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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】ヒト第ＶＩＩＩ因子の選択的測定
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240910BHJP
G01N 33/86 20060101ALI20240910BHJP
G01N 33/52 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/86
G01N33/52 C
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508710
(86)(22)【出願日】2021-08-20
(85)【翻訳文提出日】2024-02-13
(86)【国際出願番号】 IB2021000578
(87)【国際公開番号】W WO2023021311
(87)【国際公開日】2023-02-23
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100139723
【弁理士】
【氏名又は名称】樋口 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100116540
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 香
(72)【発明者】
【氏名】ウェーバー，アルフレット
(72)【発明者】
【氏名】グリッチェ，ヘルベルト
(72)【発明者】
【氏名】シュレンク，ゲラルド
(72)【発明者】
【氏名】ビルヴァイン，マンフレット
(72)【発明者】
【氏名】エンゲルマイヤー，アンドレア
(72)【発明者】
【氏名】ツラビンガー，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ドチカル，ミヒャエル
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA10
2G045FB03
2G045FB11
2G045FB15
(57)【要約】
ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の選択的かつ感度の高い活性測定のための方法及びキットが本明細書に記載される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するための方法であって、ａ）前記試料を、前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、前記捕捉剤が前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップであって、それによって反応混合物を形成し、前記捕捉剤が、固体支持体に結合している、前記ステップと、
ｂ）前記反応混合物からヒトＦＶＩＩＩの非結合画分を除去するステップと、
ｃ）発色アッセイを使用して、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を測定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項2】
ｄ）ＦＶＩＩＩ参照調製物と比較することによって、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記発色アッセイが、ｃ１）前記反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、前記反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ２）前記反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、前記反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ３）任意に、前記反応混合物に、停止剤を添加して、前記ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止することと、
ｃ４）前記反応混合物から生成された前記シグナルを測定することと、によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記発色基質が、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記停止剤が、酢酸である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ａ２ドメインに選択的に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインに結合しない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記試料が、非ヒト動物由来の血漿及び／または血清を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記非ヒト動物が、実験動物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記非ヒト動物が、ヒツジ、ヤギ、カニクイザル、ウサギ、ラット、アカゲザル、マウス、ブタ、ハムスター、ミニピッグ、またはモルモットである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記試料が、クエン酸血漿を含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記試料が、１つ以上のＦＶＩＩＩ活性模倣剤を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、抗体、抗原結合断片、ペプチド、核酸、または小分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、二重特異性抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記二重特異性抗体が、エミシズマブである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記試料が、ステップａ）の前に希釈される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記試料が、１：１～約１：１００，０００倍希釈される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記試料が、１：２～約１：２０，０００倍希釈される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記試料が、約１：１０倍希釈される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ステップａ）における前記インキュベーションが、室温で約１時間にわたって行われる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ステップｃ１）における前記インキュベーションが、室温で約１５分にわたって行われる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
ステップｃ２）における前記インキュベーションが、室温で約２５分にわたって行われる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の前記除去が、前記固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄することによって行われる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の前記除去が、前記固体支持体をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液で約３回洗浄することによって行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ヒトＦＶＩＩＩが、組換えＦＶＩＩＩである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ヒトＦＶＩＩＩが、全長ＦＶＩＩＩである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ヒトＦＶＩＩＩが、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するためのキットであって、ｉ．前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤であって、前記捕捉剤が、固体支持体に結合している、前記捕捉剤、
ｉｉ．活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンのうちの１つ以上を含む、第１のバイアル、
ｉｉｉ．ＦＸａ特異的発色基質を含む、第２のバイアル、及び／または
ｉｖ．任意に、停止剤を含む、第３のバイアルを含む、前記キット。
【請求項33】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、請求項３２に記載のキット。
【請求項34】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ａ２ドメインに選択的に結合する、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項35】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインに結合しない、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項36】
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項37】
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、請求項３２～３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項39】
前記発色基質が、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、請求項３２～３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項40】
前記停止剤が、酢酸である、請求項３２～３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項41】
反応緩衝液、ＦＶＩＩＩ希釈緩衝液、洗浄緩衝液、及び／またはＦＶＩＩＩ参照調製物のうちの１つ以上を更に含む、請求項３２～４０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、発色ベースアッセイの分野に関し、より具体的には、血漿及び他の流体中の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）凝固促進活性の測定のための発色ベースアッセイに関する。
【背景技術】
【0002】
血漿または他の流体中の治療的に投与される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の凝固促進活性を選択的に測定する能力は、第ＶＩＩＩ因子置換処理アプローチを調査するために不可欠である。ヒトＦＶＩＩＩ薬物候補の試験及び開発、または代替投与経路の評価中、正常レベルの内因性ＦＶＩＩＩを有する動物モデルにおいてそれらを試験することがしばしば必要とされる。しかしながら、ヒトＦＶＩＩＩを定量化し、動物宿主モデルの内因性ＦＶＩＩＩから十分な正確性及び精度で区別することは困難である。内因性非ヒトＦＶＩＩＩの存在は、薬物動態試験分析に潜在的にバイアスをかけ得るだけでなく、特定の製造プロセス関連添加物もまた、アッセイ性能に影響を与え得る。例えば、ウイルス不活性化プロセス中に使用される溶媒／洗剤混合物は、アッセイに干渉し得る。
【0003】
したがって、非ヒトＦＶＩＩＩを含有する動物血漿の存在下、または製造関連添加物の存在下、ヒトＦＶＩＩＩの選択的かつ感度の高い活性測定を可能にするアッセイの必要性は満たされていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の選択的かつ感度の高い活性測定を可能にする方法及びキットが本明細書に記載される。方法は、別の動物由来の内因性ＦＶＩＩＩ及び／または他の製造関連添加剤の存在下でも、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合するＦＶＩＩＩ認識捕捉剤を利用する。
【0005】
一態様において、試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するための方法であって、
ａ）試料を、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、捕捉剤がヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップであって、それによって反応混合物を形成し、捕捉剤が、固体支持体に結合している、ステップと、
ｂ）反応混合物からヒトＦＶＩＩＩの非結合画分を除去するステップと、
ｃ）発色アッセイを使用して、反応混合物中のヒトＦＶＩＩＩの活性を測定するステップと、を含む、方法が本明細書に提供される。
