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▶ ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッドの特許一覧 ▶ メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-10
(54)【発明の名称】水溶性プロドラッグ、複合体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07D 491/22 20060101AFI20240903BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240903BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240903BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20240903BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20240903BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20240903BHJP
C07K 5/083 20060101ALI20240903BHJP
C07K 5/06 20060101ALI20240903BHJP
C07K 5/062 20060101ALI20240903BHJP
C07K 5/103 20060101ALI20240903BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240903BHJP
C07C 271/06 20060101ALN20240903BHJP
【ＦＩ】
C07D491/22 CSP
A61K47/68
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 E
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K38/05
A61K31/4745
A61K47/65
C07K5/083
C07K5/06
C07K5/062
C07K5/103
C07K16/28
C07C271/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505333
(86)(22)【出願日】2022-07-20
(85)【翻訳文提出日】2024-03-25
(86)【国際出願番号】 IL2022050782
(87)【国際公開番号】W WO2023007481
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】285208
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507253749
【氏名又は名称】ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】591032596
【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シャバット、ドロン
(72)【発明者】
【氏名】サッチ－ファイナロ、ロニット
(72)【発明者】
【氏名】スウィーネイ－ラシュ、スタンレイ
(72)【発明者】
【氏名】ドイチュ、カール
(72)【発明者】
【氏名】ベルガー、ニール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4H006
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA01
4C076AA06
4C076AA11
4C076AA12
4C076AA17
4C076AA22
4C076AA24
4C076AA30
4C076AA31
4C076AA36
4C076AA49
4C076AA53
4C076AA56
4C076AA72
4C076AA94
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB14
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB25
4C076BB27
4C076BB29
4C076BB31
4C076CC27
4C076CC41
4C076CC42
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA10
4C084BA14
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA59
4C084MA13
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA21
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA28
4C084MA31
4C084MA32
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA41
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA15
4C084ZB26
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG04
4C085GG08
4C085GG10
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086CB22
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA13
4C086MA16
4C086MA17
4C086MA21
4C086MA22
4C086MA23
4C086MA28
4C086MA31
4C086MA32
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4C086MA37
4C086MA41
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA56
4C086MA59
4C086MA60
4C086MA63
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA15
4C086ZB26
4H006AA01
4H006AB20
4H045AA10
4H045AA11
4H045BA11
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA50
4H045BA51
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA10
(57)【要約】
本発明は、プロドラッグおよびその複合体、それらの使用、キットおよび医薬組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：【化1】
Ｒ1は、マレイミド、ブロモアセトアミド、テトラジン、アルキン、アミン部分またはそれらの任意の組み合わせを含む反応性部分であり；
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、オリゴ－もしくはポリ－カルボン酸部分またはオリゴ－もしくはポリ－エチレングリコールまたはオリゴ－もしくはポリ－アルコールまたはオリゴ－もしくはポリ－ビニルアルコールまたはオリゴ－もしくはポリ－グリセロール部分を含み；そして
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコールまたはオリゴもしくはポリビニルアルコールまたはオリゴもしくはポリグリセロール部分である）
により表される化合物。
【請求項2】
Ｒ1が、【化2】
【請求項3】
Ｒ2が抗がん剤部分、免疫刺激剤部分または免疫抑制剤部分である請求項１または２記載の化合物。
【請求項4】
Ｒ2が、エキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である請求項３記載の化合物。
【請求項5】
Ｒ2が、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカン部分である請求項４記載の化合物。
【請求項6】
Ｒ3が抗がん剤部分、免疫刺激剤部分または免疫抑制剤部分である請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項7】
Ｒ3が、エキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である請求項６記載の化合物。
【請求項8】
Ｒ3が、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカン部分である請求項７記載の化合物。
【請求項9】
Ｒ2およびＲ3が抗がん剤部分、免疫刺激剤部分または免疫抑制剤部分である請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項10】
Ｒ2およびＲ3が、各々独立してエキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である請求項９記載の化合物。
【請求項11】
Ｒ2およびＲ3が、エキサテカン、アウリスタチンまたはベロテカン部分である請求項１０記載の化合物。
【請求項12】
Ｒ4が、【化3】
【請求項13】
Ｘ1が、－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－、－Ａｌａ－Ａｌａ－、ＡＡＮ、ＧＧＦＧ、－Ｖａｌ－Ａｌａ－または－Ｖａｌ－Ａｒｇ－である請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項14】
式１、１７、１８、１９または２０：【化4】
の構造により表される請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項15】
式（Ｉ（ａ））：【化5】
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、オリゴ－もしくはポリ－カルボン酸部分またはオリゴ－もしくはポリ－エチレングリコールまたはオリゴ－もしくはポリ－アルコールまたはオリゴ－もしくはポリ－ビニルアルコールまたはオリゴ－もしくはポリ－グリセロール部分を含み；そして
Ｒ5は、抗体または抗原部分であり；
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール、またはオリゴもしくはポリグリセロール部分であり；
Ｘ2は、スクシンイミド、アセトアミド、ジヒドロピリダジン、アルケンまたはアミン部分またはそれらの任意の組み合わせを含むリンカーであり；そして
ｎは０．０１～１０の間の数である）
により表される複合体。
【請求項16】
Ｒ2が抗がん剤部分、免疫刺激剤部分または免疫抑制剤部分である請求項１５記載の複合体。
【請求項17】
Ｒ2が、エキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である請求項１６記載の複合体。
【請求項18】
Ｒ2が、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカン部分である請求項１７記載の複合体。
【請求項19】
Ｒ3が抗がん剤部分、免疫刺激剤部分または免疫抑制剤部分である請求項１５～１８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項20】
Ｒ3が、エキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である請求項１９記載の複合体。
【請求項21】
Ｒ3が、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカン部分である請求項２０記載の複合体。
【請求項22】
Ｒ2およびＲ3が抗がん剤部分、免疫刺激剤部分または免疫抑制剤部分である請求項１５～２１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項23】
Ｒ2およびＲ3が、各々独立してエキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である請求項２２記載の複合体。
【請求項24】
Ｒ2およびＲ3が、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカン部分である請求項２３記載の複合体。
【請求項25】
Ｒ4が、【化6】
【請求項26】
