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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-30
(54)【発明の名称】ヘテロ二量体Ｆｃドメイン抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20240723BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240723BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240723BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240723BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240723BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240723BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240723BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240723BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240723BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240723BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240723BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K35/17
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502038
(86)(22)【出願日】2022-07-20
(85)【翻訳文提出日】2024-01-24
(86)【国際出願番号】 EP2022070338
(87)【国際公開番号】W WO2023001884
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】21187191.8
(32)【優先日】2021-07-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514099673
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ダロフスキ， ダイアナ
(72)【発明者】
【氏名】フライモサー－グルントショーバー， アン
(72)【発明者】
【氏名】クライン， クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】メスナー， エッケハルト
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085BB01
4C085BB36
4C085BB42
4C085EE01
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は一般に、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン抗体、並びにＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むそのような抗体に特異的に結合することができる抗原結合受容体との組み合わせに関する。本発明はまた、そのような抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞、及び形質導入されたＴ細胞とそのようなヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む腫瘍標的化抗体とを含むキットに関する。
【選択図】図７Ａ
【選択図】図７Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体。
【請求項2】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１、Ｆｃドメインである、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
抗体が脱フコシル化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を示し、特にエフェクター機能がＡＤＣＣである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を増加させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含み、特にエフェクター機能がＡＤＣＣである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
抗体が、標的細胞上の抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
標的細胞が、がん細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
抗原が、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ｐ９５ ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ－２、ＣＡ－１２－５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＧＤ２、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）及びＣＡ－ＩＸからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
抗原結合部分が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、又はｓｃＦａｂである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項13】
抗体が、多重特異性抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項15】
請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項16】
（ａ）抗体の発現に適した条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に（ｂ）抗体を回収する工程とを含む、抗体を産生する方法。
【請求項17】
請求項１６に記載の方法によって産生される抗体。
【請求項18】
請求項１～１３又は１７のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項19】
がんの治療において組み合わせて使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体、及び形質導入されたＴ細胞であって、第１のサブユニットに特異的に結合できる抗原結合受容体を発現する、形質導入されたＴ細胞。
【請求項20】
抗原結合受容体が、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインサブユニットに特異的に結合することができる、請求項１９に記載の使用のための抗体及び形質導入されたＴ細胞。
【請求項21】
抗原結合受容体が、（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項２０に記載の使用のための抗体及び形質導入されたＴ細胞。
【請求項22】
抗原結合受容体が、（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の使用のための抗体及び形質導入されたＴ細胞。
【請求項23】
形質導入されたＴ細胞が、抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される、請求項１９～２２に記載の使用のための抗体及び形質導入されたＴ細胞。
【請求項24】
個体におけるがんを治療する又は進行を遅延させる方法であって、有効量の抗体及び形質導入されたＴ細胞を前記個体に投与することを含み、ここで、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含み、形質導入されたＴ細胞は、第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現する、方法。
【請求項25】
抗原結合受容体が、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインサブユニットに特異的に結合することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
抗原結合受容体が、（ｇ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｈ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｉ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｊ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｋ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｌ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
抗原結合受容体が、（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
形質導入されたＴ細胞が、抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
がんの治療において形質導入されたＴ細胞と組み合わせて使用するための医薬の製造における抗体の使用であって、ここで、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロメリック（hetereomeric）Ｆｃドメインを含み、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含み、形質導入されたＴ細胞は、第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現する、使用。
【請求項30】
抗原結合受容体が、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインサブユニットに特異的に結合することができる、請求項２９に記載の使用。
【請求項31】
抗原結合受容体が、（ｇ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｈ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｉ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｊ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｋ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｌ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項32】
抗原結合受容体が、（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項33】
形質導入されたＴ細胞が、抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項34】
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と、
を含むキット。
【請求項35】
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
を含むキット。
【請求項36】
実施例のいずれか又は添付の図面のいずれか１つを参照して実質的に上記に記載されたヘテロ二量体Ｆｃドメイン及び抗原結合受容体を含む抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン抗体、並びにＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むそのような抗体に特異的に結合することができる抗原結合受容体との組み合わせに関する。本発明はまた、そのような抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞、及び形質導入されたＴ細胞とそのようなヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む腫瘍標的化抗体とを含むキットに関する。
【背景技術】
【0002】
養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、がん特異的Ｔ細胞を使用する強力な治療手法である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３０）（２０１５），６２－６８）。ＡＣＴは、天然に存在する腫瘍特異的細胞、又はＴ細胞若しくはキメラ抗原受容体を使用した遺伝子操作によって特異的にされたＴ細胞を使用し得る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３０）（２０１５），６２－６８）。ＡＣＴは、進行性及び他の治療抵抗性疾患、例えば、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫又は黒色腫に罹患している患者でさえも、治療に成功し、寛解を誘導することができる（Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（３２）（２００８），５２３３－５２３９；Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１６）（２０１３），１５０９－１５１８；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）３３（６）：５４０－５４９，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１４．５６．２０２５．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｕｇ ２５）。
【0003】
しかし、ＡＣＴは、顕著な臨床有効性にもかかわらず、治療関連毒性によって制限される。ＡＣＴで使用される操作されたＴ細胞の特異性並びに結果として生じるオンターゲット及びオフターゲット効果は、主に、抗原結合受容体に実装された腫瘍標的化抗原結合部分によって駆動される。腫瘍抗原の非排他的発現又は発現レベルの時間差は重篤な副作用を引き起こしたり、治療の許容できない毒性のためにＡＣＴの中止に至ることさえある。
【0004】
さらに、効率的な腫瘍細胞溶解のための腫瘍特異的Ｔ細胞の利用可能性は、工学的に操作されたＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの長期生存と増殖能力に依存している。一方、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生存及び増殖はまた、健常組織の損傷をもたらし得る制御されないＴ細胞応答の持続に起因する望ましくない長期効果をもたらし得る（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１６）：１５０９－１８，Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１４ ２０１４ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７１（１６）：１５０７－１７）。
【0005】
重篤な治療関連毒性を抑制し、ＡＣＴの安全性を向上させるための手法の一つは、免疫シナプスにアダプター分子を導入することによってＴ細胞の活性化及び増殖を制限することである。そのようなアダプター分子は、例えば最近記載された葉酸－ＦＩＴＣスイッチ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１５；１３７：２８３２－２８３５）のような小分子二峰性スイッチを含む。さらなる手法には、Ｔ細胞の特異性を誘導して腫瘍細胞を標的化するタグを含む人工的に改変された抗体が含まれた（Ｍａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１６；１１３（４）：Ｅ４５０－４５８，Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ２０１６；１２８：１－６，Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１６；１１３（４）：Ｅ４５９－４６８，Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２；１８（２３）：６４３６－６４４５）。
【0006】
しかし、既存の手法にはいくつかの限界がある。分子スイッチに依存する免疫シナプスには、免疫応答を誘発したり非特異的なオフターゲット効果をもたらす可能性のあるエレメントを追加的に導入する必要がある。さらに、そのような多成分システムの複雑さは、治療有効性及び忍容性を制限する可能性がある。一方、既存の治療用モノクローナル抗体にタグ構造を導入することで、これらの構築物の有効性及び安全性プロファイルに影響を与える可能性がある。さらに、タグを付加することにより、当該抗体の製造をより複雑にする追加の改変工程及び精製工程が必要となるうえに、追加の安全性試験も必要となる。
【0007】
さらに、Ｆｃ受容体結合が低下した変異ドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体は、本発明者らによって以前に記載されている（国際公開第２０１８／１７７９６６号）。
【0008】
がん患者の治療における安全性及び／又は有効性を改善する可能性を有する改良された養子Ｔ細胞療法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本明細書において提供されるのは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であり、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む。本発明による抗体は、死滅させるために抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞を効率的に動員することができる。さらに、本発明による抗体は、非特異的な交差活性化を伴わずに、ＦｃｇＲ依存性ＡＤＣＣのために、ＮＫ細胞又は単球などの自然免疫細胞を効率的に動員することができる。
【0010】
ＣＡＲ－Ｔ細胞と同時に自然免疫細胞を動員することは、とりわけ、最初に抗体を投与し、抗体がすでにＡＤＣＣ媒介の抗腫瘍効果とデバルキングを誘導した後の時点でのみＣＡＲ－Ｔ細胞を注入することによって、有害事象（サイトカイン放出症候群など）の軽減に役立つ可能性がある。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞と同時に自然免疫細胞を動員することは、腫瘍微小環境においてＦｃｇＲ発現単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化することにより、二次免疫応答の生成に特に役立つ可能性がある。
【0011】
したがって、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体が提供され、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む。
【0012】
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１、Ｆｃドメインである。
【0013】
一態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【0014】
一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
【0015】
一態様では、抗体は脱フコシル化されている。
【0016】
一態様では、ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を示し、特にエフェクター機能はＡＤＣＣである。
【0017】
一態様では、ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を増加させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含み、特にエフェクター機能はＡＤＣＣである。
【0018】
一態様では、抗体は、標的細胞上の抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む。
【0019】
一態様では、上記標的細胞はがん細胞である。
【0020】
一態様では、抗原は、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ｐ９５ ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、ＥｐＣＡＭ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ－２、ＣＡ－１２－５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＧＤ２、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）及びＣＡ－ＩＸからなる群から選択される。
【0021】
一態様では、抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、又はｓｃＦａｂである。
【0022】
一態様では、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。
【0023】
一態様では、抗体は、多重特異性抗体である。
【0024】
さらに、本明細書に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【0025】
さらに、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。
【0026】
さらに、（ａ）抗体の発現に適した条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に（ｂ）抗体を回収する工程とを含む、抗体を産生する方法が提供される。
【0027】
さらに、本明細書に記載の方法によって産生される抗体が提供される。
【0028】
さらに、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。
【0029】
さらに、がんの治療において組み合わせて使用するための本明細書に記載の抗体及び形質導入されたＴ細胞が提供され、ここで、形質導入されたＴ細胞は、第１のサブユニットに特異的に結合できる抗原結合受容体を発現する。
【0030】
一態様では、抗原結合受容体は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインサブユニットに特異的に結合することができる。
【0031】
一態様では、抗原結合受容体は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【0032】
一態様では、抗原結合受容体は、
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0033】
一態様では、形質導入されたＴ細胞は、抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される。
【0034】
さらに、個体におけるがんを治療する又は進行を遅延させる方法であって、有効量の抗体及び形質導入されたＴ細胞を前記個体に投与することを含む方法が提供され、ここで、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含み、形質導入されたＴ細胞は、第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現する。
【0035】
本方法の一態様では、抗原結合受容体は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインサブユニットに特異的に結合することができる。
【0036】
本方法の一態様では、抗原結合受容体は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【0037】
本方法の一態様では、抗原結合受容体は、
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0038】
一態様では、形質導入されたＴ細胞は、抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される。
【0039】
さらに、がんの治療において形質導入されたＴ細胞と組み合わせて使用するための医薬の製造における抗体の使用が提供され、ここで、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロメリック（hetereomeric）Ｆｃドメインを含み、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含み、形質導入されたＴ細胞は、第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現する。
【0040】
該使用の一態様では、抗原結合受容体は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインサブユニットに特異的に結合することができる。
【0041】
一態様では、抗原結合受容体は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【0042】
該使用の一態様では、抗原結合受容体は、
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン若しくはその断片、特にＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくはその断片、
（ｉｉ）ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から選択される少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ｚ細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、若しくはそれらの断片からなる群から個別に選択される少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ２８細胞内ドメイン若しくはその断片である該少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0043】
一態様では、形質導入されたＴ細胞は、抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される。
【0044】
さらに提供されるのは、
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と、
を含むキットである。
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と、
を含むキットである。
【0045】
さらに提供されるのは、
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
を含むキットである。
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
を含むキットである。
【0046】
さらに、実施例のいずれか又は添付の図面のいずれか１つを参照して実質的に上記に記載されるようなヘテロ二量体Ｆｃドメイン及び抗原結合受容体を含む抗体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図3A-C】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図3D-F】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図4A-C】ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１＋標的細胞の存在下で異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図4D-F】ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１＋標的細胞の存在下で異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図4G-I】ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１＋標的細胞の存在下で異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図5】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の活性化。レポーター細胞の活性を、ＩｇＧ及びＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋）標的細胞を標的とする抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１の存在下で評価した（図５Ａ）。抗体の用量依存性活性化を、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用したＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価し、曲線下面積を計算した（図５Ｂ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図6】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の活性化。レポーター細胞の活性を、ＩｇＧ及びＨｅＬａ（ＨＥＲ２＋）標的細胞を標的とする抗ＨＥＲ２（ペルツズマブ）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１の存在下で評価した（図６Ａ）。抗体の用量依存性活性化を、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用したＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価し、曲線下面積を計算した（図６Ｂ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図7A】ノブ・イントゥ・ホール技術を用いて生成されたヘテロ二量体ＩｇＧが描かれている。図７Ａ：本発明によるＩｇＧ型抗体。一方の重鎖は、３２９位（Ｋａｂａｔによる番号付け）にプロリンを含み、これはこの位置の野生型アミノ酸である。もう一方の重鎖には、Ｐ３２９Ｇ（Ｅｕ命名法に従った番号付け）が存在する。この変異は、ＦｃγＲ相互作用を破壊することが知られている。
【図7B】ノブ・イントゥ・ホール技術を用いて生成されたヘテロ二量体ＩｇＧが描かれている。図７Ｂ：さらなる実施態様では、抗体はさらに、変化したグリコシル化パターンを有する。発現細胞株のため、Ｆｃ領域のアスパラギン２９７に非フコシル化オリゴ糖が存在する（アフコシル化Ｆｃ）。この糖鎖操作されたバリアントは、増加した親和性でＦｃｇＲＩＩＩに結合する。
【図8】ヘテロ二量体ＩｇＧのＰ３２９Ｇ変異に結合する、ｓｃＦｖフォーマットの抗Ｐ３２９Ｇ結合部分を有する第２世代キメラ抗原結合受容体の概略図（図８Ａ）。ヘテロ二量体ＩｇＧに存在する非フコシル化オリゴ糖に結合するＣＤ１６細胞外部分を有する第二世代キメラ抗原結合受容体の概略図（図８Ｂ）。
【図9】ＷＳＵＤＬＣＬ２ ＣＤ２０＋標的細胞及び様々な濃度の抗ＣＤ２０ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０糖修飾ＩｇＧ１又は抗ＣＤ２０野生型ＩｇＧ１の存在下での、ＡＤＣＣレポーター細胞株として使用されるＣＤ１６－ＣＡＲＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞（図９Ａ）及び抗Ｐ３２９ＧＣＡＲＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞（図９Ｂ）の活性化。活性化は、ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図10】抗ＣＤ２０ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０糖鎖修飾ＩｇＧ１の存在下でのＣＤ１６ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞の溶解が描かれている。描かれているのは技術的な重複であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図11】描かれているのは、抗ＣＤ２０ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０脱フコシル化ＩｇＧ１及び野生型ＩｇＧ１の、ＷＳＵＤＬＣＬ２（ＣＤ２０＋）とＰＢＭＣの共培養物におけるＡＤＣＣを誘導する能力を示す棒グラフである。値は技術的トリプリケートから計算され、エラーバーは％ＳＤを示す。
【図12】抗ＣＤ２０ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ、抗ＣＤ２０脱フコシル化ＩｇＧ１、及び野生型ＩｇＧ１の存在下でのＮＫ細胞の活性化。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａの上方制御及びＣＤ１６受容体の下方制御によって実証された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【0048】
定義
以下で別途定義されない限り、用語は当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
以下で別途定義されない限り、用語は当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
【0049】
本明細書の目的では、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよいし、アミノ酸配列の変化を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【0050】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【0051】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示的方法を以下に記載する。
【0052】
「親和性成熟」抗体とは、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ以上の改変を有する抗体を指し、そのような改変を有しない親抗体と比較して、そのような改変は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
【0053】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（「ＡＤＣＣ」）は、抗体でコートした標的細胞の免疫エフェクター細胞による溶解につながる免疫機構である。該標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介してＦｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低減」という用語は、上で定義したＡＤＣＣの機構により、標的細胞を取り囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な生産、精製、製剤化及び保存方法（これらは当業者には既知である）を用いて、同じタイプの宿主細胞によって生産された同じ抗体であるが操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。例えば、ＦｃドメインにＡＤＣＣを低減させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低減は、Ｆｃドメインにこのアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。ＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照）。
【0054】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。
【0055】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされているアミノ酸と、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、Ｏ－ホスホセリンなど、後に修飾されるアミノ酸のことである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持ちながら、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸は、一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号のいずれかで称される。
【0056】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴（例えば、Ｆｃ受容体への結合の低減又は別のペプチドとの会合の増加）を有することを条件として、置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達することができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変化させるためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０種類の標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ることが考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用され得る。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示され得る。
【0057】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
【0058】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ、及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照。
【0059】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0060】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及びその誘導体、例えばその断片、並びに抗原結合受容体及びその誘導体である。
【0061】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、該抗原結合部分を含む抗原結合受容体を発現している細胞）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと誘導することができる。抗原結合部分には、本明細書でさらに定義する抗体及びその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ断片）を含む。特定の実施態様では、該抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、且つ当技術分野において公知の抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５種類のアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかを含む。
【0062】
本発明の文脈において、「抗原結合受容体」という用語は、アンカー膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む抗原結合分子に関する。抗原結合受容体は、異なる供給源からのポリペプチド部分から作ることができる。したがって、抗原結合受容体は、「融合タンパク質」及び／又は「キメラタンパク質」としても理解され得る。通常、融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子（好ましくはｃＤＮＡ）を結合して作られるタンパク質である。この融合遺伝子（又は融合ｃＤＮＡ）を翻訳すると、好ましくは、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療における使用のために、組換えＤＮＡ技術によって人工的に作られる。本発明の抗原結合受容体のさらなる詳細は、本明細書において後述する。本発明の文脈において、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、それ自体が細胞内シグナル伝達ドメインに融合しているアンカー膜貫通ドメインにスペーサー配列によって融合された抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解される。
