
(72)【発明者】
【氏名】イェーガー，セバスチャン
(72)【発明者】
【氏名】ラッシュ，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】コーニング，ドリーン
(72)【発明者】
【氏名】シュローダー，クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】シュナイダー，ヘンドリック
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA19
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C084ZC752
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、標的タンパク質分解キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）のＶＨＬリガンド分解部分（デグロン）に、任意選択で、標的タンパク質に結合可能な、単一特異性または二重特異性抗体またはその抗体断片または融合タンパク質に関する。本発明はまた、このような抗体またはその抗体断片または融合タンパク質とＰＲＯＴＡＣの複合体（ＰＡＸ）ならびにそれらの生成方法、ならびにその各々の医学的ならびに非医学的使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＲＯＴＡＣのＶＨＬリガンドデグロンに結合可能な単離抗体。
【請求項2】
単一特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
ＩｇＧ型の全長抗体またはその断片または単一ドメイン抗体または単鎖抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
前記全長抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４型のものである、請求項３に記載の抗体。
【請求項5】
前記単一ドメイン抗体が、ＶＨＨ抗体である、請求項３に記載の抗体。
【請求項6】
前記単鎖抗体が、単一特異性の一価単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項３に記載の抗体。
【請求項7】
二重特異性抗体であり、第２の結合可能性が標的タンパク質に対してである、請求項１または３から６のいずれかに記載の抗体。
【請求項8】
ａ）２つの全長抗体重鎖および２つの全長抗体軽鎖からなる単一特異性二価抗体であって、各鎖は１つのみの可変ドメインを含む、単一特異性二価抗体、ｂ）各々、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメインおよび前記抗体重鎖可変ドメインと前記抗体軽鎖可変ドメインの間の単鎖－リンカーからなる、２つの単一特異性一価単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ならびに任意選択で、
ｃ）（ａ）部分のＣ末端と（ｂ）部分のＮ末端を接続するペプチド－リンカー
を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項9】
ａ）２つの全長抗体重鎖および２つの全長抗体軽鎖からなり、それによって、各鎖は１つのみの可変ドメインを含む、単一特異性二価抗体、ｂ）各々、１つの抗体可変ドメインからなる、２つの可変２つの重鎖単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体、ならびに任意選択で、
ｃ）（ａ）部分のＣ末端と（ｂ）部分のＮ末端を接続するペプチド－リンカー
を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項10】
（ｂ）部分の前記２つの重鎖単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体の前記Ｎ末端および（ａ）部分の前記単一特異性二価抗体の前記Ｃ末端が、ペプチドリンカーを介して接続される、請求項９に記載の抗体。
【請求項11】
（ａ）部分の前記可変ドメインが、前記標的タンパク質に結合可能であり、（ｂ）部分の前記可変ドメインが、前記ＰＲＯＴＡＣの前記ＶＨＬリガンドデグロンに結合可能である、請求項８から１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項12】
（ｂ）部分の前記可変ドメインが前記標的タンパク質に結合可能であり、（ａ）部分の前記可変ドメインが前記ＰＲＯＴＡＣの前記デグロンに結合可能である、請求項８から１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項13】
前記ＰＲＯＴＡＣの前記デグロンが、式Ｉ：【化1】
Ｒ１またはＲ２の一方は、弾頭に接続されたリンカーであり、ただし、
Ｒ２がリンカーである場合には、Ｒ１はアセチルであり、および
Ｒ１がリンカーである場合には、Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、シアノ、Ｆ、Ｃｌ、アミノまたはメチルであり、
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ５、Ｒ６は、ＨまたはＯＨであり、ただし、
Ｒ６がＨである場合には、Ｒ５はＯＨであり、および
Ｒ５がＨである場合には、Ｒ６はＯＨである］
のＶＨ０３２誘導体である、請求項１１または１２に記載の抗体。
【請求項14】
Ｒ１が、ＰＢ－Ｑ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
Ｑは、ＮＨ、Ｃ＝Ｏまたは存在せず、
ｎ、ｍは独立に、０、１、２、３または４であり、
ｐは、０～１０であり、
Ｒ２は、メチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１３に記載される通りである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項15】
Ｒ１が、ＰＢ－Ｑ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
Ｑは、ＮＨ、Ｃ＝Ｏまたは存在せず、
（ｘｉ）ｎ、ｍ、ｐは１であり、または
（ｘｉｉ）ｎは３もしくは４であり、ｍは０であり、ｐは１である、または
（ｘｉｉｉ）ｎは１であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｘｉｖ）ｎは２であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｘｖ）ｎ、ｍは０であり、ｐは６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１３に記載の通りである、請求項１４に記載の抗体。
【請求項16】
Ｒ１がアセチルであり、Ｒ２が、ＰＢ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｓ－であり、式中、ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、ｐは、１、２、３、４、５または６であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、請求項１３に記載の通りである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項17】
前記ＰＲＯＴＡＣが、図８（ａ）および８（ｂ）に示される前記ＰＲＯＴＡＣから選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項18】
前記標的タンパク質が、細胞表面タンパク質である、請求項１、３から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項19】
前記細胞表面タンパク質が腫瘍抗原である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項20】
前記細胞表面タンパク質が、Ｈｅｒ２、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＴＲＯＰ２、ＮＡＰＩ２Ｂ、Ｂ７Ｈ３またはＥＧＦＲである、請求項１９に記載の抗体。
【請求項21】
前記ＰＲＯＴＡＣの前記デグロンに結合可能な前記可変ドメインが、全長抗体のものであり、以下のＣＤＲ配列：ＨＣ ＣＤＲ１： Ｇ Ｙ Ｓ Ｘ１ Ｔ Ｘ２ Ｘ３ Ｙ （配列番号１）；
ＨＣ ＣＤＲ２： Ｉ Ｔ Ｙ Ｓ Ｇ Ｘ４ Ｔ （配列番号２）；
ＨＣ ＣＤＲ３： Ｘ５ Ｘ６ Ｙ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ （配列番号３）；
ＬＣ ＣＤＲ１： Ｑ Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｘ２４ Ｙ （配列番号４）；
ＬＣ ＣＤＲ２： Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ （配列番号５）；
ＬＣ ＣＤＲ３： Ｘ２８ Ｑ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１ Ｘ３２ Ｐ Ｙ Ｔ （配列番号６）；
を含み、
ここで、Ｘ１は、ＩまたはＡであり、Ｘ２は、ＧまたはＮであり、Ｘ３は、ＤまたはＮであり、Ｘ４は、ＧまたはＡであり、Ｘ５は、ＡまたはＧであり、Ｘ６は、ＫまたはＹであり、Ｘ７は、ＧまたはＹであり、Ｘ８は、存在しないかまたはＡであり、Ｘ９は、存在しないかまたはＶであり、Ｘ１０は、存在しないかまたはＰであり、Ｘ１１は、ＤまたはＹであり、Ｘ１２は、ＧまたはＹであり、Ｘ１３は、ＧまたはＦであり、Ｘ１４は、ＲまたはＡであり、Ｘ１５は、ＤまたはＨであり、Ｘ１６は、ＳまたはＧであり、Ｘ１７は、ＬまたはＩであり、Ｘ１８は、Ｓであるかまたは存在せず、Ｘ１９は、Ｙであるかまたは存在せず、Ｘ２０は、Ｓであるかまたは存在せず、Ｘ２１は、Ｄであるかまたは存在せず、Ｘ２２は、Ｇであるかまたは存在せず、Ｘ２３は、ＮまたはＧであり、Ｘ２４は、ＴまたはＮであり、Ｘ２５は、ＬまたはＹであり、Ｘ２６は、ＶまたはＡであり、Ｘ２７は、ＳまたはＴであり、Ｘ２８は、ＶまたはＬであり、Ｘ２９は、ＳまたはＹであり、Ｘ３０は、ＩまたはＤであり、Ｘ３１は、ＨまたはＥであり、Ｘ３２は、ＶまたはＹである、請求項１から２０のいずれかに記載の抗体。
【請求項22】
前記ＰＲＯＴＡＣの前記デグロンに結合可能な前記可変ドメインが、ＶＨＨ抗体のものであり、以下のＣＤＲ配列：ＣＤＲ１： Ｇ Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ （配列番号１７）；
ＣＤＲ２： Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ （配列番号１８）；
ＣＤＲ３： Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｘ２４ Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ Ｘ２８ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１ Ｘ３２ Ｘ３３ Ｘ３４ Ｘ３５ Ｘ３６ （配列番号１９）；
を含み、
ここで、Ｘ１は、ＦまたはＲであり、Ｘ２は、Ｔ、Ａ、ＳまたはＲであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、ＤまたはＮであり、Ｘ５は、ＤまたはＴであり、Ｘ６は、ＹまたはＬであり、Ｘ７は、ＡまたはＴであり、Ｘ８は、Ｉ、ＮまたはＬであり、Ｘ９は、ＳまたはＴであり、Ｘ１０は、ＳまたはＷであり、Ｘ１１は、ＳまたはＮであり、Ｘ１２は、ＤまたはＧであり、Ｘ１３は、ＧまたはＤであり、Ｘ１４は、ＳまたはＮであり、Ｘ１５は、ＡまたはＴであり、Ｘ１６は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ１７は、Ａ、ＶまたはＩであり、Ｘ１８は、Ｓ、Ａ、ＩまたはＤであり、Ｘ１９は、Ｔ、Ｙ、ＲまたはＡであり、Ｘ２０は、Ｒ、ＹまたはＧであり、Ｘ２１は、Ｖ、Ｓ、ＬまたはＴであり、Ｘ２２は、Ｌ、Ｇ、ＳまたはＣであり、Ｘ２３は、Ｓ、Ａ、ＣまたはＰであり、Ｘ２４は、Ｔ、Ａ、ＳまたはＮであり、Ｘ２５は、Ｐ、Ｉ、ＶまたはＤであり、Ｘ２６は、存在しないかまたはＶまたはＡであり、Ｘ２７は、Ｄ、Ｓ、Ｒまたは存在せず、Ｘ２８は、Ｖ、ＧまたはＰであり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｔ、ＧまたはＲであり、Ｘ３０は、Ｑ、Ｉ、ＴまたはＲであり、Ｘ３１は、Ｖ、ＫまたはＲであり、Ｘ３２は、Ｒ、ＩまたはＹであり、Ｘ３３は、Ｙ、Ｑ、ＦまたはＡであり、Ｘ３４は、ＶまたはＬであり、Ｘ３５は、Ｅ、ＰまたはＤであり、Ｘ３６は、Ｖ、ＹまたはＡである、請求項１から２０のいずれかに記載の抗体。
【請求項23】
Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＴまたはＳであり、Ｘ３がＬまたはＦであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＹであり、Ｘ７がＡまたはＴであり、Ｘ８がＩであり、Ｘ９がＳまたはＴであり、Ｘ１０がＳであり、Ｘ１１がＳであり、Ｘ１２がＤであり、Ｘ１３がＧであり、Ｘ１４がＳであり、Ｘ１５がＡまたはＴであり、Ｘ１６がＡまたはＳであり、Ｘ１７がＶまたはＡであり、Ｘ１８がＡまたはＩであり、Ｘ１９がＴまたはＹであり、Ｘ２０がＧまたはＲであり、Ｘ２１がＬまたはＳであり、Ｘ２２がＣまたはＳであり、Ｘ２３がＰまたはＣであり、Ｘ２４がＡまたはＳであり、Ｘ２５がＶまたはＤであり、Ｘ２６が存在しないかまたはＶであり、Ｘ２７がＲであるかまたは存在せず、Ｘ２８がＧまたはＰであり、Ｘ２９がＴまたはＧであり、Ｘ３０がＱまたはＩであり、Ｘ３１がＫまたはＲであり、Ｘ３２がＲ、ＩまたはＹであり、Ｘ３３がＦまたはＡであり、Ｘ３４がＬであり、Ｘ３５がＥまたはＤであり、Ｘ３６がＶまたはＹである、請求項２２に記載の抗体。
【請求項24】
ＣＤＲ１がＧＦＳＦＤＤＹＡ（配列番号２１）であり、ＣＤＲ２がＩＳＳＳＤＧＳＴ（配列番号２２）であり、
ＣＤＲ３がＳＡＩＹＲＬＳＣＳＶＶＲＰＴＩＲＹＡＬＤＹ（配列番号２３）である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項25】
ＣＤＲ１がＧＦＴＦＤＤＹＡ（配列番号２５）であり、ＣＤＲ２がＩＳＳＳＤＧＳＡ（配列番号２６）であり、
ＣＤＲ３がＡＶＡＴＧＳＣＰＡＤＧＧＱＫＩＦＬＥＶ（配列番号２７）である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項26】
ＰＲＯＴＡＣを検出、定量化または精製するための、前記の請求項のいずれかに記載の単一特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項27】
前記二重特異性抗体が前記ＰＲＯＴＡＣの前記デグロンに結合する、請求項１、３から２５のいずれかに記載の二重特異性抗体およびＰＲＯＴＡＣの複合体（ＰＡＸ）。
【請求項28】
前記ＰＲＯＴＡＣの前記デグロンおよび前記リンカーが、請求項１３から１７のいずれかに記載される通りである、請求項２６に記載の複合体（ＰＡＸ）。
【請求項29】
請求項２７または２８に記載の複合体と、１つまたは複数のさらなる薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物。
【請求項30】
分解標的タンパク質を発現する標的細胞にＰＲＯＴＡＣを送達するための、請求項２７または２８に記載の複合体の使用。
【請求項31】
請求項２７または２８に記載の複合体を、それを必要とする患者に投与することによって疾患を処置する方法であって、前記疾患が、前記ＰＲＯＴＡＣの前記分解標的タンパク質の分解から恩恵を受ける、方法。
【請求項32】
前記ＰＲＯＴＡＣの前記分解標的タンパク質の前記分解から恩恵を受ける疾患の処置において使用するための、請求項２７または２８に記載の複合体（ＰＡＸ）。
【請求項33】
前記複合体（ＰＡＸ）がまず投与され、続いて、前記ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣ構成成分単独がその後投与される、前記ＰＲＯＴＡＣの前記分解標的タンパク質の前記分解から恩恵を受ける疾患の処置において使用するための請求項２７または２８に記載の複合体（ＰＡＸ）。
【請求項34】
前記ＰＡＸの抗体構成成分がまず投与され、前記ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣ構成成分がその後投与される、前記ＰＲＯＴＡＣの前記分解標的タンパク質の前記分解から恩恵を受ける疾患の処置において使用するための請求項２７または２８に記載の複合体（ＰＡＸ）。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．技術分野
本発明は、標的タンパク質分解キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）のＶＨＬリガンド分解部分（デグロン）に、任意選択で、標的タンパク質に結合可能な、単一特異性または二重特異性抗体またはその抗体断片または融合タンパク質に関する。本発明はまた、このような抗体またはその抗体断片または融合タンパク質とＰＲＯＴＡＣの複合体（ＰＡＸ）ならびにそれらの生成方法、ならびにその各々の医学的ならびに非医学的使用にも関する。
本発明は、標的タンパク質分解キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）のＶＨＬリガンド分解部分（デグロン）に、任意選択で、標的タンパク質に結合可能な、単一特異性または二重特異性抗体またはその抗体断片または融合タンパク質に関する。本発明はまた、このような抗体またはその抗体断片または融合タンパク質とＰＲＯＴＡＣの複合体（ＰＡＸ）ならびにそれらの生成方法、ならびにその各々の医学的ならびに非医学的使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
２．背景
２．１ 不必要なタンパク質の分解 － ＰＲＯＴＡＣ
細胞維持および正常な機能には、細胞性タンパク質の制御された分解が必要である。例えば、調節タンパク質の分解は、ＤＮＡ複製、染色体分離などといった細胞周期中の事象を引き起こす。したがって、タンパク質のこのような分解は、細胞の増殖、分化および死滅に影響を及ぼす。タンパク質の阻害剤は、細胞においてタンパク質活性を遮断または低減することができるが、タンパク質分解は、標的タンパク質の活性を低減する、または完全に除去するもう１つの可能性である。したがって、細胞のタンパク質分解経路を使用することで、タンパク質活性を低減または除去する手段が提供できる。細胞主要分解経路の１つは、ユビキチン－プロテアソームシステムとして知られている。このシステムでは、タンパク質は、タンパク質に結合し、そのタンパク質にユビキチン分子を転移するＥ３ユビキチンリガーゼによるプロテアソーム分解のためにマークされる。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｅ１およびＥ２ユビキチンリガーゼを含む経路の一部であり、これは、ユビキチンを、Ｅ３ユビキチンリガーゼによって触媒されるタンパク質への転移にとって利用可能にする。所望のタンパク質のためにこの分解経路を利用するために、ＰＲＯＴＡＣが開発された。ＰＲＯＴＡＣは、Ｅ３ユビキチンリガーゼを所望のタンパク質と近接させることができ、その結果、ユビキチン化され、分解のためにマークされる。ＰＲＯＴＡＣは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する構造モチーフと、分解することが望まれるタンパク質に結合する別のモチーフを含むヘテロ二機能性分子である。これらの基は通常、リンカーを用いて接続される。
２．１ 不必要なタンパク質の分解 － ＰＲＯＴＡＣ
細胞維持および正常な機能には、細胞性タンパク質の制御された分解が必要である。例えば、調節タンパク質の分解は、ＤＮＡ複製、染色体分離などといった細胞周期中の事象を引き起こす。したがって、タンパク質のこのような分解は、細胞の増殖、分化および死滅に影響を及ぼす。タンパク質の阻害剤は、細胞においてタンパク質活性を遮断または低減することができるが、タンパク質分解は、標的タンパク質の活性を低減する、または完全に除去するもう１つの可能性である。したがって、細胞のタンパク質分解経路を使用することで、タンパク質活性を低減または除去する手段が提供できる。細胞主要分解経路の１つは、ユビキチン－プロテアソームシステムとして知られている。このシステムでは、タンパク質は、タンパク質に結合し、そのタンパク質にユビキチン分子を転移するＥ３ユビキチンリガーゼによるプロテアソーム分解のためにマークされる。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｅ１およびＥ２ユビキチンリガーゼを含む経路の一部であり、これは、ユビキチンを、Ｅ３ユビキチンリガーゼによって触媒されるタンパク質への転移にとって利用可能にする。所望のタンパク質のためにこの分解経路を利用するために、ＰＲＯＴＡＣが開発された。ＰＲＯＴＡＣは、Ｅ３ユビキチンリガーゼを所望のタンパク質と近接させることができ、その結果、ユビキチン化され、分解のためにマークされる。ＰＲＯＴＡＣは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する構造モチーフと、分解することが望まれるタンパク質に結合する別のモチーフを含むヘテロ二機能性分子である。これらの基は通常、リンカーを用いて接続される。
【0003】
約６００のＥ３リガーゼの小さい割合のみ、すなわちＭＤＭ２、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）、ＨＥＣＴおよびＲＢＲファミリーメンバー、ＲＮＦ４、ＤＣＡＦ１６、ＥＡＰ１－Ｎｒｆ２、フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）およびセレブロン（ＣＲＢＮ）が成功裏に標的化タンパク質分解に適用されており、最後の２つが最大の役割を果たしている。ＶＨＬは、ヒドロキシル化ＨＩＦ－１αに堅固に結合する、十分に確立されたＥ３リガーゼ基質受容体である。ＨＩＦ－１αのヒドロキシルプロリル結合部位の周囲のペプチド構造に基づいて、より薬物様の小分子リガンドが誘導され、キメラタンパク質分解剤を作出するために成功裏に適用されてきた（Shanique, A. and Crews, C., J. Biol. Chem 296 (2021) 100647）。
【0004】
広く適用されたリガンドとして、ＶＨ０３２（図１Ａ）があり、これは、強い親和性でＶＨＬに結合するＶＨＬリガンドである（Galdeano, C. et al. J. Med. Chem. 57 (2014) 8657-8663）。ＶＨ０３２は特にアセチル基の置換を許容するので（Ciulli, A and Ishida, T. SLAS 7Discovery 26 (2021) 484-502）、ＶＨ２９８のようなさらなるＶＨＬリガンドの開発の道を開いた（Soares, P. et al. J. Med. Chem. 61 (2018) 599-618）。
【0005】
ＣＲＢＮリガンドとしてのサリドマイドの作用様式が解明されると、ＣＲＢＮは、標的化タンパク質分解における適用に利用できるようになった。ＣＲＢＮの会合によって、種々の標的タンパク質がすでに分解されている（Shanique, A. and Crews, C., J. Biol. Chem. 296 (2021) 100647）。
【0006】
キメラ分解剤を使用する前記のＥ３リガーゼの会合によって、標的化タンパク質分解はすでに大量のタンパク質について達成されている。例として、ＣＲＢＮ、ＶＨＬ、Ｔａｕ、ＤＨＯＤＨ、ＦＫＢＰ１２、ＡＲ、ＥＲα、ＲＡＲ、ＣＲＡＢＰ－ＩＩ、ＡＬＫ、ＣＫ２、ＣＤＫ８およびＣＤＫ９、ＢＴＫ、ＰＩ３Ｋ、ＴＢＫ１、ＦＬＴ３、ＢＴＫ、ＲＴＫ、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびｃＭＥＴ、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＲＩＰＫ２、ＢＣＬ６、ＰＣＡＦ／ＧＣＮ５、ＢＲＤ４およびＨＤＡＣ６、ＴＲＩＭ２４、ＳＩＲＴ２、ＢＲＤ９が挙げられる（Scheepstra, M., Comput. Struct. Biotec. 17 (2019) 160-176；米国特許出願公開第２０１８／０１２５８２１号明細書；同２０１５／０２９１５６２号明細書；同２０１７／００６５７１９号明細書）。
【0007】
合成する場合、ヘテロ二機能性分解剤の組み立てには多数の戦略がある。一例では（米国特許出願公開第２０１７／００６５７１９号明細書）、分解剤は主に、活性化されたカルボキシル官能基のアミドとの縮合反応によって合成された。したがって、ＶＨＬリガンドＶＨ０３２およびその誘導体を、リンカー構造を含有する活性化されたカルボン酸と反応させた。リンカー構造は、末端アミンを保持しており、これを脱保護後、タンパク質結合剤の活性化されたカルボン酸官能基と反応させた。しかし、合成戦略は、改変されなければならないリガンドの化学的性質に高度に依存している。別の例では、７－ヒドロキシ－サリドマイドのヒドロキシル基は、プロパルギルブロミドまたはプロパルギルトシラートを使用するアルキル化反応を使用して改変された。得られた化合物は、クリックケミストリーハンドルを保持しており、その後これを使用し、銅（Ｉ）によって触媒されたアジドアルキン環化反応によって完全分解剤を得た（Wurz, R. P. et al. J. Med. Chem. 61 (2018) 453-461）。
【0008】
ＡＲＶ－１１０を分解するアンドロゲン受容体およびＡＲＶ－４７１を分解するエストロゲン受容体（Ａｒｖｉｎａｓ， Ｉｎｃ．）は、最近第ＩＩ相に到達した臨床開発における２つの最も進歩したＰＲＯＴＡＣである。しかし、いくつかのヘテロ二機能性分解剤が、さまざまな標的について第Ｉ相臨床開発にすでに達している、例えば、ＢＣＬ－ＸＬのＰＲＯＴＡＣであるＤＴ２２１６分解剤（Ｄｉａｌｅｃｔｉｃ， Ｉｎｃ．）およびＩＲＡＫ４分解剤ＫＴ４７４（Ｋｙｍｅｒａ／Ｓａｎｏｆｉ Ｓ．Ａ．）。
【0009】
数多くの報告されたＰＲＯＴＡＣは、高度に効率的な分解剤であるが、それらは、広い発現プロファイルを有するＥ３リガーゼを利用するので全般的に非組織特異的である。組織特異的分解は、広域性スペクトルＰＲＯＴＡＣの、薬物または化学ツールとしてのその可能性を増大しながら、治療ウィンドウの最適化を可能にし、副作用を最小にする可能性がある。しかし、組織分布が制限されたＥ３リガーゼを利用するＰＲＯＴＡＣは今までのところ報告されておらず、新規Ｅ３リガーゼリガンドの開発は、依然として重大な課題である（Maneiro, M. et al. ACS Chemical Biology 5 (2020) 1306-1312）。ＰＲＯＴＡＣ開発におけるもう１つの課題は、マウスにおいて数時間の範囲のその短い循環半減期である（Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25； Burslem, G. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 140 (2018) 16428-16432）。
【0010】
さらに、ＰＲＯＴＡＣの有効性は、その低い透過性によって妨げられることが多く（Klein, V. G. et al., ACS Med. Chem. Lett. 11 (2020) 1732-1738）、これによって、細胞に入り、タンパク質分解を誘導する能力が制限される。
【0011】
したがって、分解されるべきタンパク質標的を含有する細胞へのＰＲＯＴＡＣの増強された、標的化された送達が当技術分野で現在必要である。
【0012】
この必要性に対処するために、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と同様の共有結合性の抗体－ＰＲＯＴＡＣコンジュゲートを使用することによる特定の細胞へのＰＲＯＴＡＣの送達を増強する試みが行われてきた。このような構築物は、細胞標的選択的結合および抗体によって付与される増強された薬物動態を利用する。
【0013】
２．２ 標的化薬物送達 － 抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
ＡＤＣの基本的概念は、かなり単純である。必要条件は、例えば、がんと健康な細胞の間を分子ベースで区別することを可能にする抗原である。これは、例えば、腫瘍細胞において重度に上方制御されるある特定の細胞表面受容体であり得る。このような抗原に対する抗体は、細胞傷害性薬剤、つまり「ペイロード」の高度に強力な標的化媒体として働くことができる。ＡＤＣを形成するために、細胞傷害性薬剤は、ペイロードの早期放出を避けるために循環において安定であるリンカーを介して抗体に共有結合によって付着される必要がある。投与後、ＡＤＣは患者の身体中に分布し、腫瘍細胞の表面上のその抗原に結合する。次いで、抗体－抗原複合体は細胞によって内部移行され、内因性細胞内輸送経路によってリソソームへと方向付けられる。リソソームに到達した後、ＡＤＣは、分解され、それによって、その毒性カーゴを放出する。次いで、遊離毒素は、その細胞内標的に結合し、したがって、アポトーシスおよびがん細胞の死滅を誘導できる。一部の場合には、毒素は、がん細胞から離れ、隣接する、理想的には、がん性の細胞に同様に作用できる。このプロセスはバイスタンダー効果と呼ばれ、その程度は、適用されるリンカーおよび薬物に応じて変わる。他方、抗体は、抗原を発現するがん細胞にのみ結合し、毒素を送達するはずであるので、健康な細胞は、主に温存される。
ＡＤＣの基本的概念は、かなり単純である。必要条件は、例えば、がんと健康な細胞の間を分子ベースで区別することを可能にする抗原である。これは、例えば、腫瘍細胞において重度に上方制御されるある特定の細胞表面受容体であり得る。このような抗原に対する抗体は、細胞傷害性薬剤、つまり「ペイロード」の高度に強力な標的化媒体として働くことができる。ＡＤＣを形成するために、細胞傷害性薬剤は、ペイロードの早期放出を避けるために循環において安定であるリンカーを介して抗体に共有結合によって付着される必要がある。投与後、ＡＤＣは患者の身体中に分布し、腫瘍細胞の表面上のその抗原に結合する。次いで、抗体－抗原複合体は細胞によって内部移行され、内因性細胞内輸送経路によってリソソームへと方向付けられる。リソソームに到達した後、ＡＤＣは、分解され、それによって、その毒性カーゴを放出する。次いで、遊離毒素は、その細胞内標的に結合し、したがって、アポトーシスおよびがん細胞の死滅を誘導できる。一部の場合には、毒素は、がん細胞から離れ、隣接する、理想的には、がん性の細胞に同様に作用できる。このプロセスはバイスタンダー効果と呼ばれ、その程度は、適用されるリンカーおよび薬物に応じて変わる。他方、抗体は、抗原を発現するがん細胞にのみ結合し、毒素を送達するはずであるので、健康な細胞は、主に温存される。
【0014】
がんの処置のために承認されているＡＤＣとして、ＨＥＲ２標的化ＤＭ１コンジュゲートカドサイラ、アドセトリス、チュブリン阻害剤ＭＭＡＥを保持する抗ＣＤ３０ ＡＤＣおよびＣＤ３３標的化カリケアマイシンＡＤＣマイロターグが挙げられる。
【0015】
ＡＤＣの設計は、それらがバイオテクノロジーによって生成された生体分子と、化学的に合成された高度に強力な小分子分子薬物から構成されるので集学的取り組みである。両実体は、別個に生成され、その後、高度に複雑なハイブリッド分子に組み合わされる。したがって、個々の構成成分の設計から出発して、コンジュゲートの最終生成までのＡＤＣ開発の全プロセスは、重大な技術的課題を伴ってくる。「抗体－薬物コンジュゲート」という用語によれば、ＡＤＣの主構成成分は、薬物および抗体である。しかしこれらの実体をカップリングするには、ｍＡｂを薬物と接続するリンカーが必要である。ｍＡｂとペイロードの両方を考慮した、このリンカーの注意深い選択が、最終ＡＤＣの有効性および安全性にとって重大である。血流中では、リンカーは、そうでなければ全身のオフターゲット毒性を引き起こす可能性がある早期ペイロード放出を防ぐためにできる限り安定であるべきである。しかし、ひとたびＡＤＣが標的細胞に到達すると、ペイロードは、付着しているリンカーによって妨げられることなく活性でなくてはならない。さらに、リンカーの長さおよび化学的性質が、ＡＤＣの薬物動態学および動力学に対して強い影響を有する場合がある。ＡＤＣに利用されるリンカーは、非切断可能なものおよび切断可能なものに主に分類される。非切断可能なリンカーは、循環中および細胞中の両方で安定であるが、切断可能なリンカーは、標的細胞内の特定の細胞内機序によって分解されるように設計されている。上記から、所与のＡＤＣにとって適切なリンカーを操作することは、それ自体が課題であるということが明確になる。
【0016】
ＡＤＣの３つの部分、つまり抗体、リンカーおよび細胞傷害性ペイロードすべてが、最終コンジュゲートの重要な特性を決定するが、同様に重要なパラメータは、これらの構成成分が組み立てられる方法である。リンカーおよびペイロードは、ｍＡｂに直接コンジュゲートされる、組み合わされたリンカー－ペイロード構造として、またはＡＤＣ作製の際に連続的に組み立てられる個々の構成成分として化学合成によって生成される。両場合において、小分子は、その好都合な特性を損なうことなくｍＡｂにコンジュゲートされる必要があり、これは大きな技術的課題である。ＡＤＣ作製の際に制御される必要がある主要なパラメータは、薬物抗体比（ＤＡＲ）と呼ばれる、各抗体にコンジュゲートされるリンカー－薬物の数および構造が付着される抗体表面の位置（コンジュゲーション部位）である。両パラメータは、その安定性および薬物動態挙動、および最終的にその毒性および有効性プロファイルも含むＡＤＣのいくつかの特性に決定的に影響を及ぼし得る。他方、ＡＤＣに使用される弾頭は、大部分は疎水性であり、ＤＡＲが増大することは、全体的な疎水性を大幅に変更し、最終コンジュゲートのタンパク質安定性を著しく乱す場合がある。他方、十分に活性なＡＤＣに到達するには、その効力に応じてある特定の量の薬物が必要である。しかし、ＤＡＲだけでなくコンジュゲーション部位および化学も、これらのパラメータに重大な影響を及ぼす。例えば、いくつかの研究が、ある特定の部位は困難なペイロードに対して優れた許容性を示し、抗体表面で好都合な微小環境および立体遮蔽を提供することによって他のものよりもより安定なコンジュゲートをもたらすということを示している。したがって、個々の構成成分であるリンカー、薬物およびｍＡｂの好都合な組合せならびに適したＤＡＲ、コンジュゲーション戦略およびコンジュゲーション部位を見出すことが、効率的な、安全な治療薬の開発の鍵である（Dickgiesser, S. et al., Introduction to Antibody Engineering, Springer (2021) 189-214）。
【0017】
２．３ ペイロードとしてＰＲＯＴＡＣを有するＡＤＣ
ＡＤＣの特別な形状として、薬物がタンパク質分解剤によって表される分解剤－ＡＤＣがある。これでは、リンカーは、抗体へのコンジュゲーションを容易にするために分解剤に付着される必要がある。正しいリンカーを選択することに加え、分解剤上の適した付着部位（弾頭、デグロンまたはリンカー部分中のいずれか）を同定することも重大である。いくつかの刊行物が、この概念の実現可能性を証明している。
ＡＤＣの特別な形状として、薬物がタンパク質分解剤によって表される分解剤－ＡＤＣがある。これでは、リンカーは、抗体へのコンジュゲーションを容易にするために分解剤に付着される必要がある。正しいリンカーを選択することに加え、分解剤上の適した付着部位（弾頭、デグロンまたはリンカー部分中のいずれか）を同定することも重大である。いくつかの刊行物が、この概念の実現可能性を証明している。
【0018】
一例として、操作されたシステインへのコンジュゲーションを介してＨＥＲ２標的化抗体に共有結合によって付着されるエストロゲン受容体α（ＥＲα）分解剤がある。したがって、分解剤は、ＥＲα標的化部分上またはＸＩＡＰ結合剤上のいずれかでプロテアーゼ切断可能なリンカーを用いて化学的に改変されなければならなかった。リンカーが弾頭で付着された分解剤－ＡＤＣの場合には、ＥＲα分解は、ＨＥＲ２過剰発現性ＭＣＦ７細胞において達成されたが、親のＭＣＦ７細胞では有意に少ない分解が観察された。さらなるリンカー選択肢が試験された。ＶＨＬリガンドのヒドロキシプロリル残基のヒドロキシル基は、炭酸エステルリンカーを用いて改変され、これはＨＥＲ２抗体へ活性化されたジスルフィドを介してコンジュゲートされた。さらに、二リン酸塩を含有するリンカーが、ＶＨＬリガンドのヒドロキシプロリル残基に付着された。両場合において、コンジュゲートは、選択性を欠いていた（Dragovich, P. S. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 30 (2020) 126907）。
【0019】
分解剤－ＡＤＣの細胞内ＰＲＯＴＡＣ標的としてのＥＲαに加え、ＢＲＤ４も、標的タンパク質として集中的に研究された。一例は、ＢＲＤ４分解剤のＨＥＲ２陽性細胞への選択的送達を示し、ＨＥＲ２標的化抗体を介したＢＲＤ４分解につながった。分解剤は、ＶＨＬリガンドのヒドロキシプロリル残基で、システインコンジュゲーションと、酸切断可能なエステル結合を使用するクリックケミストリーの組合せを介してコンジュゲートされた（Maneiro, M. et al. ACS Chemical Biology 5 (2020) 1306-1312）。別の例では、ＢＲＤ４分解剤ＧＮＥ９８７は、ＣＬＬ１標的化抗体の操作されたシステインにコンジュゲートされ、６のＤＡＲに到達した。したがって、ＰＲＯＴＡＣは、コンジュゲーションのために活性化されたジスルフィドを含む酸切断可能な炭酸エステルリンカーで改変された。コンジュゲートは、耐容性良好でありながら、マウス異種移植モデルにおいてＰＲＯＴＡＣの薬物動態プロファイルおよびｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有意に改善した（Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25）。
【0020】
ＢＲＤ４分解剤コンジュゲートは、２つのさらなる刊行物においてこのグループによって徹底的に調査されている（Dragovich, P. S. et al., J. Med. Chem. 64 (2021) 2534-2575；Dragovich, P. S. et al., J. Med. Chem. 64 (2021) 2576-2607）。ＳＴＥＡＰ１およびＨＥＲ２抗体に基づいてＢＲＤ４分解剤の複数のコンジュゲートが調製されている。研究の焦点は、ＡＤＣと分解剤を接続する理想的なリンカー、ならびに標的タンパク質リガンド、Ｅ３リガーゼリガンドまたは標的タンパク質リガンドとＥ３リガーゼリガンドの間のリンカーのいずれかにおけるこのリンカーの理想的な結合点の調査であった。したがって、リンカー付着のための適した化学ハンドルを組み込んでいるＪＱ１誘導体を含むいくつかの標的タンパク質リガンドが評価された。標的タンパク質とＥ３リガーゼリガンドの間のリンカーの場合には、ＰＥＧおよび脂肪鎖ならびにリンカー付着のための化学ハンドルを組み込んだバージョンを含む複数のバリアントが試験された。さらに、リンカー付着を可能にするように化学的に改変されたＶＨＬリガンドの誘導体が評価された。コンジュゲートは、受容体選択的タンパク質分解を誘導できたが、２、３種のみが、選択的細胞傷害性を呈した。それらの刊行物は、キメラ分解剤の抗体へのコンジュゲーションの複雑性を強調する。記載された分解剤コンジュゲートについて、２つの特許出願が出願された（国際公開第２０２０／０８６８５８号パンフレット、国際公開第２０１７／２０１４４９号パンフレット）。
【0021】
それに加えて、ＢＲＤ４分解剤コンジュゲートも、ＨＥＲ２に標的化された特許文献において見出され（国際公開第２０１９／１４０００３号パンフレット）、ＣＤ３３標的化抗体のペイロードとしてＢＲＤ４およびＰＬＫ１の二重分解剤が調べられた（国際公開第２０２０／０７３９３０号パンフレット）。さらに、ＴＧＦβＲ２分解剤は、標的化送達のためにＨＥＲ２およびＴＲＯＰ２抗体にコンジュゲートされている（国際公開第２０１８／２２７０１８号パンフレット、国際公開第２０１８／２２７０２３号パンフレット）。