Ｘ1が、－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－、－Ａｌａ－Ａｌａ－、ＡＡＮ、ＧＧＦＧ、－Ｖａｌ－Ａｌａ－または－Ｖａｌ－Ａｒｇ－である請求項１５～２５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項27】
Ｘ2が、【化7】
【請求項28】
Ｒ5が、抗ＥＧＦＥまたは抗ＣＤ３３抗体である請求項１５～２７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項29】
Ｒ5が、トラスツズマブまたはリツキシマブまたはＣＧＫＲＫ部分である請求項１５～２８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項30】
Ｒ5が、トラスツズマブ部分である請求項２９記載の複合体。
【請求項31】
１（ａ）または２（ａ）：【化8】
【請求項32】
Ｒ5が、トラスツズマブ部分またはリツキシマブ部分である請求項３１記載の複合体。
【請求項33】
Ｒ5が、トラスツズマブ部分である請求項３２記載の複合体。
【請求項34】
化合物２１：【化9】
【請求項35】
薬物対抗体比（ＤＡＲ）が０．５と２００との間である請求項１５～３４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項36】
ｎが０．１～１の間である請求項１５～３５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項37】
がんの治療における使用のための請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１５～３６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項38】
がんが、乳がん、腎がん、脳腫瘍、皮膚がん、卵巣がん、肺がん、膵がん、結腸がん、頭頸部がん、前立腺がん、子宮内膜がん、肝臓がん、血液がん、胃がん、線維肉腫、骨腫瘍、骨肉腫または十二指腸がんである請求項３７記載の化合物または複合体。
【請求項39】
ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物；およびii）抗体または抗原
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プロドラッグおよびその複合体、それらの使用、キットおよび医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
低分子またはバイオ医薬品を用いる標的治療は、過去１０年でより注目を集めている。標的治療の１つの特別なクラスは、ＡＤＣ（抗体薬物複合体）である。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体の特異性を利用して強力な薬物の特定の組織への標的送達を得ることにより高い毒性を有する薬物の安全性を向上させる無比の機会を提示する。ＡＤＣの成功の多くは、抗体と治療ペイロードとの間のリンケージの設計における技術的進歩によるものである。
【0003】
選択的かつ強力なＡＤＣとなるためには、採用されるリンカー技術は３つの重要な特性：
（１）循環における高い安定性
（２）バイオコンジュゲーションの助けとなり、かつ不活性ＡＤＣ凝集体の形成を回避する高い水溶性
（３）高い細胞毒性のペイロード－リンカー代謝物の効率的な放出
を目指さなければならない。
（１）循環における高い安定性
（２）バイオコンジュゲーションの助けとなり、かつ不活性ＡＤＣ凝集体の形成を回避する高い水溶性
（３）高い細胞毒性のペイロード－リンカー代謝物の効率的な放出
を目指さなければならない。
【0004】
開裂可能なリンカーは一般的に、その適用範囲のため非開裂リンカーより好ましいが、循環において不安定性になる可能性がより非常に高い。したがって、開裂可能なリンカーの成功は、循環状態と標的細胞状態を効果的に区別できる能力による。大きなＩｇＧ抗体は腫瘍への浸透性が低く、内在化、細胞内輸送および薬物放出の低効率と相まって、強力な細胞毒のがん細胞への送達を最大限にするロバストな開裂可能なリンカー手法が必要となる。
【0005】
ＡＤＣリンカーの安定性は、開裂可能なリンカー技術により定義されるのみならず、抗体上への結合部位によっても定義される。大きな抗体へのコンジュゲーションは、リンカーを化学的および酵素的トリガーにアクセスし難くし、それにより血漿安定性が高まり、かつ標的細胞放出速度が遅くなる。
【0006】
この効果は、部位選択的バイオコンジュゲーション技術を用いて溶媒にアクセスし難い部位にリンカー－ペイロードを結合させる場合にさらに増幅することができる。
【0007】
コンジュゲーション技術および開裂機序に関して多くの研究が行われてきたが、開裂部位ごとに複数の薬物を付加することについては、十分に研究されていない。低い効力の薬物がより高いＤＡＲ（薬物抗体比）を必要とすることを考慮すれば、そのようなモジュールの同定は、開裂段階ごとにより多くの薬物の放出を可能とできるため、有益である。
【発明の概要】
【0008】
１つの実施態様において、本発明は、式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ1は、反応性部分であり；
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、親水性部分であり；そして
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール部分、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール部分、またはオリゴもしくはポリグリセロール部分である）
により表される化合物を提供する。
【化1】
Ｒ1は、反応性部分であり；
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、親水性部分であり；そして
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール部分、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール部分、またはオリゴもしくはポリグリセロール部分である）
により表される化合物を提供する。
【0009】
１つのさらなる実施態様において、本発明は、式（Ｉ（ａ））：
（式中、
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、親水性部分であり；
Ｒ5は、抗体または抗原部分であり；
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール部分、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール部分、またはオリゴまたはポリグリセロール部分であり；
Ｘ2はリンカーであり；そして
ｎは０．０１～１０の間の数である）
により表される複合体を提供する。
【化2】
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、親水性部分であり；
Ｒ5は、抗体または抗原部分であり；
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール部分、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール部分、またはオリゴまたはポリグリセロール部分であり；
Ｘ2はリンカーであり；そして
ｎは０．０１～１０の間の数である）
により表される複合体を提供する。
【0010】
１つのさらなる実施態様において、本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書において上述した化合物または複合体を提供する。
【0011】
１つのさらなる実施態様において、本発明は、
ｉ）本明細書において上述した化合物；および
ii）抗体または抗原
を含むキットを提供する。
ｉ）本明細書において上述した化合物；および
ii）抗体または抗原
を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
本発明とみなされる主題は、明細書の結びの部分で特に指摘され、かつ明確に請求される。本発明は、しかしながら、その目的、特徴および利点とともに、組織および動作方法の両方に関し、添付の図面を読む際、以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。
【0013】
【図1A】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：５日）。複合体の連続希釈法による１２０時間（５日間）の処置後のＨＣＣ１９５４の細胞生存率。データは、平均±ＳＤを示し；２つの個別実験の代表である。
【図1B】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：５日）。複合体の連続希釈法による１２０時間（５日間）の処置後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞生存率。データは、平均±ＳＤを示し；２つの個別実験の代表である。
【図1C】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：５日）。表はＨＣＣ１９５４細胞における種々の処置のＩＣ50を記載する。データは、平均±ＳＤを示し；２つの個別実験の代表である。
【図1D】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：５日）。表はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における種々の処置のＩＣ50を記載する。データは、平均±ＳＤを示し；２つの個別実験の代表である。
【図2A】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：６日）。トラスツヅマブ、エキサテカン、またはＴｒａｎｓ－Ｅｘａ－１の連続希釈法による１４４時間（６日間）の処置後のＨＣＣ１９５４細胞の生存率。データは、平均±ＳＤを示し；３つの個別実験の代表である。
【図2B】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：６日）。トラスツヅマブ、エキサテカン、またはＴｒａｎｓ－Ｅｘａ－１の連続希釈法による１４４時間（６日間）の処置後のＪＩＭＴ－１細胞の生存率。データは、平均±ＳＤを示し；３つの個別実験の代表である。
【図2C】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：６日）。トラスツヅマブ、エキサテカン、またはＴｒａｎｓ－Ｅｘａ－１の連続希釈法による１４４時間（６日間）の処置後のＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の生存率。データは、平均±ＳＤを示し；３つの個別実験の代表である。
【図2D】種々の細胞生存アッセイに対する本発明の複合体の細胞毒性効果を示す（曝露時間：６日）。表は種々の処置のＩＣ50を記載しており、最初の２行はＩＣ５０値であり、「Ｔｒａｓ－Ｅｘａ／Ｅｘａ倍率変化（fold change）」は、Ｔｒａｓ－Ｅｘａをｅｘａ値で割った値であり、「－」、「＋」および「＋＋」は、文献に見られるｈｅｒ２レベルを示し、それぞれ、検出されない、低レベルおよび高レベルを示す（例えば、Yang, L.; Li, Y.; Bhattacharya, A.; Zhang, Y. S. A recombinant human protein targeting HER2 overcomes drug resistance in HER2-positive breast cancer. Sci. Transl. Med. 2019, 11, 11に記載されたような相対レベル）。データは、平均±ＳＤを示し；３つの個別実験の代表である。
【図3A】トラスツヅマブ系ＡＤＣが腫瘍成長の用量依存的阻害を誘導することを示す。１０ｍｇ／ｋｇの濃度でのトラスツヅマブ系ＡＤＣの単回静脈内注射後のＨＣＣ１９５４腫瘍の成長曲線（ｎ＝９マウス／群）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【図3B】トラスツヅマブ系ＡＤＣが腫瘍成長の用量依存的阻害を誘導することを示す。３ｍｇ／ｋｇの濃度でのトラスツヅマブ系ＡＤＣの単回静脈内注射後のＨＣＣ１９５４腫瘍の成長曲線（ｎ＝９マウス／群）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【図3C】トラスツヅマブ系ＡＤＣが腫瘍成長の用量依存的阻害を誘導することを示す。１ｍｇ／ｋｇの濃度でのトラスツヅマブ系ＡＤＣの単回静脈内注射後のＨＣＣ１９５４腫瘍の成長曲線（ｎ＝９マウス／群）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【図3D】トラスツヅマブ系ＡＤＣが腫瘍成長の用量依存的阻害を誘導することを示す。体重変化は、腫瘍細胞接種の日からのパーセント変化として表される。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。
