特表 2024-527252 発現の増加した組み換えＦＶＩＩＩバリアントをコードするウイルスベクターを用いた、血友病Ａの遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】発現の増加した組み換えＦＶＩＩＩバリアントをコードするウイルスベクターを用いた、血友病Ａの遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240717BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240717BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240717BHJP

   G01N 33/86 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240717BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20240717BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20240717BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P7/04 ZNA

A61K35/76

A61P43/00 112

A61K31/573

G01N33/86

C12N15/12

C12N15/864 100Z

C12N7/01

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023576332

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 IB2022055518

(87)【国際公開番号】W WO2022264040

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/210,386

(32)【優先日】2021-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ロッテンシュタイナー ハンスペーター

【テーマコード（参考）】

2G045

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

2G045AA10

2G045AA25

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA16

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA10

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA16

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA10

4C086ZA53

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA16

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA10

4C087NA14

4C087ZA53

4C087ZC75

(57)【要約】

本開示は、数ある態様の中でも、哺乳動物細胞内での発現用に、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物の遺伝子療法用ベクター及び血友病Ａを治療するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、血友病Ａ患者に、ポリヌクレオチド、例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドを投与する方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血友病Ａを治療するための方法であって、血友病Ａと診断されたヒト対象に、前記ヒト対象の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を静脈内注入することを含み、
前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記方法。

【請求項2】

血友病Ａを治療するための方法であって、血友病Ａと診断されたヒト対象に、前記ヒト対象の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を静脈内注入することを含み、
前記ＡＡＶ粒子が、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記方法。

【請求項3】

前記血友病Ａと診断されたヒト対象に、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＡＡＶ粒子の注入後に、前記１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することが、
前記ＡＡＶ粒子の注入直後の１週間目に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり６０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ＡＡＶ粒子の注入直後の２週間目に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり４０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ＡＡＶ粒子の注入直後の３週間目に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり３０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
を含む、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＡＡＶ粒子の注入直後の３週間目の後に、漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することが、
最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの完了直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり２０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを２０ｍｇ投与した前記５日間の直後の３日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１５ｍｇ投与した前記３日間の直後の３日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１０ｍｇ投与した前記３日間の直後の３日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することが、
最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの完了直後の７日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり３０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを３０ｍｇ投与した前記７日間の直後の７日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり２０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを２０ｍｇ投与した前記７日間の直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１５ｍｇ投与した前記５日間の直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１０ｍｇ投与した前記５日間の直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

血友病Ａと診断されたヒト対象に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与した後、かつ、前記ヒト対象に、最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療を行っている最中に、前記ヒト対象から採取した血液試料中の、第１のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性を求めることと、
前記最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療の完了後に、前記ヒト対象から採取した血液試料中の、第２のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性を求めることと、
前記第２のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性を前記第１のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性と比較することと、
漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与することであって、
前記第２のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性が、前記第１のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性よりも低くないときには、第１の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを、３週間以内の期間にわたり投与し、
前記第２のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性が、前記第１のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性よりも低いときには、第２の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを、３週間を超える期間にわたり投与する、前記投与することと、
を含む、方法。

【請求項10】

血友病Ａと診断されたヒト対象に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与する前に、前記ヒト対象から採取した血液試料中の、第１のレベルの肝臓酵素活性を求めることと、
第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を前記ヒトに投与した後、かつ最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療を完了した後に、前記ヒト対象から採取した血液試料中の、第２のレベルの肝臓酵素活性を求めることと、
前記第２のレベルの肝臓酵素活性を前記第１のレベルの肝臓酵素活性と比較することと、
漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与することであって、
前記第２のレベルの肝臓酵素活性が、前記第１のレベルの肝臓酵素活性よりも高くないときには、第１の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを、３週間以内の期間にわたり投与し、
前記第２のレベルの肝臓酵素活性が、前記第１のレベルの第ＶＩＩＩ因子活性よりも高いときには、第２の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを、３週間を超える期間にわたり投与する、前記投与することと、
を含む、方法。

【請求項11】

前記第１の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与することが、
前記最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療の完了直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり２０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象にプレドニゾロンまたはプレドニゾンを２０ｍｇ投与した前記５日間の直後の３日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１５ｍｇ投与した前記３日間の直後の３日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１０ｍｇ投与した前記３日間の直後の３日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
含む、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第２の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与することが、
前記最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療の完了直後の７日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり３０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを３０ｍｇ投与した前記７日間の直後の７日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり２０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを２０ｍｇ投与した前記７日間の直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１５ｍｇ投与した前記５日間の直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり１０ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
前記ヒト対象に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１０ｍｇ投与した前記５日間の直後の５日間連続で、プレドニゾロンまたはプレドニゾンを１日当たり５ｍｇ、前記ヒト対象に投与することと、
を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を用いた血友病Ａの第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法の有効性を、モニタリングするための方法であって、
前記ＡＡＶ粒子をヒト対象に投与した後に、前記ヒト対象から採取した血液試料中に、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体が存在するかどうかを判断することと、
前記ヒト対象の血液中に、第ＶＩＩＩ因子阻害物質の存在が検出されたら、血友病Ａを治療するための代替薬を前記ヒト対象に投与することと、
を含む、前記方法。

【請求項14】

前記代替薬が、化学修飾されたヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記代替薬が、ブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記代替薬が、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を含む第ＶＩＩＩ因子バイパス治療剤である、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の、配列番号１またはその断片のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項18】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の、配列番号１またはその断片のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項19】

ａ）血友病Ａ患者に、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項20】

前記それよりも後の時点が、７日である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記それよりも後の時点が、１４日である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記それよりも後の時点が、２１日である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の前記カプシドタンパク質のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項24】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の前記カプシドタンパク質のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項25】

ａ）血友病Ａ患者に、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の前記カプシドタンパク質のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項26】

前記それよりも後の時点が、７日である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記それよりも後の時点が、１４日である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記それよりも後の時点が、２１日である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項30】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項31】

ａ）血友病Ａ患者に、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項32】

前記それよりも後の時点が、７日である、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記それよりも後の時点が、１４日である、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記それよりも後の時点が、２１日である、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項36】

ａ）血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項37】

ａ）血友病Ａ患者に、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することであって、前記ＡＡＶ粒子が、最初の時点に、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記投与することと、
ｂ）それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することであって、前記それよりも後の時点が、７日以上である、前記測定することと、
を含む方法。

【請求項38】

ｃ）前記用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を前記患者に投与する前に、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のベースラインレベルを測定することと、
ｄ）任意に、前記それよりも後の時点における前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体の前記レベルの測定値を、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体の前記ベースラインレベルと比較することと、
をさらに含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記それよりも後の時点が、７日である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記それよりも後の時点が、１４日である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記それよりも後の時点が、２１日である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

血友病Ａと診断された対象に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法剤を投与した後に、前記対象から採取した第１の末梢血試料中の免疫原性媒介物質の第１のレベルを求めることによって、前記対象が、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断することと、
前記対象が、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしている場合には、第１の投与量のステロイドを前記対象に投与することと、
前記対象が、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしていない場合には、前記第１の投与量の前記ステロイドよりも少ない第２の投与量の前記ステロイドを前記対象に投与することと、
を含む方法。

【請求項43】

前記対象が、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断することが、前記免疫原性媒介物質の第１のレベルと、１人以上の健常な個体の末梢血中の前記媒介物質または免疫原性の基準レベルとを比較することを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記対象が、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断することが、前記免疫原性媒介物質の第１のレベルと、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法剤を投与する前に、前記血友病Ａと診断された対象から採取した第２の末梢血試料中の前記免疫原性媒介物質の第２のレベルとを比較することを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記対象が、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断することが、前記免疫原性媒介物質の第１のレベルと、前記第１の末梢血試料を採取する前、かつ前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法剤を投与した後に、前記血友病Ａと診断された対象から採取した第２の末梢血試料中の前記免疫原性媒介物質の第２のレベルとを比較することを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項46】

前記免疫原性媒介物質が、サイトカインである、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記サイトカインが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはインターロイキン６（ＩＬ－６）である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記サイトカインのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって求める、請求項４６または４７に記載の方法。

【請求項49】

前記免疫原性媒介物質が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路の媒介物質である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記ＴＬＲシグナル伝達経路の媒介物質が、ＣＨＵＫ、ＣＸＣＬ８、ＩＦＮＡ２０Ｐ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＮＦＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧ－ＡＳ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ３Ｐ１、ＩＦＮＬ４、ＩＦＮＬＲ１、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＢＫＧ、ＩＫＢＫＧＰ１、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ６、ＩＲＦ７、ＭＹＤ８８、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＦＢＩＢ、ＮＦＫＢＩＥ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ８－ＡＳ１、ＴＬＲ９及びＴＮＦからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記免疫原性媒介物質が、自然免疫シグナル伝達経路の媒介物質または抗ウイルスサイトカインである、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記自然免疫シグナル伝達経路の媒介物質または抗ウイルスサイトカインが、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ３、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ６、ＬＴＡ及びＴＮＦからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。

【請求項53】

前記免疫原性媒介物質が、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達経路の媒介物質である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の媒介物質が、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＲ２、ＨＬＡ－Ａ、ＩＣＯＳ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ９、ＡＫＴ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＬＣＫ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＲＩＰＫ１、ＲＡＦ１、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＴＢＰ、ＣＹＬＤ、ＩＬＢＫＢ、ＩＬＢＫＥ、ＩＬＢＫＧ、ＩＬＢＫＧＰ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＢ、ＮＦＫＢＩＥ、ＣＨＵＫ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ５、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＬ１、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ９、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＣＡＭ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ６－ＡＳ１、ＰＥＣＡＭ１及びＶＣＡＭ１からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。

【請求項55】

前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含む、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記遺伝子療法が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを前記対象に投与することを含む、請求項４２～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記ＡＡＶベクターが、セロタイプ８ＡＡＶベクター（ＡＡＶ８）である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記遺伝子療法が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、２×１０^１２コピーの前記ポリヌクレオチド、６ｘ１０^１２コピーの前記ポリヌクレオチド、１．８×１０^１３コピーの前記ポリヌクレオチド、１．２×１０^１３コピーの前記ポリヌクレオチド及び５×１０^１３コピーの前記ポリヌクレオチドからなる群から選択される用量で投与することを含む、請求項４２～５８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年６月１４日に出願した米国特許仮出願第６３／２１０，３８６号に対する優先権を主張するものであり、その仮出願の開示内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。

【0002】

配列表
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表が含まれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。２０２２年６月２日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、００８０７３－５２３６－ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、８４，９５５キロバイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

本開示の背景
血液凝固は、相互依存的な生化学反応の複雑かつ動的な生物学的経路を進み、この経路は、凝固カスケードという。凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、このカスケードにおける重要な構成要素である。第ＶＩＩＩ因子は、出血部位に動員され、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）とＸａｓｅ複合体を形成する。このＸａｓｅ複合体は、ＦＸを活性化し、ひいては、プロトロンビンを活性化してトロンビンにし、続いて、凝固カスケード内の他の構成要素を活性化して、安定した血餅を生成する（Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５－１９２（１９９９）（非特許文献１）、Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３－３９９６（１９９８）（非特許文献２）で概説されている）。

【0004】

血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子活性の欠損を特徴とする先天的なＸ連鎖性出血障害である。第ＶＩＩＩ因子活性の低下により、凝固カスケードにおけるポジティブフィードバックループが阻害される。これにより、凝固が不完全になり、長期にわたる出血エピソード、広範な挫傷、口腔及び鼻からの突発性出血、関節硬直及び慢性疼痛として顕在化し、重症例では、場合により内出血及び貧血として顕在化する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４－１２４（２００９）（非特許文献３））。

【0005】

従来から、血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子補充療法によって治療されており、この療法は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子または組み換え作製した第ＶＩＩＩ因子）を、血友病Ａの個体に投与することからなる。第ＶＩＩＩ因子は、出血エピソードを予防するか、もしくは急性出血エピソードに応じて、その頻度を低下させるために予防的に投与されるか、及び／または手術中の出血を管理するために手術時に投与される。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子補充療法には、望ましくない特徴がいくつかある。

【0006】

第１に、第ＶＩＩＩ因子補充療法は、血友病Ａを治療または管理する目的で用いられるが、その根底にある、第ＶＩＩＩ因子の欠乏は治癒させない。このため、血友病Ａの個体は、生涯にわたって第ＶＩＩＩ因子補充療法を必要とする。継続的な治療にはお金がかかり、その個体には、厳格なコンプライアンスの維持が求められる。重度の血友病Ａの個体では、予防的投与を数回逃しただけで、深刻な結果がもたらされる可能性があるからである。

【0007】

第２に、第ＶＩＩＩ因子は、生体内での半減期が比較的短いため、従来の予防的な第ＶＩＩＩ因子補充療法では、２～３日ごとに投与が必要となる。これは、その個体が、生涯にわたってコンプライアンスを維持する上での負担となる。第３世代の「長時間作用型」の第ＶＩＩＩ因子薬は、投与頻度を低下できるが、これらの薬物を用いた予防的な第ＦＶＩＩＩ因子補充療法でも、毎月、毎週、またはより高頻度の投与が、一生涯必要となる。例えば、ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）［抗血友病因子（組み換え型）－Ｆｃ融合タンパク質］による予防的な治療では、３～５日ごとの投与が必要となる（ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）の処方情報、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．，（２０１５）（非特許文献４））。さらに、化学修飾された生物製剤（例えばＰＥＧ化ポリペプチド）の長期作用は、まだ完全には理解されていない。

【0008】

第３に、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けている全個体の１５％～３０％において、抗第ＶＩＩＩ因子阻害抗体が形成され、その療法を無効にする。阻害抗体を形成する個体における血友病を治療するために、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法（例えば、血漿由来であるかまたは組み換え作製したプロトロンビン複合体濃縮製剤の投与）を用いることができる。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法は、第ＶＩＩＩ因子補充療法よりも効果が低く（Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９－５５（２００３）（非特許文献５））、心血管合併症リスクの増加と関連し得る（Ｌｕｕ ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０ Ｓｕｐｐｌ．２：１０－１６（２００４）（非特許文献６））。

【0009】

体細胞遺伝子療法は、１回用量の第ＶＩＩＩ因子活性を個体に供給するのではなく、根底にある、機能的第ＶＩＩＩ因子活性の過少発現（例えば、ミスセンス変異またはナンセンス変異に起因する）を改善することになるため、血友病Ａの治療における有望性が高い。第ＶＩＩＩ因子補充療法と比べて、作用機序がこのように異なるため、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法用ベクターの１回投与により、個体に、第ＶＩＩＩ因子を数年にわたって供給することができ、治療コストが削減されるとともに、患者コンプライアンスを持続する必要性がなくなる。

【0010】

凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子療法は、第ＩＸ因子活性の減弱を特徴とする関連血液凝固病態である血友病Ｂである個体を治療するために、効果的に用いられてきている（Ｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２－４７（２００６）（非特許文献７））。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法には、特有の課題がいくつかある。例えば、完全長の野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（２３５１アミノ酸、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００４５１）は、完全長の野生型第ＩＸ因子のポリペプチド（４６１アミノ酸、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７４０）よりも５倍大きい。したがって、野生型第ＶＩＩＩ因子のコード配列は、７０５３塩基対であり、これは、従来のＡＡＶ遺伝子療法用ベクターにパッケージングするには大きすぎる。さらに、Ｂドメインが欠失された第ＶＩＩＩ因子バリアント（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）の組み換え発現の報告値は、不十分である。したがって、いくつかのグループが、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩコンストラクトのコドン使用頻度を変更しようと試みているが、成功は限られている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５－１９２（１９９９）

【非特許文献2】Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３－３９９６（１９９８）

【非特許文献3】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４－１２４（２００９）

【非特許文献4】ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）の処方情報、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．，（２０１５）

【非特許文献5】Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９－５５（２００３）

【非特許文献6】Ｌｕｕ ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０ Ｓｕｐｐｌ．２：１０－１６（２００４）

【非特許文献7】Ｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２－４７（２００６）

【発明の概要】

【0012】

開示の概要
したがって、そのコード配列が遺伝子療法用ベクターにさらに効率的にパッケージングされ、遺伝子療法用ベクターを介して送達される第ＶＩＩＩ因子バリアントに対するニーズが存在する。第ＶＩＩＩ因子をさらに効率的に発現するコドン変更型合成核酸に対するニーズも存在する。このような第ＶＩＩＩ因子バリアント及びコドン変更型核酸により、第ＶＩＩＩ因子欠乏（例えば血友病Ａ）の治療の改善が可能になる。上記の欠乏、及び第ＶＩＩＩ因子欠乏（例えば血友病Ａ）の治療と関連するその他の問題は、開示されているコドン変更型第ＶＩＩＩ因子バリアントによって低減または排除される。

【0013】

いくつかの実施形態によれば、本開示は、第ＶＩＩＩ因子重鎖（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ）及び軽鎖（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ）からなる、開示されているコドン変更型配列との配列同一性が高い第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、これらの核酸は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖をコードする配列間の天然型の第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインに置き換わるリンカー配列（例えば、フューリン切断部位を含むリンカー配列）をコードする配列をさらに含む。

【0014】

一態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、軽鎖、重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端につなぎ合わせるポリペプチドリンカーを含む。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との同一性が少なくとも９５％である第１のヌクレオチド配列によってコードされる。その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との同一性が少なくとも９５％である第２のヌクレオチド配列によってコードされる。そのポリペプチドリンカーは、フューリン切断部位を含む。

【0015】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９５％である第３のヌクレオチド配列によってコードされる。

【0016】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３））との同一性が少なくとも９６％であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４））との同一性が少なくとも９６％である。

【0017】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３））との同一性が少なくとも９７％であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４））との同一性が少なくとも９７％である。

【0018】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３））との同一性が少なくとも９８％であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４））との同一性が少なくとも９８％である。

【0019】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３））との同一性が少なくとも９９％であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４））との同一性が少なくとも９９％である。

【0020】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３））との同一性が少なくとも９９．５％であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４））との同一性が少なくとも９９．５％である。

【0021】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えばＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３））との同一性が少なくとも９９．９％であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えばＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４））との同一性が少なくとも９９．９％である。

【0022】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）であり、その第ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）である。

【0023】

一態様では、本開示は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡとの同一性が少なくとも９５％であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、そのポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0024】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えばＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１））との同一性が少なくとも９６％である。

【0025】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えばＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１））との同一性が少なくとも９７％である。

【0026】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えばＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１））との同一性が少なくとも９８％である。

