特表 2024-532700 カチオン交換体によるアデノ随伴ウイルス分離

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-10

(54)【発明の名称】カチオン交換体によるアデノ随伴ウイルス分離

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20240903BHJP

   C12N 11/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

C12N11/00

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506633

(86)(22)【出願日】2022-08-03

(85)【翻訳文提出日】2024-03-25

(86)【国際出願番号】 IB2022000436

(87)【国際公開番号】W WO2023012514

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】63/229,303

(32)【優先日】2021-08-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100139723

【弁理士】

【氏名又は名称】樋口 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100116540

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 香

(72)【発明者】

【氏名】フィードラー，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ミッテルグラトネッガー，ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】ハシュラヒャー，マインハルト

(72)【発明者】

【氏名】ガッテルニク，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ヴァシナ，ダニエラ

(72)【発明者】

【氏名】フェルトホーファー，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】プファンドル，レナーテ

【テーマコード（参考）】

4B033

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B033NA11

4B033NB62

4B033NB68

4B033ND01

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA06

4C087NA07

(57)【要約】

本開示は、アデノ随伴ウイルスを精製する方法であって、空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮されたＡＡＶ画分または調製物から完全ＡＡＶカプシドを精製することを含む、方法を提供する。本開示はまた、アデノ随伴ウイルスを精製する方法であって、空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮されたＡＡＶ画分または調製物から空ＡＡＶカプシドを精製することを含む、方法を提供する。方法は、精製された完全ＡＡＶカプシドまたは空ＡＡＶカプシドを得るために、１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを利用して分離を行う。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物から完全ＡＡＶカプシドを精製して、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法であって、
（ａ）完全ＡＡＶカプシド、空ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）前記第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、前記完全ＡＡＶカプシド及び前記空ＡＡＶカプシドが前記カラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液を前記カチオン交換カラムに対して、前記完全ＡＡＶカプシドが前記空ＡＡＶカプシドから精製される条件下で添加するステップと
を含む、前記方法。

【請求項2】

ＡＡＶ調製物中の完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）完全ＡＡＶカプシド、空ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）前記第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、前記完全ＡＡＶカプシド及び前記空ＡＡＶカプシドが前記カラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液を前記カチオン交換カラムに対して、前記完全ＡＡＶカプシドが前記空ＡＡＶカプシドから分離される条件下で添加するステップと
を含む、前記方法。

【請求項3】

前記第１の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、Ｎａ^＋である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの総濃度である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、約３０ｍＭの総濃度である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｏ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、Ｃａ^２＋である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、約２ｍＭの総濃度である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の溶液が、約５．０～約８．５のｐＨを有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記第１の溶液が、約６．０のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第１の溶液が、１つ以上の界面活性剤を更に含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記１つ以上の界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェノールエーテル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）－ソルビタン－モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０／ポリソルベート８０））、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、クレモフォア、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－１０１還元型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記１つ以上の界面活性剤が、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％の合計量である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記１つ以上の界面活性剤が、約０．００５ｗ／ｗ％の合計量である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記カチオン交換カラムが、荷電基を有する樹脂を含み、前記荷電基は、スルホン酸基、硫酸基、スルホプロピル基、カルボン酸基、リン酸基、またはこれらの組み合わせである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記カチオン交換カラムが、樹脂を含み、前記樹脂は、ＣａｐｔｏＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＸＳ、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｇｉｇａｃａｐ Ｓ、Ｇｉｇａｃａｐ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、ＭａｃｒｏｐｒｅｐＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、ＣＭ及びＳＰ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、ＣＭ及びＳ ＨｙｐｅｒＤ、Ｓ及びＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓ及びＣＭ ＣＡＰＴＯ（商標）、ＭｏｎｏＳ、Ｎｕｖｉａ Ｓ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ－Ｓ ｒ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ－Ｓ ｈ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＨｂＰ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＶｉｒＳ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ６５０、またはＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記樹脂が、ＣａｐｔｏＳである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記樹脂が、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓである、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記樹脂が、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓである、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記第２の溶液の前記一価カチオンが、Ｎａ^＋である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、Ｃａ^２＋である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記第２の溶液が、約５．０～約８．５のｐＨを有する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記第２の溶液が、約６．０のｐＨを有する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記第２の溶液が、１つ以上の界面活性剤を更に含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記１つ以上の界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェノールエーテル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）－ソルビタン－モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０／ポリソルベート８０））、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、クレモフォア、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－１０１還元型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記１つ以上の界面活性剤が、約０．００２５％～約０．００７５ｗ／ｗ％の合計量である、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記１つ以上の界面活性剤が、約０．００５ｗ／ｗ％の合計量である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記第２の溶液の前記添加が、一定の総濃度の前記１つ以上の一価カチオンで実施される、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの一定の総濃度である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンが、約３０ｍＭの一定の総濃度である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記第２の溶液の前記添加が、一定の総濃度の前記１つ以上の二価カチオンで実施される、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、約１ｍＭ～約３０ｍＭの一定の総濃度である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンが、約２ｍＭの一定の総濃度である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記第２の溶液の前記添加が、前記１つ以上の一価カチオンの総濃度を段階的に増加させることを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの初期総濃度が、約１５ｍＭ～約６０ｍＭである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの前記初期総濃度が、約３０ｍＭである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの中間総濃度が、約１００ｍＭ～約３００ｍＭである、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの前記中間総濃度が、約２００ｍＭである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの最終総濃度が、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭである、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの前記最終総濃度が、約１０００ｍＭである、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記第２の溶液の前記添加が、前記１つ以上の二価カチオンの総濃度を段階的に増加させることを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの初期総濃度が、約１ｍＭ～約１０ｍＭである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの中間総濃度が、約１０ｍＭ～約２０ｍＭである、請求項４７または請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの最終総濃度が、約２０ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記第２の溶液の前記添加が、前記１つ以上の一価カチオンの総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、５カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記第２の溶液の前記１つ以上の一価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記第２の溶液の前記添加が、前記１つ以上の二価カチオンの総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む、請求項１～３３及び５１～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、４０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、４０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、４０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである、請求項５９に記載の方法。

【請求項62】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、５カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項５８に記載の方法。

【請求項63】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、５カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記第２の溶液の前記１つ以上の二価カチオンの総濃度の前記連続的な直線的増加が、５カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである、請求項６２に記載の方法。

【請求項65】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、遺伝子改変ＡＡＶ、化学改変ＡＡＶ、遺伝子化学改変ＡＡＶ、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８に由来する、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９に由来する、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ６に由来する、請求項６５に記載の方法。

【請求項69】

請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法に従って精製された完全ＡＡＶカプシドを薬学的に許容される担体中に含むＡＡＶ製剤であって、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まない、前記ＡＡＶ製剤。

【請求項70】

請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法によって作製されたＡＡＶ生成物を含む、医薬組成物。

【請求項71】

空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物から空ＡＡＶカプシドを精製して、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）前記第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、前記空ＡＡＶカプシド及び前記完全ＡＡＶカプシドが前記カラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液を前記カチオン交換カラムに対して、前記空ＡＡＶカプシドが前記完全ＡＡＶカプシドから精製される条件下で添加するステップと
を含む、前記方法。

【請求項72】

ＡＡＶ調製物中の空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）前記第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、前記空ＡＡＶカプシド及び前記完全ＡＡＶカプシドが前記カラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液を前記カチオン交換カラムに対して、前記空ＡＡＶカプシドが前記完全ＡＡＶカプシドから分離される条件下で添加するステップと
を含む、前記方法。

【請求項73】

前記空ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、遺伝子改変ＡＡＶ、化学改変ＡＡＶ、遺伝子化学改変ＡＡＶ、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する、請求項７１または７２に記載の方法。

【請求項74】

前記空ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８に由来する、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記空ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９に由来する、請求項７３に記載の方法。

【請求項76】

前記空ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ６に由来する、請求項７３に記載の方法。

【請求項77】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）請求項７１または７２に記載の空ＡＡＶカプシドを限外濾過によって濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）前記空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップと
を含む、前記方法。

【請求項78】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）請求項７１または７２に記載の空ＡＡＶカプシドをアニオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）前記空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップと
を含む、前記方法。

【請求項79】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）請求項７１または７２に記載の空ＡＡＶカプシドをカチオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）前記空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップと
を含む、前記方法。

【請求項80】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の完全ＡＡＶカプシドを限外濾過によって濃縮するステップと、
（ｂ）患者の治療に好適なバッファーにバッファー交換するステップと
を含む、前記方法。

【請求項81】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の完全ＡＡＶカプシドをアニオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）患者の治療に好適なバッファーにバッファー交換するステップと
を含む、前記方法。

【請求項82】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の完全ＡＡＶカプシドをカチオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）患者の治療に好適なバッファーにバッファー交換するステップと
を含む、前記方法。

【請求項83】

前記ＡＡＶ生成物が、約３０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記ＡＡＶ生成物が、約２０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記ＡＡＶ生成物が、約６％未満の空ＡＡＶカプシドを含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記ＡＡＶ製剤または組成物が、約３０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む、請求項６９に記載のＡＡＶ製剤または請求項７０に記載の組成物。

【請求項87】

前記ＡＡＶ製剤または組成物が、約２０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む、請求項８６に記載のＡＡＶ製剤または組成物。

【請求項88】

前記ＡＡＶ製剤または組成物が、約６％未満の空ＡＡＶカプシドを含む、請求項８７に記載のＡＡＶ製剤または組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、２０２１年８月４日に出願された米国特許仮出願第６３／２２９，３０３号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、線状一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングしたエンベロープのない小型ウイルスである。ＡＡＶは、ＡＡＶによる増殖感染が、例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でのみ生じることから、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ヘルパーウイルスが存在しない場合であっても、ＡＡＶ（血清型２）は、宿主ヒトゲノムの染色体１９ｑ１３．４に組み込まれることによって潜伏感染を達成することができる。ＡＡＶは、部位特異的な組み込みが可能であることがわかっている、唯一の哺乳動物ＤＮＡウイルスである（非特許文献１）。

【0003】

ＡＡＶを臨床で安全に使用するために、ＡＡＶは、そのゲノム内のいくつかの位置で遺伝子改変されている。例えば、多くのウイルスベクターでは、ウイルス複製に必要なＲｅｐ遺伝子及び部位特異的組み込みに必要な要素がＡＡＶゲノムから除去されている。これらの組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、染色体外状態で存在し、ゲノムＤＮＡへの組み込み効率は極めて低い。したがって、ｒＡＡＶが宿主細胞でランダム変異導入を誘発する可能性は、完全には排除されないにせよ、低減される。このような特性及び病原性の欠如から、ｒＡＡＶは、遺伝子療法ベクターとして、前臨床及び臨床用途の多方面において大きな可能性を示している。臨床では、新しい血清型及び自己相補的ベクターが試験されている。このような進行中のベクター開発と並行して、純度及び力価の高い高タイター量のｒＡＡＶベクターを効率的に製造することができるスケーラブルな製造プロセスに対する継続的な取り組みにも力が入れられている。

【0004】

ヒト投与に好適なＡＡＶ生成物を精製するための効率的で大規模な方法を設計することに多大な努力が払われているが、より優れたＡＡＶ精製法に対する必要性は依然として残っている。例えば、細胞培養でＡＡＶを生成する現在の方法では、「空」カプシドが形成されることから、カプシド抗原に対するＴ細胞媒介性免疫応答が引き起こされ、低悪性度の肝毒性及び部分的な発現喪失につながることが示されている（非特許文献２）。したがって、最終ＡＡＶ生成物から空ＡＡＶカプシドを除去するステップを含むＡＡＶ精製法が望まれている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐａｇｅｓ ５８３－５９３（２００８）

【非特許文献2】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１）：１－２（２０１４）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

細胞培養におけるＡＡＶベクター生成の特徴は、ベクターゲノムを欠く「空」カプシドの過剰な形成である。そのような空カプシドは、導入遺伝子産生に関連した治療上の利益をもたらすことができない。空カプシドが臨床結果に与える影響は明らかではないが、ベクターに対する自然免疫応答または適応免疫応答を増加させる可能性があることから、空カプシドは遺伝子療法における懸念となる。Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１）：１－２（２０１４）。

【0007】

本明細書で提供されるのは、完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物から完全ＡＡＶカプシドを精製して、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該完全ＡＡＶカプシド及び当該空ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、完全ＡＡＶカプシドが空ＡＡＶカプシドから精製される条件下で添加するステップとを含む、方法である。