【図4A】トラスツヅマブ系ＡＤＣが用量依存的様式でマウスの生存を延長することを示す。１０ｍｇ／ｋｇの濃度でのトラスツヅマブ系ＡＤＣの単回静脈内注射で治療したＨＣＣ１９５４腫瘍担持ＳＣＩＤマウスのカプラン－マイヤー全生存曲線（ｎ＝９マウス／群）。
【図4B】トラスツヅマブ系ＡＤＣが用量依存的様式でマウスの生存を延長することを示す。３ｍｇ／ｋｇの濃度でのトラスツヅマブ系ＡＤＣの単回静脈内注射で治療したＨＣＣ１９５４腫瘍担持ＳＣＩＤマウスのカプラン－マイヤー全生存曲線（ｎ＝９マウス／群）。
【図4C】トラスツヅマブ系ＡＤＣが用量依存的様式でマウスの生存を延長することを示す。１ｍｇ／ｋｇの濃度でのトラスツヅマブ系ＡＤＣの単回静脈内注射で治療したＨＣＣ１９５４腫瘍担持ＳＣＩＤマウスのカプラン－マイヤー全生存曲線（ｎ＝９マウス／群）。
【図4D】トラスツヅマブ系ＡＤＣが用量依存的様式でマウスの生存を延長することを示す。死までの生存期間メジアンと個々の時点。破線は試験の事前に定義された終点（１５２日）を示す。
【0014】
説明を単純かつ明確にするために、図面に示される要素は必ずしも一定の縮尺で描かれていないことが理解されるであろう。例えば、いくつかの要素の寸法は、明確化のために他の要素と比較して誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は、対応する要素または類似の要素を示すために図面間で繰り返されていてもよい。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下の詳細な説明において、多数の具体的詳細が本発明の完全な理解を提供するために説明される。しかしながら、本発明がこれらの具体的詳細でなくとも実施し得るということが当業者によって理解されるであろう。他の例において、周知の方法、手順および構成要素は、本発明を分かりにくくしないように詳細には説明されていない。
【0016】
プロドラッグ
１つの実施態様において、本発明は、式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ1は、反応性部分であり；
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、親水性部分であり；そして
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール部分、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール部分、またはオリゴもしくはポリグリセロール部分である）
により表される化合物を提供する。
１つの実施態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化3】
Ｒ1は、反応性部分であり；
Ｒ2およびＲ3は、同じかまたは異なる活性医薬成分部分であり；
Ｒ4は、親水性部分であり；そして
Ｘ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、オリゴもしくはポリエチレングリコール部分、またはオリゴもしくはポリビニルアルコール部分、またはオリゴもしくはポリグリセロール部分である）
により表される化合物を提供する。
【0017】
１つの実施態様において、Ｒ1は反応性部分である。別の実施態様において、本発明の文脈における「反応性部分」は、１つの官能基または（同一または異なる）複数の官能基を含有し得る化学的部分（例えば、アルケン基）として定義され、ここで、そのような官能基の少なくとも１つは、当該部分と抗体または抗原とを結合させるために抗体または抗原と反応または相互作用することができる。いくつかの他の実施態様においては、抗体または抗原由来のＣｙｓのチオールまたはＬｙｓのアミンが、この部分と１，４（マイケル）付加で反応する。別の実施態様においては、Ｒ1は、ジヒドロピリダジンマレイミド、ブロモアセトアミン、テトラジン、アルキンもしくはアミン部分またはそれらの組み合わせを含む。別の実施態様においては、Ｒ1はアルキン部分を含む。別の実施態様においては、Ｒ1は、制約されたアルキン（constrained alkyne）部分を含む。別の実施態様においては、Ｒ1はシクロアルキン部分を含む。別の実施態様において、シクロオクチン部分の非限定的な例は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）およびビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）部分を含む。別の実施態様において、Ｒ1は、
により表される。
【化4】
【0018】
１つの実施態様において、式（Ｉ）のＲ2は、抗がん剤、免疫刺激剤（免疫－腫瘍学用）、または免疫抑制剤（例えば、免疫学用ステロイド）である。１つのさらなる実施態様において、Ｒ2は、免疫学、免疫－腫瘍学、がん関連疾患および／または障害の治療、または免疫系の欠損／機能不全の治療において使用される薬剤である。他の実施態様において、がんと関連／関係付けられる病状／障害、および／または免疫系の欠損／機能不全は、次の非限定的な例：自己免疫疾患、関節炎、異所性皮膚炎、クローン病、大腸炎、ＩＢＤ、線維症、乾癬、紅斑性狼瘡（Lupus）、多発性硬化症、神経変性病（パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、重症筋無力症、グレーブス病、強直性線維症）、および呼吸器系疾患（ＣＯＰＤ、喘息）の少なくとも１つを含む。別の実施態様においては、Ｒ2は、エキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である。別の実施態様においては、Ｒ2は、エキサテカン、アウリスタチンまたはベロテカンである。
【0019】
１つの実施態様において、式（Ｉ）のＲ3は、抗がん剤、免疫刺激剤（免疫－腫瘍学用）、または免疫抑制剤（例えば、免疫学用ステロイド）である。１つのさらなる実施態様において、Ｒ3は、免疫学、免疫－腫瘍学、がん関連疾患および／または障害の治療、または免疫系の欠損／機能不全の治療において使用される薬剤である。他の実施態様において、がんと関連／関係付けられる病状／障害、および／または免疫系の欠損／機能不全は、次の非限定的な例：自己免疫疾患、関節炎、異所性皮膚炎、クローン病、大腸炎、ＩＢＤ、線維症、乾癬、紅斑性狼瘡（Lupus）、多発性硬化症、神経変性病（パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、重症筋無力症、グレーブス病、強直性線維症）、および呼吸器系疾患（ＣＯＰＤ、喘息）の少なくとも１つを含む。別の実施態様においては、Ｒ3は、エキサテカン、ベロテカン、カンプトテシン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはドキソルビシン部分である。別の実施態様においては、Ｒ3は、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカンである。
【0020】
１つの実施態様において、式（Ｉ）のＲ2およびＲ3は、抗がん剤、免疫刺激剤（免疫－腫瘍学用）、または免疫抑制剤（例えば、ステロイド）、または免疫学、免疫－腫瘍学、がん関連疾患および／または障害の治療、または免疫系の欠損／機能不全の治療において使用される薬剤であって、該がんと関連／関係付けられる病状／障害、および／または免疫系の欠損／機能不全は、本明細書に上述した通りである（Ｒ2および／またはＲ3の実施態様を参照）。別の実施態様において、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、エキサテカン、ベロテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、カンプトテシンまたはドキソルビシン部分である。別の実施態様においては、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、エキサテカン、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはベロテカン部分である。別の実施態様においては、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、エキサテカン部分である。別の実施態様においては、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、ベロテカン部分である。
【0021】
１つの実施態様において、式（Ｉ）のＲ4は、オリゴ－もしくはポリ－カルボン酸部分、またはオリゴ－もしくはポリ－エチレングリコール部分、またはオリゴ－もしくはポリ－アルコール部分、またはオリゴ－もしくはポリ－ビニルアルコール部分、またはオリゴ－もしくはポリ－グリセロール部分を含む。別の実施態様において、Ｒ4は、
により表される。
【化5】
【0022】
１つの実施態様において、式（Ｉ）のＸ1は、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－もしくはポリペプチド部分、またはオリゴ－もしくはポリ－エチレングリコール部分、またはオリゴ－もしくはポリ－ビニルアルコール部分、またはオリゴ－もしくはポリ－グリセロール部分である。別の実施態様において、Ｘ1は、任意のアミノ酸：天然、非天然（人工）、飽和もしくは不飽和、またはそれらの組み合わせを任意の順番／配列で含む、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－、オリゴ－またはポリペプチドである。１つの他の実施態様において、Ｘ1は、ＣＧＫＲＫ、－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－、－Ａｌａ－Ａｌａ－、ＡＡＮ、ＧＧＦＧ、Ｖａｌ－Ａｒｇ－もしくはＶａｌ－Ａｌａまたはそれらの任意の組み合わせである。１つの他の実施態様において、Ｘ1は、－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－、－Ａｌａ－Ａｌａ－、ＡＡＮ、ＧＧＦＧ、－Ｖａｌ－Ａｒｇ－または－Ｖａｌ－Ａｌａ－、またはそれらの任意の組み合わせである。別の実施態様において、Ｘ1は、非限定的な例としてカテプシンＢおよびレグマインを含む、具体的なプロテアーゼにより切断可能な配列（例えば、Ａｌａ－Ａｌａ）を含む。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0023】
１つの実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式１、１７、１８、１９または２０：
（式中、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸である）
の構造により表される。
【化6】
の構造により表される。
【0024】
いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、抗体または抗原と、抗体または抗原の関連する部分（moiety）／一部（portions）／官能基／アミノ酸と反応するおよび／または相互作用するＲ1を介して結合されるプロドラッグであり、この反応の生成物が、本明細書において続くセクションにおいて、例えば、式（Ｉ（ａ））、１（ａ）、２（ａ）および／または化合物２１により以下に表される複合体である。１つの具体的な実施態様において、抗体または抗原のリジンまたはシステインが、マイケル付加を経てマレイミド部分であるＲ1に反応する。１つのさらなる実施態様において、Ｒ1は、アジド－チロシンなどの人工アミノ酸と、またはアルキンと反応し、上記複合体を生成する。別の実施態様において、抗体／抗原は、式（Ｉ）の化合物と反応し、次いでそれが当該化合物のいくつかの部分（例えば、いくつかのペプチド認識モチーフ／トリガー）と相互作用し、相互作用が、その化合物が共有結合的に負荷された薬物を放出するトリガーとなる可能性がある。１つの実施態様において、抗体はトラスツズマブまたはリツキシマブである。
【0025】
プロドラッグと抗体または抗原との複合体
１つの実施態様において、本発明は、式（Ｉ（ａ））：
（式中、
Ｒ5は抗体または抗原部分であり；
Ｘ2はリンカーであり；
ｎは０．０１～１０の間の数であり；
そして
Ｒ2～Ｒ4およびＸ1は、本明細書に上述されている）
により表される複合体を提供する。
１つの実施態様において、本発明は、式（Ｉ（ａ））：
【化7】
Ｒ5は抗体または抗原部分であり；
Ｘ2はリンカーであり；
ｎは０．０１～１０の間の数であり；
そして
Ｒ2～Ｒ4およびＸ1は、本明細書に上述されている）