【0027】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えばＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１））との同一性が少なくとも９９％である。

【0028】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えばＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１））との同一性が少なくとも９９．５％である。

【0029】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えばＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１））との同一性が少なくとも９９．９％である。

【0030】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）である。

【0031】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリペプチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドをコードする。

【0032】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0033】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９７％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0034】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0035】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0036】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．５％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0037】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0038】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0039】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９５％である。

【0040】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９６％である。

【0041】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９７％である。

【0042】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９８％である。

【0043】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９９％である。

【0044】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９９．５％である。

【0045】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択した配列との同一性が少なくとも９９．５％である。

【0046】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡからなる群から選択されている。

【0047】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターエレメントも含む。

【0048】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたエンハンサーエレメントも含む。

【0049】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたポリアデニル化エレメントも含む。

【0050】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されたイントロンも含む。

【0051】

上記のポリヌクレオチドの一実施形態では、そのイントロンは、プロモーターエレメントと、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始部位（例えば第１のコーディングＡＴＧ）の間に位置する。

【0052】

別の態様では、本開示は、上記のようなポリヌクレオチドを含む、哺乳動物の遺伝子療法用ベクターを提供する。

【0053】

上記のような、哺乳動物の遺伝子療法用ベクターの一実施形態では、その哺乳動物の遺伝子療法用ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0054】

上記のような、哺乳動物の遺伝子療法用ベクターの一実施形態では、そのＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－８ベクターである。

【0055】

別の態様では、本開示は、血友病Ａを治療する方法であって、それを必要とする患者に、上記のような、哺乳動物の遺伝子療法用ベクターを投与することを含む方法を提供する。

【0056】

別の態様では、本開示は、血友病Ａを治療するために、上記のような、哺乳動物の遺伝子療法用ベクターを提供する。

【0057】

別の態様では、本開示は、血友病Ａを治療するための医薬の製造における、上記のような、哺乳動物の遺伝子療法用ベクターの使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】野生型及びＲｅＦａｃｔｏ型のヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質コンストラクトの概略図を示す。

【図2A】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列（配列番号１）（完全長コード配列「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図2B】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列（配列番号１）（完全長コード配列「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図3】いくつかの実施形態に従って、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列（配列番号２）（完全長アミノ酸配列「ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ」）を示す。

【図4】いくつかの実施形態に従って、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列のうち、第ＶＩＩＩ因子バリアントの重鎖をコードする部分（配列番号３）（「ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ」）を示す。

【図5】いくつかの実施形態に従って、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列のうち、第ＶＩＩＩ因子バリアントの軽鎖をコードする部分（配列番号４）（「ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ」）を示す。

【図6】いくつかの実施形態によるＢドメイン置換リンカーの例示的なコード配列（配列番号５）を示す。ＢＤＬＯ０４（配列番号５）は、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列のうち、Ｂドメイン置換リンカーをコードするそれぞれの部分である。

【図7A】いくつかの実施形態に従って、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列を含むＡＡＶベクターの配列（配列番号６）（「ＣＳ０４－ＡＶ－ＮＡ」）を示す。

【図7B】いくつかの実施形態に従って、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列を含むＡＡＶベクターの配列（配列番号６）（「ＣＳ０４－ＡＶ－ＮＡ」）を示す。

【図7C】いくつかの実施形態に従って、コドン変更型ヌクレオチドＣＳ０４の配列を含むＡＡＶベクターの配列（配列番号６）（「ＣＳ０４－ＡＶ－ＮＡ」）を示す。

【図8A】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ０８の配列（配列番号７）（「ＣＳ０８－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図8B】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ０８の配列（配列番号７）（「ＣＳ０８－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図9A】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ１０の配列（配列番号８）（「ＣＳ１０－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図9B】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ１０の配列（配列番号８）（「ＣＳ１０－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図10A】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ１１の配列（配列番号９）（「ＣＳ１１－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図10B】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＳ１１の配列（配列番号９）（「ＣＳ１１－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図11A】いくつかの実施形態による、野生型ＲｅＦａｃｔｏ ＣＳ４０のコード配列（配列番号１０）（「ＣＳ４０－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図11B】いくつかの実施形態による、野生型ＲｅＦａｃｔｏ ＣＳ４０のコード配列（配列番号１０）（「ＣＳ４０－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図12A】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＨ２５の配列（配列番号１１）（「ＣＨ２５－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図12B】いくつかの実施形態に従って、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ヌクレオチドＣＨ２５の配列（配列番号１１）（「ＣＨ２５－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。

【図13】いくつかの実施形態による、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列（配列番号１２）（「ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ」）を示す。

【図14】ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を介して、ＲｅＦａｃｔｏ型の合成ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ ＤＮＡ配列をベクター骨格ｐＣｈ－ＢＢ０１に挿入することによって、ｐＣＳ４０、ｐＣＳ０４、ｐＣＳ０８、ｐＣＳ１０、ｐＣＳ１１及びｐＣｈ２５のコンストラクトをクローニングするスキームを例示する。

【図15】ＡＡＶベクターゲノムの調製物の完全性をアガロースゲル電気泳動によって解析したものを示す。レーン１は、ＤＮＡマーカーであり、レーン２は、ｖＣＳ４０であり、レーン４は、ｖＣＳ０４である。これらのＡＡＶベクターはいずれも、サイズが同じゲノムを有し、およそ５ｋｂ（右側の矢印）の位置まで移動している。左側の目盛りは、ＤＮＡ断片のサイズをキロベース（ｋｂ）で示す。

【図16】ＡＡＶベクターの調製物をＰＡＧＥ及び銀染色によってタンパク質解析したものを示す。レーン１は、タンパク質マーカー（Ｍ）であり、レーン２は、ｖＣＳ４０であり、レーン４は、ｖＣＳ０４である。これらのコンストラクトはいずれも、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３（右側の矢印）からなる同じＡＡＶ８カプシドを有する。左側の目盛りは、タンパク質マーカーのサイズをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。

【図17】実施例３に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを全身投与した後のＦＶＩＩＩ活性を示す。ｃｐは、ベクターカプシド粒子、ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子、ＬＬＯＱは、定量下限である。グラフには、１４日目、２８日目、４２日目及び５６日目の時点が、左から右に示されている。

【図18】実施例３に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを全身投与した後の尾先端出血アッセイにおける失血の減少を示す。ｃｐは、ベクターカプシド粒子である。

【図19A】コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＤＮＡ ＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターの全身投与後の生体内分布を示す。１９０２は肝臓、１９０４はリンパ節、１９０６は骨格筋、１９０８は心臓、１９１０は腎臓、１９１２は脾臓、１９１４は肺、１９１６は精巣、１９１８は脳である。

【図19B】コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＤＮＡ ＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターの全身投与後の生体内分布を示す。１９０２は肝臓、１９０４はリンパ節、１９０６は骨格筋、１９０８は心臓、１９１０は腎臓、１９１２は脾臓、１９１４は肺、１９１６は精巣、１９１８は脳である。

【図19C】コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＤＮＡ ＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターの全身投与後の生体内分布を示す。１９０２は肝臓、１９０４はリンパ節、１９０６は骨格筋、１９０８は心臓、１９１０は腎臓、１９１２は脾臓、１９１４は肺、１９１６は精巣、１９１８は脳である。

【図20A】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の血中の経時的な第ＶＩＩＩ因子活性を例示する。

【図20B】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の血中の経時的な第ＶＩＩＩ因子活性を例示する。

【図20C】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の血中の経時的な第ＶＩＩＩ因子活性を例示する。

【図20D】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の血中の経時的な第ＶＩＩＩ因子活性を例示する。

【図21】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の４人の血友病Ａ患者の末梢血中の経時的なＴＮＦａ及びＩＬ－６のレベルを示す。

【図22A】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の４人の血友病Ａ患者の末梢血中のＡＡＶ８中和抗体の経時的な力価を例示する。

【図22B】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の４人の血友病Ａ患者の末梢血中の抗ＡＡＶ８ ＩｇＭ及び抗ＡＡＶ８ ＩｇＧの経時的な結合力価を例示する。

【図23A】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＡＡＶ抗原及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗原に対する経時的なＴ細胞応答に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を例示する。

【図23B】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＡＡＶ抗原及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗原に対する経時的なＴ細胞応答に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を例示する。

【図23C】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＡＡＶ抗原及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗原に対する経時的なＴ細胞応答に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を例示する。

【図23D】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＡＡＶ抗原及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗原に対する経時的なＴ細胞応答に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を例示する。

【図24】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の４人の血友病Ａ患者の様々な免疫原性経路における経時的な遺伝子発現パターンを評価するのに用いたトランスクリプトミクス解析のワークフローを例示する。

【図25A】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＴＬＲを介した、ＭｙＤ８８依存性及びＭｙＤ８８非依存性の免疫活性化経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図25B】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＴＬＲを介した、ＭｙＤ８８依存性及びＭｙＤ８８非依存性の免疫活性化経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図25C】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中のＴＬＲを介した、ＭｙＤ８８依存性及びＭｙＤ８８非依存性の免疫活性化経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図25D】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の健常コントロールの末梢血中のＴＬＲを介した、ＭｙＤ８８依存性及びＭｙＤ８８非依存性の免疫活性化経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図26A】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中の自然免疫シグナル伝達及び抗ウイルスサイトカインの応答の際の経時的な発現パターンを例示する。

【図26B】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中の自然免疫シグナル伝達及び抗ウイルスサイトカインの応答の際の経時的な発現パターンを例示する。

【図26C】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中の自然免疫シグナル伝達及び抗ウイルスサイトカインの応答の際の経時的な発現パターンを例示する。

【図26D】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の健常コントロールの末梢血中の自然免疫シグナル伝達及び抗ウイルスサイトカインの応答の際の経時的な発現パターンを例示する。

【図27A】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中の古典的及び非古典的なＮＦκＢシグナル伝達経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図27B】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中の古典的及び非古典的なＮＦκＢシグナル伝達経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図27C】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の血友病Ａ患者の末梢血中の古典的及び非古典的なＮＦκＢシグナル伝達経路における経時的な発現パターンを例示する。

【図27D】実施例５に記載されているように、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターを投与した後の健常コントロールの末梢血中の古典的及び非古典的なＮＦκＢシグナル伝達経路における経時的な発現パターンを例示する。

【発明を実施するための形態】

【0059】

開示の詳細な説明
Ｉ．序論
ＡＡＶベースの遺伝子療法は、血友病の治療において有望性が高い。血友病Ｂでは、第１の臨床データは、少なくとも一部の患者において、１年超にわたり、約１０％のＦＩＸレベルを維持できるという点で、有望である。しかしながら、血友病Ａでは、ＡＡＶベクターにより、治療効果のある５～１０％の発現レベルを達成するのは、様々な理由から、依然として困難なままである。第１に、第ＶＩＩＩ因子のコード配列は、従来のＡＡＶベースのベクターには大きすぎる。第２に、Ｂドメインが欠失またはトランケートされた操作済みの第ＶＩＩＩ因子コンストラクトは、コドンを最適化しても、ｉｎ ｖｉｖｏで発現不良をきたす。第３に、Ｂドメインが欠失またはトランケートされたこれらの第ＶＩＩＩ因子バリアントコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短く、発現不良の作用が悪化する。第４に、ＦＶＩＩＩは、発現しても、第ＩＸ因子のような他の凝固因子のようには、細胞から効率的には分泌されない。したがって、血友病Ａ患者にとって、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法を実用的な治療選択肢とするには、ＦＶＩＩＩの発現を改善する方策が必要である。

【0060】

本開示は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に関連するこれらの問題及びその他の問題を解決する、コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列の発見に関するものである。例えば、本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞での発現を著しく改善させるとともに、パッキング相互作用の安定化により、ビリオンのパッケージング量を改善させる。いくつかの実施態様では、これらの利点は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖のコード配列であって、コドン変更型のＣＳ０４コンストラクトとの配列同一性が高い（例えば、ＣＳ０４－ＨＣ重鎖コード配列との配列同一性が高く、かつＣＳ０４－ＬＣ軽鎖コード配列との配列同一性が高い）コード配列を用いることによって実現される。

【0061】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子分子は、その野生型Ｂドメインをトランケートするか、欠失させるか、または置き換えることによって、短縮されている。すなわち、そのポリヌクレオチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子などのより大きいポリペプチドを非効率的に発現する従来の遺伝子療法用ベクターを介して第ＶＩＩＩ因子を発現させるのに、より適している。

【0062】

有益なことに、本明細書では、コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列ＣＳ０４により、Ｂドメインが欠失された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトをｉｎ ｖｉｖｏで高度に発現させることが示されている。例えば、実施例２及び表４では、第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおいて、ＣＳ０４のコード配列（配列番号１）を有するＡＡＶベースの遺伝子療法用ベクターの静脈内投与により、第ＶＩＩＩ因子の発現が、野生型ポリヌクレオチド配列（配列番号１７）によってコードされる対応するＣＳ４０コンストラクトと比べて、７４倍増加することが示されている（表４）。

【0063】

さらに、本明細書には、コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアントＣＳ０４のコード配列が、ビリオンパッケージング量及びウイルス産生量に優れることも示されている。例えば、実施例１では、ＣＳ０４コンストラクトを含むＡＡＶベクターコンストラクトは、ウイルス収量が、野生型ポリヌクレオチド配列によってコードされる対応するＣＳ４０コンストラクトと比べて、同じ量の細胞ペレットを単離したときに、５～７倍多かったことが示されている。

【0064】

ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、別段の記載のない限り、以下の用語は、それらに与えられた意味を有する。

【0065】

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」という用語は、同義的に用いられており、第ＶＩＩＩ因子活性を有する任意のタンパク質（例えば、活性なＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩａと称される場合が多い）、または第ＶＩＩＩ因子活性、特に第ＩＸａ因子の補因子活性を有するタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、プロタンパク質もしくはプレプロタンパク質）を指す。例示的な実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖及び軽鎖との配列同一性が高い（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％以上である）配列を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズを低減するために、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインが、欠失されているか、トランケートされているか、またはリンカーポリペプチドに置き換えられている。例示的な実施形態では、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡの２０～１４５７番目のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを構成する。

【0066】

野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例としては、ヒトプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５２４８５、ＣＡＡ２５６１９、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＡ５２４８４、ＡＡＡ５２４２０、ＡＡＶ８５９６４、ＢＡＦ８２６３６、ＢＡＧ３６４５２、ＣＡＩ４１６６０、ＣＡＩ４１６６６、ＣＡＩ４１６７２、ＣＡＩ４３２４１、ＣＡＯ０３４０４、ＥＡＷ７２６４５、ＡＡＨ２２５１３、ＡＡＨ６４３８０、ＡＡＨ９８３８９、ＡＡＩ１１９６８、ＡＡＩ１１９７０またはＡＡＢ６１２６１）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子及びその天然のバリアント、ブタプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｆ１ＲＺ３６またはＫ７ＧＳＺ５）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子及びその天然のバリアント、マウスプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３７３８５、ＣＡＭ１５５８１、ＣＡＭ２６４９２またはＥＤＬ２９２２９）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子及びその天然のバリアント、ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＱ２１５８０）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子及びその天然のバリアント、ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子、ならびにその他の哺乳動物の第ＶＩＩＩ因子ホモログ（例えば、サル、類人猿、ハムスター、モルモットなど）が挙げられる。