【0008】

本明細書で提供されるのは、ＡＡＶ調製物中の完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該完全ＡＡＶカプシド及び当該空ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、完全ＡＡＶカプシドが空ＡＡＶカプシドから分離される条件下で添加するステップとを含む、方法である。

【0009】

本明細書で提供されるのは、ＡＡＶ調製物中の空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該空ＡＡＶカプシド及び当該完全ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、空ＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドから精製される条件下で添加するステップとを含む、方法である。

【0010】

本明細書で提供されるのは、ＡＡＶ調製物中の空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該空ＡＡＶカプシド及び当該完全ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、空ＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドから分離される条件下で添加するステップとを含む、方法である。

【0011】

いくつかの態様において、本開示の方法は、ＡｄＶ粒子、レンチウイルス粒子、ガンマレトロウイルスベクター粒子、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）粒子、アルファウイルス粒子、トガウイルス粒子、ロスリバーウイルス粒子、及びワクシニアウイルス粒子の精製にも有用である。いくつかの態様において、本開示の方法はまた、ベクターワクチンの作製にも有用である。

【0012】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋である。

【0013】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの総濃度である。いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭの総濃度である。

【0014】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｏ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋である。

【0015】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約２ｍＭの総濃度である。

【0016】

いくつかの実施形態において、第１の溶液は、約５．０～約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、第１の溶液は、約６．０のｐＨを有する。

【0017】

いくつかの実施形態において、第１の溶液は、１つ以上の界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェノールエーテル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）－ソルビタン－モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０／ポリソルベート８０））、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、クレモフォア、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－１０１還元型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

【0018】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％の合計量である。いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、約０．００５ｗ／ｗ％の合計量である。

【0019】

いくつかの実施形態において、カチオン交換カラムは、荷電基を有する樹脂を含み、荷電基は、スルホン酸基、硫酸基、スルホプロピル基、カルボン酸基、リン酸基、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、カチオン交換カラムは、樹脂を含み、樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＸＳ、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｇｉｇａｃａｐ Ｓ、Ｇｉｇａｃａｐ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、ＭａｃｒｏｐｒｅｐＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、ＣＭ及びＳＰ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、ＣＭ及びＳ ＨｙｐｅｒＤ、Ｓ及びＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓ及びＣＭ ＣＡＰＴＯ（商標）、ＭｏｎｏＳ、Ｎｕｖｉａ Ｓ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ－Ｓ ｒ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ－Ｓ ｈ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＨｂＰ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＶｉｒＳ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ６５０、またはＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅである。いくつかの実施形態において、ＣａｐｔｏＳ。いくつかの実施形態において、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ。いくつかの実施形態において、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ。

【0020】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の溶液の一価カチオンは、Ｎａ^＋である。

【0021】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋である。

【0022】

いくつかの実施形態において、第２の溶液は、約５．０～約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、第２の溶液は、約６．０のｐＨを有する。

【0023】

いくつかの実施形態において、第２の溶液は、１つ以上の界面活性剤を更に含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェノールエーテル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）－ソルビタン－モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０／ポリソルベート８０））、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、クレモフォア、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－１０１還元型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

【0024】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、約０．００２５％～約０．００７５ｗ／ｗ％の合計量である。いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤は、約０．００５ｗ／ｗ％の合計量である。

【0025】

いくつかの態様において、第２の溶液の添加は、一定濃度の１つ以上の一価カチオンで実施される。

【0026】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの一定の総濃度である。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭの一定の総濃度である。

【0027】

いくつかの態様において、第２の溶液の添加は、一定濃度の１つ以上の二価カチオンで実施される。

【0028】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約３０ｍＭの一定の総濃度である。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約２ｍＭの一定の総濃度である。

【0029】

いくつかの態様において、第２の溶液の添加は、１つ以上の一価カチオンの濃度を段階的に増加させることを含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの初期総濃度は、約１５ｍＭ～約６０ｍＭである。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの初期総濃度は、約３０ｍＭである。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの中間総濃度は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭである。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの中間総濃度は、約２００ｍＭである。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの最終総濃度は、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭである。いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの最終総濃度は、約１０００ｍＭである。

【0031】

いくつかの態様において、第２の溶液の添加は、１つ以上の二価カチオンの総濃度を段階的に増加させることを含む。

【0032】

ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの初期総濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの中間総濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの最終総濃度は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0033】

いくつかの態様において、第２の溶液の添加は、１つ以上の一価カチオンの総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む。

【0034】

ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0035】

いくつかの態様において、第２の溶液の添加は、１つ以上の二価カチオンの総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む。

【0036】

ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。ある特定の実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0037】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、遺伝子改変ＡＡＶ、化学改変ＡＡＶ、遺伝子化学改変ＡＡＶ、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８に由来する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９に由来する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６に由来する。

【0038】

ある特定の態様において、方法は、
（ａ）限外濾過、アニオン交換体、及び／またはカチオン交換体によって、空ＡＡＶカプシドを濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップとを含む、免疫吸着カラムを調製することを更に含む。

【0039】

本明細書において提供されるのはまた、本明細書に記載される方法に従って精製した完全ＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶ製剤である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ製剤は、薬学的に許容される担体を更に含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ製剤は、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まない。

【0040】

本明細書において提供されるのはまた、本明細書に記載される方法によって作製された、ＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を含む、医薬組成物である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ医薬組成物は、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まない。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】実施例２の完全なクロマトグラムを示す。

【図2】実施例２の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図3】画分Ｅ２の曲線下面積（ＡＵＣ）プロファイルを示す。

【図4】画分Ｅ３のＡＵＣプロファイルを示す。

【図5】画分Ｅ４のＡＵＣプロファイルを示す。

【図6】画分Ｅ５のＡＵＣプロファイルを示す。

【図7】実施例３の完全なクロマトグラムを示す。

【図8】実施例３の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図9】画分Ｅ２のＡＵＣプロファイルを示す。

【図10】画分Ｅ３のＡＵＣプロファイルを示す。

【図11】画分Ｅ５のＡＵＣプロファイルを示す。

【図12】実施例４の完全なクロマトグラムを示す。

【図13】実施例４の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図14】画分Ｅ２のＡＵＣプロファイルを示す。

【図15】画分Ｅ３のＡＵＣプロファイルを示す。

【図16】画分Ｅ４のＡＵＣプロファイルを示す。

【図17】画分Ｅ５のＡＵＣプロファイルを示す。

【図18】実施例５の完全なクロマトグラムを示す。

【図19A】実施例５の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図19B】実施例５の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図20】画分Ｅ１のＡＵＣプロファイルを示す。

【図21】画分Ｅ２のＡＵＣプロファイルを示す。

【図22】画分Ｅ３のＡＵＣプロファイルを示す。

【図23】画分Ｅ４のＡＵＣプロファイルを示す。

【図24】画分Ｅ５のＡＵＣプロファイルを示す。

【図25】実施例６の完全なクロマトグラムを示す。

【図26A】実施例６の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図26B】実施例６の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図27】画分Ｅ１のＡＵＣプロファイルを示す。

【図28】画分Ｅ２のＡＵＣプロファイルを示す。

【図29】画分Ｅ３のＡＵＣプロファイルを示す。

【図30】画分Ｅ４のＡＵＣプロファイルを示す。

【図31】画分Ｅ５のＡＵＣプロファイルを示す。

【図32】画分Ｅ６のＡＵＣプロファイルを示す。

【図33A】実施例７の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図33B】実施例７の溶出域のクロマトグラフを示す。

【図34】画分Ｅ１のＡＵＣプロファイルを示す。

【図35】画分Ｅ２のＡＵＣプロファイルを示す。

【図36】画分Ｅ３のＡＵＣプロファイルを示す。

【図37】画分Ｅ４のＡＵＣプロファイルを示す。

【図38】画分Ｅ５のＡＵＣプロファイルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

定義
本発明の組成物及び方法について記載する前に、本発明は、記載される特定のプロセス、組成物、または方法論に限定されるものではなく、多様であり得ることを理解されたい。また、本説明において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明することのみを目的にし、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本明細書の実施形態の範囲を限定する意図はないことも理解されたい。別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の実施形態の実施形態の実施または試験には、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法、装置、及び材料について、以下に記載する。本明細書で言及される公開物は全て、その全体が参照により援用される。本明細書におけるいかなる記載も、本明細書の実施形態が、先行発明によりかかる開示に先行する権利がないという自認を構成するものではない。

【0043】

本明細書で使用される場合、以下の用語は、示された意味を有する。

【0044】

本開示を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示語の使用は、本明細書で別途の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈される。

【0045】

いくつかの実施形態において、本開示の態様が、ある特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」またはその変形（例えば、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））ものとして記載される場合、実施形態は、その特徴「からなる」または「から本質的になる」ことも企図される。

【0046】

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、その語が修飾する数値を限定することを意図しており、かかる値が誤差の範囲内で変動することを示す。データの図または表に示されている平均値に対する標準偏差などの特定の誤差が記載されていない場合、「約」という用語は、その語が使用されている数のプラスまたはマイナス１０％の数値を意味すると理解されるものとする。したがって、約５０％は、４５％～５５％の範囲を意味する。

【0047】

「アルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、本明細書で使用される場合、直鎖または分枝鎖のアルキルラジカルを指す。アルキル基は、本明細書に定義されるように、任意選択により置換されてもよい。アルキルラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ノニルなどが挙げられる。「アルキレン」という用語は、単独でまたは組み合わせて、本明細書で使用される場合、２つ以上の位置で結合する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素から誘導される飽和脂肪族基、例えば、メチレン（－ＣＨ_２－）を指す。別途の記載がない限り、「アルキル」という用語は、「アルキレン」基を含み得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、「カプシド」、「カプシド粒子」、及び「粒子」という用語は、区別なく使用され、少なくとも１つのインタクトなＡＡＶカプシドシェルで構成されるＡＡＶ粒子を指す。

【0049】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドまたはＡＡＶ粒子に関する「空」という用語は、全ての（すなわち、完全な）ベクターゲノムを欠いているものを指す。空ＡＡＶまたは空ＡＡＶカプシドまたは空ＡＡＶ粒子は、治療上の利益をもたらすことができない。本明細書で使用される場合、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドまたはＡＡＶ粒子に関する「完全」または「完全ＡＡＶカプシド」という用語は、全ベクターゲノムの大部分を含有しているものを指す。完全ＡＡＶカプシドは、レシピエント患者に治療上の利益をもたらすことができる。ある特定の実施形態において、「完全」には、「不完全なベクターＤＮＡ」または「切断されたベクターＤＮＡ」も含まれる。ある特定の実施形態において、完全なベクターＤＮＡと不完全及び／または切断ベクターＤＮＡは、追加の分析法により識別することができる。そのような方法には、限定するものではないが、キャピラリー電気泳動、ＡＵＣ（分析用超遠心分離法）、％アガロースＤＮＡ（ネイティブまたはアルカリ）、ゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱アニオン交換クロマトグラフィー、及び質量分析法によるＤＮＡサイジングが挙げられる（Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｅ．Ｐｉｅｒｓｏｎｅｔ．ａｌ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８８（１３），ｐｐ ６７１８－６７２５参照；全ての目的のためにその全体が本明細書に援用される）。

【0050】

「患者」及び「対象」という用語は、区別なく使用され、本開示のＡＡＶ生成物、製剤、または組成物の投与によって予防または治療することができる状態に罹患している、または罹患しやすい生体を指すために従来の意味で使用され、ヒトと非ヒト動物の両方を含む。対象の例としては、ヒト、チンパンジー及び他の類人猿；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット、及びモルモットなどの齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他の鶉鶏目、アヒル、ガチョウなどの家禽、野鳥及び狩猟用鳥類を含む鳥類などが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢を示すものではない。したがって、成体、幼体、新生体が対象となる。

【0051】

ＡＡＶ生成物、ＡＡＶ製剤、または任意のＡＡＶ含有組成物は、約３０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む場合、空ＡＡＶカプシドを「実質的に含まない」。

【0052】

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別途の指示がない限り、その範囲内に含まれる各個別の値及び各端点に個別に言及する簡潔な方法として機能することのみを意図しているにすぎず、各個別の値及び各端点は、本明細書において個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書に記載される任意の数値には、下限値から上限値までの全ての値が含まれ、すなわち、列挙される下限値と上限値との間の数値の全ての可能な組み合わせが本出願において明示されているものとみなされることを特に理解されたい。例えば、濃度範囲が約１％～５０％と記載されている場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が本出願において明示的に列挙されていることが意図される。上の列挙した値は、具体的に示される値の単なる例に過ぎない。