により表される複合体を提供する。
【0026】
１つの実施態様において、本発明は、プロドラッグまたは式（Ｉ）の化合物を抗体または抗原と反応させることにより製造される、式（Ｉ（ａ））により表される複合体を提供し、式のすべての定義および構造は、本明細書において、上述または後述される。
【0027】
いくつかの実施態様において、抗原／抗体部分（Ｒ5）と式（Ｉ（ａ））のその他の部分との間の結合は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。用語「非共有結合」は、本発明の意義の範囲内で、当該技術分野において知られているように、ファンデルワールス／相互作用／ロンドン分散力、水素結合、ハロゲン結合、パイ－パイ（π－π）相互作用、イオン結合（例えば、Ｒ5の抗体または抗原とＸ1のペプチド部分との間の塩橋）等の任意の非共有相互作用／結合をいう。いくつかの実施態様において、Ｒ5は、その１つよりも多くの位置で式（Ｉ（ａ））のその他の部分と、各位置において同一または異なる相互作用／結合でつながる。１つの具体的な実施態様において、Ｒ5は、式（Ｉ（ａ））のその他の部分である１つまたは複数の化合物に共有結合によりつながり、また共有結合点と比較して異なる位置で、そのような１つまたは複数の化合物と非共有結合でもつながる／相互作用する。１つの実施態様において、「式（Ｉ（ａ））のその他の部分」は、
（式中、縮れた（curly）結合はＲ5（示さず）への結合を示す）をいう。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【化8】
【0028】
１つの実施態様において、式（Ｉ（ａ））のＸ2は、スクシンイミド、アセトアミド、ジヒドロピリダジン、アルケンもしくはアミン部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施態様において、Ｘ2は、アルケン部分を含む。別の実施態様において、Ｘ2は、制約されたアルケン部分を含む。別の実施態様において、Ｘ2は
により表される。
【化9】
【0029】
いくつかの実施態様において、ｎは０．０１～１０の間である。１つの実施態様において、ｎは０．０１～１の間である。別の実施態様において、ｎは０．０１～２の間である。別の実施態様において、ｎは０．０１～５の間である。別の実施態様において、ｎは０．０５～１の間である。別の実施態様において、ｎは０．０５～２の間である。別の実施態様において、ｎは０．１～１の間である。別の実施態様において、ｎは０．１～２の間である。別の実施態様において、ｎは０．５～１の間である。別の実施態様において、ｎは０．０１～０．５の間である。別の実施態様において、ｎは０．１～０．５の間である。別の実施態様において、ｎは０．５～２の間である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0030】
１つの実施態様において、式（Ｉ（ａ））のＲ5は、抗体または抗原である。別の実施態様において、Ｒ5は、腫瘍を標的とする抗体である。別の実施態様において、Ｒ5は、免疫細胞特異的抗原である。他の実施態様において、Ｒ5は、抗ＥＧＦＲまたは抗ＣＤ３３抗体である。別の実施態様において、Ｒ5の抗体は、モデル抗体または抗体を「刺激する」部分／フラグメントであり、そのようなモデル／部分／フラグメントは、とりわけＣＧＫＲＫペプチドにより代表される。別の実施態様において、Ｒ5は、ＣＥＡＣＡＭファミリー、葉酸受容体、ＥＲ、ＰＲ、ノッチ受容体、ノッチリガンド、ＰＳＭＡ、グリピカン－３、メソテリン、ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ２、ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、エフリンＡ４、ＩＧＦ－１Ｒ、ＦＡＰ、Ｌｙ６Ｅ、カドヘリンファミリー、ＶＥＧＦＲ－２、ＲＮＦ４３、ＭＵＣファミリー、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＫ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ネクチン－４、トランスフェリン、ＴＩＭ－１、ＬＡＧ－３、Ａｘｌ、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＭＡＲＴ－１、ＴＩＧＩＴ、ＳＬＡＭＦ６、ＣＸ４０、トラスツヅマブまたはリツキシマブのいずれか１つである。別の実施態様において、Ｒ5は、トラスツヅマブまたはリツキシマブまたはＣＧＫＲＫ部分である。別の実施態様において、Ｒ5はトラスツヅマブ部分である。別の実施態様において、Ｒ5は、リツキシマブ部分である。別の実施態様において、Ｒ5はＣＧＫＲＫ部分である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0031】
１つの実施態様において、式（Ｉ（ａ））の化合物は、式１（ａ）または２（ａ）：
（式中、Ｒ5は本明細書において上述した通りである）
の構造により表される。
【化10】
の構造により表される。
【0032】
１つの実施態様において、式（Ｉ（ａ））の化合物は、化合物２１：
の構造により表される。
【化11】
【0033】
いくつかの実施態様において、例えば式（Ｉ）または１、１７、１８、１９もしくは２０の構造により表される化合物は、「プロドラッグ」とも称され、抗体または抗原と結合し、複合体を生成することができる。用語「複合体」は、本発明の文脈において、「抗体薬物複合体」（ＡＤＣ）と置換可能に称され得る。
【0034】
提案される放出の機序
いくつかの実施態様において、いかなる機序や理論にも拘束されることなく、薬物は、共有結合された複合体から、後に付加的な反応のカスケードを導くプロテアーゼおよび／またはヒドラ―ゼおよび／または他の酵素との反応を経て放出される。１つの実施態様において、本機序／カスケードの例は、以下に続くもの（カテプシンＢは提示されたプロテアーゼである）において示されている。
スキーム１：薬物放出機序の例
いくつかの実施態様において、いかなる機序や理論にも拘束されることなく、薬物は、共有結合された複合体から、後に付加的な反応のカスケードを導くプロテアーゼおよび／またはヒドラ―ゼおよび／または他の酵素との反応を経て放出される。１つの実施態様において、本機序／カスケードの例は、以下に続くもの（カテプシンＢは提示されたプロテアーゼである）において示されている。
スキーム１：薬物放出機序の例
【化12】
【0035】
それにより、上記スキームにおけるペプチドまたはＲ5の任意の他の実行可能な抗体／抗原は、所望の（生物学的）部位への複合体の標的化送達を利用可能とし、いくつかのトリガー、例えば上記に例示したようなヒドロラーゼ／プロテアーゼとの反応などにより活性化される。
【0036】
プロドラッグ、抗体または抗原および／またはそれらの複合体を含む医薬組成物
１つの実施態様において、本発明は、治療的に有効な量のプロドラッグまたは本明細書において上述したようなその複合体、および任意には少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物に関する。他の実施態様において、組成物は、プロドラッグと抗体または抗原の組み合わせ、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、本技術分野において周知の、錠剤（例えばフィルムコーティング錠を含む）、粉末、顆粒、カプセル（軟カプセルを含む）、口腔内崩壊錠、ピル、ペレット、トローチ剤、サシェ、カシェー、パッチ、エリキシル剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、溶液剤、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、座剤、滅菌注射溶液、滅菌包装粉末剤、および徐放性製剤からなる群より選択される形態である。別の実施態様において、組成物は、固体状態の組成物（例えば、錠剤、ピル、カプセル、ペレット、顆粒剤、粉末剤など）である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
１つの実施態様において、本発明は、治療的に有効な量のプロドラッグまたは本明細書において上述したようなその複合体、および任意には少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物に関する。他の実施態様において、組成物は、プロドラッグと抗体または抗原の組み合わせ、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、本技術分野において周知の、錠剤（例えばフィルムコーティング錠を含む）、粉末、顆粒、カプセル（軟カプセルを含む）、口腔内崩壊錠、ピル、ペレット、トローチ剤、サシェ、カシェー、パッチ、エリキシル剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、溶液剤、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、座剤、滅菌注射溶液、滅菌包装粉末剤、および徐放性製剤からなる群より選択される形態である。別の実施態様において、組成物は、固体状態の組成物（例えば、錠剤、ピル、カプセル、ペレット、顆粒剤、粉末剤など）である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0037】
いくつかの実施態様において、本発明の文脈において使用され得る薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤は、界面活性剤、潤滑剤、結合剤、フィラー、圧縮助剤、崩壊剤、水溶性ポリマー、無機塩、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、泡立ち剤および香味剤（flavoring）を含むが、それらに限定されるものではない。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0038】
いくつかの実施態様において、本発明の範囲内で適切な担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤の非限定的具体例には、例えば、ラクトース、Ｄ－マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶性セルロース、軽質無水ケイ酸および酸化チタンなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な界面活性剤には、例えば、レシチンおよびホスファチジルコリンが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切
な潤滑剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルクおよびステアリン酸が挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な結合剤には、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶性セルロース、ａ－デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム粉末、ゼラチン、プルランおよび低置換度ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な崩壊剤には、例えば、架橋されたポビドン（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ）などの任意の架橋された１－エテニル－２－ピロリドンホモポリマーおよび１－ビニル－２－ピロリドンホモポリマー）、架橋されたカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な水溶性ポリマーには、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、グァーガムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な無機塩には、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩などが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。特別な実施態様は、マグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩を含む。ナトリウムの塩基性無機塩には、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。カリウムの塩基性無機塩には、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。マグネシウムの塩基性無機塩には、例えば、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、水酸化アルミナマグネシウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。カルシウムの塩基性無機塩には、例えば、沈降炭酸カルシウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