【0067】

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、天然のバリアント、及び第ＩＸ因子補因子活性を有する人工のコンストラクトを含む。本開示で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子には、任意の天然のバリアント、代替配列、アイソフォーム、または多少の基礎的な第ＩＸ因子補因子活性（例えば、対応する野生型活性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％もしくは７５％以上）を保持する変異体タンパク質が含まれる。（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号１９）に対する、）第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸バリエーションのうち、ヒト集団で見られるバリエーションの例としては、Ｓ１９Ｒ、Ｒ２２Ｔ、Ｙ２４Ｃ、Ｙ２５Ｃ、Ｌ２６Ｐ／Ｒ、Ｅ３０Ｖ、Ｗ３３Ｇ、Ｙ３５Ｃ／Ｈ、Ｇ４１Ｃ、Ｒ４８Ｃ／Ｋ、Ｋ６７Ｅ／Ｎ、Ｌ６９Ｐ、Ｅ７２Ｋ、Ｄ７５Ｅ／Ｖ／Ｙ、Ｐ８３Ｒ、Ｇ８９Ｄ／Ｖ、Ｇ９２Ａ／Ｖ、Ａ９７Ｐ、Ｅ９８Ｋ、Ｖ９９Ｄ、Ｄ１０１Ｇ／Ｈ／Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｋ１０８Ｔ、Ｍ１１０Ｖ、Ａ１１１Ｔ／Ｖ、Ｈ１１３Ｒ／Ｙ、Ｌ１１７Ｆ／Ｒ、Ｇ１２１Ｓ、Ｅ１２９Ｖ、Ｇ１３０Ｒ、Ｅ１３２Ｄ、Ｙ１３３Ｃ、Ｄ１３５Ｇ／Ｙ、Ｔ１３７Ａ／Ｉ、Ｓ１３８Ｒ、Ｅ１４１Ｋ、Ｄ１４５Ｈ、Ｖ１４７Ｄ、Ｙ１５５Ｈ、Ｖ１５９Ａ、Ｎ１６３Ｋ、Ｇ１６４Ｄ／Ｖ、Ｐ１６５Ｓ、Ｃ１７２Ｗ、Ｓ１７６Ｐ、Ｓ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｅ／Ｍ、Ｋ１８５Ｔ、Ｄ１８６Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｓ１８９Ｌ、Ｌ１９１Ｆ、Ｇ１９３Ｒ、Ｌ１９５Ｐ、Ｃ１９８Ｇ、Ｓ２０２Ｎ／Ｒ、Ｆ２１４Ｖ、Ｌ２１７Ｈ、Ａ２１９Ｄ／Ｔ、Ｖ２２０Ｇ、Ｄ２２２Ｖ、Ｅ２２３Ｋ、Ｇ２２４Ｗ、Ｔ２５２Ｉ、Ｖ２５３Ｆ、Ｎ２５４Ｉ、Ｇ２５５Ｖ、Ｌ２６１Ｐ、Ｐ２６２Ｌ、Ｇ２６３Ｓ、Ｇ２６６Ｆ、Ｃ２６７Ｙ、Ｗ２７４Ｃ、Ｈ２７５Ｌ、Ｇ２７８Ｒ、Ｇ２８０Ｄ、Ｅ２８４Ｋ、Ｖ２８５Ｇ、Ｅ２９１Ｇ／Ｋ、Ｔ２９４Ｉ、Ｆ２９５Ｌ、Ｖ２９７Ａ、Ｎ２９９Ｉ、Ｒ３０１Ｃ／Ｈ／Ｌ、Ａ３０３Ｅ／Ｐ、Ｉ３０７Ｓ、Ｓ３０８Ｌ、Ｆ３１２Ｓ、Ｔ３１４Ａ／Ｉ、Ａ３１５Ｖ、Ｇ３２３Ｅ、Ｌ３２６Ｐ、Ｌ３２７Ｐ／Ｖ、Ｃ３２９Ｆ、Ｉ３３１Ｖ、Ｍ３３９Ｔ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４５Ａ／Ｌ、Ｃ３４８Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｙ３６５Ｃ、Ｒ３９１Ｃ／Ｈ／Ｐ、Ｓ３９２Ｌ／Ｐ、Ａ３９４Ｓ、Ｗ４０１Ｇ、Ｉ４０５Ｆ／Ｓ、Ｅ４０９Ｇ、Ｗ４１２Ｇ／Ｒ、Ｋ４２７Ｉ、Ｌ４３１Ｆ／Ｓ、Ｒ４３７Ｐ／Ｗ、Ｉ４３８Ｆ、Ｇ４３９Ｄ／Ｓ／Ｖ、Ｙ４４２Ｃ、Ｋ４４４Ｒ、Ｙ４５０Ｄ／Ｎ、Ｔ４５４Ｉ、Ｆ４５５Ｃ、Ｇ４６６Ｅ、Ｐ４７０Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｇ４７４Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ｅ４７５Ｋ、Ｇ４７７Ｖ、Ｄ４７８Ｎ、Ｔ４７９Ｒ、Ｆ４８４Ｃ、Ａ４８８Ｇ、Ｒ４９０Ｇ、Ｙ４９２Ｃ／Ｈ、Ｙ４９２Ｈ、Ｉ４９４Ｔ、Ｐ４９６Ｒ、Ｇ４９８Ｒ、Ｒ５０３Ｈ、Ｇ５１３Ｓ／Ｖ、Ｉ５２２Ｙ、Ｋ５２９Ｅ、Ｗ５３２Ｇ、Ｐ５４０Ｔ、Ｔ５４１Ｓ、Ｄ５４４Ｎ、Ｒ５４６Ｗ、Ｒ５５０Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｓ５５３Ｐ、Ｓ５５４Ｃ／Ｇ、Ｖ５５６Ｄ、Ｒ５６０Ｔ、Ｄ５６１Ｇ／Ｈ／Ｙ、Ｉ５６７Ｔ、Ｐ５６９Ｒ、Ｓ５７７Ｆ、Ｖ５７８Ａ、Ｄ５７９Ａ／Ｈ、Ｎ５８３Ｓ、Ｑ５８４Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｉ５８５Ｒ／Ｔ、Ｍ５８６Ｖ、Ｄ５８８Ｇ／Ｙ、Ｌ５９４Ｑ、Ｓ５９６Ｐ、Ｎ６０１Ｄ／Ｋ、Ｒ６０２Ｇ、Ｓ６０３Ｉ／Ｒ、Ｗ６０４Ｃ、Ｙ６０５Ｈ／Ｓ、Ｎ６０９Ｉ、Ｒ６１２Ｃ、Ｎ６３１Ｋ／Ｓ、Ｍ６３３Ｉ、Ｓ６３５Ｎ、Ｎ６３７Ｄ／Ｉ／Ｓ、Ｙ６３９Ｃ、Ｌ６４４Ｖ、Ｌ６５０Ｆ、Ｖ６５３Ａ／Ｍ、Ｌ６５９Ｐ、Ａ６６３Ｖ、Ｑ６６４Ｐ、Ｆ６７７Ｌ、Ｍ６８１Ｉ、Ｖ６８２Ｆ、Ｙ６８３Ｃ／Ｎ、Ｔ６８６Ｒ、Ｆ６９８Ｌ、Ｍ６９９Ｔ／Ｖ、Ｍ７０１Ｉ、Ｇ７０５Ｖ、Ｇ７１０Ｗ、Ｎ７１３Ｉ、Ｒ７１７Ｌ／Ｗ、Ｇ７２０Ｄ／Ｓ、Ｍ７２１Ｉ／Ｌ、Ａ７２３Ｔ、Ｌ７２５Ｑ、Ｖ７２７Ｆ、Ｅ７３９Ｋ、Ｙ７４２Ｃ、Ｒ７９５Ｇ、Ｐ９４７Ｒ、Ｖ１０１２Ｌ、Ｅ１０５７Ｋ、Ｈ１０６６Ｙ、Ｄ１２６０Ｅ、Ｋ１２８９Ｑ、Ｑ１３３６Ｋ、Ｎ１４６０Ｋ、Ｌ１４８１Ｐ、Ａ１６１０Ｓ、Ｉ１６９８Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ／Ｆ、Ｅ１７０１Ｋ、Ｑ１７０５Ｈ、Ｒ１７０８Ｃ／Ｈ、Ｔ１７１４Ｓ、Ｒ１７１５Ｇ、Ａ１７２０Ｖ、Ｅ１７２３Ｋ、Ｄ１７２７Ｖ、Ｙ１７２８Ｃ、Ｒ１７４０Ｇ、Ｋ１７５１Ｑ、Ｆ１７６２Ｌ、Ｒ１７６８Ｈ、Ｇ１７６９Ｒ、Ｌ１７７１Ｐ、Ｌ１７７５Ｆ／Ｖ、Ｌ１７７７Ｐ、Ｇ１７７９Ｅ／Ｒ、Ｐ１７８０Ｌ、Ｉ１７８２Ｒ、Ｄ１７８８Ｈ、Ｍ１７９１Ｔ、Ａ１７９８Ｐ、Ｓ１７９９Ｈ、Ｒ１８００Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｐ１８０１Ａ、Ｙ１８０２Ｃ、Ｓ１８０３Ｙ、Ｆ１８０４Ｓ、Ｌ１８０８Ｆ、Ｍ１８４２Ｉ、Ｐ１８４４Ｓ、Ｔ１８４５Ｐ、Ｅ１８４８Ｇ、Ａ１８５３Ｔ／Ｖ、Ｓ１８５８Ｃ、Ｋ１８６４Ｅ、Ｄ１８６５Ｎ／Ｙ、Ｈ１８６７Ｐ／Ｒ、Ｇ１８６９Ｄ／Ｖ、Ｇ１８７２Ｅ、Ｐ１８７３Ｒ、Ｌ１８７５Ｐ、Ｖ１８７６Ｌ、Ｃ１８７７Ｒ／Ｙ、Ｌ１８８２Ｐ、Ｒ１８８８Ｉ、Ｅ１８９４Ｇ、Ｉ１９０１Ｆ、Ｅ１９０４Ｄ／Ｋ、Ｓ１９０７Ｃ／Ｒ、Ｗ１９０８Ｌ、Ｙ１９０９Ｃ、Ａ１９３９Ｔ／Ｖ、Ｎ１９４１Ｄ／Ｓ、Ｇ１９４２Ａ、Ｍ１９４５Ｖ、Ｌ１９５１Ｆ、Ｒ１９６０Ｌ／Ｑ、Ｌ１９６３Ｐ、Ｓ１９６５Ｉ、Ｍ１９６６Ｉ／Ｖ、Ｇ１９６７Ｄ、Ｓ１９６８Ｒ、Ｎ１９７１Ｔ、Ｈ１９７３Ｌ、Ｇ１９７９Ｖ、Ｈ１９８０Ｐ／Ｙ、Ｆ１９８２Ｉ、Ｒ１９８５Ｑ、Ｌ１９９４Ｐ、Ｙ１９９８Ｃ、Ｇ２０００Ａ、Ｔ２００４Ｒ、Ｍ２００７Ｉ、Ｇ２０１３Ｒ、Ｗ２０１５Ｃ、Ｒ２０１６Ｐ／Ｗ、Ｅ２０１８Ｇ、Ｇ２０２２Ｄ、Ｇ２０２８Ｒ、Ｓ２０３０Ｎ、Ｖ２０３５Ａ、Ｙ２０３６Ｃ、Ｎ２０３８Ｓ、２０４０Ｙ、Ｇ２０４５Ｅ／Ｖ、Ｉ２０５１Ｓ、Ｉ２０５６Ｎ、Ａ２０５８Ｐ、Ｗ２０６５Ｒ、Ｐ２０６７Ｌ、Ａ２０７０Ｖ、Ｓ２０８２Ｎ、Ｓ２０８８Ｆ、Ｄ２０９３Ｇ／Ｙ、Ｈ２１０１Ｄ、Ｔ２１０５Ｎ、Ｑ２１０６Ｅ／Ｐ／Ｒ、Ｇ２１０７Ｓ、Ｒ２１０９Ｃ、Ｉ２１１７Ｆ／Ｓ、Ｑ２１１９Ｒ、Ｆ２１２０Ｃ／Ｌ、Ｙ２１２４Ｃ、Ｒ２１３５Ｐ、Ｓ２１３８Ｙ、Ｔ２１４１Ｎ、Ｍ２１４３Ｖ、Ｆ２１４５Ｃ、Ｎ２１４８Ｓ、Ｎ２１５７Ｄ、Ｐ２１６２Ｌ、Ｒ２１６９Ｃ／Ｈ、Ｐ２１７２Ｌ／Ｑ／Ｒ、Ｔ２１７３Ａ／Ｉ、Ｈ２１７４Ｄ、Ｒ２１７８Ｃ／Ｈ／Ｌ、Ｒ２１８２Ｃ／Ｈ／Ｐ、Ｍ２１８３Ｒ／Ｖ、Ｌ２１８５Ｓ／Ｗ、Ｓ２１９２Ｉ、Ｃ２１９３Ｇ、Ｐ２１９６Ｒ、Ｇ２１９８Ｖ、Ｅ２２００Ｄ、Ｉ２２０４Ｔ、Ｉ２２０９Ｎ、Ａ２２１１Ｐ、Ａ２２２０Ｐ、Ｐ２２２４Ｌ、Ｒ２２２８Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｌ２２２９Ｆ、Ｖ２２４２Ｍ、Ｗ２２４８Ｃ／Ｓ、Ｖ２２５１Ａ／Ｅ、Ｍ２２５７Ｖ、Ｔ２２６４Ａ、Ｑ２２６５Ｒ、Ｆ２２７９Ｃ／Ｉ、Ｉ２２８１Ｔ、Ｄ２２８６Ｇ、Ｗ２２９０Ｌ、Ｇ２３０４Ｖ、Ｄ２３０７Ａ、Ｐ２３１９Ｌ／Ｓ、Ｒ２３２３Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｒ２３２６Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｑ２３３０Ｐ、Ｗ２３３２Ｒ、Ｉ２３３６Ｆ、Ｒ２３３９Ｔ、Ｇ２３４４Ｃ／Ｄ／Ｓ及びＣ２３４５Ｓ／Ｙが挙げられるが、これらに限らない。第ＶＩＩＩ因子タンパク質には、翻訳後修飾を含むポリペプチドも含まれる。

【0068】

概して、第ＶＩＩＩ因子をコードするポリヌクレオチドは、翻訳後プロセシングを受けると、活性な第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えばＦＶＩＩＩａ）を形成する、不活性な一本鎖ポリペプチド（例えばプレプロタンパク質）をコードする。例えば、図１を参照すると、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子プレプロタンパク質が最初に切断されて、コードされたシグナルペプチド（図示なし）が放出されて、第１の一本鎖プロタンパク質（「ヒト野生型ＦＶＩＩＩ」として示されている）が形成される。続いて、そのプロタンパク質が、ＢドメインとＡ３ドメインの間で切断されて、第ＶＩＩＩ因子重鎖（例えば、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメイン）とＢドメインとを含む第１のポリペプチドと、第ＶＩＩＩ因子軽鎖（例えば、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ３ドメインを含む）を含む第２のポリペプチドが形成される。その第１のポリペプチドがさらに切断されて、Ｂドメインが除去されるとともに、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメインも分離されるが、これらのドメインは、成熟した第ＶＩＩＩａ因子タンパク質では、第ＶＩＩＩ因子軽鎖と結合したままである。第ＶＩＩＩ因子の成熟プロセスの概説については、Ｇｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，６（６）：４８８－５０１（２００５）（その内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される）を参照されたい。

【0069】

しかしながら、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、一本鎖の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。一本鎖の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、天然の切断部位を除去するとともに、任意に、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを除去するか、トランケートするかまたは置き換えるために操作されている。したがって、この一本鎖の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、（任意のシグナルペプチド及び／またはリーダーペプチドの切断以外の）切断によっては成熟せず、一本鎖として活性を有する。一本鎖の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例は、Ｚｏｌｌｎｅｒらの文献（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１３４（１）：１２５－３１（２０１４））及びＤｏｎａｔｈらの文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１２（１）：４９－５５（１９９５））に記載されており、これらの開示内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。

【0070】

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子重鎖」または単に「重鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１ドメイン及びＡ２ドメインの凝集体を指す。例示的な実施形態では、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の２０～７５９番目のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子重鎖を構成する。

【0071】

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子軽鎖」または単に「軽鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインの凝集体を指す。例示的な実施形態では、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の７７４～１４５７番目のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子軽鎖を構成する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子軽鎖には、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟中に放出される酸性のａ３ペプチドが含まれない。

【0072】

概して、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、１本のポリペプチド鎖として、例えば、任意のＢドメインまたはＢドメイン置換リンカーとともに発現させる。しかしながら、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び第ＶＩＩＩ因子軽鎖は、別々のポリペプチド鎖として発現させ（例えば共発現させ）、（例えばｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）再構成させて、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を形成させる。

【0073】

本明細書で使用する場合、「Ｂドメイン置換リンカー」及び「第ＶＩＩＩ因子リンカー」という用語は、同義的に使用されており、野生型の第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（例えば、ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号１９）の７６０～１６６７番目のアミノ酸）のトランケート型、または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置き換えるように操作されたペプチドを指す。本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子リンカーは、いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドにおいて、第ＶＩＩＩ因子重鎖のＣ末端と第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＮ末端との間に位置する。Ｂドメイン置換リンカーの非限定的な例は、米国特許第４，８６８，１１２号、同第５，１１２，９５０号、同第５，１７１，８４４号、同第５，５４３，５０２号、同第５，５９５，８８６号、同第５，６１０，２７８号、同第５，７８９，２０３号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第６，０６０，４４７号、同第６，１１４，１４８号、同第６，２２８，６２０号、同第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第６，４５８，５６３号、同第６，９２４，３６５号、同第７，０４１，６３５号及び同第７，９４３，３７４号、米国特許出願公開第２０１３／０２４９６０号、同第２０１５／００７１８８３号及び同第２０１５／０１５８９３０号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１４／０６４２７７号及び同第ＷＯ２０１４／１２７２１５号に開示されており、これらの開示内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。

【0074】

本明細書に別段の記載のない限り、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸のナンバリングは、図１３に配列番号１９として示されている完全長の野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ）における対応するアミノ酸を指す。したがって、本明細書に開示されている第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質においてアミノ酸置換に言及するときには、示されているアミノ酸番号は、完全長の野生型第ＶＩＩＩ因子配列における類似の（例えば、構造的もしくは機能的に同等である）アミノ酸及び／または相同な（例えば、一次アミノ酸配列において進化的に保存されている）アミノ酸を指す。例えば、Ｔ２１０５Ｎというアミノ酸置換は、完全長の野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ、配列番号１９）の２１０５位のＴがＮに置換されていること、及びＣＳ０４によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質（ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ、配列番号２）の１２１１位のＴがＮに置換されていることを指す。

【0075】

本明細書に記載されているように、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸のナンバリング体系は、第ＶＩＩＩ因子のシグナルペプチド（例えば、完全長の野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の１～１９番目のアミノ酸）が含まれるか否かによって決まる。シグナルペプチドが含まれる場合、そのナンバリングは、「シグナルペプチドを含むもの」または「ＳＰＩ」という。シグナルペプチドが含まれない場合には、そのナンバリングは、「シグナルペプチドを含まないもの」または「ＳＰＥ」という。例えば、Ｆ３２８Ｓは、ＳＰＥナンバリングにおけるＦ３０９Ｓと同じアミノ酸のＳＰＩナンバリングである。別段に示されていない限り、すべてのアミノ酸番号は、図１３に配列番号１９として示されている、完全長の野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ）における対応するアミノ酸を指す。

【0076】

本明細書に記載されているように、コドン変更型ポリヌクレオチドは、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクト（例えば、野生型ヒトコドンを用いた場合の同じ第ＶＩＩＩ因子コンストラクトをコードするポリヌクレオチド）によって得られる、第ＶＩＩＩ因子の発現レベルと比べて、（例えば、遺伝子療法用ベクターの一部として投与したときに）ｉｎ ｖｉｖｏで、トランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の発現を増加させる。本明細書で使用する場合、「発現の増加」という用語は、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン変更型ポリヌクレオチドを投与された動物の血中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性レベルが、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクトを投与された動物の血中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性レベルと比べて上昇することを指す。その活性レベルは、当該技術分野で知られている任意の第ＶＩＩＩ因子活性を用いて測定できる。第ＶＩＩＩ因子活性を求めるための例示的なアッセイは、Ｔｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）である。

【0077】

いくつかの実施形態では、発現の増加は、そのコドン変更型の第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性が、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性レベルと比べて少なくとも２５％高いことを指す。いくつかの実施形態では、発現の増加は、そのコドン変更型の第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性が、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性レベルと比べて、少なくとも５０％高いか、少なくとも７５％高いか、少なくとも１００％高いか、少なくとも３倍高いか、少なくとも４倍高いか、少なくとも５倍高いか、少なくとも６倍高いか、少なくとも７倍高いか、少なくとも８倍高いか、少なくとも９倍高いか、少なくとも１０倍高いか、少なくとも１５倍高いか、少なくとも２０倍高いか、少なくとも２５倍高いか、少なくとも３０倍高いか、少なくとも４０倍高いか、少なくとも５０倍高いか、少なくとも６０倍高いか、少なくとも７０倍高いか、少なくとも８０倍高いか、少なくとも９０倍高いか、少なくとも１００倍高いか、少なくとも１２５倍高いか、少なくとも１５０倍高いか、少なくとも１７５倍高いか、少なくとも２００倍高いか、少なくとも２２５倍高いか、または少なくとも２５０倍高いことを指す。