【0053】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で別途の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順番で実施することができる。本明細書で提供されるあらゆる例、または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本開示をより明瞭に例示することのみを意図しており、別途の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかな文言も、特許請求されていない任意の要素が本開示の実施に不可欠であることを示すものと解釈されるべきではない。

【0054】

本開示の好ましい実施形態について、本発明者らが認識している本開示を実施するための最良の形態を含め、本明細書に記載する。それらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことにより、当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適宜採用することを予測しており、本発明者らは、本開示が本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用法によって認められる限り、添付の特許請求の範囲に記載される主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形形態における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で別途の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本開示に包含される。

【0055】

本明細書で引用される全ての参考文献は、公開物、特許出願、及び特許を含め、各参考文献が参照により援用されることが個別かつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されている場合と同様に、参照により本明細書に援用される。

【0056】

本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）生成物、製剤、または組成物を生成する方法、ＡＡＶを精製する方法、完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物または画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法、空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物または画分から空ＡＡＶカプシドを精製する方法、ならびに精製された空ＡＡＶカプシド及び精製された完全ＡＡＶカプシドの両方を用いて免疫吸収カラムを調製する方法である。

【0057】

ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物または画分から完全ＡＡＶカプシドを精製して、空ＡＡＶカプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を提供するための方法であって、
（ａ）完全ＡＡＶカプシド、空ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該完全ＡＡＶカプシド及び当該空ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、完全ＡＡＶカプシドが空ＡＡＶカプシドから精製される条件下で添加するステップとを含む、方法。

【0058】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物または画分中の完全ＡＡＶカプシド及び空ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）完全ＡＡＶカプシド、空ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該完全ＡＡＶカプシド及び当該空ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、完全ＡＡＶカプシドが空ＡＡＶカプシドから分離される条件下で添加するステップとを含む、方法。

【0059】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｎ（Ｃ_１－５アルキル）_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、Ｃｕ^＋、Ａｇ^＋、Ａｕ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0060】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0061】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0062】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋である。

【0063】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋である。

【0064】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋である。

【0065】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約５ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５ｍＭ～約９００ｍＭ、約５ｍＭ～約８００ｍＭ、約５ｍＭ～約７００ｍＭ、約５ｍＭ～約６００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０ｍＭ～約８０ｍＭ、３０ｍＭ～約６０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0066】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの総濃度である。

【0067】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭ～約２００ｍＭの総濃度である。

【0068】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭ～約８０ｍＭの総濃度である。

【0069】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭ～約６０ｍＭの総濃度である。

【0070】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約２００ｍＭの総濃度である。

【0071】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約８０ｍＭの総濃度である。

【0072】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約６０ｍＭの総濃度である。

【0073】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭの総濃度である。

【0074】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約５ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５ｍＭ～約９００ｍＭ、約５ｍＭ～約８００ｍＭ、約５ｍＭ～約７００ｍＭ、約５ｍＭ～約６００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０ｍＭ～約８０ｍＭ、３０ｍＭ～約６０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0075】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの総濃度である。

【0076】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約３０ｍＭ～約２００ｍＭの総濃度である。

【0077】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約３０ｍＭ～約８０ｍＭの総濃度である。

【0078】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約３０ｍＭ～約６０ｍＭの総濃度である。

【0079】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約２００ｍＭの総濃度である。

【0080】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約８０ｍＭの総濃度である。

【0081】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約６０ｍＭの総濃度である。

【0082】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋であり、約３０ｍＭの総濃度である。

【0083】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約５ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５ｍＭ～約９００ｍＭ、約５ｍＭ～約８００ｍＭ、約５ｍＭ～約７００ｍＭ、約５ｍＭ～約６００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０ｍＭ～約８０ｍＭ、３０ｍＭ～約６０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0084】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの総濃度である。

【0085】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約３０ｍＭ～約２００ｍＭの総濃度である。

【0086】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約３０ｍＭ～約８０ｍＭの総濃度である。

【0087】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約３０ｍＭ～約６０ｍＭの総濃度である。

【0088】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約２００ｍＭの総濃度である。

【0089】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約８０ｍＭの総濃度である。

【0090】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約６０ｍＭの総濃度である。

【0091】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｋ^＋であり、約３０ｍＭの総濃度である。

【0092】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約５ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５ｍＭ～約９００ｍＭ、約５ｍＭ～約８００ｍＭ、約５ｍＭ～約７００ｍＭ、約５ｍＭ～約６００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０ｍＭ～約８０ｍＭ、３０ｍＭ～約６０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0093】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの総濃度である。

【0094】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約３０ｍＭ～約２００ｍＭの総濃度である。

【0095】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約３０ｍＭ～約８０ｍＭの総濃度である。

【0096】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約３０ｍＭ～約６０ｍＭの総濃度である。

【0097】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約２００ｍＭの総濃度である。

【0098】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約８０ｍＭの総濃度である。

【0099】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約６０ｍＭの総濃度である。

【0100】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の一価カチオンは、ＮＨ_４ ^＋であり、約３０ｍＭの総濃度である。

【0101】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｂｅ^２＋、Ｇａ^２＋、Ｐｂ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｔｉ^２＋、Ｓｒ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0102】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｏ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0103】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0104】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋である。

【0105】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋である。

【0106】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0107】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0108】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0109】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約２ｍＭの総濃度である。

【0110】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0111】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0112】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋であり、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0113】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋であり、約２ｍＭの総濃度である。

【0114】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0115】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0116】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0117】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約２ｍＭの総濃度である。

【0118】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0119】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0120】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0121】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋であり、約２ｍＭの総濃度である。

【0122】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｚｎ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0123】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｚｎ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0124】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｚｎ^２＋であり、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0125】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｚｎ^２＋であり、約２ｍＭの総濃度である。

【0126】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｎ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0127】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｎ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0128】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｎ^２＋であり、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0129】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｍｎ^２＋であり、約２ｍＭの総濃度である。

【0130】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃｕ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0131】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃｕ^２＋であり、約１ｍＭ～約３０ｍＭの総濃度である。

【0132】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃｕ^２＋であり、約１ｍＭ～約１０ｍＭの総濃度である。

【0133】

いくつかの実施形態において、第１の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃｕ^２＋であり、約２ｍＭの総濃度である。

【0134】

いくつかの実施形態において、第１の溶液は、約５．０～約８．５、約５．５～約８．５、約６．０～約８．５、約６．５～約８．５、約７．０～約８．５、約７．５～約８．５、約８．０～約８．５、約５．０～約８．０、約５．０～約７．５、約５．０～約７．０、約５．０～約６．５、約５．０～約６．０、約５．０～約５．５、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値のｐＨを有する。具体例としては、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0135】

いくつかの実施形態において、第１の溶液は、約６．０のｐＨを有する。

【0136】

いくつかの実施形態において、第１の溶液は、１つ以上の界面活性剤を更に含む。

【0137】

いくつかの実施形態において、カチオン交換カラムは、荷電基を有する樹脂を含み、荷電基は、スルホン酸基、硫酸基、スルホプロピル基、カルボン酸基、リン酸基、またはこれらの組み合わせである。

【0138】

いくつかの実施形態において、カチオン交換カラムは、樹脂を含み、樹脂は、ＣａｐｔｏＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＸＳ、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｇｉｇａｃａｐ Ｓ、Ｇｉｇａｃａｐ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、ＭａｃｒｏｐｒｅｐＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、ＣＭ及びＳＰ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、ＣＭ及びＳ ＨｙｐｅｒＤ、Ｓ及びＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓ及びＣＭ ＣＡＰＴＯ（商標）、ＭｏｎｏＳ、Ｎｕｖｉａ Ｓ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ－Ｓ ｒ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ－Ｓ ｈ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＨｂＰ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤｅｘＳ－ＶｉｒＳ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ６５０、またはＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅである。

【0139】

いくつかの実施形態において、樹脂は、ＣａｐｔｏＳである。

【0140】

いくつかの実施形態において、樹脂は、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓである。

【0141】

いくつかの実施形態において、樹脂は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓである。

【0142】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｎ（Ｃ_１－５アルキル）_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、Ｃｕ^＋、Ａｇ¹、Ａｕ¹、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0143】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0144】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の一価カチオンは、Ｎａ^＋である。

【0145】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｂｅ^２＋、Ｇａ^２＋、Ｐｂ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｔｉ^２＋、Ｓｒ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0146】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0147】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0148】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の二価カチオンは、Ｃａ^２＋である。

【0149】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の二価カチオンは、Ｍｇ^２＋である。

【0150】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の二価カチオンは、Ｚｎ^２＋である。

【0151】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の二価カチオンは、Ｍｎ^２＋である。

【0152】

いくつかの実施形態において、第２の溶液は、約５．０～約８．５、約５．５～約８．５、約６．０～約８．５、約６．５～約８．５、約７．０～約８．５、約７．５～約８．５、約８．０～約８．５、約５．０～約８、約５．０～約７．５、約５．０～約７．０、約５．０～約６．５、約５．０～約６、約５．０～約５．５、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値のｐＨを有する。具体例としては、約５、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0153】

いくつかの実施形態において、第２の溶液は、約６のｐＨを有する。

【0154】

いくつかの実施形態において、第２の溶液は、１つ以上の界面活性剤を更に含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、一定の総濃度の１つ以上の一価カチオンで実施される。

【0156】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約５ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５ｍＭ～約９００ｍＭ、約５ｍＭ～約８００ｍＭ、約５ｍＭ～約７００ｍＭ、約５ｍＭ～約６００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の一定の総濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0157】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの一定の総濃度である。

【0158】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンは、約３０ｍＭの一定の総濃度である。

【0159】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、一定の総濃度のＮａ^＋で実施される。

【0160】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋は、約５ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５ｍＭ～約９００ｍＭ、約５ｍＭ～約８００ｍＭ、約５ｍＭ～約７００ｍＭ、約５ｍＭ～約６００ｍＭ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、約５ｍＭ～約３００ｍＭ、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の一定の総濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0161】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋は、約５ｍＭ～約１５００ｍＭの一定の総濃度である。

【0162】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋は、約３０ｍＭの一定の総濃度である。

【0163】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、一定の総濃度の１つ以上の二価カチオンで実施される。

【0164】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の一定の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0165】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約１ｍＭ～約３０ｍＭの一定の総濃度である。

【0166】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンは、約２ｍＭの一定の総濃度である。

【0167】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、一定の総濃度のＣａ^２＋で実施される。

【0168】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋は、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の一定の総濃度である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0169】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋は、約１ｍＭ～約３０ｍＭの一定の総濃度である。

【0170】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋は、約２ｍＭの一定の総濃度である。

【0171】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、１つ以上の一価カチオンの総濃度を段階的に増加させることを含む。

【0172】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの初期総濃度は、約１５ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２５ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３５ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４５ｍＭ～約６０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約５５ｍＭ～約６０ｍＭ、約１５ｍＭ～約５５ｍＭ、約１５ｍＭ～約５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約４５ｍＭ、約１５ｍＭ～約４０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３５ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0173】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの初期総濃度は、約１５ｍＭ～約６０ｍＭである。

【0174】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの初期総濃度は、約３０ｍＭである。

【0175】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの中間総濃度は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１２５ｍＭ～約３００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１７５ｍＭ～約３００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約２２５ｍＭ～約３００ｍＭ、約２５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約２７５ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２２５ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１２５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0176】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの中間総濃度は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭである。

【0177】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの中間総濃度は、約２００ｍＭである。

【0178】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの最終総濃度は、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５００ｍＭ～約９００ｍＭ、約５００ｍＭ～約８００ｍＭ、約５００ｍＭ～約７００ｍＭ、約５００ｍＭ～約６００ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0179】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの最終総濃度は、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭである。

【0180】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの最終総濃度は、約１０００ｍＭである。

【0181】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、Ｎａ^＋の総濃度を段階的に増加させることを含む。

【0182】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の初期総濃度は、約１５ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２５ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３５ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４５ｍＭ～約６０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約５５ｍＭ～約６０ｍＭ、約１５ｍＭ～約５５ｍＭ、約１５ｍＭ～約５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約４５ｍＭ、約１５ｍＭ～約４０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３５ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0183】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の初期総濃度は、約１５ｍＭ～約６０ｍＭである。

【0184】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の初期総濃度は、約３０ｍＭである。

【0185】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の中間総濃度は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１２５ｍＭ～約３００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１７５ｍＭ～約３００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約２２５ｍＭ～約３００ｍＭ、約２５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約２７５ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２２５ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１２５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0186】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の中間総濃度は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭである。