な潤滑剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルクおよびステアリン酸が挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な結合剤には、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶性セルロース、ａ－デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム粉末、ゼラチン、プルランおよび低置換度ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な崩壊剤には、例えば、架橋されたポビドン（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ）などの任意の架橋された１－エテニル－２－ピロリドンホモポリマーおよび１－ビニル－２－ピロリドンホモポリマー）、架橋されたカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な水溶性ポリマーには、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、グァーガムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な無機塩には、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩などが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。特別な実施態様は、マグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩を含む。ナトリウムの塩基性無機塩には、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。カリウムの塩基性無機塩には、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。マグネシウムの塩基性無機塩には、例えば、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、水酸化アルミナマグネシウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。カルシウムの塩基性無機塩には、例えば、沈降炭酸カルシウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0039】
適切な防腐剤には、例えば、安息香酸ナトリウム、安息香酸、およびソルビン酸などが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な抗酸化剤には、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸およびα－トコフェロールなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な着色剤には、例えば、Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．５、Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｏｒ Ｒｅｄ Ｎｏ．２およびＦｏｏｄ Ｃｏｌｏｒ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．２などの食品色素などが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な甘味剤には、例えば、グリシルレチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアおよびタウマチンなどが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な酸味剤には、例えば、クエン酸（クエン酸無水物）、酒石酸およびリンゴ酸などが挙げられる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。適切な泡立ち剤には、例えば、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な風味剤には、例えば、レモン、ライム、オレンジ、メントールおよびストロベリーなどを含む、合成物質または天然物質が含まれる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0040】
１つの実施態様において、本発明の化合物（プロドラッグおよび／またはその複合体）は、医学的治療のための医薬品（pharmaceuticals）として有用である。本発明は、したがって、本明細書に開示されるプロドラッグまたはその複合体、またはプロドラッグおよび抗体または抗原の組み合わせ、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の化合物は、経口または非経口で安全に投与することができる。投与経路は、経口、局所、皮下、腹腔内、直腸、静脈内、動脈内、経皮、筋肉内、局所および経鼻が挙げられるが、これらに限定されるものではない。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。投与のさらなる経路は、粘膜の、鼻の、非経口の（parenteral）、胃腸の、髄腔内、子宮内、眼球内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、大脳内、眼の、口の、硬膜外および舌下が挙げられるが、これらに限定されるものではない。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0041】
別の実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物の錠剤および他の固形剤形は、任意には、本技術分野において周知の腸溶コーティングや他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを伴い保管または製造することができる。それらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための様々な割合でのヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクスなどを用い、そこに含まれる活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化することもできる。活性成分は、妥当な場合、上記賦形剤の１つまたは複数と共にマイクロカプセル化形態とすることもできる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0042】
プロドラッグおよび複合体の使用
１つの実施態様において、本発明は、がんまたは関連疾患／病状を治療する方法であって、それを必要とする対象に、プロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）、その複合体（例えば、式（Ｉ（ａ））の化合物）、またはプロドラッグと抗体または抗原との組み合わせ、またはプロドラッグ／複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、がんまたは関連疾患／病状を治療する方法であって、それを必要とする対象に、複合体（例えば、式（Ｉ（ａ））の化合物）、またはプロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）と抗体または抗原との組み合わせ、または複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。１つの実施態様において、その方法は、免疫学的方法である。別の実施態様において、その方法は免疫－腫瘍学的方法である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
１つの実施態様において、本発明は、がんまたは関連疾患／病状を治療する方法であって、それを必要とする対象に、プロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）、その複合体（例えば、式（Ｉ（ａ））の化合物）、またはプロドラッグと抗体または抗原との組み合わせ、またはプロドラッグ／複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、がんまたは関連疾患／病状を治療する方法であって、それを必要とする対象に、複合体（例えば、式（Ｉ（ａ））の化合物）、またはプロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）と抗体または抗原との組み合わせ、または複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤を含む医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。１つの実施態様において、その方法は、免疫学的方法である。別の実施態様において、その方法は免疫－腫瘍学的方法である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0043】
１つの実施態様において、本発明は、免疫系の欠損／機能不全と関係付けられる病状および／または疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、プロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）、その複合体（例えば、式（Ｉ（ａ））の化合物）、またはプロドラッグと抗体または抗原との組み合わせ、またはプロドラッグ／複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤とを含む医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、がんまたは関連疾患／病状を治療する方法であって、それを必要とする対象に、複合体（例えば、式（Ｉ（ａ））の化合物）、またはプロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）と抗体または抗原との組み合わせ、または複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤とを含む医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。他の実施態様において、その方法は、免疫学的方法である。別の実施態様において、その方法は免疫－腫瘍学的方法である。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0044】
他の実施態様において、がんと関連／関係付けられる病状および／または疾患および／または免疫系の欠損／機能不全は、次の非限定的な例：自己免疫疾患、関節炎、異所性皮膚炎、クローン病、大腸炎、ＩＢＤ、線維症、乾癬、紅斑性狼瘡（Lupus）、多発性硬化症、神経変性病（パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、重症筋無力症、グレーブス病、強直性線維症）、および呼吸器系疾患（ＣＯＰＤ、喘息）の少なくとも１つを含む。１つの実施態様においては、本発明は、それを必要とする対象に、
ａ）プロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）；および
ｂ）抗体または抗原
を投与すること；または
プロドラッグと抗体または抗原との複合体を投与すること
を含む、がんを治療する方法を提供する。
ａ）プロドラッグ（例えば、式（Ｉ）の化合物）；および
ｂ）抗体または抗原
を投与すること；または
プロドラッグと抗体または抗原との複合体を投与すること
を含む、がんを治療する方法を提供する。
【0045】