【0078】

本明細書に記載されているように、そのコドン変更型ポリヌクレオチドは、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクト（例えば、野生型ヒトコドンを用いた場合の同じ第ＶＩＩＩ因子コンストラクトをコードするポリヌクレオチド）によって得られるベクター産生レベルと比べて、ベクター産生量を増加させる。本明細書で使用する場合、「ウイルス産生量の増加」という用語は、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン変更型ポリヌクレオチドを播種した細胞培養液でのベクター収量（例えば、培養液１リットル当たりの力価）が、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクトを播種した細胞培養液でのベクター収量と比べて増加することを指す。ベクター収量は、当該技術分野で知られている任意のベクター力価アッセイを用いて測定できる。（例えばＡＡＶベクターの）ベクター収量を求めるための例示的なアッセイは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列を標的とするｑＰＣＲである（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ Ｂ ２３：１８－２８（２０１２））。

【0079】

いくつかの実施形態では、ウイルス産生量の増加は、コドン変更型ベクターの収量が、同じ種類の培養液において、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクトの収量と比べて少なくとも２５％多いことを指す。いくつかの実施形態では、ベクター産生量の増加は、コドン変更型ベクターの収量が、同じ種類の培養液において、天然の状態でコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクトの収量と比べて少なくとも５０％多いか、少なくとも７５％多いか、少なくとも１００％多いか、少なくとも３倍多いか、少なくとも４倍多いか、少なくとも５倍多いか、少なくとも６倍多いか、少なくとも７倍多いか、少なくとも８倍多いか、少なくとも９倍多いか、少なくとも１０倍多いか、少なくとも１５倍多いか、または少なくとも２０倍多いことを指す。

【0080】

本明細書で使用する場合、「血友病」という用語は、凝血または血液凝固の低下を大きな特徴とする病態群を指す。血友病は、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型の血友病を指すこともあるし、または３つのすべての疾患型の複合型を指すこともある。Ａ型血友病（血友病Ａ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の低下または喪失を原因とし、血友病の亜型の中で最も顕著に見られるものである。Ｂ型血友病（血友病Ｂ）は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の凝固機能の喪失または低下に起因する。Ｃ型血友病（血友病Ｃ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）の凝固活性の喪失または低下の結果である。血友病Ａ及び血友病Ｂは、Ｘ連鎖性疾患であり、血友病Ｃは、常染色体性である。血友病に対する従来の治療には、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ（Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）－ＶＨを含む）及びＦＸＩのような凝固因子、ならびにＦＥＩＢＡ－ＶＨ、デスモプレシン及び血漿輸液の予防的投与及びオンデマンド投与の両方が含まれる。

【0081】

本明細書で使用する場合、「ＦＶＩＩＩ遺伝子療法」という用語には、血友病と関連する１つ以上の症状（例えば臨床的因子）を緩和したり、その症状を減少させたり、またはその再発を予防したりするために、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を患者に供給する任意の治療手法が含まれる。この用語には、血友病の個体の健康を維持または改善するために、第ＶＩＩＩ因子の任意の修飾形態（例えば第ＶＩＩＩ因子バリアント）を含む第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を含む任意の化合物もしくは薬物の投与、任意の手順もしくはレジメンの実施を行うことが含まれる。ＦＶＩＩＩ療法の過程またはＦＶＩＩＩ治療剤の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られた結果に基づいて変更できることは、当業者には明らかであろう。

【0082】

本明細書で使用する場合、「バイパス療法」という用語には、血友病と関連する１つ以上の症状（例えば臨床的因子）を緩和したり、その症状を減少させたり、またはその再発を予防するために、第ＶＩＩＩ因子ではない止血剤、化合物または凝固因子を患者に供給する任意の治療手法が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ではない化合物及び凝固因子としては、第ＶＩＩＩ因子阻害バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、組み換え活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮製剤及び活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤が挙げられるが、これらに限定されない。第ＶＩＩＩ因子ではないこれらの化合物及び凝固因子は、組み換えたものまたは血漿由来であってよい。バイパス療法の過程またはバイパス療法の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られた結果に基づいて変更できることは、当業者には明らかであろう。

【0083】

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸及び従来の血友病Ａ治療剤の投与を含む「併用療法」には、血友病と関連する１つ以上の症状（例えば臨床的因子）を緩和したり、その症状を減少させたり、またはその再発を予防したりするために、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸と、第ＶＩＩＩ因子分子及び／または第ＶＩＩＩ因子ではない止血剤（例えばバイパス治療剤）との両方を患者に供給する任意の治療手法が含まれる。この用語には、任意の修飾形態の第ＶＩＩＩ因子を含む第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を含む、任意の化合物もしくは薬物の投与、または任意の手順もしくはレジメンの実施を行うことが含まれ、この療法は、血友病の個体の健康を維持または改善するのに有用であるとともに、本明細書に記載されている任意の治療剤を含む。

【0084】

「治療上有効な量もしくは用量」、「治療上十分な量もしくは用量」または「有効または十分な量もしくは用量」とは、その量または用量を投与した場合に治療効果をもたらす用量を指す。例えば、血友病の治療に有用な薬物の治療上有効な量は、血友病と関連する１つ以上の症状を予防または緩和できる量であることができる。正確な用量は、治療の目的によって左右され、当業者であれば、既知の技術を使用して確認することができるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。

【0085】

本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖をコードする、ＤＮＡ分子のセグメント（例えばコード領域）を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ポリペプチド鎖の産生に関与するコード領域の直前にある領域、その領域の直後にある領域、及び／またはその領域に介在する領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域またはイントロンなどの調節エレメント）によって位置が定められる。

【0086】

本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、細胞内でコード配列を発現させるプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、イントロンなどのヌクレオチド配列を指す。

【0087】

本明細書で使用する場合、「プロモーターエレメント」という用語は、コード配列の発現の制御を助けるヌクレオチド配列を指す。概して、プロモーターエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’に位置する。しかしながら、特定の実施形態では、プロモーターエレメントは、イントロン配列内、またはコード配列の３’に位置してもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子療法用ベクターに有用なプロモーターは、標的タンパク質の天然型遺伝子に由来する（例えば第ＶＩＩＩ因子プロモーター）。いくつかの実施形態では、遺伝子療法用ベクターに有用なプロモーターは、標的生物の特定の細胞または組織における発現に特異的である（例えば肝特異的プロモーター）。さらに別の実施形態では、十分に特徴付けられている複数のプロモーターエレメントの１つが、本明細書に記載されている遺伝子療法用ベクターで使用されている。十分に特徴付けられているプロモーターエレメントの非限定的な例としては、ＣＭＶ初期プロモーター、β－アクチンプロモーター及びメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、標的タンパク質の実質的に連続的な発現を駆動する構成的プロモーターである。別の実施形態では、そのプロモーターは、特定の刺激（例えば、特定の治療または薬剤への曝露）に応答して、標的タンパク質の発現を駆動する誘導性プロモーターである。ＡＡＶによる遺伝子療法のためのプロモーターの設計の概説については、Ｇｒａｙらの文献（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３－５３（２０１１））を参照されたい。その内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される。

【0088】

本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法用のコンストラクトをコードする核酸）を宿主細胞に移入するのに使用する任意のビヒクルを指す。いくつかの実施形態では、ベクターは、そのビヒクルを標的核酸とともに複製するように機能するレプリコンを含む。遺伝子療法に有用なベクターの非限定的な例としては、ｉｎ ｖｉｖｏ複製の自律性単位として機能するプラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体及びウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ポリヌクレオチド）を導入するためのウイルスビヒクルである。当該技術分野では、遺伝子療法に有用な改変型の真核生物ウイルスが数多く知られている。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子療法に使用するのに特に適しているが、その理由は、ヒトが、このウイルスの天然の宿主であり、その天然のウイルスは、いずれの疾患にも寄与しないことが知られており、このウイルスが誘起する免疫応答は軽度だからである。

【0089】

本明細書で使用する場合、「ＣｐＧアイランド」という用語は、ポリヌクレオチド内の領域のうち、ＣｐＧジヌクレオチドの密度が統計的に高い領域を指す。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（例えば、コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の領域は、２００塩基対のウィンドウにわたって、（ｉ）ＧＣ含有率が５０％超であり、かつ（ｉｉ）下記の関係：

によって定義されるように、ＣｐＧジヌクレオチド予測値に対するＣｐＧジヌクレオチド観察値の比の値が少なくとも０．６である場合には、ＣｐＧアイランドである。ＣｐＧアイランドを特定する方法に関するさらなる情報については、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（２）：２６１－８２（１９８７）を参照されたい。その内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される。

【0090】

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、及びそれらのポリマー、ならびにそれらの相補体を指す。この用語には、既知のヌクレオチドアナログを含むか、または修飾された主鎖残基もしくは結合を含む核酸であって、合成、天然、及び非天然のものであり、基準となる核酸と類似の結合特性を持ち、基準となるヌクレオチドと同様の形で代謝される、核酸が含まれる。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0091】

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣体を含む非天然アミノ酸を指す。天然アミノ酸には、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、及びそれらのアミノ酸を後で修飾させたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリンが含まれる。天然アミノ酸には、例えば、Ｄ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸を含めることができる。本明細書で使用されているアミノ酸には、非天然アミノ酸も含めることができる。アミノ酸アナログとは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合している任意の炭素、を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンメチルスルホニウムを指す。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、広く知られている３文字表記、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ推奨の１文字表記のいずれかによって表されていることがある。ヌクレオチドも同様に、広く認められている１文字表記によって表されていることがある。

【0092】

アミノ酸配列については、核酸配列またはペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加のうち、コード配列内の１つのアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸が変更、付加または欠失されるものは、その変更により、アミノ酸が、化学的に類似したアミノ酸に置換される場合には、「保存的修飾バリアント」であることを当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。このような保存的修飾バリアントは、本開示の多型バリアント、種間ホモログ及びアレルに加えて存在し、これらを除外するものではない。

【0093】

機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において周知である。特定のアミノ酸、例えば、触媒性アミノ酸、構造アミノ酸または立体的に重要なアミノ酸の機能性に応じて、様々なアミノ酸群を互いに対する保存的置換とみなすことができる。表１には、アミノ酸の電荷及び極性、アミノ酸の疎水性、アミノ酸の表面露出性／構造的性質、ならびにアミノ酸の二次構造傾向に基づき、保存的置換とみなされるアミノ酸群が示されている。

【0094】

（表１）タンパク質の残基の機能性に基づく、保存的アミノ酸置換の群

【0095】

「同一」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸配列またはペプチド配列との関連では、例えば、ＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターで使用するか、または手動アラインメント及び目視確認によって測定した場合に、同じである２つ以上の配列もしくは部分配列、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが所定のパーセンテージである（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって一致率が最大になるように比較及びアラインメントしたときに、所定の領域にわたって、同一性が約６０％、好ましくは、同一性が６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である）２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。

【0096】

当該技術分野で知られているように、いくつかの異なるプログラムを用いて、タンパク質（または下に論じられているように、核酸）が、既知の配列と同一であるかまたは類似している配列を有するか定めてよい。配列同一性及び／または配列類似性は、当該技術分野で知られている標準的な技術を使用して求め、この技術としては、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の、局所的な配列同一性のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の、配列同一性のアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムの、コンピューターによるインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２：３８７－３９５（１９８４）に説明されている配列プログラムＢｅｓｔ Ｆｉｔ（好ましくは、デフォルト設定を使用する）、または検証によるものが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、同一性パーセントは、ＦａｓｔＤＢによって、ミスマッチペナルティ１、ギャップサイズペナルティ１、ギャップサイズペナルティ０．３３及びジョイニングペナルティ３０というパラメーターに基づいて計算する。“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ（そのすべては、参照により援用される）。

【0097】

有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的なペアワイズアラインメントを用いて、関連する配列群に由来する複数配列のアラインメントを行う。アラインメントを行うために用いたクラスター関係を示す樹形図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰでは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０（１９８７）の累進的アラインメント方法を簡略化したものを利用し、この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３（１９８９）に説明されているものと類似しており、いずれの文献も、参照により援用される。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、デフォルトのギャップ加重３．００、デフォルトのギャップ長加重０．１０及び加重エンドギャップが挙げられる。

【0098】

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７（１９９３）に説明されている、ＢＬＡＳＴのアルゴリズムであり、いずれの文献も、参照により援用される。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０－４８０（１９９６）、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ］から得たＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２というプログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２では、いくつかの検索パラメーターが用いられ、その大部分は、デフォルト値に設定する。調節可能なパラメーターは、オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１という値に設定する。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２のパラメーターは、ダイナミック値であり、特定配列の構成、及び対象とする配列の検索先である特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが、それらの値を調節して、感度を上昇させてもよい。

【0099】

さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２に報告されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴであり、この文献は、参照により援用される。Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴでは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコア、９に設定した閾値Ｔパラメーター、ギャップなしの伸長を開始させるための２ヒット法、ギャップ長ｋにコスト１０＋ｋを負荷、１６に設定したＸｕ、及びデータベース検索段階には４０に、アルゴリズムの出力段階には６７に設定したＸｇを使用する。ギャップ付きのアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによって開始される。

【0100】

アミノ酸配列同一性パーセントの値は、アラインメントされた領域内で、マッチする同一残基の数を「長い方の」配列の残基の総数で除すことによって求める。「長い方の」配列は、アラインメントされた領域（アラインメントスコアを最大にするために、ＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２によって導入されたギャップは無視する）内で、実際の残基が最も多い配列である。同様に、特定されたポリペプチドのコード配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、候補配列内のヌクレオチド残基のうち、細胞周期タンパク質のコード配列内のヌクレオチド残基と同一である残基の割合として定義する。好ましい方法では、デフォルトパラメーターに設定した、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを、オーバーラップスパン１、オーバーラップフラクション０．１２５で使用する。

【0101】

アラインメントには、アラインメントしようとする配列にギャップを導入することが含まれることもある。さらに、図２の配列（配列番号１）によってコードされるタンパク質よりも多いかまたは少ないアミノ酸を含む配列については、一実施形態では、配列同一性の割合は、アミノ酸またはヌクレオチドの総数に対する、同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数に基づいて求められるものと理解される。したがって、例えば、図２に示されている配列（配列番号１）よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では、下に論じられているように、その短い方の配列内のヌクレオチドの数を用いて求めることになる。同一性パーセントの計算の際には、挿入、欠失、置換などの種々の配列バリエーションの出現に対して、相対的重みを付与しない。

【0102】

一実施形態では、同一性のみにプラス（＋１）のスコアを付し、あらゆる形態の配列バリエーションには、ギャップを含め、「０」という値を割り当てるので、配列類似性の計算について後述されているように、加重スケールまたは加重パラメーターの必要性がなくなる。配列同一性パーセントは、例えば、アラインメントされた領域内で、マッチする同一残基の数を「短い方の」配列の残基総数で除し、１００を乗じることによって計算してよい。「長い方の」配列は、アラインメントされた領域内で、実際の残基が最も多い配列である。

【0103】

「アレルバリアント」という用語は、特定の遺伝子座における遺伝子の多型、その遺伝子のｍＲＮＡ転写物から得たｃＤＮＡ、及びそれらによってコードされるポリペプチドを指す。「好ましい哺乳動物コドン」という用語は、アミノ酸をコードするコドンセットのうち、哺乳動物細胞内で発現するタンパク質で最も使われる頻度が高いコドンサブセットを指し、以下のリスト：Ｇｌｙ（ＧＧＣ、ＧＧＧ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）、Ａｓｐ（ＧＡＣ）、Ｖａｌ（ＧＴＧ、ＧＴＣ）、Ａｌａ（ＧＣＣ、ＧＣＴ）、Ｓｅｒ（ＡＧＣ、ＴＣＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ｔｙｒ（ＴＡＴ、ＴＡＣ）、Ｌｅｕ（ＣＴＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ、ＡＧＧ、ＡＧＡ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｈｉｓ（ＣＡＣ）及びＰｒｏ（ＣＣＣ）から選択される。

【0104】

本明細書で使用する場合、コドン変更型という用語は、ポリペプチド（例えば第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドをコードする天然型ポリヌクレオチドのコドンの少なくとも１つが、そのポリヌクレオチド配列の特性を改善するために変更されている配列を指す。いくつかの実施形態では、その特性の改善により、そのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写の増大、そのｍＲＮＡの安定性の上昇（例えば、ｍＲＮＡの半減期の改善）、そのポリペプチドの翻訳の増加、及び／またはそのポリヌクレオチドのベクター内でのパッケージング量の増加が促進される。特性を改善させる目的で使用できる変更の非限定的な例としては、特定のアミノ酸のコドンの使用頻度及び／または分布の変更、全体的及び／または局所的なＧＣ含有率の調整、ＡＴリッチ配列の除去、繰り返される配列エレメントの除去、全体的及び／または局所的なＣｐＧジヌクレオチド含有量の調整、潜在性調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックスエレメント及びＣＣＡＡＴボックスエレメント）の除去、イントロン／エクソンスプライス部位の除去、調節配列の改善（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の導入）、ならびに転写ｍＲＮＡ内で二次構造（例えばステムループ）を形成し得る配列エレメントの除去が挙げられる。

【0105】

本明細書に論じられているように、本明細書における開示内容の構成要素に言及するための用語には、様々なものが存在する。「ＣＳ番号」（例えば「ＣＳ０４」）とは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチド、及び／またはそのコードされたポリペプチド（バリアントを含む）を指す。例えば、ＣＳ０４－ＦＬは、ＣＳ０４のポリヌクレオチド配列によってコードされるＣＳ０４の完全長のコドン変更型ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す（本明細書では、そのアミノ酸配列は「ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ」、その核酸配列は「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ」という場合もある）。同様に、「ＣＳ０４－ＬＣ」とは、ＦＶＩＩＩポリペプチドの軽鎖をコードするコドン変更型核酸配列（「ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ」）、またはＣＳ０４のポリヌクレオチド配列によってコードされるＦＶＩＩＩ軽鎖のアミノ酸配列（本明細書では、「ＣＳ０４－ＬＣ－ＡＡ」という場合もある）のいずれかを指す。同様に、ＣＳ０４－ＨＣ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＡＡ及びＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡも、ＦＶＩＩＩ重鎖の同じものである。当業者であれば明らかであるように、ＣＳ０４のように、コドンが変更されているのみであるコンストラクト（例えば、Ｒｅｆａｃｔｏと比べて、追加のアミノ酸置換を含まない）では、そのアミノ酸配列は、コドン最適化によって変更されていないアミノ酸配列と同一となる。すなわち、本開示の配列コンストラクトとしては、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ、ＣＳ０４－ＬＣ－ＡＡ、ＣＳ０４－ＨＣ－ＡＡ及びＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0106】