【0187】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の中間総濃度は、約２００ｍＭである。

【0188】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の最終総濃度は、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約７００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約９００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１３００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１４００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１４００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１３００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１２００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１１００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約５００ｍＭ～約９００ｍＭ、約５００ｍＭ～約８００ｍＭ、約５００ｍＭ～約７００ｍＭ、約５００ｍＭ～約６００ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１１００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１３００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１５００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0189】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の最終総濃度は、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭである。

【0190】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の最終総濃度は、約１０００ｍＭである。

【0191】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、１つ以上の二価カチオンの総濃度を段階的に増加させることを含む。

【0192】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの初期総濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約２ｍＭ～約１０ｍＭ、約３ｍＭ～約１０ｍＭ、約４ｍＭ～約１０ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約６ｍＭ～約１０ｍＭ、約７ｍＭ～約１０ｍＭ、約８ｍＭ～約１０ｍＭ、約９ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約１ｍＭ～約８ｍＭ、約１ｍＭ～約７ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約４ｍＭ、約１ｍＭ～約３ｍＭ、約１ｍＭ～約２ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0193】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの初期総濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭである。

【0194】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの中間総濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１２ｍＭ～約２０ｍＭ、約１３ｍＭ～約２０ｍＭ、約１４ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１６ｍＭ～約２０ｍＭ、約１７ｍＭ～約２０ｍＭ、約１８ｍＭ～約２０ｍＭ、約１９ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１９ｍＭ、約１０ｍＭ～約１８ｍＭ、約１０ｍＭ～約１７ｍＭ、約１０ｍＭ～約１６ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約１４ｍＭ、約１０ｍＭ～約１３ｍＭ、約１０ｍＭ～約１２ｍＭ、約１０ｍＭ～約１１ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0195】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの中間総濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭである。

【0196】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの最終総濃度は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２２ｍＭ～約３０ｍＭ、約２３ｍＭ～約３０ｍＭ、約２４ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２６ｍＭ～約３０ｍＭ、約２７ｍＭ～約３０ｍＭ、約２８ｍＭ～約３０ｍＭ、約２９ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２９ｍＭ、約２０ｍＭ～約２８ｍＭ、約２０ｍＭ～約２７ｍＭ、約２０ｍＭ～約２６ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、約２０ｍＭ～約２４ｍＭ、約２０ｍＭ～約２３ｍＭ、約２０ｍＭ～約２２ｍＭ、約２０ｍＭ～約２１ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0197】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの最終総濃度は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0198】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、Ｃａ^２＋の総濃度を段階的に増加させることを含む。

【0199】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の初期総濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約２ｍＭ～約１０ｍＭ、約３ｍＭ～約１０ｍＭ、約４ｍＭ～約１０ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約６ｍＭ～約１０ｍＭ、約７ｍＭ～約１０ｍＭ、約８ｍＭ～約１０ｍＭ、約９ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約１ｍＭ～約８ｍＭ、約１ｍＭ～約７ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約４ｍＭ、約１ｍＭ～約３ｍＭ、約１ｍＭ～約２ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0200】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の初期総濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭである。

【0201】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の中間総濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１２ｍＭ～約２０ｍＭ、約１３ｍＭ～約２０ｍＭ、約１４ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１６ｍＭ～約２０ｍＭ、約１７ｍＭ～約２０ｍＭ、約１８ｍＭ～約２０ｍＭ、約１９ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１９ｍＭ、約１０ｍＭ～約１８ｍＭ、約１０ｍＭ～約１７ｍＭ、約１０ｍＭ～約１６ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約１４ｍＭ、約１０ｍＭ～約１３ｍＭ、約１０ｍＭ～約１２ｍＭ、約１０ｍＭ～約１１ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0202】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の中間総濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭである。

【0203】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の最終総濃度は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２２ｍＭ～約３０ｍＭ、約２３ｍＭ～約３０ｍＭ、約２４ｍＭ～約３０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約２６ｍＭ～約３０ｍＭ、約２７ｍＭ～約３０ｍＭ、約２８ｍＭ～約３０ｍＭ、約２９ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２９ｍＭ、約２０ｍＭ～約２８ｍＭ、約２０ｍＭ～約２７ｍＭ、約２０ｍＭ～約２６ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、約２０ｍＭ～約２４ｍＭ、約２０ｍＭ～約２３ｍＭ、約２０ｍＭ～約２２ｍＭ、約２０ｍＭ～約２１ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。具体例としては、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0204】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の最終総濃度は、約２０ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0205】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、１つ以上の一価カチオンの総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む。

【0206】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0207】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0208】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0209】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0210】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0211】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0212】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0213】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0214】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0215】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0216】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0217】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0218】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0219】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0220】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0221】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0222】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0223】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0224】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0225】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の一価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0226】

いくつかの実施形態において、カラム容量の量は、特定の構築物（例えば、ＡＡＶ構築物）の正確な分離特性が評価されたら、減らすことができる。一例として、限定するものではないが、平衡バッファーと溶出バッファーの間の一価カチオンのモル濃度の差が、例えば、５ｍＭ～１０ｍＭである場合、グラジエントのカラム容量は、５カラム容量まで減らすことができる（または５カラム容量未満とすることができる）（例えば、５カラム容量で３０ｍＭ Ｎａ^＋から４０ｍＭ Ｎａ^＋へのグラジエント）。

【0227】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、Ｎａ^＋の総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む。

【0228】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0229】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0230】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0231】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0232】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約１７５ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、１５０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、５カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0233】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0234】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0235】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0236】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0237】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0238】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0239】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0240】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0241】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0242】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0243】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0244】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ ０である。

【0245】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約２００ｍＭである。

【0246】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約８０ｍＭである。

【0247】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＮａ^＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約３０ｍＭ～約４０ｍＭである。

【0248】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、１つ以上の二価カチオンの総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む。

【0249】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0250】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0251】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0252】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0253】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0254】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0255】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0256】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0257】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0258】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0259】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0260】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0261】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0262】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0263】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0264】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0265】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0266】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0267】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0268】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の１つ以上の二価カチオンの総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0269】

いくつかの実施形態において、第２の溶液の添加は、Ｃａ^２＋の総濃度を連続的に直線的に増加させることを含む。

【0270】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、４０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0271】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、３０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0272】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、２０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0273】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、１０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、１０カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0274】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で５ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で１０ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で１５ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で２０ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で２５ｍＭ～約３０ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約２５ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約２０ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約１５ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約１０ｍＭ、５カラム容量で１ｍＭ～約５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値である。

【0275】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0276】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0277】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、４０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0278】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0279】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0280】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、３０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0281】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0282】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0283】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、２０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0284】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の総濃度の連続的な直線的増加は、０カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0285】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、０カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0286】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、０カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0287】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約３０ｍＭである。

【0288】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約１５ｍＭである。

【0289】

いくつかの実施形態において、第２の溶液のＣａ^２＋の総濃度の連続的な直線的増加は、５カラム容量で約１ｍＭ～約５ｍＭである。

【0290】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、遺伝子改変ＡＡＶ、化学改変ＡＡＶ、遺伝子化学改変ＡＡＶ、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する。

【0291】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８に由来する。

【0292】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９に由来する。

【0293】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６に由来する。

【0294】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェノールエーテル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（２０）－ソルビタン－モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０／ポリソルベート８０））、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、クレモフォア、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－１０１還元型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0295】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１２４、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0296】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、ポリソルベート８０である。

【0297】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、ポリソルベート２０である。

【0298】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、ポリソルベート１２４である。

【0299】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００３ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００３５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００４ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００４５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００５５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００６ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００６５ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００７ｗ／ｗ％～約０．００７５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００７０ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００６５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００６ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００６５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００６ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００５５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００４５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００４ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００３５ｗ／ｗ％、約０．００２５ｗ／ｗ％～約０．００３ｗ／ｗ％、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の総量である。具体例としては、約０．００２５ｗ／ｗ％、約０．００３ｗ／ｗ％、約０．００３５ｗ／ｗ％、約０．００４ｗ／ｗ％、約０．００４５ｗ／ｗ％、約０．００５ｗ／ｗ％、約０．００５５ｗ／ｗ％、約０．００６ｗ／ｗ％、約０．００６５ｗ／ｗ％、約０．００７ｗ／ｗ％、約０．００７５ｗ／ｗ％、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0300】

いくつかの実施形態において、１つ以上の界面活性剤（例えば、第１の溶液または第２の溶液）は、約０．００５ｗ／ｗ％の総量である。

【0301】

ある特定の実施形態において、空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物または画分から空ＡＡＶカプシドを精製して、完全ＡＡＶカプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を提供するための方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該空ＡＡＶカプシド及び当該完全ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、空ＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドから精製される条件下で添加するステップとを含む、方法。

【0302】

いくつかの実施形態において、精製されたＡＡＶ生成物、製剤、または組成物は、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２９％、約２８％、約２７％、約２６％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満の空ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、精製されたＡＡＶ生成物、製剤、または組成物は、約３０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、精製されたＡＡＶ生成物、製剤、または組成物は、約２０％未満の空ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、精製されたＡＡＶ生成物、製剤、または組成物は、約６％未満の空ＡＡＶカプシドを含む。

【0303】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物または画分中の空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを分離する方法であって、
（ａ）空ＡＡＶカプシド、完全ＡＡＶカプシド、１つ以上の一価カチオン、及び１つ以上の二価カチオンを含む第１の溶液を提供するステップと、
（ｂ）当該第１の溶液をカチオン交換カラムに対して、当該空ＡＡＶカプシド及び当該完全ＡＡＶカプシドがカラムに結合する条件下でロードするステップと、
（ｃ）１つ以上の一価カチオン及び１つ以上の二価カチオンを含む第２の溶液をカチオン交換カラムに対して、空ＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドから分離される条件下で添加するステップとを含む、方法。

【0304】

ある特定の実施形態において、低い導電率域では完全カプシドまたは実質的に完全なカプシドを選択することができ、高い導電率域では空カプシドまたは実質的に空のカプシドを選択することができる。

【0305】

いくつかの実施形態において、空ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、遺伝子改変ＡＡＶ、化学改変ＡＡＶ、遺伝子化学改変ＡＡＶ、及びこれらの組み合わせからなる群に由来する。

【0306】

いくつかの実施形態において、空ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８に由来する。

【0307】

いくつかの実施形態において、空ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９に由来する。

【0308】

いくつかの実施形態において、空ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ６に由来する。

【0309】

いくつかの実施形態は、免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）本明細書で開示されるいずれかの実施形態の空ＡＡＶカプシドを限外濾過によって濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップとを含む、方法を対象とする。

【0310】

いくつかの実施形態は、免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）本明細書で開示されるいずれかの実施形態の空ＡＡＶカプシドをアニオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップとを含む、方法を対象とする。

【0311】

いくつかの実施形態は、免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）本明細書で開示されるいずれかの実施形態の空ＡＡＶカプシドをカチオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）アミン不含バッファーにバッファー交換するステップと、
（ｃ）空ＡＡＶカプシドを活性化樹脂上に固定化するステップとを含む、方法を対象とする。

【0312】

いくつかの実施形態は、免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）本明細書で開示されるいずれかの実施形態の完全ＡＡＶカプシドを限外濾過によって濃縮するステップと、
（ｂ）患者の治療に好適なバッファーにバッファー交換するステップとを含む、方法を対象とする。

【0313】

免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）本明細書で開示されるいずれかの実施形態の完全ＡＡＶカプシドをアニオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）患者の治療に好適なバッファーにバッファー交換するステップとを含む、方法を対象とする。

【0314】

いくつかの実施形態は、免疫吸収カラムを調製する方法であって、
（ａ）本明細書で開示されるいずれかの実施形態の完全ＡＡＶカプシドをカチオン交換体によって濃縮するステップと、
（ｂ）患者の治療に好適なバッファーにバッファー交換するステップとを含む、方法を対象とする。

【0315】

いくつかの実施形態において、空ＡＡＶカプシドの活性化樹脂上への固定化は、約２℃～約３７℃、約５℃～約３７℃、約１０℃～約３７℃、約１５℃～約３７℃、約２０℃～約３７℃、約２５℃～約３７℃、約３０℃～約３７℃、約３５℃～約３７℃、約２℃～約３５℃、約２℃～約３０℃、約２℃～約２５℃、約２℃～約２０℃、約２℃～約１５℃、約２℃～約１０℃、約２℃～約５℃、約５℃～約３５℃、約１０℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の温度で生じる。具体例としては、約２℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0316】