【0022】
２．４ 標的細胞に薬物を送達する非共有結合的アプローチ
抗体に結合するか、または抗体の結合を受け得るリガンドまたはハプテンに、薬物が常に化学的に接続される必要がある非共有結合的薬物送達のために複数のアプローチが記載されている。
抗体に結合するか、または抗体の結合を受け得るリガンドまたはハプテンに、薬物が常に化学的に接続される必要がある非共有結合的薬物送達のために複数のアプローチが記載されている。
【0023】
例えば、ゲムシタビンは、抗体上のいくつかの部位に結合する親和性リガンドである４－メルカプトエチルピリジンを用いて化学的に改変された。抗体を親和性リガンドで改変されたゲムシタビンと混合することによって、標的陽性がん細胞に対する選択毒性を誘導でき、未改変抗体と同等の薬物動態プロファイルを有するＡＤＣが組み立てられた。マウス異種移植モデルにおいてゲムシタビンＡＤＣの腫瘍退縮が観察された（Gupta, N. et al., Nat. Biomed. Eng. 3 (2019) 917-929）。
【0024】
さらに、細胞への薬物送達を容易にするために、いくつかのアプローチが、ハプテンであるジゴキシゲニンを用いる、抗がん薬物ドキソルビシンまたはフルオロフォアＣｙ５、ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰのようなタンパク質およびサポリンなどの小分子の改変を使用した（Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (2011) 8194-8199；Schneider, B. et al., Mol. Ther. - Nucleic Acids 1 (2012) e46；Mayer, K. et al., Int. J. Mol. Sci. 16, (2015) 27497-27507）。
【0025】
さらに、細胞傷害性薬物であるデュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｙｍｃｉｎ）ＤＭは、ＥＧＦＲへの、および同時にコチニンへの二重特異性抗体結合を使用してＥＧＦＲ陽性細胞に送達される可能性がある。デュオカルマイシンＤＭを標的細胞に送達するために、Ｃ末端およびＮ末端にコチニンを保持するペプチドが合成され、切断可能なバリン－シトルリンリンカーを介してペプチドに４つのデュオカルマイシンＤＭ分子が付着された。構築物は、マウスＥＧＦＲ発現Ａ５４９異種移植モデルにおいて試験され、アイソタイプ対照構築物の抗腫瘍効果を上回った（Jin, J. et al., Exp. Mol. Med. 50 (2018), 67）。同様の構築物を使用して、デュオカルマイシンをｍＰＤＧＦＲβ陽性細胞に送達した（Kim, S. et al., Methods 154 (2019) 125-135）。
【0026】
種々の他の刊行物は、ハプテン改変された化合物および抗ハプテン抗体を使用する複合体形成の概念について詳述している（Yu, B. et al., Angew. Chemie - Int. Ed. 58 (2019) 2005-2010；Kim, H. et al., Mol. Pharm. 16 (2019) 165-172；Kilian, T. et al., Nucleic Acids Res., 47 (2019) e55）。
【0027】
同等のアプローチは、チューブリシンＡの、プロテインＡまたはＧのようなＦｃ結合性タンパク質への共有結合的コンジュゲーションを使用して、標的化薬物送達のための抗体との複合体を組み立てる（Maso, K. et al., Eur J Pharm Biopharm 142 (2019) 49-60）。
【0028】
ハプテン化化合物を抗ハプテン抗体または抗体に結合する親和性リガンド／タンパク質と一緒に使用する非共有結合的薬物送達の多数の例があるが、未改変薬物を使用する非共有結合的薬物送達の例はまれである。
【0029】
すべてのこれらの試みにかかわらず、広く適用することができる、標的でのペイロードの有効な放出を有する、ＰＲＯＴＡＣの十分に定義された効率的な特異的送達プラットフォームが依然として必要である。
【発明の概要】
【0030】
３ 発明の概要
本発明は、標的タンパク質分解キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）のＶＨＬリガンド分解部分（デグロン）に、および二重特異性抗体の場合には、標的タンパク質に結合可能な単一特異性または二重特異性抗体またはその抗体断片または融合タンパク質に関する。本発明はまた、このような抗体またはその抗体断片または融合タンパク質と、ＰＲＯＴＡＣの複合体、それらの生成方法、ならびにその各々の医学的および非医学的使用に関する。このようなＰＲＯＴＡＣ－抗体複合体は、本明細書において以下、「ＰＡＸ」と呼ばれる。
本発明は、標的タンパク質分解キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）のＶＨＬリガンド分解部分（デグロン）に、および二重特異性抗体の場合には、標的タンパク質に結合可能な単一特異性または二重特異性抗体またはその抗体断片または融合タンパク質に関する。本発明はまた、このような抗体またはその抗体断片または融合タンパク質と、ＰＲＯＴＡＣの複合体、それらの生成方法、ならびにその各々の医学的および非医学的使用に関する。このようなＰＲＯＴＡＣ－抗体複合体は、本明細書において以下、「ＰＡＸ」と呼ばれる。
【0031】
一実施形態では、標的タンパク質は、ＰＲＯＴＡＣが送達される標的細胞上の細胞表面抗原である。送達されると、ＰＲＯＴＡＣが標的細胞のサイトゾル中に放出され、ここで、分解標的タンパク質に結合し、それによって細胞のプロテアソームを介して分解を開始する。
【0032】
共有結合によって連結された抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と比較したＰＡＸの利点は、ＰＲＯＴＡＣを抗体に連結するために特定の製造ステップが必要ではないということである。別の利点は、ＰＡＸがそのＰＲＯＴＡＣペイロードを放出すると、ＰＲＯＴＡＣ結合、および例えば、以前にそれに向けて送達された標的細胞から離れたＰＲＯＴＡＣ分子の標的化送達の新規サイクルのための準備が整っていることである。
【0033】
さらに別の利点は、ＰＡＸにおけるＰＲＯＴＡＣ複合体形成が、患者の身体におけるＰＲＯＴＡＣの半減期を延長すると予測される改善された薬物動態プロファイルである。ＰＲＯＴＡＣの抗ＰＲＯＴＡＣ抗体との複合体形成のために、複合体安定性がＰＲＯＴＡＣのクリアランスを決定する。ＰＲＯＴＡＣが抗体によって複合体形成される限り、抗体の高分子量のために腎性に除去され得ない。
【0034】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ａ）２つの全長抗体重鎖および２つの全長抗体軽鎖からなり、それによって各鎖が１つのみの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体、ｂ）各々が抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメインおよび前記抗体重鎖可変ドメインと前記抗体軽鎖可変ドメインの間の単鎖リンカーからなる２つの単一特異性一価単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、任意選択で、ｃ）前記ｓｃＦｖに融合された、ｓｃＦｖ（ｂ）の２つまたはそれより多いさらなるコピー、ならびに任意選択で、ｄ）ａ）、ｂ）および／またはｃ）を接続するペプチドリンカーを含む。
【0035】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ａ）２つの全長抗体重鎖および２つの全長抗体軽鎖からなり、それによって、各鎖が、１つのみの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体、ｂ）各々１つの抗体可変ドメインからなる２つの重鎖単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体、任意選択で、ｃ）前記ＶＨＨに融合されたＶＨＨ（ｂ）の２つまたはそれより多いさらなるコピー、ならびに任意選択で、ｄ）ａ）、ｂ）および／またはｃ）を接続するペプチドリンカーを含む。
【0036】
当業者は、ペプチドリンカーの存在またはその長さは、本発明の性能に影響を及ぼさないことを理解する。しかし、一実施形態では、ペプチドリンカーは１～５０個のアミノ酸、好ましくは、１～３５個のアミノ酸、より好ましくは、３～２０個のアミノ酸、さらにより好ましくは、１２～１８個のアミノ酸、例えば、１５個のアミノ酸からなる。
【0037】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、抗体の重鎖および／または軽鎖のＣ末端をｓｃＦｖまたはＶＨＨのＮ末端と接続する。
【0038】
一実施形態では、ｓｃＦｖまたはＶＨＨは、抗体の重鎖のＣ末端に融合される。
【0039】
一実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖまたはＶＨＨのさらなるコピーを含まない。
【0040】
一実施形態では、単一特異性二価抗体の可変領域は、標的タンパク質に結合し、ｓｃＦｖまたはＶＨＨは、ＰＲＯＴＡＣに結合する。
【0041】
代替実施形態では、単一特異性二価抗体の可変領域は、ＰＲＯＴＡＣに結合し、ｓｃＦｖまたはＶＨＨは、標的タンパク質に結合する。
【0042】
一実施形態では、ＶＨＬリガンドは、ＶＨ０３２またはその誘導体である。
【0043】
一実施形態では、二重特異性抗体は、標的タンパク質が、細胞表面抗原、例えば、腫瘍抗原であることを特徴とする。好ましい実施形態では、標的タンパク質は、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＭＵＣ１、ＲＯＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＲＯＰ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＴＲＯＰ２、ｃＭＥＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＮａＰｉ２ｂ、ＰＳＭＡ、インテグリンアルファ－Ｖ、ＦＲα、ＭＵＣ１６、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣａｎＡｇ－ＭＵＣ１グリコフォーム、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ３またはＴＮＣである。より好ましい実施形態では、標的タンパク質はＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＬＬ１またはＥＧＦＲである。
【0044】
しかし、当業者は、本発明は、患者の身体中に存在する任意の細胞と比較して、標的化ＰＲＯＴＡＣ送達のための細胞のサブセットを確立する任意の標的タンパク質と共に働くことを理解する。
【0045】
本発明の別の態様は、ある特定の標的タンパク質の分解が疑われる疾患を処置する方法であって、ＰＡＸがそれを必要とする患者に投与される方法である。
【0046】
本明細書で開示されるＰＡＸを、種々の疾患または障害を処置するために使用できるということが企図される。例示的過剰増殖性障害として、良性または悪性固形腫瘍および血液障害、例えば、白血病およびリンパ系腫瘍が挙げられる。他のものとして、ニューロンの、グリアの、アストロサイトの(astrocytal)、視床下部の、腺性、マクロファージの(macrophagal)、上皮性、間質性、胞胚腔の(blastocoelic)、炎症性、血管新生性および自己免疫性を含む免疫学的障害が挙げられる。
【0047】
本発明の別の態様は、本発明に従うＰＡＸを含む医薬組成物である。さらに別の態様では、前記医薬組成物は、標的化されたがん療法において使用される。
【0048】
さらに他の態様では、本発明の抗体は、ＰＲＯＴＡＣを検出および／または定量化するために、または目的のＰＲＯＴＡＣを不純物／製造プロセスの副生成物から精製するために働く。
４ 図の表
４ 図の表
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】図１は、ＶＨＬリガンドＶＨ０３２および誘導体の化学構造を示す図である。（Ａ）ＶＨ０３２の構造。（Ｂ）ＶＨ０３２をベースとするＶＨＬ－リガンドのＭａｒｋｕｓｈ構造。（Ｃ）ＭＺ１、ＡＴ１およびＡＣＢｌ１弾頭について例示的に示される異なる弾頭にＶＨ０３２ベースのデグロンを接続するリンカーの異なる出口ベクター（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）を示す表現。ＭＩＣ２抗体は、出口ベクターＲ１およびＲ２を許容し、ＰＲＯＴＡＣであるＭＺ１およびＡＴ１の結合をもたらす。
【図2-1】図２は、細胞表面抗原およびＰＲＯＴＡＣに対する二重特異性融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。太字：抗ＰＲＯＴＡＣ抗体ＭＩＣ２の配列、ＣＤＲ配列に下線が引かれている；イタリック体：リンカー配列；下線が引かれているもの：抗体断片配列（抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ配列または抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ。
【図2-2】図２は、細胞表面抗原およびＰＲＯＴＡＣに対する二重特異性融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。太字：抗ＰＲＯＴＡＣ抗体ＭＩＣ２の配列、ＣＤＲ配列に下線が引かれている；イタリック体：リンカー配列；下線が引かれているもの：抗体断片配列（抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ配列または抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ。
【図7】図７は、親和性決定のアッセイ原理を示す図である。Ａ）ＭＩＣ２は、ＳＰＲチップ上に固定化されている。分析物は、抗体を通過して流れ、捕捉される。ＰＲＯＴＡＣが捕捉された後、緩衝液が交換され、ＰＲＯＴＡＣは、再度解離することができる。Ｂ）ＰＲＯＴＡＣの抗体との会合は、シグナルの増大として観察され、一方、解離はシグナルの減少につながる。これは、ＭＩＣ２の、ＰＲＯＴＡＣであるＭＺ１への結合について例示的に示されている。
【図9】図９は、親抗体ＭＩＣ２に対して比較した二重特異性抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２、ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２の、いくつかのＰＲＯＴＡＣへの結合評価を示す図である。親和性パラメータは、結合速度および解離速度ならびに親和性によって分類された。
【図10】図１０は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって分析されたローディング依存性複合体形成を示す図である。ピーク分布は、複合体形成されていない抗体（０％ローディング）（左）のピークから、半分ローディングされた（５０％ローディング；抗体：ＰＲＯＴＡＣモル比＝１：１）抗体、完全ローディングされた（１００％ローディング；抗体：ＰＲＯＴＡＣモル比＝１：２）抗体のピークへと理論上のローディングが増大するにつれて移動する。
【図15】図１５は、ＢＲＤ４レベルの例示的蛍光画像を示す図である。高い緑色蛍光は、高いＢＲＤ４存在量と相関する。未処置細胞は、最も強い蛍光を有していたが、蛍光は、４ｎＭのＧＮＥ９８７ならびにＥＧＦＲ標的化Ｃ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７およびＧＮＥ９８７がローディングされたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２を用いて処置された細胞については低減した。蛍光は、４ｎＭの、ＧＮＥ９８７がローディングされた非結合性ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２を用いる処置の場合にはＥＧＦＲ標的化複合体と比較して増大した。緑色蛍光は、灰色の陰影で表されている。
【図16】図１６は、ＢＲＤ４レベル定量化を示す図である。Ａ）ＧＮＥ９８７、Ｃ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７およびａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７は、調査した濃度範囲全体にわたってＢＲＤ４レベルに対して同等の効果を有していたが、ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７は、ＢＲＤ４をより小さい程度に分解した。Ｂ）ＢＲＤ４分解は、４ｎＭの濃度のすべての分析物で誘導された。
【図17】図１７は、ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７および対照の用量反応曲線プロットを示す図である。試験化合物の段階希釈をＭＤＡＭＢ４６８細胞に添加し、インキュベーションの３日後、個々の化合物各々の細胞生存率に対する影響を評価した。５０％（１：１）ローディングのＥＧＦＲ標的化ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７ならびにベンチマークＣ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７およびＧＮＥ９８７は、同等の効力を有していたが、非結合性対照ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７および５０％（１：１）ローディングのａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７は、低減した効力を有していた。
【図18】図１８は、ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７および対照の用量反応曲線プロットを示す図である。ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７は、最高の効力を有し、２５％ローディングのａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７がそれに続く。非結合性対照ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７および５０％（１：１）ローディングのａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７は、細胞生存率に対して低減した効果を有していた。
【図22】図２２は、ＧＮＥ９８７Ｐ単独と比較して、複合体形成されたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７Ｐは、０．１～１０ｎＭの範囲の濃度でＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞に対する細胞傷害性効果の増大を示し、標的化送達を示すことを示す図である。非標的化ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７Ｐとの複合体形成は、ＧＮＥ９８７Ｐの細胞傷害性を完全に低減する。
【図25】図２５は、マウス血漿における９６時間にわたる、５０％ローディングの複合体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７の安定性評価を示す図である。ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体は、ビーズ上に捕捉され、上清が未結合ＧＮＥ９８７のＬＣ－ＭＳ分析のために収集された。その後、ビーズに結合したａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体が、ビーズから溶出され、ＬＣ－ＭＳを使用するＧＮＥ９８７定量化に供された。
【図29】図２９は、ＶＨＨ ＭＩＣ５を欠く親抗体と比較した、それぞれ、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５またはＥＧＦＲｘＭＩＣ５のＭＶ４１１およびＭＤＡＭＢ４６８への細胞結合のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図32】図３２は、６時間にわたる、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７の、ＣＤ３３陽性細胞ＭＯＬＭ１３、ＭＶ４１１およびＵ９３７ならびにＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞への内部移行のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図33】図３３は、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１細胞でのＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（１：１）およびＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（１：１）のウエスタンブロットを示す図である。プロットの上の濃度は、ｍｏｌ／Ｌで示されている。マーカーのサイズ（右）は、ｋＤａで示されている。
【図35】図３５は、ＣＤ３３受容体発現レベルに依存する細胞生存率データの比較を示す図である。５０％ローディングのＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７は、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＭＯＬＭ１３細胞に対して細胞傷害性を誘導したが、ＣＤ３３を欠くＲＡＭＯＳ細胞に対してはわずかな効果しか有さなかった。
【図36】図３６は、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１細胞に対するＧＮＥ９８７の細胞傷害性と比較した、２５、５０および７５％の、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７をローディングしたＣＤ３３ｘＭＩＣ５の細胞傷害性を示す図である。
【図38】図３８は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７Ｐ単独と比較した、抗体あたり、ＰＲＯＴＡＣであるＦＬＴ３ｄ１がローディングされたＣＤ３３ｘＭＩＣ５抗体の細胞生存率データを示す図である。細胞生存率は処置の６日後に分析した。
【図39】図３９は、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞に対する、事前に複合体形成された、または事前に複合体形成されていない７５％ローディング（１：１．５）のＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７の細胞生存率アッセイを示す図である。事前に複合体形成されていない試料の場合には、抗体（ＣＤ３３ｘＭＩＣ５）およびＰＲＯＴＡＣ（ＧＮＥ９８７）は、処置として細胞懸濁液に別個に添加した。ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７は、参照のために細胞に対して試験した。
【図40】図４０は、ＣＬＬ１陽性ＭＯＬＭ１３およびＵ９３７に対する、ならびにＣＬＬ１陰性Ｋ５６２細胞に対する７５％ローディング（１：１．５）のＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰおよびＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐの細胞生存率アッセイを示す図である。ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７単独は、参照のために細胞に対して試験した。
【図41】図４１は、ＣＬＬ１陽性ＭＶ４１１およびＵ９３７細胞に対する、ならびにＣＬＬ１陰性ＲＡＭＯＳおよびＫ５６２細胞に対する７５％ローディング（１：１．５）のＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰおよびＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１の細胞生存率アッセイを示す図である。ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１を、参照のために細胞に対して試験した。
【図42】図４２は、Ｂ７Ｈ３陽性ＭＶ４１１およびＵ９３７細胞に対する、ならびにＢ７Ｈ３陰性ＲＡＭＯＳ細胞に対する７５％ローディング（１：１．５）のＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰまたはＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１の細胞生存率アッセイを示す図である。ＰＲＯＴＡＣ単独（ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１）を、参照のために細胞に対して試験した。
【図43】図４３は、Ｂ７Ｈ３陽性ＭＶ４１１およびＵ９３７細胞に対する、ならびにＢ７Ｈ３陰性ＲＡＭＯＳ細胞に対する７５％ローディング（１：１．５）のＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７およびＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７の細胞生存率アッセイを示す図である。ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７を、参照のために細胞に対して試験した。
【図44】図４４は、ＮＡＰＩ２Ｂ陽性ＯＶＣＡＲ３およびＮＡＰＩ２Ｂ陰性ＳＫＯＶ３細胞に対する、５０％ローディング（１：１）でＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰまたはＳＩＭ１がローディングされたＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７およびＤＩＧｘＭＩＣ７の細胞生存率アッセイを示す図である。ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１を参照として細胞に対して試験した。
【図45】図４５は、ＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２およびＥＧＦＲ陽性ＭＤＡＭＢ４６８細胞に対する、５０％のＰＲＯＴＡＣがローディングされたＥＧＦＲｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７およびセツキシマブベースのＥＧＦＲ結合性ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ（ＤＡＲ＝１．６２）の細胞傷害性の比較を示す図である。
【図47】図４７は、３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの、１００％の理論上のローディングを有するＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７およびＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣ－抗体複合体のＰＫ研究を示す図である。ＧＮＥ９８７の検出された濃度が示されている。
【図48】図４８は、比較した未改変抗体ＣＤ３３ Ａｂ、抗体－ＶＨＨ融合タンパク質ＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＣＤ３３ｘＭＩＣ７ならびにＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＧＮＥ９８７がローディングされたＣＤ３３ｘＭＩＣ７のクリアランスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0050】
５ 表の表
表１：本発明の抗体の結合エピトープ。
表１：本発明の抗体の結合エピトープ。
【0051】
表２：ＭＩＣ２の１：１動態学結合モデルおよび定常状態モデルから導かれたＰＲＯＴＡＣのＭＩＣ１への結合のＫＤを使用して得られた、ＭＩＣ２およびＰＲＯＴＡＣの組合せ（構造、図８を参照されたい）の親和性パラメータＫＤ、会合速度ｋｏｎ、解離速度ｋｏｆｆに関する概要。ＮＭ＝測定されていない；ＮＢ＝結合なし。
【0052】
表３：所望のローディングを達成するための必要な最終ＰＲＯＴＡＣ濃度に関する概要。
【0053】
表４：２５および５０％のローディングでＧＮＥ９８７と複合体形成された、ＥＧＦＲ結合性ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２および非結合性対照ＭＩＣ２のＩＣ５０値。
【0054】
表５：ＭＤＡＭＢ４６８に対するＥＧＦＲ結合性ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体および対照のＩＣ５０値。効力および標準偏差は、３つの独立実験から導かれた。
【0055】
表６：ＰＢＳ ｐＨ６．８、５％のＤＭＳＯ最終における抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体の保存安定性評価。
【0056】
表７：ファージディスプレイを使用する抗体ヒット発見キャンペーンのライブラリー特徴。
【0057】
表８：ＳＰＲを使用して決定されたＶＨＨクローンのＰＲＯＴＡＣに対する親和性（ＫＤ）。ＶＨＨは、抗ＣＤ３３または抗ＣＬＬ１抗体のいずれかの重鎖へのＣ末端付加による抗体融合タンパク質として研究された。Ｎ／Ｄ － 検出されていない（完全ＰＲＯＴＡＣ構造は、図８に見出すことができる）。
【0058】
表９：ＶＨＨ抗体断片との融合のためのＩｇＧ型抗体骨格。
【0059】
表１０：ＰＡＸ標的化ＣＤ３３の命名法。
【0060】
表１１：ＥＧＦＲ陽性ＭＤＡＭＢ４６８細胞およびＭＤＡＭＢ４６８陰性ＨＥＰＧ２細胞での、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７と組み合わせた、ＣＤ３３結合性ゲムツズマブ（Ｇ）－およびＥＧＦＲ－結合性セツキシマブ（ｃ）－ベースのＶＨＨ融合タンパク質の細胞プロファイリング。ＩＣ５０値を使用して、選択性指数を算出した。
【0061】
表１２：ウエスタンブロット分析のために使用された一次抗体。
【0062】
表１３：ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１細胞およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞での、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７およびＧＮＥ９８７Ｐと組み合わせた種々のＣＤ３３ｘＭＩＣ７またはＰＲＯＴＡＣ単独の細胞プロファイリング。ＩＣ５０値は、Ｍで表されている。
【0063】
表１４：ＰＲＯＴＡＣであるＡＲＶ７７１、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＥＧＦＲ陽性細胞およびＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２細胞の細胞プロファイリング。ＩＣ５０値は、Ｍで表されている。
【0064】
表１５：ＥＧＦＲ陽性細胞およびＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２細胞での、５０％のローディングの、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１と組み合わせたＥＧＦＲｘＭＩＣ７の細胞プロファイリング。非内部移行対照として、ジゴキシゲニン結合性ＤＩＧｘＭＩＣ７融合タンパク質を利用した。ＩＣ５０値は、Ｍで表されている。
【0065】
表１６：ＥＧＦＲ陽性細胞およびＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２およびＥＧＦＲ－低ＭＣＦ７細胞での、７５％のローディングの、ＰＲＯＴＡＣであるＡＲＶ７７１、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１と組み合わせたＥＧＦＲｘＭＩＣ７の細胞プロファイリング。非内部移行対照として、ジゴキシゲニン結合性ＤＩＧｘＭＩＣ７融合タンパク質を利用した。
【0066】
表１７：ＨＥＲ２陽性細胞およびＨＥＲ２陰性ＭＤＡＭＢ４６８細胞での、７５％のローディングの、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１と組み合わせたＨＥＲ２ｘＭＩＣ７の細胞プロファイリング。
【0067】
表１８：ＴＲＯＰ２陽性細胞およびＴＲＯＰ２陰性ＳＷ６２０細胞での、７５％のローディングの、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７と組み合わせたＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７の細胞プロファイリング。
【0068】
表１９：ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７がローディングされた、およびローディングされていないＭＩＣ５およびＭＩＣ７とのＣＤ３３ベースのＶＨＨ融合物および親抗体ＣＤ３３ Ａｂの薬物動態パラメータの概要。分析物は３０ｍｇ／ｋｇで投与され、定量化総抗体（ｔＡｎｔｉｂｏｄｙ）およびＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７のＰＫパラメータが表されている。略語：ｔ１／２：半減期；Ｃｍａｘ：最大血清濃度；ＡＵＣ０－ｉｎｆ：無限時間までの曲線下面積；Ｃｌ：クリアランス；Ｖｓｓ：定常状態分布容積。ＳＤ：標準偏差。
【0069】
表２０：この研究の範囲の概要。調査された組合せは、表形式で表されている。
【0070】
６ 発明の詳細な説明
６．１ 定義
「ＰＲＯＴＡＣ」（標的タンパク質分解キメラ）は、特定の不必要なタンパク質を除去可能な、２つの活性ドメインおよびリンカーから構成されるヘテロ二機能性小分子である。ＰＲＯＴＡＣは、従来の酵素阻害剤として作用するよりも、選択的タンパク質分解を誘導することによって働く。ＰＲＯＴＡＣは、２つの共有結合によって連結されたタンパク質結合分子：１つは、会合可能であるもの（多くの場合において）、および分解に向けられた標的タンパク質に結合するもう１つのものからなる。標的タンパク質へのＥ３リガーゼの補充は、ユビキチン化およびその後のプロテアソームによる標的タンパク質の分解をもたらす。この概念は、Deshaies and coworkers in 2001 （Skamoto, K.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 8554-8559）によって最初に記載された。
６．１ 定義
「ＰＲＯＴＡＣ」（標的タンパク質分解キメラ）は、特定の不必要なタンパク質を除去可能な、２つの活性ドメインおよびリンカーから構成されるヘテロ二機能性小分子である。ＰＲＯＴＡＣは、従来の酵素阻害剤として作用するよりも、選択的タンパク質分解を誘導することによって働く。ＰＲＯＴＡＣは、２つの共有結合によって連結されたタンパク質結合分子：１つは、会合可能であるもの（多くの場合において）、および分解に向けられた標的タンパク質に結合するもう１つのものからなる。標的タンパク質へのＥ３リガーゼの補充は、ユビキチン化およびその後のプロテアソームによる標的タンパク質の分解をもたらす。この概念は、Deshaies and coworkers in 2001 （Skamoto, K.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 8554-8559）によって最初に記載された。
【0071】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ(poly-epitopic)特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体、特に、二重特異性抗体、ダイアボディーおよび単鎖分子（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボディー、例えば、新世界ラクダ類の種、例えば、ラマに由来するＶＨＨ）ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）を含む。
【0072】
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体ユニットと、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとからなり、１０の抗原結合部位を含有するが、ＩｇＡ抗体は、２～５の基本的な４鎖ユニットを含み、これは、重合し、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成できる。ＩｇＧの場合には、４鎖ユニットは一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。各ＨおよびＬ鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）と、続いて、アルファおよびガンマ重鎖アイソタイプの各々については３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにミューおよびイプシロン重鎖アイソタイプについては４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）と、続いて、もう一方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨとアラインされ、ＣＬは、重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインとアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。ＶＨおよびＶＬの対形成は、単一の抗原結合部位を一緒に形成する。種々のクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Schroeder, H., Cavacini, L., J. Allergy Clin. Immunol. 125 (2010), S41-S52を参照されたい。任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に別個の種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリンがある：それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと名付けられた重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。ガンマおよびアルファクラスは、ＣＨ配列中の相対的に微量の相違および機能に基づいてサブクラスにさらに分けられる、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【0073】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」と呼ばれる場合もある。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変部分であり（同一クラスの他の抗体に対して）、抗原結合部位を含有する。