ＩＩＩ．コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアント
いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン変更型ポリヌクレオチドは、ＡＡＶベースの遺伝子療法用コンストラクトで投与すると、第ＶＩＩＩ因子の発現を著しく改善させる。このコドン変更型ポリヌクレオチドでは、コドン最適化された従来のコンストラクトと比べて、ＡＡＶビリオンのパッケージング量の改善も見られる。実施例２及び表４に示されているように、本出願人は、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖と、活性ＦＶＩＩＩａタンパク質の成熟をｉｎ ｖｉｖｏで促すために、フューリン切断部位を含む短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（「ＳＱ」リンカー）とを有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチド（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の発見を通じて、これらの利点を実現させた。

【0107】

一実施形態では、本発明で提供するコドン変更型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４（配列番号１）内の配列のうち、少なくとも、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする配列との配列同一性が高いヌクレオチド配列を有する。当該技術分野で知られているように、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏ活性には必須ではない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で提供するコドン変更型ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインを完全に欠損している。いくつかの実施形態では、天然型の第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインが、フューリン切断部位を含む短いアミノ酸リンカー、例えば、ＣＳ０４（配列番号２）コンストラクトの７６０～７７３番目のアミノ酸からなる「ＳＱ」リンカーに置き換えられている。「ＳＱ」リンカーは、ＢＤＬＯ０４（アミノ酸配列の場合にはＢＤＬＯ０４－ＡＡ、ヌクレオチド配列の場合にはＢＤＬＯ０４－ＮＡ）ともいう。

【0108】

一実施形態では、そのコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、それぞれ、ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖である。別の実施形態では、そのコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、別の哺乳動物（例えばブタ第ＶＩＩＩ因子）に由来する重鎖配列及び軽鎖配列である。さらに別の実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、キメラの重鎖及び軽鎖（例えば、ヒトの配列と第２の哺乳動物の配列との組み合わせ）である。さらに別の実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、別の哺乳動物に由来する重鎖及び軽鎖のヒト化型、例えば、別の哺乳動物に由来する重鎖配列及び軽鎖配列であって、ヒトに投与したときに、得られるペプチドの免疫原性を低下させるために、所定の位置がヒト残基に置換されている、配列である。

【0109】

ヒト遺伝子のＧＣ含有率は、２５％未満から９０％超まで大きく変動する。しかしながら、概して、ＧＣ含有率の高いヒト遺伝子ほど、高レベルで発現する。例えば、Ｋｕｄｌａ ｅｔ ａｌ．，（ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．，４（６）：８０（２００６））では、遺伝子のＧＣ含有率が上昇すると、主に、転写が増大するとともに、ｍＲＮＡ転写物の高い定常状態レベルがもたらされることによって、コードされるポリペプチドの発現が増加することが示されている。概して、コドン最適化された遺伝子コンストラクトの望ましいＧＣ含有率は、６０％以上である。しかしながら、天然型のＡＡＶゲノムは、ＧＣ含有率が５６％前後である。

【0110】

したがって、いくつかの実施形態では、本発明で提供するコドン変更型ポリヌクレオチドは、ＣＧ含有率が、天然型のＡＡＶビリオン（例えばＧＣが５６％前後）のＧＣ含有率にさらに近く、これは、哺乳動物細胞内での発現のために、従来コドン最適化されているポリヌクレオチドの好ましいＣＧ含有率（例えば６０％以上のＧＣ）よりも低い。実施例１に概説されているように、ＧＣ含有率が約５６％であるＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）は、同様にコドン変更型でありかつＧＣ含有率がより高いコード配列と比べて、ビリオンのパッケージング量が改善している。

【0111】

したがって、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、６０％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５９％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５８％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５７％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６％以下である。

【0112】

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５４％～５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５５％～５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６％～５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５４％～５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５５％～５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６％～５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５４％～５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５５％～５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６％～５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５４％～５６％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５５％～５６％である。

【0113】

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６±０．５％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６±０．４％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６±０．３％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６±０．２％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６±０．１％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドの全体的なＧＣ含有率は、５６％である。

【0114】

Ａ．第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン置換リンカー
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との連結部（例えば、野生型第ＶＩＩＩ因子におけるＢドメイン）がさらに変更されている。ＡＡＶパッケージング能力にはサイズ制限があるので、Ｂドメイン欠失型、Ｂドメイントランケート型、及びまたはリンカー置換型のバリアントは、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法用コンストラクトの有効性を改善するはずである。従来最も使用されているＢドメイン置換リンカーは、ＳＱ ＦＶＩＩＩのリンカーであり、このリンカーは、Ｂドメインの１４アミノ酸のみをリンカー配列として保持している。ブタＶＩＩＩの別のバリアント（米国特許第６，４５８，５６３号に記載されている「ＯＢＩ－１」）は、ＣＨＯ細胞内で十分に発現し、２４アミノ酸というわずかに長めのリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクトは、ＳＱ型のＢドメインリンカー配列を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されているコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子コンストラクトは、ＯＢＩ－１型のＢドメインリンカー配列を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ＳＱ型のＢドメインリンカー（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、ＢＤＬ－ＳＱ－ＡＡ、配列番号３０）を含み、そのリンカーは、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ、配列番号１９）の７６０～７６２番目／１６５７～１６６７番目のアミノ酸を含む（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：９３（２００１））。いくつかの実施形態では、ＳＱ型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を１つ有する。いくつかの実施形態では、ＳＱ型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を２つ有する。

【0116】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型のＢドメインリンカーを含み、そのリンカーは、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ、配列番号１９）の７６０番目／１５８２～１６６７番目のアミノ酸を含む（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１７：１９９９（２００１））。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を１つ有する。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を２つ有する。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ＳＱ型のＢドメインリンカーが伸長されたリンカーを含み、そのリンカーは、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ、配列番号１９）の７６０～７６９番目／１６５７～１６６７番目のアミノ酸を含む（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１６：３４９（２０１０））。いくつかの実施形態では、ＳＱ型のＢドメインリンカーが伸長されたリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を１つ有する。いくつかの実施形態では、ＳＱ型のＢドメインリンカーが伸長されたリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を２つ有する。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ブタＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーを含み、このリンカーは、野生型のブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインに由来するＳＦＡＱＮＳＲＰＰＳＡＳＡＰＫＰＰＶＬＲＲＨＱＲ（配列番号３１）というアミノ酸を含む（Ｔｏｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１２：５１７（２０１０））。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を１つ有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を２つ有する。

【0119】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ヒトＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーを含み、このリンカーは、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ、配列番号１９）の７６０～７７２番目／１６５５～１６６７番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を１つ有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を２つ有する。

【0120】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｏ８型のＢドメインリンカーを含み、このリンカーは、野生型のブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインに由来するＳＦＳＱＮＳＲＨＱＡＹＲＹＲＲＧ（配列番号３２）というアミノ酸を含む（Ｔｏｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１２：５１７（２０１０））。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を１つ有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型のＢドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して、アミノ酸置換を２つ有する。

【0121】

Ｂ．切断可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン変更型ポリヌクレオチド
コドン変更型ポリヌクレオチドＣＳ０４
一実施形態では、本発明で提供するコドン変更型ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで切断可能であるリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端につなぎ合わせるポリペプチドリンカーを含む。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が高い第１のヌクレオチド配列によってコードされ、このＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）のうち、第ＶＩＩＩ因子重鎖をコードする部分である。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が高い第２のヌクレオチド配列によってコードされ、このＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）のうち、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする部分である。そのポリペプチドリンカーは、フューリン切断部位を含み、この部位は、（例えば、前駆体ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現、または前駆体ポリペプチドの投与の後に、）ｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を可能にする。

【0122】

いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９５％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９６％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９７％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９８％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９．５％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９．９％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）と同一であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）と同一である。

【0123】

いくつかの実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子コンストラクトのポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との配列同一性が高い第３のヌクレオチド配列によってコードされ、このＢＤＬＯ０４は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の７６０～７７３番目のアミノ酸に対応する１４アミノ酸のリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）と同一である。

【0124】

いくつかの実施形態では、そのコドン変更型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との配列同一性が高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と同一である。

【0125】

いくつかの実施形態では、そのコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との配列同一性が高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と同一である。

【0126】

Ｃ．第ＶＩＩＩ因子発現ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているコドン変更型ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれている。発現ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（例えば、遺伝子療法に適するベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体などが挙げられる。

【0127】

ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス及びラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタインバーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ならびにポリオウイルスが挙げられる。

【0128】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているコドン変更型ポリヌクレオチドは、遺伝子療法用ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態では、その遺伝子療法用ベクターは、レトロウイルス、特に複製欠損性レトロウイルスである。複製欠損性レトロウイルスを作製するプロトコールは、当該技術分野で知られている。概説については、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）を参照されたい。

【0129】

一実施形態では、その遺伝子療法用ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法用ベクターである。ＡＡＶシステムは、これまでに説明されてきており、概して、当該技術分野において周知である（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９（１９９２）及びＡｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）。これらはそれぞれ、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される）。ｒＡＡＶベクターの作製及び使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。特定の実施形態では、そのＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－８ベクターである。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているコドン変更型ポリヌクレオチドは、レトロウイルス発現ベクターに組み込まれている。これらのシステムは、これまでに説明されてきており、概して、当該技術分野において周知である（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３－１５９（１９８３）、Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４－５１３（１９８８）、Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９－１８８（１９８６）。具体的な実施形態では、そのレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３－２６７（１９９６）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１－８７５，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１－６６４９（１９９７）、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。

【0131】

細胞培養下で、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコドン変更型ポリペプチドから発現させるには、真核生物発現ベクター及び原核生物発現ベクターを含め、多種多様なベクターを使用することができる。特定の実施形態では、細胞培養下で第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現させる際に使用するのに、プラスミドベクターが想定されている。概して、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で使用される。そのベクターは、複製部位、及び形質転換細胞内で表現型の選択を行えるようにできるマーキング配列を有することができる。そのプラスミドは、１つ以上の制御配列、例えばプロモーターに機能可能に連結された、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドを含むことになる。

【0132】

原核生物における発現用のベクターの非限定的な例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのプラスミドが挙げられ、原核生物発現ベクターで使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核生物における発現用のベクターの例としては、（ｉ）酵母での発現の場合には、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクターで、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用したもの、（ｉｉ）昆虫細胞での発現の場合には、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのベクターで、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用したもの、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現の場合には、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのベクター、及びワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルスシステムに由来するベクターで、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ及びβ－アクチンなどのプロモーターを使用したものが挙げられる。

【0133】

Ｄ．投与
本発明は、血友病Ａと診断されたヒト患者（「血友病Ａ患者」または「患者」）に、本発明の、コドン最適化されたコンストラクトを投与することを提供する。概して、本明細書に概説されているように、この投与は、本発明の、コドン最適化されたコンストラクトを含むＡＡＶ粒子を用いて行う。さらに、下により詳細に説明されているように、本発明のコンストラクトの投与は、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの投与によって増強することもできる。

【0134】

体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子
一態様では、本開示は、血友病Ａを治療する方法であって、血友病Ａ患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を（例えば末梢静脈内注入によって）静脈内注入することを含み、そのＡＡＶ粒子が、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

【0135】

一実施形態では、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いコドン変更型ポリヌクレオチドであって、ヒト患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個という用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子で投与されるポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで切断可能であるリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードする。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端につなぎ合わせるポリペプチドリンカーを含む。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が高い第１のヌクレオチド配列によってコードされ、このＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）のうち、第ＶＩＩＩ因子重鎖をコードする部分である。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が高い第２のヌクレオチド配列によってコードされ、このＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）のうち、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする部分である。そのポリペプチドリンカーは、フューリン切断部位を含み、この部位は、（例えば、前駆体ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現、または前駆体ポリペプチドの投与の後に、）ｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を可能にする。

【0136】

いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９５％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９６％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９７％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９８％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９．５％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９．９％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）と同一であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＡＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＡＡと同一である。

【0137】

いくつかの実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子コンストラクトのポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との配列同一性が高い第３のヌクレオチド配列によってコードされ、このＢＤＬＯ０４は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の７６０～７７３番目のアミノ酸に対応する１４アミノ酸のリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の７６０～７７３番目のアミノ酸と同一である。いくつかの実施形態では、そのヒト患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与されるコドン変更型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との配列同一性が高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡと同一である。

【0138】

いくつかの実施形態では、そのコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との配列同一性が高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と同一である。

【0139】

したがって、一実施形態では、本開示は、血友病Ａを治療する方法であって、血友病Ａ患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を静脈内注入することを含み、そのＡＡＶ粒子が、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

【0140】

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子は、１回用量で、静脈内注入によって（例えば、患者の腕の静脈に）投与する。いくつかの実施形態では、１回用量の一部を投与し、その投与に対する有害反応の徴候について、その患者を短時間（例えば３０分）モニタリングしてから、（例えば、有害反応の徴候が見られなかった場合に）その１回用量の残部をその患者に投与する。

【0141】

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は、重度の血友病Ａである。例えば、いくつかの実施形態では、その患者は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに、血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料、例えば、第ＶＩＩＩ因子活性の正常な血液試料（例えば、血友病Ａではないと判断された対象から採取した血液試料）で見られる第ＶＩＩＩ因子活性値、または血友病Ａではないと判断された複数の対象の血液試料で見られる第ＶＩＩＩ因子活性の平均の２％未満である。いくつかの実施形態では、その対象は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに、血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料で見られる第ＶＩＩＩ因子活性値の２％未満である。

【0142】

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は、ＦＶＩＩＩ阻害物質（例えば第ＶＩＩＩ因子阻害抗体）を有さず、重度の血友病Ａ以外の止血異常を有さず、慢性肝機能障害を有さず、及び／または重度の腎臓機能障害を有さない。

【0143】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、そのヒト患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の投与を受ける許可をその患者に与える工程を含み、そのＡＡＶ粒子は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを含む。その方法は、その患者が、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに、その患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルを求めることと、その患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準試料中の第ＶＩＩＩ因子のレベルの約２％未満または約１％未満であるときに、そのＡＡＶ粒子の投与を受ける許可をその患者に与えることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その患者が、ＦＶＩＩＩ阻害物質（例えば第ＶＩＩＩ因子阻害抗体）、重度の血友病Ａ以外の止血異常、慢性肝機能障害及び重度の腎臓機能障害の１つ以上を有するかどうかを判断することと、その患者が、列挙したこれらの条件のいずれかを有する場合には、投与を受ける許可をその患者に与えないことを含む。

【0144】

体重１キログラム当たり５×１０^１３個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子
一態様では、本開示は、血友病Ａを治療する方法であって、血友病Ａ患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を（例えば末梢静脈内注入によって）静脈内注入することを含み、そのＡＡＶ粒子が、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

【0145】

一実施形態では、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いコドン変更型ポリヌクレオチドであって、ヒト患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子という用量で投与されるポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで切断可能であるリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードする。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端につなぎ合わせるポリペプチドリンカーを含む。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が高い第１のヌクレオチド配列によってコードされ、このＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）のうち、第ＶＩＩＩ因子重鎖をコードする部分である。その第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が高い第２のヌクレオチド配列によってコードされ、このＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）のうち、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする部分である。そのポリペプチドリンカーは、フューリン切断部位を含み、この部位は、（例えば、前駆体ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現、または前駆体ポリペプチドの投与の後に、）ｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を可能にする。

【0146】

いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９５％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９６％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９７％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９８％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９．５％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）との配列同一性が少なくとも９９．９％であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）との配列同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＮＡ（配列番号３）と同一であり、第２のヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＬＣ－ＮＡ（配列番号４）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＨＣ－ＡＡ及びＣＳ０４－ＬＣ－ＡＡと同一である。

【0147】

いくつかの実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子コンストラクトのポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との配列同一性が高い第３のヌクレオチド配列によってコードされ、このＢＤＬＯ０４は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の７６０～７７３番目のアミノ酸に対応する１４アミノ酸のリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、その第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）の７６０～７７３番目のアミノ酸と同一である。

【0148】

いくつかの実施形態では、そのヒト患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子という用量で投与されるコドン変更型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との配列同一性が高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９６％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）との同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と同一である。これらの実施形態では、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡと同一である。

【0149】

いくつかの実施形態では、そのコドン変更型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との配列同一性が高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９７％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９８％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．５％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）との同一性が少なくとも９９．９％である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、ＣＳ０４－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と同一である。

【0150】

したがって、一実施形態では、本開示は、血友病Ａを治療する方法であって、血友病Ａ患者に、そのヒト患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を静脈内注入することを含み、そのＡＡＶ粒子が、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

【0151】

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子は、１回用量で、静脈内注入によって（例えば、患者の腕の静脈に）投与する。いくつかの実施形態では、１回用量の一部を投与し、その投与に対する有害反応の徴候について、その患者を短時間（例えば３０分）モニタリングしてから、（例えば、有害反応の徴候が見られなかった場合に）その１回用量の残部をその患者に投与する。

【0152】

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は、重度の血友病Ａである。例えば、いくつかの実施形態では、その患者は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに、血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料、例えば、第ＶＩＩＩ因子活性の正常な血液試料（例えば、血友病Ａではないと判断された対象から採取した血液試料）で見られる第ＶＩＩＩ因子活性値、または血友病Ａではないと判断された複数の対象の血液試料で見られる第ＶＩＩＩ因子活性の平均の２％未満である。いくつかの実施形態では、対象は、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに、血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準血液試料で見られる第ＶＩＩＩ因子活性値の２％未満である。

【0153】

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子を投与されるヒト患者は、ＦＶＩＩＩ阻害物質（例えば第ＶＩＩＩ因子阻害抗体）を有さず、重度の血友病Ａ以外の止血異常を有さず、慢性肝機能障害を有さず、及び／または重度の腎臓機能障害を有さない。

【0154】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、そのヒト患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の投与を受ける許可をその患者に与える工程を含み、そのＡＡＶ粒子は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン変更型ポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを含む。その方法は、その患者が、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けていないときに、その患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルを求めることと、その患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子活性のレベルが、基準試料中の第ＶＩＩＩ因子のレベルの約２％未満または約１％未満であるときに、そのＡＡＶ粒子の投与を受ける許可をその患者に与えることを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その患者が、ＦＶＩＩＩ阻害物質（例えば第ＶＩＩＩ因子阻害抗体）、重度の血友病Ａ以外の止血異常、慢性肝機能障害及び重度の腎臓機能障害の１つ以上を有するかどうかを判断することと、その患者が、列挙したこれらの条件のいずれかを有する場合には、投与を受ける許可をその患者に与えないことを含む。