ａ）試料を、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、捕捉剤がヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップであって、それによって反応混合物を形成し、捕捉剤が、固体支持体に結合している、ステップと、
ｂ）反応混合物からヒトＦＶＩＩＩの非結合画分を除去するステップと、
ｃ）発色アッセイを使用して、反応混合物中のヒトＦＶＩＩＩの活性を測定するステップと、を含む、方法が本明細書に提供される。
【0006】
いくつかの実施形態において、方法は、ｄ）ＦＶＩＩＩ参照調製物と比較することによって、反応混合物中のヒトＦＶＩＩＩの活性を決定することを更に含む。
【0007】
いくつかの実施形態において、発色アッセイは、
ｃ１）反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ２）反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ３）任意に、反応混合物に、停止剤を添加して、ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止することと、
ｃ４）反応混合物から生成されたシグナルを測定することと、によって行われる。
ｃ１）反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ２）反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ３）任意に、反応混合物に、停止剤を添加して、ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止することと、
ｃ４）反応混合物から生成されたシグナルを測定することと、によって行われる。
【0008】
いくつかの実施形態において、発色基質は、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。
【0009】
いくつかの実施形態において、停止剤は、酢酸である。
【0010】
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＢドメインに結合しない。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである。
【0011】
いくつかの実施形態において、捕捉抗体は、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである。
【0012】
いくつかの実施形態において、試料は、非ヒト動物由来の血漿及び／または血清を含む。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、実験動物である。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、ヒツジ、ヤギ、カニクイザル、ウサギ、ラット、アカゲザル、マウス、ブタ、ハムスター、ミニピッグ、またはモルモットである。いくつかの実施形態において、試料は、クエン酸血漿を含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、試料は、ステップａ）の前に希釈される。試料は、１：２～約１：２００００倍希釈され得る。一実施形態において、試料は、約１：１０倍希釈される。
【0014】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である。
【0015】
いくつかの実施形態において、ステップａ）におけるインキュベーションは、室温で約１時間行われる。
【0016】
いくつかの実施形態において、ステップｃ１）におけるインキュベーションは、室温で約１５分間行われる。
【0017】
いくつかの実施形態において、ステップｃ２）におけるインキュベーションは、室温で約２５分間行われる。
【0018】
いくつかの実施形態において、ステップｂ）における非結合ヒトＦＶＩＩＩの除去は、固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄することによって行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）における非結合ヒトＦＶＩＩＩの除去は、固体支持体をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液で約３回洗浄することによって行われる。
【0019】
様々な実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、組換えＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。
【0020】
一態様において、試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するためのキットであって、
ｉ．ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤であって、捕捉剤が、固体支持体に結合している、捕捉剤、
ｉｉ．活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンのうちの１つ以上を含む、第１のバイアル、
ｉｉｉ．ＦＸａ特異的発色基質を含む、第２のバイアル、及び／または
ｉｖ．任意に、停止剤を含む、第３のバイアルを含む、キットが本明細書に提供される。
ｉ．ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤であって、捕捉剤が、固体支持体に結合している、捕捉剤、
ｉｉ．活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンのうちの１つ以上を含む、第１のバイアル、
ｉｉｉ．ＦＸａ特異的発色基質を含む、第２のバイアル、及び／または
ｉｖ．任意に、停止剤を含む、第３のバイアルを含む、キットが本明細書に提供される。
【0021】
上述されるキットのいくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する。上述されるキットのいくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに選択的に結合する。上述されるキットのいくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＢドメインに結合しない。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである。いくつかの実施形態において、捕捉抗体は、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである。
【0022】
上述されるキットのいくつかの実施形態において、固体支持体は、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である。いくつかの実施形態において、発色基質は、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、停止剤は、酢酸である。
【0023】
キットのいくつかの実施形態は、反応緩衝液、ＦＶＩＩＩ希釈緩衝液、洗浄緩衝液、及び／またはＦＶＩＩＩ参照調製物のうちの１つ以上を更に含み得る。
【0024】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する、添付の図面は、以下に記載されるいくつかの態様を示す。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】本発明に従う発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの概略図を示す。ＣＨＡ及びｐＮＡは、それぞれ、シクロヘキシルアラニン及びｐ－ニトロフェニルアニリドを表す。
【図2】１８８、９４、及び４７ｍＵ／ｍＬのＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ｒＦＶＩＩＩ濃度について得られたブランク補正光学密度（ＯＤ）を示す。本発明の発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの一実施形態に従って試験された異なる捕捉抗体のｍＩＵ／ｍＬで測定されたＦＶＩＩＩ活性。左から右へ、抗ＦＶＩＩＩ捕捉抗体は、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、ＧＭＡ－０１２、ＥＳＨ－８、ＥＳＨ－４、ＲＦＦ－ＶＩＩＩＣ／８、ＲＦＦ－ＶＩＩＩＣ／５、及びＮ５５１９５Ｍである。
【図3】平均較正曲線及びバックフィットアッセイ較正のそれらの公称値との一致を示す。エラーバーは、平均の単一標準偏差を示す。
【図4】ＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ調製物を使用することによって得られた平均較正曲線及びバックフィットアッセイ較正のそれらの公称値との一致を示す。エラーバーは、平均の単一標準偏差を示す。
【図5】クエン酸動物血漿種にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩ（１００ｍＵ／ｍＬ）について決定された個々の回収率を示す。カラム上部の数字は、スパイクされた１００ｍＵ／ｍＬのパーセントとしての回収率を示す。
【図6】動物血清試料にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩ（１００ｍＵ／ｍＬ）について決定された回収率を示す。カラム上部の数字は、スパイクされた１００ｍＵ／ｍＬのパーセントとしての回収率を示す。
【図7】クエン酸ヤギ、ヒツジ、及びカニクイザル血漿にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。インサートは、緩衝液希釈系列について決定されたもののパーセントとして与えられる、二重対数濃度－応答曲線の相対勾配、及び曲線の対応する決定係数を示す。
【図8】クエン酸ウサギ及びラット血漿ならびにマウス血清にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。インサートは、緩衝液希釈系列について決定されたもののパーセントとして与えられる、二重対数濃度－応答曲線の相対勾配、及び曲線の対応する決定係数を示す。
【図9】クエン酸アカゲザル血漿及びモルモット血清にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。インサートは、緩衝液希釈系列について決定されたもののパーセントとして与えられる、二重対数濃度－応答曲線の相対勾配、及び曲線の対応する決定係数を示す。
【図10】ブタ及びハムスター血清にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。インサートは、緩衝液希釈系列について決定されたもののパーセントとして与えられる、二重対数濃度－応答曲線の相対勾配、及び曲線の対応する決定係数を示す。
【図11】Ａ～Ｄは、経時的なアッセイの中間精度及び頑健性を実証するために、６ヶ月の期間にわたって３人のオペレーターによって実施された、１０８の測定のデータを示す。Ａ及びＢは、それぞれ、全ての個々の値及び３人のオペレーターの値を示す（平均±ＳＤ）一方で、Ｃ及びＤは、ＱＱプロット（Ｃ）及びヒストグラム（Ｄ）の形態でデータを提示する。
【図12】溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）溶液、すなわち、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．３％のポリソルベート８０、及び０．３％の溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）の存在下、１０ＩＵ ヒトＦＶＩＩＩ／ｍＬ、ならびにＰＢＳ緩衝液中の同じＦＶＩＩＩ濃度（＝天然ＦＶＩＩＩ）を含有する試料について得られた濃度－応答曲線を示す。インサートは、天然ＦＶＩＩＩについて決定された勾配のパーセントとして表される、希釈－応答曲線の相対勾配、及びそれらの変動係数を示す。
【図13】溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）溶液、すなわち、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００、０．３％のポリソルベート８０、及び０．３％の溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）の存在下、１ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度、ならびに１０倍低い試料希釈を必要とし、よって抗体ベースＦＶＩＩＩ捕捉中のＳ／Ｄ成分のレベルを著しく増加させる、ＰＢＳ緩衝液中の同じＦＶＩＩＩ濃度（＝天然ＦＶＩＩＩ）を使用して得られた濃度－応答曲線を示す。インサートは、天然ＦＶＩＩＩについて決定された勾配のパーセントとして表される、希釈－応答曲線の相対勾配、及びそれらの変動係数を示す。
【図14】Ｓ／Ｄ溶液中の３つのレベルのヒトＦＶＩＩＩ（１０、１、及び０．１ＩＵ／ｍＬ）及びＳ／Ｄ溶液の個々の成分の回収率を示す。