いくつかの実施態様においては、がんは、乳がん、腎がん、脳腫瘍、皮膚がん、卵巣がん、肺がん、膵がん、結腸がん、頭頸部がん、前立腺がん、子宮内膜がん、肝臓がん、血液がん、胃がん、線維肉腫、骨腫瘍／骨肉腫または十二指腸がんである。１つの実施態様において、がんは乳がんである。別の実施態様において、プロドラッグ（式（Ｉ）の化合物）と抗体または抗原との投与は、追ってまたは同時に行われる。各可能性は本発明の個別の実施態様を表す。
【0046】
いくつかの実施態様においては、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。
【0047】
いくつかの実施態様においては、本発明は、上記方法の実施態様のなかで説明されるように、がん、またはがんに関連／関係付けられる病状および／または疾患の治療および／または免疫系の欠損／機能不全の治療に使用するための、プロドラッグ（例えば式（Ｉ）の化合物）、その複合体（例えば式（Ｉ（ａ））の化合物）またはプロドラッグと抗体もしくは抗原との組み合わせ、またはそのプロドラッグ／複合体／組み合わせと少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤、ビヒクルまたは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0048】
１つの実施態様において、本発明は、
ｉ）本明細書において上述したプロドラッグ（例えば式（Ｉ）の化合物）；および
ii）抗体または抗原
を含むキットを提供する。
ｉ）本明細書において上述したプロドラッグ（例えば式（Ｉ）の化合物）；および
ii）抗体または抗原
を含むキットを提供する。
【0049】
他の実施態様においては、キットは使用説明書を含む。
【0050】
定義
本明細書において、本明細書において使用される場合、用語「治療的に有効な量」は、対象への単回用量投与または複数回用量投与の際、対象に治療効果をもたらすのに有効である薬剤の量を示すと定義される。追加的な実施態様においては、本発明の結晶形が前述の疾患または障害を治療するための医薬の製造のために使用される。
本明細書において、本明細書において使用される場合、用語「治療的に有効な量」は、対象への単回用量投与または複数回用量投与の際、対象に治療効果をもたらすのに有効である薬剤の量を示すと定義される。追加的な実施態様においては、本発明の結晶形が前述の疾患または障害を治療するための医薬の製造のために使用される。
【0051】
本明細書において、本明細書において使用される場合、医学的処置については、用語「治療する（treating）」は、対象における病状、疾患または障害の、その出現／特定後の、医学的ケアまたはその軽減、またはその抑制もしくは予防を示すと定義される。
【0052】
本明細書において、用語「ＤＡＲ」または「薬物抗体比（Drug-Antibody Ratio）」は、抗体または抗原１当量あたりの薬物当量の数に等しいと定義される。１つの実施態様において、ＤＡＲは０．５と２００との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは０．５と５０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは０．５と２０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは０．５と１０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは０．５と５との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１と１０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１と２０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１と５０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１と１００との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１と２００との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは５と１０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは５と２０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは５と５０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１０と２０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは２０と５０との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは５０と１００との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは５０と２００との間である。別の実施態様において、ＤＡＲは１００と２００との間である。いくつかの実施態様において、ＤＡＲは、明示的に言及されている（例えば、実施例４の表１）。他の実施態様において、ＤＡＲは、式（Ｉ（ａ））の意味の範囲内で「ｎ」を介して計算することができる。当該計算に関する２、３の例を以下に示す。ここで、本発明の化合物／複合体、すなわち式（Ｉ（ａ））については、Ｒ5に結合した化合物ごとに、２つの異なるまたは同じ薬物／ＡＰＩ部分Ｒ2およびＲ3が存在するということが知られている。
－ ｎ＝１、Ｒ5に結合している１化合物に２つの薬物部分、ＤＡＲは２／１または２。
－ ｎ＝０．５、Ｒ5に結合している１化合物に２つの薬物部分、ＤＡＲは２／０．５または４。
－ ｎ＝０．３３、Ｒ5に結合している１化合物に２つの薬物部分、ＤＡＲは２／０．３３または６。
－ ｎ＝１、Ｒ5に結合している１化合物に２つの薬物部分、ＤＡＲは２／１または２。
－ ｎ＝０．５、Ｒ5に結合している１化合物に２つの薬物部分、ＤＡＲは２／０．５または４。
－ ｎ＝０．３３、Ｒ5に結合している１化合物に２つの薬物部分、ＤＡＲは２／０．３３または６。
【実施例】
【0053】
実施例１：化合物１の合成
スキーム２：化合物１の全合成
スキーム２：化合物１の全合成
【化13】
【0054】
実験手順
化合物４：化合物２（E. Danieli, D. Shabat, Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 7318-7324; R. J. Amir, E. Danieli, D. Shabat, Chem. - A Eur. J. 2007, 13, 812-821; および A. Gopin, S. Ebner, B. Attali, D. Shabat, Bioconjug. Chem. 2006, 17, 1432-1440参照）（１．０７ｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）にアルゴン雰囲気下で溶解し、０℃に冷却した。水素化ナトリウム（９７ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を加え、反応を室温まで温めた。室温で１５分間撹拌した後、化合物３（M. E. Roth-Konforti, C. R. Bauer, D. Shabat, Angew. Chemie Int. Ed. 2017, 56, 15633-15638）（１．６５ｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を加え、反応をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ ５：９５）でモニターした。完了したら反応をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）およびＮＨ4Ｃｌ（１０ｍＬ）で希釈した。次いで二相混合物をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出し、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下でエバポレートした。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題の化合物４（１．６１ｇ、６７％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ Ｃ57Ｈ78Ｎ6Ｏ9Ｓｉ2に対する計算値：１０４６．５、［Ｍ＋２Ｈ］+に対する実測値：１０４８．９。
【化14】
【0055】
【化15】
【0056】
粗物質をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、化合物５（３２７ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、反応をＴＬＣでモニターした。完了したら溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題の化合物６（６３０ｍｇ、２工程に対して５５％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ Ｃ50Ｈ79Ｎ7Ｏ10Ｓｉ2に対する計算値：９９３．５、［Ｍ＋２Ｈ］+に対する実測値：９９５．０。
【0057】
【化16】
【0058】
【化17】
【0059】
【化18】
【0060】
【化19】
【0061】
【化20】
【0062】
スキーム３：化合物４の合成
化合物４：化合物１３（P. D. Jeffrey, S. W. McCombie, J. Org. Chem. 1982, 47, 587-590）（７５０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（６９２ｍｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、次いでＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（９０８ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応を室温まで温め、撹拌を４時間続けた。完了したら混濁混合物をろ過し、ＤＣＭで洗浄した。合わせた有機溶液を濃縮し、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（１．０８ｇ、９５％）を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.95-5.85 (m, 1H), 5.28 (dd, J = 17.2, 1.1 Hz, 1H), 5.19 (dd, J = 10.4, 1.1 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.28 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.82 (s, 4H), 2.66 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.99-1.92(m, 2H)。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ Ｃ12Ｈ16Ｎ2Ｏ6に対する計算値：２８４．１、［Ｍ＋Ｈ］+に対する実測値：２８５．３。
【化21】
【0063】
スキーム４：化合物９の合成
化合物１６：化合物１６は、文献の手順（E. Roussakis, Z. Li, N. H. Nowell, A. J. Nichols, C. L. Evans, Angew. Chemie Int. Ed. 2015, 54, 14728-14731）にしたがい製造した。Ｌ－アジドグルタミン酸１４（J. Bachl, J. Mayr, F. J. Sayago, C. Cativiela, D. Diaz Diaz, Chem. Commun. 2015, 51, 5294-5297）（２２２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＨＢＴＵ（１．２３ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）をその溶液に加え、混合物を５分間室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（２．３０ｍＬ、１３．０ｍｍｏｌ）をその溶液に一度に加え、直後にＬ－グルタミン酸ジターシャリーブチルエステル１５（７６０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、その後、溶媒を真空下で除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１６（５９７ｍｇ、１４に対して７１％）をゴム状の液体として得た。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ Ｃ31Ｈ53Ｎ5Ｏ10に対する計算値：６５５．４、［Ｍ＋Ｈ］+に対する実測値：６５６．７。