【0155】

プレドニゾロンまたはプレドニゾンとの併用投与
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子をいずれかの用量で投与することによって、血友病Ａを治療するための上記の方法は、そのヒト患者に、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与して、例えばその対象のサイトカイン及び／またはケモカインの産生量を低下させることによって、例えば炎症性応答のレベルを低下させることも含む。プレドニゾロンまたはプレドニゾンを遺伝子療法と併用投与する方法の例は、例えば国際公開第ＷＯ２００８／０６９９４２号に記載されており、その内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。

【0156】

いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与する前に、ヒト患者に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、そのＡＡＶ粒子を患者に投与する約１週間前、約１日前または約２日前に投与する。いくつかの実施形態では、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンは、そのＡＡＶ粒子を投与する約１週間前、約１日前または約２日前から投与を開始し、そのＡＡＶ粒子の投与後にも投与を継続する。

【0157】

いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与するときに、ヒト対象に併用投与する。例えば、いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、同じ日、例えば、そのＡＡＶ粒子の投与直前または投与直後に投与する。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子の投与するのと同じ日に、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与し、そのＡＡＶ粒子の投与後にも投与を継続する。

【0158】

いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与した後に、患者に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、ＡＡＶ粒子を患者に投与した約１日または２日後に、１回目を投与する。

【0159】

プレドニゾロンまたはプレドニゾンは、経口投与される小分子薬であるので（ただし、静脈内投与もできる）、この文脈における「併用投与」では、１つの溶液が両方の薬物を含む必要はないことに留意されたい。

【0160】

いくつかの実施形態では、そのクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンは、患者に、少なくとも２週間の期間にわたって、例えば、１日に１回または２日に１回、投与する。いくつかの実施形態では、そのクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンは、少なくとも３週間の期間にわたって投与する。いくつかの実施形態では、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの用量は、そのクールの最中に減少させる。例えば、一実施形態では、そのクールは、１日当たり約６０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの投与から開始し、そのクールが進むにつれて減少させる。

【0161】

一実施形態では、そのクールには、そのクールの１週間目に、１日当たり約６０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをヒト患者に投与すること、そのクールの２週間目に、１日当たり約４０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に投与すること、及びそのＡＡＶ粒子の注入直後の３週間目に、１日当たり約３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に投与することが含まれる。

【0162】

いくつかの実施形態では、そのクールには、３週間目の後に、プレドニゾロンまたはプレドニゾンの投与をさらに漸減すること、例えば、漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することが含まれる。一実施形態では、漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンには、１日当たり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾン、１日当たり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾン、１日当たり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾン、及び１日当たり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの用量（例えば、それぞれの濃度で１回用量以上）を続けて投与することが含まれる。

【0163】

一実施形態では、漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンには、最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの完了後（例えば直後）に、１日当たり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に５日連続で投与すること、その患者に２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを５日間投与した後（例えば直後）に、１日当たり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に３日連続で投与すること、その患者に１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを３日間投与した後（例えば直後）に、１日当たり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に３日連続で投与すること、その患者に１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを３日間投与した後（例えば直後）に、１日当たり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に３日連続で投与することが含まれる。

【0164】

一実施形態では、漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンには、最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの完了直後に、１日当たり約３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に７日連続で投与すること、その患者に、３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを７日間投与した直後に、１日当たり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に７日連続で投与すること、そのヒト対象に、２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを７日間投与した直後に、１日当たり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に５日連続で投与すること、その患者に、１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを５日間投与した直後に、１日当たり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に５日連続で投与すること、及びその患者に、１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを５日間投与した直後に、１日当たり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に５日連続で投与することが含まれる。

【0165】

いくつかの実施形態では、その患者に投与する漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンの長さは、その患者において、最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの終了時に肝臓炎症の徴候（例えば、第ＶＩＩＩ因子レベル、例えば第ＶＩＩＩ因子力価もしくは第ＶＩＩＩ因子活性の低下、または肝臓酵素の増加によって示される場合）が依然として見られるかに基づいて定める。

【0166】

例えば、一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をその患者に投与した後、かつその患者が、最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療を受けている間に、患者の血流中（例えば、患者から採取した血液試料中）の第ＶＩＩＩ因子の第１のレベル（例えば、力価または活性）を求める。最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療の完了後に、患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子の第２のレベル（例えば、力価または活性）を求める。続いて、第ＶＩＩＩ因子の第２のレベルを第ＶＩＩＩ因子の第１のレベルと比較する。第ＶＩＩＩ因子の第２のレベルが低下していないときには（例えば、第ＶＩＩＩ因子の第２のレベルが、第ＶＩＩＩ因子の第１のレベル以上、または第ＶＩＩＩ因子の第１のレベルを下回る閾値量以上であるときには）、その患者に、３週間以内の期間にわたり、第１の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与する。第ＶＩＩＩ因子の第２のレベルが低下しているときには（例えば、第ＶＩＩＩ因子の第２のレベルが、第ＶＩＩＩ因子の第１のレベル未満、または第ＶＩＩＩ因子の第１のレベルを下回る閾値量未満であるときには）、その患者に、３週間を超える期間にわたり、第２の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与する。

【0167】

同様に、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を患者に投与する前（例えば、またはそのすぐ後）に、患者の血流中の肝臓酵素の第１のレベル（例えば、肝臓酵素の力価または活性）を求める。最初のクールのグルココルチコイドステロイド治療の完了後に、患者の血流中の肝臓酵素のレベルの第２のレベル（例えば、肝臓酵素の力価または活性）を求める。続いて、肝臓酵素の第２のレベルを肝臓酵素の第１のレベルと比較する。肝臓酵素の第２のレベルが上昇していないときには（例えば、肝臓酵素の第２のレベルが、肝臓酵素の第１のレベルよりも高くないか、または肝臓酵素の第１のレベルを上回る閾値量以下であるときには）、その患者に、３週間以内の期間にわたり、第１の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与する。肝臓酵素の第２のレベルが上昇しているときには（例えば、肝臓酵素の第２のレベルが、肝臓酵素の第１のレベルよりも高いか、または肝臓酵素の第１のレベルを上回る閾値量よりも高いときには）、その患者に、３週間を超える期間にわたり、第２の漸減用量のグルココルチコイドステロイドを投与する。

【0168】

いくつかの実施形態では、第１の漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンには、最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの完了後（例えば直後）に、１日当たり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に５日連続で投与すること、その患者に２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを５日間投与した後（例えば直後）に、１日当たり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に３日連続で投与すること、そのヒト対象に１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを３日間投与した後（例えば直後）に、１日当たり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に３日連続で投与すること、その患者に１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを３日間投与した後（例えば直後）に、１日当たり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に３日連続で投与することが含まれる。

【0169】

いくつかの実施形態では、第２の漸減用量のプレドニゾロンまたはプレドニゾンには、最初のクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンの完了直後に、１日当たり約３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを患者に７日連続で投与すること、その患者に、３０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを７日間投与した直後に、１日当たり約２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に７日連続で投与すること、その患者に、２０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを７日間投与した直後に、１日当たり約１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に５日連続で投与すること、その患者に、１５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを５日間投与した直後に、１日当たり約１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に５日連続で投与すること、及びその患者に、１０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを５日間投与した直後に、１日当たり約５ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンをその患者に５日連続で投与することが含まれる。

【0170】

いくつかの実施形態では、そのクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンは、そのＡＡＶ粒子の投与後、免疫反応の徴候を患者において検出した後に投与する。いくつかの実施形態では、そのクールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンは、肝臓の炎症の徴候を患者において検出した後に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、そのＡＡＶ粒子の投与後、肝臓炎症についてモニタリングし、肝臓の炎症が検出されたら、患者に、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する。

【0171】

いくつかの実施形態では、患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子の発現または第ＶＩＩＩ因子の活性の急激または大幅な低下により、その対象の肝臓の炎症が示される。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子活性の初期のピークが観察された後に、小幅及び／または徐々に低下する可能性もあり、この低下の後には、第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、やや低めのレベルで産生されている場合もあり、その場合には、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する必要はない。例えばいくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子の投与後、患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子の量（例えば、第ＶＩＩＩ因子の力価または第ＶＩＩＩ因子活性のレベル）をモニタリングし、第ＶＩＩＩ因子の量の急激または大幅な低下が検出された場合に（例えば、第ＶＩＩＩ因子の力価または第ＶＩＩＩ因子活性のレベルにおいて、そのＡＡＶ粒子の投与後の患者の血流中のレベルと比べて、閾値を超える低下が検出された場合に）、その対象に、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する。

【0172】

いくつかの実施形態では、患者の肝臓酵素のレベルの上昇により、その対象の肝臓の炎症が示される。例えば、いくつかの実施形態では、そのＡＡＶ粒子の投与後、患者の肝臓酵素のレベルをモニタリングし、肝臓酵素のレベルの上昇が検出された場合に（例えば、肝臓酵素の量において、例えば、そのＡＡＶ粒子を投与する前またはそのＡＡＶ粒子を投与した直後の患者の肝臓酵素のベースラインレベルと比べて、閾値を超える上昇が検出された場合に）、その対象に、１クールのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する。

【0173】

投与後のモニタリング
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）との配列同一性が高いポリヌクレオチドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の投与後に、患者において、有害反応及び／または治療有効性についてモニタリングするための方法を提供する。いくつかの実施形態では、その患者は、（ａ）肝臓の炎症の徴候（例えば、第ＶＩＩＩ因子レベル（例えば、力価または活性）の急激もしくは大幅な低下、及び／または肝臓酵素（例えば、力価もしくは活性）の上昇による）、（ｂ）患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子阻害抗体の増加、（ｃ）患者の血流中のカプシドタンパク質の増加、（ｄ）患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体の増加、ならびに（ｅ）患者の血流中の、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片の増加、の１つ以上についてモニタリングされる。いくつかの実施形態では、その対象は、１つ以上の有害反応及び／または治療の無効性が検出されたら、さらに治療される。

【0174】

例えば、一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を用いた、血友病Ａの第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法の有効性をモニタリングするための方法を提供する。その方法は、そのＡＡＶ粒子を患者に投与した後に、その患者の血流（例えば、その患者から採取した血液試料）に、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体が存在するかどうかを判断することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、患者の血流中で、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体が検出されたら（例えば、そのＡＡＶ粒子を投与する前の患者におけるレベルと比べて、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体のレベルの上昇が検出されたら）、血友病Ａを治療するための代替薬をその患者に投与することを含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、血友病Ａを治療するためのその代替薬は、代替形態の第ＶＩＩＩ因子（例えば、検出された第ＶＩＩＩ因子阻害抗体の標的となる１つ以上のエピトープを含まないか、またはそのエピトープをマスクする代替形態）である。いくつかの実施形態では、代替形態の第ＶＩＩＩ因子は、化学修飾された第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、化学修飾されたヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質）である。いくつかの実施形態では、代替形態の第ＶＩＩＩ因子は、ヒト以外の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、例えばブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質に由来する、第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。いくつかの実施形態では、血友病Ａを治療するためのその代替薬は、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法剤、例えば、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を含む治療剤である。例えば、いくつかの実施形態では、その第ＶＩＩＩ因子バイパス療法剤は、第ＶＩＩＩ因子阻害バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）複合体、組み換え活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮製剤または活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤である。

【0176】

一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子の投与後の患者の血流中の、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片のレベルをモニタリングするための方法を提供する。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。その方法は、それよりも後の時点に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドのレベルを、患者の血流中で測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。その方法は、それよりも後の時点に、配列番号１の核酸またはその断片の、患者の血流中のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。その方法は、それよりも後の時点に、配列番号１の核酸またはその断片の、患者の血流中のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。その方法のいくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、少なくとも１４日後または少なくとも２１日後である。いくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、そのＡＡＶ粒子の投与から７日後、１４日後または２１日後である。

【0177】

一実施形態では、そのＡＡＶ粒子の投与後の患者の血流中のカプシドタンパク質のレベルをモニタリングするための方法を提供する。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む。その方法は、それよりも後の時点に、前記患者の血流中のカプシドタンパク質のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む。その方法は、それよりも後の時点に、前記患者の血流中のカプシドタンパク質のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む。その方法は、それよりも後の時点に、前記患者の血流中のカプシドタンパク質のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。その方法のいくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、少なくとも１４日後または少なくとも２１日後である。いくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、そのＡＡＶ粒子の投与から７日後、１４日後または２１日後である。

【0178】

一実施形態では、そのＡＡＶ粒子の投与後の患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子阻害抗体のレベルをモニタリングするための方法を提供する。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。その方法は、それよりも後の時点に、その患者の血流中の抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。その方法は、それよりも後の時点に、その患者の血流中の抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することも含み、前記それよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。その方法は、それよりも後の時点に、その患者の血流中の抗第ＶＩＩＩ因子抗体のレベルを測定することも含み、前記それよりも後の時点は、７日以上である。その方法のいくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、少なくとも１４日後または少なくとも２１日後である。いくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、そのＡＡＶ粒子の投与から７日後、１４日後または２１日後である。

【0179】

一実施形態では、そのＡＡＶ粒子の投与後の対象の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルをモニタリングするための方法を提供する。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、前記患者の体重１キログラム当たり１．２×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む。その方法は、それよりも後の時点に、患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり５×１０^１３個の用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、カプシドタンパク質と、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む。その方法は、それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。一実施形態では、その方法は、血友病Ａ患者に、その患者の体重１キログラム当たり、ある用量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することを含み、そのＡＡＶ粒子は、最初の時点に、カプシドタンパク質と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む。その方法は、それよりも後の時点に、前記患者の血流中の抗カプシドタンパク質抗体のレベルを測定することも含み、そのそれよりも後の時点は、７日以上である。その方法のいくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、少なくとも１４日後または少なくとも２１日後である。いくつかの実施形態では、そのそれよりも後の時点は、そのＡＡＶ粒子の投与から７日後、１４日後または２１日後である。

【0180】

臨床診断
一実施形態では、対象が、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断するための方法を提供する。一実施形態では、その方法は、血友病Ａと診断された対象から採取した末梢血試料中の免疫原性媒介物質の第１のレベルを求めることを含む。一実施形態では、その方法は、血友病Ａと診断された対象に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子療法剤を投与した後に、その対象から採取した末梢血試料中の免疫原性媒介物質の第１のレベルを求めることを含む。一実施形態では、対象が、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対して免疫応答を起こしている場合に、第１の投与量のステロイドをその対象に投与する。別の実施形態では、対象が、その第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしていない場合には、第１の投与量のステロイドよりも少ない第２の投与量のステロイドをその対象に投与する。

【0181】

一実施形態では、その免疫原性媒介物質の第１のレベルと、１人以上の健常な個体の末梢血中の免疫原性媒介物質の基準レベルを比較することによって、その対象が、その第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断するための方法を提供する。

【0182】

一実施形態では、その免疫原性媒介物質の第１のレベルと、血友病Ａと診断されたその対象から、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法剤を投与する前に採取した第２の末梢血試料中の免疫原性媒介物質の第２のレベルを比較することによって、対象が、その第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断するための方法を提供する。

【0183】

一実施形態では、対象が、その第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に対して免疫応答を起こしているかどうかを判断する方法であって、免疫原性媒介物質の第１のレベルと、血友病Ａと診断されたその対象から、第１の末梢血試料を採取する前、かつ第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子療法剤をその対象に投与した後に採取した第２の末梢血試料中のその免疫原性媒介物質の第２のレベルを比較することを含む、方法を提供する。

【0184】

一実施形態では、その免疫原性媒介物質は、サイトカインである。別の実施形態では、そのサイトカインは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはインターロイキン６（ＩＬ－６）である。別の実施形態では、そのサイトカインのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって求める。

【0185】

一実施形態では、その免疫原性媒介物質は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路の媒介物質である。別の実施形態では、そのＴＬＲシグナル伝達経路の媒介物質は、ＣＨＵＫ、ＣＸＣＬ８、ＩＦＮＡ２０Ｐ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＮＦＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧ－ＡＳ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ３Ｐ１、ＩＦＮＬ４、ＩＦＮＬＲ１、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＢＫＧ、ＩＫＢＫＧＰ１、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ６、ＩＲＦ７、ＭＹＤ８８、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＦＢＩＢ、ＮＦＫＢＩＥ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ８－ＡＳ１、ＴＬＲ９及びＴＮＦから選択したものである。

【0186】

一実施形態では、その免疫原性媒介物質は、自然免疫シグナル伝達経路の媒介物質または抗ウイルスサイトカインである。別の実施形態では、自然免疫シグナル伝達経路の媒介物質または抗ウイルスサイトカインは、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ３、ＩＬ１０、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ６、ＬＴＡ及びＴＮＦから選択したものである。

【0187】

一実施形態では、その免疫原性媒介物質は、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）シグナル伝達経路の媒介物質である。別の実施形態では、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の媒介物質は、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＲ２、ＨＬＡ－Ａ、ＩＣＯＳ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ９、ＡＫＴ１、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＬＣＫ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＲＩＰＫ１、ＲＡＦ１、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＴＢＰ、ＣＹＬＤ、ＩＬＢＫＢ、ＩＬＢＫＥ、ＩＬＢＫＧ、ＩＬＢＫＧＰ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＢ、ＮＦＫＢＩＥ、ＣＨＵＫ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ５、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＬ１、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ９、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＣＡＭ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ６－ＡＳ１、ＰＥＣＡＭ１及びＶＣＡＭ１から選択したものである。

【0188】

一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１（ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ）の核酸配列である。一実施形態では、ウイルスベクターにより、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象に投与する。別の実施形態では、そのウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。別の実施形態では、そのＡＡＶベクターは、セロタイプ８ＡＡＶベクター（ＡＡＶ８）である。一実施形態では、その遺伝子療法により、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを２×１０^１２コピーという用量で投与する。別の実施形態では、その遺伝子療法により、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを６×１０^１２コピーという用量で投与する。別の実施形態では、その遺伝子療法により、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを１．８×１０^１３コピーという用量で投与する。別の実施形態では、その遺伝子療法により、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを１．２×１０^１３コピーという用量で投与する。一実施形態では、その遺伝子療法により、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを５×１０^１３コピーという用量で投与する。