【図15】Ｓ／Ｄウイルス不活性化溶液の個々の成分の存在下でのアッセイ性能を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本出願は、とりわけ、試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の凝固促進活性を測定するための方法及びキットを提供する。以下の実施例セクションにおいて実証されるように、本発明者らは、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の凝固促進活性が、（従来のアッセイと同様に）溶液中ではないが、捕捉され、よって精製されたヒトＦＶＩＩＩで実施される、ヒトＦＶＩＩＩの選択的捕捉、続いてＦＶＩＩＩ活性についての発色アッセイを組み合わせることによって、内因性ＦＶＩＩＩを含有する動物血漿マトリックス中で選択的に測定することができるかを調査した。方法は、ＦＶＩＩＩ産物が動物中に存在する内因性ＦＶＩＩＩに加えて投与されるエクスビボ血漿試験にも使用することができる。更に、アッセイは、ＦＶＩＩＩ測定がアッセイ干渉のために実行可能ではない場合がある、製造関連マトリックスに使用することができる。最後に、臨床環境では、アッセイは、二重特異性抗体のような、ＦＶＩＩＩ活性模倣剤の存在下、これらの薬剤の干渉なしに、ヒトＦＶＩＩＩの測定を可能にすることができる。
【0027】
一態様において、試料中のヒト凝固ＦＶＩＩＩの活性を測定するための方法が本明細書に提供される。方法のステップは、ａ）試料を、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、捕捉剤がヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることであって、それによって反応混合物を形成し、捕捉剤が、固体支持体に結合している、インキュベートすること、及びｂ）反応混合物から非結合ヒトＦＶＩＩＩを除去すること、ｃ）活性アッセイを使用して、反応混合物中のヒトＦＶＩＩＩの活性を測定することのうちの１つ以上を含むことができる。
【0028】
いくつかの実施形態において、方法は、ｄ）ＦＶＩＩＩ参照調製物と比較することによって、反応混合物中のヒトＦＶＩＩＩの活性を決定するステップを更に含むことができる。
【0029】
本明細書の態様は、捕捉剤を開示する。捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩ、またはヒトＦＶＩＩＩ上に存在するか、そうでなければヒトＦＶＩＩＩと会合する標的部位への選択的または実質的に選択的な（すなわち、限られた交差反応性を有する）結合が可能である任意の分子を指す。本明細書で使用される場合、「選択的に」という用語は、独自の効果もしくは影響を有すること、または１つの方法のみで、もしくは１つの標的のみと反応することを指す。本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」という用語は、捕捉剤に関して行われる場合、薬剤がヒトＦＶＩＩＩまたは他の動物由来のＦＶＩＩＩ上の非標的部位と実質的に交差反応しないような、ヒトＦＶＩＩＩまたはヒトＦＶＩＩＩ上に存在する示された標的部位への捕捉剤の区別的結合を指す。ヒトＦＶＩＩＩ、またはヒトＦＶＩＩＩ上に存在するか、もしくはそうでなければヒトＦＶＩＩＩと会合する標的部位に選択的に結合することができる任意の捕捉剤は、本明細書に開示される方法で使用され得る。捕捉剤は、一般に、単一の特異性を有するが、２つ以上の標的部位について複数の特異性を有する捕捉剤が使用され得る。捕捉剤の非限定的な例としては、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマー）、合成ペプチド、結合分子、核酸、及びヒトＦＶＩＩＩを特異的に捕捉することができ、好ましくは活性アッセイに干渉しない、例えば、ＦＩＸａ媒介性ＦＸａ生成のための補因子としてのＦＶＩＩＩの役割に干渉しない、他のアフィニティリガンドが挙げられる。
【0030】
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩのＢドメインに結合しない。
【0031】
捕捉剤の選択的結合は、例えば、結合アフィニティ、結合特異性、及び結合アビディティなどの、結合特性を含むことができる。結合アフィニティは、捕捉剤がその結合部位または部分に存在する時間の長さを指し、捕捉剤がその結合部位または部分に結合する強度として見ることができる。結合アフィニティは、平衡で比Ｋｄ／Ｋａとして定義される、捕捉剤の平衡解離定数（ＫＤ）を説明することができ、Ｋａは、捕捉剤の会合速度定数であり、Ｋｄは、捕捉剤の解離速度定数である。結合アフィニティは、会合及び解離の両方によって決定され、単独では、高い会合も低い解離も、高いアフィニティを確保することはできない。会合速度定数（Ｋａ）、またはオンレート定数（Ｋｏｎ）は、単位時間当たりの結合事象の数、または捕捉剤及びその結合部位もしくは部分がその薬剤－部分複合体に可逆的に会合する傾向を測定する。会合速度定数は、Ｍ－１ｓ－１で表され、次のように記号化される：［ＣＡ］×［ＢＳ］×Ｋｏｎ。会合速度定数が大きいほど、捕捉剤がその結合部位もしくは部分により急速に結合するか、または捕捉剤とその結合部位もしくは部分との間の結合アフィニティが高い。解離速度定数（Ｋｄ）、またはオフレート定数（Ｋｏｆｆ）は、その成分分子、すなわち、捕捉剤及びその結合部位または部分に可逆的に分離（解離）する薬剤－部分複合体の単位時間当たりの解離事象の数を測定する。解離速度定数は、ｓ－１で表され、次のように記号化される：［ＣＡ＋ＢＳ］×Ｋｏｆｆ。解離速度定数が小さいほど、捕捉剤がその結合部位もしくは部分により密接に結合するか、または捕捉剤とその結合部位もしくは部分との間の結合アフィニティが高い。平衡解離定数（ＫＤ）は、新しい薬剤－部分複合体が形成される速度が、薬剤－部分複合体が平衡で解離する速度と等しいと測定する。平衡解離定数は、Ｍで表され、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ＝［ＣＡ］×［ＢＳ］／［ＣＡ＋ＢＳ］として定義され、［ＣＡ］は、捕捉剤のモル濃度であり、［ＢＳ］は、結合部位または部分のモル濃度であり、［ＣＡ＋ＢＳ］は、薬剤－部分複合体のモル濃度であり、全ての濃度は、システムが平衡にあるときのそのような成分のものである。平衡解離定数が小さいほど、捕捉剤がその結合部位もしくは部分により密接に結合するか、または捕捉剤とその結合部位もしくは部分との間の結合アフィニティが高い。
【0032】
一実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、１×１０５Ｍ－１ｓ－１未満、１×１０６Ｍ－１ｓ－１未満、１×１０７Ｍ－１ｓ－１未満、または１×１０８Ｍ－１ｓ－１未満の会合速度定数を有し得る。別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、１×１０５Ｍ－１ｓ－１超、１×１０６Ｍ－１ｓ－１超、１×１０７Ｍ－１ｓ－１超、または１×１０８Ｍ－１ｓ－１超の会合速度定数を有し得る。他の態様において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、１×１０５Ｍ－１ｓ－１～１×１０８Ｍ－１ｓ－１、１×１０６Ｍ－１ｓ－１～１×１０８Ｍ－１ｓ－１、１×１０５Ｍ－１ｓ－１～１×１０７Ｍ－１ｓ－１、または１×１０６Ｍ－１ｓ－１～１×１０７Ｍ－１ｓ－１の会合速度定数を有し得る。
【0033】
別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、１×１０－３ｓ－１未満、１×１０－４ｓ－１未満、または１×１０－５ｓ－１未満の解離速度定数を有し得る。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、１．０×１０－４ｓ－１未満、２．０×１０－４ｓ－１未満、３．０×１０４ｓ－１未満、４．０×１０－４ｓ－１未満、５．０×１０－４ｓ－１未満、６．０×１０－４ｓ－１未満、７．０×１０－４ｓ－１未満、８．０×１０－４ｓ－１未満、または９．０×１０－４ｓ－１未満の解離速度定数を有し得る。別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、１×１０－３ｓ－１超、１×１０－４ｓ－１超、または１×１０－５ｓ－１超の解離速度定数を有し得る。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、１．０×１０－４ｓ－１超、２．０×１０－４ｓ－１超、３．０×１０－４ｓ－１超、４．０×１０－４ｓ－１超、５．０×１０－４ｓ－１超、６．０×１０－４ｓ－１超、７．０×１０－４ｓ－１超、８．０×１０－４ｓ－１超、または９．０×１０－４ｓ－１超の解離速度定数を有し得る。
【0034】
別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、５０ｎＭ未満または約５０ｎＭの平衡解離定数を有し得る。この実施形態の態様において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、５０ｎＭ未満もしくは約５０ｎＭ、２０ｎＭ未満もしくは約２０ｎＭ、１０ｎＭ未満もしくは約１０ｎＭ、５ｎＭ未満もしくは約５ｎＭ、２ｎＭ未満もしくは約２ｎＭ、１ｎＭ未満もしくは約１ｎＭ、０．５ｎＭ未満もしくは約０．５ｎＭ、０．４５ｎＭ未満もしくは約０．４５ｎＭ、０．４ｎＭ未満もしくは約０．４ｎＭ、０．３５ｎＭ未満もしくは約０．３５ｎＭ、０．３ｎＭ未満もしくは約０．３ｎＭ、０．２５ｎＭ未満もしくは約０．２５ｎＭ、０．２ｎＭ未満もしくは約０．２ｎＭ、０．１５ｎＭ未満もしくは約０．１５ｎＭ、０．１ｎＭ未満もしくは約０．１ｎＭ、または０．０５ｎＭ未満もしくは約０．０５ｎＭの平衡解離定数を有し得る。別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、０．５ｎＭ超の平衡解離定数を有し得る。この実施形態の態様において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、０．５ｎＭ超、０．４５ｎＭ超、０．４ｎＭ超、０．３５ｎＭ超、０．３ｎＭ超、０．２５ｎＭ超、０．２ｎＭ超、０．１５ｎＭ超、０．１ｎＭ超、または０．０５ｎＭ超の平衡解離定数を有し得る。
【0035】
更に別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、１×１００Ｍ－１ｓ－１未満、１×１０１Ｍ－１ｓ－１未満、１×１０２Ｍ－１ｓ－１未満、１×１０３Ｍ－１ｓ－１未満、または１×１０４Ｍ－１ｓ－１未満の、ヒト以外の動物由来のＦＶＩＩＩについての会合速度定数を有し得る。別の実施形態において、本明細書に開示される捕捉剤の結合アフィニティは、例えば、最大１×１００Ｍ－１ｓ－１、最大１×１０１Ｍ－１ｓ－１、最大１×１０２Ｍ－１ｓ－１、最大１×１０３Ｍ－１ｓ－１、または最大１×１０４Ｍ－１ｓ－１の、ヒト以外の動物由来のＦＶＩＩＩについての会合速度定数を有し得る。
【0036】
結合特異性は、その結合部位または部分を含有する分子と、その結合部位または部分を含有しない分子とを区別する捕捉剤の能力である。結合特異性を測定する１つの方法は、その結合部位または部分を含有する分子についての捕捉剤のＫｏｎ会合速度を、その結合部位または部分を含有しない分子についての捕捉剤のＫｏｎ会合速度に対して比較することである。例えば、ヒトＦＶＩＩＩについての捕捉剤の会合速度定数（Ｋａ）を、他の動物由来のＦＶＩＩＩに対して比較すること。この実施形態の態様において、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤は、他の動物由来のＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）に対して、例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも９倍である、ヒトＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施形態の更なる態様において、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤は、他の動物由来のＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）に対して、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍である、ヒトＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施形態のまた他の態様において、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤は、他の動物由来のＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）に対して、例えば、多くとも１倍、多くとも２倍、多くとも３倍、多くとも４倍、多くとも５倍、多くとも６倍、多くとも７倍、多くとも８倍、または多くとも９倍である、ヒトＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）を有する。この実施形態のまた他の態様において、ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤は、他の動物由来のＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）に対して、例えば、多くとも１０倍、多くとも１００倍、多くとも１，０００倍、または多くとも１０，０００倍である、ヒトＦＶＩＩＩについての会合速度定数（Ｋａ）を有する。
【0037】