いくつかの実施形態において、空ＡＡＶカプシドの活性化樹脂上への固定化は、約２時間（ｈｒｓ）～約２０時間、約２時間～約１９時間、約２時間～約１８時間、約２時間～約１７時間、約２時間～約１６時間、約２時間～約１５時間、約２時間～約１４時間、約２時間～約１３時間、約２時間～約１２時間、約２時間～約１１時間、約２時間～約１０時間、約２時間～約９時間、約２時間～約８時間、約２時間～約７時間、約２時間～約６時間、約２時間～約５時間、約２時間～約４時間、約２時間～約３時間、約３時間～約２０時間、約４時間～約２０時間、約５時間～約２０時間、約６時間～約２０時間、約７時間～約２０時間、約８時間～約２０時間、約９時間～約２０時間、約１０時間～約２０時間、約１１時間～約２０時間、約１２時間～約２０時間、約１３時間～約２０時間、約１４時間～約２０時間、約１５時間～約２０時間、約１６時間～約２０時間、約１７時間～約２０時間、約１８時間～約２０時間、約１９時間～約２０時間、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の反応時間で実施される。具体例としては、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0317】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、炭酸バッファー、酢酸バッファー、ホウ酸バッファー、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0318】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の濃度である。具体例としては、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0319】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約１００ｍＭの濃度である。

【0320】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、ＮａＣｌを更に含む。

【0321】

いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の濃度である。具体例としては、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0322】

いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、約１５０ｍＭの濃度である。

【0323】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約７．０～約８．５、約７．２５～約８．５、約７．５～約８．５、約７．７５～約８．５、約８．０～約８．５、約８．２５～約８．５、約７．０～約８．２５、約７．０～約８、約７．０～約７．７５、約７．０～約７．５、約７．０～約７．２５、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値のｐＨを有する。具体例としては、約７．０、約７．２５、約７．５、約７．７５、約８．０、約８．２５、約８．５、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0324】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約８．０～約８．５のｐＨを有する。

【0325】

いくつかの実施形態において、活性化樹脂は、ＣＮＢｒ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＮＨＳ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｒａｅｓｔｏ（登録商標）ＣＮＢｒ、Ｐｏｒｏｓ ＥＰ、及びＰｏｒｏｓ ＡＬからなる群から選択される。

【0326】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約６．５、約７、約７．５、約８、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲のｐＨを有する。

【0327】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約７．５のｐＨを有する。

【0328】

いくつかの実施形態において、アニオン交換体は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ ６５０、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｍａｘ Ｑ、及びＰｒａｅｓｔｏ Ｑからなる群から選択される。

【0329】

いくつかの実施形態において、アニオン交換体は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ、及びＰｏｒｏｓ ＨＱからなる群から選択される。

【0330】

いくつかの実施形態において、アニオン交換体は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥである。

【0331】

いくつかの実施形態において、アニオン交換体は、Ｐｏｒｏｓ ＰＩである。

【0332】

いくつかの実施形態において、アニオン交換体は、Ｐｏｒｏｓ ＨＱである。

【0333】

いくつかの実施形態において、カチオン交換体は、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、セルファインサルフェイト、セルファインフォスフェイト、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｓｕｌｆａｔｅ ６５０、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、及びＰｒａｅｓｔｏ ＳＰからなる群から選択される。

【0334】

いくつかの実施形態において、カチオン交換体は、Ｃａｐｔｏ Ｓ 及びＥｓｈｍｕｎｏ Ｓからなる群から選択される。

【0335】

いくつかの実施形態において、カチオン交換体は、Ｃａｐｔｏ Ｓである。

【0336】

いくつかの実施形態において、カチオン交換体は、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓである。

【0337】

例として、限定するものではないが、患者の治療に好適なバッファーの候補は、ＷＯ２０１８１２８６８９Ａ１及びＷＯ２０２００１４４７９Ａ１に見出すことができ、意図される全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0338】

いくつかの実施形態において、患者の治療に好適なバッファーは、Ｌ－ヒスチジンである。

【0339】

いくつかの実施形態において、患者の治療に好適なバッファーは、約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の濃度である。具体例としては、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、または約２５ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0340】

いくつかの実施形態において、患者の治療に好適なバッファーは、ＮａＣｌを更に含む。

【0341】

いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値の濃度である。具体例としては、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0342】

いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、約１５０ｍＭの濃度である。

【0343】

いくつかの実施形態において、患者の治療に好適なバッファーは、約６．５～約９．０、約６．５～約８．０、約６．９～約７．７、または約７．０～約７．５、またはこれらの範囲の１つの範囲内の値のｐＨを有する。具体例としては、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲を挙げることができる。

【0344】

いくつかの実施形態において、患者の治療に好適なバッファーは、約７．０のｐＨを有する。

【0345】

いくつかの実施形態において、アミン不含バッファーは、約８．０～約７．５のｐＨを有する。

【0346】

いくつかの実施形態は、ＡＡＶ調製物または画分から空ＡＡＶカプシドを精製するための方法を対象とし、精製されたＡＡＶ生成物、製剤、組成物などは、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満の空ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、精製されたＡＡＶ生成物、製剤、または組成物は、約１％～約３０％、約４％～約３０％、約１％～約２０％、約１％～約６％、約２％～約２０％、約３％～約２０％、約４％～約２０％、約５％～約２０％、約６％～約２０％、約４％～約１９％、約５％～約１９％、約４％～約１２％、約５％～約１２％、約４％～約１１％、約、または約５％～約１１％の空ＡＡＶカプシドを含む。

【0347】

ＡＡＶ製剤及びＡＡＶ生成物
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される方法に従って精製された完全ＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶ製剤である。

【0348】

本明細書において提供されるのはまた、本明細書に記載される方法によって作製されたＡＡＶ生成物を含む、医薬組成物である。

【0349】

例示的な実施形態において、本開示のＡＡＶ製剤またはＡＡＶ組成物またはＡＡＶ生成物は、追加の薬学的に許容される成分を含む。例示的な態様において、ＡＡＶ製剤またはＡＡＶ組成物またはＡＡＶ生成物は、次のうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む：酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル推進剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、凝固防止剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、防腐剤、塩基、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、フィルム形成剤、風味向上剤、矯味矯臭剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏剤、油脂性ビヒクル、有機塩基、トローチ基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味剤、治療剤、粘稠化剤、等張化剤、毒性剤、増粘剤、吸水剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、または湿潤剤。いくつかの実施形態において、本開示のＡＡＶ製剤またはＡＡＶ組成物またはＡＡＶ生成物は、次の構成成分のいずれか１つまたは組み合わせを含む：アラビアゴム、アセスルファムカリウム、クエン酸アセチルトリブチル、クエン酸アセチルトリエチル、寒天、アルブミン、アルコール、脱水アルコール、変性アルコール、希釈アルコール、アロイリット酸、アルギン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α－アミロース、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスパルテーム、注射用静菌水、ベントナイト、ベントナイトマグマ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、二塩基性無水リン酸カルシウム、二塩基性脱水リン酸カルシウム、三塩基性リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物、キャノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β－カロチン、カラギーナン、ヒマシ油、水添ヒマシ油、カチオン乳化ワックス、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、粉末セルロース、ケイ化微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、固形コーンシロップ、無水クエン酸、クエン酸一水和物、カカオ脂、着色剤、トウモロコシ油、綿実油、クレゾール、ｍ－クレゾール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デキストレート、デキストリン、デキストロース、無水デキストロース、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル－β－シクロデキストリン、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）などのシクロデキストリン系化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、ドクサートカルシウム、ドクサートカリウム、ドクサートナトリウム、没食子酸ドデシル、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸、エグルミン、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、ラウリン酸エチル、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラベン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、液体フルクトース、粉砕フルクトース、パイロジェンフリーフルクトース、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グルコース、液体グルコース、植物性飽和脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、ベヘン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、自己乳化型モノステアリン酸グリセリル、パルミチン酸ステアリン酸グリセリル、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、高フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、水素添加植物油ＩＩ型、ヒドロキシエチルセルロース、２－ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換体、酸化鉄、イソプロピルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等張食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、無水ラノリン、レシチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、中性炭酸マグネシウム、無水炭酸マグネシウム、水酸化炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、無水三ケイ酸マグネシウム、リンゴ酸、麦芽、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセリド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メタクリル酸メチル、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱油、軽鉱油、鉱油及びラノリンアルコール、油、オリーブ油、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子酸オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、ピーナッツ油、ペトロラタム、ペトロラタム及びラノリンアルコール、医薬品グレーズ、フェノール、液化フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレート、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリメタクリレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸水素カリウム、亜硫酸水素カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、無水クエン酸カリウム、リン酸水素カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、硫酸プロタミン、菜種油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ベニバナ油、サポナイト、血清タンパク質、ゴマ油、コロイダルシリカ、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム脱水物、塩化ナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、無水プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪エステル）、ソルビトール、ソルビトール溶液７０％、大豆油、スペルマセチロウ、デンプン、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌可能トウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、圧縮糖、粉糖、粒状糖、転化糖、シュガータブ、Ｓｕｎｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ ＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タートラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ）、テオブロマオイル、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、酢酸トコフェロール、コハク酸アルファトコフェロール、ベータ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、トラガカント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル－β－シクロデキストリン、臭化トリメチルテトラデシルアンモニウム、トリスバッファー、エデト酸三ナトリウム、バニリン、Ｉ型水素添加植物油、水、軟水、硬水、炭酸ガスフリー水、パイロジェンフリー水、注射用水、吸入用無菌水、注射用無菌水、灌漑用滅菌水、ロウ、アニオン性乳化ワックス、カルナウバロウ、カチオン性乳化ワックス、セチルエステルワックス、マイクロクリスタリンワックス、非イオン性乳化ワックス、坐剤ロウ、白ロウ、黄ロウ、白色ワセリン、羊毛脂、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛、またはＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）の任意の賦形剤（その全体が参照により援用される）。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）には、薬学的に許容されるＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物の製剤化に使用される様々な構成成分及びその調製のための既知の技術が開示されており、全ての意図される目的のために、その全体が参照により援用される。従来の任意の剤は、医薬用ＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物と適合性がない場合を除き、医薬用ＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物における使用が企図される。例示的な実施形態において、本開示のＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物は、上記成分のうちの１つまたは組み合わせを含まない。例示的な実施形態において、本開示のＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物は、これらの成分のいずれも含まない。例示的な態様において、本開示の医薬用ＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物は、デキストランを含まない。例示的な態様において、本開示の医薬用ＡＡＶ製剤またはＡＡＶ生成物またはＡＡＶ組成物は、塩化カルシウムを含まない。

【0350】

定量的方法及び／または定性的方法
本開示の方法は、１つ以上の品質管理ステップ、例えば、投与用のＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物を作製するための最終ステップを含む、精製プロセスの１つ以上のステップの後（例えば、各ステップの後）に得られたＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物の濃度、用量、及び／または効力を測定するステップを含む。

【0351】

本開示の方法は、ＡＡＶカプシドの数を定量化するために、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ抗原）に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを含み得る。ある特定の実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイには、酵素結合免疫吸着法、直接ＥＬＩＳＡ、関節ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、及び／または競合ＥＬＩＳＡが含まれ得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。

【0352】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶ抗原は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはキメラＡＡＶ抗原である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ抗原は、ＡＡＶ８抗原である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ抗原は、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ抗原は、遺伝子操作されたＡＡＶ、または化学的に改変されたＡＡＶ、またはその両方に由来する。

【0353】

ある特定の実施形態において、ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシド上に存在する高次構造エピトープである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシド上に存在する線状エピトープである。そのようなエピトープの例としては、カプシドビリオンタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、カプシドの表面上に追加のビリオンタンパク質を発現するように遺伝子操作され、これらの操作されたタンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイで使用／検出することができる。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、ビリオンタンパク質のバリアントを発現するように化学的に改変され、ＥＬＩＳＡアッセイで使用／検出することができる（例えば、ＶＰ１’、ＶＰ２’、ＶＰ３’など）。ある特定の実施形態において、抗体は、血清型特異的カプシドビリオンタンパク質を特定する。

【0354】

ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物の用量及び／または効力を決定する方法として、ｑＰＣＲに取って代わることができる。本発明のＥＬＩＳＡ技術は、ｑＰＣＲ法よりも変動が有意に少ない。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、ＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物を評価することを含む。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法は全て、ｑＰＣＲステップを含まない。

【0355】

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、超遠心分離後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、デプス濾過後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを使用してＡＡＶ画分または調製物を濃縮した後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップ後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ネガティブアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ポリッシングステップ後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、精製されたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。