【化22】
【0064】
【化23】
【0065】
実施例２：化合物２０の合成
スキーム５：化合物２０の全合成
化合物２０は上記スキームにしたがい合成した。
スキーム５：化合物２０の全合成
【化24】
【0066】
実施例３：化合物２１の合成
スキーム６：化合物２１の全合成
化合物２１は上記スキームにしたがい合成し、質量分析により確認した。
スキーム６：化合物２１の全合成
【化25】
【0067】
実施例４：トラスツヅマブ－エキサテカン／ベロテカン複合体は、ＨＥＲ２－陽性ＨＣＣ１９５４細胞の増殖を阻害する
材料および方法
細胞株
ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８ヒト乳がん細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から入手した。ＨＣＣ１９５４細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１２．５ Ｕ／ｍＬ ナイスタチン、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００ μｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウムを追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１２．５ Ｕ／ｍＬ ナイスタチン、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したＲＰＭＩで培養した。細胞は、５％ＣＯ2において３７℃で増殖された。
材料および方法
細胞株
ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８ヒト乳がん細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から入手した。ＨＣＣ１９５４細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１２．５ Ｕ／ｍＬ ナイスタチン、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００ μｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウムを追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１２．５ Ｕ／ｍＬ ナイスタチン、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したＲＰＭＩで培養した。細胞は、５％ＣＯ2において３７℃で増殖された。
【0068】
細胞生存率アッセイ
ヒト乳がんＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞は、２４ウェル培養プレート上に播種され（それぞれ、５，０００細胞／ウェルおよび１０，０００細胞／ウェル）、２４時間インキュベートされた。その後、細胞を、フリーのまたはトラスツヅマブと結合された、エキサテカンまたはベロテカンの連続希釈にさらした。細胞生存率は、ＭＴＴ（３μｇ／ｍＬ、シグマ社）を用いて続く５～６日間のインキュベーションで評価した。ＭＴＴ吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマルチ検出リーダーを用いて５７０ｎｍで測定した。
ヒト乳がんＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞は、２４ウェル培養プレート上に播種され（それぞれ、５，０００細胞／ウェルおよび１０，０００細胞／ウェル）、２４時間インキュベートされた。その後、細胞を、フリーのまたはトラスツヅマブと結合された、エキサテカンまたはベロテカンの連続希釈にさらした。細胞生存率は、ＭＴＴ（３μｇ／ｍＬ、シグマ社）を用いて続く５～６日間のインキュベーションで評価した。ＭＴＴ吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマルチ検出リーダーを用いて５７０ｎｍで測定した。
【0069】
結果
トラスツヅマブ－エキサテカン／ベロテカン複合体は、ＨＥＲ２－陽性ＨＣＣ１９５４細胞の増殖を阻害する
エキサテカンまたはベロテカンに結合されたトラスツヅマブの数個のバッチは、ＩＴＬから得た（表１）。異なる複合体は、２種類のヒト乳がん細胞株、ＨＣＣ１９５４（ＨＥＲ２－陽性）およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－陰性）細胞の増殖に対する、フリー薬と比較したそれらの阻害効果について評価された。ベロテカンおよびエキサテカンは試験した両細胞株において同様のＩＣ50値を示した（ＨＣＣ１９５４において７および１０ｎＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８において５および２．５ｎＭ）。しかしながら、ＨＣＣ１９５４細胞において、複合体の細胞毒性がフリー薬のものと似通っている（Ｔｒａｎｓ－Ｂｅｌ ＰＰＢ－４４３５は別として）のに対し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においては、複合体は僅かに活性が低かった。トラスツヅマブは、両細胞株の増殖に対して阻害効果を示さなかった（図１Ａ～１Ｄ）。
トラスツヅマブ－エキサテカン／ベロテカン複合体は、ＨＥＲ２－陽性ＨＣＣ１９５４細胞の増殖を阻害する
エキサテカンまたはベロテカンに結合されたトラスツヅマブの数個のバッチは、ＩＴＬから得た（表１）。異なる複合体は、２種類のヒト乳がん細胞株、ＨＣＣ１９５４（ＨＥＲ２－陽性）およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－陰性）細胞の増殖に対する、フリー薬と比較したそれらの阻害効果について評価された。ベロテカンおよびエキサテカンは試験した両細胞株において同様のＩＣ50値を示した（ＨＣＣ１９５４において７および１０ｎＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８において５および２．５ｎＭ）。しかしながら、ＨＣＣ１９５４細胞において、複合体の細胞毒性がフリー薬のものと似通っている（Ｔｒａｎｓ－Ｂｅｌ ＰＰＢ－４４３５は別として）のに対し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においては、複合体は僅かに活性が低かった。トラスツヅマブは、両細胞株の増殖に対して阻害効果を示さなかった（図１Ａ～１Ｄ）。
【0070】
【表1】
【0071】
Ｔｒａｎｓ－Ｅｘａ－１は、その増強された細胞毒性のため、さらなる評価について選択された。細胞の複合体への曝露時間の増加が、フリーのエキサテカンと比較して活性を増強する結果となるかどうかを評価するために、細胞をさらに２４時間（合計６日間）薬物にさらした。また、ＨＥＲ２陽性細胞における複合体の利点をさらに証明するために、別のＨＥＲ２＋乳がん細胞株、ＪＩＭＴ－１を評価した。先の実験との相関関係において、ＨＣＣ１９５４細胞は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８と比較してＴｒａｓ－Ｅｘａ－１に有意により敏感であった。Ｔｒａｓ－Ｅｘａ－１は、ＪＩＭＴ－１細胞において、フリーのエキサテカンと比較したいかなる利点も示さなかった（図２Ａ～２Ｄ）。
【0072】
実施例５：市販のＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）と比較したトラスツヅマブ－エキサテカン／ベロテカン複合体腫瘍成長
材料および方法
細胞株
ＨＣＣ１９５４ヒト乳がん細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１２．５ Ｕ／ｍＬ ナイスタチン、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００ μｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウムを追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞は、５％ＣＯ2において３７℃で増殖された。
材料および方法
細胞株
ＨＣＣ１９５４ヒト乳がん細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１２．５ Ｕ／ｍＬ ナイスタチン、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００ μｇ／ｍＬ ピルビン酸ナトリウムを追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞は、５％ＣＯ2において３７℃で増殖された。
【0073】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
すべての動物はテルアビブ大学・スペシフィック・パソゲン・フリー（ＳＰＦ）動物施設で飼育された。実験は、テルアビブ大学の動物実験委員会（the animal care and use committee）（ＩＡＣＵＣ）により承認され（承認番号０１－１９－０８８）、ＮＩＨガイドラインに従って行われた。
すべての動物はテルアビブ大学・スペシフィック・パソゲン・フリー（ＳＰＦ）動物施設で飼育された。実験は、テルアビブ大学の動物実験委員会（the animal care and use committee）（ＩＡＣＵＣ）により承認され（承認番号０１－１９－０８８）、ＮＩＨガイドラインに従って行われた。
【0074】
ＨＣＣ１９５４細胞（１×１０6）を６週齢の雌性の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの乳房脂肪体に注射した。腫瘍の成長をカルパスでモニターし、体積を０．５２×幅×長さ2として定義した。腫瘍体積がおおよそ９５ｍｍ3に達したら、マウスを複数の群に無作為化し（ｎ＝９）、３つの異なる濃度（１、３または１０ｍｇ／ｋｇ）で、トラスツヅマブ－デルクステカン（Ｅｎｈｅｒｔｕ（登録商標）；ＤＡＲ＝８）、トラスツヅマブ－エキサテカン（Ｔｒａｓ－Ｅｘａ；ＤＡＲ＝４）またはトラスツヅマブ－ベロテカン（Ｔｒａｓ－Ｂｅｌ；ＤＡＲ＝４）の単回用量で静脈内に注射した。対照として、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ－デルクステカン（Ｒｉｔｕｘ－ＤＸｄ；ＤＡＲ＝８）またはビヒクル対照（１０ｍＭ ヒスチジン、３％トレハロース、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）のいずれかで治療した。すべての治療は、２００μｌ／２０ｇマウスの容量で投与された。腫瘍体積が１０００ｍｍ3に達した場合、腫瘍が壊死および潰瘍となった場合またはマウスがその体重を１５％減少した場合にマウスを安楽死させた。
【0075】
統計分析
データは、特段の断りがなければ、平均±標準偏差（ＳＥＭ）として表される。全生存率における統計学的有意性は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを用いたログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）試験で決定された。統計学的有意差はｐ＜０．０５として定義された。
データは、特段の断りがなければ、平均±標準偏差（ＳＥＭ）として表される。全生存率における統計学的有意性は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを用いたログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）試験で決定された。統計学的有意差はｐ＜０．０５として定義された。
【0076】
結果