捕捉剤の結合特異性はまた、他の動物由来のＦＶＩＩＩに対するヒトＦＶＩＩＩの結合特異性比として特徴付けることができる。この実施形態の態様において、捕捉剤は、例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６４：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、または少なくとも４０：１の、他の動物由来のＦＶＩＩＩに対するヒトＦＶＩＩＩについての結合特異性比を有する。この実施形態のまた他の態様において、捕捉剤は、例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、または少なくとも４０：１の、他の動物由来のＦＶＩＩＩに対するヒトＦＶＩＩＩについての結合特異性比を有する。この実施形態の更に他の態様において、捕捉剤は、例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６４：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、または少なくとも４０：１の、他の動物由来のＦＶＩＩＩに対するヒトＦＶＩＩＩについての結合特異性比を有する。
【0038】
機能アフィニティとしても知られる、結合アビディティは、多価捕捉剤とその結合部位または部分との間の機能結合強度の合計を指す。捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩ上に２つ以上の結合部位を有することができる。捕捉剤の結合アビディティは、個々の捕捉剤結合部位の結合アフィニティに依存するが、捕捉剤が完全に解離するためには、全ての薬剤結合部位相互作用が同時に破壊されなければならないため、結合アビディティは、結合アフィニティよりも大きい。捕捉剤は、その捕捉剤の任意の及び全ての結合部位または部分に選択的に結合することができることが想定される。
【0039】
典型的には、捕捉剤は、ヒトＦＶＩＩＩを他の動物由来のＦＶＩＩＩから区別することができる。他の動物由来のＦＶＩＩＩは、試料中に存在し得るが、他の動物由来のＦＶＩＩＩが、捕捉に必要な結合部位を欠くか、またはヒトＦＶＩＩＩに対して捕捉剤へのはるかに弱い結合アフィニティを有するため、本明細書に開示される捕捉剤に選択的に結合しないであろう。他の動物由来のＦＶＩＩＩの１つの非限定的な例は、試料が直接採取されるか、または由来する動物のゲノムから発現される天然発生または内因性ＦＶＩＩＩである。他の動物由来のＦＶＩＩＩの更に別の非限定的な例は、ヒトＦＶＩＩＩを発現するために使用される細胞培養株の細胞から発現されるＦＶＩＩＩである。
【0040】
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、抗体、または抗体断片である。抗体は、その抗原に特異的に結合する特定の抗原に応答して作製された免疫系によって生成された分子を指し、天然発生抗体及び非天然発生抗体の両方を含む。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二量体、多量体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム［（ｓｃＦｖ）２断片］など、多重特異性抗体、多価抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、Ｉｇ受容体のような細胞関連抗体、線状抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ミニボディ、または断片が所望の生物活性を示す限り、その誘導体もしくは類似体、及びその一本鎖誘導体であり得る。抗体は、ＶＨ及びＶＬドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む全長免疫グロブリン分子、または全長免疫グロブリン分子の免疫活性断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｆｃ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などであり得る。抗体は、任意の脊椎動物種（例えば、ヒト、ヤギ、ウマ、ロバ、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ）に由来し得、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、またはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。
【0041】
本明細書に開示される方法を実施するのに有用な抗体は、市販されているか、または当該技術分野で周知の方法に従って生成することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって生成することができる。抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介して生成することができるか、または組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、Ｆａｂ’断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ′）２は、Ｆ（ａｂ′）２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成することができる。別のアプローチによれば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技法は、当業者には明らかである。
【0042】
一実施形態において、捕捉抗体は、ＧＭＡ－８０２４、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである。
【0043】
一実施形態において、捕捉抗体は、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである。
【0044】
一実施形態において、捕捉抗体は、ＧＭＡ－０１２、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである。
【0045】
捕捉剤は、捕捉剤がヒトＦＶＩＩＩを特異的に捕捉することができ、好ましくは、活性アッセイに干渉しない、例えば、ＦＩＸａ媒介性ＦＸａ生成のための補因子としてのＦＶＩＩＩの役割に干渉しない限り、他の形態（例えば、アフィボディ、アプタマー、合成ペプチド）をとり得る。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、アフィボディである。アフィボディ分子は、標的タンパク質への特異的なアフィニティを有する、小さい非常に頑健なタンパク質である。それらは通常、３ヘリックスバンドルドメインフレームワークに基づいて設計される。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、アプタマーである。アプタマーは、高いアフィニティ及び特異性でそれらの標的と結合することができる構造化核酸分子である。アプタマーは、ヘリックス及び一本鎖ループを形成するそれらの傾向のため、様々な形状を想定することができる。
【0046】
本明細書に開示される捕捉剤は、捕捉剤のための支持体としての固相に結合され得る。本明細書で使用される場合、「固相支持体」という用語は、「固体支持体」または「固相」と同義であり、本明細書で開示される捕捉剤を固定化するために使用することができる任意のマトリックスを指す。固相は、捕捉剤に結合するのに十分な表面アフィニティを有する任意の好適な材料を使用して構築され得る。選択された固相支持体は、それを可溶性または非結合材料から容易に分離可能にし、一般に、例えば、過剰な試薬、反応副産物、または溶媒などの、非結合材料が固相支持体結合アッセイ成分から分離またはそうでなければ（例えば、洗浄、濾過、遠心分離などによって）除去されることを可能にする物理的特性を有することができる。固相支持体を作製し、使用する方法の非限定的な例は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，上記，（２００１）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，上記，（２００４）に記載されており、これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0047】
有用な固体支持体としては、天然ポリマー炭水化物及びそれらの合成修飾、架橋、または置換誘導体、例えば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーガム、デキストラン、ジアゾセルロース、炭水化物、デンプン、セルロースエステル、特に硝酸及びカルボン酸を含むもの、混合セルロースエステル、ならびにセルロースエーテル；窒素を含有する天然ポリマー、例えば、架橋または修飾ゼラチンを含む、タンパク質及び誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えば、ラテックス及びゴム；合成ポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアセテート及びその部分加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレートを含む、ビニルポリマー、上記ポリ縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミド、及び他のポリマー、例えば、ポリウレタンまたはポリエポキシド；無機材料、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ及びアルカリ土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩を含む、アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩；ならびにアルミニウムまたはケイ素酸化物または水和物、例えば、クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、またはガラス（これらの材料は、上記ポリマー材料とフィルターとして使用することができる）；ならびに上記のクラスの混合物またはコポリマー、例えば、既存の天然ポリマー上での合成ポリマーの重合を開始することによって得られるグラフトコポリマーが挙げられる。ニトロセルロース及びナイロンも使用することができる。これらの材料の全ては、フィルム、シート、チューブ、カラム；ピンまたは「ディップスティック」；磁性粒子、微粒子、ミクロ粒子、ビーズ、またはプレートなどの、好適な形状で使用することができ、またはそれらは、紙、ガラス、プラスチックフィルム、織物などのような、適切な不活性担体上にコーティング、結合、または積層することができる。
【0048】
あるいは、固体支持体は、ミクロ粒子を構成することができる。適切なミクロ粒子としては、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、または同様の材料で構成されるものが挙げられる。更に、ミクロ粒子は、磁場内でのミクロ粒子の操作を促進するために、磁性または常磁性ミクロ粒子であり得る。ミクロ粒子は、可溶性試薬及び生体試料の混合物中に懸濁することができ、または支持体材料によって保持及び固定化することができる。後者の場合では、支持体材料上または支持体材料中のミクロ粒子は、支持体材料内の他の位置への実質的な移動が可能ではない。あるいは、ミクロ粒子は、沈降または遠心分離によって、可溶性試薬及び生体試料の混合物中の懸濁液から分離することができる。ミクロ粒子が磁性または常磁性であるとき、ミクロ粒子は、磁場によって可溶性試薬及び生体試料の混合物中の懸濁液から分離することができる。
【0049】
捕捉剤は、吸着によって固体支持体に結合され得、疎水性力によって保持される。あるいは、固体支持体の表面は、捕捉剤の支持体への共有結合を引き起こす化学プロセスによって活性化され得る。捕捉剤は、イオン捕捉によって固相に結合され得、荷電ポリマーによって保持される。
【0050】
本明細書に開示されるインキュベーションステップ後、非結合ヒトＦＶＩＩＩ、非ヒトＦＶＩＩＩ、及び／または後続活性アッセイに干渉し得る他の薬剤を含む、任意の非結合成分を混合物から除去するために、洗浄ステップが行われ得る。洗浄は、捕捉剤及び捕捉されたヒトＦＶＩＩＩを含有する固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄することによって行われ得る。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ緩衝液と称される）を含む。一実施形態において、洗浄緩衝液は、ＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含む。別の実施形態において、洗浄緩衝液は、ＰＢＳ及び約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含む。洗浄は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回を超えて行われ得る。一実施形態において、洗浄は、３回行われる。
【0051】