【0356】

ＡＡＶカプシドの数を定量化するための追加の方法には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ、ＯＣＴＥＴ）、示差走査蛍光測定法（例えば、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ４８、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）、磁気イムノアッセイ（ＭＩＡ）、及びクローン化酵素ドナーイムノアッセイ（ＣＥＤＩＡ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、ＥＬＩＳＡ定量アッセイに加えて、またはこれに代えて使用することができる。

【0357】

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（例えば、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージまたは比率）を測定することを含む。ＡＡＶ画分または調製物中の完全ＡＡＶカプシド：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージまたは比率を評価または確認するための方法には、低温透過型電子顕微鏡（ＣｒｙｏＴＥＭ）、ネガティブ染色ＴＥＭ、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心分離法、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0358】

ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドを測定するための方法は、ＣｒｙｏＴＥＭである。ある特定の実施形態において、方法は、ＣｒｙｏＴＥＭと上記のＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡの両方を使用することを伴う。ある特定の実施形態において、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。ある特定の実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシド上に存在する高次構造エピトープである。

【0359】

ＣｒｙｏＴＥＭを使用する１つの利点は、ネガティブ染色を必要としないことである。ＣｒｙｏＴＥＭはまた、完全ＡＡＶカプシドの量を定量化する能力もある。ある特定の実施形態において、ＣｒｙｏＴＥＭを使用することで、偽陽性シグナルに起因する完全ＡＡＶカプシド量の過大評価がなくなる。

【0360】

本開示の方法は、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドの数またはパーセンテージを評価する方法を含む。ある特定の実施形態において、方法は、ＣｒｙｏＴＥＭを含む。ある特定の実施形態において、方法は、（ｉ）不活性支持体上の基材中にＡＡＶ画分または調製物を包埋することと、（ｉｉ）包埋したＡＡＶ画分または調製物を急速凍結することと、（ｉｉｉ）低温透過型電子顕微鏡を使用して包埋したＡＡＶ画分または調製を画像化することと、（ｉｖ）完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージを定量化することとを含む。

【0361】

ステップ（ｉ）について、当該方法での使用に好適な基材の例としては、非結晶性の非晶質氷が挙げられるが、これらに限定されない。当該方法での使用に好適な不活性支持体の例としては、カーボン膜、熱可塑性樹脂、及びポリビニルホルマール（例えば、ポリビニルアルコール及びホルムアルデヒドからポリビニルアセテートとのコポリマーとして形成されるポリマー、例えば、限定するものではないが、ＦｏｒｍｖａｒまたはＶｉｎｙｌｅｃ、カーボンで安定化されたポリビニルホルマール、ポリビニルホルマール上に一酸化ケイ素があるもの、純粋なカーボン膜、カーボンタイプＡ：カーボン支持膜（例えば、グリッドの反対側に取り外し可能なポリビニルホルマールがあるもの）、カーボンタイプＢ：ポリビニルホルマール膜（例えば、より厚いカーボン層でコーティングされたもの）、及びカーボンタイプＡ上に一酸化ケイ素があるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、上記のステップ（ｉ）は、温度（例えば、（－１９６℃）以下）及び湿度が制御された環境下で、薄いカーボン支持膜上にサンプルを載せることを伴う。ある特定の実施形態において、湿度レベルは、相対湿度であり得る。ステップ（ｉｉ）について、サンプルは、急速凍結され得る。ある特定の実施形態において、急速凍結は、液体エタン、液体窒素、液体プロパン、またはヘリウムを液体窒素温度付近で使用することを伴い得る。例えば、液体エタン、液体窒素、液体プロパン、またはヘリウムの容器は、液体窒素で囲まれている。

【0362】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶ画分または調製は、氷晶が形成できないように、急速に凍結される（例えば、毎秒１０４～１０６Ｋ）。ある特定の実施形態において、非晶質氷は、液体の水を急速に冷却するか、または普通の氷を低温で圧縮することのいずれかによって生成される。ある特定の実施形態において、過剰のＡＡＶ画分または調製物を、試料の一部が付着したまま残るように除去した後、グリッドを液体エタン中でガラス化し、次いで、液体窒素中で保存する。ＣｒｙｏＴＥＭを実施するための追加ステップの考察については、Ｃａｂｒａ ａｎｄ Ｓａｍｓｏ，Ｊ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，（２０１５）９５（ｅ５２３１１）：１－１１を参照されたく、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0363】

ＡＡＶ粒子のＣｒｙｏＴＥＭ解析を使用して、試料全体の形態、すなわち、様々なＡＡＶの形態の存在（一般に、球状及び変形ＡＡＶ粒子、サブユニット構造ならびに構造的にあまり定義されない大きな形態を含む）を評価することができる。例えば、完全カプシドは、殻とコアとの間に明確な境界のない内部密度を示す。明確な外殻及び微小な内部密度を示すＡＡＶカプシドは、空カプシドに分類される。

【0364】

ＣｒｙｏＴＥＭは、不確定なカプシドを評価するために使用することもできる。例えば、ＣｒｙｏＴＥＭを使用して、「完全」、「空」、及び「不確定」カプシドを計数することができる。

【0365】

ＣｒｙｏＴＥＭはまた、手動で粒子を分類するか、または自動画像解析法を使用することのいずれかによって、粒子のパッケージングのレベルを決定することに使用することもできる。

【0366】

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、超遠心分離後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、デプス濾過後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを使用してＡＡＶ画分または調製物を濃縮した後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップ後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ネガティブアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ポリッシングステップ後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、精製したＡＡＶ画分または調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／または質を決定することを含む。

【0367】

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、超遠心分離後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、デプス濾過後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを使用してＡＡＶ画分または調製物を濃縮した後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップ後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ネガティブアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、ポリッシングステップ後に得られたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、精製されたＡＡＶ画分または調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。

【0368】

分析用超遠心分離法（ＡＵＣ）は、沈降係数に従ってタンパク質を分離することが可能である。同一のタンパク質の場合、沈降係数は、凝集状態と相関し得る。簡潔に述べると、サンプルを対応するサンプルバッファーで希釈し、次いで、石英ウィンドウが内蔵されたセルアセンブリーに移してローターにローディングした後、一定速度で回転させる。サイズが異なるタンパク質分子は、セルの底に向かって異なる沈降速度で移動するので、これを遠心分離中にＵＶ検出器により２８０ｎｍで連続的にモニタリングする。収集したデータセットにより、コンピューター解析が可能となり、沈降及び拡散プロセスをデコンボリューションすることで、微分沈降係数分布ｃ（ｓ）が得られる。これにより、サンプルの様々な種が特定され、それらのｓ値及び集団が示される。沈降係数の分布を積分すると、相対面積パーセンテージ及びピーク最大値のＳ値が分析の結果として得られる。

【0369】

ＡＡＶ調製物
本開示の方法によって作製されたＡＡＶ調製物も本明細書において更に提供される。ＡＡＶ調製物及びＡＡＶ画分は、本開示の目的上、区別なく使用される。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ画分は、更に濃縮されたＡＡＶ調製物またはＡＡＶ調製物から除去されたＡＡＶの一部である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物を作製するための方法であって、（ｉ）目的遺伝子を含む少なくとも１つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトすることと、（ｉｉ）ＡＡＶカプシドを含む細胞培養物の上清または細胞懸濁液を回収して、ＡＡＶ画分または調製物を生成することと、（ｉｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＡＡＶ画分または調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で決定されたＡＡＶカプシドの総数に基づいて、所望の濃度のＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を調製することとを含む、方法。ある特定の実施形態において、方法は、ＡＡＶ画分または調製物を濃縮することを含む。ある特定の実施形態において、方法は、ＡＡＶ画分または調製物から空カプシドの少なくとも一部を除去することを含む。ある特定の実施形態において、空カプシドの量を除去して、特定の濃度の完全カプシド及び／または特定の比率の完全カプシド：空カプシドを有するＡＡＶ画分、調製物、生成物、ＡＡＶ製剤またはＡＡＶ組成物を作成する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ画分または調製物は、適切なバッファーで所望の用量に希釈される。

【0370】

ある特定の実施形態において、方法は、ＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物中の完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（完全：空）のパーセンテージまたは比率を評価または確認することを含む。ある特定の実施形態において、方法は、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（完全：空）のパーセンテージまたは比率を評価または確認することがＣｒｙｏＴＥＭであることを含む。ある特定の実施形態において、用量及び／または効力は、ｑＰＣＲによって決定しない。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％～約１００％である。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４５％～約７５％、約５０％～約７０％、または約５５％～約６５％である。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約６０％～約８０％の間である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドの少なくとも約６０％は、完全ＡＡＶカプシドである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％は、完全ＡＡＶカプシドである。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法は、ＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物の間で一貫した量の完全カプシドを含むＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物を生成するために使用される。

【0371】

ある特定の実施形態において、方法は、ＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物中の完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（完全：空）のパーセンテージまたは比率を評価または確認することを含む。ある特定の実施形態において、方法は、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（完全：空）のパーセンテージまたは比率を評価または確認することがＣｒｙｏＴＥＭであることを含む。ある特定の実施形態において、用量及び／または効力は、ｑＰＣＲによって決定しない。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％～約１００％である。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４５％～約７５％、約５０％～約７０％、または約５５％～約６５％である。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約６０％～約８０％の間である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドの少なくとも約６０％は、完全ＡＡＶカプシドである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％は、完全ＡＡＶカプシドである。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法は、ＡＡＶ画分または調製物の間で一貫した量の完全カプシドを含むＡＡＶ画分、調製物、生成物、製剤、または組成物を生成するために使用される。

【0372】

本開示の方法によって作製されたＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を投与する方法も更に本明細書で提供される。ある特定の態様において、本発明の方法は、特定の用量のＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを伴い、（ｉ）精製されたＡＡＶ調製物を得ることと、（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、精製されたＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定することと、（ｉｉｉ）特定の用量のＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を対象に投与することとを含む。ある特定の実施形態において、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）における調製物は、最終的なＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を作製するために使用することができるＡＡＶ画分または調製物であり、このＡＡＶ画分または調製物は、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、及び／または（ｉｉｉ）のためのＡＡＶ生成物、製剤、または組成物を形成するために更に精製または希釈される。ある特定の実施形態において、方法は、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物中の完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（完全：空）のパーセンテージまたは比率を評価または確認することを含む。ある特定の実施形態において、方法は、完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシド（完全：空）のパーセンテージまたは比率を評価または確認することがＣｒｙｏＴＥＭであることを含む。ある特定の実施形態において、濃度、用量及び／または効力は、ｑＰＣＲによって決定しない。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％～約１００％である。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４５％～約７５％、約５０％～約７０％、または約５５％～約６５％である。ある特定の実施形態において、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約６０％～約８０％の間である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドの少なくとも約６０％は、完全ＡＡＶカプシドである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％は、完全ＡＡＶカプシドである。

【0373】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ生物効力アッセイによって更に検証することができる。例えば、ステップは、１）調製物中のＡＡＶの含量を（例えば、ＥＬＩＳＡにより）決定することと、２）完全カプシドのパーセンテージを（例えば、ＣｒｙｏＴＥＭにより）決定することと、３）生物活性を（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生物効力アッセイにより）確認することを伴い得る。

【0374】

ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法、画分、調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１×１０^１０ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^２０ｃｐ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法、画分、調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の濃度は、約１×１０^１１ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１９ｃｐ／ｍｌ、約１×１０^１２ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１８ｃｐ／ｍｌ、約１×１０^１３ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１７ｃｐ／ｍｌ、または約１×１０^１４ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１６ｃｐ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法及び調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の濃度は、約１×１０^１２ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１５ｃｐ／ｍｌ、約１×１０^１３ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１５ｃｐ／ｍｌ、または約１×１０^１２ｃｐ／ｍｌ～約１×１０^１３ｃｐ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法及び調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の濃度は、約１×１０^１４ｃｐ／ｍｌ～約５×１０^１４ｃｐ／ｍｌ、約２×１０^１４ｃｐ／ｍｌ～約３×１０^１４ｃｐ／ｍｌ、または約３．５×１０^１４ｃｐ／ｍｌ～約５×１０^１５ｃｐ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態において、ｃｐ／ｍｌは、１ｍｌあたりの総カプシドまたは１ｍｌあたりの完全カプシドであり得る。ある特定の実施形態において、ｃｐ／ｍｌは、１ｍｌあたりの総カプシドである。

【0375】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、約１０００Ｌの出発物質（例えば、細胞培養物）から産生された少なくとも約１０^１２個のウイルス粒子（ｖｐ）、または約１０００Ｌの出発物質（例えば、細胞培養物）から産生された少なくとも約１０^１３個のウイルス粒子（ｖｐ）を含む。