【0063】
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【0064】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体又は抗原結合受容体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0065】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のタンパク質を包含する。この用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。
【0066】
本発明による「ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体」は、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の結合ドメインを有し得、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であり得る。該抗体は、単一種からの完全長であっても、キメラ化若しくはヒト化されていてもよい。２つを超える抗原結合ドメインを持つ抗体の場合、一部の結合ドメインが同一であり、且つ／又は同じ特異性を有する場合がある。
【0067】
本明細書で使用される「ＡＴＤ」という用語は、細胞の１つ又は複数の細胞膜に組み込むことができるポリペプチドストレッチを画定する「アンカー膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＭは細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインに融合することができ、これらの細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインは、細胞膜に限局している。本発明の抗原結合受容体の場合、ＡＴＭは、本発明の抗原結合受容体の膜付着及び限局を付与する。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのＡＴＭと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む。また、ＡＴＭは細胞内シグナル伝達ドメインに融合している場合もある。
【0068】
「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用から区別できることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係なタンパク質に対する抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0069】
本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、当技術分野で周知の「相補性決定領域」に関する。ＣＤＲは、免疫グロブリン又は抗原結合受容体の一部であり、前記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触させるものである。ＣＤＲは該分子の最も可変的な部分であり、このような分子の抗原結合多様性に寄与している。各Ｖドメインには、３つのＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ－Ｈは可変重鎖のＣＤＲ領域を表し、ＣＤＲ－Ｌは可変軽鎖のＣＤＲ領域を表す。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１－９１７）又は「Ｃｈｏｔｈｉａ」（Ｎａｔｕｒｅ ３４２（１９８９），８７７－８８３）において説明されるように決定されることができる。
【0070】
「ＣＤ３ｚ」は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖を指し、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」や「ＣＤ２４７」としても知られる。
【0071】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【0072】
「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、スペーサー配列によって細胞内シグナル伝達ドメイン／共シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８の）に融合された、抗原結合部分の細胞外部分（例えば一本鎖抗体ドメイン）から構成された抗原結合受容体を指す。
【0073】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【0074】
本出願で使用される「ヒト起源の定常領域」又は「ヒト定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ若しくはラムダ領域を意味する。そのような定常領域は当技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５－２７８８も参照）。本明細書で特に明記されない限り、定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【0075】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖の可変ドメインとＦａｂ軽鎖の可変ドメインが交換されている（すなわち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖とを含む。明確にするために本明細書では、Ｆａｂ軽鎖の可変ドメインとＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１ を含むペプチド鎖をクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
【0076】
本明細書で使用される「ＣＳＤ」という用語は、共刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【0077】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
【0078】
本明細書で使用される場合、「操作する、操作された、操作」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。工学的操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、これらの手法の組み合わせとが含まれる。
【0079】
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【0080】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）とからなるタンパク質を指す。
【0081】
本明細書の「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域が含まれる。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞によって産生された抗体は、完全長重鎖を含んでいても、完全長重鎖の切断されたバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、ＥＵ番号付けシステム）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書においては、特に示されない限り、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドなしで示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されたＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵ番号付けシステム）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書中で特に指定しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【0082】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。
【0083】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、天然の抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【0084】
「融合した」とは、成分同士（例えば、Ｆａｂ及び膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合により、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して結合されていることを意味する。
【0085】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫とが含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【0086】
本明細書に記載の「ヘテロ二量体」Ｆｃドメインとは、２つの非同一サブユニットから構成されるＦｃドメインを指す。例えば、Ｆｃドメインサブユニットの一方が変異を含んでいてもよく、他方のＦｃドメインサブユニットは（同じ）変異を含んでいない。
【0087】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、あるいは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【0088】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一態様では、ＶＬについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループカッパＩである。一態様では、ＶＨについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループＩＩＩである。
【0089】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0090】
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
【0091】
一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨにあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬにある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書の例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））、並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部位（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））、並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部位（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
【0092】
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上掲のＣｈｏｔｈｉａ、上掲のＭｃＣａｌｌｕｍ、又は任意の他の科学的に認められた命名システムに従い決定することもできることを理解するであろう。
【0093】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【0094】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【0095】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％又は９９％より高くなるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
【0096】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分類することできる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【0097】
「単離された核酸」とは、自然環境の構成要素から切り離されている核酸分子のことである。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0098】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で発生しても、これらの末端位置の間の任意の位置で発生してもよく、参照配列内の残基間に個別に散在しているか又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続したグループで散在しているかのいずれかである。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて後で考察するもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）のような公知のコンピュータプログラムを用いて、従来通りに決定することができる。
【0099】
「単離された」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体とは、その自然の環境にないポリペプチドの意味である。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現した組換え生産ポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術により分離、断片化又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明のために単離されたものと見なされる。
【0100】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットと会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、この修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電的に有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に起こり、これらは、サブユニットの各々に融合したさらなる構成成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【0101】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち該集団を構成する個々の抗体が、可能性のあるバリアント抗体（これらは例えば天然に存在する変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じ、そのようなバリアントは通常少量存在する）を除き、同一であり且つ／又は同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって製造することができ、これらの方法及びモノクローナル抗体を製造するためのその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【0102】
「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体のことを指す。ネイキッド抗体は、薬学的組成物中に存在し得る。
【0103】
「天然抗体」とは、様々な構造を持つ、天然の免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。
【0104】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならばギャップを導入した後、アライメントのためにいかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列アラインメントを行うための適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性パーセント値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、利用者向け文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録され、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
【0105】
特に明記しない限り、本明細書中の目的のために、アミノ酸配列同一性パーセント値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム又はその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって記載されており、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．又はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａ。代替的に、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダ中に与えられる。
【0106】
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基から構成されている。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、前記塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’に向かって表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は線状又は環状であり得る。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及び／又は例えば宿主若しくは患者におけるｉｎ ｖｉｖｏにおいて、本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされる分子の発現を高めるように化学修飾され得る（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，２０１７年６月１２日にオンライン公開，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ２１０１８２３Ｂ１を参照のこと）。
【0107】
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに通例含まれる説明書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
【0108】
「薬学的組成物」又は「薬学的製剤」という用語は、調製物に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態をしており、また薬学的組成物が投与されるであろう対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない、調製物を指す。
【0109】
「薬学的に許容される担体」とは、薬学的組成物又は製剤中の、有効成分以外の、対象に対して非毒性の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、添加物、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0110】
「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の代わりに、又はこれらと互換的に、使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図されており、このような産物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるものでも組換え技術により生産されるものでもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものであるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上又は２０００以上のアミノ酸からなる大きさのものであってよい。ポリペプチドは、明確に定義された三次元構造を有する場合もあるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。明確に定義された三次元構造を有するポリペプチドは、「フォールディングされた」と言われ、明確に定義された三次元構造を有せずに多数の異なるコンフォメーションを採りうるポリペプチドは、「フォールディングされていない」といわれる。
【0111】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は一般的ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。核酸分子という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【0112】
「結合の低減」、例えばＦｃ受容体への結合の減少は、例えばＳＰＲによって測定される、それぞれの相互作用に対する親和性の減少を指す。明確にするために、この用語には、親和性がゼロ（又は分析法の検出限界未満）に低下すること、つまり相互作用が完全に消失することも含まれる。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
【0113】
「調節配列」という用語は、連結されるコード配列の発現を効果的にするために必要なＤＮＡ配列を指す。このような調節配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物において、調節配列にはプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターが通常含まれる。真核生物においては、調節配列にはプロモーター、ターミネーター、場合によってはエンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子が通常含まれる。「調節配列」という用語は、発現に必要な全ての構成要素を最低限含むことを意図しており、且つ追加の有利な構成要素も含み得る。
【0114】
本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により直線状に結合したアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一方は、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより連結されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に連結している。好ましい実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ断片である。
【0115】
本明細書で使用される「ＳＳＤ」という用語は、「共刺激シグナル伝達ドメイン」を指す。
【0116】
本明細書で使用される場合、「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（及びその文法上の変化形、「治療する」（ｔｒｅａｔ）又は「治療すること」（ｔｒｅａｔｉｎｇ））は、治療される対象における疾患の自然経過を変えるための臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の経過中に実施することができる。治療の所望の効果としては、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【0117】
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１つ又は複数の細胞応答を指す。本発明の免疫活性化Ｆｃドメイン抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【0118】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
【0119】
本明細書で使用される用語「価」は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、その抗原に特異的な１つ（且つ１つを超えない）の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。
【0120】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照。
【0121】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。一部のベクターは、それが作動可能に連結されている核酸の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と称される。
【0122】
組成物及び方法
一態様では、本発明は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体に部分的に基づく。特定の態様では、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む抗体が提供される。特に、本発明は、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの１つにＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む抗体を提供した。本発明の抗体は、例えばがんの治療に有用である。
一態様では、本発明は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体に部分的に基づく。特定の態様では、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む抗体が提供される。特に、本発明は、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの１つにＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む抗体を提供した。本発明の抗体は、例えばがんの治療に有用である。
【0123】
ＣＡＲ－Ｔ細胞と同時に自然免疫細胞を動員することは、とりわけ、最初に抗体を投与し、抗体がすでにＡＤＣＣ媒介の抗腫瘍効果とデバルキングを誘導した後の時点でのみＣＡＲ－Ｔ細胞を注入することによって、有害事象（サイトカイン放出症候群など）の軽減に役立つ可能性がある。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞と同時に自然免疫細胞を動員することは、腫瘍微小環境においてＦｃｇＲ発現単球、マクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化することにより、二次免疫応答の生成に特に役立つ可能性がある。
【0124】
本明細書で提供される抗体は、ＥＵ番号付けに従ってＰ３２９Ｇ変異を含むヘテロ二量体Ｆｃドメイン（例えばヒトＩｇＧ１）Ｆｃ領域を含む。
【0125】
Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体への結合とそれに伴うエフェクター機能を低下させる。Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、特に両方のＦｃドメインサブユニットにおいて、非変異Ｆｃドメインと比較して減少又は消失した親和性でＦｃγ受容体に結合する。しかしながら、本明細書において上述したように、Ｆｃγ受容体媒介受容体機能が望まれる可能性がある。
【0126】
本発明によれば、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体が提供され、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む。一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１、Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【0127】
本発明によるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体は、Ｆｃドメインの異なるサブユニットを含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。したがって、組換え生産における（多重特異性、例えば二重特異性）抗体の収量と純度を向上させるために、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のヘテロ二量体Ｆｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進するさらなる修飾を導入することが有利であろう。
【0128】
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。
【0129】
ヘテロ二量体化を強制するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインを修飾するためのいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分説明されている。典型的には、そのような全ての手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインとＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは両方とも相補的に設計され、それにより、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを構成する重鎖）は、それ自体でホモ二量体化できなくなるが、（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間にホモ二量体が形成されないように）相補的に操作された他のＣＨ３ドメインと強制的にヘテロ二量体化される。重鎖ヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合とベンス・ジョーンズ型の副産物を減少させる（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体において、重鎖－軽鎖修飾（例えば、１つの結合アームでのＶＨとＶＬの交換／置換、及びＣＨ１／ＣＬ界面での反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる選択肢として企図される。
【0130】
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。
【0131】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの界面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、突起が空洞内に配置され、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げる。突起は、最初のポリペプチドの界面にある小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えることによって構築される。突起に対して同一又は同様のサイズの代償空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。
【0132】
このように、好ましい態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の突起を配置可能な空洞が生成される。
【0133】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【0134】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【0135】
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作製することができる。
【0136】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0137】
またさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋が生成し、二量体をさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
【0138】
好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0139】
好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、（任意選択的に、第２の抗原（すなわち、ＦｏｌＲ１）に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニットに（「ノブ」修飾を含む）に融合している。理論に縛られることを望むものではないが、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインをＦｃドメインのノブ含有サブユニットに融合させると、ＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成が（さらに）最小限に抑えられる（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。
【0140】
ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮されており、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
【0141】
一態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づいている。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、並びにＦｃドメインのＣＨ３ドメインのもう一方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。
【0142】
別の態様では、本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ、並びにＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらに、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスに基づく番号付け）。
【0143】
別の態様では、本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、あるいは前記（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（全ての番号付けはＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる）。
【0144】
一態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（特にＬ３６８Ｅ）から選択されるアミノ酸変異をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0145】
一態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２にさらなるアミノ酸変異を含み、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択される。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）をさらに含む。
【0146】
一態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量体化手法が、例えば３６８及び４０９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに基づく番号付け）からなる群から選択される位置でのアミノ酸修飾を用いて代替的に使用される。
【0147】
一態様では、上述のノブ・イントゥ・ホール技術も使用する国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0148】
一態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
【0149】
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの接触面における１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。そのような一態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より具体的にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７のアミノ酸置換を含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換をさらに含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換をさらに、又は代替的に含む（全ての番号付けはＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる）。
【0150】
さらなる態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0151】
さらに別の態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。
【0152】
一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0153】
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を変更させることにより達成され得る。
【0154】
哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、通常、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸などの様々な炭水化物のほか、二分岐オリゴ糖構造の「幹」でＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれる場合がある。いくつかの態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために行われ得る。
【0155】
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、天然抗体又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加した抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％又はさらには約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）。ただし、抗体のわずかな配列の変化により、Ａｓｎ２９７は、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち２９４位と３００位の間に位置することもある。Ｆｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１を参照。
【0156】
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照）が挙げられる。
【0157】
さらなる態様では、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアント、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、抗体バリアントが提供される。そのような抗体バリアントは、上に記載されたように、フコシル化が低下している及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されていることがある。このような抗体バリアントの例は、例えばＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
【0158】
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【0159】
本明細書で提供される抗体は、ＥＵ番号付けに従ってＰ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１）Ｆｃ領域を含む。特定の態様では、１つ又は複数の追加のアミノ酸修飾が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域）を含み得る。