本明細書に開示されるヒトＦＶＩＩＩの活性の存在または測定の検出は、限定なしに、インビトロアッセイ、細胞ベースアッセイ、またはインビボアッセイを含む、監視されているヒトＦＶＩＩＩの存在またはそれと関連する活性を示す特徴を定性的または定量的に測定することができる任意のアッセイによって達成することができる。アッセイは、非特異的ポリペプチドアッセイ、例えば、ＵＶ吸収アッセイもしくは化学ベースアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイもしくはビウレットアッセイのようなものなど、または特異的ポリペプチドアッセイ、例えば、発色アッセイ、比色アッセイ、クロノメトリックアッセイ、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、蛍光発生アッセイ、共鳴エネルギー移動アッセイ、平面分極アッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、免疫ベースアッセイ、もしくは活性アッセイ、酵素活性、阻害活性、凝固活性、もしくは重合活性のようなものなどであり得る。ヒトＦＶＩＩＩの特徴を検出するために、またはヒトＦＶＩＩＩ活性を測定するために使用される実際のアッセイは、限定なしに、存在するヒトＦＶＩＩＩの量、アッセイされている特徴、及び当業者の選好性を含む、因子を考慮に入れることによって、当業者によって決定することができる。本明細書に開示されるヒトＦＶＩＩＩの存在または活性を検出することは、シングルプレックスまたはマルチプレックスで実施することができる。
【0052】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、発色アッセイを用いる。発色アッセイは、典型的には、特定のオリゴペプチドまたはポリペプチド部分及び発色団（色素担体）で構成され、通常、プロテアーゼ活性を有する因子を決定するために、例えば、血液及び血漿試料中の凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）を決定するために使用されるペプチド基質を使用する。初期は無色である、発色ペプチド基質は、試料中に存在するヒトＦＶＩＩＩの量及び／または活性に依存して切断され、それによって発色団を放出する。切断は、未切断基材の光学特性とは異なり、分光光度測定によって測定することができる、産物の光学特性を変化させる。ペプチド基質に結合することができる発色基の非限定的な例としては、パラ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）、７－アミノ－４－メトキシクマリン（ＡＮＣ）、キノニルアミド（ＱＵＡ）、５－アミノイソフタル酸ジメチル（ＤＰＡ）、及びそれらの誘導体が挙げられる。蛍光発生基質には、限定なしに、Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ［Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル、ＡＭＣ＝７－アミノ－４－メチルクマリン］、ホモバニリン酸、４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル酢酸、還元フェノキサジン、還元ベンゾチアジン、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造的バリアント（それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，１４８号、同第５，２４２，８０５号、同第５，３６２，６２８号、同第５，５７６，４２４号、及び同第５，７７３，２３６号）、４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、ならびにフッ素化クマリンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３０，９１２号）が含まれる。
【0053】
非限定的な活性アッセイは、血液凝固カスケードに基づいてＦＶＩＩＩ活性を測定するために使用される発色アッセイである。このアッセイでは、トロンビン活性化第ＶＩＩＩ因子は、第ＩＸａ因子と複合体を形成し、この複合体は、その後、第Ｘ因子を活性化する。活性化第Ｘ因子活性は、ｐ－ニトロ－アニリン（ｐＮＡ）のような発色基を解放する発色基質の加水分解によってアクセスすることができる。ｄＯＤにおいて４０５ｎｍで測定される１分当たりの吸光度の変化によって決定される、ｐＮＡ放出の初期速度は、第Ｘａ因子活性に、その後、試料中のＦＶＩＩＩ活性に比例している。過剰な第ＩＸａ因子、及び第Ｘ因子を使用することによって、第Ｘ因子の活性化の速度は、試料中に存在するトロンビン切断第ＶＩＩＩ因子の量にのみ比例している。
【0054】
いくつかの実施形態において、発色アッセイは、反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップ、反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップ、任意に、反応混合物に、停止剤を添加して、ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止するステップ、ならびに反応混合物から生成されたシグナルを測定するステップの１つ以上を含むことができる。
【0055】
活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを含む発色アッセイの試薬は、任意の順序で添加され得る。いくつかの実施形態において、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを含む発色アッセイの試薬が段階的に添加される。例えば、ＦＶＩＩＩが活性化されて、活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）を形成することを可能にするために、トロンビンがまず添加され得る。活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）は、ＦＶＩＩＩａがＦＸ及びＦＩＸａとテナーゼ複合体を形成することを可能にするために、その後かつ過剰に添加され、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）の生成をもたらし得る。代替的な実施形態において、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを含む発色アッセイの試薬が同時に添加される。いくつかの実施形態において、トロンビンは、プロトロンビンとして供給され得る。試薬は、任意の供給源、例えば、ヒトまたは動物（主にウシ供給源）のものであり得る。
【0056】
ＦＸａ特異的発色基質は、ＦＸａについての選択性を有する任意の基質であり、本明細書に記載されるものなどの発色基を有し得る。一実施形態において、発色基質は、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。発色基質溶液はまた、合成トロンビン阻害剤を含有し得る。
【0057】
ＦＸａ特異的発色基質が添加された後、反応に続いて、動力学的測定のための発色現像（吸光度増加）の連続的な読み取り、またはエンドポイント測定のための所定の時間後に発色現像を停止することが行われ得る。後者について、停止剤が使用され得る。
【0058】
いくつかの実施形態において、停止剤は、酢酸である。一実施形態において、停止剤は、約２０％の酢酸である。他の実施形態において、停止剤は、約５％、約１０％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３５％、約４０％の酢酸である。
【0059】
特定の実施形態において、選択的発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイは、マイクロプレートのウェル上に固定される抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体によってヒトＦＶＩＩＩを特異的に捕捉することに基づく（図１）。インキュベーション後、後続の洗浄ステップは、動物ＦＶＩＩＩを含む、任意の非結合成分を除去する。次いで、活性化ＦＩＸａ（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウム、リン脂質、及びトロンビンを含む、ＦＶＩＩＩについての発色アッセイの試薬が添加され、活性化因子ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）がＦＩＸａ媒介性ＦＸａ生成のための補因子として作用することを可能にする。最後に、アッセイ中に生成された活性化ＦＸ（ＦＸａ）は、ＦＸａについての特定の基質によって検出される。ＦＶＩＩＩ発色活性は、ＦＶＩＩＩ参照調製物との比較によって決定される。
【0060】
本開示の態様は、部分的に、本明細書に開示されるヒトＦＶＩＩＩを含む試料を含む。試料は、本明細書に開示されるヒトＦＶＩＩＩの存在または活性について試験される任意の材料であり得る。限定なしに、精製、部分精製、または未精製ヒトＦＶＩＩＩ；製剤化ヒトＦＶＩＩＩ産物；例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物源からの粗製、分画もしくは部分精製、または精製細胞溶解物；ならびに細胞、組織、または臓器試料を含む、様々な試料を、本明細書に開示される方法に従ってアッセイすることができる。試料は、例えば、ヒト、トリ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ネコ、ラット、イヌ、またはヒツジなどの、昆虫または哺乳動物を含むが、これらに限定されない、任意の対象個体由来であり得る。いくつかの実施形態において、試料は、非ヒト動物から得られる。いくつかの実施形態において、試料は、ヒツジ、ヤギ、カニクイザル、ウサギ、ラット、アカゲザル、マウス、ブタ、ハムスター、ミニブタ、及びモルモットを含むが、これらに限定されない、実験動物から得られる。
【0061】
この実施形態の一態様において、試料は、ヒトＦＶＩＩＩを含有するか、または潜在的に含有する生体試料であり得る。生体試料は、個体から直接採取された任意の細胞、組織、または臓器試料を含むことができる。生体試料はまた、限定なしに、血液、尿、痰、精液、糞便、唾液、胆汁、脳液、鼻腔スワブ、泌尿生殖器スワブ、鼻腔吸引物、脊髄液などを含む、個体から直接採取された任意の体液の試料であり得る。生体試料はまた、限定なしに、血液試料の血漿画分、血液試料の血清画分、または精製プロセスからの溶出液を含む、個体から直接採取された試料に由来する任意の調製物を含むことができる。血液試料は、全血試料、血漿試料、または血清試料などの、血液から採取または誘導される任意の試料を指す。いくつかの実施形態において、試料は、クエン酸血漿試料である。いくつかの実施形態において、試料は、組換えヒトＦＶＩＩＩの製造に使用されるものなどの添加剤を含有し得る。そのような添加剤の非限定的な例は、有効なウイルス不活性化溶液としてしばしば使用され、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．３％のポリソルベート８０、及び０．３％のリン酸トリ－ｎ－ブチル（ｔｎＢＰ）を含有する、溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）溶液である。いくつかの実施形態において、試料は、１つ以上のＦＶＩＩＩ活性模倣剤を含有し得る。ＦＶＩＩＩ活性模倣剤は、従来の方法でのＦＶＩＩＩ測定にバイアスをかけることが知られている。ＦＶＩＩＩ活性模倣剤には、抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原結合断片、ペプチド、核酸、または小分子が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＦＶＩＩＩ活性模倣剤は、エミシズマブなどの、二重特異性抗体である。
【0062】
本明細書に記載される方法は、動物の内因性ＦＶＩＩＩに加えて、動物に投与されるか、または動物血漿に添加されるヒトＦＶＩＩＩの活性を選択的に決定することを可能にすることが想定される。本明細書に記載される方法は、正常なレベルの内因性動物ＦＶＩＩＩの存在下でも、非臨床モデルにおける試験ヒトＦＶＩＩＩ産物の凝固促進活性を特異的に測定することができる。ＦＶＩＩＩ活性を測定する現在利用可能な方法は、ヒトＦＶＩＩＩ（直接添加されるか、または遺伝子移入によって生成されるかにかかわらず）と内因性動物ＦＶＩＩＩとを区別することができず、むしろヒト及び動物凝固因子の両方の活性を測定する場合がある。残念なことに、この測定は、バイアスを導入し得、投与／生成されたＦＶＩＩＩと内因性ＦＶＩＩＩとの間の差がゼロに達する、投与／生成されたヒトＦＶＩＩＩの循環半減期の終わりに更により高くなる。
【0063】
更に、本明細書に記載される方法はまた、例えば、干渉に起因して、分析のために現在利用可能ではない試料マトリックス中のＦＶＩＩＩ活性の測定を可能にすることができる。そのような干渉試料マトリックスの非限定的な例は、血漿由来及び組換えＦＶＩＩＩの製造プロセスに含まれるウイルス不活性化に使用される、溶媒－洗剤（Ｓ／Ｄ）溶液である。しかしながら、できるだけ多くの中間体及び同じ試料タイプにおいてＦＶＩＩＩ活性を決定及び監視することが興味深い。本明細書に記載される方法はまた、溶媒－洗剤溶液及び個々の化合物の存在下での測定を可能にすることができる。
【0064】
試料は、試料内のヒトＦＶＩＩＩまたはその活性の検出可能性を改善する方法で処理され得る。そのような処理は、例えば、試料の粘度を低減、または試料の成分画分を精製し得る。処理の方法は、溶解、希釈、精製、抽出、濾過、蒸留、分離、濃縮、干渉成分の不活性化、及び試薬の添加を含むことができる。加えて、ヒトＦＶＩＩＩを含有する疑いのある固体材料は、それが液体培地を形成するか、またはヒトＦＶＩＩＩを放出するように修飾されると、試験試料として使用され得る。試験の前の生体試料の選択及び前処理は、当該技術分野で周知である。
【0065】