【0074】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが抗体の間で配列において大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その抗原に対する抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインのスパン全体にわたって均一に分布しているわけではない。代わりに、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方中の超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分はベータシート配置をとり、３つのＨＶＲによって接続される４つのＦＲ領域を含み、ＨＶＲは、ベータシート構造を接続するループを形成し、一部の場合には、ベータシートの一部を形成する。各鎖中のＨＶＲは、他の鎖に由来するＨＶＲとＦＲ領域によって極めて近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性毒性における抗体の関与を示す。
【0075】
「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変であり、および／または構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの相補性決定領域を指す。一般に、抗体は、６つのＣＤＲ；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３は、６つのＣＤＲのうち最も多様性を示し、Ｈ３は特に、抗体に微細な特異性を付与する独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Xu et al., Immunity 13 (2000) 37-45; Johnson and Wu, Methods Mol. Biol. 248 (2003) 1-25 （Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003）を参照されたい。実際、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ類抗体は、軽鎖の非存在下で機能的であり、安定している。例えば、Hamers- Casterman et al., Nature 363 (1993) 446-448；Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3 (1996) 733-736を参照されたい。いくつかのＣＤＲ描写が使用されている。ＩｍＭｕｎＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）特有のＬｅｆｒａｎｃ番号付け（ＩＭＧＴ番号付け）（Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27 (2003) 55-77）では、ＦＲおよびＨＶＲを規定するために、配列保存、Ｘ線回折研究からの構造データおよび超可変ループの特性決定を考慮する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲは、配列可変性に基づいており、これも一般に使用される（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及する（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）。本明細書において使用されるＣＤＲ描写は、ＩＭＧＴ番号付けに従う。
【0076】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるようなＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【0077】
「全長抗体」、「無傷の抗体」または「全抗体」という用語は、抗体断片とは対照的にその実質的に無傷の形態の抗体を指すために互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するもの含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。一部の場合には、無傷の抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有し得る。
【0078】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部分、好ましくは、無傷の抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディー、線形抗体、単鎖抗体分子および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一抗原結合断片および残りの「Ｆｃ」断片、容易に結晶化する能力を反映する名称が生成される。Ｆａｂ断片は、全Ｌ鎖と、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処置は、異なる抗原結合活性を有し、依然として、抗原を架橋することが可能である、２つのジスルフィドによって連結されたＦａｂ断片に大まかに対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域由来の１個または複数のシステインを含む２、３の追加の残基を有することでＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が、遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【0079】
「ｓｃＦｖ」（単鎖Ｆｖ）は、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から普通発現される、共有結合によって連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖ断片は、例えば、遺伝子組換え技術を使用することによって適当なコンフォメーションで保持されるＣＤＲを含む。二価および多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合によって自発的に形成される場合も、ペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって生じる場合もある、例えば、二価ｓｃ（Ｆｖ）２。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「（ｄｓＦｖ）２」は、ペプチドリンカーによってカップリングされた２つのｄｓＦｖを表す。
【0080】
「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」という用語は、２つの異なる抗原結合部位を含む抗体を表す。したがって、ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原と同時に結合できる。例えば、欧州特許出願公開第２０５０７６４号明細書に記載されるような、結合特性およびエフェクター機能の所望のセットを有する抗体または抗体誘導体を設計する、改変するおよび生成する頻度が増大するにつれ、遺伝子工学が使用されてきた。
【0081】
「多特異性抗体」という用語は、２つまたはそれより多い異なる抗原結合部位を含む抗体を表す。
【0082】
「ハイブリドーマ」という用語は、抗原特異性を有する所望のモノクローナル抗体を生成する、非ヒト哺乳動物を抗原を用いて免疫化することによって調製されたＢ細胞を、マウスに由来する骨髄腫細胞などとの細胞融合に供することによって得られる細胞を表す。
【0083】
「ダイアボディー」という用語は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間対形成が達成され、それによって、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすようにＶＨとＶＬドメインの間に短いリンカー（約５～１０の）残基）を用いてｓｃＦｖ断片（前段落を参照されたい）を構築することによって調製された小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディーは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが、異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「乗換え」ｓｃＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第０４０４０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448により詳細に記載されている。
【0084】
本明細書において、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、または相同であり、一方、鎖（複数可）の残部が、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片を具体的に含む。
【0085】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ（本明細書において以下で定義される）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のＨＶＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、またはドナー抗体にも見出されない残基を含む場合がある。これらの改変は、抗体性能、例えば、結合親和性をさらに精密にするために行われる場合がある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、これでは、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、抗体性能、例えば、結合親和性、異性化、免疫原性等を改善する１つまたは複数の個々のＦＲ残基置換を含む場合がある。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換の数は、通常、Ｈ鎖において６以下であり、およびＬ鎖において３以下である。ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、通常、ヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321 (1986) 522-525；Riechmann et al., Nature 332 (1988) 323-329；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596を参照されたい。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1 (1998) 105-115；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 (1995) 1035-1038； Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 (1994) 428-433；および米国特許第６，９８２，３２１号明細書および同７，０８７，４０９号明細書も参照されたい。
【0086】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された、および／または本明細書において開示されるようなヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の種々の技術を使用して生成できる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 (1991) 381；Marks et al., J. Mol. Biol., 222 (1991) 581。また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能であるものとして、Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-74に記載される方法がある。ヒト抗体は、抗原投与に応じて部分または完全ヒト抗体を産生するように遺伝子改変されているが、その内因性遺伝子座が無能にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製できる、例えば、ＯｍｎｉＡｂ治療用抗体プラットフォーム（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、免疫化したゼノマウス（xenomice）（ゼノマウス（Xenomouse）技術については例えば、米国特許第６，０７５，１８１号明細書および同６，１５０，５８４号明細書を参照されたい）など。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体に関しては、Li et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 103 (2006) 3557-3562も参照されたい。
【0087】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在する可能性がある潜在的な天然に存在する突然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。各モノクローナル抗体は、通常、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられる。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、それらが他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。修飾因子「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られているというような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256 (1975) 495- 497；Hongo et al., Hybridoma 14 (1995) 253-260、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換え型ＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467- 12472；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132を参照されたい）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分もしくはすべてを有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551；Jakobovits et al., Nature 362 (1993) 255-258；Bruggemann et al., Year in Immunol. 7 (1993) 33；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: (1996) 845-851；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 (1996) 826；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 (1995) 65-93を参照されたい）を含む、さまざまな技術によって作製され得る。
【0088】
「親和性成熟した」抗体とは、その１つまたは複数のＨＶＲ中に１つまたは複数の変更を有し、その結果、それらの変更（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善するものである。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルのまたはさらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって生成される。例えば、Marks et al., Biotechnology 10 (1992) 779-783には、ＶＨ－およびＶＬ－ドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＨＶＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994) 3809-3813；Schier et al. Gene 169 (1995) 147-155；Yelton et al. J. Immunol. 155 (1995) 1994-2004；Jackson et al, J. Immunol. 154 (1995) 3310-9；およびHawkins et al, J. Mol. Biol. 226 (1992) 889-896によって記載されている。
【0089】
本明細書で使用される場合、「に特異的に結合する」または「に特異的な」という用語は、測定可能な、再現可能な相互作用、例えば、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的の存在を決定するものである、標的と抗体の間の結合を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりもより大きな親和性、アビディティーで、より容易に、および／またはより長い期間この標的に結合する抗体である。
【0090】
「結合親和性」は、一般に、分子の（例えば、抗体の）単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の総和の強さを指す。別に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」、「に結合する（bind to）」、「に結合する（binds to）」または「への結合」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体Ｆａｂ断片と抗原）間の１対１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定するさまざまな方法が当技術分野で公知であり、それらのいずれも本発明の目的のために使用できる。結合親和性、すなわち、結合力を測定するための特定の例証的および例示的実施形態が以下に記載されている。
【0091】
本発明に従う「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、抗体のＦａｂバージョンおよび抗原分子を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって、またはＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、またはＯｃｔｅｔ機器（Ｆｏｒｔｅ ｂｉｏ、カリフォルニア州、フリーモント）を使用する生体層干渉法アッセイを使用することによって測定できる。
【0092】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、抗体の可変領域（ＣＤＲ）が非共有結合によって結合した化学的（非生物学的）治療薬を意味する「複合体」とは対照的に、抗体に共有結合によって連結した化学的（非生物学的）治療薬を指す。
【0093】
「精製された」または「単離された」とは、ポリペプチド（例えば、抗体）またはヌクレオチド配列を指す場合には、示された分子が、同種の他の生体高分子の実質的非存在下で存在することを意味する。「精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、同一種類の生体高分子の少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％または９８重量％が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子とは、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、分子は、組成物の基本的特徴に有害に影響を及ぼさない、一部の追加の塩基または部分を含む場合がある。
【0094】
「デグロン」という用語は、本明細書で使用される場合、フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）リガンドであるＰＲＯＴＡＣの分解性部分を指す。
【0095】
「弾頭」という用語は、本明細書で使用される場合、分解されるべきタンパク質（例えば、阻害剤またはこのような標的タンパク質）に結合するＰＲＯＴＡＣの部分を指す。弾頭部分は、本明細書において以下、「標的タンパク質結合剤」または「タンパク質結合剤」または「ＰＢ」とも呼ばれる。
【0096】
６．２ 本発明の抗体および抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体（ＰＡＸ）
本発明者らは、特異的抗ＰＲＯＴＡＣ抗体、特に抗ＶＨＬ－リガンド抗体を作製し、選択することに成功し、これでは、抗体はＰＲＯＴＡＣのＶＨＬリガンドデグロンに特異的に結合する。
本発明者らは、特異的抗ＰＲＯＴＡＣ抗体、特に抗ＶＨＬ－リガンド抗体を作製し、選択することに成功し、これでは、抗体はＰＲＯＴＡＣのＶＨＬリガンドデグロンに特異的に結合する。
【0097】
したがって、一態様では、本発明は、ＶＨＬリガンド、例えば、ＶＨ０３２またはその誘導体に結合する抗体に関する。
【0098】
本発明者らによって作製された抗ＰＲＯＴＡＣ抗体は、ＭＩＣ１－およびＭＩＣ２－由来抗体について図１および表１によって概説されるような種々の改変を許容しながら、ＶＨＬリガンドＶＨ０３２に結合できる。抗体は、ＶＨ０３２と標的タンパク質結合剤を接続するいくつかの別個のリンカー構造を含む位置Ｒ１およびＲ２において、すべての調査された置換を許容する。Ｒ３では、水素およびヒドロキシル置換が許容されるが、標的タンパク質結合部分がリンカーを介してＲ３に接続された場合には、抗体結合は抑制された。Ｒ４は、メチルの水素であり得る。Ｒ５およびＲ６は両方とも、それぞれ他の位置が水素であると仮定するとヒドロキシル基を含有し得る。位置Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６では、許容されなかった置換は同定されなかった。
【0099】
文献の概説に基づいた構造分析によって、ＶＨＬに会合するＰＲＯＴＡＣの４９．２％がＶＨＬリガンドＶＨ０３２に基づいているということが明らかになった。ＶＨＬに基づくＰＲＯＴＡＣの２９．５％は、追加のメチル基（Ｒ４＝Ｍｅ、図１）を保持するＶＨ０３２の近い誘導体を利用する。弾頭付着のためのリンカーはここでは位置Ｒ１において付着される（図１）。残りのＶＨＬに基づくＰＲＯＴＡＣは、弾頭への接続がＲ３へのリンカー付着によって実行されるか、またはＲ４中にヒドロキシメチルのような他の改変を保持する異なるビルドアップのいずれかを使用する。まとめると、本発明において開示される抗ＰＲＯＴＡＣ抗体は、現在公的に知られているＶＨＬに基づくＰＲＯＴＡＣの少なくとも７９％に結合できる。
【0100】
【表1】
【0101】
したがって、一実施形態では、ＶＨ０３２誘導体は、式Ｉによって記載でき、
【0102】
【化1】
Ｒ１またはＲ２のうち一方は、弾頭（標的タンパク質結合剤、ＰＢ）に接続されたリンカーであり、ただし、
Ｒ２が弾頭－リンカーである場合には、Ｒ１はアセチルであり、および
Ｒ１が弾頭－リンカーである場合には、Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、シアノ、Ｆ、Ｃｌ、アミノまたはメチルであり、
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ５、Ｒ６は、ＨまたはＯＨであり、ただし、
Ｒ６がＨである場合には、Ｒ５はＯＨであり、および
Ｒ５がＨである場合には、Ｒ６はＯＨである。
【0103】
より特定の実施形態では、
Ｒ１は、ＰＢ－Ｑ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
Ｑは、ＮＨ、Ｃ＝Ｏまたは存在せず、
ｎ、ｍは独立に、０、１、２、３または４であり、
ｐは、０～１０であり、
Ｒ２は、メチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
Ｒ１は、ＰＢ－Ｑ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
Ｑは、ＮＨ、Ｃ＝Ｏまたは存在せず、
ｎ、ｍは独立に、０、１、２、３または４であり、
ｐは、０～１０であり、
Ｒ２は、メチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
【0104】
さらにより特定の実施形態では、
Ｒ１は、ＰＢ－Ｑ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
Ｑは、ＮＨ、Ｃ＝Ｏまたは存在せず、
（ｉ）ｎ、ｍ、ｐは１であり、または
（ｉｉ）ｎは３もしくは４であり、ｍは０であり、ｐは１である、または
（ｉｉｉ）ｎは１であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｉｖ）ｎは２であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｖ）ｎ、ｍは０であり、ｐは６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
Ｒ１は、ＰＢ－Ｑ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
Ｑは、ＮＨ、Ｃ＝Ｏまたは存在せず、
（ｉ）ｎ、ｍ、ｐは１であり、または
（ｉｉ）ｎは３もしくは４であり、ｍは０であり、ｐは１である、または
（ｉｉｉ）ｎは１であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｉｖ）ｎは２であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｖ）ｎ、ｍは０であり、ｐは６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
【0105】
極めて特定の実施形態では、
Ｒ１は、ＰＢ－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
（ｖｉ）ＱはＮＨであり、ｎ、ｍ、ｐは１である、または
（ｖｉｉ）ＱはＮＨであり、ｎは３もしくは４であり、ｍは０であり、ｐは１である、または
（ｖｉｉｉ）Ｑは存在せず、ｎは１であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｉｘ）Ｑは存在せず、ｎは２であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｘ）Ｑは、ＮＨもしくはＣ＝Ｏであり、ｎ、ｍは０であり、ｐは、６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
Ｒ１は、ＰＢ－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｐ－（Ｃ＝Ｏ）－であり、
式中、
ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、
（ｖｉ）ＱはＮＨであり、ｎ、ｍ、ｐは１である、または
（ｖｉｉ）ＱはＮＨであり、ｎは３もしくは４であり、ｍは０であり、ｐは１である、または
（ｖｉｉｉ）Ｑは存在せず、ｎは１であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｉｘ）Ｑは存在せず、ｎは２であり、ｍは０であり、ｐは２である、または
（ｘ）Ｑは、ＮＨもしくはＣ＝Ｏであり、ｎ、ｍは０であり、ｐは、６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｒ２はメチルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
【0106】
別のより特定の実施形態では、
Ｒ１はアセチルであり、
Ｒ２は、ＰＢ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｓ－であり、式中、ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、ｐは、１、２、３、４、５または６であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
Ｒ１はアセチルであり、
Ｒ２は、ＰＢ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｓ－であり、式中、ＰＢは、タンパク質結合性弾頭であり、ｐは、１、２、３、４、５または６であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記の通りである。
【0107】
実施形態（Ａ）では、抗体は、可変領域がＰＲＯＴＡＣ結合に関与するＣＤＲを含む全長抗体であり、以下の配列：
ＨＣ ＣＤＲ１： Ｇ Ｙ Ｓ Ｘ１ Ｔ Ｘ２ Ｘ３ Ｙ （配列番号１）；
ＨＣ ＣＤＲ２： Ｉ Ｔ Ｙ Ｓ Ｇ Ｘ４ Ｔ （配列番号２）；
ＨＣ ＣＤＲ３： Ｘ５ Ｘ６ Ｙ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ （配列番号３）；
ＬＣ ＣＤＲ１： Ｑ Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｘ２４ Ｙ （配列番号４）；
ＬＣ ＣＤＲ２： Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ （配列番号５）；
ＬＣ ＣＤＲ３： Ｘ２８ Ｑ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１ Ｘ３２ Ｐ Ｙ Ｔ （配列番号６）；
を有し、
ここで、Ｘ１は、ＩまたはＡであり、Ｘ２は、ＧまたはＮであり、Ｘ３は、ＤまたはＮであり、Ｘ４は、ＧまたはＡであり、Ｘ５は、ＡまたはＧであり、Ｘ６は、ＫまたはＹであり、Ｘ７は、ＧまたはＹであり、Ｘ８は、存在しないかまたはＡであり、Ｘ９は、存在しないかまたはＶであり、Ｘ１０は、存在しないかまたはＰであり、Ｘ１１は、ＤまたはＹであり、Ｘ１２は、ＧまたはＹであり、Ｘ１３は、ＧまたはＦであり、Ｘ１４は、ＲまたはＡであり、Ｘ１５は、ＤまたはＨであり、Ｘ１６は、ＳまたはＧであり、Ｘ１７は、ＬまたはＩであり、Ｘ１８は、Ｓであるかまたは存在せず、Ｘ１９は、Ｙであるかまたは存在せず、Ｘ２０は、Ｓであるかまたは存在せず、Ｘ２１は、Ｄであるかまたは存在せず、Ｘ２２は、Ｇであるかまたは存在せず、Ｘ２３は、ＮまたはＧであり、Ｘ２４は、ＴまたはＮであり、Ｘ２５は、ＬまたはＹであり、Ｘ２６は、ＶまたはＡであり、Ｘ２７は、ＳまたはＴであり、Ｘ２８は、ＶまたはＬであり、Ｘ２９は、ＳまたはＹであり、Ｘ３０は、ＩまたはＤであり、Ｘ３１は、ＨまたはＥであり、Ｘ３２は、ＶまたはＹである。
ＨＣ ＣＤＲ１： Ｇ Ｙ Ｓ Ｘ１ Ｔ Ｘ２ Ｘ３ Ｙ （配列番号１）；
ＨＣ ＣＤＲ２： Ｉ Ｔ Ｙ Ｓ Ｇ Ｘ４ Ｔ （配列番号２）；
ＨＣ ＣＤＲ３： Ｘ５ Ｘ６ Ｙ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ （配列番号３）；
ＬＣ ＣＤＲ１： Ｑ Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｘ２４ Ｙ （配列番号４）；
ＬＣ ＣＤＲ２： Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ （配列番号５）；
ＬＣ ＣＤＲ３： Ｘ２８ Ｑ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１ Ｘ３２ Ｐ Ｙ Ｔ （配列番号６）；
を有し、
ここで、Ｘ１は、ＩまたはＡであり、Ｘ２は、ＧまたはＮであり、Ｘ３は、ＤまたはＮであり、Ｘ４は、ＧまたはＡであり、Ｘ５は、ＡまたはＧであり、Ｘ６は、ＫまたはＹであり、Ｘ７は、ＧまたはＹであり、Ｘ８は、存在しないかまたはＡであり、Ｘ９は、存在しないかまたはＶであり、Ｘ１０は、存在しないかまたはＰであり、Ｘ１１は、ＤまたはＹであり、Ｘ１２は、ＧまたはＹであり、Ｘ１３は、ＧまたはＦであり、Ｘ１４は、ＲまたはＡであり、Ｘ１５は、ＤまたはＨであり、Ｘ１６は、ＳまたはＧであり、Ｘ１７は、ＬまたはＩであり、Ｘ１８は、Ｓであるかまたは存在せず、Ｘ１９は、Ｙであるかまたは存在せず、Ｘ２０は、Ｓであるかまたは存在せず、Ｘ２１は、Ｄであるかまたは存在せず、Ｘ２２は、Ｇであるかまたは存在せず、Ｘ２３は、ＮまたはＧであり、Ｘ２４は、ＴまたはＮであり、Ｘ２５は、ＬまたはＹであり、Ｘ２６は、ＶまたはＡであり、Ｘ２７は、ＳまたはＴであり、Ｘ２８は、ＶまたはＬであり、Ｘ２９は、ＳまたはＹであり、Ｘ３０は、ＩまたはＤであり、Ｘ３１は、ＨまたはＥであり、Ｘ３２は、ＶまたはＹである。
【0108】
好ましい実施形態では、ＣＤＲ配列は、
ＨＣ ＣＤＲ１： Ｇ Ｙ Ｓ Ｉ Ｔ Ｇ Ｄ Ｙ （配列番号７）；
ＨＣ ＣＤＲ２： Ｉ Ｔ Ｙ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ （配列番号８）；
ＨＣ ＣＤＲ３： Ａ Ｋ Ｙ Ｇ Ｄ Ｇ Ｇ Ｒ Ｄ （配列番号９）；
ＬＣ ＣＤＲ１： Ｑ Ｓ Ｌ Ｓ Ｙ Ｓ Ｄ Ｇ Ｎ Ｔ Ｙ （配列番号１０）；
ＬＣ ＣＤＲ２： Ｌ Ｖ Ｓ （配列番号１１）；
ＬＣ ＣＤＲ３： Ｖ Ｑ Ｓ Ｉ Ｈ Ｖ Ｐ Ｙ Ｔ （配列番号１２）
である。
ＨＣ ＣＤＲ１： Ｇ Ｙ Ｓ Ｉ Ｔ Ｇ Ｄ Ｙ （配列番号７）；
ＨＣ ＣＤＲ２： Ｉ Ｔ Ｙ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ （配列番号８）；
ＨＣ ＣＤＲ３： Ａ Ｋ Ｙ Ｇ Ｄ Ｇ Ｇ Ｒ Ｄ （配列番号９）；
ＬＣ ＣＤＲ１： Ｑ Ｓ Ｌ Ｓ Ｙ Ｓ Ｄ Ｇ Ｎ Ｔ Ｙ （配列番号１０）；
ＬＣ ＣＤＲ２： Ｌ Ｖ Ｓ （配列番号１１）；
ＬＣ ＣＤＲ３： Ｖ Ｑ Ｓ Ｉ Ｈ Ｖ Ｐ Ｙ Ｔ （配列番号１２）
である。
【0109】
極めて特定の実施形態では、抗体は、図２に示される、ＭＩＣ ２配列配列番号１３および１４から選択される軽鎖および重鎖配列の対に対応する。
【0110】
別の極めて特定の実施形態では、抗体は、図２（ａ）に示されるように重鎖および軽鎖配列配列番号１３および１５または１３および１６を有するＢｓＡｂであり、その重鎖に、それぞれＨＥＲ２結合性ＶＨＨまたはＥＧＦＲ結合性ｓｃＦｖが、図２（ａ）および（ｂ）に示されるようにペプチドリンカーを介して融合される。
【0111】
実施形態（Ｂ）では、抗体は、ＰＲＯＴＡＣ結合に関与するＣＤＲを含むＶＨＨであり、以下の配列：
ＣＤＲ１： Ｇ Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ （配列番号１７）；
ＣＤＲ２： Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ （配列番号１８）；
ＣＤＲ３： Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｘ２４ Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ Ｘ２８ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１ Ｘ３２ Ｘ３３ Ｘ３４ Ｘ３５ Ｘ３６ （配列番号１９）；
を有し、
ここで、Ｘ１は、ＦまたはＲであり、Ｘ２は、Ｔ、Ａ、ＳまたはＲであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、ＤまたはＮであり、Ｘ５は、ＤまたはＴであり、Ｘ６は、ＹまたはＬであり、Ｘ７は、ＡまたはＴであり、Ｘ８は、Ｉ、ＮまたはＬであり、Ｘ９は、ＳまたはＴであり、Ｘ１０は、ＳまたはＷであり、Ｘ１１は、ＳまたはＮであり、Ｘ１２は、ＤまたはＧであり、Ｘ１３は、ＧまたはＤであり、Ｘ１４は、ＳまたはＮであり、Ｘ１５は、ＡまたはＴであり、Ｘ１６は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ１７は、Ａ、ＶまたはＩであり、Ｘ１８は、Ｓ、Ａ、ＩまたはＤであり、Ｘ１９は、Ｔ、Ｙ、ＲまたはＡであり、Ｘ２０は、Ｒ、ＹまたはＧであり、Ｘ２１は、Ｖ、Ｓ、ＬまたはＴであり、Ｘ２２は、Ｌ、Ｇ、ＳまたはＣであり、Ｘ２３は、Ｓ、Ａ、ＣまたはＰであり、Ｘ２４は、Ｔ、Ａ、ＳまたはＮであり、Ｘ２５は、Ｐ、Ｉ、ＶまたはＤであり、Ｘ２６は、存在しないかまたはＶまたはＡであり、Ｘ２７は、Ｄ、Ｓ、Ｒまたは存在せず、Ｘ２８は、Ｖ、ＧまたはＰであり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｔ、ＧまたはＲであり、Ｘ３０は、Ｑ、Ｉ、ＴまたはＲであり、Ｘ３１は、Ｖ、ＫまたはＲであり、Ｘ３２は、Ｒ、ＩまたはＹであり、Ｘ３３は、Ｙ、Ｑ、ＦまたはＡであり、Ｘ３４は、ＶまたはＬであり、Ｘ３５は、Ｅ、ＰまたはＤであり、Ｘ３６は、Ｖ、ＹまたはＡである。
ここで、より詳しくは、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＴまたはＳであり、Ｘ３はＬまたはＦであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＹであり、Ｘ７はＡまたはＴであり、Ｘ８はＩであり、Ｘ９はＳまたはＴであり、Ｘ１０はＳであり、Ｘ１１はＳであり、Ｘ１２はＤであり、Ｘ１３はＧであり、Ｘ１４はＳであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＡまたはＳであり、Ｘ１７はＶまたはＡであり、Ｘ１８はＡまたはＩであり、Ｘ１９はＴまたはＹであり、Ｘ２０はＧまたはＲであり、Ｘ２１はＬまたはＳであり、Ｘ２２はＣまたはＳであり、Ｘ２３はＰまたはＣであり、Ｘ２４はＡまたはＳであり、Ｘ２５はＶまたはＤであり、Ｘ２６は存在しないかまたはＶであり、Ｘ２７はＲであるかまたは存在せず、Ｘ２８はＧまたはＰであり、Ｘ２９はＴまたはＧであり、Ｘ３０はＱまたはＩであり、Ｘ３１はＫまたはＲであり、Ｘ３２はＲ、ＩまたはＹであり、Ｘ３３はＦまたはＡであり、Ｘ３４はＬであり、Ｘ３５はＥまたはＤであり、Ｘ３６はＶまたはＹである。
ＣＤＲ１： Ｇ Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ （配列番号１７）；
ＣＤＲ２： Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ （配列番号１８）；
ＣＤＲ３： Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｘ２４ Ｘ２５ Ｘ２６ Ｘ２７ Ｘ２８ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｘ３１ Ｘ３２ Ｘ３３ Ｘ３４ Ｘ３５ Ｘ３６ （配列番号１９）；
を有し、
ここで、Ｘ１は、ＦまたはＲであり、Ｘ２は、Ｔ、Ａ、ＳまたはＲであり、Ｘ３は、ＬまたはＦであり、Ｘ４は、ＤまたはＮであり、Ｘ５は、ＤまたはＴであり、Ｘ６は、ＹまたはＬであり、Ｘ７は、ＡまたはＴであり、Ｘ８は、Ｉ、ＮまたはＬであり、Ｘ９は、ＳまたはＴであり、Ｘ１０は、ＳまたはＷであり、Ｘ１１は、ＳまたはＮであり、Ｘ１２は、ＤまたはＧであり、Ｘ１３は、ＧまたはＤであり、Ｘ１４は、ＳまたはＮであり、Ｘ１５は、ＡまたはＴであり、Ｘ１６は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ１７は、Ａ、ＶまたはＩであり、Ｘ１８は、Ｓ、Ａ、ＩまたはＤであり、Ｘ１９は、Ｔ、Ｙ、ＲまたはＡであり、Ｘ２０は、Ｒ、ＹまたはＧであり、Ｘ２１は、Ｖ、Ｓ、ＬまたはＴであり、Ｘ２２は、Ｌ、Ｇ、ＳまたはＣであり、Ｘ２３は、Ｓ、Ａ、ＣまたはＰであり、Ｘ２４は、Ｔ、Ａ、ＳまたはＮであり、Ｘ２５は、Ｐ、Ｉ、ＶまたはＤであり、Ｘ２６は、存在しないかまたはＶまたはＡであり、Ｘ２７は、Ｄ、Ｓ、Ｒまたは存在せず、Ｘ２８は、Ｖ、ＧまたはＰであり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｔ、ＧまたはＲであり、Ｘ３０は、Ｑ、Ｉ、ＴまたはＲであり、Ｘ３１は、Ｖ、ＫまたはＲであり、Ｘ３２は、Ｒ、ＩまたはＹであり、Ｘ３３は、Ｙ、Ｑ、ＦまたはＡであり、Ｘ３４は、ＶまたはＬであり、Ｘ３５は、Ｅ、ＰまたはＤであり、Ｘ３６は、Ｖ、ＹまたはＡである。