【0160】
特定の態様では、ヘテロ二量体抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一実施態様では、変異Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の低下を示す。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を増加させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。
【0161】
特定の態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の増加を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又ｉｎ ｖｉｖｏの細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体のＦｃγＲ結合が改善された（したがってＡＤＣＣ活性が改善された可能性がある）ことを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現させるのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現させる。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価してもよい。また、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。
【0162】
ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号，及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）。いくつかの態様では、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち、改善又は減少のいずれか）をもたらす改変がＦｃ領域内において行われる。
【0163】
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移動を担う（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記述されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換をＦｃ領域内に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４のうちの１つ又は複数において置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４－２３５２４を参照）。
【0164】
マウスＦｃ－マウスＦｃＲｎ相互作用に重要なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発によって同定されている（例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１－５１８０を参照）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（残基のＥＵ番号付け）が、相互作用に関与している（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５は、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎとの相互作用にとって決定的であることが見出された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、この相互作用には残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５及びＹ４３６が重要であることが示されている（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）では、残基２４８～２５９及び３０１～３１７及び３７６～３８２及び４２４～４３７の様々な変異体が報告され、調査されている。
【0165】
特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５２位及び／又は２５４位及び／又は２５６位（残基のＥＵ番号付け）に置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、２５２、２５４及び２５６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、それらの置換は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
【0166】
本明細書中に報告されるような抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は、短縮されたＣ末端で終わるＰＧである。本明細書で報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、アミノ酸位置のＥＵインデックス番号付け）を含む。本明細書で報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、アミノ酸位置のＥＵインデックス番号付け）を含む。
【0167】
抗原結合部分
一態様では、抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体のパパイン消化により、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ順にＶＨ及びＶＬ）に加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）もそれぞれが含む、２つの同一の抗原結合断片（いわゆる「Ｆａｂ」断片）を生成する。よって「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片を有する抗体断片のことである。さらなる態様では、抗体断片は一本鎖Ｆａｂ断片である。「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、当該リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ断片は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによると、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される可能性がある。
一態様では、抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体のパパイン消化により、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ順にＶＨ及びＶＬ）に加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）もそれぞれが含む、２つの同一の抗原結合断片（いわゆる「Ｆａｂ」断片）を生成する。よって「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片を有する抗体断片のことである。さらなる態様では、抗体断片は一本鎖Ｆａｂ断片である。「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、当該リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ断片は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによると、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される可能性がある。
【0168】
別の態様では、抗原結合部分断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結することも、その逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照。
【0169】
別の態様では、抗原結合部分は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。
【0170】
抗体断片は、本明細書に記載のように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組換え産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
【0171】
別の態様では、抗原結合部分はｃｒｏｓｓＦａｂである。「クロスオーバーＦａｂ分子」（「ｃｒｏｓｓＦａｂ」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわちｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域とからなるペプチド鎖及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域とからなるペプチド鎖を含む。したがって、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖定常領域（ＶＨ－ＣＬ）から構成されたポリペプチドと、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＶＬ－ＣＨ１）から構成されたポリペプチドとを含む。明確にするために、重鎖定常領域を含むポリペプチド鎖を本明細書では重鎖と呼び、軽鎖定常領域を含むポリペプチド鎖を本明細書ではｃｒｏｓｓＦａｂ断片の軽鎖と呼ぶ。
【0172】
標的細胞抗原
本明細書で提供される抗原結合部分は、標的細胞表面分子、例えば腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する。本発明の文脈において、そのような抗原結合部分を含むそのような抗体は、本明細書に記載の形質導入されたＴ細胞を標的細胞（例えば、腫瘍細胞）と物理的に接触させ、そこで細胞は活性化される。本発明の形質導入されたＴ細胞の活性化は、本明細書に記載のとおり、標的細胞の溶解を優先的にもたらす。
本明細書で提供される抗原結合部分は、標的細胞表面分子、例えば腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する。本発明の文脈において、そのような抗原結合部分を含むそのような抗体は、本明細書に記載の形質導入されたＴ細胞を標的細胞（例えば、腫瘍細胞）と物理的に接触させ、そこで細胞は活性化される。本発明の形質導入されたＴ細胞の活性化は、本明細書に記載のとおり、標的細胞の溶解を優先的にもたらす。
【0173】
標的（例えば、腫瘍）細胞の表面に天然に存在する標的細胞抗原（例えば、腫瘍マーカー）の例を本明細書において以下に示し、制限されるものではないが以下が含まれる：ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮成長因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮成長因子３）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原－Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン－１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、カーボンアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、及び／又はヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチド。
【0174】
上記の抗原の配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースで入手でき、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｒｅｖｉｅｗｅｄ％３Ａｙｅｓから検索できる。これらの（タンパク質）配列は、アノテーション付きの改変配列にも関連している。また、本発明は、本明細書で提供される短い配列の相同配列、また遺伝的対立遺伝子バリアントなどが使用される技術及び方法も提供する。好ましくは、本明細書中の短い配列の該バリアントなどが用いられる。好ましくは、該バリアントは遺伝子バリアントである。当業者は、これらのデータバンクエントリーの中から、これらの（タンパク質）配列の適切なコード化領域を容易に推測することができ、また、これらのデータバンクのエントリーはゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡ／ｃＤＮＡも含んでいる場合がある。（ヒト）ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１２８８４（エントリーバージョン１６８、配列バージョン５）から取得することができる；（ヒト）ＣＥＡ（がん胎児性抗原）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６７３１（エントリーバージョン１７１、配列バージョン３）から取得することができる；（ヒト）ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４２２（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＭＳＬＮ（メソテリン）の１つ又は複数の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１３４２１（バージョン番号１３２；配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）の１つ又は複数の配列は、バージョン番号１６５及び配列バージョン２のＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８８８（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ１３４１４（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン番号１１８；配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）の１つ又は複数の配列は、バージョン番号１５３及び配列バージョン３のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１５３２８（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ５３ＥＷ２（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の１又は複数の配列は、バージョン番号１７２及び配列バージョン３のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０９７５８（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ１５６５８（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）の１つ又は複数の配列は、バージョン番号１３４及び配列バージョン１のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｏ４３６５３（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ６ＵＷ９２（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）ＨＥＲ－１（上皮増殖因子受容体）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３（エントリーバージョン１７７、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＨＥＲ－２（受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４６２６（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＨＥＲ－３（受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－３）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８６０（エントリーバージョン１４０、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＣＤ２２（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２２）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０２７３（エントリーバージョン１３５、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＣＤ３３（Ｂリンパ球抗原ＣＤ３３）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０１３８（エントリーバージョン１２９、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＣＡ－１２－５（ムチン１６）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＸＩ７（エントリーバージョン６６、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＨＬＡ－ＤＲの１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ２９９００（エントリーバージョン５９、配列バージョン１）から取得することができる；ヒト）ＭＵＣ－１（ムチン－１）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９４１（エントリーバージョン１３５、配列バージョン３）から取得することができる；（ヒト）Ａ３３（細胞表面Ａ３３抗原）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９７９５（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＰＳＭＡ（グルタメートカルボキシペプチダーゼ２）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４６０９（エントリーバージョン１３３、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）トランスフェリン受容体の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＰ５２（エントリーバージョン９９、配列バージョン１）及びＰ０２７８６（エントリーバージョン１５２、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＴＮＣ（テネイシン）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４８２１（エントリーバージョン１４１、配列バージョン３）から取得することができる；あるいは（ヒト）ＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）の１つ又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６７９０（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から取得することができる。
【0175】
好ましい実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される。
【0176】
上記の標的細胞抗原のいずれかと特異的に結合できる抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、又はｓｃＦａｂ）は、哺乳類の免疫系を免疫する方法及び／又は組換えライブラリーを用いるファージディスプレイなど、当技術分野で周知の方法を用いて生成することができる。
【0177】
ライブラリー由来の抗原結合部分
特定の態様では、本明細書で提供される抗原結合部分はライブラリーに由来する。本発明の抗原結合部分は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）におけるＬｅｒｎｅｒらにおいて総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗原結合部分の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。かかる方法は、例えば、ＦｒｅｎｚｅｌらのｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）、及びＺｈａｏらのＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びに、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、及びＭａｒｋｓ ａｎｄ ＢｒａｄｂｕｒｙのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）に見られる。
特定の態様では、本明細書で提供される抗原結合部分はライブラリーに由来する。本発明の抗原結合部分は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）におけるＬｅｒｎｅｒらにおいて総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗原結合部分の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。かかる方法は、例えば、ＦｒｅｎｚｅｌらのｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）、及びＺｈａｏらのＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びに、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、及びＭａｒｋｓ ａｎｄ ＢｒａｄｂｕｒｙのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）に見られる。
【0178】
ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組換えられており、次いで、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）におけるＷｉｎｔｅｒらにおいて説明されたように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片としてのいずれかで抗体断片を表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗原結合部分を提供する。あるいは、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらのＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ１２：７２５－７３４（１９９３）によって記載されているように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、免疫化を行わずに広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する抗原結合部分の単一供給源を提供することができる。さらに、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許刊行物としては、例えば、以下のものが挙げられる。米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号。
【0179】
コンビナトリアルライブラリーを１つ又は複数の所望の活性を有する抗原結合部分についてスクリーニングするための当技術分野で公知の方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体の提示及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）並びにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）に概説がある。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、ＨｅらのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓらのＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。
【0180】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗原結合部分又は抗体断片は、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体断片と見なされる。
【0181】
親和性
特定の態様では、本明細書で提供される抗原結合部分は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
特定の態様では、本明細書で提供される抗原結合部分は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0182】
一態様では、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイを、約１０の反応単位（ＲＵ）で、固定化された抗原ＣＭ５チップによって２５℃で実行する。一態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、およそ１０反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得るように、５μｌ／分の流速で注入する。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。カイネティクス測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに、２５℃、約２５μｌ／分の流速で注入する。単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムを同時に当てはめることによって会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照。上記表面プラズモン共鳴アッセイによるオンレートが１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オンレートは、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗－抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加又は減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。
【0183】
別の方法では、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一態様では、ＲＩＡは、目的の抗体及びその抗原のＦａｂバージョンを用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、標識されていない抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識された抗原でＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間にわたって室温（およそ２３℃）でブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］－抗原を、目的のＦａｂの段階希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。その後、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次に、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、そのプレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイでの使用のために選択する。
【0184】
キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の態様では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類（サルなど）に由来する可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
特定の態様では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類（サルなど）に由来する可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【0185】
特定の態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択的にヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
【0186】
ヒト化抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説されており、さらに、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植法を記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイド付き選択」手法を記載）で説明されている。
【0187】
ヒト化に使用可能なフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」方法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞性変異を受けた）フレームワーク領域又はヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングから誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が挙げられる。
【0188】
ヒト抗体
特定の態様では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して製造することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に一般的に記載されている。
特定の態様では、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して製造することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に一般的に記載されている。
【0189】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製してもよい。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び米国特許第６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾され得る。
【0190】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
【0191】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択される可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
【0192】
多重特異性抗体
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る。
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る。
【0193】
多重特異性抗体を作製するための手法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２種以上の抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているような三重特異性抗体の調製によっても作製され得る。
【0194】
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
【0195】
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）、又は完全なＦａｂアーム（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号を参照、また、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによっても提供され得る。一態様では、多重特異性抗体は、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片を含む。「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）から構成されるポリペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して、正しいＦａｂ対合を誘導することによっても操作され得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
【0196】
多重特異性抗体のさらなる様々な分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
【0197】
本明細書に同様に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性型不変構成成分、例えば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３とに同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、特定の態様では、本明細書で提供される抗体は多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。
【0198】
この目的のために有用であり得る二重特異性抗体フォーマットの例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ））分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号及び同第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、安定化付加のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、並びに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７ （２０１０）に概説）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
【0199】
抗体バリアント
特定の態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、その抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を変更することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるように作成され得る。
特定の態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、その抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を変更することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるように作成され得る。
【0200】
置換、挿入及び欠失バリアント
特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発の対象部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載されるとおりである。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
アミノ酸は、共通する側鎖の特性に従って以下のように分類することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発の対象部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載されるとおりである。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0201】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。
【0202】
ある種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択される、得られるバリアントは、親抗体と比較してある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）において改変（例えば、改善）を有し、且つ／又は親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば本明細書に記載されているような、ファージディスプレイに基づく親和性成熟法を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【0203】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）が行われ得る。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基、及び／又は抗原に接触する残基で行われてもよく、結果として生じるバリアントＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーの構築及びそこからの再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、このライブラリーがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法には、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化する、ＣＤＲ指向性手法が含まれる。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。
【0204】
特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ中の抗原接触残基の外側であってもよい。上述の特定のバリアントＶＨ及びＶＬ配列において、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、又は３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
【0205】
変異導入の標的となり得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニン・スキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）の残基又はグループを同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。代替的又は追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定され得る。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。バリアントが、所望の特性を有するか否かを決定するためにスクリーニングされてもよい。
【0206】
アミノ酸配列挿入物には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合体、並びに単一又は多数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）の場合）への、又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドへの、抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
【0207】
システイン操作抗体バリアント
特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えばＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製することが望ましい場合がある。特定の態様では、その置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いることにより、本明細書中にさらに記載されるように抗体が薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートされて、イムノコンジュゲートが作製され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているように作製され得る。