いくつかの実施形態において、試料は、ＦＶＩＩＩ活性が許容されるレベルの正確性及び精度で測定することができるように、インキュベーションステップの前に希釈される。いくつかの実施形態において、試料は、１：１～約１：１００，０００倍希釈される。いくつかの実施形態において、試料は、１：２～約１：２００００倍希釈される。いくつかの実施形態において、試料は、約１：５、約１：１０、約１：２０、約１：４０、約１：８０、約１：１００、約１：１６０、約１：２００、約１：３２０、約１：４００、約１：５００、約１：６４０、約１：８００、約１：１０００、約１：１２８０、約１：１２００、約１：１５００、約１：１６００、約１：１８００、約１：２０００、約１：２４００、約１：２５００、約１：４０００、約１：５０００、約１：８０００、約１：１００００、約１：１２０００、約１：１４０００、約１：１５０００、約１：１６０００、約１：１８０００、または約１：２００００倍希釈される。
【0066】
いくつかの実施形態において、試料は、ＦＶＩＩＩ活性を保存することと適合する希釈緩衝液で希釈され得る。本明細書で使用される例示的な希釈緩衝液は、イミダゾール及びＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、希釈緩衝液は、約１～１０ｇ／Ｌのイミダゾール及び約１～１０ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、７～８のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、希釈緩衝液は、約１、約１．５、約２、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１～３、約２～４、約３～５、約２．５～４．５、約３～６、約４～８、または約５～１０ｇ／Ｌのイミダゾールを含む。いくつかの実施形態において、希釈緩衝液は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．７５、約５．８、約５．８５、約５．９、約５．９５、約６、約６．１、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１～３、約２～４、約３～５、約２．５～４．５、約３～６、約４～８、または約５～１０ｇ／ＬのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、希釈緩衝液は、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、または約８．０のｐＨを有する。一実施形態において、希釈緩衝液は、約３．４ｇ／Ｌのイミダゾール、約５．８５ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、約７．４のｐＨを有する。
【0067】
いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、捕捉剤のヒトＦＶＩＩＩへの選択的結合を可能にする条件下で行われる。いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約２時間、または約３時間にわたって室温で行われる。いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約２時間、または約３時間にわたって３７℃で行われる。いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約２時間、または約３時間にわたって２０℃で行われる。
【0068】
いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、捕捉剤のヒトＦＶＩＩＩへの選択的結合を可能にする条件下で行われる。いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約２時間、約３時間、約２０～３０分、約３０～６０分、約４０～８０分、約６０～９０分、または約１～２時間にわたって室温で行われる。いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約２時間、約３時間、約２０～３０分、約３０～６０分、約４０～８０分、約６０～９０分、または約１～２時間にわたって約３７℃で行われる。いくつかの実施形態において、試料の捕捉剤とのインキュベーションは、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約２時間、約３時間、約２０～３０分、約３０～６０分、約４０～８０分、約６０～９０分、または約１～２時間にわたって約２０℃で行われる。
【0069】
いくつかの実施形態において、発色アッセイの試薬（例えば、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビン）の添加後の反応混合物のインキュベーションは、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、発色アッセイの試薬（例えば、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビン）の添加後の反応混合物のインキュベーションは、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２５分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約１～１０分、約５～１２分、約８～１５分、約１０～２０分、約１５～３０分、または約２０～４０分にわたって室温で行われる。いくつかの実施形態において、発色アッセイの試薬（例えば、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビン）の添加後の反応混合物のインキュベーションは、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２５分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約１～１０分、約５～１２分、約８～１５分、約１０～２０分、約１５～３０分、または約２０～４０分にわたって約３７℃で行われる。いくつかの実施形態において、発色アッセイの試薬（例えば、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビン）の添加後の反応混合物のインキュベーションは、１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２５分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約１～１０分、約５～１２分、約８～１５分、約１０～２０分、約１５～３０分、または約２０～４０分にわたって２０℃で行われる。
【0070】
いくつかの実施形態において、発色アッセイのための反応緩衝液が提供される。本明細書で使用される例示的な反応緩衝液は、約１～１０ｇ／ＬのＴｒｉｓ、約０．１～１０ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、約１０～５０ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ７．５～９を有する。いくつかの実施形態において、反応緩衝液は、約１、約２、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．８５、約５．９、約５．９５、約６、約６．０６、約６．１、約６．１５、約６．２、約６．２５、約６．３、約６．３５、約６．４、約６．４５、約６．５、約６．５５、約６．６、約６．６５、約６．７、約６．７５、約６．８、約６．８５、約６．９、約７、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約９、約１０、または約２～４、約３～８、約４～７、約６～７、約５～８、もしくは約６～９ｇ／ＬのＴｒｉｓを含む。いくつかの実施形態において、反応緩衝液は、約０．１、約０．５、約１、約２、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．７５、約２．８、約２．８５、約２．９、約２．９５、約３、約３．０３、約３．０５、約３．１、約３．１５、約３．２、約３．２５、約３．３、約３．３５、約３．４、約３．４５、約３．５、約３．５５、約３．６、約３．６５、約３．７、約３．７５、約３．８、約３．８５、約３．９、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約０．１～４、約１～５、約２～４、約３～４、約３～５、約４～６、または約５～８ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態において、反応緩衝液は、約１０、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３７、約４０、約４５、約５０、約１０～２０、約１５～２５、約２０～４０、約２０～３０、または約３０～５０ｇ／ＬのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、希釈緩衝液は、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＨを有する。一実施形態において、反応緩衝液は、約６．０６ｇ／ＬのＴｒｉｓ、約３．０３ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、約２５ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、約８．３のｐＨを有する。
【0071】
いくつかの実施形態において、ＦＸａ特異的発色基質（例えば、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）の添加後の反応混合物のインキュベーションは、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、ＦＸａ特異的発色基質の添加後の反応混合物のインキュベーションは、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約１～１０分、約５～１５分、約１０～２０分、約１５～３０分、約２０～４０分、または約２５～５０分にわたって室温で行われる。いくつかの実施形態において、ＦＸａ特異的発色基質の添加後の反応混合物のインキュベーションは、５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約１～１０分、約５～１５分、約１０～２０分、約１５～３０分、約２０～４０分、または約２５～５０分にわたって３７℃で行われる。いくつかの実施形態において、ＦＸａ特異的発色基質の添加後の反応混合物のインキュベーションは、５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約１～１０分、約５～１５分、約１０～２０分、約１５～３０分、約２０～４０分、または約２５～５０分にわたって約２０℃で行われる。発色基質からのシグナル生成を停止するために、停止剤（例えば、酢酸）が添加され得る。
【0072】
様々な実施形態において、検出されているヒトＦＶＩＩＩは、組換えＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、野生型ヒトＦＶＩＩＩと比較して１つ以上の変異を含む修飾ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失に加えて、野生型ヒトＦＶＩＩＩと比較して１つ以上の変異を含む修飾Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、組換えＦＶＩＩＩ融合タンパク質である。
【0073】
本明細書に開示される方法は、例えば、正確性、精度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、範囲、特異性、選択性、直線性、堅牢性、及びシステム好適性を含む、いくつかのパラメータによって評価され得る。方法の正確性は、分析方法の正確さの尺度、または測定値と、従来の真の値もしくは許容される参照値として許容される値との間の一致の近さである。方法の精度は、手順が均質な試料の複数のサンプリングに繰り返し適用されるとき、個々の試験結果間の一致の程度である。そのようなものとして、精度は、１）アッセイ内変動性、２）日内変動性（繰り返し性）、及び３）日間変動性（中間精度）、ならびに４）ラボ間変動性（再現性）を評価する。変動係数（ＣＶ％）は、観測値または理論平均値に対して表される精度の定量的尺度である。
【0074】
本明細書に開示される方法は、バックグラウンドにかけて、ヒトＦＶＩＩＩの存在または活性を検出することができるべきである。方法の検出限界（ＬＯＤ）は、陰性対照またはブランクとは顕著に異なるシグナルを生じさせるヒトＦＶＩＩＩの濃度を指し、バックグラウンドと区別することができるヒトＦＶＩＩＩの最も低い濃度を表す。
【0075】
よって、一実施形態において、本明細書に開示される方法は、陰性対照またはブランクとは顕著に異なる量でヒトＦＶＩＩＩのＬＯＤを検出することができる。この実施形態の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更なる態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、０．９ｐｇ以下、０．８ｐｇ以下、０．７ｐｇ以下、０．６ｐｇ以下、０．５ｐｇ以下、０．４ｐｇ以下、０．３ｐｇ以下、０．２ｐｇ以下、０．１ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。