【実施例】

【0189】

ＩＶ．実施例
実施例１－コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアント発現配列の構築
血友病Ａの遺伝子療法に有効である第ＶＩＩＩ因子コード配列を作製するためには、２つの障害を克服する必要があった。第１に、従来の遺伝子療法用送達ベクター（例えばＡＡＶビリオン）には、ゲノムサイズに制限があるため、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、かなり短くしなければならなかった。第２に、そのコード配列を改変して、（ｉ）その送達ベクター内のパッケージング相互作用を安定化し、（ｉｉ）仲介物質であるｍＲＮＡを安定化し、（ｉｉｉ）そのｍＲＮＡの転写／翻訳のロバスト性を改善する必要があった。

【0190】

第１の目的を達成するために、本出願人は、Ｂドメインを欠失した第ＶＩＩＩ因子バリアントコンストラクトから開始し、このコンストラクトは、本明細書では「ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱ」と称されている。このコンストラクトでは、Ｂドメインが、「ＳＱ」配列という１４アミノ酸の配列に置き換えられている。組み換えＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱは、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）という商品名で販売されており、血友病Ａの管理に有効であることが示されている。しかしながら、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱの天然型のコード配列は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖のヒト野生型核酸配列を含むが、遺伝子療法用ベクターでの発現が効果的ではない。

【0191】

天然型のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱの発現不良に対処するために、Ｆａｔｈらの文献（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，６：ｅ１７５９６（２０１１））に記載されているコドン最適化アルゴリズムを、Ｗａｒｄらの文献（Ｂｌｏｏｄ，１１７：７９８（２０１１））及びＭｃＩｎｔｏｓｈらの文献（Ｂｌｏｏｄ，１２１，３３３５－３３４４（２０１３））に記載されているように改変したものをＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱ配列に適用して、第１の中間体コード配列ＣＳ０４ａを作製した。しかしながら、その改変アルゴリズムを用いて作製したＣＳ０４ａ配列は、その配列のさらなる修飾によって改善可能であることを本出願人は認識した。したがって、本出願人は、ＣｐＧジヌクレオチドを再導入し、アルギニンのＣＧＣコドンを再導入し、ロイシンコドン及びセリンコドンの分布を変更し、高度に保存されたコドン対を再導入し、潜在性のＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス及びスプライス部位エレメントを除去した一方で、ＣｐＧアイランド、ならびにＡＴリッチ及びＧＣリッチな領域が局所的に過剰出現しないようにした。

【0192】

まず、その改変アルゴリズムでは、ＣｐＧジヌクレオチドを含むコドン（例えばアルギニンコドン）を非ＣｐＧのジヌクレオチドコドンに体系的に置き換えるとともに、近隣のコドンによって作られるＣｐＧジヌクレオチドを排除／回避する。ＣｐＧジヌクレオチドをこのように厳格に回避することは通常、ＤＮＡワクチンの筋肉内注射後に、ＴＬＲに誘導される免疫作用を予防する目的で行われる。しかしながら、そのようにすることで、コドン最適化の可能性が制限される。例えば、この改変アルゴリズムでは、アルギニンコドンＣＧＸの完全なセットの使用が排除される。これは特に、ヒト細胞での発現のために遺伝子がコードされる際に問題を生じさせる。ＣＧＣは、高度に発現するヒト遺伝子において最も頻繁に使われるアルギニンコドンであるからである。加えて、近隣のコドンによってＣｐＧが作られるのが回避されることにより、最適化の可能性がさらに制限される（例えば、一緒に利用し得るコドン対の数が制限される）。

【0193】

ＴＬＲに誘導される免疫作用は、肝臓指向性のＡＡＶベースの遺伝子療法に付随する問題ではないと予想されるので、中間体コード配列ＣＳ０４ａ、優先的には第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする配列（例えば、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ－ＳＱコード配列の３’末端）に、ＣｐＧを含むコドン及びＣｐＧを作る近隣のコドンを再導入した。これにより、好ましいヒトコドン、特にアルギニンのコドンの使用頻度が向上する。しかしながら、ＣｐＧ部位の頻度が高いコード配列領域であるＣｐＧアイランドが作られないように注意した。これは、転写開始部位の下流のＣｐＧドメインが、高レベルの遺伝子発現を促すと示唆しているＫｒｉｎｎｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２（６）：３５５１－６４（２０１４））の教示とは対照的である。

【0194】

第２に、この改変アルゴリズムでは、ロイシンのＣＴＧ、バリンのＧＴＧ及びグルタミンのＣＡＧのような特定のコドンのみが適用される。しかしながら、これは、例えば、Ｈａａｓらの文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（３）：３１５－２４（１９９６））で提示されているような、バランスの取れたコドン使用という原理に反する。この改変アルゴリズムによる好ましいコドンの過剰使用を考慮するために、コドン変更に適用される他の規則（例えば、ＣｐＧ頻度及びＧＣ含有率）で許容される場合に、代替的なロイシンコドンを再導入した。

【0195】

第３に、この改変アルゴリズムでは、特定の基準（例えば、ＣＧジヌクレオチドの存在）を満たすときには、それらのコドン対が天然においてどの程度保存されているかにかかわらず、それらのコドン対を置き換える。進化によって保存されてきたと思われる有益な特性を考慮するために、コドン変更に適用される他の規則（例えば、ＣｐＧ頻度及びＧＣ含有率）で許容される場合に、例えば、Ｔａｔｓらの文献（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９：４６３（２００８））に記載されているように、最も保存されたコドン対のうち、そのアルゴリズムによって置き換えられたコドン対、及び最も保存された好ましいコドン対を解析し、調節した。

【0196】

第４に、その中間体コード配列で使われるセリンコドンも再操作した。具体的には、セリンコドンＡＧＣ、ＴＣＣ及びＴＣＴをその改変コード配列に、さらに高い頻度で導入して、ヒトコドン使用頻度への全体的なマッチ度を向上させた（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．による上記文献）。

【0197】

第５に、ＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックスエレメント及びイントロン／エクソンスプライス部位をスクリーニングし、その改変コード配列から除去した。そのコード配列を改変するときには、ＡＴリッチまたはＧＣリッチな領域が局所的に過剰出現しないように注意した。

【0198】

最後に、そのコード配列内のコドン使用頻度を最適化したのに加えて、中間体コード配列ＣＳ０４ａをさらに精緻化するときに、その基本的なＡＡＶビリオンの構造的要件を検討した。ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶビリオンの核酸部分）は、そのカプシド内に、一本鎖ＤＮＡ分子としてパッケージングされる（概説については、Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，２１（４）：５８３－９３（２００８）を参照されたい）。したがって、そのベクターのＧＣ含有率は、ゲノムのパッケージング、ひいては、作製中のベクター収量に影響を及ぼす可能性が高い。多くのアルゴリズムのように、本発明で使用した改変アルゴリズムでは、ＧＣ含有率が少なくとも６０％である最適化遺伝子配列が作られる（Ｆａｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（３）：ｅ１７５９６（２０１１）（ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，（６）３（２０１１）を参照されたい）。しかしながら、ＡＡＶ８カプシドタンパク質は、ＧＣ含有率が約５６％と低めなヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、天然型のＡＡＶ８カプシドタンパク質コード配列をさらに模倣するために、中間体コード配列ＣＳ０４ａのＧＣ含有率を５６％まで低下させた。

【0199】

得られたＣＳ０４コード配列は、図２に示されており、その全体的なＧＣ含有率は５６％である。その配列のＣｐＧジヌクレオチド含有率は、中程度である。しかしながら、ＣｐＧジヌクレオチドは主に、そのコード配列の下流部分、例えば、第ＶＩＩＩ因子軽鎖をコードする部分にある。ＣＳ０４配列は、野生型第ＶＩＩＩ因子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＭ１４１１３）における対応するコード配列とのヌクレオチド配列同一性が７９．７７％である。

【0200】

比較目的で、コドン最適化されたいくつかの他のＲｅＦａｃｔｏコンストラクトを調製した。ＲｅＦａｃｔｏコンストラクトＣＳ０８は、Ｒａｄｃｌｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：２８９－９７（２００８）に記載されているように、コドン最適化した。この文献の内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される。コドン最適化されたＲｅＦａｃｔｏコンストラクトＣＳ１０は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。コドン最適化されたＲｅＦａｃｔｏコンストラクトＣＳ１１は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）から入手した。コドン最適化されたＲｅＦａｃｔｏコンストラクトＣＨ２５は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＧｅｎｅＡｒｔサービス（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＲｅＦａｃｔｏコンストラクトＣＳ４０は、野生型第ＶＩＩＩ因子のコード配列からなる。これらの各ＲｅＦａｃｔｏコード配列間の配列同一性は、下記の表２に示されている。

【0201】

（表２）コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子コンストラクトの同一性パーセントのマトリックス

【0202】

それぞれ異なる合成ＤＮＡ断片を同じベクター骨格プラスミド（ｐＣｈ－ＢＢ０１）にクローニングすることによって、各コンストラクトのプラスミドを構築した。酵素制限部位ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩにより隣接されたＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ断片のＤＮＡ合成は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が行った。そのベクター骨格は、隣接するＡＡＶ２由来の２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、それらには、肝特異的なマウストランスサイレチン遺伝子に由来するプロモーター／エンハンサー配列、それぞれのＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを挿入するための酵素制限部位ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ、ならびに合成ポリＡ部位が含まれる。ＡｓｃＩ部位及びＮｏｔＩ部位を介して、その調製したベクター骨格とインサートとをライゲーションした後、得られたプラスミドをミリグラム単位で増幅した。そのコンストラクトのＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ配列をダイレクトシーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって確認した。このクローニングにより、ｐＣＳ４０、ｐＣＳ０４、ｐＣＳ０８、ｐＣＳ１０、ｐＣＳ１１及びｐＣｈ２５（図１４）という７個の異なるプラスミドコンストラクトを得た。これらのコンストラクトは、同じベクター骨格を有し、Ｂドメインが欠失された同じＦＶＩＩＩタンパク質（Ｒｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）をコードするが、ＦＶＩＩＩコード配列が異なる。

【0203】

Ｇｒｉｅｇｅｒらの文献（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，Ｏｃｔ ６．（２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１８７．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）に記載されているように、３つのプラスミドをトランスフェクションする方法によって、ＡＡＶ８ベースのベクターを調製した。この文献の内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される。対応するＦＶＩＩＩベクタープラスミド、ヘルパープラスミドｐＸＸ６－８０（アデノウイルスのヘルパー遺伝子を有する）、及びパッケージングプラスミドｐＧＳＫ２／８（ｒｅｐ２遺伝子及びｃａｐ８遺伝子をもたらす）を用いて、プラスミドをトランスフェクションするのに、ＨＥＫ２９３懸濁細胞を使用した。そのＡＡＶ８コンストラクトを単離するために、Ｇｒｉｅｇｅｒらの文献（２０１５、上記）に記載されているように、イオジキサノール勾配を用いて、１リットルの培養液の細胞ペレットを処理した。この手順により、ｖＣＳ０４、ｖＣＳ０８、ｖＣＳ１０、ｖＣＳ１１及びｖＣＨ２５というベクター調製物を得た。ＡＡＶ２逆位末端反復配列を標的とするＵｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ手順（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ Ｂ，２３：１８－２８ ２０１２））を用いて、ｑＰＣＲによって、ベクターを定量した。ＡＡＶ２逆位末端反復配列を有するコントロールベクタープラスミドを標準曲線の作成用とした。得られたｖＣＳ０４コンストラクトは、配列番号８として、図７Ａ～７Ｃに示されている。

【0204】

そのベクターゲノムの完全性をＡＡＶのアガロースゲル電気泳動によって解析した。その電気泳動は、Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３：１－７（２０１２）に記載されているようにして行った。簡潔に述べると、ＡＡＶベクター調製物を７５℃で１０分、０．５％のＳＤＳの存在下でインキュベートしてから、室温まで冷却した。１レーン当たりおよそ１．５Ｅ１０個のベクターゲノム（ｖｇ）を１％ １×ＴＡＥのアガロースゲルに流し、６０分間、７Ｖ／ｃｍのゲル長さで電気泳動した。続いて、そのゲルを２×ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍカタログ番号４１００３）溶液で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭＭＰ（Ｂｉｏｒａｄ）によってイメージングした。図１５に示されている結果により、ウイルスベクターｖＣＳ０４及びｖＣＳ４０が、同じサイズのゲノムを有することが示されており、これは、５ｋｂの範囲の明確なバンドによって示されている（図１５、レーン２～４）。およそ５．２ｋｂのベクターサイズにもかかわらず、そのゲノムは、均一なバンドであり、（４．７ｋｂというＡＡＶ野生型ゲノムに対して）いくらか大きめのゲノムが正確にパッケージングされたことが確認される。他のすべてのｖＣＳベクター調製物で、同じゲノムサイズが見られる（データは示されていない）。

【0205】

カプシドタンパク質の予想パターンを確認するために、ベクターｖＣＳ０４及びｖＣＳ４０で、ＳＤＳ ＰＡＧＥの後に、銀染色を行った（図１６）。この図に示されているように、下流の精製手順により、高精製物質が得られ、予想通り、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のタンパク質パターンが示された（図１６、レーン２～４）。他のすべてのウイルス調製物で、同じパターンが見られた（不図示）。ＡＡＶ調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ手順は、標準的な手順に従って行った。各レーンに、それぞれのウイルスコンストラクトを１Ｅ１０ｖｇで含め、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ゲルで、メーカーの指示に従って分離した。銀染色は、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）キット（Ｎｏｖｅｘ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、メーカーの指示に従って行った。

【0206】

驚くべきことに、ＡＡＶベクターｖＣＳ０４は、野生型のコードコンストラクトｖＣＳ４０及びコドン最適化されたその他のコンストラクトと比べて、ビリオンのパッケージング量が多く、これは、ＡＡＶウイルス産生量が増加したことによって測定した。表３に示されているように、そのｖＣＳ０４ベクターは、ｖＣＳ４０よりも実質的に多く複製され、ＡＡＶ力価の値が５～７倍上昇した。

【0207】

（表３）ＡＡＶベクターコンストラクトｖＣＳ０４及びｖＣＤ４０で得られた、細胞培養液（細胞ペレットから精製したもの）１リットル当たりの収量

【0208】

実施例２－コドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアント発現配列のｉｎ ｖｉｖｏ発現
本開示のコドン変更型の第ＶＩＩＩ因子バリアント配列の生物学的効力を試験するために、実施例１に記載されているＲｅＦａｃｔｏ型のＦＶＩＩＩコンストラクトを第ＶＩＩＩ因子欠失マウスに投与した。簡潔に述べると、このアッセイは、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウス（１群当たり６～８匹）において、マウスの体重１キログラム当たり４Ｅ１２個のベクターゲノム（ｖｇ）を尾静脈注射することによって行った。注射から１４日後に、血液を眼窩後部穿刺によって採取し、標準的な手順を用いて、血漿を調製及び凍結した。１４日目の発現レベルを選択した。この時点においては、阻害抗体の影響が最小限であるからである。１４日目よりも後では、このマウスモデルの数匹において、阻害抗体の影響が見られる。メーカー（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から提案されたもの、ほんのわずかな改変を加えた状態で行ったＴｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩＩアッセイを用いて、マウス血漿中のＦＶＩＩＩ活性を求めた。このアッセイでは、その血漿試料は適宜、トロンビン、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、第Ｘ因子及びカルシウムを含むアッセイ試薬で希釈及び混合した。トロンビンによるＦＶＩＩＩの活性化の後、ＦＩＸａ、リン脂質及びカルシウムとの複合体が形成される。この複合体は、ＦＸを活性化して、活性化ＦＸ（ＦＸａ）にし、ひいては、このＦＸａが、パラニトロアニリド（ｐＮＡ）を発色基質から切断する。ｐＮＡ形成の動態を４０５ｎｍで測定する。その比率は、試料におけるＦＶＩＩＩ濃度に正比例する。ＦＶＩＩＩ濃度を基準曲線から読み取り、結果を１ミリリットル当たりのＩＵ ＦＶＩＩＩで示す。

【0209】

下記の表４に示されている結果により、市販のアルゴリズムを用いて設計したコドン変更型配列（ＣＳ１０、ＣＳ１１及びＣＨ２５）では、野生型のＢＤＤ－第ＶＩＩＩ因子コンストラクト（ＣＳ４０）と比べて、ＢＤＤ－第ＶＩＩＩ因子が中程度（３～４倍）にしか増加しなかったことが示されている。同様に、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅらの文献に記載されているようにして調製したコドン変更型のＢＤＤ－第ＶＩＩＩ因子コンストラクト（ＣＳ０８）でも、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの発現は３～４倍しか増加しなかった。この結果は、Ｒａｄｃｌｉｆｆらの文献で報告された結果と一致している。驚くべきことに、ＣＳ０４コンストラクトでは、ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的効力アッセイにおいて、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの発現が大幅に多かった（例えば、７４倍増加）。

【0210】

（表４）様々なＡＡＶベクターコンストラクトによって誘導した、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスの血漿でのＦＶＩＩＩ発現

【0211】

実施例３－マウスにおけるヒトＦＶＩＩＩ遺伝子療法用ベクターの非臨床効果及び毒性評価
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠失または異常を原因とする遺伝性の出血障害であり、血漿由来または組み換えの因子濃縮製剤で治療する。これらの濃縮製剤は、適切なＦＶＩＩＩレベルを維持して、出血イベントを制御及び予防するために、定期的に注入する必要がある。タンパク質補充療法の課題に鑑みると、遺伝子療法は、血友病Ａ患者に、代替的な治療手法をもたらす可能性がある。機能的なＦ８遺伝子のコピーを標的の肝細胞に導入して、ＦＶＩＩＩの内在発現を誘導することによって、頻繁に凝固因子を注入する必要がなくなる可能性がある。

【0212】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法には、血友病Ａ患者において、臨床上の利点をもたらす可能性がある。コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コンストラクトＣＳ０４を含む、組み換え（ｒ）ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法用ベクターは、コドン最適化されたヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤＦＶＩＩＩ）導入遺伝子を肝特異的トランスサイレチンプロモーターの制御下で送達するように設計されている。このコンストラクトを用いて、Ｆ８ノックアウト（ｋｏ）マウスにおいて、ＦＶＩＩＩ活性についての用量と応答との関係を調べ、１回静脈内投与後の毒性を評価した。