特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えばＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製することが望ましい場合がある。特定の態様では、その置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いることにより、本明細書中にさらに記載されるように抗体が薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートされて、イムノコンジュゲートが作製され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているように作製され得る。
【0208】
抗体誘導体
特定の態様では、本明細書に提供されるヘテロ二量体抗体は、当技術分野で公知であり容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐していてもしていなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、１を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改善すべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下での治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定することができる。
特定の態様では、本明細書に提供されるヘテロ二量体抗体は、当技術分野で公知であり容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐していてもしていなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、１を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改善すべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下での治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【0209】
例示的なヘテロ二量体抗体
一態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一態様では、ＣＤ２０に結合する単離されたヘテロ二量体抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一態様では、ヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体はヒト化されている。本発明のさらなる態様では、上記態様のいずれかによるヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様では、ヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体は、配列番号１２９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号１３０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号１３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一態様では、ＣＤ２０に結合する単離されたヘテロ二量体抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一態様では、ヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体はヒト化されている。本発明のさらなる態様では、上記態様のいずれかによるヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様では、ヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体は、配列番号１２９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号１３０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号１３１と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【0210】
別の態様では、上記の例示的なヘテロ二量体抗体のいずれか１つは完全長抗体である。一態様では、さらにＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）が存在する。一態様では、さらにＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在する。
【0211】
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ又は複数の単離された核酸が提供される。
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ又は複数の単離された核酸が提供される。
【0212】
天然抗体又は天然抗体断片の場合、２つの核酸が必要であり、１つは軽鎖又はその断片用で、もう１つは重鎖又はその断片用である。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上又は異なる発現ベクター上に存在し得る。
【0213】
ヘテロ二量体重鎖を持つ二重特異性抗体の場合、４つの核酸が必要であり、１つは第１の軽鎖用、１つは第１のヘテロ単量体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖用、１つは第２の軽鎖用、１つは第２のヘテロ単量体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖用である。４つの核酸は、１つ又は複数の核酸分子又は発現ベクターの中に含まれ得る。このような核酸（複数可）は、抗体の第１のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は第１のヘテロ単量体Ｆｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列、及び／又は第２のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は第２のヘテロ単量体Ｆｃ領域を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の第１及び／若しくは第２の軽鎖、並びに／又は第１及び／若しくは第２の重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上又は異なる発現ベクター上に存在し得、通常、これらの核酸は、２つ又は３つの発現ベクター上に位置しており、すなわち１つのベクターがこれらの核酸の２つ以上を含み得る。これらの二重特異性抗体の例は、ＣｒｏｓｓＭａｂである（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１９１を参照）。例えば、ＥＵインデックス番号付けによれば、ヘテロ単量体重鎖の１つは、いわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗと、場合により、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃのうち１つ）を含み、他方は、いわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖと、場合により、Ｙ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照）。
【0214】
一態様では、本明細書で報告される方法で使用される抗体をコードする単離された核酸が提供される。
【0215】
一態様では、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体を作製する方法が提供され、ここで、方法は、上で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び任意に宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【0216】
ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体の組換え産生のために、例えば上記のように、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞内での発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【0217】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐ．２４５－２５４も参照）。発現の後、抗体は、可溶型画分中の細菌細胞ペーストから単離され、さらに精製され得る。
【0218】
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株及び酵母株を含めた糸状菌類又は酵母などの有用真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４；及びＬｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照。
【0219】
（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。
【0220】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照。
【0221】
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７（１９８０）４２１６－４２２０）を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編．）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５－２６８頁を参照。
【0222】
一態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【0223】
薬学的組成物
さらなる態様では、例えば以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供される抗体のいずれかを含む薬学的組成物が提供される。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
さらなる態様では、例えば以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供される抗体のいずれかを含む薬学的組成物が提供される。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【0224】
本明細書で記載される抗体の薬学的組成物は、所望の純度を有するこのような抗体を、１つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、凍結乾燥組成物又は水溶液の形態で混合することにより調製され得る。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、それらとしては、緩衝剤、例えば、ヒスチジン、リン酸、クエン酸、酢酸及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性物質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）どの間質性薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、コンドロイチナーゼなど、１つ又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
【0225】
例示的な凍結乾燥抗体組成物については、米国特許第６，２６７，９５８号において記載されている。水性抗体組成物には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号において記載されているものが含まれ、後者の組成物にはヒスチジン－酢酸緩衝液が含まれる。
【0226】
本明細書における薬学的組成物は、治療されている特定の適応症に必要な２つ以上の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する有効成分も含み得る。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【0227】
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0228】
徐放用の薬学的組成物が調製され得る。徐放調製物の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、これらのマトリクスは、成形物、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
【0229】
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に用いられる薬学的組成物は、一般に滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
【0230】
治療方法及び投与経路
本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体のいずれも、治療方法に使用することができる。本発明のヘテロ二量体抗体は、本明細書に記載されるように、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体と組み合わされる。
本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体のいずれも、治療方法に使用することができる。本発明のヘテロ二量体抗体は、本明細書に記載されるように、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体と組み合わされる。
【0231】
一態様では、医薬として使用するためのヘテロ二量体抗体が提供される。さらなる態様では、がんの治療において使用するためのヘテロ二量体抗体が提供される。特定の態様では、治療方法において使用するためのヘテロ二量体抗体が提供される。特定の態様では、本発明は、個体に有効量のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用するためのヘテロ二量体抗体を提供する。そのような１つの態様では、その方法は、例えば下記に記載されるような、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、１、２、３、４、５又は６種の追加の治療剤）を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、がん、特に上皮、内皮又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療において使用するためのヘテロ二量体抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、がんを治療するために有効量のヘテロ二量体抗体を個体に投与することを含む、個体におけるがん、特に上皮、内皮又は中皮起源のがん及び血液のがんを治療する方法において使用するためのヘテロ二量体抗体を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【0232】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるヘテロ二量体抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、がんの治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、がんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法において使用するためのものである。そのような１つの態様では、その方法は、例えば、下記に記載されるような、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、がん、特に上皮、内皮又は中皮起源のがん及び血液のがんの治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、がんを治療するために有効量の医薬を個体に投与することを含む、個体におけるがん、特に上皮、内皮又は中皮起源のがん及び血液のがんを治療する方法において使用するためのものである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
【0233】
さらなる態様では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一態様では、本方法は、そのようながんを有する個体に有効量のヘテロ二量体抗体を投与することを含む。そのような１つの態様では、その方法は、下記に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。
【0234】
上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
【0235】
さらなる態様では、本開示は、例えば、上記治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるヘテロ二量体抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるヘテロ二量体抗体のいずれかと、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【0236】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが企図される。
【0237】
本発明の抗体は、良好な医療行為と一貫する様式で、製剤化され、投薬され、投与されるだろう。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤とともに製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、薬学的組成物中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのものと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投薬量の約１から９９％で、又は適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【0238】
疾患の予防又は治療について、本発明の抗体の適切な投薬量は（単独で、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、並びに主治医の裁量に依存するだろう。抗体は、患者に一度に又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投薬量は、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。かかる用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間に１回（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回用量の抗体を受けるように）投与され得る。最初のより高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量を投与することができる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【0239】
製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の多様な材料から形成され得る。容器は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えていてもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の多様な材料から形成され得る。容器は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えていてもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
【0240】
抗原結合受容体との組み合わせ
本発明によるヘテロ二量体抗体は、薬理学的活性を高めるために、変異Ｆｃサブユニット（例えば、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇからなる）に特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現する細胞と組み合わせることができる（以下にもさらに記載）。上記のこのような併用療法は、併用投与（ヘテロ二量体抗体及び細胞が同じ又は別個の薬学的組成物に含まれる場合）を包含し、この場合、本発明のヘテロ二量体抗体の投与は、以下に記載する抗原結合受容体を発現する細胞の投与の前、同時、及び／又は後に行うことができる。
本発明によるヘテロ二量体抗体は、薬理学的活性を高めるために、変異Ｆｃサブユニット（例えば、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇからなる）に特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現する細胞と組み合わせることができる（以下にもさらに記載）。上記のこのような併用療法は、併用投与（ヘテロ二量体抗体及び細胞が同じ又は別個の薬学的組成物に含まれる場合）を包含し、この場合、本発明のヘテロ二量体抗体の投与は、以下に記載する抗原結合受容体を発現する細胞の投与の前、同時、及び／又は後に行うことができる。
【0241】
本明細書に記載されるように、本発明による抗体は、死滅させるために抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ－Ｔ細胞を効率的に動員することができる。さらに、本発明による抗体は、非特異的な交差活性化を伴わずに、ＦｃｇＲ依存性ＡＤＣＣのために、ＮＫ細胞又は単球などの自然免疫細胞を効率的に動員することができる。
【0242】
ＣＡＲ－Ｔ細胞と同時に自然免疫細胞を動員することは、とりわけ、最初に抗体を投与し、抗体がすでにＡＤＣＣ媒介の抗腫瘍効果とデバルキングを誘導した後の時点でのみＣＡＲ－Ｔ細胞を注入することによって、有害事象（サイトカイン放出症候群など）の軽減に役立つ可能性がある。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞と同時に自然免疫細胞を動員することは、腫瘍微小環境においてＦｃｇＲ発現単球、マクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化することにより、二次免疫応答の生成に特に役立つ可能性がある。
【0243】
一態様では、ヘテロ二量体抗体の投与と細胞の投与は、互いに約１ヶ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内に行われる。一態様では、ヘテロ二量体抗体及び細胞は、治療の１日目に患者に投与される。
【0244】
本発明の抗原結合受容体は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、親非変異Ｆｃドメインには特異的に結合することができない少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。好ましい実施態様では、抗原結合受容体の抗原結合部分は、ヒト化又はヒト抗原結合部分、例えばヒト化又はヒトｓｃＦｖである。
【0245】
本発明はさらに、本明細書で提供される抗原結合受容体を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の、本明細書で提供される抗体による標的化された動員、例えば腫瘍への形質導入に関する。
【0246】
添付の実施例に示すように、治療用抗体（配列番号１２９の重鎖（Ｐ３２９Ｇ変異を含む）、配列番号１３０の重鎖、及び配列番号１３１の２つの軽鎖を含むヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体によって表される）に特異的に結合することができる、本発明によるアンカー膜貫通ドメイン及びヒト化細胞外ドメインを含む抗原結合受容体（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号７）を構築した。ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号７）を発現する形質導入されたＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞）は、ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む抗ＣＤ２０抗体とＣＤ２０陽性腫瘍細胞との共インキュベーションによって強く活性化することができた（例えば図９Ｂを参照）。さらに、驚くべきことに、ＣＤ１６－ＣＡＲ活性化によって証明されるＡＤＣＣエフェクター機能（例えば図９Ａを参照）は、ヘテロ二量体抗ＣＤ２０抗体によって強く活性化され得る。
【0247】
さらに、Ｐ３２９Ｇ変異を含む腫瘍抗原に対する抗体と、ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号７）を発現する形質導入されたＴ細胞との組み合わせによる腫瘍細胞の治療は、驚くべきことに、ＶＬ１ＶＨ３－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ（配列番号３３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号３１）を発現する形質導入されたＴ細胞と比較して、形質導入されたＴ細胞のより強い活性化をもたらす。
【0248】
ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質において、ＶＨドメイン（ＶＨ３）は、そのＣ末端において、ペプチドリンカーを介してＶＬドメイン（ＶＬ１）のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖを形成する。ｓｃＦｖは、そのＣ末端（ＶＬドメインのＣ末端）において、ペプチドリンカーを介してアンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）に融合される。一方、ＶＬ１ＶＨ３－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質において、ＶＬドメイン（ＶＬ１）は、そのＣ末端において、ペプチドリンカーを介してＶＨドメイン（ＶＨ３）のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖを形成する。ｓｃＦｖは、そのＣ末端（ＶＨドメインのＣ末端）において、ペプチドリンカーを介してアンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）に融合される。理論に拘束されるものではないが、ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質が、ＶＬ１ＶＨ３－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤと比較して、形質導入されたＴ細胞のより強い活性化をもたらすという観察結果は、ＶＬドメインとアンカードメインとの（ペプチドリンカーを介した）融合が、より強力な抗原結合受容体をもたらすことを示唆している。これは予想外であり、驚くべきことである。
【0249】
ＶＨドメインＶＨ３とＶＬドメインＶＬ１との組み合わせ（両方とも本発明者らによって同定された）は、これらの可変ドメインがヒト化抗体ドメインであるため、特に好ましい。理論に拘束されるものではないが、ヒト化抗体ドメインは、そのようなヒト化抗体ドメインを含む抗原結合部分をヒト患者に適用する場合、副作用が少ない（例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成がより少ない）と予想され得るので好ましい。しかしながら、ヒト化は、抗原結合部分（例えば、非ヒト源に由来するもの）の結合の喪失をもたらし得る。添付の実施例に示すように、ヒト化ＶＨ３及びＶＬ１ドメインは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインへの結合を保持する。この結果は、例えば、他のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインと同等の結合を保持できないことによって示されるように予想外である。
【0250】
したがって、本発明の好ましい実施態様では、ヘテロ二量体抗体は、ヒト化抗原結合部分を含む抗原結合受容体と組み合わされる。
【0251】
ヘテロ二量体Ｆｃドメイン（例えば、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む）を含む腫瘍特異的抗体、すなわち抗体と、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む／からなる抗原結合受容体を形質導入されたＴ細胞との対合により、Ｔ細胞特異的活性化及びその後の腫瘍細胞の溶解が得られる。この手法は、変異Ｆｃドメインを含む抗体の非存在下ではＴ細胞は不活性であるため、従来のＴ細胞ベースの手法に比べて安全性に大きな利点がある。したがって、本発明は、ＩｇＧ型抗体が、Ｔ細胞のためのガイダンスとして腫瘍細胞をマーク又は標識するために使用され、形質導入されたＴ細胞が、ＩｇＧ型抗体の変異Ｆｃドメインに対する特異性を提供することによって腫瘍細胞に対して特異的に標的化される、汎用的な治療プラットフォームを提供する。腫瘍細胞の表面上の抗体の変異Ｆｃドメインに結合した後、本明細書に記載の形質導入されたＴ細胞は活性化され、腫瘍細胞はその後溶解される。
【0252】
抗原結合受容体の抗原結合部分
本発明の例示的な一実施態様では、概念実証として、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるヒト化抗原結合受容体及び該抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞が提供される。Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体への結合とそれに伴うエフェクター機能を低下させる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインと比較して低下した又は消失した親和性でｃγ受容体に結合する。
本発明の例示的な一実施態様では、概念実証として、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるヒト化抗原結合受容体及び該抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞が提供される。Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体への結合とそれに伴うエフェクター機能を低下させる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異Ｆｃドメインと比較して低下した又は消失した親和性でｃγ受容体に結合する。
【0253】
一実施態様では、抗原結合部分は、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成される変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる。一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
【0254】
好ましい実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９Ｇ変異を含む。
【0255】
一実施態様では、抗原結合受容体は、抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。一実施態様では、抗原結合部分は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに特異的に結合することができる。
一実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
一実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0256】
一実施態様では、抗原結合部分は、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0257】
好ましい実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【0258】
好ましい実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【0259】
別の特定の実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【0260】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８、配列番号４１及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0261】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0262】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0263】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0264】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0265】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0266】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0267】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0268】
好ましい実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0269】
一実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。好ましい実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖである。
【0270】
一実施態様では、抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨドメインは、特にペプチドリンカーを介してＶＬドメインに連結されている。一実施態様では、ＶＬドメインのＣ末端は、特にペプチドリンカーを介してＶＨドメインのＮ末端に連結されている。好ましい実施態様では、ＶＨドメインのＣ末端は、特にペプチドリンカーを介してＶＬドメインのＮ末端に連結されている。一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）を含む。
【0271】
一実施態様では、抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖであり、ここで、前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構成：ａ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はｂ）ＶＬ－リンカー－ＶＨの１つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬの構成を有する。
【0272】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０、配列番号１２６及び配列番号１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0273】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0274】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。
【0275】
一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。
【0276】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合部分、例えば本明細書に記載のｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド架橋を導入することによってさらに安定化され得る。したがって、一実施態様では、本発明による抗原結合受容体に含まれるｓｃＦｖ断片（複数可）及び／又はｓｃＦａｂ断片（複数可）は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される。一実施態様では、提供されるのは、システインによるアミノ酸の少なくとも１つの置換（特に、Ｋａｂａｔ番号付けによる、可変重鎖の４４位及び／又は可変軽鎖の１００位における）を含む、上記のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列のいずれか１つである。
【0277】
アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）
本発明の文脈において、抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼに対する切断部位を有しないことを特徴とすることができる。本発明の文脈において、プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解できるタンパク質分解酵素のことをいう。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、ＣＤ命名法で特に規定されているような、膜貫通タンパク質の任意のアンカー膜貫通ドメインが本発明の抗原結合受容体を生成するために使用され得る。
本発明の文脈において、抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼに対する切断部位を有しないことを特徴とすることができる。本発明の文脈において、プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解できるタンパク質分解酵素のことをいう。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、ＣＤ命名法で特に規定されているような、膜貫通タンパク質の任意のアンカー膜貫通ドメインが本発明の抗原結合受容体を生成するために使用され得る。
【0278】
したがって、本発明の文脈において、アンカー膜貫通ドメインは、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）の膜貫通ドメインの一部、又は好ましくはヒトの膜貫通ドメインの一部を含み得る。このようなアンカー膜貫通ドメインの例は、例えば本明細書において配列番号１１に示されるアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を有するＣＤ８の膜貫通ドメインである。本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含み得る／から構成され得る。
【0279】
別の実施態様では、本明細書で提供される抗原結合受容体は、配列番号６１に示されるヒト全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３～１７９、１５４～１７９、１５５～１７９、１５６～１７９、１５７～１７９、１５８～１７９、１５９～１７９、１６０～１７９、１６１～１７９、１６２～１７９、１６３～１７９、１６４～１７９、１６５～１７９、１６６～１７９、１６７～１７９、１６８～１７９、１６９～１７９、１７０～１７９、１７１～１７９、１７２～１７９、１７３～１７９、１７４～１７９、１７５～１７９、１７６～１７９、１７７～１７９又は１７８～１７９（配列番号７０に示されるｃＤＮＡによってコードされている）に位置するＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み得る。
【0280】
あるいは、特にＣＤ命名法によって提供される膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質を、本発明の抗原結合受容体タンパク質のアンカー膜貫通ドメインとして使用することができる。
【0281】