ここで、より詳しくは、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＴまたはＳであり、Ｘ３はＬまたはＦであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＹであり、Ｘ７はＡまたはＴであり、Ｘ８はＩであり、Ｘ９はＳまたはＴであり、Ｘ１０はＳであり、Ｘ１１はＳであり、Ｘ１２はＤであり、Ｘ１３はＧであり、Ｘ１４はＳであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＡまたはＳであり、Ｘ１７はＶまたはＡであり、Ｘ１８はＡまたはＩであり、Ｘ１９はＴまたはＹであり、Ｘ２０はＧまたはＲであり、Ｘ２１はＬまたはＳであり、Ｘ２２はＣまたはＳであり、Ｘ２３はＰまたはＣであり、Ｘ２４はＡまたはＳであり、Ｘ２５はＶまたはＤであり、Ｘ２６は存在しないかまたはＶであり、Ｘ２７はＲであるかまたは存在せず、Ｘ２８はＧまたはＰであり、Ｘ２９はＴまたはＧであり、Ｘ３０はＱまたはＩであり、Ｘ３１はＫまたはＲであり、Ｘ３２はＲ、ＩまたはＹであり、Ｘ３３はＦまたはＡであり、Ｘ３４はＬであり、Ｘ３５はＥまたはＤであり、Ｘ３６はＶまたはＹである。
【0112】
好ましい実施形態では、ＣＤＲ配列は、図５０（ａ）に示される抗体ＹＵ７３４－Ｆ０６（ＭＩＣ７）のもの（配列番号２０）
ＣＤＲ１： Ｇ Ｆ Ｔ Ｌ Ｄ Ｄ Ｙ Ａ （配列番号２１）
ＣＤＲ２： Ｉ Ｓ Ｓ Ｓ Ｄ Ｇ Ｓ Ｔ （配列番号２２）
ＣＤＲ３： Ｓ Ａ Ｉ Ｙ Ｒ Ｌ Ｓ Ｃ Ｓ Ｖ Ｖ Ｒ Ｐ Ｔ Ｉ Ｒ Ｙ Ａ Ｌ Ｄ Ｙ （配列番号２３）
または図５０（ａ）に示された抗体ＹＵ７３３－Ｇ１０（ＭＩＣ５）のもの（配列番号２４）
ＣＤＲ１： Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｄ Ｄ Ｙ Ａ （配列番号２５）
ＣＤＲ２： Ｉ Ｓ Ｓ Ｓ Ｄ Ｇ Ｓ Ａ （配列番号２６）
ＣＤＲ３： Ａ Ｖ Ａ Ｔ Ｇ Ｓ Ｃ Ｐ Ａ Ｄ Ｇ Ｇ Ｑ Ｋ Ｉ Ｆ Ｌ Ｅ Ｖ （配列番号２７）
である。
ＣＤＲ１： Ｇ Ｆ Ｔ Ｌ Ｄ Ｄ Ｙ Ａ （配列番号２１）
ＣＤＲ２： Ｉ Ｓ Ｓ Ｓ Ｄ Ｇ Ｓ Ｔ （配列番号２２）
ＣＤＲ３： Ｓ Ａ Ｉ Ｙ Ｒ Ｌ Ｓ Ｃ Ｓ Ｖ Ｖ Ｒ Ｐ Ｔ Ｉ Ｒ Ｙ Ａ Ｌ Ｄ Ｙ （配列番号２３）
または図５０（ａ）に示された抗体ＹＵ７３３－Ｇ１０（ＭＩＣ５）のもの（配列番号２４）
ＣＤＲ１： Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｄ Ｄ Ｙ Ａ （配列番号２５）
ＣＤＲ２： Ｉ Ｓ Ｓ Ｓ Ｄ Ｇ Ｓ Ａ （配列番号２６）
ＣＤＲ３： Ａ Ｖ Ａ Ｔ Ｇ Ｓ Ｃ Ｐ Ａ Ｄ Ｇ Ｇ Ｑ Ｋ Ｉ Ｆ Ｌ Ｅ Ｖ （配列番号２７）
である。
【0113】
極めて特定の実施形態では、ＶＨＨは、図５０（ａ～ｅ）に示された配列から選択された配列に対応する。
【0114】
好ましい特定の実施形態では、ＶＨＨは、図５０（ａ）に示される配列ＹＵ７３４－Ｆ０６（ＭＩＣ７、配列番号２０）またはＹＵ７３３－Ｇ１０（ＭＩＣ５、配列番号２４）に対応する。
【0115】
一実施形態では、実施形態（Ｂ）について上記で記載された配列は、ＢｓＡｂの一部であり、前記配列のＮ末端は、任意選択で、ペプチドリンカーを介して、標的タンパク質に結合可能である全長抗体のＣ末端に融合される。
【0116】
好ましい実施形態では、ＢｓＡｂは、ペプチドリンカーを含む。より好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは各々、ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８）の１、２または３回の反復からなる。さらにより好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは各々、ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８）の１回の反復からなる。
【0117】
全長抗体の場合には、抗体は、好ましくは、ＦｃＲｎ受容体結合を可能にするＩｇＧ１またはＩｇＧ４型のものである。
【0118】
一実施形態では、抗体は、単一特異性であり、ＰＲＯＴＡＣにのみ結合する。抗体はまた、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）である場合があり、これでは、第２の特異性は、標的タンパク質に対してである。
【0119】
ＢｓＡｂの場合には、ＰＲＯＴＡＣ結合は、全長抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの、または両鎖のＣ末端またはＮ末端のいずれか、または両端に融合された単鎖抗体によって達成され得るが、標的タンパク質結合は、全長抗体の可変領域の６つのＣＤＲによって達成される。
【0120】
あるいは、標的タンパク質結合は、全長抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの、または両鎖のＣ末端またはＮ末端のいずれか、または両端に融合された単鎖抗体によって達成され、ＰＲＯＴＡＣ結合は、全長抗体の可変領域の６つのＣＤＲによって達成される。
【0121】
本発明に従うＢｓＡｂバリアントの例は、図３に示されている。
【0122】
好ましい実施形態では、本発明に従うＢｓＡｂの標的タンパク質は、細胞表面タンパク質、例えば、腫瘍抗原、例えば、ＨＥＲ２またはＥＧＦＲである。
【0123】
６．３ 核酸、ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、上記で定義されるような本発明の抗体をコードする核酸配列を含む、またはそれからなる単離核酸に関する。
本発明の別の態様は、上記で定義されるような本発明の抗体をコードする核酸配列を含む、またはそれからなる単離核酸に関する。
【0124】
通常、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、任意の適したベクター、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクター中に含まれる場合がある。
【0125】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、それによってＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入することができる媒体を意味する。したがって、本発明のさらなる態様は、上記で定義されるような本発明の核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、対象への投与の際に前記ポリペプチドの発現を引き起こす、または指示するために、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。
【0126】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う核酸および／またはベクターをトランスフェクトされている、感染しているまたは形質転換されている宿主細胞に関する。
【0127】
「形質転換」という用語は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、導入された遺伝子または配列によってコードされる所望の物質、通常、タンパク質または酵素を産生するような、宿主細胞への「外来」（すなわち、外因性）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取り、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【0128】
本発明の核酸は、適した発現系において本発明の抗体を生成するために使用され得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって保持される、および宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適した条件下での宿主細胞および適合したベクターを意味する。
【0129】
一般的な発現系として、大腸菌（E. coli）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクターならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例として、制限するものではないが、原核細胞（例えば、細菌）および真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例として、大腸菌（E. coli）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）またはサッカロミセス属（Saccharomyces）の酵母、哺乳動物細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）が挙げられる。
【0130】
６．４ 本発明の抗体を生成する方法
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば、制限するものではないが、単独または組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技術によって生成され得る。
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば、制限するものではないが、単独または組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技術によって生成され得る。
【0131】
所望の抗体のアミノ酸配列を知ることで、当業者は、ポリペプチドの生成のための標準技術を使用して前記抗体または免疫グロブリン鎖を容易に生成できる。例えば、市販のペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、フォスターシティーによって製造されたもの）を使用し、製造業者の使用説明書に従って周知の固相法を使用してそれらを合成できる。あるいは、本発明の抗体および免疫グロブリン鎖を、当技術分野で周知であるような組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、これらのポリペプチド（例えば、抗体）は、発現ベクターへ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込み、適した真核生物または原核生物宿主へ、所望のポリペプチドを発現するこのようなベクターを導入した後に、ＤＮＡ発現生成物として得ることができ、適した真核生物または原核生物宿主から周知の技術を使用してそれらを後に単離できる。
【0132】
さらなる態様にでは、本発明は、本発明の抗体を生成する方法に関し、方法は、（ｉ）本発明に従う形質転換された宿主細胞を培養すること、（ｉｉ）抗体を発現させること、および（ｉｉｉ）発現された抗体を回収することからなるステップを含む。
【0133】
本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって培養培地から適宜分離できる。
【0134】
本発明のＦａｂは、本発明の抗体（例えば、ＩｇＧ）をプロテアーゼ、例えば、パパインで処置することによって得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂの両鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核生物発現用または真核生物発現用のベクター中に挿入することおよびＦａｂを発現させるためにベクターを原核細胞または真核細胞（必要に応じて）中に導入することによって生成できる。
【0135】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗体（例えば、ＩｇＧ）をプロテアーゼ、ペプシンで処置して得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、以下に記載されるＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合によって結合することによって生成できる。
【0136】
本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）２を還元剤、例えば、ジチオトレイトールで処置することによって得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’鎖をコードするＤＮＡ配列を原核生物発現用のベクターまたは真核生物発現用のベクター中に挿入することおよびその発現を実施するためにベクターを原核細胞または真核細胞（必要に応じて）中に導入することによって生成できる。
【0137】
６．５ ＰＲＯＴＡＣを可溶化および安定化すること
ＰＲＯＴＡＣは疎水性であることが多く、これがそのｉｎ ｖｉｖｏ適用性を制限するが、抗体は一般に十分に可溶性である。したがって、本発明の抗ＰＲＯＴＡＣ抗体のＰＲＯＴＡＣのデグロン部分への結合は、周囲の溶媒からＰＲＯＴＡＣを部分的にマスクする。これの正味の結果は、抗体結合の可溶化効果、すなわち、溶解度の改善であり、これは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与および異種移植研究にとって有利である。
ＰＲＯＴＡＣは疎水性であることが多く、これがそのｉｎ ｖｉｖｏ適用性を制限するが、抗体は一般に十分に可溶性である。したがって、本発明の抗ＰＲＯＴＡＣ抗体のＰＲＯＴＡＣのデグロン部分への結合は、周囲の溶媒からＰＲＯＴＡＣを部分的にマスクする。これの正味の結果は、抗体結合の可溶化効果、すなわち、溶解度の改善であり、これは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与および異種移植研究にとって有利である。
【0138】
さらに、ＰＲＯＴＡＣは、弾頭、リンカーおよびデグロン部分にいくつかの代謝ソフトスポットを有し（Goracci, L. et al., J. Med. Chem. 63 (2020) 11615-11638）、これがその代謝安定性を制限する。ＰＲＯＴＡＣの本発明の抗体との複合体形成によって、ＰＲＯＴＡＣの代謝酵素への立体的到達性が制限され、代謝的安定性の改善につながる。
【0139】
６．６ 医薬組成物
本発明のＰＡＸは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と、任意選択で、それだけには限らないが、生分解性ポリマー、非生分解性ポリマー、脂質または糖のクラスを含む徐放性マトリックスと組み合わせて、医薬組成物を形成することができる。
本発明のＰＡＸは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と、任意選択で、それだけには限らないが、生分解性ポリマー、非生分解性ポリマー、脂質または糖のクラスを含む徐放性マトリックスと組み合わせて、医薬組成物を形成することができる。
【0140】
したがって、本発明の別の態様は、本発明のＰＡＸおよび薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0141】
「医薬品」または「薬学的に許容される」とは、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与された場合に有害な、アレルギー性またはその他の不必要な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とは、非毒性固体、半固体または液体増量剤、希釈剤、カプセル化剤または任意の種類の製剤化助剤を指す。
【0142】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合しているありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤などが含まれる。適した担体、希釈剤および／または賦形剤の例として、それだけには限らないが、水、アミノ酸、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、緩衝液リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩；アミノ酸および誘導体、例えば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、プロリン、グリシルグリシン；無機塩、例えば、ナトリウムまたは塩化カルシウム；糖または多価アルコール、例えば、デキストロース、グリセロール、エタノール、スクロース、トレハロース、マンニトール；界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８などのうち１つまたは複数ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、医薬組成物中に等張性剤、例えば、糖、多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含むことは有用であり、製剤はまた、抗酸化物質、例えば、トリプタミンおよび／または分解防止剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する場合がある。
【0143】
医薬組成物の形態、投与の経路、投与量およびレジメンは、当然、処置されるべき状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重および性別などに応じて変わる。
【0144】
本発明の医薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内または皮下投与などのために製剤化できる。
【0145】
一実施形態では、医薬組成物は、注射用の製剤のために薬学的に許容される媒体を含有する。これらは、等張性で、無菌の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）または場合に応じて、滅菌水もしくは生理食塩水を添加すると、注射用溶液の構成が可能になる乾燥、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【0146】
医薬組成物は、薬物組合せデバイスによって投与できる。
【0147】
投与のために使用される用量は、種々のパラメータの関数として、例えば、使用される投与の様式の、関連する病態の、あるいは所望の処置期間の関数として適応させることができる。
【0148】
医薬組成物を調製するために、本発明のＰＡＸの有効量を、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させることができる。
【0149】
注射用使用に適した医薬品形態として、滅菌水溶液または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製用の滅菌粉末が挙げられ、すべてのこのような場合において、形態は、分解を伴わない送達のための適当なデバイスまたはシステムを備えた無菌で、注射用でなくてはならず、製造および保存の条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
【0150】
無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を必要に応じて上記で列挙された他の成分のいずれかとともに適当な溶媒中に組み込むこと、続いて、滅菌濾過することによって調製できる。一般に、分散物は、種々の滅菌有効成分を、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要な他の成分を含有する滅菌媒体に組み込むことによって調製できる。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製方法は、その事前に滅菌濾過された溶液から有効成分および任意の追加の所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
【0151】
水溶液中の非経口投与用には、例えば、溶液を必要な場合には適宜緩衝させ、液体希釈剤をまず、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にできる。これらの水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒介物は、本開示を踏まえて当業者に公知である。例えば、１投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下点滴療法液に添加するか、または提案された注入部位に注射できる（例えば、"Remington’s Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。投与量の幾分かの変動は、処置されている対象の状態に応じて必然的に生じる。いずれにしても、投与責任者は、個々の対象に適切な用量を決定する。
【0152】
本発明のＰＡＸは、例えば、用量あたり約０．０１～１００ミリグラムなどを含むように治療用混合物内に製剤化され得る。
【0153】
特定の態様では、第１の医薬組成物はＰＡＸを含み、第２の医薬組成物は、前記ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣ構成成分のみを含む。
【0154】
別の特定の態様では、第１の医薬組成物は、ＰＡＸの抗体構成成分のみを含み、第２の医薬組成物は、前記ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣ構成成分のみを含む。
【0155】
６．７ 治療方法および使用
上記および下記のように、本発明者らは、本発明のＰＡＸは、所与のＰＲＯＴＡＣを標的細胞に効果的に送達できるということを見出した。さらに、彼らは、前記ＰＡＸが、そのＰＲＯＴＡＣペイロードを標的細胞のサイトゾル中に放出し、そこでＰＲＯＴＡＣがその標的タンパク質の分解を媒介することを示した。
上記および下記のように、本発明者らは、本発明のＰＡＸは、所与のＰＲＯＴＡＣを標的細胞に効果的に送達できるということを見出した。さらに、彼らは、前記ＰＡＸが、そのＰＲＯＴＡＣペイロードを標的細胞のサイトゾル中に放出し、そこでＰＲＯＴＡＣがその標的タンパク質の分解を媒介することを示した。
【0156】
したがって、一実施形態では、本発明は、医薬として使用するためのＰＡＸまたはその医薬組成物を提供する。
【0157】
別の態様では、本発明は、ＰＲＯＴＡＣの標的タンパク質の分解から恩恵を受ける疾患、例えば、がんを処置する方法であって、本発明のＰＡＸまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【0158】
特定の実施形態では、ＰＡＸまたは前記ＰＡＸを含む医薬組成物がまず投与され、ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣ構成成分単独または前記ＰＲＯＴＡＣを含む医薬組成物のその後の投与が続き、そのＰＲＯＴＡＣペイロードを放出した抗体が、さらなるＰＲＯＴＡＣ構成成分に結合し、それらを標的細胞に送達することを可能にする。
【0159】
別の特定の実施形態では、ＰＡＸの抗体構成成分または前記抗体を含む医薬組成物がまず投与され、その後、ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣ構成成分または前記ＰＲＯＴＡＣを含む医薬組成物が投与され、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体がそのＰＲＯＴＡＣ「抗原」に結合し、それらを標的細胞に送達することが可能になる。
【0160】
さらなる態様では、ＰＡＸの抗体構成成分は、（ｉ）ＰＲＯＴＡＣのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増大するために（すなわち、分解を減速するために）、（ｉｉ）ＰＲＯＴＡＣの持続放出製剤（すなわち、より長い期間にわたって有効であることを可能にする）として、または（ｉｉｉ）それらを一時的に中和し、その結果、毒性閾値が低下することによってＰＲＯＴＡＣの毒性効果に対抗する解毒薬として使用される。
【0161】
一実施形態では、ＰＡＸの抗体構成成分は、抗体断片、例えば、Ｆｃ断片である。
【0162】
６．８ 非治療的使用
本発明の抗ＰＲＯＴＡＣ抗体、好ましくは、単一特異性抗体はまた、非治療的適用、例えば、ＰＲＯＴＡＣを検出、定量化または精製するために使用され得る。
本発明の抗ＰＲＯＴＡＣ抗体、好ましくは、単一特異性抗体はまた、非治療的適用、例えば、ＰＲＯＴＡＣを検出、定量化または精製するために使用され得る。
【0163】
一実施形態では、このような使用のために、抗体はクロマトグラフィーカラムまたはいくつかの他の固相支持体上に固定化される。
【0164】
６．９ キット
最後に、本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗体またはＰＡＸを含むキットを提供する。
最後に、本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗体またはＰＡＸを含むキットを提供する。
【0165】
本発明のＰＡＸを含有するキットは、単剤療法である場合も併用療法である場合もある治療目的で使用されることがあり、この場合には、それらは追加の医薬成分を含む１つまたは複数のさらなる医薬組成物を含有する。治療用キットはまた、投与指示を有する添付文書を含有することもある。
【0166】
本発明の抗体を含有するキットはまた、診断目的または検出目的のために使用され得る。このようなキットでは、抗体は通常、固相支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいてＰＲＯＴＡＣを検出および／または定量化するために使用される。検出のために有用なこのような抗体には、標識、例えば、蛍光または放射標識が提供される場合がある。
【実施例】
【0167】
７ 実施例
７．１ 抗ＰＲＯＴＡＣ抗体ＭＩＣ１およびＭＩＣ２
７．１．１ ハプテンコンジュゲーション
免疫原の調製および化合物をスクリーニングするために、ＶＨ０３２をベースとするハプテン（ＶＨＬ－１、ＶＨＬ－６、ＶＨＬ－７、ＶＨＬ－ｃ（図４）を、コンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％のナトリウムアジド；ｐＨ４．７）中に４ｍｇ／ｍＬの最終濃度に別個に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１０ｍｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、１０ｍｇ／ｍＬのカチオン性ＢＳＡ（ｃＢＳＡ）および７ｍｇ／ｍＬのヒトＦｃ（ｈｕＦｃ）の溶液のいずれかと混合した（１：１００の最終タンパク質：ハプテンモル比）。
７．１ 抗ＰＲＯＴＡＣ抗体ＭＩＣ１およびＭＩＣ２
７．１．１ ハプテンコンジュゲーション
免疫原の調製および化合物をスクリーニングするために、ＶＨ０３２をベースとするハプテン（ＶＨＬ－１、ＶＨＬ－６、ＶＨＬ－７、ＶＨＬ－ｃ（図４）を、コンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％のナトリウムアジド；ｐＨ４．７）中に４ｍｇ／ｍＬの最終濃度に別個に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１０ｍｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、１０ｍｇ／ｍＬのカチオン性ＢＳＡ（ｃＢＳＡ）および７ｍｇ／ｍＬのヒトＦｃ（ｈｕＦｃ）の溶液のいずれかと混合した（１：１００の最終タンパク質：ハプテンモル比）。
【0168】
この混合物に、１０ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の水溶液を添加し（最終タンパク質ＥＤＣモル比１：１７５０）、反応物を一晩インキュベートした。反応混合物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、０．１３７ＭのＮａＣｌ、０．００２７ＭのＫＣｌ、０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．００１８ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）（７Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で事前に平衡化されたＺｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラムで精製した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を用い、標準としてコンジュゲートされていないＫＬＨまたはＢＳＡを使用して決定した。ＭＡＬＤＩ－ＭＳによってＢＳＡおよびｈｕＦｃコンジュゲートについてコンジュゲーション効率を試験した。個々のコンジュゲーション各々について、おおよそのハプテン対担体タンパク質比を導き出すことができる（図５）。
【0169】
７．１．２ 免疫化およびハイブリドーマスクリーニング
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ－１マウスならびにＳＤラットを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートされたハプテンＶＨＬ－１、ＶＨＬ－６およびＶＨＬ－７の等モル混合物（図４）を免疫原担体タンパク質として用いて免疫化した。免疫原の注射後、すべての動物の血清を、ＥＬＩＳＡを使用してＢＳＡ－ハプテンコンジュゲートを用いて瞬時に抗体応答について調べた。動物は免疫応答を示し、ハイブリドーマスクリーニングを使用するＶＨＬ－リガンド結合性抗体についての免疫レパートリースクリーニングにつながった。図６は、詳細な作業計画を示す。
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ－１マウスならびにＳＤラットを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートされたハプテンＶＨＬ－１、ＶＨＬ－６およびＶＨＬ－７の等モル混合物（図４）を免疫原担体タンパク質として用いて免疫化した。免疫原の注射後、すべての動物の血清を、ＥＬＩＳＡを使用してＢＳＡ－ハプテンコンジュゲートを用いて瞬時に抗体応答について調べた。動物は免疫応答を示し、ハイブリドーマスクリーニングを使用するＶＨＬ－リガンド結合性抗体についての免疫レパートリースクリーニングにつながった。図６は、詳細な作業計画を示す。
【0170】
７．２ ＭＩＣ抗体の製造
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の対応するトランスフェクションキットおよび培地を使用し、製造業者の使用説明書に従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における重鎖および軽鎖の一時的トランスフェクションによって単一特異性抗体を発現させた。重鎖については５０μｇのプラスミドＤＮＡおよび軽鎖については１００μｇのプラスミドＤＮＡを、１０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈した。５３６μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを１０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭに添加し、続いて、５分間室温でインキュベートした。次いで、プラスミド希釈物を添加した。室温で２０分間インキュベートした後、ｍＬあたり２．９×１０６個の生存細胞の細胞密度で混合物を１８０ｍＬのＥｘｐｉ２９３細胞に添加した。細胞懸濁液を３７℃、５％のＣＯ２、８０ｒｐｍで、湿性雰囲気下でインキュベートした。１８～２２時間後、１ｍＬのエンハンサー１および１０ｍＬのエンハンサー２を添加した。３７℃で５％のＣＯ２を用い、振盪しながら、湿性雰囲気下で４日間さらにインキュベートした後、抗体を遠心分離（３０００ｒｐｍで３０分）によって回収し、０．２２μｍのボトルトップフィルターを用いて滅菌濾過した。
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の対応するトランスフェクションキットおよび培地を使用し、製造業者の使用説明書に従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における重鎖および軽鎖の一時的トランスフェクションによって単一特異性抗体を発現させた。重鎖については５０μｇのプラスミドＤＮＡおよび軽鎖については１００μｇのプラスミドＤＮＡを、１０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈した。５３６μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを１０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭに添加し、続いて、５分間室温でインキュベートした。次いで、プラスミド希釈物を添加した。室温で２０分間インキュベートした後、ｍＬあたり２．９×１０６個の生存細胞の細胞密度で混合物を１８０ｍＬのＥｘｐｉ２９３細胞に添加した。細胞懸濁液を３７℃、５％のＣＯ２、８０ｒｐｍで、湿性雰囲気下でインキュベートした。１８～２２時間後、１ｍＬのエンハンサー１および１０ｍＬのエンハンサー２を添加した。３７℃で５％のＣＯ２を用い、振盪しながら、湿性雰囲気下で４日間さらにインキュベートした後、抗体を遠心分離（３０００ｒｐｍで３０分）によって回収し、０．２２μｍのボトルトップフィルターを用いて滅菌濾過した。
【0171】
ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓシステムを使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いて、分取ＳＥＣ（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ）によって上清を精製して、凝集体を除去した。超遠心フィルターユニット（３０ｋ ＭＷＣＯ、Ａｍｉｃｏｎ）を使用して抗体を濃縮し、滅菌濾過し、２８０ｎｍでのＵＶ－ＶＩＳ分光法によってタンパク質濃度を決定した。抗体を同一性に関して分析的ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳによって特性決定した。
【0172】
７．３ ＰＲＯＴＡＣに結合する抗体の多用途性
ヒット抗体ＭＩＣ１およびＭＩＣ２のＶＨ０３２をベースとするＰＲＯＴＡＣの多様なセットに対する結合親和性（図８）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ランニング緩衝液は、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、２％のＤＭＳＯからなり、温度および流速はそれぞれ３０℃および３０μＬ／分に設定した。アッセイ設定は、図７に例示的に表されている。ＣＭ５センサーチップを抗体（＝リガンド；２５００ＲＵ）を用い、標準ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用してコーティングした。ＰＲＯＴＡＣ（＝分析物）をランニング緩衝液で段階希釈し（１μＭ～１．９ｎＭ）、連続実行で機器に注入し、抗体によって捕捉し、その結果、対応するＳＰＲ応答が増大した。会合ステップ（３００秒）後、ランニング緩衝液を６００秒間注射し、抗体から解離したＰＲＯＴＡＣはシグナル減少につながった。各実行の後、２×３０秒間の１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５の注入によって固定化抗体から残存する結合しているＰＲＯＴＡＣを除去し、次の会合および解離サイクルのために抗体を再生した。マトリックス効果を補償するために、測定されたＳＰＲ応答シグナルは、リガンドを省略した不活性化（ＥＤＣ／ＮＨＳ、エタノールアミン）参照表面に対する分析物応答によって差し引かれた。さらに、ＤＭＳＯ溶媒補正を実施し、分析物応答は、ランニング緩衝液シグナルによって差し引かれた。補正された応答を１：１動態学的結合モデルによってフィッティングし、ＰＲＯＴＡＣの結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）ならびにその解離定数（ＫＤ）を得た。
ヒット抗体ＭＩＣ１およびＭＩＣ２のＶＨ０３２をベースとするＰＲＯＴＡＣの多様なセットに対する結合親和性（図８）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ランニング緩衝液は、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、２％のＤＭＳＯからなり、温度および流速はそれぞれ３０℃および３０μＬ／分に設定した。アッセイ設定は、図７に例示的に表されている。ＣＭ５センサーチップを抗体（＝リガンド；２５００ＲＵ）を用い、標準ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用してコーティングした。ＰＲＯＴＡＣ（＝分析物）をランニング緩衝液で段階希釈し（１μＭ～１．９ｎＭ）、連続実行で機器に注入し、抗体によって捕捉し、その結果、対応するＳＰＲ応答が増大した。会合ステップ（３００秒）後、ランニング緩衝液を６００秒間注射し、抗体から解離したＰＲＯＴＡＣはシグナル減少につながった。各実行の後、２×３０秒間の１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５の注入によって固定化抗体から残存する結合しているＰＲＯＴＡＣを除去し、次の会合および解離サイクルのために抗体を再生した。マトリックス効果を補償するために、測定されたＳＰＲ応答シグナルは、リガンドを省略した不活性化（ＥＤＣ／ＮＨＳ、エタノールアミン）参照表面に対する分析物応答によって差し引かれた。さらに、ＤＭＳＯ溶媒補正を実施し、分析物応答は、ランニング緩衝液シグナルによって差し引かれた。補正された応答を１：１動態学的結合モデルによってフィッティングし、ＰＲＯＴＡＣの結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）ならびにその解離定数（ＫＤ）を得た。
【0173】
１６の別個のＰＲＯＴＡＣと組み合わせたＭＩＣ２について、親和性パラメータが、対応するＫＤ、会合速度ｋｏｎおよび解離速度ｋｏｆｆを用いて表形式（表２）でまとめられている。１６のうち１３（８１．３％）のＰＲＯＴＡＣが、ナノモルのＫＤでＭＩＣ２の結合を受けた。表２はまた、ＭＩＣ２の結合を受けなかった１つのＰＲＯＴＡＣに結合できたＭＩＣ１の親和性データも含有する。
【0174】
【表2】
【0175】
７．４ ＭＩＣ２およびＰＲＯＴＡＣを使用するＰＡＸの製造
抗体ＭＩＣ２を、グリシン－セリンリンカー配列、続いて抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ抗体配列または抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ配列をＭＩＣ２の重鎖にＣ末端に遺伝子的に融合することによって二重特異性形式に再編成した。生成は、単一特異性抗体について先に記載したように行った。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２が細胞の細胞表面で発現される腫瘍関連抗原であり、したがって抗体結合に到達できるのでそれらを選択した。さらに、それらは、抗体－薬物コンジュゲートの開発においてすでに適用されており、これは、腫瘍モデルの利用可能性、十分な発現および内部移行に関する標的としてのそれらの有用性を裏付ける。