この実施形態の別の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または１ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０００ｆＭ以下、９００ｆＭ以下、８００ｆＭ以下、７００ｆＭ以下、６００ｆＭ以下、５００ｆＭ以下、４００ｆＭ以下、３００ｆＭ以下、２００ｆＭ以下、または１００ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下、または１０ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｆＭ以下、９ｆＭ以下、８ｆＭ以下、７ｆＭ以下、６ｆＭ以下、５ｆＭ以下、４ｆＭ以下、３ｆＭ以下、２ｆＭ以下、または１ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。
この実施形態の別の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または１ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０００ｆＭ以下、９００ｆＭ以下、８００ｆＭ以下、７００ｆＭ以下、６００ｆＭ以下、５００ｆＭ以下、４００ｆＭ以下、３００ｆＭ以下、２００ｆＭ以下、または１００ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下、または１０ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｆＭ以下、９ｆＭ以下、８ｆＭ以下、７ｆＭ以下、６ｆＭ以下、５ｆＭ以下、４ｆＭ以下、３ｆＭ以下、２ｆＭ以下、または１ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＤを有する。
【0076】
定量限界（ＬＯＱ）は、許容されるレベルの正確性及び精度で測定することができる試料または検体中のヒトＦＶＩＩＩの最も低い及び最も高い濃度である。定量下限は、検出方法がバックグラウンドから一貫して測定することができる最も低い用量を指す。定量上限は、検出方法がシグナルの飽和が生じる前に一貫して測定することができる最も高い用量である。方法の直線範囲は、定量下限と上限との間の面積である。直線範囲は、定量の上限から定量の下限を差し引くことによって計算される。本明細書で使用される場合、「下方漸近線のためのシグナル対ノイズ比」という用語は、バックグラウンドシグナルで割った検出下限で方法において検出されたシグナルを指す。本明細書で使用される場合、「上方漸近線のためのシグナル対ノイズ比」という用語は、バックグラウンドシグナルで割った検出上限で方法において検出されたシグナルを指す。
よって、一実施形態において、本明細書に開示される方法は、陰性対照またはブランクとは顕著に異なる量でヒトＦＶＩＩＩのＬＯＱを検出することができる。この実施形態の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更なる態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、０．９ｐｇ以下、０．８ｐｇ以下、０．７ｐｇ以下、０．６ｐｇ以下、０．５ｐｇ以下、０．４ｐｇ以下、０．３ｐｇ以下、０．２ｐｇ以下、０．１ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。
この実施形態の別の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または１ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０００ｆＭ以下、９００ｆＭ以下、８００ｆＭ以下、７００ｆＭ以下、６００ｆＭ以下、５００ｆＭ以下、４００ｆＭ以下、３００ｆＭ以下、２００ｆＭ以下、または１００ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下、または１０ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｆＭ以下、９ｆＭ以下、８ｆＭ以下、７ｆＭ以下、６ｆＭ以下、５ｆＭ以下、４ｆＭ以下、３ｆＭ以下、２ｆＭ以下、または１ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。
よって、一実施形態において、本明細書に開示される方法は、陰性対照またはブランクとは顕著に異なる量でヒトＦＶＩＩＩのＬＯＱを検出することができる。この実施形態の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更なる態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、０．９ｐｇ以下、０．８ｐｇ以下、０．７ｐｇ以下、０．６ｐｇ以下、０．５ｐｇ以下、０．４ｐｇ以下、０．３ｐｇ以下、０．２ｐｇ以下、０．１ｐｇ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。
この実施形態の別の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態のまた他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または１ｐＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０００ｆＭ以下、９００ｆＭ以下、８００ｆＭ以下、７００ｆＭ以下、６００ｆＭ以下、５００ｆＭ以下、４００ｆＭ以下、３００ｆＭ以下、２００ｆＭ以下、または１００ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１００ｆＭ以下、９０ｆＭ以下、８０ｆＭ以下、７０ｆＭ以下、６０ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、４０ｆＭ以下、３０ｆＭ以下、２０ｆＭ以下、または１０ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。この実施形態の更に他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、１０ｆＭ以下、９ｆＭ以下、８ｆＭ以下、７ｆＭ以下、６ｆＭ以下、５ｆＭ以下、４ｆＭ以下、３ｆＭ以下、２ｆＭ以下、または１ｆＭ以下のヒトＦＶＩＩＩの、ＬＯＱを有する。
【0077】
本明細書に開示される方法は、５０％以下の精度を有し得る。この実施形態の態様において、本明細書に開示される方法は、５０％以下、４０％以下、３０％以下、または２０％以下の精度を有し得る。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、１５％以下、１０％以下、または５％以下の精度を有する。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の精度を有し得る。
【0078】
本明細書に開示される方法は、少なくとも５０％の精度を有し得る。この実施形態の態様において、本明細書に開示される方法は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の精度を有し得る。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の精度を有し得る。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の精度を有し得る。
【0079】
本明細書に開示される方法は、統計的に有意である下方漸近線についてのシグナル対ノイズ比、及び統計的に有意である上方漸近線についてのシグナル対ノイズ比を有し得る。この実施形態の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、または少なくとも２０：１の、下方漸近線についてのシグナル対ノイズ比を有し得る。この実施形態の他の態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、または少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１、または少なくとも６００：１の上方漸近線についてのシグナル対ノイズ比を有し得る。
【0080】
本明細書に開示される方法の特異性は、例えば、他の動物由来のＦＶＩＩＩなどの、他の関連する成分を除外してヒトＦＶＩＩＩを測定する方法の能力を定義する。本明細書に開示される方法の選択性は、試料中の様々な物質を区別する方法の能力を説明する。本明細書に開示される方法の直線性は、試料中のヒトＦＶＩＩＩの濃度に比例して、直接的に、または十分に定義された数学的変換によって、結果を誘発する方法の能力を説明する。よって、一実施形態において、本明細書に開示される方法は、例えば、他の動物由来のＦＶＩＩＩの活性の７０以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下を有する、ヒトＦＶＩＩＩを他の動物から区別し得る。
【0081】
本明細書に開示される方法の堅牢性は、方法の通常（だが可変的な）条件下で同一の試料について得られた結果の再現性を説明する。本明細書に開示される方法の頑健性は、方法パラメータにおける小さいが意図的な変動によって影響を受けないままであるその能力を測定する方法の能力を説明し、通常使用におけるその信頼性の指標を提供する。よって、堅牢性は、不可避の変化を評価するのに対し、頑健性は、意図的な変化を評価する。堅牢性及び頑健性によって評価される典型的なパラメータには、凍結／解凍の効果、インキュベーション時間、インキュベーション温度、試薬の寿命、試料調製、試料保存、細胞継代数、多くの毒素、精製間の変動性、及びニッキング反応間の変動性が含まれる。本明細書に開示される方法についての頑健性パラメータには、細胞バンク（凍結の開始、中間、及び終了）、細胞継代レベル、細胞播種密度、細胞ストック密度（培養中の日数）、フラスコ中の細胞齢（播種までの待機時間）、インキュベーション時間、異なるプレート、血清の過剰量、及び試薬の供給源が含まれる。本明細書に開示される方法のシステム好適性は、試薬及び器具の性能を含む、方法性能を、参照標準の分析によって経時的に決定する方法の能力を説明する。システム好適性は、装置、電子機器、アッセイ性能、及び分析される試料が、統合されたシステムを構成するという事実を指す。システム好適性は、平行性について試験することによって評価することができ、これは、ｌｏｇ用量対応答をプロットするときであり、参照の段階希釈及び試料の段階希釈は、平行曲線を生じさせるはずである。
【0082】
本明細書の態様は、本明細書に開示される方法を実施するのに有用な１つ以上の成分を含むキットを開示する。キットの１つ以上の成分は、本明細書に開示される１つ以上の捕捉剤、１つ以上の固相支持体、及び／またはヒトＦＶＩＩＩの存在を検出及び／またはその活性を測定するのに必要な１つ以上の試薬を含み得る。本明細書に開示されるキットは、固相及び固相に固定された捕捉剤を含むことができる。本明細書に開示されるキットは、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを含む発色アッセイにおいて使用される１つ以上の試薬を、１つのまたは別個のバイアルにおいて含むことができる。いくつかの実施形態において、トロンビンは、プロトロンビンとして供給され得る。いくつかの実施形態において、ＦＩＸａ及びＦＸは、１つのバイアルにおいて、別個のバイアルにおいてリン脂質、及びまた別個のバイアルにおいてカルシウムイオンと組み合わせられ得る。いくつかの実施形態において、ＦＩＸａ、リン脂質、及びＣａは、１つのバイアルにおいて、ＦＸは、別個のバイアルにおいて組み合わされる。本明細書に開示されるキットはまた、ＦＸａ特異的発色基質（例えば、ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）及び任意に停止剤（例えば、酢酸）を含むことができる。発色基質バイアルはまた、合成トロンビン阻害剤を含有し得る。試薬は、任意の供給源、例えば、ヒトまたは動物（主にウシ供給源）のものであり得る。
【0083】
本明細書に開示されるキットはまた、捕捉剤及び／またはアッセイステップのための陽性対照として有用なＦＶＩＩＩ参照調製物を含み得る。所望の場合、この成分は、試験試料中で検出されたシグナルを比較することができる標準曲線の生成を促進するために、複数の濃度で試験キットに含めることができる。
【0084】
本明細書に開示されるキットは、結合緩衝液、反応緩衝液、ＦＶＩＩＩ希釈緩衝液、及び本明細書に記載されるものなどの洗浄緩衝液のうちの１つ以上を更に含むことができる。
【0085】
キットは、概して、１つ以上の別個の組成物として、または任意に、試薬の適合性が許容する場合、混合物として、成分を保持する１つ以上の容器を有するパッケージを含む。キットはまた、ユーザー観点から望ましくあり得る、他の材料（複数可）、例えば、緩衝液（複数可）、希釈剤（複数可）、標準（複数可）、及び／または試料処理、洗浄、もしくはアッセイの任意の他のステップを実施するのに有用な任意の他の材料（複数可）を含むことができる。本明細書に開示されるキットはまた、本明細書に開示される１つ以上の方法を実施するための指示を含み得る。本明細書に開示されるキットに含まれる指示は、包装材料に貼付することができ、または添付文書として含めることができる。指示は、典型的には、書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような指示を記憶し、それらをエンドユーザーに伝達することができる任意の媒体は、本明細書に開示される実施形態によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「指示」という用語は、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【実施例】
【0086】