いくつかの実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、抗原結合受容体を当該膜に固定する能力を保持する、ＣＤ２７（配列番号５８によってコードされる配列番号５９）、ＣＤ１３７（配列番号６６によってコードされる配列番号６７）、ＯＸ４０（配列番号７０によってコードされる配列番号７１）、ＩＣＯＳ（配列番号７４によってコードされる配列番号７５）、ＤＡＰ１０（配列番号７９によってコードされる配列番号８０）、ＤＡＰ１２（配列番号８２によってコードされる配列番号８３）、ＣＤ３ｚ（配列番号８７によってコードされる配列番号８８）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号９１によってコードされる配列番号９０）、ＮＫＧ２Ｄ（配列番号９５によってコードされる配列番号９４）、ＣＤ８（配列番号１２４によってコードされる配列番号１２３）からなる群のうちのいずれか１つの膜貫通ドメイン又はその膜貫通部の断片を含む。
【0282】
ヒト配列は、例えば、アンカー膜貫通ドメイン（の一部）が細胞外空間からアクセス可能であり、したがって患者の免疫系にアクセス可能である可能性があるため、一般的な発明の文脈において有益である可能性がある。好ましい実施態様では、アンカー膜貫通ドメインはヒト配列を含む。そのような実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、抗原結合受容体を当該膜に固定する能力を保持する、ヒトＣＤ２７（配列番号５６によってコードされる配列番号５７）、ヒトＣＤ１３７（配列番号６４によってコードされる配列番号６５）、ヒトＯＸ４０（配列番号６８によってコードされる配列番号６９）、ヒトＩＣＯＳ（配列番号７２によってコードされる配列番号７３）、ヒトＤＡＰ１０（配列番号７７によってコードされる配列番号７８）、ヒトＤＡＰ１２（配列番号８０によってコードされる配列番号８１）、ヒトＣＤ３ｚ（配列番号８５によってコードされる配列番号８６）、ヒトＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８９によってコードされる配列番号８８）、ヒトＮＫＧ２Ｄ（配列番号９３によってコードされる配列番号９２）、ヒトＣＤ８（配列番号１２２によってコードされる配列番号１２１）からなる群のうちのいずれか１つの膜貫通ドメイン又はその膜貫通部の断片を含む。
【0283】
刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）及び共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）
好ましくは、抗原結合受容体は、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞活性化をもたらす刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又は
ヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（バージョン番号１７７、配列番号２）であり；マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２４１６１（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１４３、配列番号１）である）、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（バージョン番号１７８、配列番号２）である、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（バージョン番号１５１、配列番号１）であり；マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０９（バージョン番号１３２、配列番号２）である）の断片／ポリペプチド部分である刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。
好ましくは、抗原結合受容体は、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞活性化をもたらす刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又は
ヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（バージョン番号１７７、配列番号２）であり；マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２４１６１（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１４３、配列番号１）である）、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（バージョン番号１７８、配列番号２）である、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（バージョン番号１５１、配列番号１）であり；マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０９（バージョン番号１３２、配列番号２）である）の断片／ポリペプチド部分である刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。
【0284】
したがって、本明細書において提供される抗原結合受容体において含まれる刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの完全長の断片／ポリペプチド部分であってもよい。マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長ＣＤ３ｚ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８６（ＣＤ３ｚ）、９０（Ｆｃｇｒ３Ａ）又は９４（ＮＫＧ２Ｄ）として示される（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）は、配列番号８７（ＣＤ３ｚ）、９１（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９５（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。ヒト完全長ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８４（ＣＤ３ｚ）、８８（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９２（ＮＫＧ２Ｄ）として示される（ヒトは、配列番号８５（ＣＤ３ｚ）、８９（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９３（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。本発明の抗原結合受容体は、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの断片を刺激ドメインとして含んでもよく、ただし、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれることを条件とする。特に、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの任意の部分／断片は、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフが含まれる限り、刺激ドメインとして適切である。しかし、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源から得られるポリペプチドを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、本明細書において配列番号８４（ＣＤ３ｚ）、８８（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９２（ＮＫＧ２Ｄ）として示されるアミノ酸配列を含む（ヒトは配列番号８５（ＣＤ３ｚ）、８９（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９３（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。一実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列（配列番号２６に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含み得るか、又はそれからなり得る。さらなる実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１３に示される配列を含むか、又は配列番号１３と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の置換、欠失若しくは挿入を有し、且つ刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）を含む抗原結合受容体の具体的な構成は、本明細書では以下及び実施例と図面に示されている。刺激シグナル伝達活性は、例えばＥＬＩＳＡによって測定されるようなサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）放出の増強、（細胞数の増加によって測定されるような）増殖活性の増強、又はＬＤＨ放出アッセイによって測定されるような溶解活性の増強によって決定することができる。
【0285】
さらに、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞にさらなる活性を提供する少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又はヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ１０７４７（バージョン番号１７３、配列番号１であり；マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ３１０４１（バージョン番号１３４、配列番号２）である）、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４５、配列番号１）であり；マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１３９、配列番号１）である）、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２３５１０（バージョン番号１３８、配列番号１）であり；マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４３４８８（バージョン番号１１９、配列番号１）である）、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９Ｙ６Ｗ８（配列番号１、バージョン番号１２６）であり；マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＷＶ４０（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９ＪＬ１７（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１０２、配列番号２）である）、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６８４２（バージョン番号１６０、配列番号２）であり；マウスＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４１２７２（バージョン番号１３７、配列番号１）である）、４－１－ＢＢ（マウス４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１４０、配列番号１）であり；ヒト４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４６、配列番号）である）、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＵＢＪ５（バージョン番号２５、配列番号２）であり；マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＱＵＪ０（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１０１、配列番号１）である）又はＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ４３９１４（バージョン番号１４６、配列番号１）であり；マウスＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ０５４８８５（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１２３、配列番号１）である）の断片／ポリペプチド部分である共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。本発明の特定の実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、本明細書に記載の１つ又は複数、すなわち１、２、３、４、５、６又は７つの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。したがって、本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体は、第１の共刺激シグナル伝達ドメインとして、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１３７の断片／ポリペプチド部分、又は、好ましくはヒトＣＤ１３７の断片／ポリペプチド部分を含み得、第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、マウス若しくは好ましくはヒトＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２又はそれらの断片からなる群から選択される。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源から得られる共刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体に含まれている１つ又は複数の刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含み得るか又はそれからなり得る。
【0286】
したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体に任意選択で含まれる共刺激シグナル伝達ドメインは、完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号５９（ＣＤ３ｚ）、６３（ＣＤ２８）、６７（ＣＤ１３７）、７１（ＯＸ４０）、７５（ＩＣＯＳ）、７９（ＤＡＰ１０）又は８３（ＤＡＰ１２）として示される（マウスは、配列番号５８（ＣＤ２７）、６２（ＣＤ２８）、６６（ＣＤ１３７）、７０（ＯＸ４０）、７４（ＩＣＯＳ）、７８（ＤＡＰ１０）又は８２（ＤＡＰ１２）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。しかし、本発明の文脈ではヒト配列が最も好ましいため、本明細書で提供される抗原結合受容体タンパク質に任意選択で含まれ得る共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号５７（ＣＤ２７）、６１（ＣＤ２８）、６５（ＣＤ１３７）、６９（ＯＸ４０）、７３（ＩＣＯＳ）、７７（ＤＡＰ１０）又は８１（ＤＡＰ１２）として示される（ヒトは配列番号５６（ＣＤ２７）、６０（ＣＤ２８）、６４（ＣＤ１３７）、６８（ＯＸ４０）、７２（ＩＣＯＳ）、７６（ＤＡＰ１０）又は８０（ＤＡＰ１２）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。
【0287】
１つの好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８又はその断片を含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、ＣＤ２８の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８の断片を含み得る。特に、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれる限り、ＣＤ２８の任意の部分／断片が本発明の抗原結合受容体に適している。共刺激シグナル伝達ドメインＰＹＡＰ（ＣＤ２８のＡＡ２０８から２１１）及びＹＭＮＭ（ＣＤ２８のＡＡ１９１から１９４）は、ＣＤ２８ポリペプチドの機能及び上に列挙した機能効果にとって有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列は配列番号９６に示されており、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列は配列番号９７に示されている。したがって、本発明の抗原結合受容体において、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、配列ＹＭＮＭ（配列番号９６）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号９７）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメイン由来の配列を含む。他の実施態様では、本発明の抗原結合受容体において、これらのドメインの一方又は両方が、それぞれＦＭＮＭ（配列番号９８）及び／又はＡＹＡＡ（配列番号９９）に変異している。これらの変異のいずれも、抗原結合受容体を含む形質導入された細胞の、自身の増殖能力に影響を与えずにサイトカインを放出する能力を低下させ、且つ、有利には、形質導入された細胞の生存を延長させ、ひいてはその治療能力を高めるために使用することができる。すなわち、言い換えれば、このような非機能性変異は、好ましくは、本明細書で提供される抗原結合受容体がｉｎ ｖｉｖｏで形質導入された細胞の持続性を高めるものである。しかしながら、これらのシグナル伝達モチーフは、本明細書で提供される抗原結合受容体の細胞内ドメイン内の任意の部位に存在し得る。
【0288】
別の好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ１３７又はその断片を含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、ＣＤ１３７の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ１３７の断片を含み得る。特に、ＣＤ１３７のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれる限り、ＣＤ１３７の任意の部分／断片が本発明の抗原結合受容体に適している。好ましい実施態様では、本発明の抗原結合受容体タンパク質に含まれるＣＤ１３７ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされるもの）を含むか、又はそれからなる。
【0289】
共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含む抗原結合受容体の具体的な構成は、本明細書の以下及び実施例及び図面に提供される。共刺激シグナル伝達活性は、例えばＥＬＩＳＡによって測定されるようなサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）放出の増強、（細胞数の増加によって測定されるような）増殖活性の増強、又はＬＤＨ放出アッセイによって測定されるような溶解活性の増強によって決定することができる。上述のように、本発明の実施態様では、抗原結合受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、形質導入されたＴ細胞のような、本明細書に記載の形質導入された細胞のサイトカイン産生、増殖及び溶解活性であると定義されるヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７遺伝子Ｔ細胞活性に由来してもよい。ＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７活性は、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－□□又はインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインのＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによるサイトカインの放出、ｋｉ６７測定などによるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞の定量、又は標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価される溶解活性（例えば、Ｔｈａｋｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．３５（１）（２０１２），５０３５０６；Ｋｒｕｔｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６９９（２０１１），１７９２０２；Ｅｋｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７５（５）（２００７），２２９１２２９６；Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９（５）（２００２），２９８３２９８８；Ｄｕｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２１（１２）（２０１４），１８２５１８３７，Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２１（１２）（２０１４），１６１）に記載されるＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ機器の使用による）によって測定することができる。
【0290】
リンカー及びシグナルペプチド
さらに、本明細書において提供される抗原結合受容体は、少なくとも１つのリンカー（又は「スペーサー」）を含み得る。リンカーは通常、２０アミノ酸までの長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の長さを有し得る。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン間にリンカーを含み得る。さらに、本明細書で提供される抗原結合受容体は、抗原結合部分に、特に抗原結合部分の免疫グロブリンドメイン間（例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインの間）にリンカーを含み得る。このようなリンカーには、抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン）が独立してフォールディングされ、予想通りに動作する確率が高まるという利点がある。したがって、本発明の文脈において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、一本鎖多機能ポリペプチドに含まれ得る。一本鎖融合構築物は、例えば、少なくとも１つの抗原結合部分を含む（１つ又は複数の）細胞外ドメイン、（１つ又は複数の）アンカー膜貫通ドメイン、（１つ又は複数の）共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／又は（１つ又は複数の）刺激シグナル伝達ドメインから構成され得る。したがって、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるように、１つ又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって連結され得る。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を含むか、又はそれらから構成され得る。別の実施態様では、抗原結合部分とアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。したがって、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激ドメインは、ペプチドリンカーによって、あるいはドメインの直接融合によって互いに連結され得る。
さらに、本明細書において提供される抗原結合受容体は、少なくとも１つのリンカー（又は「スペーサー」）を含み得る。リンカーは通常、２０アミノ酸までの長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の長さを有し得る。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン間にリンカーを含み得る。さらに、本明細書で提供される抗原結合受容体は、抗原結合部分に、特に抗原結合部分の免疫グロブリンドメイン間（例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインの間）にリンカーを含み得る。このようなリンカーには、抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン）が独立してフォールディングされ、予想通りに動作する確率が高まるという利点がある。したがって、本発明の文脈において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、一本鎖多機能ポリペプチドに含まれ得る。一本鎖融合構築物は、例えば、少なくとも１つの抗原結合部分を含む（１つ又は複数の）細胞外ドメイン、（１つ又は複数の）アンカー膜貫通ドメイン、（１つ又は複数の）共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／又は（１つ又は複数の）刺激シグナル伝達ドメインから構成され得る。したがって、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるように、１つ又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって連結され得る。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を含むか、又はそれらから構成され得る。別の実施態様では、抗原結合部分とアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。したがって、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激ドメインは、ペプチドリンカーによって、あるいはドメインの直接融合によって互いに連結され得る。
【0291】
本発明による好ましい実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、これは、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性を高めるためのグリシンと、溶解性を高めるためのセリン又はスレオニンを豊富に含んでおり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端を連結したり、その逆を連結したりすることができる。好ましい実施態様では、リンカーは、ＶＬドメインのＮ末端をＶＨドメインのＣ末端に連結する。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、リンカーは、配列番号１６に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を有し得る。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。
【0292】
本発明によるいくつかの実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドである一本鎖Ｆａｂ断片又はｓｃＦａｂであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。
【0293】
本明細書で提供される抗原結合受容体又はその一部は、シグナルペプチドを含み得る。このようなシグナルペプチドは、タンパク質をＴ細胞膜の表面に運ぶことになる。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、シグナルペプチドは、配列番号１００に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列（配列番号１０１に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を有し得る。
【0294】
抗原結合受容体の特異的な構造
本明細書に記載の抗原結合受容体の構成要素は、様々な構成で互いに融合して、Ｔ細胞活性化抗原結合受容体を生成することができる。
本明細書に記載の抗原結合受容体の構成要素は、様々な構成で互いに融合して、Ｔ細胞活性化抗原結合受容体を生成することができる。
【0295】
いくつかの実施態様では、抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメインに連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成される細胞外ドメインを含む。好ましい実施態様では、ＶＨドメインは、Ｃ末端で該ＶＬドメインのＮ末端に、任意選択でペプチドリンカーを介して融合される。他の実施態様では、抗原結合受容体は、刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。特定のそのような実施態様では、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、及び任意選択で、刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカリー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。任意選択で、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様の１つでは、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、刺激シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。別の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりにアンカー膜貫通ドメインに連結される。好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【0296】
抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、並びに刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、互いに直接融合されてもよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２～２０アミノ酸を含む１つ又は複数のペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここで「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の数である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を連結するのに好ましいペプチドリンカーは、配列番号１７によるＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を連結するための別の好ましいペプチドリンカーは、配列番号１９によるＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（ＣＤ８ｓｔａｌｋ）である。可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を連結するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１６によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）４である。
【0297】
さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特に、抗原結合部分がアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合される場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合され得る。
【0298】
本明細書に記載のとおり、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有する抗原結合受容体は、特に抗原結合受容体の高発現が必要な場合に有用であり、好ましい。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、抗原結合受容体の発現効率を制限し得る。しかしながら、他の場合には、例えば、標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分を含む抗原結合受容体を有することが有利であろう。
【0299】
特定の一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含む変異Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメインに特異的に結合することができる１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することができない抗原結合部分は、ｓｃＦｖである。
【0300】
一実施態様では、抗原結合部分は、ｓｃＦｖ断片のＣ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に、任意にペプチドリンカーを介して融合されている。一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１９）を含む。一実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン又はその断片である。好ましい実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン又はその断片である。特定の実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）をさらに含む。一実施態様では、抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。一実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書で前述したような、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、又はそれらの断片からなる群から個別に選択される。好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８の細胞内ドメイン又はその断片である。好ましい一実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、又はＣＤ２８シグナル伝達を保持するその断片を含む。別の好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメイン、又はＣＤ１３７シグナル伝達を保持するその断片を含む。特定の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１２を含むか、又は配列番号１２からなる。一実施態様では、抗原結合受容体は、刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。一実施態様では、抗原結合受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。一実施態様では、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、又はそれらの断片からなる群から個別に選択される。好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚの細胞内ドメイン、又はＣＤ３ｚシグナル伝達を保持するその断片である。特定の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１３を含むか、又は配列番号１３からなる。
【0301】
一実施態様では、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にＧＦＰ又はその増強されたアナログに融合している。一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｃ末端で、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）のＮ末端に、任意選択で本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、融合している。好ましい実施態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１８によるＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）である。
【0302】
特定の実施態様では、抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、ここで、少なくとも１つの抗原結合部分は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異親Ｆｃドメインに特異的に結合することはできないｓｃＦｖであり、変異ＦｃドメインはＰ３２９Ｇ変異を含む（ＥＵ番号付けによる）。Ｐ３２９Ｇ変異はＦｃγ受容体の結合を減少させる。一実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）、共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）、及び刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）を含む。このような一実施態様では、抗原結合受容体はｓｃＦｖ－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤという構成を有する。好ましい実施態様では、抗原結合受容体はＶＨ－ＶＬ－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤという構成を有する。より具体的なそのような実施態様では、抗原結合受容体は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤという構成を有する。
【0303】
特定の実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるｓｃＦｖであり、ここで、抗原結合部分は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【0304】
別の特定の実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるｓｃＦｖであり、ここで、抗原結合部分は、配列番号１、配列番号４０、及び配列番号３からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【0305】
好ましい実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるｓｃＦｖであり、ここで、抗原結合部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１のアミノ酸配列ＲＹＷＭＮ（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２のアミノ酸配列ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３のアミノ酸配列ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）、軽鎖相補決定領域（ＣＤＲ Ｌ）１のアミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２のアミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）、及びＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）を含む。
【0306】
好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0307】
一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0308】
一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
ここで、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに結合する抗原結合部分を形成することができ、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