抗体ＭＩＣ２を、グリシン－セリンリンカー配列、続いて抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ抗体配列または抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ配列をＭＩＣ２の重鎖にＣ末端に遺伝子的に融合することによって二重特異性形式に再編成した。生成は、単一特異性抗体について先に記載したように行った。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２が細胞の細胞表面で発現される腫瘍関連抗原であり、したがって抗体結合に到達できるのでそれらを選択した。さらに、それらは、抗体－薬物コンジュゲートの開発においてすでに適用されており、これは、腫瘍モデルの利用可能性、十分な発現および内部移行に関する標的としてのそれらの有用性を裏付ける。
【0176】
複合体形成は以下の通りに実施した：１０μＭ（最終）ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２またはａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２を、ＰＢＳ ｐＨ７．４中で、ＤＭＳＯ中のＧＮＥ９８７と混合して、所望のローディング（表３）を達成した。ＰＢＳ ｐＨ７．４溶液中、５％のＴｗｅｅｎ－２０を０．３％の最終濃度に添加した。試料を、６５０ｒｐｍで振盪しながらＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒで２５℃で３時間インキュベートした。水性Ｔｗｅｅｎ－２０は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用する複合体調査のために添加しなかった。
【0177】
【表3】
【0178】
ＰＲＯＴＡＣのセットに対する親和性を再度評価して、ＰＲＯＴＡＣ結合を確認した。全体として、二重特異性抗体の親和性は、ＭＩＣ２の親和性と同等であった（図９）。
【0179】
７．４．１ ローディング依存性複合体形成
ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２に０、１０、２５、５０、７５および１００％のＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣをローディングし、ＳＥＣシステム中に直ちに注入した。抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２は３．１５分で溶出した。第２のピークはローディングが増大した３．４８分で現れ、１つのＰＲＯＴＡＣ分子がローディングされた抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２に対応した。ローディングのさらなる増大は、４．０４分での第３のピーク（抗体あたり２つのＰＲＯＴＡＣ）の出現につながる。全体的に、ピーク分布は、ローディングが増大するにつれ遅い溶出時間に移動する（図１０）。
ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２に０、１０、２５、５０、７５および１００％のＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣをローディングし、ＳＥＣシステム中に直ちに注入した。抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２は３．１５分で溶出した。第２のピークはローディングが増大した３．４８分で現れ、１つのＰＲＯＴＡＣ分子がローディングされた抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２に対応した。ローディングのさらなる増大は、４．０４分での第３のピーク（抗体あたり２つのＰＲＯＴＡＣ）の出現につながる。全体的に、ピーク分布は、ローディングが増大するにつれ遅い溶出時間に移動する（図１０）。
【0180】
７．４．２ 十分にローディングされた複合体の精製および複合体安定性
ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２抗体に２００％のＧＮＥ９８７をローディングした。試料を半分に分け、一方の部分をＺｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム、４０Ｋ ＭＷＣＯ、７５μＬを製造業者の使用説明書に従って使用してＰＢＳ ｐＨ７．４中で脱塩した。クロマトグラムは、ＤＭＳＯの除去およびおよそ５．７分で溶出するＰＲＯＴＡＣを示す（図１１）。
ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２抗体に２００％のＧＮＥ９８７をローディングした。試料を半分に分け、一方の部分をＺｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム、４０Ｋ ＭＷＣＯ、７５μＬを製造業者の使用説明書に従って使用してＰＢＳ ｐＨ７．４中で脱塩した。クロマトグラムは、ＤＭＳＯの除去およびおよそ５．７分で溶出するＰＲＯＴＡＣを示す（図１１）。
【0181】
未精製および精製抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体について、図１１からのピークを積分し、ピーク分布をプロットした（図１２）。ピーク分布は、脱塩プロセスによって影響を受けないままであり、ＰＡＸをＰＲＯＴＡＣローディングに全く影響を及ぼさずに過剰のＰＲＯＴＡＣまたは他の小分子から精製できるということを示す。
【0182】
ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体を１０μＭのタンパク質濃度で室温で７０時間の経過にわたって研究して、ＰＢＳ ｐＨ７．４中で複合体安定性を経時的に評価した。ピーク分布は、インキュベーション時間の増大によって影響を受けず（図１３）、７０時間にわたる複合体安定性を示す。
【0183】
７．５ ＰＡＸアプローチの機能性
７．５．１ 共有結合ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ
対照ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣを、１（図１４）の、Ｌ３２８Ｃ突然変異を保持していた抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（Ｃ２２５）へのコンジュゲーションによって国際公開第２０２００８６８５８号パンフレットに従って調製した。最終コンジュゲートは、９７．０％の単量体含量を有しながら、質量スペクトルによれば１．６２の薬物抗体比を有していた。
７．５．１ 共有結合ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ
対照ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣを、１（図１４）の、Ｌ３２８Ｃ突然変異を保持していた抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（Ｃ２２５）へのコンジュゲーションによって国際公開第２０２００８６８５８号パンフレットに従って調製した。最終コンジュゲートは、９７．０％の単量体含量を有しながら、質量スペクトルによれば１．６２の薬物抗体比を有していた。
【0184】
７．５．２ ＢＲＤ４分解
ＢＲＤ４の分解の際に誘導される強い薬理学的効果（細胞死）のために、ＢＲＤ４を開示された本発明のためのモデルタンパク質として選択した。標的化ＢＲＤ４分解の評価のために、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を黒色９６ウェル透明底プレートに播種し（１０，０００個細胞／ウェル）、続いて湿性チャンバー中で一晩インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２）。Ｄ３００ｅデジタルディスペンサー（Ｔｅｃａｎ）を使用して試験化合物を添加し、４３時間インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２、湿性チャンバー）。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド中で、室温で１５分間固定し、再度洗浄した（３回）。細胞を透過処理するために、０．２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を添加し室温で１０分間おき、ＰＢＳで洗浄すること（３回）によって除去した。ＰＢＳ中、３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用い、室温で６０分間ウェルをブロッキングし、瞬時に洗浄し、細胞を３％のＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した２．３μｇ／ｍＬのウサギ抗ＢＲＤ４抗体（Ａｂｃａｍ）とともに４℃で６０分間一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した（３回）後、細胞を、二次標識性ＡＦ４８８ヤギ抗ウサギ抗体（３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬ）とともに暗所、室温で１２０分間インキュベートし、瞬時に洗浄し、核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（５μｇ／ｍＬ ３％のＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて暗所、室温で９０分間染色した。最終洗浄ステップ後、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジド中で保存し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５細胞イメージングリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）に移した。ＤＡＰＩ（核）および緑色蛍光タンパク質（ＢＲＤ４）フィルターキューブを適用して撮像し、ＢｉｏＴｅｋ ｇｅｎ５データ分析ソフトウェアを用いて処理した。核ＢＲＤ４レベルの定量的分析のために、ＤＡＰＩ染色と共存する緑色蛍光（ＡＦ４８８）のみをカウントした。緑色蛍光は細胞数に対して正規化され、未処置細胞に対して表された。
ＢＲＤ４の分解の際に誘導される強い薬理学的効果（細胞死）のために、ＢＲＤ４を開示された本発明のためのモデルタンパク質として選択した。標的化ＢＲＤ４分解の評価のために、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を黒色９６ウェル透明底プレートに播種し（１０，０００個細胞／ウェル）、続いて湿性チャンバー中で一晩インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２）。Ｄ３００ｅデジタルディスペンサー（Ｔｅｃａｎ）を使用して試験化合物を添加し、４３時間インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２、湿性チャンバー）。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド中で、室温で１５分間固定し、再度洗浄した（３回）。細胞を透過処理するために、０．２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を添加し室温で１０分間おき、ＰＢＳで洗浄すること（３回）によって除去した。ＰＢＳ中、３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用い、室温で６０分間ウェルをブロッキングし、瞬時に洗浄し、細胞を３％のＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した２．３μｇ／ｍＬのウサギ抗ＢＲＤ４抗体（Ａｂｃａｍ）とともに４℃で６０分間一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した（３回）後、細胞を、二次標識性ＡＦ４８８ヤギ抗ウサギ抗体（３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬ）とともに暗所、室温で１２０分間インキュベートし、瞬時に洗浄し、核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（５μｇ／ｍＬ ３％のＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて暗所、室温で９０分間染色した。最終洗浄ステップ後、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジド中で保存し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５細胞イメージングリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）に移した。ＤＡＰＩ（核）および緑色蛍光タンパク質（ＢＲＤ４）フィルターキューブを適用して撮像し、ＢｉｏＴｅｋ ｇｅｎ５データ分析ソフトウェアを用いて処理した。核ＢＲＤ４レベルの定量的分析のために、ＤＡＰＩ染色と共存する緑色蛍光（ＡＦ４８８）のみをカウントした。緑色蛍光は細胞数に対して正規化され、未処置細胞に対して表された。
【0185】
図１５は、ＢＲＤ４レベルの例示的画像を示す。より高い蛍光は、ＭＤＡＭＢ４６８細胞におけるＢＲＤ４のより高い利用可能性を示すことに留意することは重要である。未処置細胞は、最も強い緑色蛍光を示し、これは、ＧＮＥ９８７、抗ＥＧＦＲ ＰＲＯＴＡＣ－抗体－薬物コンジュゲート、ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（短いＣ２２５）をベースとするＣ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７および５０％のＧＮＥ９８７がローディングされたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２によって媒介されるＢＲＤ４分解によって抑制され得る。それらの分子は、ＢＲＤ４分解に対して同等の効果を有する。ＧＮＥ９８７による分解の誘導は、ＭＤＡＭＢ４６８細胞に結合しないａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２との複合体形成によって低減され得る。
【0186】
核中の蛍光を使用して、分析物の分解効果を定量化できる（図１６）。蛍光画像においてすでに観察された傾向が、濃度の全範囲にわたって再度可視できるようになる（図１６Ａ）。より簡単な比較を容易にするために、４ｎＭの処置濃度でのＢＲＤ４値の拡大表示を作製した（図１６Ｂ）。ＧＮＥ９８７は、最強の分解効果を有しており、３９．０％の残存するＢＲＤ４まで到達した。ＧＮＥ９８７をローディングしたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２およびＣ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７は、ほぼ同一の方法でＢＲＤ４を分解した（それぞれ４４．０％および４４．２％）。ＧＮＥ９８７がローディングされたａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２によって誘導される分解は、５７．３％になり、これは、対応するａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体と比較して１３．３％低かった。
【0187】
結論
ＧＮＥ９８７と複合体形成されたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７およびＰＲＯＴＡＣ－抗体－薬物コンジュゲート、Ｃ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７と同様にＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞においてＢＲＤ４分解を誘導した。ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体は、ＨＥＲ２発現を欠くためにＭＤＡＭＢ４６８細胞に入ることができないので、ＧＮＥ９８７と複合体形成されたａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２についてはＢＲＤ４分解の減少が観察された。
ＧＮＥ９８７と複合体形成されたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７およびＰＲＯＴＡＣ－抗体－薬物コンジュゲート、Ｃ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７と同様にＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞においてＢＲＤ４分解を誘導した。ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体は、ＨＥＲ２発現を欠くためにＭＤＡＭＢ４６８細胞に入ることができないので、ＧＮＥ９８７と複合体形成されたａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２についてはＢＲＤ４分解の減少が観察された。
【0188】
７．５．３ ＢＲＤ４分解性ＰＲＯＴＡＣの抗体媒介性送達による選択的細胞死滅
ＢＲＤ４分解は、いくつかの細胞株で強力な細胞死滅を誘導すると示されており、ナノモル～ナノモル未満の範囲で効力を有する（Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25）。
ＢＲＤ４分解は、いくつかの細胞株で強力な細胞死滅を誘導すると示されており、ナノモル～ナノモル未満の範囲で効力を有する（Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25）。
【0189】
ウェルあたり２０００個の細胞を白色－不透明の３８４ウェルプレート中に播種し、続いて、湿性チャンバー中、３７℃および５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。複合体形成は、７．４章に記載されるように実施した。
【0190】
Ｔｅｃａｎ Ｄ３００ｅディスペンサーを使用し、抗体濃度に基づいて溶液を細胞に添加し、すべてのウェルを、ＰＢＳ ｐＨ７．４中、０．３％のＴＷ２０およびＤＭＳＯを使用して同一容量に標準化した。このアッセイは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイを製造業者のプロトコールに記載されるように使用して、別段の記載がない場合には３日後に行った。手短には、プレートを室温に３０分間平衡化した。１００ｍＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質フラスコに添加し、十分に混合した。３０μＬの試薬を各ウェルに移した。５５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３分間インキュベートした後、プレートを室温でさらに１０分間インキュベートした。発光をＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーで読み取った。試料で処置した細胞を未処置細胞に対して正規化することによってＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して評価を実施した。データを４点ロジスティック曲線を用いてフィッティングして、ＩＣ５０値を決定した。
【0191】
ＥＧＦＲ高発現ＭＤＡＭＢ４６８細胞で、ＢＲＤ４分解性ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７ならびにＥＧＦＲ－結合性ＰＲＯＴＡＣ－抗体コンジュゲーションＣ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７（ＤＡＲ＝１．６２）および５０％のＧＮＥ９８７と複合体形成されたＥＧＦＲ標的化二重特異性抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２（１：１）は、同等の効力を有していた。ＧＮＥ９８７の細胞傷害性効果は、ＶＨ０３２－結合性抗体ＭＩＣ２ならびに非結合性ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（１：１）ととものインキュベーションによって抑制された（図１７）。ＰＲＯＴＡＣを伴わない二重特異性抗体は、試験された濃度の範囲で細胞生存率に対して効果を有さなかった。
【0192】
二重特異性抗体および抗ＶＨ０３２抗体ＭＩＣ２のローディングの２５％への低減は、ＥＧＦＲ標的化複合体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（１：０．５）の効力を低減した。同時に、非結合性対照ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２およびＭＩＣ２の細胞生存率に対する影響も、より低いローディングで低減された（図１８）。
【0193】
非結合性対照複合体ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７およびＥＧＦＲ標的化ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７の効力は、複合体のローディングに応じて変わる（表４）。
【0194】
【表4】
【0195】
選択指数は、各それぞれのローディングについて非結合性対照複合体の効力をＥＧＦＲ標的化ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体によって除することによって算出できる。選択指数は、５０％（１：１）ローディングについては１２．９になり、２５％（１：０．５）ローディングについては２９．４になる。
【0196】
実験は生物学的３連物で実施した。分子の効力は、表５にまとめられ、図１９で図によって表されている。
【0197】
【表5】
【0198】
ＧＮＥ９８７のＥＧＦＲ結合性ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２との複合体形成は、非結合性ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２のＧＮＥ９８７との複合体と比較して４２倍高い効力に、また、非結合性ＭＩＣ２抗体のＧＮＥ９８７との複合体と比較して２１倍高い効力につながる。
【0199】
さらに、５０％のＧＮＥ９８７と複合体形成されたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２ならびにａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２を、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７単独、非標的化ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７複合体およびＥＧＦＲを標的化するＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ（Ｃ２２５＿Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７）を含むいくつかのベンチマークと一緒にＥＧＦＲ陰性細胞株ＨＥＰＧ２で調査した（図２０）。ＰＲＯＴＡＣ自体はＨＥＰＧ２細胞に対して強い抗増殖性効果を有し、３．１ｎＭのＩＣ５０値を有するが、すべての抗体ベースの構築物は、＞１００ｎＭのＩＣ５０値を有していた。ＧＮＥ９８７と複合体形成されたａＥＧＦＲｘＭＩＣ２およびＭＩＣ２は、ＧＮＥ９８７の毒性を最も強く抑制し、１００ｎＭで最初の毒性（約１０％）しか誘導しなかった。
【0200】
結論
細胞生存率アッセイデータは、ＢＲＤ４分解データを裏付ける。Ａ）ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（５０％）複合体は、ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ Ｃ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７およびＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７と比較してＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞に対して同様の細胞傷害性効果を示す。Ｂ）それらが標的化部分を完全に欠くので（ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（５０％））、または抗体の標的受容体がＭＤＡＭＢ４６８上で発現されないので（ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（５０％））細胞に入ることができない抗体複合体は、抗増殖性効果を減少させた。さらに、ＥＧＦＲを発現しないＨＥＰＧ２細胞で、すべての抗体をベースとする複合体およびコンジュゲートの細胞傷害性は、標的化部分を欠くＰＲＯＴＡＣ単独と比較して減少した。
細胞生存率アッセイデータは、ＢＲＤ４分解データを裏付ける。Ａ）ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（５０％）複合体は、ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ Ｃ２２５－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７およびＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７と比較してＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞に対して同様の細胞傷害性効果を示す。Ｂ）それらが標的化部分を完全に欠くので（ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（５０％））、または抗体の標的受容体がＭＤＡＭＢ４６８上で発現されないので（ａＨＥＲ２ｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（５０％））細胞に入ることができない抗体複合体は、抗増殖性効果を減少させた。さらに、ＥＧＦＲを発現しないＨＥＰＧ２細胞で、すべての抗体をベースとする複合体およびコンジュゲートの細胞傷害性は、標的化部分を欠くＰＲＯＴＡＣ単独と比較して減少した。
【0201】
７．５．４ さらなるＰＲＯＴＡＣの標的化送達
別のＰＲＯＴＡＣの標的化送達を実証するために、親水性ＰＥＧリンカーを有するＧＮＥ９８７類似体、ＧＮＥ９８７Ｐ（図２１）を、ＭＩＣ２またはａＥＧＦＲｘＭＩＣ２と複合体形成し、ＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞でインキュベートした（図２２）。ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７Ｐは、０．１～１０ｎＭの濃度範囲でＧＮＥ９８７Ｐ単独と比較して細胞傷害性の増大を媒介し、ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２によるＧＮＥ９８７Ｐの標的化細胞内送達を示したが、非結合性対照構築物ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７Ｐの毒性は有意に低かった。
別のＰＲＯＴＡＣの標的化送達を実証するために、親水性ＰＥＧリンカーを有するＧＮＥ９８７類似体、ＧＮＥ９８７Ｐ（図２１）を、ＭＩＣ２またはａＥＧＦＲｘＭＩＣ２と複合体形成し、ＥＧＦＲ発現性ＭＤＡＭＢ４６８細胞でインキュベートした（図２２）。ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７Ｐは、０．１～１０ｎＭの濃度範囲でＧＮＥ９８７Ｐ単独と比較して細胞傷害性の増大を媒介し、ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２によるＧＮＥ９８７Ｐの標的化細胞内送達を示したが、非結合性対照構築物ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７Ｐの毒性は有意に低かった。
【0202】
７．６ マウス血清安定性
抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２をＧＮＥ９８７と、最終濃度が各々４０μＭであるように混合した。混合物を６５０ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートした。１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５５をＢｉｏｗｅｓｔ製のマウス血清（ロット番号Ｓ１８１６９Ｓ２１６０）に添加し、続いて、滅菌濾過した。
抗体ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２をＧＮＥ９８７と、最終濃度が各々４０μＭであるように混合した。混合物を６５０ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートした。１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５５をＢｉｏｗｅｓｔ製のマウス血清（ロット番号Ｓ１８１６９Ｓ２１６０）に添加し、続いて、滅菌濾過した。
【0203】
ａＥＧＦＲｘＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７およびＧＮＥ９８７を、マウス血清－ＨＥＰＥＳ混合物を使用して５μＭに希釈し、３７℃および５％のＣＯ２で０、２、４、６、２４、４８、７２および９６時間インキュベートした。－２０℃で凍結することによってインキュベーションを停止した。
【0204】
ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７の濃度をＬＣ－ＭＳを使用して定量化した。ＧＮＥ９８７およびａＥＧＦＲｘＭＩＣ２との複合体中のＧＮＥ９８７は、７２時間にわたって安定であった（図２３）。
【0205】
さらに、マウス血清中で９６時間インキュベートされた試料中の無傷のａＥＧＦＲｘＭＩＣ２抗体の濃度を定量化した。定量化は総抗体ＥＬＩＳＡを使用して実施した（図２４）。無傷の抗体の濃度は影響を受けず、これによって二重特異性抗体の高い血漿安定性が実証された。
【0206】
さらに、ＧＮＥ９８７との複合体中のａＥＧＦＲｘＭＩＣ２を、マウス血清中で０および９６時間インキュベートし、試料をその後、親和性捕捉アッセイに供した。したがって、ビーズをボルテックス処理し、１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブ中に移し、続いて、５００μＬのＨＢＳ－Ｅ緩衝液で３回洗浄した。０．２μｇ／μＬのビオチン－ＳＰ（ロングスペーサー）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）をビーズに添加し、それを回転板上で２時間インキュベートした。ビーズを５００μＬのＨＢＳ－Ｅ緩衝液で３回洗浄した。２０μＬの０．５μｇ／μＬ試料をＨＢＳ－Ｅ緩衝液を用いて０．１μｇ／μＬに希釈し、ビーズに添加し、回転板上で２時間インキュベートした。上清を収集した。１００μＬのアセトニトリルをビーズに添加し、続いて、１０００ｒｐｍで３０分間インキュベートし、溶出液を収集した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してＧＮＥ９８７を上清および溶出液から定量化した。
【0207】
血清上清中ではＧＮＥ９８７は検出されなかったが、溶出液は依然として、抗体に結合した９６．７％の無傷のＧＮＥ９８７を含んでいた。驚くべきことに、抗体が結合しているＧＮＥ９８７は、溶出液中で９６時間後に依然として検出でき、高い安定性を示した（図２５）。
【0208】
７．７ 保存安定性
抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体の保存安定性を、４℃の冷蔵庫中で９６時間にわたるインキュベーションならびに複合体を瞬間凍結することおよび－８０℃で２４時間または－２０℃で９６時間の保存によって複合体形成（６ｍｇ／ｍＬ、６５０ｒｐｍ、３時間、室温）後に評価した。その後、試料を目に見える変化について調べ、ＤＬＳ測定を使用して多分散を評価し、ＳＥ－ＨＰＬＣによってローディングを測定した（表６）。１５％までの多分散を有する試料は単分散と考えられる。
抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体の保存安定性を、４℃の冷蔵庫中で９６時間にわたるインキュベーションならびに複合体を瞬間凍結することおよび－８０℃で２４時間または－２０℃で９６時間の保存によって複合体形成（６ｍｇ／ｍＬ、６５０ｒｐｍ、３時間、室温）後に評価した。その後、試料を目に見える変化について調べ、ＤＬＳ測定を使用して多分散を評価し、ＳＥ－ＨＰＬＣによってローディングを測定した（表６）。１５％までの多分散を有する試料は単分散と考えられる。
【0209】
【表6】
【0210】
データは、多分散ならびにローディングが大きく変化しないままであったことから複合体の高い保存安定性を示しただけでなく、疎水性ＧＮＥ９８７がＭＩＣ２の存在下で沈殿しなかったのでＰＲＯＴＡＣ疎水性に対する遮蔽効果も観察された。
【0211】
７．８ ＶＨＨベースの抗体およびＰＡＸ
７．８．１ 免疫化
新世界ラクダ類（ＮＷＣ）を交互のＫＬＨベースのおよびｃＢＳＡベースの免疫原を用いて免疫化した（スケジュール図２６）。ｈｕＦｃ－ハプテンコンジュゲートを用いて血清ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、ＶＨＬリガンド特異的免疫応答をモニタリングした。すべての動物は、免疫化後に免疫応答を示した。
７．８．１ 免疫化
新世界ラクダ類（ＮＷＣ）を交互のＫＬＨベースのおよびｃＢＳＡベースの免疫原を用いて免疫化した（スケジュール図２６）。ｈｕＦｃ－ハプテンコンジュゲートを用いて血清ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、ＶＨＬリガンド特異的免疫応答をモニタリングした。すべての動物は、免疫化後に免疫応答を示した。
【0212】
７．８．２ 抗体遺伝子ライブラリー
ＶＨＬリガンド特異的抗体の選択のために３個体の免疫化されたＮＷＣの免疫レパートリーから免疫ライブラリーを作製した。動物の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＲＮＡを抽出し、精製し、ｃＤＮＡ合成のために使用した。次いで、ｃＤＮＡプールをＰＣＲによるＶＨＨ遺伝子配列の増幅のために使用し、ＶＨＨ抗体－ファージディスプレイベクター中にクローニングし、大腸菌（E. coli）の形質転換のために使用した。段階希釈によって抗体－遺伝子ライブラリーのサイズを決定し、コロニーをカウントした。さらに、ｃＰＣＲによって挿入率を決定し、機能的ＯＲＦを有するクローン数を、ＤＮＡ－配列分析によって決定した。その後、形質転換された細菌を増殖させ、抗体－ファージ粒子のパッケージングのために使用した。抗体－ファージ粒子の精製後、抗体－ファージ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングおよび抗ｐＩＩＩイムノブロット染色によって、抗体－ｐＩＩＩ融合タンパク質の存在を調べた。ライブラリー特徴の概要は、以下に示されている（表７）：
ＶＨＬリガンド特異的抗体の選択のために３個体の免疫化されたＮＷＣの免疫レパートリーから免疫ライブラリーを作製した。動物の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＲＮＡを抽出し、精製し、ｃＤＮＡ合成のために使用した。次いで、ｃＤＮＡプールをＰＣＲによるＶＨＨ遺伝子配列の増幅のために使用し、ＶＨＨ抗体－ファージディスプレイベクター中にクローニングし、大腸菌（E. coli）の形質転換のために使用した。段階希釈によって抗体－遺伝子ライブラリーのサイズを決定し、コロニーをカウントした。さらに、ｃＰＣＲによって挿入率を決定し、機能的ＯＲＦを有するクローン数を、ＤＮＡ－配列分析によって決定した。その後、形質転換された細菌を増殖させ、抗体－ファージ粒子のパッケージングのために使用した。抗体－ファージ粒子の精製後、抗体－ファージ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングおよび抗ｐＩＩＩイムノブロット染色によって、抗体－ｐＩＩＩ融合タンパク質の存在を調べた。ライブラリー特徴の概要は、以下に示されている（表７）：
【0213】
【表7】
【0214】
７．８．３ 抗体発見
第１に、ライブラリーを、非特異的または交差反応性抗体－ファージからクリアにした。その目的のために、ライブラリーを、固定化されたストレプトアビジン、磁性ストレプトアビジンビーズおよびＢＳＡの存在下でインキュベートした。陰性抗原に結合した抗体－ファージをさらなる選択から除去した。
第１に、ライブラリーを、非特異的または交差反応性抗体－ファージからクリアにした。その目的のために、ライブラリーを、固定化されたストレプトアビジン、磁性ストレプトアビジンビーズおよびＢＳＡの存在下でインキュベートした。陰性抗原に結合した抗体－ファージをさらなる選択から除去した。
【0215】
その後、クリアにしたライブラリーを、標的抗原特異的抗体について選択した。その目的のために、ＶＨ０３２およびペンダントアミンを有するＰＥＧ化架橋剤のコンジュゲートを獲得し（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；図２７）、ビオチン－ＮＨＳ－エステルカップリングによってビオチン化した。ビオチン化ＶＨ０３２を精製し、ＨＰＬＣによって分析した。第１に、ビオチン化ＶＨ０３２をクリアにしたライブラリー調製物に添加した。ビオチン化標的抗原に結合した抗体－ファージを捕捉し、磁性ストレプトアビジンビーズを使用して溶液から回収した。ビーズを、ＢＳＡ溶液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する）およびＰＢＳを用いて複数回洗浄して、非特異的なまたは弱く結合した抗体－ファージ粒子を除去した。抗原特異的抗体ファージを、トリプシン処置によってビーズから溶出し、大腸菌（E. coli）感染によってレスキューした。短期間増殖させた後、細菌にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージと同時感染させ、抗体－ファージ増幅を誘導した。上記のような２回のさらなる選択サイクルのために免疫ライブラリーに起因する増幅したファージを使用した。
【0216】
７．８．４ 抗体スクリーニング
抗体－ファージ選択後、モノクローナル抗体クローンの結合特徴をＥＬＩＳＡによって分析した。免疫ライブラリーのために、選択サイクル２および３後の選択アウトプットを使用した。細菌におけるＶＨＨ抗体発現のために３８４のシングルクローンを選び取った。
・ストレプトアビジン＋ビオチン化ＶＨ０３２
・ストレプトアビジン
・ヒトＦｃ－ＶＨＬ－１
・ヒトＦｃ
でのＥＬＩＳＡによってその結合特異性について生成物を試験した。