【0376】

ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法または調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の用量は、約１×１０^５ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２５ｃｐ／ｋｇの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法または調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の用量は、約１×１０^６ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２４ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^７ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２３ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^８ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２２ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^９ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２１ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^１０ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２０ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^１１ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１９ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^１２ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１８ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^１３ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１７ｃｐ／ｋｇ、または約１×１０^１４ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１６ｃｐ／ｋｇの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法及び調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の用量は、約１×１０^１２ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^２０ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^１３ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１９ｃｐ／ｋｇ、約１×１０^１４ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１８ｃｐ／ｋｇ、または約１×１０^１５ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１７ｃｐ／ｋｇの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法及び調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の用量は、約１×１０^１０ｃｐ／ｋｇ～約１×１０^１６ｃｐ／ｋｇの間である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示される方法及び調製物、生成物、製剤、または組成物について、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物の用量は、少なくとも約１×１０^６ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１７ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１８ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１９ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^２０ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^２１ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^２２ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^２３ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^２４ｃｐ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０^２５ｃｐ／ｋｇである。ある特定の実施形態において、ｃｐ／ｋｇは、対象１ｋｇあたりの総カプシドまたは対象１ｋｇあたりの完全カプシドであり得る。ある特定の実施形態において、ｃｐ／ｋｇは、対象１ｋｇあたりの総カプシドである。

【0377】

ある特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、高純度で高力価であり、対象での臨床使用に好適である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、均質な集団かつ高純度のＡＡＶカプシド粒子を含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、全長ベクターＤＮＡを含む。例示的な実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、限定するものではないが、切断されたもしくは不完全なベクターＤＮＡを含有するＡＡＶカプシド粒子、不完全なタンパク質組成及びオリゴマー化構造を含むＡＡＶ粒子、または汚染ウイルス、例えば、非ＡＡＶ、脂質エンベロープウイルスを含む、不要な夾雑物を実質的に含まない。例示的な実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、目的のタンパク質のコードｃＤＮＡを大量に含有する。ある特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、対象への投与に好適である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、滅菌及び／または適正製造基準（ＧＭＰ）グレードである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、遺伝子治療医薬品に関して米国薬局方チャプター１０４６もしくは欧州薬局方に記載されている要件、または米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）もしくは欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により定められている要件に適合する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ調製物、生成物、製剤、または組成物は、ほとんどまたは全く処理または操作することなく、対象に直接投与するための即時使用可能な調製物、生成物、製剤、または組成物である。

【0378】

ＡＡＶの供給源
本開示の方法に関して、ＡＡＶは、任意のＡＡＶ血清型であり得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶは、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、ＡＡＶ１０血清型、またはキメラＡＡＶベクターである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、野生型である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、遺伝子操作によって改変され、及び／または化学的に改変される。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、改変されたカプシド、例えば、遺伝子操作されたまたは化学的に改変されたＡＡＶカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型である。

【0379】

本発明の方法に関して、ＡＡＶ画分または調製物は、例示的な態様において、濃縮されたＡＡＶ画分または調製物である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ画分または調製物は、１ｍＬあたり少なくとも約１×１０^１０個、約１×１０^１１個、約１×１０^１２個、約１×１０^１３個、約１×１０^１４個、約１×１０^１５個、または約１×１０^１６個のＡＡＶ総カプシドを含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ画分または調製物は、１ｍＬあたり少なくとも約１×１０^１２個のＡＡＶ総カプシドを含む。ＡＡＶカプシドは、空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含み得る。

【0380】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、トランスフェクトされた宿主細胞によって産生されたＡＡＶ画分または調製物を示す。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ画分または調製物は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞培養物から採取された上清または細胞懸濁液を示し、システムのうちの１つのプラスミドは、目的の遺伝子またはｃＤＮＡを含み、１つのプラスミドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、カプシドタンパク質ＶＰ２及び／またはカプシドタンパク質ＶＰ３をコードする。ある特定の実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３は、ＡＡＶ８ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３である。ｒＡＡＶ生成のためのトリプルプラスミドトランスフェクションは、当該技術分野において知られている。例えば、Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５（上掲）、及びＭｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”ＰｈＤ ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８；及びＫｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６（２０１１）を参照されたい。ある特定の実施形態において、トランスフェクションは、無機化合物、例えば、リン酸カルシウム、または有機化合物、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、または非化学的手段、例えば、エレクトロポレーションを使用して実施され得る。

【0381】

ある特定の実施形態において、宿主細胞は、接着細胞である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、浮遊細胞である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞もしくはＳｆ９細胞（例えば、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞）またはＨｅＬａもしくはＢＨＫ（ヘルペスウイルスシステム）である。ある特定の実施形態において、細胞培養は、血清及びタンパク質を含まない培養培地を含む。ある特定の実施形態において、培地は、合成培地であり、動物由来成分、例えば、加水分解物を含まない。

【0382】

ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含む画分または調製物は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含む画分または調製物を示す。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子を含む画分または調製物は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションから約２～約７日後、または細胞培養物が約５×１０^６細胞／ｍＬ以上の細胞密度を有し、約５０％以上の細胞生存率を有するときの採取物の画分または調製物を示す。

【0383】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、トリプルプラスミドトランスフェクションに続いて、１～７日後に採取することによって調製される。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、細胞破砕から調製される。

【0384】

ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、次のように調製される：ＨＥＫ２９３細胞を市販の培養培地中で接着及び成長させる。培地は、合成培地であり得、動物由来成分、例えば、血清及びタンパク質を含み得ない。細胞を約３×１０^６～約１２×１０^６細胞／ｍｌ、例えば、約６×１０^６～約１０×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度まで培養する。次いで、細胞を、細胞密度が約３～５×１０^６細胞／ｍｌになるように、約１：２の比に分割する。分割後、細胞は、（１）ＡＡＶ生成に不可欠な１つ以上のヘルパーウイルス機能を提供することが可能なヘルパープラスミドと、（２）ウイルスのカプシド生成、複製及びパッケージングに関与する１つ以上の遺伝子をコードするプラスミドと、（３）結果として生じるｒＡＡＶ粒子中にパッケージされる目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドとを含む、３つのプラスミドでトランスフェクトされ得る。例えば、ＧＯＩは、ヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを一本鎖の自己相補形態で含むベクターＤＮＡであり得、ベクターＤＮＡとともに存在する。別の例として、ＧＯＩは、ヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを二本鎖の自己相補形態で含むベクターＤＮＡであり得、ベクターＤＮＡの全長は、４．８ｋＢである。別の例として、ＧＯＩは、Ｂドメイン欠失ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子を一本鎖の自己相補形態で含むベクターＤＮＡであり得、ベクターＤＮＡの全長は、４．８ｋＢである。他のＧＯＩが使用されてもよい。トランスフェクションは、カチオン性ポリマーを使用することなどによって、一過性に実施されてもよい。溶出前に、ＨＥＫ２９３細胞株は、採取前に少なくとも約１日間、例えば、３～５日間培養され得る。

【実施例】

【0385】

実施例１：一般的な精製手順
以下の実施例は、単に本発明を例示するために提供されるものであり、その範囲を決して限定するものではない。

【0386】

ＨＥＫ２９３細胞株において、目的タンパク質のコードｃＤＮＡならびにＡＡＶ８－ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含有するトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＡＡＶ８作製を行った。清澄化した細胞培養上清を、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで濃縮及び透析濾過した。ウイルス粒子を非結合条件でメンブレンアブソーバー（ＭｕｓｔａｎｇＱ． Ｐａｌｌ品番ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にローディングした。得られたＡＡＶ８を含むフロースルーを、以下のアフィニティー精製ステップのロードとして使用した。

【0387】

ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号Ａ３０７９４． Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を入れた、ベッド高さ６０ｍｍ及び体積およそ２００ｍｌの内径３２ｍｍのカラムを、少なくとも５カラム容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化した。ロードを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号Ａ３０７９４． Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を入れたカラムにアプライした。次いで、カラムを５カラム容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で再平衡化した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭ 酢酸ナトリウム及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で洗浄した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％ エチレングリコール（ｐＨ８．５）で洗浄した。

【0388】

溶出を、５カラム容量の次の溶出バッファー：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、５０％ エチレングリコール及び７５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）をカラムにアプライすることによって行った。

【0389】

上記手順を表１にまとめる。

【表1】

【0390】

カチオン交換体（ＣＥＸ）に対する適切な結合特性を全てのＡＡＶサブタイプに与えるために、３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）への溶出物のバッファー交換を、ＶＩＶＡＣＥＬＬ１００（１０Ｋ）カートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実施した。

【0391】

実施例２：ＡＡＶ８、ベクターゲノム２．６ｋＢ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、カルシウム存在下
以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。まず、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂（カタログ１７－５４４１－０１；Ｃｙｔｉｖａ）を入れた、ベッド高さ１００ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、及び体積およそ９．５ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）を含む５カラム容量のバッファーで平衡化（活性化）した。次いで、カラムを少なくとも５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で平衡化した。ロード（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）でコンディショニングしたＡＡＶ）を、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂を入れたカラムにアプライした。

【0392】

次いで、カラムを５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【0393】

次いで、溶出には、グラジエント溶出を実施した。グラジエントは、４０カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）から２００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。ポストエリューションを１０カラム容量の１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0394】

全てのステップについて、直線流速は、６０ｃｍ／時であった。

【0395】

バッファーの組成を表２にまとめる。

【表2】

【0396】

表３は、ＣＥＸ分離のためのクロマトグラフィーのスキームを示す。

【表3】

【0397】

表４は、ｄｄＰＣＲ／ＡＡＶ８：ＡＧの比を示す。

【表4】

【0398】

表５は、ＡＵＣを用いて決定された完全カプシドと空カプシドのパーセンテージを示す。

【表5】

【0399】

結果を図１～６に示し、収率を表６に示す。

【0400】

図１～６は、画分の大部分のデータを含むランを示す。ロード、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ＝溶出液、Ｅ１～Ｅ９＝プール－クロマトグラムに従ったピークの画分Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。ｖｇ／ｃｐ比は、完全カプシドの量が最も多いＡＡＶ（完全カプシド画分）を示す。値が高いほど完全カプシドの量が多い。

【0401】

図１及び図２は、ＣＥＸランのクロマトグラムである。再生手順を含む完全なランのデータを含んでいる。ＵＶ２８０ｎｍ、ＵＶ２５４ｎｍ、導電率、ｐＨ、圧力、蛍光及び画分の曲線を示す。Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。

【0402】

【表6】

【0403】

ＡＡＶ８を含有する２．６ｋＢのベクターゲノムをカチオン交換体Ｃａｐｔｏ Ｓ上でカルシウム存在下で分離すると、空ＡＡＶ８カプシドと完全ＡＡＶ８カプシドの分離で高い分離能が示された。画分Ｅ１、Ｅ２及びＥ３の収率は、ｄｄＰＣＲで４４．４％及びＡＡＶ８抗原で９．１％であった。

【0404】

実施例３：ＡＡＶ８、ベクターゲノムサイズ２．６ｋＢ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、キレート化二価カチオン非存在下／存在下
以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。まず、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂（カタログ１７－５４４１－０１；Ｃｙｔｉｖａ）を入れた、ベッド高さ１００ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、及び体積およそ９．５ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）を含む５カラム容量のバッファーで平衡化（活性化）した。次いで、カラムを少なくとも０．００５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で平衡化した。ロード（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）でコンディショニングしたＡＡＶ）を、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂を入れたカラムにアプライした。

【0405】

次いで、カラムを５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【0406】

次いで、溶出には、グラジエント溶出を実施した。グラジエントは、４０カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）から２００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0407】

ポストエリューションを１０カラム容量の１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0408】

全てのステップについて、直線流速は、６０ｃｍ／時であった。

【0409】

バッファーの組成を表７にまとめる。

【表7】

【0410】

表８は、ＣＥＸ分離のためのクロマトグラフィーのスキームを示す。

【表8】

【0411】

表９は、ｄｄＰＣＲ／ＡＡＶ８：ＡＧの比を示す。

【表9】

【0412】

表１０は、ＡＵＣを用いて決定された完全カプシドと空カプシドのパーセンテージを示す。

【表10】

【0413】

結果を図７～１１に示し、収率を表１１に示す。

【0414】

図７～１１は、最も興味深い画分のデータを含むランを示す：Ｌ＿ｎａｔｉｖ＝アフィニティー溶出液、ロード（出発物質＝平衡バッファーに対して透析したアフィニティー溶出液）、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ＝溶出液、Ｅ１～Ｅ３＝ピークの画分（クロマトグラム）。ｖｇ／ｃｐ比は、完全カプシドの量が最も多いＡＡＶ（完全カプシド画分）を示す。値が高いほど完全カプシドの量が多い。