ここで、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに結合する抗原結合部分を形成することができ、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0309】
一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0310】
一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0311】
一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む。
【0312】
一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0313】
一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。
【0314】
一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。
【0315】
一実施態様では、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にＧＦＰ又はその増強されたアナログに融合している。一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｃ末端で、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）のＮ末端に、任意選択で本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、融合している。好ましい実施態様では、ペプチドリンカーは配列番号１８のＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）である。
【0316】
抗原結合受容体を発現することができる形質導入された細胞
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞である。これらの抗原結合受容体は、天然にはＴ細胞内及び／又はＴ細胞表面上には含まれず、正常な（非形質導入）Ｔ細胞内又は表面上で（内因的に）発現されない分子に関する。したがって、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上の抗原結合受容体は、Ｔ細胞に人工的に導入される。本発明の文脈において、前記Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に定義されるように治療される対象から単離／入手され得る。したがって、人工的に導入され、続いて前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される本明細書に記載の抗原結合受容体は、（Ｉｇ由来）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のＦｃドメインに（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで）アクセス可能な１つ又は複数の抗原結合部分を含むドメインを含む。本発明の文脈において、これらの人工的に導入された分子は、本明細書において以下に記載されるように（レトロウイルス、レンチウイルス又は非ウイルス）形質導入後に前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される。したがって、形質導入後、本発明によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは本明細書に記載のＦｃドメインに特異的変異を含む抗体によって、標的細胞の存在下で活性化され得る。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞である。これらの抗原結合受容体は、天然にはＴ細胞内及び／又はＴ細胞表面上には含まれず、正常な（非形質導入）Ｔ細胞内又は表面上で（内因的に）発現されない分子に関する。したがって、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上の抗原結合受容体は、Ｔ細胞に人工的に導入される。本発明の文脈において、前記Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に定義されるように治療される対象から単離／入手され得る。したがって、人工的に導入され、続いて前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される本明細書に記載の抗原結合受容体は、（Ｉｇ由来）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のＦｃドメインに（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで）アクセス可能な１つ又は複数の抗原結合部分を含むドメインを含む。本発明の文脈において、これらの人工的に導入された分子は、本明細書において以下に記載されるように（レトロウイルス、レンチウイルス又は非ウイルス）形質導入後に前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される。したがって、形質導入後、本発明によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは本明細書に記載のＦｃドメインに特異的変異を含む抗体によって、標的細胞の存在下で活性化され得る。
【0317】
本発明はまた、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞に関する。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子、又は本発明の抗原結合受容体を発現する本発明のベクターを含み得る。
【0318】
本発明の文脈において、「形質導入されたＴ細胞」という用語は、遺伝子改変されたＴ細胞（すなわち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）に関する。本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞は、本発明のベクターを含み得る。好ましくは、本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子及び／又は本発明のベクターを含む。本発明の形質導入されたＴ細胞は、外来ＤＮＡ（すなわち、Ｔ細胞に導入された核酸分子）を一過性に又は安定的に発現するＴ細胞であり得る。特に、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子は、レトロウイルス又はレンチウイルス形質導入を使用することにより、Ｔ細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。ｍＲＮＡトランスフェクションを使用することにより、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を一過性に発現させることができる。好ましくは、本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を介してＴ細胞に核酸分子を導入することによって遺伝子改変されている。したがって、抗原結合受容体の発現は構成的である可能性があり、抗原結合受容体の細胞外ドメインが細胞表面上で検出可能である可能性がある。抗原結合受容体のこの細胞外ドメインは、本明細書で定義される抗原結合受容体の完全な細胞外ドメインを含み得るが、その一部も含み得る。抗原結合受容体における抗原結合部分の大きさは、必要最小限の大きさである。
【0319】
抗原結合受容体が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下でＴ細胞に導入される場合、発現は条件的又は誘導性であってもよい。このような誘導性又は抑制性プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターとトランス活性化因子タンパク質ＡｌｃＲとを含む転写系を挙げることができる。ａｌｃＡプロモーターに結合した目的の遺伝子の発現を制御するために、異なる農業用アルコールベースの製剤が使用される。さらに、テトラサイクリン応答性プロモーター系は、テトラサイクリン存在下で遺伝子発現系を活性化するか又は抑制するかのいずれかの機能を有し得る。これらの系のエレメントとしては、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びＴｅｔＲと単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化配列との融合体であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）などがある。さらに、ステロイド応答性プロモーター、金属調節プロモーター又は病原性関連（ＰＲ）タンパク質関連プロモーターを使用することができる。
【0320】
この発現は、使用する系によって、恒常的又は構成的であり得る。本発明の抗原結合受容体は、本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞の表面に発現させることができる。抗原結合受容体の細胞外部分（すなわち抗原結合受容体の細胞外ドメイン）は細胞表面で検出可能であり得るが、一方、細胞内部分（すなわち共刺激シグナル伝達ドメイン（１つ又は複数）及び刺激シグナル伝達ドメイン）は細胞表面で検出不可能である。抗原結合受容体の細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使用することによって、又は細胞外ドメインが結合することができる変異Ｆｃドメインによって行うことができる。細胞外ドメインは、これらの抗体又はＦｃドメインを使用して、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によって検出することができる。
【0321】
他の細胞も本発明の抗原結合受容体で形質導入され、それによって標的細胞に向けられることができる。これらのさらなる細胞には、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、自然リンパ球系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞又は好中球が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、前記免疫細胞はリンパ球であろう。白血球の表面上で本発明の抗原結合受容体がトリガーとなり、細胞が由来する系統に関係なく、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体と組み合わせて、細胞が標的細胞に対して細胞傷害性になる。細胞傷害性は、抗原結合受容体として選択された刺激シグナル伝達ドメイン又は共刺激シグナル伝達ドメインに関係なく起こり、追加のサイトカインの外因性供給には依存しない。したがって、本発明の形質導入された細胞は、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ミエロイド細胞又は間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、本明細書で提供される形質導入された細胞はＴ細胞（例えば、自己Ｔ細胞）であり、より好ましくは、形質導入された細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。さらに、本発明の文脈において、形質導入された細胞は自己Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、好ましくは自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。対象から分離した自己細胞（例えば、Ｔ細胞）の使用に加えて、本発明は、同種異系細胞の使用も包含する。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、同種異系ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの同種異系細胞であってもよい。同種異系という用語は、例えば本明細書に記載の抗原結合受容体発現型の形質導入された細胞によって治療される個体／対象とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する非血縁ドナー個体／対象に由来する細胞を指す。自己細胞とは、本明細書に記載の形質導入された細胞で治療される対象から上記のように単離／取得された細胞を指す。
【0322】
本発明の形質導入された細胞は、さらなる核酸分子、例えばサイトカインをコードする核酸分子を共形質導入され得る。
【0323】
本発明はまた、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞の製造方法であって、Ｔ細胞に本発明のベクターを形質導入する工程と、前記形質導入された細胞の中又は上での抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で前記形質導入されたＴ細胞を培養する工程と、前記形質導入されたＴ細胞を回収する工程とを含む方法に関する。
【0324】
本発明の文脈において、本発明の形質導入された細胞は、好ましくは対象（好ましくはヒト患者）から細胞（例えば、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）を単離することによって製造される。患者から又はドナーから細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）を単離／取得する方法は当技術分野において周知であり、患者から又はドナーからの本細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の文脈では、例えば細胞は採血又は骨髄の除去によって単離されてもよい。患者の試料として細胞を単離／取得した後、細胞（例えばＴ細胞）を試料の他の成分から分離する。試料から細胞（例えばＴ細胞）を分離するいくつかの方法が知られており、限定されないが、例えば、患者又はドナーの末梢血試料から細胞を得るための白血球搬出法、ＦＡＣＳ細胞選別装置を使用することにより細胞を単離／取得する方法などが挙げられる。単離／取得された細胞Ｔ細胞は、その後、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用することによって、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用することによって、且つ／又は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びインターロイキン２（ＩＬ－２）を使用することによって培養及び増殖される（例えば、Ｄｕｄｌｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６（２００３），３３２－３４２又はＤｕｄｌｅｙ，Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（２００８），５２３３－５２３９を参照）。
【0325】
その後の工程において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６（２００４），３７４－３８６を参照）によって人工的／遺伝子的に改変／形質導入される。細胞（例えばＴ細胞）に形質導入する方法は当技術分野で公知であり、限定されないが、核酸又は組換え核酸を形質導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法又はリポソーム法などが挙げられる。導入する核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えばリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１６６８０２７）を使用することにより、従来通りに高効率で形質導入することができる。ベクターを使用する場合、ベクターは、プラスミドベクター（すなわち、ウイルスベクターではないベクター）である限り、上述の核酸と同様に形質導入することができる。本発明の文脈において、細胞（例えば、Ｔ細胞）に形質導入する方法としては、レトロウイルス又はレンチウイルスＴ細胞形質導入、非ウイルスベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙミニサークルベクトル）、並びにｍＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。「ｍＲＮＡトランスフェクション」とは、形質導入される細胞内で目的のタンパク質、例えば本発明の抗原結合受容体を一過性に発現させる当業者に周知の方法を指す。簡単に言えば、細胞は、エレクトロポレーションシステム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用することによって、本発明の抗原結合受容体をコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションされ、その後、上記の標準的な細胞（例えば、Ｔ細胞）培養プロトコールによって培養され得る（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（１）（２００６），１５１－１５９を参照）。本発明の形質導入された細胞は、レンチウイルス形質導入、又は最も好ましくはレトロウイルス形質導入によって生成することができる。
【0326】
この文脈において、細胞に形質導入するのに適したレトロウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Ｃｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１９９９），５０７－５１３）、ＬＺＲＳ－ｉｄ３－ＩＨＲＥＳ（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６（１９９７），１５９７－１６０２）、ＦｅＬＶ（Ｎｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０８（１９８４），８１４－８２０）、ＳＡＸ（Ｋａｎｔｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６），６５６３－６５６７）、ｐＤＯＬ（Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７（１９８８），３７２－３８８）、Ｎ２（Ｋａｓｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（１９９０），４７３－４７７）、ＬＮＬ６（Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４（１９９４），１３３３－１３４１）、ｐＺｉｐＮＥＯ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３（１９９４），３６３０－３６３８）、ＬＡＳＮ（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１９９６），１１２３－１１２９）、ｐＧ１ＸｓＮａ（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４（１９９６），２０３１－２０３６）、ＬＣＮＸ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１９９７），１０４１－１０４８）、ＳＦＧ（Ｇａｌｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９０（１９９７）、及びＬＸＳＮ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１９９７），１０４１－１０４８）、ＳＦＧ（Ｇａｌｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９０（１９９７），９５２－９５７）、ＨＭＢ－Ｈｂ－Ｈｕ（Ｖｉｅｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７），１１５９５－１１６００）、ｐＭＶ７（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４６（１９９８），６１－６６）、ｐＳＴＩＴＣＨ（Ｗｅｉｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５（１９９８），１１９５－１２０３）、ｐＬＺＲ（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（１９９９），１２３－１３２）、ｐＢＡＧ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（１９９９），９７７－９８２）、ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Ｇｉｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２５（２００２），１３９－１５１）、ｐＬＧＳＮ（Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２００３），１１５５－１１６８）、ｐＭＰ７１（Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２００３），１１５５－１１６８）、ｐＧＣＳＡＭ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（２００３），３２８７－３２９５）、ｐＭＳＧＶ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（２００５），４４１５－４４２３）、又はｐＭＸ（ｄｅ Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（２００８），５１２８－５１３６）である。本発明の文脈において、細胞（例えば、Ｔ細胞）に形質導入するための適切なレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ－ＳＩＮレンチウイルスベクター（Ｈｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６（５）（２００９），３７０－３７６）、ｐ１５６ＲＲＬ－ｓｉｎＰＰＴ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Ｃａｍｐｅａｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（８）（２００９），ｅ６５２９）、ｐＣＭＶＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：２２０３６）、ＦＵＧＷ（Ｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５（５５５６）（２００２），８６８－８７２、ｐＬＶＸ－ＥＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：６４３６８）、ｐＬＶＥ（Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（９）（２０１４），Ｅ７９８－８０６）、ｐＣＤＨ１－ＭＣＳ１－ＥＦ１（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７（１１）（２００９），１７５６－１７７０）、ｐＳＬＩＫ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（４）（２０１４），３４５－３５６）、ｐＬＪＭ１（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４５（１２）（２０１３），１４２８－３０）、ｐＬＸ３０２（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．６（２８７）（２０１３），ｒｓ１３）、ｐＨＲ－ＩＧ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．３３（１２）（２０１３），１８７５－８５）、ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：６２０５３）、ｐＬＳ（Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）（１９９８），８１５０－８１５７）、ｐＬＬ３．７（Ｌａｚｅｂｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８３（７）（２００８），１１０７８－８２）、ＦＲＩＧ（Ｒａｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７（２０１３），２３－３２）、ｐＷＰＴ（Ｒｉｔｚ－Ｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４６（６）（２００３），８１０－８２１）、ｐＢＯＢ（Ｍａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（１－２）（２００４），５－１１）、又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：２７９７６）である。
【0327】
本発明の形質導入された細胞は、好ましくは、それらの自然環境外の制御された条件下で増殖される。特に、「培養する」という用語は、多細胞真核生物（好ましくはヒト患者由来）に由来する細胞（例えば、本発明の形質導入された細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることを意味する。細胞を培養することは、元の組織源から分離された細胞を生きた状態に保つための実験技術である。ここで、本発明の形質導入された細胞は、前記形質導入された細胞内又は上で本発明の抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で培養される。この発現又は導入遺伝子（すなわち、本発明の抗原結合受容体のもの）を可能にする条件は、当技術分野において一般に知られており、例えば、アゴニスト抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、並びにサイトカイン（インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）など）の添加が含まれる。培養された形質導入細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ）における本発明の抗原結合受容体の発現後、形質導入細胞は培養物（すなわち培地）から回収（すなわち再抽出）される。
【0328】
したがって、本発明の方法によって得られる本発明の核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する、形質導入された細胞、好ましくはＴ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔも本発明に包含される。
【0329】
核酸分子
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の１つ又はいくつかの抗原結合受容体をコードする核酸及びベクターである。抗原結合受容体をコードする例示的な核酸分子を配列番号２０に示す。核酸分子は、調節配列の制御下にあり得る。例えば、本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が用いられ得る。本発明の文脈において、核酸分子は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で発現される。好適なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＵＢＣプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＰＧＫ（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＥＦ１Ａプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＡＧＧプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＳＶ４０プロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＴＲＥプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（２００４），Ｓ３６７－Ｓ３６７（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．０６．９０４））又はＮａｎｏｇプロモーター（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５（５）（２００５），３１７－２４）がある。したがって、本発明は、本発明に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクターに関するものでもある。ここでのベクターという用語は、それが導入された細胞内で自律的に複製することができる環状又は直鎖状の核酸分子を指す。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、その選択は所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子工学で従来から使用されている他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を使用して、様々なプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載の技術を参照。あるいは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに再構成することができる。以下でさらに詳細に説明するように、個々のＤＮＡ配列を単離するためにクローニングベクターが使用された。特定のポリペプチドの発現が必要な場合、適切な配列を発現ベクターに導入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８及びｐＧＢＴ９が含まれる。代表的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の１つ又はいくつかの抗原結合受容体をコードする核酸及びベクターである。抗原結合受容体をコードする例示的な核酸分子を配列番号２０に示す。核酸分子は、調節配列の制御下にあり得る。例えば、本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が用いられ得る。本発明の文脈において、核酸分子は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で発現される。好適なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＵＢＣプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＰＧＫ（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＥＦ１Ａプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＡＧＧプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＳＶ４０プロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＴＲＥプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（２００４），Ｓ３６７－Ｓ３６７（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．０６．９０４））又はＮａｎｏｇプロモーター（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５（５）（２００５），３１７－２４）がある。したがって、本発明は、本発明に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクターに関するものでもある。ここでのベクターという用語は、それが導入された細胞内で自律的に複製することができる環状又は直鎖状の核酸分子を指す。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、その選択は所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子工学で従来から使用されている他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を使用して、様々なプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載の技術を参照。あるいは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに再構成することができる。以下でさらに詳細に説明するように、個々のＤＮＡ配列を単離するためにクローニングベクターが使用された。特定のポリペプチドの発現が必要な場合、適切な配列を発現ベクターに導入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８及びｐＧＢＴ９が含まれる。代表的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
【0330】
本発明はまた、本明細書に定義される抗原結合受容体をコードする前記核酸分子（複数可）に作動可能に連結された調節配列である核酸分子（複数可）を含むベクター（複数可）にも関する。本発明の文脈において、ベクターはポリシストロン性であり得る。このような調節配列（制御エレメント）は当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクター（複数可）に挿入物を導入するための翻訳及び挿入部位を含み得る。本発明の文脈において、前記核酸分子（複数可）は、真核細胞又は原核細胞における発現を可能にする前記発現制御配列に作動可能に連結されている。前記ベクター（複数可）が、本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする核酸分子（複数可）を含む発現ベクター（複数可）であることが想定される。動作可能に連結するとは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方法で連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましく使用されることは当業者にとって明らかである。
【0331】
本発明の文脈において、記載されたベクター（複数可）は発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができ、選択された細胞内でコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター（複数可）、バイナリーベクター（複数可）、又は組み込みベクター（複数可）であり得る。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物及び／又は真核生物細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。調節エレメントは、真核細胞の場合、転写の開始を確実にするプロモーターを通常含み、さらに任意選択で転写の終了と転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核生物宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの候補は、例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを含み、真核生物宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１若しくはＧＡＬ１プロモーター又は哺乳動物細胞及びその他の動物細胞のＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。
【0332】
転写の開始に関与するエレメントに加えて、そのような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流にあるＳＶ４０－ポリ－Ａ部位又はｔｋ－ポリ－Ａ部位などの転写終結シグナルを含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントに向けることができるか又はそれを培地に分泌することができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列は、列挙される核酸配列のコード配列に添加されてもよく、当技術分野でよく知られている；例えば、添付の実施例も参照。
【0333】
リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始及び終止配列と適切な段階で組み合わされ、好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部を細胞周辺腔又は細胞外培地に分泌するように指示することができるリーダー配列である。任意選択で、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化又は精製の簡略化を付与するＮ末端識別ペプチドを含む抗原結合受容体をコードすることができる；前掲書参照。この脈絡において、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ若しくはｐＥＦ－ｎｅｏ（Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１），１４１－１５０）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）など、当技術分野で公知である。
【0334】
本発明の文脈において、発現制御配列は、真核細胞を形質転換又はトランスフェクトできるベクター中の真核プロモーターシステムであるが、原核細胞用の制御配列も使用することができる。ベクターが適切な細胞に組み込まれると、その細胞は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で、所望のように維持される。追加の調節エレメントには、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーが含まれる場合がある。有利には、本発明の上記ベクターは、選択可能及び／又はスコア化可能なマーカーを含んでいる。形質転換細胞、例えば植物組織及び植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は、当業者に周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４），１４３－１４９）、アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン及びパラマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３），９８７－９９５）、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ ３２（１９８４），４８１－４８５）に対する選択の基礎として代謝拮抗薬耐性を含む。さらなる選択可能な遺伝子、すなわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５（１９８８）、８０４７）、マンノースを細胞が利用することを可能にするマンノース－６－ホスフェート（国際公開第９４／２０６２７号）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）又はブラストサイジンＳに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５）、２３３６－２３３８）が記載されている。
【0335】
有用なスコア化可能なマーカーも当業者に知られており、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６），５９－７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６），１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６），４４－４７）又はβ－グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．６（１９８７），３９０１－３９０７）である。この実施態様は、言及したベクターを含む細胞、組織及び生物の簡単且つ迅速なスクリーニングに特に有用である。
【0336】