抗体－ファージ選択後、モノクローナル抗体クローンの結合特徴をＥＬＩＳＡによって分析した。免疫ライブラリーのために、選択サイクル２および３後の選択アウトプットを使用した。細菌におけるＶＨＨ抗体発現のために３８４のシングルクローンを選び取った。
・ストレプトアビジン＋ビオチン化ＶＨ０３２
・ストレプトアビジン
・ヒトＦｃ－ＶＨＬ－１
・ヒトＦｃ
でのＥＬＩＳＡによってその結合特異性について生成物を試験した。
【0217】
以下の場合に、抗体クローンを抗原特異的と同定した：
陽性抗原に対するＥＬＩＳＡ結合シグナルが≧０．１であった
陰性抗原に対するＥＬＩＳＡ結合シグナルが≦０．１であった
陽性と陰性抗原間のシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が≧１０であった。
陽性抗原に対するＥＬＩＳＡ結合シグナルが≧０．１であった
陰性抗原に対するＥＬＩＳＡ結合シグナルが≦０．１であった
陽性と陰性抗原間のシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が≧１０であった。
【0218】
ＤＮＡ－配列分析のためにすべての５６２ヒットを使用して、独特の抗体配列（ＣＤＲ中、≧１のアミノ酸相違）を有する抗体を同定した。ＮＷＣライブラリーから１１３の独特のクローンが同定された。
【0219】
最良の結合親和性を有するクローンを同定するために、ＢＬＩ解離速度測定を実施した。第１に、独特のクローンのＶＨＨ含有培養上清を生成した。その後、抗体断片の、ＢＬＩストレプトアビジンセンサー上に固定化されたビオチン化ＶＨＬへの会合および解離を測定した。結合曲線を１：１結合モデルとフィッティングし、解離速度を算出した。
【0220】
解離速度および抗体配列情報に基づいて、最終形式への変換のために１０のリードクローン（ＭＩＣ５～ＭＩＣ１４と名付けられた）を選択した。
【0221】
７．８．５ 抗体変換
ＶＨＨ遺伝子を、ＰＣＲによってファージミドＤＮＡから増幅し、２つの異なるＩｇＧ発現ベクター中にクローニングした。一方の発現ベクターは、ＥＧＦＲ標的化セツキシマブＩｇＧ抗体をコードしていた。もう一方の発現ベクターは、ＣＤ３３標的化ゲムツズマブＩｇＧ抗体をコードしていた。ＶＨＨ抗体断片を発現ベクター中に挿入するために、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に遺伝子融合した。抗体断片は、短いＧＳリンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））によってＩｇＧ重鎖から離れており、以下の形式：ＨＣ－リンカー－ＶＨＨをもたらした。
ＶＨＨ遺伝子を、ＰＣＲによってファージミドＤＮＡから増幅し、２つの異なるＩｇＧ発現ベクター中にクローニングした。一方の発現ベクターは、ＥＧＦＲ標的化セツキシマブＩｇＧ抗体をコードしていた。もう一方の発現ベクターは、ＣＤ３３標的化ゲムツズマブＩｇＧ抗体をコードしていた。ＶＨＨ抗体断片を発現ベクター中に挿入するために、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に遺伝子融合した。抗体断片は、短いＧＳリンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））によってＩｇＧ重鎖から離れており、以下の形式：ＨＣ－リンカー－ＶＨＨをもたらした。
【0222】
トランスフェクション等級のＤＮＡの配列検証および調製後、１つのＶＨＨクローンの発現ベクターをＨＥＫ細胞に一過性にトランスフェクトした。抗体は、７日間、ＨＥＫ細胞によって産生され、培養培地中に分泌された。遠心分離による細胞からの培養上清のクリアランス後、ＩｇＧ抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。緩衝液のＰＢＳへの調整後、抗体のタンパク質濃度をＵＶ／ＶＩＳ分光法によって決定した。還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって抗体の完全性および純度を評価した。抗体の標的抗原への機能的結合活性をＥＬＩＳＡによって測定した。
【0223】
さらに、親抗体は、親抗体対融合タンパク質の発現率を比較することができるように同一手順を使用して生成した。データは、セツキシマブおよびゲムツズマブへのＶＨＨ融合物について図２８に例示的に表されており、ＶＨＨ融合物の生産性に対して大きな影響がないことを実証する。
【0224】
７．８．６ ＰＲＯＴＡＣへのＶＨＨ結合の多用途性
タンパク質－ＰＲＯＴＡＣ相互作用の動態学的および親和性パラメータを、ＳＰＲによって評価した。抗ＰＲＯＴＡＣ ＶＨＨクローンＭＩＣ５～ＭＩＣ１４を、２５℃で標準アミンカップリング手順によってＣＭ５（シリーズＳ）センサーチップ上にＣＤ３３またはＣＬＬ１抗体融合物として固定化した（融合タンパク質の製造および使用されたリンカーは、７．９章に記載されている）。固定化の前に、チップのカルボキシメチル化表面を、４００ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドおよび１００ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミドを用いて７分間活性化した。３，０００～６，０００応答単位（ＲＵ）に達するために、ＣＤ３３およびＣＬＬ１抗体融合物としてのヒット抗ＰＲＯＴＡＣ ＶＨＨを、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸塩で１０μｇ／ｍＬに希釈し、活性化された表面チップ上に７分間固定化した。残存する活性化されたカルボキシメチル化基を、１ＭのエタノールアミンｐＨ８の１０分の注射でブロックした。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および１５０ｍＭのＮａＣｌからなるＨＢＳ－Ｎを、固定化の際にバックグラウンド緩衝液として使用した。
タンパク質－ＰＲＯＴＡＣ相互作用の動態学的および親和性パラメータを、ＳＰＲによって評価した。抗ＰＲＯＴＡＣ ＶＨＨクローンＭＩＣ５～ＭＩＣ１４を、２５℃で標準アミンカップリング手順によってＣＭ５（シリーズＳ）センサーチップ上にＣＤ３３またはＣＬＬ１抗体融合物として固定化した（融合タンパク質の製造および使用されたリンカーは、７．９章に記載されている）。固定化の前に、チップのカルボキシメチル化表面を、４００ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドおよび１００ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミドを用いて７分間活性化した。３，０００～６，０００応答単位（ＲＵ）に達するために、ＣＤ３３およびＣＬＬ１抗体融合物としてのヒット抗ＰＲＯＴＡＣ ＶＨＨを、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸塩で１０μｇ／ｍＬに希釈し、活性化された表面チップ上に７分間固定化した。残存する活性化されたカルボキシメチル化基を、１ＭのエタノールアミンｐＨ８の１０分の注射でブロックした。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および１５０ｍＭのＮａＣｌからなるＨＢＳ－Ｎを、固定化の際にバックグラウンド緩衝液として使用した。
【0225】
ＰＲＯＴＡＣをＤＭＳＯで事前希釈し、ランニング緩衝液（１２ｍＭのリン酸塩ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、２％のＤＭＳＯ）で１：５０希釈し、２倍希釈シリーズを使用して、１μＭ～０．００２μＭの１０の異なる濃度で注入した。ＤＭＳＯ溶媒補正（１％～３％）を実施して、バルクシグナルの変動を考慮して高品質データを達成した。相互作用分析サイクルは、３００秒の試料注入（３０μＬ／分；会合相）、続いて、９００秒の緩衝液フロー（解離相）からなるものであった。
【0226】
すべてのセンサーグラムを、対照表面（参照フロー－チャネル）から記録された結合応答をまず差し引くこと、続いて、活性フロー－チャネル（固定化された標的タンパク質）から緩衝液ブランク注入を差し引くことによって処理した。すべてのデータセットを単純な１：１ラングミュア相互作用モデルにフィッティングして、動態学的速度定数を決定した。実験は２５℃でＢｉａｃｏｒｅ ８ｋ＋（Ｃｙｔｉｖａ、スウェーデン、ウプサラ）で実施し、相互作用を、提供されたＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用して評価した。
【0227】
結果は表８にまとめられている。この研究のＰＲＯＴＡＣは、できる限り多様な分子のセットを試験するためにその化学構造に基づいて選択した。一般に、すべての抗体がナノモル未満～３桁のナノモルの親和性でさまざまなＰＲＯＴＡＣに結合した。
【0228】
試験されたすべてのバリアントから、ＭＩＣ７抗ＰＲＯＴＡＣ ＶＨＨは、１桁のナノモル～ナノモル未満でさえの親和性で大部分のＰＲＯＴＡＣに結合する最も好都合な結合プロファイルを有していた。ＭＩＣ７クローンは、タンパク質結合部分へのリンカーが、Ｒ１およびＲ２において出るが、Ｒ３においては出ない、すべてのＰＲＯＴＡＣを許容する。リンカー化学に関しては、いかなる種類のＭＩＣ７－ＰＲＯＴＡＣ結合に対しても負の影響は観察されなかった。さらに、ＭＩＣ７は、Ｒ４における共通のメチル基を許容する。最後に、ＣＤ３３結合性抗体融合物の代わりにＣＬＬ１－結合性抗体ＭＩＣ７ ＶＨＨ融合物（ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７）を用いるＳＰＲ ＰＲＯＴＡＣ結合測定値は、結合親和性が影響を受けなかったので、ＰＲＯＴＡＣ結合が他の抗体への融合によって影響を受けないことを示す（表８）。
【0229】
【表8】
【0230】
７．９ ＶＨＨベースのＰＡＸの製造
ＶＨＨ抗体断片をＩｇＧ型抗体の重鎖および軽鎖に融合して、種々の疾患関連細胞株へのＰＲＯＴＡＣの送達を可能にした。融合物は以下の通りに作製した。抗体の重鎖または軽鎖または重鎖および軽鎖を、リンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））、続いて、ＶＨＨの配列（例えば、ＹＵ７３４－Ｆ０６（ＭＩＣ７））によってＣ末端に伸長した。このように、細胞表面受容体を認識でき、同時にＰＲＯＴＡＣのＶＨＬ－リガンドに結合できる二重特異性抗体は、図３に記載されるように作製できる。リンカー－ＶＨＨ（リンカー：ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））配列を、反復単位としてＨＣ、ＬＣまたは両方に複数回融合できる（例えば、リンカー－ＶＨＨ－リンカー－ＶＨＨ、すなわち、２つの反復）。鎖あたり最大３つのリンカー－ＶＨＨをＨＣ、ＬＣまたは両方のいずれかに融合した。命名法は以下の通りである：１つのＭＩＣ７ ＶＨＨが、上記のリンカーを介して各重鎖のＣ末端に融合されたＣＤ３３標的化抗体は、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７と名付けられている。これは、すべての他の構築物に使用された以下の命名法の唯一の例外である：ここで、一般化された式：ＣＤ３３ｘＭＩＣ７ＮＨＭＬが適用され、式中、ＮおよびＭは２、４、６である。「Ｈ」は、融合物が重鎖で作製されることを示し、「Ｌ」は、ＬＣへの融合物を示す。ＶＨＨがＨＣにもＬＣにも融合されない場合には、それぞれの文字は消失する。例えば、２つのＭＩＣ７ ＶＨＨ（リンカー－ＶＨＨ－リンカー－ＶＨＨ、すなわち、２つの反復）が各重鎖のＣ末端ならびに各軽鎖のＣ末端に融合されるＣＤ３３標的化抗体は、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７４Ｈ４Ｌと呼ばれる。二重特異性融合タンパク質を作製するために使用される抗体骨格および骨格変更は、表９に表されている。表１０は、例として、ＣＤ３３を標的化するＰＡＸの命名法を示す。
ＶＨＨ抗体断片をＩｇＧ型抗体の重鎖および軽鎖に融合して、種々の疾患関連細胞株へのＰＲＯＴＡＣの送達を可能にした。融合物は以下の通りに作製した。抗体の重鎖または軽鎖または重鎖および軽鎖を、リンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））、続いて、ＶＨＨの配列（例えば、ＹＵ７３４－Ｆ０６（ＭＩＣ７））によってＣ末端に伸長した。このように、細胞表面受容体を認識でき、同時にＰＲＯＴＡＣのＶＨＬ－リガンドに結合できる二重特異性抗体は、図３に記載されるように作製できる。リンカー－ＶＨＨ（リンカー：ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））配列を、反復単位としてＨＣ、ＬＣまたは両方に複数回融合できる（例えば、リンカー－ＶＨＨ－リンカー－ＶＨＨ、すなわち、２つの反復）。鎖あたり最大３つのリンカー－ＶＨＨをＨＣ、ＬＣまたは両方のいずれかに融合した。命名法は以下の通りである：１つのＭＩＣ７ ＶＨＨが、上記のリンカーを介して各重鎖のＣ末端に融合されたＣＤ３３標的化抗体は、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７と名付けられている。これは、すべての他の構築物に使用された以下の命名法の唯一の例外である：ここで、一般化された式：ＣＤ３３ｘＭＩＣ７ＮＨＭＬが適用され、式中、ＮおよびＭは２、４、６である。「Ｈ」は、融合物が重鎖で作製されることを示し、「Ｌ」は、ＬＣへの融合物を示す。ＶＨＨがＨＣにもＬＣにも融合されない場合には、それぞれの文字は消失する。例えば、２つのＭＩＣ７ ＶＨＨ（リンカー－ＶＨＨ－リンカー－ＶＨＨ、すなわち、２つの反復）が各重鎖のＣ末端ならびに各軽鎖のＣ末端に融合されるＣＤ３３標的化抗体は、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７４Ｈ４Ｌと呼ばれる。二重特異性融合タンパク質を作製するために使用される抗体骨格および骨格変更は、表９に表されている。表１０は、例として、ＣＤ３３を標的化するＰＡＸの命名法を示す。
【0231】
【表9】
【0232】
抗体生成は、７．２章に記載されるように実施した。ＰＡＸを作出するための複合体形成は、以下の通りに実施した：１０μＭ（最終）の抗体－ＶＨＨ融合物を、ＰＢＳ ｐＨ７．４中で、ＤＭＳＯ中のＶＨＬベースのＰＲＯＴＡＣと混合して、所望のローディングを達成した（表３）。ｉｎ ｖｉｖｏ適用のために決定されたＰＡＸは、６８．８μＭの抗体濃度で複合体形成された。
【0233】
分配のために、ＰＢＳ ｐＨ７．４溶液中、５％のＴｗｅｅｎ－２０を、０．３％の最終濃度まで添加した。試料を、６５０ｒｐｍで振盪しながらＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上で２５℃で３時間インキュベートした。
【0234】
【表10】
【0235】
７．１０ ＶＨＨベースのＰＡＸの細胞特性決定
７．１０．１ セツキシマブおよびゲムツズマブの融合物としてのＶＨＬベースのＰＲＯＴＡＣ結合性抗体断片の細胞プロファイリング
７．９章に記載されるように、ＶＨＨを、リンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））を介してそれぞれの抗体のＨＣにＣ末端に遺伝子的に付着することによって、ゲムツズマブ－およびセツキシマブ－ベースのＶＨＨ融合物を作出した。発現および精製後、抗体融合タンパク質にＧＮＥ９８７を１：１比でローディングした（５０％ローディング）。このように、１０のＶＨＨ抗体断片を、標的陽性細胞で細胞死滅を誘導する、または非標的化細胞への非選択的取り込みを防ぐその能力に関して特性決定できた（７．１０．５章に記載されるように）。結果は、表１１に表されている。選択性の測定基準として、選択性指数を導入した。第１に、ゲムツズマブベースの構築物の効力をセツキシマブベースの構築物の効力によって除すことによって、同じ細胞状況における構築物の比較を可能にする選択性指数が得られる。この場合には、クローンＭＩＣ５～ＭＩＣ８は最高の選択性指数を有し、これは、それらの構築物が細胞培地中での３日のインキュベーション時間の間ＰＲＯＴＡＣに結合することを証明する。第２に、ＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２細胞に対するセツキシマブベースの構築物の効力を、受容体発現依存性取り込みによって媒介される選択性の尺度であるＥＧＦＲ陽性ＭＤＡＭＢ４６８細胞に対する同一構築物の効力によって除した。この場合には、構築物ＭＩＣ７～ＭＩＣ１０は、最高の選択性指数をもたらした。高選択性を示す１つのさらなるパラメータは、細胞傷害性が予測されなかった、ＨＥＰＧ２細胞に対するＰＲＯＴＡＣがローディングされた融合タンパク質の効力である。ＰＲＯＴＡＣ単独は、ＨＥＰＧ２で２．６ｎＭのＩＣ５０値を有する。これは、ＰＲＯＴＡＣが細胞の外側にすでに放出され、強力な細胞死滅につながることを示す。それとは対照的に、ＶＨＨベースの構築物は、＞１００ｎＭの効力を有する強い解毒効果につながった。全体的に、クローンＭＩＣ５、ＭＩＣ７およびＭＩＣ１０は、特に親和性（７．８．６章）を考慮した場合に有望なプロファイルを示した。
７．１０．１ セツキシマブおよびゲムツズマブの融合物としてのＶＨＬベースのＰＲＯＴＡＣ結合性抗体断片の細胞プロファイリング
７．９章に記載されるように、ＶＨＨを、リンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））を介してそれぞれの抗体のＨＣにＣ末端に遺伝子的に付着することによって、ゲムツズマブ－およびセツキシマブ－ベースのＶＨＨ融合物を作出した。発現および精製後、抗体融合タンパク質にＧＮＥ９８７を１：１比でローディングした（５０％ローディング）。このように、１０のＶＨＨ抗体断片を、標的陽性細胞で細胞死滅を誘導する、または非標的化細胞への非選択的取り込みを防ぐその能力に関して特性決定できた（７．１０．５章に記載されるように）。結果は、表１１に表されている。選択性の測定基準として、選択性指数を導入した。第１に、ゲムツズマブベースの構築物の効力をセツキシマブベースの構築物の効力によって除すことによって、同じ細胞状況における構築物の比較を可能にする選択性指数が得られる。この場合には、クローンＭＩＣ５～ＭＩＣ８は最高の選択性指数を有し、これは、それらの構築物が細胞培地中での３日のインキュベーション時間の間ＰＲＯＴＡＣに結合することを証明する。第２に、ＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２細胞に対するセツキシマブベースの構築物の効力を、受容体発現依存性取り込みによって媒介される選択性の尺度であるＥＧＦＲ陽性ＭＤＡＭＢ４６８細胞に対する同一構築物の効力によって除した。この場合には、構築物ＭＩＣ７～ＭＩＣ１０は、最高の選択性指数をもたらした。高選択性を示す１つのさらなるパラメータは、細胞傷害性が予測されなかった、ＨＥＰＧ２細胞に対するＰＲＯＴＡＣがローディングされた融合タンパク質の効力である。ＰＲＯＴＡＣ単独は、ＨＥＰＧ２で２．６ｎＭのＩＣ５０値を有する。これは、ＰＲＯＴＡＣが細胞の外側にすでに放出され、強力な細胞死滅につながることを示す。それとは対照的に、ＶＨＨベースの構築物は、＞１００ｎＭの効力を有する強い解毒効果につながった。全体的に、クローンＭＩＣ５、ＭＩＣ７およびＭＩＣ１０は、特に親和性（７．８．６章）を考慮した場合に有望なプロファイルを示した。
【0236】
【表11】
【0237】
７．１０．２ 骨格抗体の細胞結合は、ＶＨＨ融合物およびＰＲＯＴＡＣでのＰＡＸのローディングによって影響を受けない
７．９章に記載されるリンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））を介したＶＨＨ融合物の、ＣＤ３３結合性抗体ゲムツズマブ（ＩｇＧ４－ＰＧ－ＳＰＬＥ）またはＥＧＦＲ結合性抗体セツキシマブのいずれかへの細胞結合に対する影響を、フローサイトメトリーを使用して調査した。したがって、ＶＨＨ ＭＩＣ５融合を伴わないＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＣＤ３３ Ａｂの、ＣＤ３３発現性ＭＶ４１１細胞への結合を評価した。１×１０５個のＭＶ４１１またはＭＤＡＭＢ４６８細胞を、丸底９６ウェルプレートに播種し、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄し、続いて、それぞれの抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて３回洗浄し、蛍光標識された二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて３回洗浄した。細胞を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ３ Ｓｃｒｅｅｎｅｒでフローサイトメトリーによって分析し、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ＦｏｒｅＣｙｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ８．０（Ｒ３）ソフトウェアを介して分析した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳで培養した。直接比較によって、ＶＨＨ ＭＩＣ５の添加が細胞結合に影響を及ぼさなかったことが実証された（図２９）。
７．９章に記載されるリンカー（ＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８））を介したＶＨＨ融合物の、ＣＤ３３結合性抗体ゲムツズマブ（ＩｇＧ４－ＰＧ－ＳＰＬＥ）またはＥＧＦＲ結合性抗体セツキシマブのいずれかへの細胞結合に対する影響を、フローサイトメトリーを使用して調査した。したがって、ＶＨＨ ＭＩＣ５融合を伴わないＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＣＤ３３ Ａｂの、ＣＤ３３発現性ＭＶ４１１細胞への結合を評価した。１×１０５個のＭＶ４１１またはＭＤＡＭＢ４６８細胞を、丸底９６ウェルプレートに播種し、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄し、続いて、それぞれの抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて３回洗浄し、蛍光標識された二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて３回洗浄した。細胞を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ３ Ｓｃｒｅｅｎｅｒでフローサイトメトリーによって分析し、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ＦｏｒｅＣｙｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ８．０（Ｒ３）ソフトウェアを介して分析した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳで培養した。直接比較によって、ＶＨＨ ＭＩＣ５の添加が細胞結合に影響を及ぼさなかったことが実証された（図２９）。
【0238】
その後、抗体－ＶＨＨ融合物のＰＲＯＴＡＣでのローディングが、細胞結合挙動にどの程度影響を及ぼすかを調査した。したがって、ＨＬ６０、ＭＯＬＭ１３、ＭＶ４１１、ＲＡＭＯＳおよびＵ９３７への細胞結合が、ＣＤ３３結合性抗体－ＶＨＨ融合物ＣＤ３３ｘＭＩＣ７について決定された。９０％のＧＮＥ９８７がローディングされた同一分子の結合を評価した。アイソタイプ非結合性対照として、ジゴキシゲニン結合性抗体を使用した。ＣＤ３３ｘＭＩＣ７を、細胞染色のために使用する前に、１％のＦＣＳを有する、１．８倍モル過剰で５％のＤＭＳＯに溶解したＧＮＥ９８７を有するＰＢＳ中で６５０ｒｐｍで振盪しながら２５℃で３時間インキュベートした。５％のＤＭＳＯととものインキュベーションの際にアイソタイプ非結合性対照を分析した。各細胞株から、条件あたり２００，０００個細胞を採取し、遠心分離し、それぞれの抗体、抗体－ＶＨＨ融合物またはＰＡＸ条件とともに、２００μｌの、１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で、１０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で４５分間インキュベートした。クエンチすることおよび１％のＦＣＳを有するＰＢＳでの１回の洗浄ステップの後、試料をフルオレセイン標識抗ヒト抗体６０７番（１：５０）でその後さらに４５分間処置した。１％のＦＣＳを有するＰＢＳでクエンチした後、細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで実施される分析の際に排除されるべき死細胞を染色する１μｇ／ｍＬのプロピジウムヨウ素（ＰＩ）染色を含有するＰＢＳに再懸濁した。Ｔｕｒｋｕ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＦｌｏｗｉｎｇソフトウェアを使用して定量的分析を行った。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ中で培養した。
【0239】
図３０に実証されるように、ＰＲＯＴＡＣを用いる抗体－ＶＨＨ融合物のローディングは、結合に対して影響を有さなかった。アイソタイプ対照抗体は、細胞株パネルへの強く低減された結合を示した。
【0240】
７．１０．３ ＣＤ３３ ＰＡＸ（ｐＨＡｂ色素を有する）は、ＣＤ３３陽性細胞中に内部移行する
ＰＡＸ取り込みが、受容体媒介性エンドサイトーシスによって媒介されるか否かを解明するために、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７にｐＨ応答性ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素をローディングした（図３１）。ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素は、ｐＨ＞７では最小の蛍光だけを示すが、酸性ｐＨでは有意に増強された蛍光を示すｐＨセンサーである。したがって、受容体媒介性内部移行の際に、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素を酸性エンドソームおよびリソソーム小胞に輸送することが、蛍光シグナルの増強をもたらすはずである。細胞染色のための使用の前に、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７を２５℃で、６５０ｒｐｍで、１．８倍モル過剰で５％のＤＭＳＯに溶解されたＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素を有するＰＢＳ中、暗所で２時間インキュベートした。ＣＤ３３陽性ＭＯＬＭ１３、ＭＶ４１１、Ｕ９３７および受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、得られたＰＡＸで、または対照としてＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素単独で処置した。各細胞株から、条件当たり２００，０００個細胞を採取し、遠心分離し、２００μＬの、１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で、１０μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で６時間、６５０ｒｐｍで振盪しながら、暗所でＰＡＸとともにインキュベートした。対照として、細胞を、等モル濃度のＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素単独で処置した。１％のＦＣＳを有するＰＢＳでの１回の洗浄ステップの後、細胞を、４００μｌの、１％のＦＣＳを有するＰＢＳに再懸濁し、サイトメトリー分析をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで実施した。ＶＨＬ－ｐＨＡｂ色素への干渉を取り除くために、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）を用いる死細胞の染色は実施しなかった。ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦｌｏｗＪｏを使用して定量的分析を実施した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ中で培養した。
ＰＡＸ取り込みが、受容体媒介性エンドサイトーシスによって媒介されるか否かを解明するために、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７にｐＨ応答性ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素をローディングした（図３１）。ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素は、ｐＨ＞７では最小の蛍光だけを示すが、酸性ｐＨでは有意に増強された蛍光を示すｐＨセンサーである。したがって、受容体媒介性内部移行の際に、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素を酸性エンドソームおよびリソソーム小胞に輸送することが、蛍光シグナルの増強をもたらすはずである。細胞染色のための使用の前に、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７を２５℃で、６５０ｒｐｍで、１．８倍モル過剰で５％のＤＭＳＯに溶解されたＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素を有するＰＢＳ中、暗所で２時間インキュベートした。ＣＤ３３陽性ＭＯＬＭ１３、ＭＶ４１１、Ｕ９３７および受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、得られたＰＡＸで、または対照としてＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素単独で処置した。各細胞株から、条件当たり２００，０００個細胞を採取し、遠心分離し、２００μＬの、１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で、１０μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で６時間、６５０ｒｐｍで振盪しながら、暗所でＰＡＸとともにインキュベートした。対照として、細胞を、等モル濃度のＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素単独で処置した。１％のＦＣＳを有するＰＢＳでの１回の洗浄ステップの後、細胞を、４００μｌの、１％のＦＣＳを有するＰＢＳに再懸濁し、サイトメトリー分析をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで実施した。ＶＨＬ－ｐＨＡｂ色素への干渉を取り除くために、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）を用いる死細胞の染色は実施しなかった。ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦｌｏｗＪｏを使用して定量的分析を実施した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＣＳ中で培養した。
【0241】
ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＶＨ０３２－ｐＨＡｂ色素で処置された細胞の、対照と比較して増強された蛍光シグナルは、すべてのＣＤ３３陽性細胞株で見出されたが、受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞については、増強された平均蛍光強度は、見出されなかった（図３２）。これらの結果は、ＰＡＸが、受容体媒介性抗体内部移行を介して取り込まれることを実証した。
【0242】
７．１０．４ ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ ＰＡＸは、標的化細胞においてＢＲＤ４分解を誘導する
ＰＡＸが、標的化細胞において標的タンパク質の分解を媒介できることを実証するために、ＢＲＤ４ウエスタンブロット分解アッセイを実施した（図３３および図３４）。したがって、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１細胞を、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７で、または非結合性ＰＡＸ対照としてＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７で異なる濃度で、および対照としてＧＮＥ９８７単独で処置した。ＭＶ４１１細胞を、１０％のＦＣＳおよびペニシリン－ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ－１６４０培地において培養した。ＭＶ４１１細胞を、１２ウェルプレートに、２ｍｌの培養培地中、１００万個細胞／ｍｌで播種し、細胞インキュベーター中、３７℃および５％のＣＯ２で一晩培養した。複合体形成を７．４章に記載された通りに実施した。ＧＮＥ９８７のみは、同一条件下であるが、抗体の非存在下でプレインキュベートした。その後、細胞を、それぞれの濃度のＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（１：１）、ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（１：１）またはＧＮＥ９８７のいずれかを用い、Ｔｅｃａｎディスペンサーを使用してナノドロップ分注物（ｄｉｓｐｅｎｓｉｏｎ）によって処置した。すべての条件は０．０００５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび３．０Ｅ－５％のＴｗｅｅｎ２０に標準化した。細胞を、細胞インキュベーター中、３７℃および５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。処置された細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを、Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤混合物を補給した細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ－１００）中で溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、粗溶解物を１５，０００ｘｇ、４℃での遠心分離によってクリアにし、クリアにした溶解物をアセトンによって沈殿させた。乾燥ペレットをＳＤＳ－ローディング緩衝液に溶解した。タンパク質濃度を、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＵＶ５Ｎａｎｏ光度計によって決定した。試料（５０μｇ／レーン）を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適用した。ゲルを流した後、試料をニトロセルロースメンブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、メンブレンを、０．１％のＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０中、５％の脱脂乳を用いてブロッキングし、示された一次抗体（表１２）とともにインキュベートした。
ＰＡＸが、標的化細胞において標的タンパク質の分解を媒介できることを実証するために、ＢＲＤ４ウエスタンブロット分解アッセイを実施した（図３３および図３４）。したがって、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１細胞を、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７で、または非結合性ＰＡＸ対照としてＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７で異なる濃度で、および対照としてＧＮＥ９８７単独で処置した。ＭＶ４１１細胞を、１０％のＦＣＳおよびペニシリン－ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ－１６４０培地において培養した。ＭＶ４１１細胞を、１２ウェルプレートに、２ｍｌの培養培地中、１００万個細胞／ｍｌで播種し、細胞インキュベーター中、３７℃および５％のＣＯ２で一晩培養した。複合体形成を７．４章に記載された通りに実施した。ＧＮＥ９８７のみは、同一条件下であるが、抗体の非存在下でプレインキュベートした。その後、細胞を、それぞれの濃度のＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（１：１）、ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（１：１）またはＧＮＥ９８７のいずれかを用い、Ｔｅｃａｎディスペンサーを使用してナノドロップ分注物（ｄｉｓｐｅｎｓｉｏｎ）によって処置した。すべての条件は０．０００５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび３．０Ｅ－５％のＴｗｅｅｎ２０に標準化した。細胞を、細胞インキュベーター中、３７℃および５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。処置された細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを、Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤混合物を補給した細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ－１００）中で溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、粗溶解物を１５，０００ｘｇ、４℃での遠心分離によってクリアにし、クリアにした溶解物をアセトンによって沈殿させた。乾燥ペレットをＳＤＳ－ローディング緩衝液に溶解した。タンパク質濃度を、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＵＶ５Ｎａｎｏ光度計によって決定した。試料（５０μｇ／レーン）を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適用した。ゲルを流した後、試料をニトロセルロースメンブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、メンブレンを、０．１％のＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０中、５％の脱脂乳を用いてブロッキングし、示された一次抗体（表１２）とともにインキュベートした。
【0243】
【表12】
【0244】
１：１０，０００希釈の対応するＨＲＰ標識抗ウサギ／マウス二次抗体（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートした後、ＥＣＬ溶液（Ａｄｖａｎｓｔａ）およびＸ線フィルム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してブロットを検出した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ １．５３Ｋ、ＮＩＨ）を用いて結果を分析した。バックグラウンドを差し引いたＢＲＤ４シグナルを、対応するアクチンシグナルに対して正規化し、溶媒対照の正規化されたＢＲＤ４シグナルを１００％に設定した。
【0245】