【0213】

簡潔に述べると、この治療の有効性を試験するために、１群当たり１２匹の雄のＦＶＩＩＩノックアウトマウスに、ベクターカプシド粒子（ｃｐ）を１ｋｇ当たり３．０×１０^１１個、１．２×１０^１２個もしくは３．０×１０^１２個、または緩衝液を１０ｍＬ／ｋｇ、１回静脈内投与した。８週間にわたり、眼窩後部血液試料を隔週で採取し、ＦＶＩＩＩについて、発色アッセイを用いて解析した。生存中の最後の血液採取から得た血漿試料は、ＦＶＩＩＩ結合中和抗体の解析にも用いた。観察期間の終了時に、尾先端出血アッセイを用いて、止血制御を評価した。

【0214】

試験の終了時、結合抗体及び中和抗体に対して試験で陽性であった４匹のマウス（３．０×１０^１２ｃｐ／ｋｇのベクターで処置した）以外のすべての試料は、抗ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ結合抗体に対して陰性であった。陽性であったマウスは、ＦＶＩＩＩ活性レベル及び尾先端出血アッセイにおける失血の統計解析から除外した。試験期間にわたって計算したところ、血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、１．２×１０^１２ｃｐ／ｋｇのベクターの投与によって平均０．６ＩＵ／ｍＬに、または３．０×１０^１２ｃｐ／ｋｇのベクターの投与によって平均１．９ＩＵ／ｍＬに、用量依存的に向上したが、緩衝液または３．０×１０^１１ｃｐ／ｋｇのベクターで処置したマウスでは、ＦＶＩＩＩ活性は、定量下限（ＬＬＯＱ）未満であった（図１７）。

【0215】

有効性は、尾先端出血アッセイにおいて、６３日目に評価した。６０分にわたる失血が、体重１ｇ当たりのｍｇで、図１８に示されている。緩衝液または３．０×１０^１１ｃｐ／ｋｇの遺伝子療法用ベクターで処置したマウスで、同程度の失血（それぞれ、６．１ｍｇ／ｇ及び７．５ｍｇ／ｇ）が見られ、検出可能なＦＶＩＩＩ活性が見られなかったことと整合していた。遺伝子療法用ベクターの用量が多いほど、失血が用量依存的に有意に低下した（１．２×１０^１２：０．６ｍｇ／ｇ、３．０×１０^１２：０．４ｍｇ／ｇ、ヨンクヒール－タプストラ検定：片側Ｐ値＜０．００１）。

【0216】

このコンストラクトの毒性を試験するために、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１群当たりｎ＝２０匹）に、１×１０^１３ｃｐ／ｋｇ、３×１０^１３ｃｐ／ｋｇもしくは５×１０^１３ｃｐ／ｋｇの１回ボーラス用量のベクター、または処方緩衝液を静脈内注射した（表５）。毒性の評価は、臨床徴候、体重、飼料消費量、眼科的状態、臨床病理状態及び解剖学的病理状態をベースとした。各コホートから得た５匹のマウスで完全な検死を行い、肉眼的知見、器官の重量及び顕微鏡観察結果を記録した。定量ポリメラーゼ連鎖反応による生体内分布評価のために、各コホートのさらに５匹のマウスから組織を採取した。投与前及び検死時に、血液を採取した。ＦＶＩＩＩ活性、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ抗原、抗ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ結合抗体、抗ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ中和抗体及び抗ＡＡＶ８結合抗体を解析した。

【0217】

（表５）毒性試験のデザイン

【0218】

遺伝子療法用ベクターを最大で５×１０^１３ｃｐ／ｋｇで１回、静脈内ボーラス投与したところ、十分な忍容性があったことが分かった。試験中の死亡は見られず、臨床徴候または投与後の観察結果は、ベクターの投与に関連するとは見られなかった。芳しくない眼科的所見も観察されなかった。体重または飼料消費量に対する影響も観察されなかった。臨床での化学的パラメーター、血液学的パラメーターまたは検尿パラメーターの変化も観察されなかった。また、毒性に関連する肉眼的な所見または顕微鏡的な所見も、遺伝子療法用ベクターの投与との関連は見られなかった。

【0219】

ＦＶＩＩＩ活性及びＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ抗原の評価結果は、ばらつきが大きい傾向があり、これは、ヒトＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに対する中和抗体が作られた結果である可能性が最も高い。しかしながら、すべてのベクター群における個々のマウスは、３日目、３週間目及び１８週間目に、大まかなベースラインレベルを上回る活性が見られた（データは示されていない）。摘出した組織試料において、ベクターＤＮＡは、主に肝臓で検出された。肝臓及びその他の組織への生体内分布は、用量相関性があり、概して、最初期の時点に最も高く、時間とともに低下した。脳及び精巣内でのベクターＤＮＡの存在量は、時間とともに有意に低下し、多くのマウスでは、１８週目までに、アッセイのＬＬＯＱ未満となった（図１９）。

【0220】

勘案すると、これらの結果により、コドン最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩ遺伝子療法は、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスに、１．２×１０^１２ｃｐ／ｋｇ以上の用量で投与すると有効であるということが示されている。無毒性量は、この毒性試験で試験した最大用量であった５．０×１０^１３ｃｐ／ｋｇであると考えられた。

【0221】

実施例４－マウスにおけるヒトＦＶＩＩＩ遺伝子療法用ベクターの非臨床効果及び毒性評価
血友病Ａ患者の遺伝子療法用に、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードするＣＳ０４コンストラクトを含むベクターを調製した。その一本鎖（ＳＳ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベースのベクターは、肝特異的トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの制御下で、コドン最適化されたヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）導入遺伝子を送達するように設計されている。

【0222】

１回静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた雄のＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスにおいて、尾先端出血アッセイで、ＦＶＩＩＩの血漿中活性及び止血効果を評価した。血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、１．０ｘ１０^１２ｃｐ／ｋｇ以上の用量で検出可能であった。血漿中ＦＶＩＩＩ活性の用量依存的な向上は、失血の用量依存的な減少に従って見られた。

【0223】

そのベクターを１．９ｘ１０^１２ｃｐ／ｋｇ～５．０ｘ１０^１３ｃｐ／ｋｇの範囲で１回ｉ．ｖ．ボーラス投与した場合の毒性及び生体内分布の評価を、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて行った。そのデータにより、最高用量（５．０×１０^１３ｃｐ／ｋｇ）でも、死亡、有害な臨床徴候、または有害な投与後観察結果が見られなかったことが示されている。生体内分布プロファイリングにより、主に肝臓で検出されたことが示され、低用量に関連して他の組織で見られるベクターＤＮＡは、概ね時間とともに減少した。無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、この毒性試験で試験した最大用量であった５．０ｘ１０^１３ｃｐ／ｋｇという用量であった。組み込み部位解析により、ベクターの組み込みが最小限であったことが示され、以前に肝細胞癌の形成に関係があるとされた遺伝子またはその遺伝子近傍において、クローン性増殖も、優先的組み込みも観察されなかった。勘案すると、これらの臨床前試験により、安全性及び有効性の良好なプロファイルが示されている。

【0224】

いくつかの実施形態では、マウスに投与した投与量は、“Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ－Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｊｕｌｙ ２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙに示されているガイダンスに従って、ヒト用の投与量に変換でき、この文献の内容は参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。

【0225】

実施例５－コドン最適化されたＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子で処置した重度の血友病Ａ患者から得た末梢血中の免疫構成要素の翻訳解析
血友病Ａ患者の遺伝子療法用に、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードするＣＳ０４コンストラクトを含むベクターを調製した。その一本鎖（ＳＳ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベースのベクターは、肝特異的トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの制御下で、コドン最適化されたヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）導入遺伝子を送達するように設計されている。

【0226】

方法：重度のＨＡであるとともに、阻害物質歴がない１８～７５歳の男性は、年間出血回数（ＡＢＲ）が３回以上であったか、またはＦＶＩＩＩによる予防治療を用いており、曝露日数が１５０日超であった場合には適格とした。患者を２つの漸増用量コホートで処置した（コホート１は、２×１０^１２個のカプシド粒子（ｃｐ）／ｋｇ、コホート２は、６×１０^１２ｃｐ／ｋｇであった）。安全性評価には、ベクターの注入に対する寛容性、カプシドまたは導入遺伝子産物の免疫原性、ベクターの排出、有害事象（ＡＥ）及び重篤なＡＥ（ＳＡＥ）が含まれる。有効性評価には、ＦＶＩＩＩの発現、ＡＢＲ、及び外因性ＦＶＩＩＩの利用が含まれる。

【0227】

一次的な結果：４人の患者（各コホートにおいてｎ＝２人）に、そのベクターの静脈内注入を行った。４人全員が、登録前に、ＦＶＩＩＩによる予防を利用していた（ＡＢＲは０～２）。解析時に、すべての患者は、１０カ月以上の追跡調査を受けていた。注入に対する反応は観察されず、ＦＶＩＩＩ阻害物質または血栓症も見られなかった。合わせて６１件のＡＥが記録され、１４件は、副腎皮質ステロイドの使用に関するものであり、８件は、そのベクターに関するものであった。注入から１カ月後に、重度の低リン血症というＳＡＥが１件報告された。ＦＶＩＩＩ活性のピークは、注入から４～９週間後に見られ、用量依存的であった（コホート１［ｎ＝２］：３．８％、１１％、コホート２［ｎ＝２］：５４．７％、６９．４％）。試験患者の特徴及び時間的経過は、図２０Ａ～２０Ｄに示されている。すべての患者において、トランスアミナーゼのわずかな上昇が見られ、副腎皮質ステロイドの投与（ｎ＝３）または副腎皮質ステロイドによる予防（ｎ＝１）を行った。副腎皮質ステロイドの漸減中、ＦＶＩＩＩの発現は有意に減少し、４人の患者のうち３人で、ＦＶＩＩＩ補充を再開した。

【0228】

二次的な結果：ベースライン時、ならびに注入から３０分後、４時間後、８時間後及び２４時間後に、サイトカイン解析のための試料を採取した。スクリーニング時、１週目、そしてそれ以降、３４週目まで週に２回、全血算（ＣＢＣ）、結合及び中和免疫グロブリンアッセイ値を収集した。１８週目から１４４週目まで、プロトコールごとに、収集間隔を１６週間に１回まで長くした。同様の時点に、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ値を５２週目まで収集した。

【0229】

市販の方法を用いて、ＥＬＩＳＡによって、血清中サイトカイン、ならびにＡＡＶ及びＦＶＩＩＩに対する結合抗体を測定した。図２１に報告されているように、いずれの患者でも、注入に対する反応は見られず、注入時、血清中サイトカインの有意な変化も観察されなかった。

【0230】

Ｋｏｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１３７（６）：７６３－７４（２００１）に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスダクションの阻害に基づく中和抗体アッセイを行った。簡潔に述べると、対象血清の２倍段階希釈液をＡＡＶ－ルシフェラーゼと１：１で混合し、２時間、３７℃でインキュベートしてから、組織培養液でＨｕｈ７を感染させるのに使用した。２４時間後、ルシフェリンを加え、ルシフェラーゼ活性を発光測定装置によって定量した。コントロールと比べて５０％以上のルシフェラーゼ活性を阻害した、対象血清の最大希釈率をＮＡｂ力価として記録した。注入後、ＡＡＶカプシド抗原に対する中和抗体及び結合抗体を観察した。図２２Ａ～２２Ｂに示されているように、すべての患者は、２週目までにセロコンバージョンを起こし、抗ＡＡＶ８中和抗体の力価が持続的に高くなった。ＦＶＩＩＩ阻害物質、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩに対するＩｇＧ及びＩｇＭ、ならびにＦＶＩＩＩに対するＩｇＭは、いずれの対象でも、いずれの時点にも検出されなかった。１人の患者で、いくつかの時点に、ＦＶＩＩＩに対する結合ＩｇＧが一過的に低い力価で検出され、臨床上の続発症は見られなかった。

【0231】

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、以前にＫｏｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１３７（６）：７６３－７４（２００１）で説明されたようにして行った。ＰＢＭＣを用いて、ＡＡＶ抗原及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗原に対するＴ細胞応答に関するＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ値を評価した。１０アミノ酸配列ごとに重複している１５ｍｅｒのペプチドからなるライブラリーを作製し、対象とするタンパク質全体を広げ、３プールに編成した。プレートを滅菌ＰＢＳ中のヒトＩＦＮ－γコーティング抗体でコーティングし、洗浄し、完全培地でブロックした。試験対象から得た新鮮なＰＢＭＣをリンパ球培養培地で２×１０細胞／ｍＬの濃度に調節し、ウェルに加えた。１８～２４時間、３７℃で刺激した後、プレートを洗浄し、ヒト抗ＩＦＮ－γ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とインキュベートしてから、アビジン－ＨＲＰとインキュベートした後に、ＡＥＣ発色試薬とインキュベートした。ＡＩＤ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒを用いて、ヒトＩＦＮ－γによる活性化数を定量した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現喪失またはトランスアミナーゼ上昇と一致しなかった（図２３Ａ～２３Ｄ）。全血算集団の有意な変化は観察されなかったが、高用量のグルココルチコイドの使用に対応して、全ＷＢＣ数及び好中球数の一過性の増加が観察された（不図示）。

【0232】

トランスクリプトミクス用試料の調製：注入前、注入から８時間後、１～１４週間後、４カ月後、５カ月後、６カ月後、９カ月後及び１２カ月後に、トランスクリプトミクス用に、同意した３人のＨＡ患者の全血試料を採取した。コントロールである健常なボランティア試料は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。全血試料をＰＡＸＧｅｎｅチューブに集め、－８０℃のフリーザーで保存した。全ＲＮＡをｍｉＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔで抽出した。調製物には、全ＲＮＡ抽出物が含まれ、ヘモグロビンｍＲＮＡを枯渇させ、バルクｍＲＮＡｓｅｑライブラリーを構築してから、シーケンシングした。

【0233】

解析：ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ ＳＲ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｋｉｔ Ｖ３を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｃＢｏｔシステムフローセルでクラスターを生成するために、個々にインデックスを付与した等量の６個のｃＤＮＡライブラリーを８ｐＭの濃度でプールし、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑシステムで、ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳキットを用いて、１００サイクルシーケンシングした。各試料で、およそ５千万本のシーケンスリードを生成した。シーケンスリードのデマルチプレックスを行い、ＣＡＳＡＶＡ１．８というソフトウェアを用いて、ｆａｓｔｑファイルにエクスポートした。ＯｍｉｃＳｏｆｔ ＡｒｒａｙＳｕｉｔｅというソフトウェア（バージョン１０．２．３．１０）及びＲ（バージョン３．６．１）を用いて、データ解析を行った。ＯｍｉｃＳｏｆｔでＯＳＡ４のアルゴリズムを用いて、リードを参照ゲノムにアラインメントした。ｆｉｌｔｅｒＢｙＥｘｐｒでデフォルトパラメーターを用いて、発現遺伝子をフィルタリングしたとともに、ｔｒｉｍｍｅｄ ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ （ＴＭＭ）を用いて、カウント数を正規化したが、いずれの方法もｅｄｇｅＲ（バージョン３．２６．８）で行った。ＰＣＡｔｏｏｌｓライブラリー（バージョン２．６．０；分散により、１％未満の遺伝子を除外）を用いて、発現遺伝子のＴＭＭをさらに主成分解析（ＰＣＡ）に使用して、各試料の全体の分散を確認した。カスタムメイドで書かれたＲプログラム（Ｒコードチーム バージョン３．３．２）を用いて、遺伝子のクラスター生成を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．２．１で、遺伝子クラスターを可視化した。このトランスクリプトミクス解析のワークフローは、図２４に示されている。

【0234】

トランスクリプトミクス解析では、バルクｍＲＮＡを用いたところ、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＩＬ－６、ＴＬＲ１～８、ＳＴＩＮＧ－Ｃ Ｇａｓ経路またはＴ細胞経路のシグナルの有意な変化は示されなかった。注入から８時間後に、ＴＬＲ９、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ５及びＩＲＦ７のシグナルが一過性に微増したが、１型ＩＦＮの応答は活性化しなかった（図２５Ａ～２５Ｄ及び２６Ａ～２６Ｄ）。末梢血において、古典的及び非古典的なＮＦκＢシグナル伝達経路、ケモカイン／サイトカイン、アポトーシス及び細胞接着経路はアップレギュレートしなかった（図２７Ａ～２７Ｄ）。小胞体ストレス経路のアップレギュレーションは観察されなかった。

【0235】

考察／結論：そのベクターの安全性プロファイルは、ＡＡＶ８ベースの遺伝子療法と整合していた。最初のベクター由来のＦＶＩＩＩ発現は、着実な減少を示し、トランスアミナーゼの上昇と整合した。副腎皮質ステロイドの使用によっても、ＦＶＩＩＩ発現の喪失は予防されなかった。

【0236】

この実施例では、用量依存的なＦＶＩＩＩ活性ピークが観察され、出血イベントの一時的な解消及び第ＦＶＩＩＩ因子注入の低減と相関した。しかしながら、ＦＶＩＩＩの発現は、副腎皮質ステロイドの漸減中に有意に減少し、その後、すべての患者は、ＦＶＩＩＩ補充を再開した。最初のベクター由来のＦＶＩＩＩ発現は、着実な減少を示し、これは、副腎皮質ステロイドの使用によっても予防されなかったトランスアミナーゼ上昇と整合した。ＡＡＶ８に対する免疫グロブリンは、依然として、再投与に関連する重大な課題であり、高い力価が少なくとも１２カ月間持続し、数年続くこともある。

【0237】

ＡＡＶ遺伝子療法の研究の多くでは、末梢血を循環するＴ細胞の、ＥＬＩＳＰＯＴによる応答を用いて、免疫抑制を評価し、これを誘導する。本試験では、ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、トランスアミナーゼの上昇またはＦＶＩＩＩ発現の喪失とは相関しなかった。

【0238】

末梢血における探索的なトランスクリプトミクス解析により、炎症に関連する一過性の免疫応答が最小限であったことが示された。評価した免疫原性経路の大半では、健常コントロールとの違いは見られなかった。ＡＡＶ遺伝子療法を血友病Ａに合わせて最適化する試みでは、標的組織特異的な解析に注力して、既存の中和抗体を除去し、前臨床の免疫原性モデルを開発すべきである。

【0239】

本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、例示のためのものに過ぎないとともに、当業者には、それらの実施例及び実施形態に鑑み、様々な修正形態または変更形態が示唆されることになり、それらの形態は、本願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることは理解される。本明細書に引用されている刊行物、特許及び特許出願はいずれも、参照により、その全体が、あらゆる目的のために本明細書に援用される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図27D】

【配列表】

2024527252000001.app

【国際調査報告】