上記のように、言及した核酸分子（複数可）は、例えば、養子Ｔ細胞療法のためだけでなく、遺伝子治療の目的のために、細胞内で本発明の抗原結合受容体を発現させるために、単独で、又はベクター（複数可）の一部として使用することができる。本明細書に記載の抗原結合受容体のいずれか１つをコードするＤＮＡ配列（複数可）を含む核酸分子又はベクター（複数可）は細胞に導入され、次いで目的のポリペプチドを産生する。遺伝子治療は、ｅｘ ｖｉｖｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法による細胞への治療用遺伝子の導入に基づいており、遺伝子導入の最も重要な応用の一つである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法又は遺伝子送達系に適したベクター、方法又は遺伝子送達系は文献に記載されており、当業者に知られている。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６），５３４－５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１－９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２），８０８－８１３；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９４），２３９；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６），３７０－３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５），１０７７－１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｂｌｏｏｄ ９１（１９９８），３０－３６；Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９８），６９２－６９９；Ｎａｂｅｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７），２８９－２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８），２２４３－５１；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６），７１４－７１６；国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号；米国特許第５，５８０，８５９号；米国特許第５，５８９，４６６号；又はＳｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６），６３５－６４０を参照されたい。言及した核酸分子（複数可）及びベクター（複数可）は、細胞への直接導入のために、又はリポソーム若しくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のために設計され得る。本発明の文脈において、前記細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞であり、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0337】
以上により、本発明は、本明細書に記載の抗原結合受容体のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含むベクター、特に遺伝子工学において従来から用いられているプラスミド、コスミド、バクテリオファージを得る方法に関する。本発明の文脈において、前記ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子導入ベクター若しくは標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが、言及したポリヌクレオチド又はベクターを標的細胞集団に送達するために使用され得る。
【0338】
当業者に周知の方法を用いて１つ又は複数の組換えベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．），Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９，ｌｏｃ ｃｉｔ．）又は他の標準的な教科書に記載の技術を参照されたい。あるいは、言及した核酸分子及びベクターは、標的細胞への送達のためのリポソームに再構成することができる。本発明の核酸分子を含むベクターを周知の方法によって宿主細胞内に導入することができるが、但しそれは細胞宿主の種類によって異なる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるが、その他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが利用され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ前掲書を参照されたい。言及したベクターは、特に、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ又はｐＥＦ－ｎｅｏであってもよい。ベクターｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ及びｐＥＦ－ｎｅｏは、当技術分野において、例えばＭａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１９９５），７０２１－７０２５及びＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１），１４１－１５０に記載されている。
【0339】
本発明は、本明細書に記載のベクターを形質導入されたＴ細胞も提供する。前記Ｔ細胞は、上述したベクターの少なくとも１つ又は上述した核酸分子の少なくとも１つをＴ細胞又はその前駆細胞に導入することによって製造することができる。Ｔ細胞における前記少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む上記の抗原結合受容体をコードする遺伝子の発現を媒介するものである。本発明のベクターは多シストロン性とすることができる。
【0340】
Ｔ細胞又はその前駆細胞に導入される記載の核酸分子（複数可）又はベクター（複数可）は、細胞のゲノムに組み込まれるか、又は染色体外に維持され得る。
【0341】
キット
本発明のさらなる態様は、本発明によるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体／抗体（複数）、及び本発明による抗原結合受容体をコードする核酸（複数可）、及び／又は前記抗原結合受容体による形質導入のための細胞／前記抗原結合受容体で形質導入された細胞、好ましくはＴ細胞を含むか、又はこれらからなるキットである。
本発明のさらなる態様は、本発明によるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体／抗体（複数）、及び本発明による抗原結合受容体をコードする核酸（複数可）、及び／又は前記抗原結合受容体による形質導入のための細胞／前記抗原結合受容体で形質導入された細胞、好ましくはＴ細胞を含むか、又はこれらからなるキットである。
【0342】
したがって、
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と、
を含むキットが提供される。
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と、
を含むキットが提供される。
【0343】
さらに、
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
を含むキットが提供される。
（ａ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、抗体と、
（ｂ）第１のサブユニットに特異的に結合することができる抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドと、
を含むキットが提供される。
【0344】
好ましい実施態様では、本発明のキットは、形質導入されたＴ細胞と、単離されたポリヌクレオチド及び／又はベクターと、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む１つ又は複数の抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む抗体とを含む。特定の実施態様では、本抗体は、治療用抗体、例えば、本明細書に記載の腫瘍特異的抗体である。腫瘍特異的抗原は、当技術分野で公知であり、本明細書で上に記載されている。本発明の文脈において、本抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。本発明によるキットは、形質導入されたＴ細胞、又は形質導入されたＴ細胞を生成するためのポリヌクレオチド／ベクターを含む。この文脈では、形質導入されたＴ細胞は、所定の腫瘍に特異的ではないが、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体の使用によって任意の腫瘍を標的とすることができるため、ユニバーサルＴ細胞である。本明細書では、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体の例（例えば、配列番号１２９～１３１）が提供されるが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む任意の抗体であって、ここで、第１のサブユニットは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含み、第２のサブユニットは、ＥＵ番号付けによる３２９位にプロリン（Ｐ）を含む、任意の抗体が提供される。
【0345】
本発明のキットの部品は、バイアル又はボトルに個別包装されていても、容器又はマルチコンテナユニットにまとめて包装されていてもよい。さらに、本発明のキットは、患者細胞、好ましくは本明細書に記載のＴ細胞を本発明の１つ又は複数の抗原結合受容体で形質導入し、ＧＭＰ（欧州委員会がｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｅｕｄｒａｌｅｘ／ｉｎｄｅｘ＿ｅｎ．ｈｔｍに掲載している優良製造所基準）条件下でインキュベートすることができる細胞培養バッグ（クローズド）システム（（ｃｌｏｓｅｄ）ｂａｇ ｃｅｌｌ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を含んでもよい。さらに、本発明のキットは、単離した／入手した患者Ｔ細胞を本発明の抗原結合受容体で形質導入し、ＧＭＰ下でインキュベートすることができる細胞培養バッグ（クローズド）システムを含む。さらに、本発明の文脈において、本キットは、本明細書に記載の１つ又は複数の抗原結合受容体をコードするベクターを含んでいてもよい。本発明のキットは、特に、本発明の方法を実施するために有利に使用することができ、本明細書で言及する様々な用途、例えば、研究ツール又は医療ツールとして採用することができる。本キットの製造は、好ましくは、当業者に既知の標準的な手順に従う。
【0346】
この文脈において、患者由来細胞、好ましくはＴ細胞は、上記のＥＵ番号付けに従って、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むヘテロ二量体Ｆｃドメインに特異的に結合することができる本発明の抗原結合受容体で形質導入され得る。変異ヘテロ二量体Ｆｃドメインに特異的に結合できる抗原結合部分を含む細胞外ドメインは、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に天然には存在しないしたがって、本発明のキットで形質導入された患者由来細胞は、本発明によるヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体、例えば治療用抗体への特異的結合能力を獲得し、前記抗体との相互作用を介して標的細胞の除去／溶解を誘導することができるようになり、前記抗体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する（すなわち、内因的に発現される）腫瘍特異的抗原に結合することができる。本明細書に記載の抗原結合受容体の細胞外ドメインの結合は、そのＴ細胞を活性化し、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む抗体を介してそれを腫瘍細胞と物理的に接触させる。非形質導入Ｔ細胞又は内因性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、変異Ｆｃドメインを含む抗体のヘテロ二量体Ｆｃドメインに結合することができない。本明細書に記載の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞は、本明細書に記載のＦｃドメインに変異を含まない治療用抗体による影響を受けない状態である。したがって、本明細書に記載の抗原結合受容体分子を発現するＴ細胞は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む本明細書に記載の抗体の存在下で、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞を溶解する能力を有する。対応する標的細胞は、本明細書に記載の抗体の少なくとも１つ、好ましくは２つの結合ドメインによって認識される表面分子、すなわち腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原を発現する細胞を含む。
【0347】
標的細胞の溶解は、当技術分野で公知の方法によって検出することができる。したがって、このような方法は、特に生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを含む。このような生理学的アッセイは、例えば細胞膜の完全性の喪失による細胞死をモニターすることができる（例えば、ＦＡＣＳベースのヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出定（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ）アッセイ（ＬＤＨ）、放射性５１Ｃｒ放出（ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ）アッセイ、蛍光定量ユーロピウム放出（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）アッセイ及びカルセインＡＭ放出アッセイ）。さらなるアッセイは、例えば、測光ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ－１及びアラマーブルーアッセイ、放射性３Ｈ－Ｔｈｄ取り込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、及びミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン１２３アッセイによる細胞生存能力のモニターを含む。さらに、アポトーシスは、例えば、ＦＡＣＳベースのホスファチジルセリン曝露アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのＴＵＮＥＬ試験、カスパーゼ活性アッセイ（測光、蛍光測定又はＥＬＩＳＡベース）によって、又は変化した細胞形態（収縮、膜小疱形成）を分析することによってモニターすることができる。
【0348】
併用療法
本明細書で提供される分子又は構築物（例えば、抗体、抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞及びキット）は、特にがんの治療のために医療現場で特に有用である。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞上の標的抗原に結合し、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む治療用抗体と併せて、本発明による抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞で治療され得る。したがって、特定の実施態様では、抗体、抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又はキットは、がん、特に上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんの治療において使用される。
本明細書で提供される分子又は構築物（例えば、抗体、抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞及びキット）は、特にがんの治療のために医療現場で特に有用である。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞上の標的抗原に結合し、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む治療用抗体と併せて、本発明による抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞で治療され得る。したがって、特定の実施態様では、抗体、抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又はキットは、がん、特に上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんの治療において使用される。
【0349】
治療の腫瘍特異性は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインと標的細胞抗原に結合する特異性を持つ抗体によってもたらされる。抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与することができる。この文脈では、形質導入されたＴ細胞は、所定の腫瘍に特異的ではないが、本発明に従って使用される抗体の特異性に応じて任意の腫瘍を標的とすることができるため、ユニバーサルＴ細胞である。
【0350】
上記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん／癌であっても、血液のがんであってもよい。一実施態様では、上記がん／癌は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸管がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、上咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、皮膚がん（メラノーマ）、尿生殖器管のがん、例えば精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、及び甲状腺のがん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫若しくは骨肉腫などの他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。
【0351】
例えば、腫瘍性疾患及び／又はリンパ腫は、これらの医学的適応症を対象とする特定の構築物を用いて治療され得る。例えば、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異抗原としての）（ヒト）ＥｐＣＡＭに対して向けられる抗体で治療することができる。
【0352】
胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＨＥＲ１、好ましくはヒトＨＥＲ１に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。さらに、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＭＣＳＰ、好ましくはヒトＭＣＳＰに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＦＯＬＲ１、好ましくはヒトＦＯＬＲ１に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、Ｔｒｏｐ－２、好ましくはヒトＴｒｏｐ－２に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＰＳＣＡ、好ましくはヒトＰＳＣＡに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、好ましくはヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＭＳＬＮ、好ましくはヒトＭＳＬＮに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＨＥＲ２、好ましくはヒトＨＥＲ２に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃がん及び／又は肺がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＨＥＲ３、好ましくはヒトＨＥＲ３に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＣＤ２０、好ましくはヒトＣＤ２０に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。骨髄性白血病は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。卵巣がん、肺がん、乳がん、及び／又は胃腸がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＣＡ１２－５、好ましくはヒトＣＡ１２－５に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、白血病、及び／又は上咽頭癌は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくはヒトＨＬＡ－ＤＲに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、及び／又は膵臓がんは、ＭＵＣ－１、好ましくはヒトＭＵＣ－１に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。結腸がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、Ａ３３、好ましくはヒトＡ３３に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。前立腺がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。膵臓がん、肺がん、及び／又は乳がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、トランスフェリン受容体、好ましくはヒト受容体に対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。腎臓がんは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ＣＡ－ＩＸ、好ましくはヒトＣＡ－ＩＸに対して向けられる抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療され得る。
【0353】
また、本発明は、疾患、例えば上皮、内皮若しくは中皮由来のがん及び／又は血液のがんなどの悪性疾患の治療方法に関するものでもある。本発明の文脈において、前記対象はヒトである。
【0354】
本発明の文脈において、疾患の治療のための特定の方法は、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；及び
（ｃ）形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む。
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；及び
（ｃ）形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む。
【0355】
本発明の文脈において、前記形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び／又はヘテロ二量体抗体／抗体（複数）は、静脈内注入によって前記対象に同時投与される。
【0356】
さらに、本発明の文脈において、本発明は、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；
（ｃ）任意選択的に、前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞にＴ細胞受容体を同時形質導入する工程；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によってＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を増殖させる工程；及び
（ｅ）形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む疾患の治療方法を提供する。
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；
（ｃ）任意選択的に、前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞にＴ細胞受容体を同時形質導入する工程；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によってＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を増殖させる工程；及び
（ｅ）形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む疾患の治療方法を提供する。
【0357】
上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体によるＴＩＬなどのＴ細胞の増殖工程を指す）は、インターロイキン２及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などの（刺激性）サイトカインの存在下で実施することもできる。本発明の文脈において、上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体によるＴＩＬなどのＴ細胞の増殖工程を指す）は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）及び／又はインターロイキン２１（ＩＬ－２１）の存在下で実施することもできる。
【0358】
治療方法は、さらに、本発明に従って使用される抗体の投与を含む。前記抗体は、形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与され得る。本発明の文脈において、形質導入されたＴ細胞の投与は、静脈内注入によって行われるであろう。本発明の文脈において、その形質導入されたＴ細胞は、治療対象から単離／取得される。
【0359】
本発明はさらに、他の化合物、例えば、免疫エフェクター細胞、細胞増殖又は細胞刺激のための活性化シグナルを提供することができる分子との同時投与プロトコールを想定している。前記分子は、例えば、Ｔ細胞のさらなる一次活性化シグナル（例えば、さらなる共刺激分子：Ｂ７ファミリーの分子、Ｏｘ４０Ｌ、４．１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１）、又はさらなるサイトカインインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）であってもよい。
【0360】
また、上記のような本発明の組成物は、任意選択で検出のための手段及び方法をさらに含む、診断用組成物であってもよい。
【0361】
これら及びその他の実施態様は、本発明の説明及び実施例によって開示され、包含される。本発明に従って採用される抗体、細胞、方法、使用及び化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子機器を使用して公共の図書館及びデータベースから検索することができる。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌから、例えばインターネット上で公開されている公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。さらなるデータベース及びアドレス、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌなどが当業者に知られており、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍを使用して取得することもできる。
【0362】
例示的配列
【実施例】
【0363】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【0364】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に示される。
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に示される。
【0365】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
【0366】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手できない場合は、最も近い相同体からの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全ての構築物は、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計された。
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手できない場合は、最も近い相同体からの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全ての構築物は、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計された。
【0367】
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造
抗体及び二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０７４３０２９）に置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、補充物（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を加えた（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充物（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を加えた。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、以下に示す標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
抗体及び二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０７４３０２９）に置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、補充物（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を加えた（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充物（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を加えた。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、以下に示す標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
【0368】
ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造
代替的に、本明細書に記載の抗体及び二重特異性抗体は、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。製造のために、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を使用した。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
代替的に、本明細書に記載の抗体及び二重特異性抗体は、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。製造のために、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を使用した。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
【0369】
ＩｇＧ様タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６））によって濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、凝集したタンパク質を単量体タンパク質から分離した。
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６））によって濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、凝集したタンパク質を単量体タンパク質から分離した。
【0370】
ＩｇＧ様タンパク質の分析
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。タンパク質の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。凝集物含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。タンパク質の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。凝集物含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。
【0371】
レンチウイルス上清の調製とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞への形質導入
約８０％コンフルエントなＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１６）及びＣＡＲをコードする移入ベクター並びにパッケージングベクターｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ及びｐｓＰＡＸ２を２：２：１のモル比で使用して、リポフェクタミンＬＴＸ（商標）に基づくトランスフェクションを行った（Ｇｉｒｙ－Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７３７：１８３－２０９，Ｍｙｂｕｒｇｈ Ｒ，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１４）。６６時間後、上清を回収し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍポリエーテルスルホンフィルターで濾過してウイルス粒子を回収し、精製した。ウイルス粒子は、そのまま使用するか、又は濃縮して（Ｌｅｎｔｉ－ｘ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｔａｋａｒａ）、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞のスピンフェクション（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１、９００×ｇ、２時間、３１℃）に使用した。
約８０％コンフルエントなＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１６）及びＣＡＲをコードする移入ベクター並びにパッケージングベクターｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ及びｐｓＰＡＸ２を２：２：１のモル比で使用して、リポフェクタミンＬＴＸ（商標）に基づくトランスフェクションを行った（Ｇｉｒｙ－Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７３７：１８３－２０９，Ｍｙｂｕｒｇｈ Ｒ，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１４）。６６時間後、上清を回収し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍポリエーテルスルホンフィルターで濾過してウイルス粒子を回収し、精製した。ウイルス粒子は、そのまま使用するか、又は濃縮して（Ｌｅｎｔｉ－ｘ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｔａｋａｒａ）、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞のスピンフェクション（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１、９００×ｇ、２時間、３１℃）に使用した。
【0372】
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイは、ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）のＴ細胞活性化を測定するものである。この不死化Ｔ細胞株は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように遺伝子操作されている。さらに、該細胞株は、ＣＤ３ｚシグナル伝達メインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を発現する。ＣＡＲと固定化されたアダプター分子（腫瘍抗原結合アダプター分子など）との結合により、ＣＡＲの架橋が起こり、Ｔ細胞活性化とルシフェラーゼの発現に至る。基質の添加後、ＮＦＡＴ活性の細胞変化を相対光単位として測定することができる（Ｄａｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｍａｙ ２０１９，Ｐａｇｅｓ ２０７－２１８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｚ０２７）。一般に、このアッセイは３８４プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３９６３ 白色、透明底）で実施された。標的細胞（ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞）とエフェクター細胞を１：５の比率（標的細胞２０００個、エフェクター細胞１００００個）で１０μｌずつ、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に３連で播種した。増殖培地でさらに、目的の抗体の段階希釈液を、アッセイプレートで最終濃度が６７ｎＭから０．００００６７ｎＭ、最終体積が１ウェルあたり合計３０μｌとなるように調製した。３８４ウェルプレートを３００ｇ、室温で１分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で、湿度雰囲気中インキュベートした。７時間のインキュベーション後、最終容量の２０％のＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ（Ｅ６１２０，Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを３５０×ｇで１分間遠心分離した。その後、直ちにＴｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダーを使用して、１秒／ウェルあたりの相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ バージョン７を用いて、濃度反応曲線をフィッティングさせ、ＥＣ５０値を算出した。ｐ値として、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７に記載されているＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅスタイルを使用した。＊はＰ≦０，０３３；＊＊はＰ≦０，００２；＊＊＊はＰ≦０，００１を意味する。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイは、ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）のＴ細胞活性化を測定するものである。この不死化Ｔ細胞株は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように遺伝子操作されている。さらに、該細胞株は、ＣＤ３ｚシグナル伝達メインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を発現する。ＣＡＲと固定化されたアダプター分子（腫瘍抗原結合アダプター分子など）との結合により、ＣＡＲの架橋が起こり、Ｔ細胞活性化とルシフェラーゼの発現に至る。基質の添加後、ＮＦＡＴ活性の細胞変化を相対光単位として測定することができる（Ｄａｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｍａｙ ２０１９，Ｐａｇｅｓ ２０７－２１８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｚ０２７）。一般に、このアッセイは３８４プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３９６３ 白色、透明底）で実施された。標的細胞（ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞）とエフェクター細胞を１：５の比率（標的細胞２０００個、エフェクター細胞１００００個）で１０μｌずつ、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に３連で播種した。増殖培地でさらに、目的の抗体の段階希釈液を、アッセイプレートで最終濃度が６７ｎＭから０．００００６７ｎＭ、最終体積が１ウェルあたり合計３０μｌとなるように調製した。３８４ウェルプレートを３００ｇ、室温で１分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で、湿度雰囲気中インキュベートした。７時間のインキュベーション後、最終容量の２０％のＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ（Ｅ６１２０，Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを３５０×ｇで１分間遠心分離した。その後、直ちにＴｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダーを使用して、１秒／ウェルあたりの相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ バージョン７を用いて、濃度反応曲線をフィッティングさせ、ＥＣ５０値を算出した。ｐ値として、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７に記載されているＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅスタイルを使用した。＊はＰ≦０，０３３；＊＊はＰ≦０，００２；＊＊＊はＰ≦０，００１を意味する。