予測されたように、ＧＮＥ９８７単独での処置についてＢＲＤ４分解が見出された。さらに、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７について濃度依存性ＢＲＤ４分解が観察されたが、非結合性ＰＡＸ対照ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７については、すべての濃度で分解が観察されなかった（図３３および図３４）。これらの結果は、ＰＡＸが目的の細胞内タンパク質の濃度依存性、細胞種（標的受容体）選択的分解を媒介できることを実証した。
【0246】
７．１０．５ ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７ ＰＡＸは、受容体発現およびＰＡＸローディングに依存する細胞傷害性効果を誘導する
以下に記載される手順に従って、いくつかの細胞生存率実験を実施した。
以下に記載される手順に従って、いくつかの細胞生存率実験を実施した。
【0247】
細胞を白色細胞培養処置された平板の透明底マルチウェルプレート中の種々の培地に播種し、続いて、湿性チャンバー中、３７℃および５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。複合体形成は、７．４章に記載された通りに実施した。
【0248】
溶液を、Ｔｅｃａｎ Ｄ３００ｅデジタルディスペンサーを使用し、ナノドロップ分注物を使用して抗体濃度に基づいて細胞に添加し、すべてのウェルを、ＰＢＳ ｐＨ７．４中、０．３％のＴＷ２０およびＤＭＳＯを使用して同一容量に、０．０５％のＤＭＳＯおよび０．００３％のＴＷ２０の最終溶媒濃度に標準化した。インキュベーションを培地に応じて３７℃で、５％または１０％のＣＯ２で実施した。アッセイは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイを製造業者のプロトコールに記載されるように使用して、別段の記載がない場合には３日後に行った。手短には、プレートを室温に３０分間平衡化した。１００ｍＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質フラスコに添加し、十分に混合した。３０μＬの試薬を各ウェルに移した。５５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３分間インキュベートした後、プレートを室温でさらに１０分間インキュベートした。発光をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーで読み取った。溶媒単独およびボルテゾミブ（１．０Ｅ－０５Ｍ）は、それぞれ高対照（１００％生存率）および低対照（０％生存率）として働いた。生データを、それぞれ１００％および０％に設定した高および低対照に対する細胞生存率パーセントに変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、下部制約として０％生存率を、上部制約として１００％生存率を使用する可変傾斜シグモイド応答フィッティングモデルを用いてＩＣ５０算出を実施した。濃度は、ＰＡＸ中のＰＲＯＴＡＣの濃度に対応する。
【0249】
ＰＡＸ技術が、その細胞表面受容体発現に基づいて細胞の細胞選択的標的化を媒介できるか否か、またどの程度媒介できるかを調査した。したがって、ＭＩＣ５をＨＣに遺伝子的に融合すること、続いて、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７をローディングすることによって、ＣＤ３３標的化ＰＡＸを作出した。次いで、ＰＡＸをＣＤ３３陽性およびＣＤ３３陰性細胞で試験した。
【0250】
ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＭＯＬＭ１３細胞およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞の、５０％のＧＮＥ９８７が事前ローディングされたＣＤ３３ｘＭＩＣ５の段階希釈物での処置は、ＭＶ４１１およびＭＯＬＭ１３細胞の場合には３日のインキュベーション後に生存細胞の減少につながったが、ＲＡＭＯＳ細胞ではそうではなかった（図３５）。これは、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５はＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣの受容体陽性細胞への取り込みを媒介するが、受容体陰性細胞への取り込みを妨げ、したがって、ＰＡＸはＰＲＯＴＡＣを標的化細胞へ選択的に送達できたということを実証する。
【0251】
ＣＤ３３ｘＭＩＣ５構築物の細胞傷害性は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７でのローディングを増大または減少させることによってモジュレートできる可能性がある（図３６）。ＭＶ４１１細胞に対する、ＧＮＥ９８７と組み合わせたＣＤ３３ｘＭＩＣ５の細胞傷害性は、ローディングが２５％から５０％に、またはさらに７５％に増大する場合には増大する場合がある。これは、ローディングされるＰＲＯＴＡＣの量を希望に応じて調整することによって、ＰＡＸの細胞死滅特性を目的に合わせることが可能であることを実証する。
【0252】
７．１０．６ ＣＤ３３ｘＭＩＣ５のＧＮＥ９８７Ｐとの複合体形成は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７Ｐ単独の細胞死滅効力を改善できる
これまで、ＰＡＸ技術は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７を標的細胞に送達するために活用され得ることがわかり、他のＰＲＯＴＡＣにも適しているか否かは明らかではなかった。したがって、さらなる研究のために別のＰＲＯＴＡＣ、すなわちＧＮＥ９８７Ｐを選択し、ＰＡＸ技術が、このＰＲＯＴＡＣへの選択性も媒介できるか否かを調査した。
これまで、ＰＡＸ技術は、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７を標的細胞に送達するために活用され得ることがわかり、他のＰＲＯＴＡＣにも適しているか否かは明らかではなかった。したがって、さらなる研究のために別のＰＲＯＴＡＣ、すなわちＧＮＥ９８７Ｐを選択し、ＰＡＸ技術が、このＰＲＯＴＡＣへの選択性も媒介できるか否かを調査した。
【0253】
したがって、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＭＯＬＭ１３ならびにＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、２５～７５％ローディングを有するＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７ＰおよびＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７Ｐ単独を用いて処置した（図３７）。両ＣＤ３３陽性細胞株に対して、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７Ｐの組合せは、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７Ｐ単独よりも強力であり、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７Ｐの効力は、ローディングに応じて変わり、ローディングが高いほど、より高い効力につながった。全体的に、ＣＤ３３陰性細胞に対しては、１５０ｎＭまで毒性は観察されなかった。抗体－複合体形成を使用してＰＲＯＴＡＣの標的化送達を促進するという概念は、第２のＰＲＯＴＡＣがＣＤ３３発現性細胞に選択的に送達されたので、より一般化できる可能性があると結論付けることができる。さらに、この技術は、細胞への標的化送達によってある特定のＰＲＯＴＡＣの効力をさらに改善する可能性を提供することが観察された。
【0254】
７．１０．７ ＣＤ３３ｘＭＩＣ５は、ＦＬＴ３分解剤をＣＤ３３陽性細胞に送達するために使用できる
ＰＡＸアプローチを別の細胞内標的に拡大するために、ＦＬＴ３分解剤を抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体を使用してＣＤ３３発現性細胞に特異的に送達できるか否かを調査した。したがって、ＣＤ３３陽性ＭＯＬＭ１３およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、７５％のローディングを有するＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＦＬＴ３ｄ１および対照としてＰＲＯＴＡＣであるＦＬＴ３ｄ１単独を用いて処置した（図３８）。ＣＤ３３陽性ＭＯＬＭ１３細胞では、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＦＬＴ３ｄ１について細胞傷害性が観察された。ＣＤ３３受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞では、細胞傷害性は観察されなかった。これは、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５を使用して、ＦＬＴ３分解剤をＣＤ３３陽性細胞に送達できる可能性があることを実証した。細胞をＰＲＯＴＡＣまたはＰＡＸで６日間処置したというわずかな改変を加えて７．１０．５章に記載された手順に従ってアッセイを実施した。実験は、ＰＡＸが受容体の状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、実験は、ＰＡＸ技術を別のＰＲＯＴＡＣ分解性ＦＬＴ３に移すことができることを実証して、ＰＡＸアプローチの多用途性をさらに裏付けた。
ＰＡＸアプローチを別の細胞内標的に拡大するために、ＦＬＴ３分解剤を抗体－ＰＲＯＴＡＣ複合体を使用してＣＤ３３発現性細胞に特異的に送達できるか否かを調査した。したがって、ＣＤ３３陽性ＭＯＬＭ１３およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、７５％のローディングを有するＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＦＬＴ３ｄ１および対照としてＰＲＯＴＡＣであるＦＬＴ３ｄ１単独を用いて処置した（図３８）。ＣＤ３３陽性ＭＯＬＭ１３細胞では、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＦＬＴ３ｄ１について細胞傷害性が観察された。ＣＤ３３受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞では、細胞傷害性は観察されなかった。これは、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５を使用して、ＦＬＴ３分解剤をＣＤ３３陽性細胞に送達できる可能性があることを実証した。細胞をＰＲＯＴＡＣまたはＰＡＸで６日間処置したというわずかな改変を加えて７．１０．５章に記載された手順に従ってアッセイを実施した。実験は、ＰＡＸが受容体の状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、実験は、ＰＡＸ技術を別のＰＲＯＴＡＣ分解性ＦＬＴ３に移すことができることを実証して、ＰＡＸアプローチの多用途性をさらに裏付けた。
【0255】
７．１０．８ ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７のＣＤ３３ｘＭＩＣ５による複合体形成は、細胞での抗体およびＰＲＯＴＡＣの別個の適用によって達成できる
別の実験では、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５の、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７との事前複合体形成が、細胞標的受容体依存性細胞死滅にとって必要であるか否かを調査した。したがって、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５を、ＧＮＥ９８７と３時間複合体形成して、７５％のローディングに到達し、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞に添加した。さらに、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５を前記の細胞に添加し、７５％のローディングが到達されるようにその後、別個にＧＮＥ９８７を添加した。興味深いことに、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＧＮＥ９８７の別個の添加は、同一ローディングを有する事前複合体形成されたＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７ ＰＡＸと同一の結果をもたらした（図３９）。
別の実験では、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５の、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７との事前複合体形成が、細胞標的受容体依存性細胞死滅にとって必要であるか否かを調査した。したがって、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５を、ＧＮＥ９８７と３時間複合体形成して、７５％のローディングに到達し、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞に添加した。さらに、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５を前記の細胞に添加し、７５％のローディングが到達されるようにその後、別個にＧＮＥ９８７を添加した。興味深いことに、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＧＮＥ９８７の別個の添加は、同一ローディングを有する事前複合体形成されたＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７ ＰＡＸと同一の結果をもたらした（図３９）。
【0256】
これらの結果は、ＰＡＸの事前複合体形成が、ＰＡＸによる細胞表面受容体依存性細胞死滅の必要条件ではないことを実証した。
【0257】
７．１０．９ ＰＡＸのＰＲＯＴＡＣローディングを、標的化抗体へ融合されるＶＨＨ ＰＲＯＴＡＣ結合剤の数を増大することによって増大することができる
単一ＰＡＸ分子によって標的細胞中に送達できるＰＲＯＴＡＣの数を増大するために、ＩｇＧを標的化する細胞に付着された、融合されたＰＲＯＡＴＣ結合性ＶＨＨ単位の数を増大した。より詳細には、ＭＩＣ７ ＰＲＯＡＴＣ結合性ＶＨＨを、重鎖、軽鎖のいずれか、または両者の組合せ上のＣＤ３３標的化抗体のＣ末端に異なる数で融合した。抗体断片は、短いリンカーによってＩｇＧ重鎖から、および任意のさらなる断片から離れている。さらなる詳細については、７．９章を参照されたい。次いで、ＶＨＨ断片の、標的化抗体の種々の部位への遺伝的融合が、得られたＰＡＸの効力をどのようにもたらすかを調査した。
単一ＰＡＸ分子によって標的細胞中に送達できるＰＲＯＴＡＣの数を増大するために、ＩｇＧを標的化する細胞に付着された、融合されたＰＲＯＡＴＣ結合性ＶＨＨ単位の数を増大した。より詳細には、ＭＩＣ７ ＰＲＯＡＴＣ結合性ＶＨＨを、重鎖、軽鎖のいずれか、または両者の組合せ上のＣＤ３３標的化抗体のＣ末端に異なる数で融合した。抗体断片は、短いリンカーによってＩｇＧ重鎖から、および任意のさらなる断片から離れている。さらなる詳細については、７．９章を参照されたい。次いで、ＶＨＨ断片の、標的化抗体の種々の部位への遺伝的融合が、得られたＰＡＸの効力をどのようにもたらすかを調査した。
【0258】
表１３に表された複合体形成比の、ＧＮＥ９８７またはＧＮＥ９８７Ｐと複合体形成されたＶＨＨ－抗体融合物を、７．１０．５において記載された細胞生存率アッセイ手順に従って、ＣＤ３３陽性ＭＶ４１１およびＣＤ３３陰性ＲＡＭＯＳ細胞で調査した。ＧＮＥ９８７Ｐとの組合せの場合には、同一抗体は、異なる比率のＧＮＥ９８７Ｐがローディングされ、したがって、処置濃度は、抗体濃度と関連していた。すべての融合物は、細胞表面受容体依存性細胞傷害性を示した。ＧＮＥ９８７Ｐをローディングしている一部のＶＨＨ－抗体融合物でさえ、ＰＲＯＴＡＣ単独と比較して、陽性ＭＶ４１１細胞で増強された効力および受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞で低減された細胞傷害性を示した。これは複雑な特性を有する複数のＰＡＸを生成するこのアプローチの多用途性をさらに実証した。
【0259】
【表13】
【0260】
７．１０．１０ ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７－ＰＲＯＴＡＣ複合体は、ＣＬＬ１媒介性取り込みに依存して選択的細胞傷害性を誘導する
本発明の範囲は、これまでＣＤ３３標的化抗体に制限されており、したがって、ＣＤ３３標的化抗体以外の他の抗体を使用して、ＰＲＯＴＡＣを細胞選択的方法で送達することが可能であるか否かを調査した。
本発明の範囲は、これまでＣＤ３３標的化抗体に制限されており、したがって、ＣＤ３３標的化抗体以外の他の抗体を使用して、ＰＲＯＴＡＣを細胞選択的方法で送達することが可能であるか否かを調査した。
【0261】
ＰＲＯＴＡＣをＣＬＬ１を発現する細胞に標的化するために、ＣＬＬ１結合性抗体およびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＣＬＬ１結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。さらに、ジゴキシゲニン抗体を同じ方法で改変して、アイソタイプ対照を得た。ＣＬＬ１陽性ＭＯＬＭ１３およびＵ９３７細胞ならびにＣＬＬ１陰性Ｋ５６２細胞を、７５％ローディングを有するＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰもしくはＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐまたは対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７Ｐ単独を用いて処置した。アッセイを上記の手順に従って実施した。両ＣＬＬ１陽性細胞株で、ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐについて細胞傷害性が観察されたが、ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐについては、細胞傷害性は観察されなかった（図４０）。これは、ＰＡＸを所望の細胞に標的化することによって受容体陽性細胞における取り込みが媒介されることをやはり実証した。さらに、これは、この技術が、異なる抗体骨格に適用される可能性があることを実証し、このアプローチの多用途性を強調する。
【0262】
追加の実験では、ＣＬＬ１陽性ＭＶ４１１およびＵ９３７またはＣＬＬ１陰性ＲＡＭＯＳおよびＫ５６２細胞を、７５％のローディングを有する、ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰもしくはＣＬＬ１ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１を用いて、または対照としてＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰもしくはＳＩＭ１単独を用いて処置した。上記の手順に従ってアッセイを実施した。ＣＬＬ１ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて、両ＣＬＬ１陽性細胞株で細胞傷害性が観察されたが、ＣＬＬ１陰性Ｋ５６２およびＲＡＭＯＳ細胞では、有意に少ない細胞傷害性が観察された、ないし観察されなかった（図４１）。これは、受容体陽性細胞への取り込みは、所望の細胞にＰＡＸを標的化することによって媒介されるということをやはり実証した。さらに、これは、この技術が異なる抗体骨格に適用され得ることを実証し、本発明の多用途性を裏付けた。さらに、ＰＡＸアプローチを使用して合計３つの異なるＰＲＯＴＡＣが、ＣＬＬ１発現細胞に送達されたので、ＰＲＯＴＡＣの選択は極めて柔軟であるということが実証された。
【0263】
７．１０．１１ Ｂ７Ｈ３ｘＭＩＣ７－ＰＲＯＴＡＣ複合体は、Ｂ７Ｈ３媒介性取り込みに依存して選択的細胞傷害性を誘導する
本発明の範囲をさらに広げるために、Ｂ７Ｈ３標的化抗体を使用して細胞選択的方法でＰＲＯＴＡＣを送達することが可能であるか否かを調査した。ＰＲＯＴＡＣをＢ７Ｈ３を発現する細胞に標的化するために、Ｂ７Ｈ３結合性抗体およびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、Ｂ７Ｈ３結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、Ｂ７Ｈ３ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。Ｂ７Ｈ３陽性ＭＶ４１１、Ｕ９３７およびＭＯＬＭ１３ならびにＢ７Ｈ３陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、７５％のローディングを有するＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰおよびＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１ならびに対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１単独を用いて処置した。上記の手順に従ってアッセイを実施した。すべてのＢ７Ｈ３陽性細胞株で、すべてのＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性が観察された（図４２）。Ｂ７Ｈ３受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞で、すべてのＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性は見出されなかったが、ＰＲＯＴＡＣ単独を用いる処置は、最高であるが細胞種特異的ではない細胞傷害性をもたらした。これは、Ｂ７Ｈ３ｘＭＩＣ７がＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１の受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みは妨げられたことを実証した。実験は、ＰＡＸが受容体の状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性があることを実証して、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
本発明の範囲をさらに広げるために、Ｂ７Ｈ３標的化抗体を使用して細胞選択的方法でＰＲＯＴＡＣを送達することが可能であるか否かを調査した。ＰＲＯＴＡＣをＢ７Ｈ３を発現する細胞に標的化するために、Ｂ７Ｈ３結合性抗体およびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、Ｂ７Ｈ３結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、Ｂ７Ｈ３ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。Ｂ７Ｈ３陽性ＭＶ４１１、Ｕ９３７およびＭＯＬＭ１３ならびにＢ７Ｈ３陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、７５％のローディングを有するＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰおよびＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１ならびに対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１単独を用いて処置した。上記の手順に従ってアッセイを実施した。すべてのＢ７Ｈ３陽性細胞株で、すべてのＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性が観察された（図４２）。Ｂ７Ｈ３受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞で、すべてのＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性は見出されなかったが、ＰＲＯＴＡＣ単独を用いる処置は、最高であるが細胞種特異的ではない細胞傷害性をもたらした。これは、Ｂ７Ｈ３ｘＭＩＣ７がＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１の受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みは妨げられたことを実証した。実験は、ＰＡＸが受容体の状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性があることを実証して、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
【0264】
別の実験では、Ｂ７Ｈ３陽性ＭＶ４１１、Ｕ９３７およびＭＯＬＭ１３ならびにＢ７Ｈ３陰性ＲＡＭＯＳ細胞を、７５％のローディングを有するＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７またはＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７および対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７単独を用いて処置した。アッセイは、上記の手順に従って実施した。すべてのＢ７Ｈ３陽性細胞株で、すべてのＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７構築物について細胞傷害性が観察されたが、アイソタイプ対照ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７について有意に少ない毒性が見出された（図４３）。Ｂ７Ｈ３受容体陰性ＲＡＭＯＳ細胞で、ＰＲＯＴＡＣ単独と比較してＢ７Ｈ３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７について少ない細胞傷害性が見出された。これは、Ｂ７Ｈ３ｘＭＩＣ７がＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１ ＰＲＯＴＡＣの受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞への取り込みを妨げることをさらに実証した。
【0265】
７．１０．１２ ＥＧＦＲｘＭＩＣ７－ＰＲＯＴＡＣ複合体は、ＰＲＯＴＡＣローディング依存性およびＥＧＦＲ媒介性細胞種選択的細胞傷害性を誘導する
ＰＲＯＴＡＣを、ＥＧＦＲを発現する細胞に標的化するために、ＥＧＦＲ結合性抗体セツキシマブおよびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、セツキシマブのＨＣを、リンカー、続いて、ＥＧＦＲｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。さらに、ジゴキシゲニン抗体を、アイソタイプ対照を得るために同一の方法で改変した。ＥＧＦＲ高発現性ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３ならびにＥＧＦＲ低発現性ＨＥＰＧ２を、上記のように５０％のＰＲＯＴＡＣ、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰまたはＳＩＭ１がローディングされたＥＧＦＲｘＭＩＣ７およびＤＩＧｘＭＩＣ７で処置して、それらの構築物の効力を決定した（表１４）。ＰＲＯＴＡＣ単独の効力は、表１４にまとめられている。すべてのＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＰＲＯＴＡＣ組合せがＩＣ５０＞１００ｎＭを有していたが、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７およびＳＩＭ１と組み合わせたＥＧＦＲｘＭＩＣ７は、細胞死滅を誘導し、１桁のｎＭ範囲のＩＣ５０値を有していた。ＥＧＦＲ低発現性ＨＥＰＧ２でのすべてのＰＲＯＴＡＣと組み合わせたＥＧＦＲｘＭＩＣ７の毒性は、ＥＧＦＲ高発現性ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３と比較してすべての構築物について低減した（２桁～３桁のｎＭの範囲）。全体として、ＧＮＥ９８７Ｐ組合せは、不活性であった。この実験は、ＰＡＸがＰＲＯＴＡＣを受容体の状態に応じて標的細胞に送達できることをやはり実証した。
ＰＲＯＴＡＣを、ＥＧＦＲを発現する細胞に標的化するために、ＥＧＦＲ結合性抗体セツキシマブおよびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、セツキシマブのＨＣを、リンカー、続いて、ＥＧＦＲｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。さらに、ジゴキシゲニン抗体を、アイソタイプ対照を得るために同一の方法で改変した。ＥＧＦＲ高発現性ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３ならびにＥＧＦＲ低発現性ＨＥＰＧ２を、上記のように５０％のＰＲＯＴＡＣ、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰまたはＳＩＭ１がローディングされたＥＧＦＲｘＭＩＣ７およびＤＩＧｘＭＩＣ７で処置して、それらの構築物の効力を決定した（表１４）。ＰＲＯＴＡＣ単独の効力は、表１４にまとめられている。すべてのＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＰＲＯＴＡＣ組合せがＩＣ５０＞１００ｎＭを有していたが、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７およびＳＩＭ１と組み合わせたＥＧＦＲｘＭＩＣ７は、細胞死滅を誘導し、１桁のｎＭ範囲のＩＣ５０値を有していた。ＥＧＦＲ低発現性ＨＥＰＧ２でのすべてのＰＲＯＴＡＣと組み合わせたＥＧＦＲｘＭＩＣ７の毒性は、ＥＧＦＲ高発現性ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３と比較してすべての構築物について低減した（２桁～３桁のｎＭの範囲）。全体として、ＧＮＥ９８７Ｐ組合せは、不活性であった。この実験は、ＰＡＸがＰＲＯＴＡＣを受容体の状態に応じて標的細胞に送達できることをやはり実証した。
【0266】
【表14】
【0267】
【表15】
【0268】
別の実験では、ＥＧＦＲｘＭＩＣ７に７５％のローディングで、ＰＲＯＴＡＣであるＡＲＶ７７１、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１を別個にローディングし、変動するＥＧＦＲ発現レベルを有するさまざまな細胞を処置した（表１６）。全体的に、７５％のＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１がローディングしている非結合性対照ＤＩＧｘＭＩＣ７は、同じＰＲＯＴＡＣがローディングしているＥＧＦＲ結合性ＥＧＦＲｘＭＩＣ７ほど強力ではなかった。
【0269】
【表16】
【0270】
結論として、ＰＡＸはまた、ＰＲＯＴＡＣを固形腫瘍細胞に標的化できることが実証された。取り込みはＥＧＦＲ受容体発現レベルに応じて変わり、したがって、ＥＧＦＲｘＭＩＣ７＋ＰＲＯＴＡＣ複合体によるＥＧＦＲの結合を介した活性取り込み、続いて、内部移行およびＰＲＯＴＡＣ放出によって駆動されるということもわかった。有意に少ない細胞傷害性を示した非結合性アイソタイプ対照ＰＡＸを試験することによって、活性ＥＧＦＲ媒介性取り込みによって駆動される細胞選択性も示された。
【0271】
７．１０．１３ ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１とのＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７複合体は、細胞選択的細胞傷害性を示す
ＰＲＯＴＡＣを、ＮＡＰＩ２Ｂを発現する細胞に標的化するために、ＮＡＰＩ２Ｂ結合性抗体ＸＭＴ１５３５およびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＮＡＰＩ２Ｂ結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。ＮＡＰＩ２Ｂ陽性ＯＶＣＡＲ３およびＮＡＰＩ２Ｂ陰性ＳＫＯＶ３細胞を、５０％のローディングを有する、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐ、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１またはＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰまたはＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１ならびに対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１単独を用いて処置した。アッセイは、上記の手順に従って実施した。ＮＡＰＩ２Ｂ陽性ＯＶＣＡＲ３で、すべてのＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性が観察された（図４４）。ＮＡＰＩ２Ｂ受容体陰性ＳＫＯＶ３細胞で、すべてのＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性は見出されなかったが、ＰＲＯＴＡＣ単独を用いる処置は、ＮＡＰＩ２Ｂ受容体発現状態とは独立してすべての細胞株で最高の観察された細胞傷害性をもたらした。これは、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７が、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１の受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みは妨げられたことを実証した。この実験は、ＰＡＸが、受容体状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、この実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性があることを実証して、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
ＰＲＯＴＡＣを、ＮＡＰＩ２Ｂを発現する細胞に標的化するために、ＮＡＰＩ２Ｂ結合性抗体ＸＭＴ１５３５およびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＮＡＰＩ２Ｂ結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。ＮＡＰＩ２Ｂ陽性ＯＶＣＡＲ３およびＮＡＰＩ２Ｂ陰性ＳＫＯＶ３細胞を、５０％のローディングを有する、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐ、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１またはＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ＰまたはＤＩＧｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１ならびに対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１単独を用いて処置した。アッセイは、上記の手順に従って実施した。ＮＡＰＩ２Ｂ陽性ＯＶＣＡＲ３で、すべてのＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性が観察された（図４４）。ＮＡＰＩ２Ｂ受容体陰性ＳＫＯＶ３細胞で、すべてのＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性は見出されなかったが、ＰＲＯＴＡＣ単独を用いる処置は、ＮＡＰＩ２Ｂ受容体発現状態とは独立してすべての細胞株で最高の観察された細胞傷害性をもたらした。これは、ＮＡＰＩ２ＢｘＭＩＣ７が、ＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１の受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みは妨げられたことを実証した。この実験は、ＰＡＸが、受容体状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、この実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性があることを実証して、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
【0272】
７．１０．１４ ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１と組み合わせたＨＥＲ２ｘＭＩＣ７は、ＨＥＲ２依存性細胞傷害性を示す
ＰＲＯＴＡＣを、ＨＥＲ２を発現する細胞に標的化するために、ＨＥＲ２結合性抗体トラスツズマブおよびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＨＥＲ２結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＨＥＲ２ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ３およびＮＣＩＮ８７細胞およびＨＥＲ２陰性ＭＤＡＭＢ４６８細胞を、７５％のローディングを有するＨＥＲ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＨＥＲ２ＢｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐ、ＨＥＲ２ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１ならびに対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１単独を用いて処置した。アッセイは、上記の手順に従って実施した。ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ３およびＮＣＩＮ８７で、すべてのＨＥＲ２ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性が観察された（表１７）。ＨＥＲ２受容体陰性ＭＤＡＭＢ４６８細胞では、すべてのＨＥＲ２ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性は見出されなかったが、ＰＲＯＴＡＣ単独を用いる処置は、ＨＥＲ２受容体発現状態とは独立にすべての細胞株で明白な細胞傷害性をもたらした。これは、ＨＥＲ２ｘＭＩＣ７が、受容体陽性細胞へのＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１の取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みは妨げられたことを実証した。この実験は、ＰＡＸが、受容体発現状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性を実証し、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