【0415】

図７及び図８は、ＣＥＸランのクロマトグラムである。再生手順を含む完全なランのデータを含んでいる。ＵＶ２８０ｎｍ、ＵＶ２５４ｎｍ、導電率、ｐＨ、圧力、蛍光及び画分の曲線を示す。Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。

【0416】

【表11】

【0417】

カルシウムの代わりにＥＤＴＡを添加すると、著しく低下した分離能が示され、Ｃａｐｔｏ Ｓ上に結合するＡＡＶ８構築物の能力が低下することが示されている。かなりの量のＡＡＶ８がフロースルー中に認められた。

【0418】

実施例４：ＡＡＶ８、ベクターゲノムサイズ＞４．８ｋＢ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、カルシウム存在下
ロード物質の調製
ＨＥＫ２９３細胞株において、目的タンパク質のコードｃＤＮＡならびにＡＡＶ８－ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含有するトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＡＡＶ８作製を行った。清澄化した細胞培養上清を、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで濃縮及び透析濾過した。ウイルス粒子を非結合条件でメンブレンアブソーバー（ＭｕｓｔａｎｇＱ． Ｐａｌｌ品番ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にローディングした。得られたＡＡＶ８を含むフロースルーを、以下のアフィニティー精製ステップのロードとして使用した。

【0419】

ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号Ａ３０７９４． Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を入れた、ベッド高さ６０ｍｍ及び体積およそ２００ｍｌの内径３２ｍｍのカラムを、少なくとも５カラム容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化した。ロードを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号Ａ３０７９４． Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を入れたカラムにアプライした。次いで、カラムを５カラム容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で再平衡化した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭ 酢酸ナトリウム及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で洗浄した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％ エチレングリコール（ｐＨ８．５）で洗浄した。

【0420】

溶出を、５カラム容量の次の溶出バッファー：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、５０％ エチレングリコール及び７５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）をカラムにアプライすることによって行った。詳細を表Ａに記載する。

【0421】

カチオン交換体（ＣＥＸ）に対する適切な結合特性を全てのＡＡＶサブタイプに与えるために、３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）への溶出物のバッファー交換を、ＶＩＶＡＣＥＬＬ１００（１０Ｋ）カートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実施した。

【0422】

以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。まず、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂（カタログ１７－５４４１－０１；Ｃｙｔｉｖａ）を入れた、ベッド高さ１０１ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、及び体積およそ９．６ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）を含む５カラム容量のバッファーで平衡化（活性化）した。次いで、カラムを少なくとも５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で平衡化した。ロード（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）でコンディショニングしたＡＡＶ）を、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂を入れたカラムにアプライした。

【0423】

次いで、カラムを５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【0424】

次いで、溶出には、グラジエント溶出を実施した。グラジエントは、４０カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）から２００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。ポストエリューションを１０カラム容量の１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0425】

全てのステップについて、直線流速は、６０ｃｍ／時であった。

【0426】

バッファーの組成を表１２にまとめる。

【表12】

【0427】

表１３は、ＣＥＸ分離のためのクロマトグラフィーのスキームを示す。

【表13】

【0428】

表１４は、ｄｄＰＣＲ／ＡＡＶ８：ＡＧの比を示す。

【表14】

【0429】

表１５は、ＡＵＣを用いて決定された完全カプシドと空カプシドのパーセンテージを示す。

【表15】

【0430】

結果を図１２～１７に示し、収率を表１６に示す。

【0431】

図１２～１７は、画分の大部分のデータを含むランを示す：Ｌ ｎａｔｉｖ＝アフィニティー溶出液。ロード＝（出発物質）、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ＝溶出液、Ｅ１～Ｅ５＝ピークの画分（クロマトグラム）。ｖｇ／ｃｐ比は、完全カプシドの量が最も多いＡＡＶ（完全カプシド画分）を示す。値が高いほど完全カプシドの量が多い。

【0432】

図１２及び図１３は、ＣＥＸランのクロマトグラムである。再生手順を含む完全なランのデータを含んでいる。ＵＶ２８０ｎｍ、ＵＶ２５４ｎｍ、導電率、ｐＨ、圧力、蛍光及び画分の曲線を示す。Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。

【0433】

【表16】

【0434】

実施例５：ＡＡＶ８ベクターゲノムサイズ２．６ｋＢ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、カルシウム存在下
以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。まず、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓカチオン交換体樹脂（カタログ１．２００７８；Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れた、ベッド高さ１００ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、及び体積およそ９．５ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）を含む５カラム容量のバッファーで平衡化（活性化）した。次いで、カラムを少なくとも５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で平衡化した。ロード（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）でコンディショニングしたＡＡＶ）を、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓカチオン交換体樹脂を入れたカラムにアプライした。

【0435】

次いで、カラムを５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【0436】

次いで、溶出には、グラジエント溶出を実施した。グラジエントは、４０カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）から２００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。ポストエリューションを１０カラム容量の１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0437】

全てのステップについて、直線流速は、６０ｃｍ／時であった。

【0438】

バッファーの組成を表１７にまとめる。

【表17】

【0439】

表１８は、ＣＥＸ分離のためのクロマトグラフィーのスキームを示す。

【表18】

【0440】

表１９は、ｄｄＰＣＲ／ＡＡＶ８：ＡＧの比を示す。

【表19】

【0441】

表２０は、ＡＵＣを用いて決定された完全カプシドと空カプシドのパーセンテージを示す。

【表20】

【0442】

結果を図１８～２４に示し、収率を表２１に示す。

【0443】

図１８～２４は、画分の大部分のデータを含むランを示す：Ｌ ｎａｔｉｖ＝ＡＡＶ８アフィニティー溶出液。ロード（出発物質、平衡バッファーへの透析後）、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ＝溶出液、Ｅ１～Ｅ９＝ピークの画分（クロマトグラム）。ｖｇ／ｃｐ比は、完全カプシドの量が最も多いＡＡＶ（完全カプシド画分）を示す。値が高いほど完全カプシドの量が多い。

【0444】

図１８及び図１９は、ＣＥＸランのクロマトグラムである。再生手順を含む完全なランのデータを含んでいる。ＵＶ２８０ｎｍ、ＵＶ２５４ｎｍ、導電率、ｐＨ、圧力、蛍光及び画分の曲線を示す。Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。

【0445】

【表21】

【0446】

実施例６：ＡＡＶ８、ベクターゲノムサイズ２．６ｋＢ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、カルシウム存在下
以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。まず、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂（カタログ１７－５４４１－０１；Ｃｙｔｉｖａ）を入れた、ベッド高さ１００ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、及び体積およそ９．５ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）を含む５カラム容量のバッファーで平衡化（活性化）した。次いで、カラムを少なくとも５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で平衡化した。ロード（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）でコンディショニングしたＡＡＶ）を、Ｃａｐｔｏ Ｓカチオン交換体樹脂を入れたカラムにアプライした。

【0447】

次いで、カラムを５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【0448】

次いで、溶出には、グラジエント溶出を実施した。グラジエントは、４０カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）から８０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。ポストエリューションを１０カラム容量の１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0449】

全てのステップについて、直線流速は、６０ｃｍ／時であった。

【0450】

バッファーの組成を表２２にまとめる。

【表22】

【0451】

表２３は、ＣＥＸ分離のためのクロマトグラフィーのスキームを示す。

【表23】

【0452】

表２４は、ｄｄＰＣＲ／ＡＡＶ８：ＡＧの比を示す。

【表24】

【0453】

表２５は、ＡＵＣを用いて決定された完全カプシドと空カプシドのパーセンテージを示す。

【表25】

【0454】

結果を図２５～３２に示し、収率を表２６に示す。

【0455】

図２５～３２は、画分の大部分のデータを含むランを示す。ロード（出発物質、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ＝溶出液、Ｅ１～Ｅ６＝ピークの画分（クロマトグラム）。ｖｇ／ｃｐ比は、完全カプシドの量が最も多いＡＡＶ（完全カプシド画分）を示す。値が高いほど完全カプシドの量が多い。

【0456】

図２５及び図２６は、ＣＥＸランのクロマトグラムである。再生手順を含む完全なランのデータを含んでいる。ＵＶ２８０ｎｍ、ＵＶ２５４ｎｍ、導電率、ｐＨ、圧力、蛍光及び画分の曲線を示す。Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。

【0457】

【表26】

【0458】

実施例７：ＡＡＶ９、ベクターゲノムサイズ２．６ｋＢ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、カルシウム存在下
ロード物質の調製
ＨＥＫ２９３細胞株において、目的タンパク質のコードｃＤＮＡならびにＡＡＶ９－ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含有するトリプルプラスミドシステムでトランスフェクションした後、ＡＡＶ９作製を行った。清澄化した細胞培養上清を、Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００ｋＤａで濃縮及び透析濾過した。ウイルス粒子を非結合条件でメンブレンアブソーバー（ＭｕｓｔａｎｇＱ． Ｐａｌｌ品番ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）にローディングした。得られたＡＡＶ９を含むフロースルーを、以下のアフィニティー精製ステップのロードとして使用した。

【0459】

以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号Ａ３６７４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を入れた、ベッド高さ５７ｍｍ及び体積およそ５．４ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、少なくとも５カラム容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化した。ロードを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号Ａ３６７４２ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を入れたカラムにアプライした。次いで、カラムを５カラム容量の５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で再平衡化した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭ 酢酸ナトリウム及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。次いで、カラムを５カラム容量の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で洗浄した。５カラム容量の１００ｍＭ 酢酸ナトリウム及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ６．０）の更なる洗浄液をアプライした。これらのステップは、全て室温で実施した。

【0460】

温度を＋２℃～＋８℃に下げ、流速を５ｃｍ／時に下げ、１０カラム容量の１００ｍＭ 酢酸ナトリウム及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ６．０）をカラムにアプライすることによって溶出を行った。手順を表Ｂに詳しく示す。

【0461】

カチオン交換体（ＣＥＸ）に対する適切な結合特性を全てのＡＡＶサブタイプに与えるために、３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）への溶出物のバッファー交換を、ＶＩＶＡＣＥＬＬ１００（１０Ｋ）カートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実施した。

【0462】

以下の試験手順を行った。本実施例で開示されるバッファーは全て室温で作られ、全てのバッファーのｐＨは室温で測定されたことに留意されたい。まず、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓカチオン交換体樹脂（カタログ１．２００７８；Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れた、ベッド高さ１００ｍｍ、面積０．９５ｃｍ^２、及び体積およそ９．５ｍｌの内径１１ｍｍのカラムを、１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）を含む５カラム容量のバッファーで平衡化（活性化）した。次いで、カラムを少なくとも５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で平衡化した。ロード（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）でコンディショニングしたＡＡＶ）を、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓカチオン交換体樹脂を入れたカラムにアプライした。

【0463】

次いで、カラムを５カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【0464】

次いで、溶出には、グラジエント溶出を実施した。グラジエントは、４０カラム容量の３０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）から２００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。ポストエリューションを１０カラム容量の１０００ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ 酢酸カルシウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）で実施した。

【0465】

全てのステップについて、直線流速は、６０ｃｍ／時であった。

【0466】

バッファーの組成を表２７にまとめる。

【表27】

【0467】

表２８は、ＣＥＸ分離のためのクロマトグラフィーのスキームを示す。

【表28】

【0468】

表２９は、ｄｄＰＣＲ／ＡＡＶ９：ＡＧの比を示す。

【表29】

【0469】

表３０は、ＡＵＣを用いて決定された完全カプシドと空カプシドのパーセンテージを示す。

【表30】

【0470】

結果を図３３～３８に示し、収率を表３１に示す。

【0471】

図３３～３８は、画分の大部分のデータを含むランを示す。ロード（出発物質、ＦＴ＝フロースルー、Ｗ＝洗浄、Ｅ＝溶出液、Ｅ１～Ｅ６＝ピークの画分（クロマトグラム）。ｖｇ／ｃｐ比は、完全カプシドの量が最も多いＡＡＶ（完全カプシド画分）を示す。値が高いほど完全カプシドの量が多い。

【0472】

図３３及び図３４は、ＣＥＸランのクロマトグラムである。再生手順を含む完全なランのデータを含んでいる。ＵＶ２８０ｎｍ、ＵＶ２５４ｎｍ、導電率、ｐＨ、圧力、蛍光及び画分の曲線を示す。Ｘ軸：ＵＶ２８０ｎｍ（左）、導電率（右）、Ｙ軸：体積（ｍｌ）。

【0473】

【表31】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【国際調査報告】