【0373】
実施例１
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体の生成及び特性評価
親抗Ｐ３２９Ｇ抗体及びヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体はＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。全ての抗体は、高品質で精製された（表２）。
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体の生成及び特性評価
親抗Ｐ３２９Ｇ抗体及びヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体はＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。全ての抗体は、高品質で精製された（表２）。
【0374】
【0375】
抗Ｐ３２９ＧバインダーＭ－１．７．２４の親及び６つのヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合
器具類：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００
チップ：ＣＭ５（＃７７２）
Ｆｃ１～４：抗ヒトＦａｂ特異的（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９５８３－２５）
捕捉：５０ｎＭ ＩｇＧ、６０秒
分析物：ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）（Ｐ１ＡＤ９０００－００４）
ランニングバッファー：ＨＢＳ－ＥＰ
Ｔ°：２５℃
希釈：ＨＢＳ－ＥＰで２倍希釈 ０．５９～３７．５ｎＭ
流速：３０μｌ／分
会合：２４０秒
解離：８００秒
再生：１０ｍＭ グリシン ｐＨ２．１ ２ｘ６０秒
器具類：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００
チップ：ＣＭ５（＃７７２）
Ｆｃ１～４：抗ヒトＦａｂ特異的（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９５８３－２５）
捕捉：５０ｎＭ ＩｇＧ、６０秒
分析物：ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）（Ｐ１ＡＤ９０００－００４）
ランニングバッファー：ＨＢＳ－ＥＰ
Ｔ°：２５℃
希釈：ＨＢＳ－ＥＰで２倍希釈 ０．５９～３７．５ｎＭ
流速：３０μｌ／分
会合：２４０秒
解離：８００秒
再生：１０ｍＭ グリシン ｐＨ２．１ ２ｘ６０秒
【0376】
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニングバッファーとして（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して実施された。抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９５８３－２５）を、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にアミンカップリングにより直接固定化した。ＩｇＧを、５０ｎＭで６０秒間捕捉した。ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）の２倍希釈系列を、３０μｌ／分で２４０秒間リガンド上を通過させ、会合相を記録した。解離相を、８００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋へと切り替えることによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．１を６０秒間２回注入することにより、サイクルごとに再生された。バルク屈折率の差は、参照フローセル１で得られた応答を差し引くことで補正された。親和定数を、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングによって速度定数から導出した。測定は、独立した希釈系列でトリプリケートで行われた。
【0377】
以下の試料について、ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）との結合を解析した（表３）。
【0378】
【0379】
ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）は、ヒトＩｇＧ１のプラスミン消化と、続いてプロテインＡによるアフィニティー精製及びサイズ排除クロマトグラフィーによって調製された。
【0380】
抗Ｐ３２９ＧバインダーＭ－１．７．２４の親及び６つのヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合
解離相を１本の曲線に当てはめ、オフレートを特徴づけるのに役立てた。結合と捕捉反応レベルの比率を算出した。（表４）
解離相を１本の曲線に当てはめ、オフレートを特徴づけるのに役立てた。結合と捕捉反応レベルの比率を算出した。（表４）
【0381】
【0382】
抗Ｐ３２９ＧバインダーＭ－１．７．２４の親及び３つのヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）に対する親和性
親と同様の結合パターンを持つ３種類のヒト化バリアントを、より詳細に評価した。１：１のラングミュア結合の速度定数を表５にまとめた。
親と同様の結合パターンを持つ３種類のヒト化バリアントを、より詳細に評価した。１：１のラングミュア結合の速度定数を表５にまとめた。
【0383】
【0384】
結論
６つのヒト化バリアントが生成された。それらのうちの３つ（ＶＨ４ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３）は、親Ｍ－１．７．２４と比較して、ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合の減少を示した。他の３つのヒト化バリアント（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）は、親バインダーと非常に似た結合反応速度を示し、ヒト化によって親和性が失われることはなかった。
６つのヒト化バリアントが生成された。それらのうちの３つ（ＶＨ４ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３）は、親Ｍ－１．７．２４と比較して、ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合の減少を示した。他の３つのヒト化バリアント（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）は、親バインダーと非常に似た結合反応速度を示し、ヒト化によって親和性が失われることはなかった。
【0385】
実施例２
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の調製
ヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントの機能性を評価するために、Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ変異に特異的なバインダーをコードする重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の異なる可変ドメインＤＮＡ配列を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）結合部分としてクローニングし、第二世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインとして使用した。
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の調製
ヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントの機能性を評価するために、Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ変異に特異的なバインダーをコードする重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の異なる可変ドメインＤＮＡ配列を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）結合部分としてクローニングし、第二世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインとして使用した。
【0386】
Ｐ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バリアントは、Ｉｇ重鎖可変メインドメイン（ＶＬ）とＩｇ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ＶＨとＶＬは（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して連結されている。ｓｃＦｖ抗原結合ドメインは、アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）ＣＤ８ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１７３２［１８３－２０３］）に融合され、これが細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）ＣＤ１３７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１ＡＡ ２１４－２５５）に融合され、さらに刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）ＣＤ３ζ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０９６３ ＡＡ ５２－１６４）に融合される。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲのｓｃＦｖは、ＶＨｘＶＬ（図１Ａ）又はＶＬｘＶＨ（図１Ｂ）の２つの異なる方向で構築された。ＶＨＶＬ構成についての例示的な発現構築物（ＧＦＰレポーターを含む）のグラフ表示を図１Ｃに示し、ＶＬＶＨ構成について図１Ｄに示す。
【0387】
実施例３
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞における抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体をＪｕｒｋａｔ（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）細胞へウイルス形質導入した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞における抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体をＪｕｒｋａｔ（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）細胞へウイルス形質導入した。
【0388】
抗Ｐ３２９Ｇ抗原結受容体の発現をフローサイトメトリーで評価した。異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体を使用するＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、９６ウェル平底プレートにウェル当たり５０，０００細胞で播種した。異なる濃度（１：５の５００ｎＭ～０ｎＭ連続希釈）のＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む抗体で暗所及び冷蔵庫（４～８℃）で４５分間染色した後、試料をＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＦＢＳ、１０％の０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８及び０．５ｇ／Ｌ ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、試料を２．５μｇ／ｍＬポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的且つＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ断片抗体で３０分間、暗所冷蔵庫内で染色し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＢＤ）で分析した。さらに、抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体には細胞内ＧＦＰレポーターが含まれていた（図１Ｃを参照）。
【0389】
Ｐ３２９Ｇバインダーのヒト化バージョン（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、及びＶＨ３ＶＬ１）と比較して、元の非ヒト化バインダーは細胞表面で弱いＣＡＲ標識化を示すが（図２Ａ）、ＧＦＰ発現は同等である。興味深いことに、ＶＬ１ＶＨ１構築物（図１Ｄを参照）は高いＧＦＰ発現を示すが、細胞表面での弱いＣＡＲ標識化も示し、これはバインダーの好ましくないコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）であることを示している。
【0390】
全体として、予想外に、ＶＨ３ＶＬ１バージョンが最も高いＧＦＰ発現とＣＡＲ表面発現を示す。さらに、ＶＨＶＬコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の試験された全ての構築物（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、及びＶＨ３ＶＬ１）は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に形質導入すると、元の非ヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体、さらには興味深いことにＶＬＶＨコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の構築物（ＶＬ１ＶＨ３）と比較して、増強されたＧＦＰシグナルを示す。
【0391】
結論として、ＶＨＶＬコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）は、抗原結合受容体の発現レベル及び細胞表面への正確な標的化に有利であると思われる。
【0392】
さらに、ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の選択性、特異性及び安全性を特徴づけるために、様々な試験を実施した。
【0393】
実施例４
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的化抗体の存在下での特異的なＴ細胞活性化
様々なヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアントの非特異的結合を除外するために、これらのバリアントを含む抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化を、ＣＤ２０陽性ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞及び様々なＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、ＬＡＬＡ変異、Ｄ２４６Ａ変異又はそれらの組み合わせ）を有する抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）抗体の存在下で評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように行い、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）を使用して、非特異的結合の可能性を評価した。抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）については、非特異的抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化を検出することができなかった。
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的化抗体の存在下での特異的なＴ細胞活性化
様々なヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアントの非特異的結合を除外するために、これらのバリアントを含む抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化を、ＣＤ２０陽性ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞及び様々なＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、ＬＡＬＡ変異、Ｄ２４６Ａ変異又はそれらの組み合わせ）を有する抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）抗体の存在下で評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように行い、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）を使用して、非特異的結合の可能性を評価した。抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）については、非特異的抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化を検出することができなかった。
【0394】
特異的な抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化を、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）の存在下で検出することができた。評価されたＥＣ５０は、全てのヒト化抗Ｐ３２９Ｇバリアント間で同等であり、元のバインダーのＥＣ５０と異なることはなかった。
【0395】
興味深いことに、ＶＨＶＬコンフォメーションのｓｃＦｖバインダーを含む抗原結合受容体は、元の非ヒト化バインダー及びＶＬＶＨコンフォメーションのヒト化バインダーと比較して、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の強い活性化をもたらす。より高いプラトー（例えば図３Ｆ参照）は、発現レベルの向上及び／又は抗原結合受容体による細胞表面への輸送の向上により、より強い活性化がもたらされたためと考えられる。さらに、このコンフォメーションはＰ３２９Ｇ変異への結合に影響を与え得る。
【0396】
Ｔ細胞のトニックシグナル伝達又は非特異的な活性化をもたらす抗原結合ドメインクラスター化のリスクを調べるため、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施したが、使用する初期抗体濃度を上げ、１００ｎＭのＧＡ１０１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１で段階希釈を開始し、さらに標的細胞は播種しなかった。
【0397】
図３Ｃに描かれているように、試験した全てのヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントで活性化が検出されなかったことは、標的細胞の非存在下で検出可能な受容体クラスタリング又は非特異的な活性化を示している。
【0398】
実施例５
異なるレベルの抗原を発現する標的細胞に対するＴ細胞活性化によって評価される、異なるヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体バリアントの感受性
さらに、ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の感受性及び選択性を特徴づけるために、上記のようにＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。
異なるレベルの抗原を発現する標的細胞に対するＴ細胞活性化によって評価される、異なるヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体バリアントの感受性
さらに、ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の感受性及び選択性を特徴づけるために、上記のようにＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。
【0399】
異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアント抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞を、高（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中（Ｓｋｏｖ３）、低（ＨＴ２９）ＦｏｌＲ１陽性標的細胞を識別する能力について評価した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞株において、抗Ｐ３２９Ｇ結合体の様々なバリアントをｓｃＦｖ抗原認識足場として、ＦｏｌＲ１に対して高親和性（１６Ｄ５）（図４Ａ、Ｄ、Ｇ）、中親和性（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）（図４Ｂ、Ｅ、Ｈ）又は低親和性（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）（図４Ｃ、Ｆ、Ｉ）を呈する抗体と組み合わせて使用した。高発現標的細胞であるＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１は、高親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ａ）、中程度親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｂ）及び低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｃ）と組み合わせて、用量依存的活性化を示した。中程度発現標的細胞であるＳｋｏｖ３は、高親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ｄ）、中程度親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｅ）、低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｆ）と組み合わせて、用量依存的活性化を示した。低発現標的細胞であるＨＴ２９については、異なる親和性バインダー抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ｇ）、抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｈ）又は低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｉ）と組み合わせて、シグナルは全く検出されなかった。さらに、興味深いことに、ＶＨＶＬフォーマットの抗原結合受容体は、元の非ヒト化バインダー及びＶＬＶＨフォーマットのヒト化バインダーと比較して強いＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の活性化をもたらす。ヒト化バリアントＶＨ３ＶＬ１ ｓｃＦｖバインダーは、全ての構築物の中で最も高いシグナル強度をもたらす（図４Ａ－Ｆ）。
【0400】
さらに、抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図５）又は抗ＨＥＲ２ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図６）のいずれかと組み合わせて使用したＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋及びＨＥＲ２＋）細胞について、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。いずれも、ＶＬＶＨ配向よりもＶＨＶＬ配向の方が優れているという知見を確かめるものである。ヒト化バリアントＶＨ３ＶＬ１が、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の最も強い活性化をもたらす。
【0401】
実施例６
Ｆｃドメインの１つのサブユニットにＰ３２９Ｇ変異を含むヘテロ二量体標的化抗体の存在下での特異的Ｔ細胞活性化
ヘテロ二量体抗ＣＤ２０ ＩｇＧ（配列番号１２９～１３１）が抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ（配列番号７）ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞又はＣＤ１６－ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞を選択的に動員する能力を、それぞれのＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞とＷＳＵＤＬＣＬ２（ＣＤ２０＋）標的細胞の共培養によって評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施し、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧを滴定した。ＣＤ１６－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図９Ａ）。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図９Ｂ）。
Ｆｃドメインの１つのサブユニットにＰ３２９Ｇ変異を含むヘテロ二量体標的化抗体の存在下での特異的Ｔ細胞活性化
ヘテロ二量体抗ＣＤ２０ ＩｇＧ（配列番号１２９～１３１）が抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ（配列番号７）ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞又はＣＤ１６－ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞を選択的に動員する能力を、それぞれのＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞とＷＳＵＤＬＣＬ２（ＣＤ２０＋）標的細胞の共培養によって評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施し、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧを滴定した。ＣＤ１６－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図９Ａ）。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図９Ｂ）。
【0402】
実施例７
ヘテロ二量体ＩｇＧ１で動員されたＣＤ１６－ＣＡＲ Ｔ細胞による特異的標的細胞溶解
ヘテロ二量体ＩｇＧがＣＤ１６－ＣＡＲ Ｔ細胞を選択的に動員し、腫瘍細胞溶解を誘導する能力を、それぞれのＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞とＷＳＵＤＬＣＬ２（ＣＤ２０＋）標的細胞の共培養によって評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施し、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧを滴定した。ＣＤ１６－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図１０Ａ）。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図１０Ｂ）。
ヘテロ二量体ＩｇＧ１で動員されたＣＤ１６－ＣＡＲ Ｔ細胞による特異的標的細胞溶解
ヘテロ二量体ＩｇＧがＣＤ１６－ＣＡＲ Ｔ細胞を選択的に動員し、腫瘍細胞溶解を誘導する能力を、それぞれのＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞とＷＳＵＤＬＣＬ２（ＣＤ２０＋）標的細胞の共培養によって評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施し、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧを滴定した。ＣＤ１６－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図１０Ａ）。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞については、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１を使用した場合、特異的な用量依存的な活性化が観察される可能性がある（図１０Ｂ）。
【0403】
実施例８
ヘテロ二量体ＩｇＧ１のＡＤＣＣを誘導する能力
ヘテロ二量体ＩｇＧ１がＡＤＣＣを誘導する能力を評価するために、健康なドナーからのＰＢＭＣとＷＳＵＤＬＣＬＳ（ＣＤ２０＋）の共培養物中で抗体を滴定した。４．５時間後、ＬＤＨ放出を測定した。アッセイを実施するために、ＰＢＭＣをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（シグマ）を使用して密度勾配遠心分離法によって単離した。５０μｌ／ウェル（０．６２５Ｍｉｏ細胞／ウェル）の単離されたＰＢＭＣを９６丸底ウェルプレートに播種した。ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞を回収し、計数して生存率を確認し、０．０２５Ｍｉｏ細胞／ウェルを５０μｌ／ウェルでＰＢＭＣに播種した。異なる濃度の抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡのいずれかを加えた。細胞を抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥで直接染色し、３７℃、５％ ＣＯ２、加湿雰囲気のインキュベーター内で４．５時間インキュベートした。読み出しの１時間前に、５０μｌ／ウェルの４％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を最大放出ウェルに加えた（標的細胞のみ）。最終インキュベーション時間の後、５０μｌの上清を平底ＴＰＰプレートに移し、製造業者の指示に従って調製した５０μｌのＬＤＨ基質（ＬＤＨキット；Ｒｏｃｈｅ）を加えた。吸収度は直ちにＴｅｃａｎ－ｒｅａｄｅｒ（４９０ｎｍ－６５０ｎｍ）で１０分間測定した。
ヘテロ二量体ＩｇＧ１のＡＤＣＣを誘導する能力
ヘテロ二量体ＩｇＧ１がＡＤＣＣを誘導する能力を評価するために、健康なドナーからのＰＢＭＣとＷＳＵＤＬＣＬＳ（ＣＤ２０＋）の共培養物中で抗体を滴定した。４．５時間後、ＬＤＨ放出を測定した。アッセイを実施するために、ＰＢＭＣをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（シグマ）を使用して密度勾配遠心分離法によって単離した。５０μｌ／ウェル（０．６２５Ｍｉｏ細胞／ウェル）の単離されたＰＢＭＣを９６丸底ウェルプレートに播種した。ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞を回収し、計数して生存率を確認し、０．０２５Ｍｉｏ細胞／ウェルを５０μｌ／ウェルでＰＢＭＣに播種した。異なる濃度の抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）脱フコシル化、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１、又は抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡのいずれかを加えた。細胞を抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥで直接染色し、３７℃、５％ ＣＯ２、加湿雰囲気のインキュベーター内で４．５時間インキュベートした。読み出しの１時間前に、５０μｌ／ウェルの４％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を最大放出ウェルに加えた（標的細胞のみ）。最終インキュベーション時間の後、５０μｌの上清を平底ＴＰＰプレートに移し、製造業者の指示に従って調製した５０μｌのＬＤＨ基質（ＬＤＨキット；Ｒｏｃｈｅ）を加えた。吸収度は直ちにＴｅｃａｎ－ｒｅａｄｅｒ（４９０ｎｍ－６５０ｎｍ）で１０分間測定した。
【0404】
棒グラフはテクニカルトリプリケートから算出した平均値を示す。興味深いことに、ヘテロ二量体ＩｇＧは、脱フコシル化ＩｇＧ１バリアントと同じ程度までＡＤＣＣを誘導できることが示された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【0405】
そのアッセイ中のＮＫ細胞の活性化を評価するために、残りの細胞をＦＡＣＳ分析に使用した。そこで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌ／ウェルで４℃、暗所で３０分間染色した。ＦＡＣＳ ａｂ染色は、ライブデッド染色として、４００μｌ ＣＤ３－ＰＥ／Ｃｙ７＋４００μｌ ＣＤ５６－ＡＰＣ＋４００μｌ ＣＤ１６－ＦＩＴＣ＋１８８００μｌ ＰＢＳ緩衝液＋ｅＦ ４５０を混合する。染色後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。試料はＦＡＣＳＦｏｒｔｅｓｓａ（ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア）で最終容量１５０μｌで取得された。抗ＣＤ２０ヘテロ二量体ＩｇＧ１、抗ＣＤ２０ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ、抗ＣＤ２０脱フコシル化ＩｇＧ１、及び野生型ＩｇＧ１の存在下でのＮＫ細胞の活性化を評価した。ＮＫ細胞の活性化は、脱フコシル化バリアント、ヘテロ二量体バリアント及び野生型バリアントの存在下でのＣＤ１０７ａの上方制御及びＣＤ１６受容体の下方制御によって実証することができた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。興味深いことに、ヘテロ二量体ＩｇＧは脱フコシル化ＩｇＧ１と同じ程度にＮＫ細胞を活性化した。
【0406】
実施例９
抗ＣＤ２０抗体の異なるＦｃバリアントがサイトカイン放出とＢ細胞枯渇に及ぼす影響。
抗ＣＤ２０抗体（ＧＡ１０１）の異なるＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、脱フコシル化、又は脱フコシル化とＰ３２９Ｇ変異の組み合わせ）がＢ細胞の枯渇とサイトカイン放出に及ぼす影響を評価するために、異なる抗ＣＤ２０抗体の濃度を上昇させながら新鮮な全血中でインキュベートした。２４時間後に血清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いてサイトカインを測定した。４８時間後、ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。
抗ＣＤ２０抗体の異なるＦｃバリアントがサイトカイン放出とＢ細胞枯渇に及ぼす影響。
抗ＣＤ２０抗体（ＧＡ１０１）の異なるＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、脱フコシル化、又は脱フコシル化とＰ３２９Ｇ変異の組み合わせ）がＢ細胞の枯渇とサイトカイン放出に及ぼす影響を評価するために、異なる抗ＣＤ２０抗体の濃度を上昇させながら新鮮な全血中でインキュベートした。２４時間後に血清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いてサイトカインを測定した。４８時間後、ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。
【0407】
ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８及びＭＣＰ－１のレベルは、ドナー１（図１４Ａ）及びドナー２（図１４Ｂ）については、ＧＥ ＧＡ１０１（脱フコシル化Ｆｃ）及びヘテロ二量体ＧＡ１０１（Ｐ３２９Ｇ及び脱フコシル化）で同程度であり、ＷＴ ＧＡ１０１（野生型Ｆｃ）及びＰＧＬＡＬＡ ＧＡ１０１（Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ変異）で観察されたものよりも高かった。このことは、ヘテロ二量体ＧＡ１０１と脱フコシル化ＧＡ１０１のサイトカイン放出活性は同等であることを示している。さらに、ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞の割合は、脱フコシル化ＧＡ１０１及びヘテロ二量体ＧＡ１０１では同程度であり、野生型ＧＡ１０１又はＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＧＡ１０１で観察されたものよりも低かった（図示せず）。ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞の割合は、野生型ＧＡ１０１、脱フコシル化ＧＡ１０１とは対照的に、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＧＡ１０１の方がはるかに高かった。予想通り、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異は、Ｂ細胞枯渇という点で、抗ＣＤ２０抗体の活性をはるかに低下させる。このデータは、抗ＣＤ２０抗体のＦｃにおける脱フコシル化とＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異の組み合わせが、脱フコシル化単独よりも同等の活性をもたらし、野生型ＧＡ１０１よりも優れた活性をもたらすことを示唆している。
【0408】
全体として、この実験は、ヘテロ二量体がＢ細胞の枯渇とサイトカイン放出を損なわないことを示唆している。さらに、それは、ＷＴ ＧＡ１０１（野生型Ｆｃ）又はＰＧＬＡＬＡ ＧＡ１０１（Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ、ＬＡＬＡ変異）とは対照的に、Ｂ細胞の枯渇とサイトカイン放出の増強をもたらす。
【図1A-B】
【図1C-D】
【図2】
【図3A-C】
【図3D-F】
【図4A-C】
【図4D-F】
【図4G-I】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【配列表】
【国際調査報告】