エキサテカンに結合されたトラスツズマブ系抗体薬物複合体（ＡＤＣ）（「Ｔｒａｓ－Ｅｘａ」；ＤＡＲ＝４）またはベロテカンに結合されたトラスツズマブ系抗体薬物複合体（ＡＤＣ）（「Ｔｒａｓ－Ｂｅｌ」；ＤＡＲ＝４）を、それらのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果について評価した。このため、ＨＣＣ１９５４（ＨＥＲ２＋）ヒト乳がん異種移植片担持マウスが、３つの濃度（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）でＴｒａｓ－ＥｘａまたはＴｒａｓ－Ｂｅｌの単回投与で治療され、腫瘍の成長および生存をモニターした。我々のＡＤＣの治療効果は、それもまた３つの濃度（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）で投与された商業的に入手可能なＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）（Ｔｒａｓ－デルクステカン；ＤＡＲ＝８）と、最高用量１０ｍｇ／ｋｇでのみ投与されたリツキシマブ－デルクステカン（「Ｒｉｔｕｘ－ＤＸｄ」；ＤＡＲ＝８）の同位体対照と比較された。追加の対照群はビヒクルで治療された。腫瘍成長の用量依存的阻害が観察され、最も強力な抗腫瘍効果は、３つのトラスツズマブ系ＡＤＣの１０ｍｇ／ｋｇで観察された（図３Ａ～３Ｃ）。興味深いことに、Ｔｒａｓ－ＥｘａまたはＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）の最高濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）での単回投与は完全な腫瘍退縮をもたらした。逆に、Ｔｒａｓ－Ｂｅｌ治療マウス（１０ｍｇ／ｋｇ）の９匹中４匹（４４％）は、治療後６０日でぶり返した（図３Ａ）。さらに、中程度の抗腫瘍活性が全てのＡＤＣについて３ｍｇ／ｋｇで観察され、Ｅｎｈｅｒｔｕ（登録商標）は、さまざまなＡＤＣの中でより強力な腫瘍成長阻害を示した（図３Ｂ）。全体として、Ｔｒａｓ－ＥｘａおよびＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）は、Ｔｒａｓ－ＢｅｌＡＤＣと比較して３および１０ｍｇ／ｋｇで優れた抗腫瘍活性を示したが、これら２つのＡＤＣの間の効果には、両濃度において有意差はなかった。対照的に、最も低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）での治療は、いずれのＡＤＣにおいても対照と比較して腫瘍成長に影響を与えなかった（図３Ｃ）。
エキサテカンに結合されたトラスツズマブ系抗体薬物複合体（ＡＤＣ）（「Ｔｒａｓ－Ｅｘａ」；ＤＡＲ＝４）またはベロテカンに結合されたトラスツズマブ系抗体薬物複合体（ＡＤＣ）（「Ｔｒａｓ－Ｂｅｌ」；ＤＡＲ＝４）を、それらのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果について評価した。このため、ＨＣＣ１９５４（ＨＥＲ２＋）ヒト乳がん異種移植片担持マウスが、３つの濃度（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）でＴｒａｓ－ＥｘａまたはＴｒａｓ－Ｂｅｌの単回投与で治療され、腫瘍の成長および生存をモニターした。我々のＡＤＣの治療効果は、それもまた３つの濃度（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）で投与された商業的に入手可能なＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）（Ｔｒａｓ－デルクステカン；ＤＡＲ＝８）と、最高用量１０ｍｇ／ｋｇでのみ投与されたリツキシマブ－デルクステカン（「Ｒｉｔｕｘ－ＤＸｄ」；ＤＡＲ＝８）の同位体対照と比較された。追加の対照群はビヒクルで治療された。腫瘍成長の用量依存的阻害が観察され、最も強力な抗腫瘍効果は、３つのトラスツズマブ系ＡＤＣの１０ｍｇ／ｋｇで観察された（図３Ａ～３Ｃ）。興味深いことに、Ｔｒａｓ－ＥｘａまたはＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）の最高濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）での単回投与は完全な腫瘍退縮をもたらした。逆に、Ｔｒａｓ－Ｂｅｌ治療マウス（１０ｍｇ／ｋｇ）の９匹中４匹（４４％）は、治療後６０日でぶり返した（図３Ａ）。さらに、中程度の抗腫瘍活性が全てのＡＤＣについて３ｍｇ／ｋｇで観察され、Ｅｎｈｅｒｔｕ（登録商標）は、さまざまなＡＤＣの中でより強力な腫瘍成長阻害を示した（図３Ｂ）。全体として、Ｔｒａｓ－ＥｘａおよびＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）は、Ｔｒａｓ－ＢｅｌＡＤＣと比較して３および１０ｍｇ／ｋｇで優れた抗腫瘍活性を示したが、これら２つのＡＤＣの間の効果には、両濃度において有意差はなかった。対照的に、最も低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）での治療は、いずれのＡＤＣにおいても対照と比較して腫瘍成長に影響を与えなかった（図３Ｃ）。
【0077】
注目すべきは、治療後、ビヒクルおよび同位体対照を含めたすべての実験群のマウスは、一時的な体重減少を示し、５日後に回復した（図３Ｄ）。全体としては、我々のトラスツズマブ系ＡＤＣならびにＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）は、ビヒクルまたは同位体対照と同様に、評価されたすべての濃度で良好に耐え、試験の間にわたり最終的な正の体重増加を伴った（図３Ｄ）。
【0078】
上述のデータと一致して、カプラン－マイヤー分析は評価された種々のＡＤＣの用量依存的生存利益を示した。試験の終了時（１５２日目）には、１０ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ－ＥｘａまたはＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）で治療したマウスの１００％と、同濃度のＴｒａｓ－Ｂｅｌで治療したマウスの８９％が生存していたが；一方で１０９日（ビヒクル）および１１６日（Ｒｉｔｕｘ－ＤＸｄ）を超えて生存していた対照治療マウスはいなかった（図４Ａおよび４Ｄ）。さらに、３ｍｇ／ｋｇでの治療は、Ｔｒａｓ－Ｅｘａ（１１６日）またはＥｎｈｅｒｔｕ（登録商標）（１３７日）で治療したマウスのメジアン生存期間を、ビヒクル対照（６０日）およびＲｉｔｕｘ－ＤＸｄ（７１日）と比較して有意に延長させた（図４Ｂ、４Ｄおよび表２）。Ｔｒａｓ－Ｂｅｌ（３ｍｇ／ｋｇ）は、８４日のメジアン生存期間で、対照と比較してマウスの生存に有意な効果はなかった（図４Ｂおよび４Ｄならびに表２）。１ｍｇ／ｋｇの最も低い投与量では、いずれのＡＤＣも、ビヒクルおよび同位体対照と比較して何の治療効果も示さなかった（図４Ｃおよび４Ｄならびに表２）。
【0079】
【表2】
【0080】
実施例６：抗体コンジュゲーション技術
トランスグルタミナーゼによる連結は、野生型微生物トランスグルタミナーゼ（Zedira社、ドイツより購入したＷＴトランスグルタミナーゼ）を用いて、Dickgiesser et al., Bioconjugate Chem. (2020), vol. 31(4), p. 1070-1076にも説明されている手順に従い、標準的な方法によりトランスツズマブの軽鎖に実施された。この目的のために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を有する緩衝液中で１当量の抗体をそれぞれのペイロード（結合部位の数に応じて、抗体の濃度の１０倍または２０倍過剰）の溶液および６Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼと混合した。混合物を３７℃および４５０ｒｐｍでサーモミキサー中で１６時間インキュベートした。
トランスグルタミナーゼによる連結は、野生型微生物トランスグルタミナーゼ（Zedira社、ドイツより購入したＷＴトランスグルタミナーゼ）を用いて、Dickgiesser et al., Bioconjugate Chem. (2020), vol. 31(4), p. 1070-1076にも説明されている手順に従い、標準的な方法によりトランスツズマブの軽鎖に実施された。この目的のために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を有する緩衝液中で１当量の抗体をそれぞれのペイロード（結合部位の数に応じて、抗体の濃度の１０倍または２０倍過剰）の溶液および６Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼと混合した。混合物を３７℃および４５０ｒｐｍでサーモミキサー中で１６時間インキュベートした。
【0081】
マレイミド化学による連結のため、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のそれぞれの抗体成分の５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した（～３３μＭ抗体）。抗体を、ＴＣＥＰ（（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）；所望のＤＡＲに依存して抗体成分のＴＣＥＰに対する比１：２～１：６；ＴＣＥＰは２ｍＭ原液、ｐＨ７．０で使用した）でまたはいくつかの場合はＤＴＴ（ジチオスレイトール；２０ｍＭ）で還元した。３７℃の水浴中、０．５～２時間（活性化すべきシステインの数による）のインキュベーション後、反応を室温まで冷却させた。溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上でコンジュゲーション緩衝液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２Ｍｍ ＥＤＴＡ、Ｎ２脱気）に脱塩し、コンジュゲーション緩衝液中、０．２ｍｇ／ｍＬの抗体濃度に調整した。コンジュゲーションは、還元された抗体を適切なマレイミド活性化リンカーペイロード構築物の溶液に適切な比率（例えば、ＤＡＲ＝４について抗体対リンカーペイロード構築物比１：４～１：８；例えば、ＤＡＲ＝８について抗体対リンカーペイロード構築物比１：２０）で加えることにより開始された。反応を、２２℃でゆっくりと揺動（rocking）させながら１時間インキュベートし、その後、コンジュゲーションをＬＣＭＳにより確認した。必要に応じ、所望のＤＡＲに達するまで反応を続けた。
【0082】
結合された試料を、１５ＰＨＥ（フェニル）カラム（ＧＥヘルスケア）またはＨｉＴｒａｐ ＨＰまたはＦＦブチルセファロースカラム（ＧＥヘルスケア）上で疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製した。溶出画分を濃縮し、緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４または１０ｍＭ リン酸カリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ヒスチジン、５０ｍＭ トレハロース、ｐＨ７．０に交換した。各調製されたＡＤＣの同定と純度はＬＣ－ＭＳおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認された。各調製されたＡＤＣのＤＡＲは、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）データおよび質量分析データから計算、確認された。
【0083】
各調製されたＡＤＣの安定性は、凍結解凍実験により調べられた。具体的には、ヒスチジン緩衝液中のＡＤＣを液体窒素で－８０℃まで急速冷凍し（shock-frozen）、この温度で数週間、最大数か月保管した。試料を、完全に解凍してしまうまで室温に置いた後、資料をＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）分析にかけ、化合物の分解を調べ、そして解凍したＡＤＣの活性を検討した。具体的には、オクテット結合アッセイにより標的抗原結合を調べ、そしてペイロード－介在細胞毒性を、陽性および陰性細胞株上で細胞力価グローアッセイによりテストした。凍結解凍ＡＤＣについての結果は、対応する凍結解凍をしていないＡＤＣと比較された。各ケースにおいて、溶解性タグを有するＡＤＣが、この凍結解凍手順において安定であることが分かった。
【0084】
エンドトキシンはＰＴＳ（ポータブルテストシステム）カートリッジ法（Ｎｅｘｇｅｎ）により、製造業者の取扱説明書にしたがい、標準条件下で測定された。各調製されたＡＤＣについて、エンドトキシンレベルは＜５．０エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍｇであったことが分かった。
【0085】
本発明の特定の実施態様が解説および説明されたが、本発明は、本明細書に記載されたその実施態様に限定されるものではないことが明らかである。多数の修飾、変更、バリエーション、置換物および等価物は、添付の特許請求の範囲により説明されるように本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者に明らかであろう。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【国際調査報告】