ＰＲＯＴＡＣを、ＨＥＲ２を発現する細胞に標的化するために、ＨＥＲ２結合性抗体トラスツズマブおよびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＨＥＲ２結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＨＥＲ２ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ３およびＮＣＩＮ８７細胞およびＨＥＲ２陰性ＭＤＡＭＢ４６８細胞を、７５％のローディングを有するＨＥＲ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＨＥＲ２ＢｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７Ｐ、ＨＥＲ２ｘＭＩＣ７＋ＳＩＭ１ならびに対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１単独を用いて処置した。アッセイは、上記の手順に従って実施した。ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ３およびＮＣＩＮ８７で、すべてのＨＥＲ２ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性が観察された（表１７）。ＨＥＲ２受容体陰性ＭＤＡＭＢ４６８細胞では、すべてのＨＥＲ２ｘＭＩＣ７ ＰＲＯＴＡＣ組合せについて細胞傷害性は見出されなかったが、ＰＲＯＴＡＣ単独を用いる処置は、ＨＥＲ２受容体発現状態とは独立にすべての細胞株で明白な細胞傷害性をもたらした。これは、ＨＥＲ２ｘＭＩＣ７が、受容体陽性細胞へのＧＮＥ９８７、ＧＮＥ９８７ＰおよびＳＩＭ１の取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みは妨げられたことを実証した。この実験は、ＰＡＸが、受容体発現状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性を実証し、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
【0273】
【表17】
【0274】
７．１０．１５ ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７はＴＲＯＰ２依存性細胞傷害性を媒介する
本発明の範囲をさらに広げるために、ＴＲＯＰ２標的化抗体を使用して細胞選択的方法でＰＲＯＴＡＣを送達することが可能であるか否かを調査した。ＰＲＯＴＡＣを、ＴＲＯＰ２を発現する細胞に標的化するために、ＴＲＯＰ２結合性抗体サシツズマブおよびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＴＲＯＰ２結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。ＴＲＯＰ２陽性Ａ４３１、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡＭＢ４６８、ＮＣＩＮ８７、ＳＫＯＶ３細胞およびＴＲＯＰ２陰性ＳＷ６２０細胞を、７５％のローディングを有するＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７または対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７単独を用いて処置した。アッセイは、７．１０．５章に記載される手順に従って実施した。すべてのＴＲＯＰ２陽性Ａ４３１、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡＭＢ４６８、ＮＣＩＮ８７およびＳＫＯＶ３細胞で、ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７について細胞傷害性が観察された（表１８）。低減した細胞傷害性が、ＧＮＥ９８７単独と比較してＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７についてＴＲＯＰ２陰性ＳＷ６２０細胞で見出された。これらの結果は、ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７がＧＮＥ９８７の受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みが低減されたことを実証した。この実験は、ＰＡＸが、受容体発現状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、この実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性があることを実証して、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
本発明の範囲をさらに広げるために、ＴＲＯＰ２標的化抗体を使用して細胞選択的方法でＰＲＯＴＡＣを送達することが可能であるか否かを調査した。ＰＲＯＴＡＣを、ＴＲＯＰ２を発現する細胞に標的化するために、ＴＲＯＰ２結合性抗体サシツズマブおよびＰＲＯＴＡＣ結合性クローンＭＩＣ７を使用して融合タンパク質を構築した。したがって、ＴＲＯＰ２結合性抗体のＨＣを、リンカー、続いて、ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７をもたらすＭＩＣ７の配列によってＣ末端に伸長した。ＴＲＯＰ２陽性Ａ４３１、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡＭＢ４６８、ＮＣＩＮ８７、ＳＫＯＶ３細胞およびＴＲＯＰ２陰性ＳＷ６２０細胞を、７５％のローディングを有するＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７または対照としてＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７単独を用いて処置した。アッセイは、７．１０．５章に記載される手順に従って実施した。すべてのＴＲＯＰ２陽性Ａ４３１、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡＭＢ４６８、ＮＣＩＮ８７およびＳＫＯＶ３細胞で、ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７について細胞傷害性が観察された（表１８）。低減した細胞傷害性が、ＧＮＥ９８７単独と比較してＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７についてＴＲＯＰ２陰性ＳＷ６２０細胞で見出された。これらの結果は、ＴＲＯＰ２ｘＭＩＣ７がＧＮＥ９８７の受容体陽性細胞への取り込みを媒介したが、受容体陰性細胞へのその取り込みが低減されたことを実証した。この実験は、ＰＡＸが、受容体発現状態に応じてＰＲＯＴＡＣを標的細胞に送達できることをやはり実証した。さらに、この実験は、ＰＡＸ技術を別の抗体骨格に移すことができる可能性があることを実証して、このアプローチの多用途性をさらに強調した。
【0275】
【表18】
【0276】
７．１０．１６ ＰＡＸおよびＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣの同等の細胞傷害性
ＰＡＸ技術が、共有結合によって連結されたＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣに匹敵する程度を理解するために、７．５．１章に記載されたＥＧＦＲ－ＩｇＧ１－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ（ＤＡＲ １．６２）を、ＥＧＦＲ陽性ＭＤＡＭＢ４６８およびＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２細胞で５０％のＧＮＥ９８７がローディングされたＥＧＦＲｘＭＩＣ５と一緒に調査した。より良好な比較のために、処置濃度を、抗体濃度と関連付けた。両構築物がＭＤＡＭＢ４６８細胞で同一効力を有し、ＨＥＰＧ２細胞に対して少ないが同等の細胞傷害性効果を示したことが観察された（図４５）。これは、ＰＲＯＴＡＣは非共有結合によって会合されるだけであるが、ＰＡＸは、共有結合ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣの効果と同等の選択的細胞死滅を可能にできることを実証した。さらにこの効果は、ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣと比較して低いＤＡＲで達成できる。
ＰＡＸ技術が、共有結合によって連結されたＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣに匹敵する程度を理解するために、７．５．１章に記載されたＥＧＦＲ－ＩｇＧ１－Ｌ３２８Ｃ－ＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣ（ＤＡＲ １．６２）を、ＥＧＦＲ陽性ＭＤＡＭＢ４６８およびＥＧＦＲ陰性ＨＥＰＧ２細胞で５０％のＧＮＥ９８７がローディングされたＥＧＦＲｘＭＩＣ５と一緒に調査した。より良好な比較のために、処置濃度を、抗体濃度と関連付けた。両構築物がＭＤＡＭＢ４６８細胞で同一効力を有し、ＨＥＰＧ２細胞に対して少ないが同等の細胞傷害性効果を示したことが観察された（図４５）。これは、ＰＲＯＴＡＣは非共有結合によって会合されるだけであるが、ＰＡＸは、共有結合ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣの効果と同等の選択的細胞死滅を可能にできることを実証した。さらにこの効果は、ＰＲＯＴＡＣ－ＡＤＣと比較して低いＤＡＲで達成できる。
【0277】
７．１１ ＰＲＯＴＡＣの抗ＰＲＯＴＡＣ抗体との複合体形成は、薬物動態プロファイルを有意に改善できる
ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７のＰＲＯＴＡＣ結合性抗体ＭＩＣ２との複合体形成が、ＰＲＯＴＡＣの全体的な薬物動態プロファイルに影響を及ぼすか否かおよびどの程度であるかを調査した。したがって、薬物動態研究を以下の通りに実施した。
ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７のＰＲＯＴＡＣ結合性抗体ＭＩＣ２との複合体形成が、ＰＲＯＴＡＣの全体的な薬物動態プロファイルに影響を及ぼすか否かおよびどの程度であるかを調査した。したがって、薬物動態研究を以下の通りに実施した。
【0278】
雌のＳＣＩＤベージュ（ｎ＝９、複合プロファイル）に、水中、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／２０％（ｖ／ｖ）（ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン）クレプトース（Ｋｌｅｐｔｏｓｅ）中、０．４ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＴＡＣ単独（ＧＮＥ９８７）の単回尾静脈静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射を５ｍＬ／ｋｇの投薬容量で与えた。ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７（１：２の抗体薬物比）については、雌のＳＣＩＤベージュ（ｎ＝１２、複合プロファイル）に、ＰＢＳ中、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の０．４ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７および３０ｍｇ／ｋｇのＭＩＣ２の等価用量でＰＲＯＴＡＣシャトルの単回尾静脈静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射を５ｍＬ／ｋｇの投薬容量で与えた。
【0279】
ＰＲＯＴＡＣ単独については、舌下でイソフルラン麻酔下で、抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（Ｋ３－ＥＤＴＡ）を用いて、ｉ．ｖ．投与の０．１（Ｇ（群）１）、０．５（Ｇ２）、１（Ｇ３）、２（Ｇ１）、４（Ｇ３）、６（Ｇ２）および２４時間（Ｇ３）後に連続血液試料を採取し（ｎ＝３）、さらに処理して血漿を得た。
【0280】
ＭＩＣ２＋ＧＮＥ９８７については、上記のように、ｉ．ｖ．投与の０．１（Ｇ（群）１）、０．５（Ｇ２）、１（Ｇ３）、２（Ｇ４）、６（Ｇ２）、２４時間（Ｇ１、Ｇ３）、３０（Ｇ３）、４８（Ｇ３、Ｇ４））、７２（Ｇ１、Ｇ２）および９６時間（Ｇ２）後に連続血液試料を採取し（ｎ＝３）、さらに処理して血漿を得た。
【0281】
試料調製のために、ＬｏｗＢｉｎｄ（タンパク質）プレート中で、１０μＬの血漿を１０μＬのメタノールで希釈し、８０μＬのラベタロールｓの内部標準（２．５μｇ／ｍＬ）を含有するアセトニトリルを用いて沈殿させた。１分間振盪／ボルテックス処理した後、試料を濾過し（ポリプロピレンフィルター、０．４５μｍの孔径でのＣａｐｔｉｖａ濾過）、濾液に１２０μＬのメタノール：水（１：１、ｖ／ｖ）を添加し、分析まで４℃で保存し、注射の前にオートサンプラーに入れた。分析はＱＴＲＡＰ ６５００＋（Ｓｃｉｅｘ）質量分析計と連結されたＵＰＬＣからなるＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムで実施した。移動相Ａは、０．１％ギ酸を有する水とし、移動相Ｂは、０．１％ギ酸を有するメタノールとした。１０％のＢで勾配を開始し、１．５分で９５％のＢとし、９５％のＢで２分間維持し、次いで、０．５分で１０％のＢまで低下させ、１０％のＢで２分間維持した。クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８カラム、２．７μｍ粒子、３×５０ｍｍで実施した。流速は、０．６ｍＬ／分とし、サイクル時間（注射から注射）は、およそ６分とした。試料注射容量は、１０μＬとした。ＧＮＥ９８７のＭＲＭ遷移は、ラベタロール（ＩＳ）について、５４８．７８８（ｍ／ｚ、ｚ＝２）→７７９．２（ｍ／ｚ、ｚ＝１）および３２９．１０１（ｍ／ｚ、ｚ＝１）→９１（ｍ／ｚ、ｚ＝１）であった。定量化のための較正曲線は、０．５（定量化の下限）～１００００（定量化の上限）ｎｇ／ｍＬの範囲の標準に基づいており、最小５つの較正点を有し、較正標準の最小７５％がその公称値の±２０％以内であるようにした。
【0282】
総抗体濃度は、メソスケール診断技術（ＭＳＤ、ＬＬＣ．、メリーランド州、ロックビル）に基づくリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）によって決定した。すべてのインキュベーションステップは、２２℃で穏やかに撹拌しながら実施した。すべての洗浄ステップ（２００μＬ／ウェル）は、ＰＢＳ ｐＨ７．４および０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ－Ｔで、プレートウォッシャーＥＬｘ４０５（ＢｉｏＴｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、バーモント州、ウィヌースキ）を使用して実施した。第１に、２．５μｇ／ｍＬのビオチン－ＳＰがコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃｙ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ＪＩＲ、ケンブリッジシャー、英国、１０９－０６５－０９８番）を、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６ウェルストレプトアビジンＱＵＩＣＫＰＬＥＸプレート（ＭＳＤ、Ｌ５５ＳＡ番）上に２時間コーティングした。その後、プレートを３回洗浄した。血漿試料、標準および品質対照を、ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０および３．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡからなる希釈緩衝液で段階希釈し、プレート上で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、製造手順に従って、ＭＳＤ ＧＯＬＧ ＳＵＬＦＯ－タグ（ＭＳＤ、Ｒ３１ＡＡ－１番）で事前に標識された、０．６μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（ＪＩＲ、２０９－００５－０９７番）とともに１時間インキュベートした。最終洗浄ステップの後、各ウェルに１５０μＬの、界面活性剤（ＭＳＤ、Ｒ９２ＴＣ番）を有する２ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを添加し、プレートをＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ１２０プレートリーダー（ＭＳＤ）で読み取った。Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（バージョン７．５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用し、５ＰＬ（Ｍａｒｑｕａｒｔ）方程式、重み係数１／Ｙ２で標準曲線をフィッティングして、血漿試料の総ｍＡｂ濃度を算出した。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、５０ｎｇ／ｍＬであった。
【0283】
ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７の半減期は、文献で報告された半減期（２．８時間、Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25）と同一範囲内である５．８時間であると決定された。ＭＩＣ２による、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７の複合体形成は、マウスにおいて１４．７時間の、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７の半減期につながり、これは、２．５倍の半減期改善に相当する。
【0284】
さらに、１００％の理論上のローディングを有するＰＡＸ ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７およびＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７を作製し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｔａｌｉａ、イタリア、カルコによって提供されたＣ５７ＢＬ／６Ｎ近交系マウス（各群についてＮ＝２の雄および雌）において実施されたＰＫ研究において調査した。７～８週齢のマウスに、３０ｍｇ／ｋｇ（０．３８ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＴＡＣに相当する）のＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７およびＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７、ＣＤ３３抗体単独、ＣＤ３３ｘＭＩＣ５またはＣＤ３３ｘＭＩＣ７を、尾静脈中に静脈内注射された単回用量として与えた。マイクロサンプリング技術を使用してすべての動物から試料を連続的に収集した（各採血について２０ｍＬ）。投与後、１日目に２つの血液試料を採取し、後の３週間の間に７つを採取した。各試料を予冷した（０～４℃）Ｍｉｎｉｖｅｔｔｅ ＰＯＣＴ ＥＤＴＡチューブ中に収集し、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００ ＥＤＴＡ中に移し、４℃で２５００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた血漿を新たなバイアル中に移し、さらなる分析まで－８０℃で直ちに保存した。ＰＫ研究、動物取り扱いおよび実験法は、イタリアのＤ．Ｌｖｏ． ２０１４／２６および指令２０１０／６３／ＥＵに従って実施した。研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｈｅ Ａｎｔｏｉｎｅ Ｍａｒｘｅｒ、イタリア、コッレレット・ジャコーザで実施した。この研究所はイタリア保健省から完全に認可されている。
【0285】
総抗体濃度は、メソスケール診断技術（ＭＳＤ、ＬＬＣ．、メリーランド州、ロックビル）に基づくリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）によって決定した。すべてのインキュベーションステップは、２２℃で穏やかに撹拌しながら実施した。すべての洗浄ステップ（２００μＬ／ウェル）は、ＰＢＳ ｐＨ７．４および０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ－Ｔで、プレートウォッシャーＥＬｘ４０５（ＢｉｏＴｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、バーモント州、ウィヌースキ）を使用して実施した。第１に、２．５μｇ／ｍＬのビオチン－ＳＰがコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃｙ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ＪＩＲ、ケンブリッジシャー、英国、１０９－０６５－０９８番）を、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６ウェルストレプトアビジンＱＵＩＣＫＰＬＥＸプレート（ＭＳＤ、Ｌ５５ＳＡ番）上に２時間コーティングした。その後、プレートを３回洗浄した。血漿試料、標準および品質対照を、ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０および３．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡからなる希釈緩衝液で段階希釈し、プレート上で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、製造手順に従ってＭＳＤ ＧＯＬＧ ＳＵＬＦＯ－タグ（ＭＳＤ、Ｒ３１ＡＡ－１番）で事前に標識された、０．６μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（ＪＩＲ、２０９－００５－０９７番）とともに１時間インキュベートした。最終洗浄ステップの後、各ウェルに１５０μＬの、界面活性剤（ＭＳＤ、Ｒ９２ＴＣ番）を有する２ｘ ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを添加し、プレートをＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ１２０プレートリーダー（ＭＳＤ）で読み取った。Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（バージョン７．５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用し、５ＰＬ（Ｍａｒｑｕａｒｔ）方程式、重み係数１／Ｙ２で標準曲線をフィッティングして、血漿試料の総ｍＡｂ濃度を算出した。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、５０ｎｇ／ｍＬであった。
【0286】
ＭＳＣ２７３４２４２の濃度は、ポジティブモダリティでＴｕｒｂｏイオンスプレー源（ＩＴＳ）を備えたＳＣＩＥＸ ５５００三連四重極型（ＳＣＩＥＸ、米国、カリフォルニア州、レッドウッドシティ）を使用して液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定した。クロマトグラフィー分離は、１００μＬの拡張ループで構成されたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ Ｉ－クラスＵＰＬＣシステム（米国、マサチューセッツ州、ミルフォード）に取り付けられたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ（Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ）カラムを使用して達成した。流速０．３５０ｍＬ／分で、相Ａ（Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ ９５：５、０．１％ギ酸）およびＢ（ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ ９５：５、０．１％ギ酸）について使用したクロマトグラフィー勾配は、０．２５分の１００％のＡの均一濃度、続いて、１００％のＢまで２．２５分の勾配および１００％のＢでのその後の０．７５分の洗浄ステップおよび初期条件で２．５分の再調整であった。
【0287】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス血漿試料からのＭＳＣ２７３４２４２の抽出は、タンパク質沈殿技術によって実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｍｐａｃｔタンパク質沈殿プレート（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、米国、カリフォルニア州、トーランス、ＣＥ０－７５６５）上で、３μＬの血漿試料を、内部標準として使用される５０ｎｇ／ｍＬのＭＳＣ２７３７５００を含有する１００μＬのアセトニトリル中で沈殿させた。５分振盪（９００ｒｐｍ）した後、真空によってすべてのウェルを濾過し、清潔な９６ウェルプレート中に収集し、次いで、１００μＬの２．５％ギ酸を含有する水溶液を用いて希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に提供した。すべての試薬は、ＬＣ－ＭＳ等級または等価物であった。
【0288】
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（バージョン７．５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、線形回帰、重み係数１／Ｘ２で、面積比（分析物シグナル／内部標準シグナル）で標準曲線をフィッティングして、血漿試料の総ＭＳＣ２７３４２４２濃度を算出した。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、５ｎｇ／ｍＬであり、定量化の完全範囲は、５～２０００ｎｇ／ｍＬであった。
【0289】
主要ＰＫパラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン８．３．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）を使用する非コンパートメント分析（ＮＣＡ）によって推定した。薬物動態パラメータは、投与後時間に対する総抗体およびＭＳＣ２７３４２４２分析物の個々の血漿中濃度から取得または算出した。
【0290】
パラメータ推定のために個々の血漿中濃度－時間プロファイルを使用した。定量化限界未満（ＢＱＬ）で算出されたすべてのＰＫ試料の濃度は、ＡＵＣ０－ｉｎｆ、クリアランス、および分布容積をより良好に推定するために欠損値と考えた。終末半減期（ｔ１／２）およびλｚ（曲線の終末対数－線形部分と関連する一次速度定数）の値は、線形回帰の終末相において少なくとも３つの時点が定量可能であった場合にのみ算出された。ＢＱＬ未満の値は、記述統計学のために０ｎｇ／ｍＬと考えた。全体に、ＧＮＥ９８７のＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＣＤ３３ｘＭＩＣ７のいずれかとの複合体形成は、マウスにおけるＰＲＯＴＡＣの有意に長い半減期につながり、それぞれ２９．６時間および１０５時間であった（図４７）。印象的なことに、ＧＮＥ９８７の濃度は、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７を与えられた群において２１日（５０４時間）後でさえマウス血漿における平均で依然として６９ｎｇ／ｍＬであったが、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７濃度は、２５時間後にはＬＬＯＱ未満にすでに低下した。この結果は、抗体－複合体形成が、例えば、ＰＲＯＴＡＣの抗体との複合体形成によってＰＲＯＴＡＣに対する腫瘍細胞の曝露を強力に増大する可能性があることを例証する。
【0291】
結論を導き出すためにＰＫ研究の抗体クリアランスを比較して、ＶＨＨ融合物の作製およびそれぞれの融合タンパク質の、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７でのローディングが、クリアランス速度を変更したか否かを結論付けた（図４８）。未改変ＣＤ３３抗体ならびに同抗体のＶＨＬ－ＰＲＯＴＡＣ結合性ＶＨＨ ＭＩＣ５およびＭＩＣ７との融合物（ＣＤ３３ｘＭＩＣ５／７）のクリアランスは同様であり、これが示唆するものは、クリアランスに対するＶＨＨ融合物のわずかな影響である。さらに、抗体－ＶＨＨ融合タンパク質ＣＤ３３ｘＭＩＣ５およびＣＤ３３ｘＭＩＣ７の、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７でのローディングは、抗体クリアランスに影響を及ぼさなかった。結論として、ＶＨＬ－ＰＲＯＴＡＣ結合性ＶＨＨの付加およびＰＲＯＴＡＣとの複合体形成は、ＰＫプロファイルに影響を及ぼさなかった。
【0292】
後者の研究の薬物動態パラメータは、表１９にまとめられている。
【0293】
【表19】
【0294】
７．１２ ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７ ＰＲＯＴＡＣ－抗体複合体は、ＭＶ４１１マウス異種移植モデルにおいて有効である
ヒト白血病ＭＶ４１１細胞を、免疫不全マウスに異種移植した。３００万個のＭＶ４１１細胞を未処置の雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの左側腹部に皮下注射した。種々の処置群における動物の無作為化および処置の開始は、平均腫瘍サイズが４５ｍｍ２に到達した後に開始した。対照群は媒体で処置した。試験群は、０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７および３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）を用いて１回（１日目）処置した。さらに、２つの群は、１日目での３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）、続いて、８日目での０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７での処置または１および８日目での０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７のいずれかで２回処置した。さらに、１つの群には、３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）を１回（１日目）与え、別の群には、抗体対照３０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＴＡＣを伴わないＣＤ３３ｘＭＩＣ７を１回与えた（１日目）。個々の群を、腫瘍が最大腫瘍サイズ（２２５ｍｍ２）に到達する前に停止させた（図４９）。
ヒト白血病ＭＶ４１１細胞を、免疫不全マウスに異種移植した。３００万個のＭＶ４１１細胞を未処置の雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの左側腹部に皮下注射した。種々の処置群における動物の無作為化および処置の開始は、平均腫瘍サイズが４５ｍｍ２に到達した後に開始した。対照群は媒体で処置した。試験群は、０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７および３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）を用いて１回（１日目）処置した。さらに、２つの群は、１日目での３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）、続いて、８日目での０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７での処置または１および８日目での０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７のいずれかで２回処置した。さらに、１つの群には、３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）を１回（１日目）与え、別の群には、抗体対照３０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯＴＡＣを伴わないＣＤ３３ｘＭＩＣ７を１回与えた（１日目）。個々の群を、腫瘍が最大腫瘍サイズ（２２５ｍｍ２）に到達する前に停止させた（図４９）。
【0295】
抗体単独は、媒体対照に対して有意な関連効果を有さなかったが、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７は抗腫瘍効果を誘導した。しかし、約４日目に、腫瘍は、再度進行し始め、媒体対照と同じ成長速度を示した。１および８日目にＧＮＥ９８７を投薬した群では、ＧＮＥ９８７の再投薬は、再投薬後約３日目まで抗増殖性効果を再度誘導し、これでは、腫瘍は再度増殖を開始した。ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７の単回用量は、１５日目まで腫瘍増殖阻害につながり、その後、腫瘍が進行した。１日目に３０ｍｇ／ｋｇのＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７（０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７がローディングされた）を用いて、続いて、８日目に０．３８ｍｇ／ｋｇのＧＮＥ９８７での処置が投薬された群では、再投薬は、約２３日までの持続性腫瘍増殖阻害につながった。ＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７を用いる処置は、媒体と比較して腫瘍増殖遅延を誘導したが、効果はＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７と比較してかなり明白ではなかった。
【0296】
全体として、ＧＮＥ９８７がローディングされたＣＤ３３ｘＭＩＣ７の抗腫瘍効果は、同等のＰＲＯＴＡＣ用量でＰＲＯＴＡＣ単独よりも優れていた。興味深いことに、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７の抗腫瘍効果は、８日目にＧＮＥ９８７を単純に再投薬することによってさらに増強できる可能性がある。これは、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７を与えた群へのＧＮＥ９８７単独のさらなる投薬の明確な利益があることおよびＣＤ３３ｘＭＩＣ７が血清から、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７を捕捉し、それを腫瘍部位で蓄積する可能性があることを実証する。これらの結果は、腫瘍特異的抗原に、ならびにＰＲＯＴＡＣに結合する二重特異性抗体の投与、続いて、複合体形成されていないＰＲＯＴＡＣ（例えば、経口適用可能なもの）の投与によって腫瘍を事前標的化する道を開く。このアプローチを用いると、ｅｘ ｖｉｖｏでＰＡＸを事前に製造する必要なく、所望の組織に別個に投与されたＰＲＯＴＡＣを標的化できる。
【0297】
抗ＰＲＯＴＡＣクローンＭＩＣ５およびＭＩＣ７を比較すると、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７＋ＧＮＥ９８７がＣＤ３３ｘＭＩＣ５＋ＧＮＥ９８７よりも強力な抗腫瘍効果を誘導することが明らかになる。ＣＤ３３の結合は、ＣＤ３３ｘＭＩＣ７を用いる処置によって実証されるように腫瘍増殖に影響を及ぼさず、これは、抗腫瘍効果がＣＤ３３ｘＭＩＣ７に、ＰＲＯＴＡＣであるＧＮＥ９８７をローディングすることによって駆動されることを裏付ける。
【0298】
８ まとめ
本発明は、非共有結合ＰＲＯＴＡＣ抗体複合体（ＰＡＸ）によるＰＲＯＴＡＣの標的化送達を可能にする前例のない送達技術を開示する。ＰＡＸ技術は、活性原薬が普通ハプテンで改変される、非共有結合薬物送達の分野における他の方法とは異なり、未改変活性ＰＲＯＴＡＣの標的化送達を可能にすることに留意することが重要である。この発明は、その細胞表面受容体発現に応じたＰＲＯＴＡＣの複数の細胞種への送達を包含する。それらの受容体として、それだけには限らないが、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＴＲＯＰ２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＮＡＰＩ２ＢおよびＢ７Ｈ３が挙げられる。ＰＲＯＴＡＣに関して、本発明の多用途性は、さまざまな構造的に異なるＰＲＯＴＡＣ（ＧＮＥ９８７、ＡＲＶ７７１、ＳＩＭ１、ＧＮＥ９８７Ｐ、ＳＩＭ１およびＦＬＴ３ｄ１）の選択的送達によって実証される。また、プラットフォームは、モジュラー抗体操作戦略を活用することによって１つの抗体を使用して最大１２のＰＲＯＴＡＣ分子を送達する可能性を提供するということも実証された。さらに、本発明は、抗体－複合体形成が、ＰＲＯＴＡＣに対する標的細胞の曝露を有意に改善できることを実証する。最後に、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデルにおいてＰＡＸ技術を検証できた。表２０は概要を示す。
本発明は、非共有結合ＰＲＯＴＡＣ抗体複合体（ＰＡＸ）によるＰＲＯＴＡＣの標的化送達を可能にする前例のない送達技術を開示する。ＰＡＸ技術は、活性原薬が普通ハプテンで改変される、非共有結合薬物送達の分野における他の方法とは異なり、未改変活性ＰＲＯＴＡＣの標的化送達を可能にすることに留意することが重要である。この発明は、その細胞表面受容体発現に応じたＰＲＯＴＡＣの複数の細胞種への送達を包含する。それらの受容体として、それだけには限らないが、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＴＲＯＰ２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＮＡＰＩ２ＢおよびＢ７Ｈ３が挙げられる。ＰＲＯＴＡＣに関して、本発明の多用途性は、さまざまな構造的に異なるＰＲＯＴＡＣ（ＧＮＥ９８７、ＡＲＶ７７１、ＳＩＭ１、ＧＮＥ９８７Ｐ、ＳＩＭ１およびＦＬＴ３ｄ１）の選択的送達によって実証される。また、プラットフォームは、モジュラー抗体操作戦略を活用することによって１つの抗体を使用して最大１２のＰＲＯＴＡＣ分子を送達する可能性を提供するということも実証された。さらに、本発明は、抗体－複合体形成が、ＰＲＯＴＡＣに対する標的細胞の曝露を有意に改善できることを実証する。最後に、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデルにおいてＰＡＸ技術を検証できた。表２０は概要を示す。
【0299】
【表20】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50-1】
【図50-2】
【図50-3】
【図50-4】
【図50-5】
【図51】
【国際調査報告】