本発明は、以下の実施例によってもまた記載及び実証される。しかしながら、明細書のいかなる場所においても、これらの、及び他の実施例の使用は例示のためだけのものであり、本発明の、またはあらゆる例示形態の範囲及び意味を少しも制限するものではない。同様に、本発明は、本明細書で記載された任意の特定の好ましい実施形態に限定されるものではない。それどころか、本発明の多くの修飾及び変更は、本明細書を読むことで当業者に明らかとなり得、そしてこのような変更は、本発明の趣旨または範囲を逸脱しない範囲で実施可能である。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に付与される権利と同等の範囲全体に加えて特許請求の範囲の用語によってのみ制限されるべきである。
【0087】
実施例１：モノクローナル抗体ベース発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの説明
ＥＬＩＳＡリーダーＥＬｘ８０８（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｚａｂｏ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、プレートウォッシャー（ＥＬｘ４０５、ＢｉｏＴｅｋ）、ピペッティングロボットシステム（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ２０００、ＢｉｏＴｅｋ）、及びプレートシェーカー（ＰＨＭＰ－４、Ｇｒａｎｔ Ｂｉｏ．Ｓｚａｂｏ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、方法を開発した。更に、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ９６平底プレートをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。緩衝液化学物質は、ＶＷＲ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入し、Ｔｗｅｅｎ ２０（ＥＩＡグレード）は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手し、塩酸ベンズアミジン一水和物は、Ｓｉｇｍａ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。モノクローナル抗第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）抗体は、Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ａ２－ＨＣ、ＧＭＡ－８０２４、Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｚａｂｏ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入した。発色ＦＶＩＩＩ活性試験のための試薬（試薬Ａ：リン脂質、ヒト血清アルブミン、ロットコード＃７Ｍ．．、試薬Ｂ：ＦＩＸ、ＦＸ、Ｃａ２＋ヒト血清アルブミン、ロットコード＃７Ｌ．．、基質ＦＸａ－１：１０μｍｏｌ＋０．０１２μｍｏｌのα－ＮＡＰＡＰ／バイアル、ロットコード＃８Ｍ．．、ＦＶＩＩＩ反応緩衝液、６．０６ｇ／ＬのＴｒｉｓ、３．０３ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ８．３、ロットコード＃９Ｔ．．、及びＦＶＩＩＩ希釈緩衝液３．４ｇ／Ｌのイミダゾール、５．８５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ロットコード＃９Ｙ．）は、Ｂａｘｔｅｒ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）からであった。以下の緩衝液／溶液を調製した：コーティング緩衝液（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、０．８％のＮａＣｌ、０．０２ ％のＫＣｌ、０．０２％のＫＨ２ＰＯ４、０．１２６％のＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．２）、洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）、遮断／希釈緩衝液（０．１％の脱脂粉乳、２ｍＭのベンズアミジン、６５０ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳＴ）、停止溶液（２０％の酢酸）、及び抗体捕捉溶液（コーティング緩衝液中で１：１００に希釈された、抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体）。
ＥＬＩＳＡリーダーＥＬｘ８０８（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｚａｂｏ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、プレートウォッシャー（ＥＬｘ４０５、ＢｉｏＴｅｋ）、ピペッティングロボットシステム（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ２０００、ＢｉｏＴｅｋ）、及びプレートシェーカー（ＰＨＭＰ－４、Ｇｒａｎｔ Ｂｉｏ．Ｓｚａｂｏ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、方法を開発した。更に、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｆ９６平底プレートをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。緩衝液化学物質は、ＶＷＲ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入し、Ｔｗｅｅｎ ２０（ＥＩＡグレード）は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手し、塩酸ベンズアミジン一水和物は、Ｓｉｇｍａ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。モノクローナル抗第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）抗体は、Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ａ２－ＨＣ、ＧＭＡ－８０２４、Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｚａｂｏ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入した。発色ＦＶＩＩＩ活性試験のための試薬（試薬Ａ：リン脂質、ヒト血清アルブミン、ロットコード＃７Ｍ．．、試薬Ｂ：ＦＩＸ、ＦＸ、Ｃａ２＋ヒト血清アルブミン、ロットコード＃７Ｌ．．、基質ＦＸａ－１：１０μｍｏｌ＋０．０１２μｍｏｌのα－ＮＡＰＡＰ／バイアル、ロットコード＃８Ｍ．．、ＦＶＩＩＩ反応緩衝液、６．０６ｇ／ＬのＴｒｉｓ、３．０３ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ８．３、ロットコード＃９Ｔ．．、及びＦＶＩＩＩ希釈緩衝液３．４ｇ／Ｌのイミダゾール、５．８５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ロットコード＃９Ｙ．）は、Ｂａｘｔｅｒ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）からであった。以下の緩衝液／溶液を調製した：コーティング緩衝液（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、０．８％のＮａＣｌ、０．０２ ％のＫＣｌ、０．０２％のＫＨ２ＰＯ４、０．１２６％のＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．２）、洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）、遮断／希釈緩衝液（０．１％の脱脂粉乳、２ｍＭのベンズアミジン、６５０ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳＴ）、停止溶液（２０％の酢酸）、及び抗体捕捉溶液（コーティング緩衝液中で１：１００に希釈された、抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体）。
【0088】
１００μＬ／ウェルの抗体捕捉溶液を、＋２～＋１０℃で一晩コーティングした。３回行われる、ＰＢＳＴでの洗浄ステップ後、プレートを２００μＬ／ウェルの遮断緩衝液で室温（ＲＴ）で１時間遮断し、次いで洗浄した。ウェルを１００μＬ／ウェルの希釈緩衝液で充填した。６つの段階１＋１希釈物を、標準、試料、及びアッセイ対照についてプレート上で直接二通りに調製した。Ｂ１１及びＢ１２位をアッセイブランクとして使用した。０．９７ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度を有するヒト血漿標準ＯＲＫＬ１７（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を参照標準として使用した。６点較正曲線は、３．０３～９７ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性範囲をカバーした。試料を、それらの推定ＦＶＩＩＩレベルに従って希釈して、較正曲線の範囲内のＦＶＩＩＩ濃度を得たが、アッセイ対照（正常参照血漿ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＣＣＮＲＰ－０５）を１／５で希釈した後、段階１＋１希釈をプレート上で調製した。希釈物を室温で１時間インキュベートした。次いで、洗浄されたプレートをＦＶＩＩＩ希釈緩衝液（２００μＬ／ウェル）で１０分間室温でインキュベートし、空にした後、発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ２０００システムを使用して行った。ＦＶＩＩＩ希釈緩衝液を試薬Ａと１＋１で混合し、装填し（４０μＬ／ウェル）、試薬Ｂ（２０μＬ／ウェル）を添加し、プレートをプレートシェーカー上で室温で１５分間インキュベートした。基質（１００μＬ／ウェル）を添加し、室温で２５分間のインキュベーション後、停止溶液（４０μＬ／ウェル）を添加した。プレートは、４０５ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で測定し、定量的評価は、６つの非ゼロアッセイキャリブレーターのブランク補正光学密度（ＯＤ）とＦＶＩＩＩ濃度との間の二重対数較正曲線に基づいた。
【0089】
アッセイ（図１）は、ウェルの表面上で捕捉及び固定化されたヒトＦＶＩＩＩで実施された、ヒトＦＶＩＩＩの特異的捕捉ステップ、続いて発色活性アッセイを含んだ。このアッセイでは、ＦＶＩＩＩをヒトトロンビンによってまず活性化して、活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）を形成した。ＦＶＩＩＩａは、次いで、過剰な試薬によって供給された、第Ｘ因子（ＦＸ）及び活性化第ＦＩＸ因子（ＦＩＸａ）でテナーゼ複合体を形成し、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）の生成をもたらした。ＦＶＩＩＩ濃度に厳密に依存的な定義された範囲内にある、得られたＦＸａ濃度は、次いで、発色ｐＮＡを形成する基質ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡの加水分解によって決定した。
【0090】
実施例２：適切な捕捉抗体の選択
本発明の方法における使用に適した抗ＦＶＩＩＩ抗体は、少なくとも以下の特徴を有するべきである：（１）ヒトＦＶＩＩＩについての絶対選択性、及び（２）ＦＶＩＩＩの抗体の結合は、発色ＦＶＩＩＩ活性試験に干渉するべきではない。後者の必要条件を、表１に要約された抗ＦＶＩＩＩ抗体について調査した。
本発明の方法における使用に適した抗ＦＶＩＩＩ抗体は、少なくとも以下の特徴を有するべきである：（１）ヒトＦＶＩＩＩについての絶対選択性、及び（２）ＦＶＩＩＩの抗体の結合は、発色ＦＶＩＩＩ活性試験に干渉するべきではない。後者の必要条件を、表１に要約された抗ＦＶＩＩＩ抗体について調査した。
【表1】
【0091】
抗体を、ＰＢＳ中での希釈によって達成される、１０μｇ／ｍＬの濃度でＦ９６マイクロプレート（１００μＬ／ウェル）のウェル上にコーティングした。ＰＢＳＴでの洗浄ステップ後、６５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬの脱脂粉乳、及び２ｍＭのベンズアミジンを含有するＰＢＳＴ中で調製された、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ｒＦＶＩＩＩの段階１＋１希釈系列を、ウェルに装填し（１００μＬ／ウェル）、６０分間室温でインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、実施例１に上述されるように更に処理した。図２は、表１に列挙される抗ＦＶＩＩＩ抗体について１８８、９４、及び４７ｍＵ／ｍＬのＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ濃度について得られたブランク補正ＯＤを示す。図２において左から右へ、抗ＦＶＩＩＩ捕捉抗体は、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、ＧＭＡ－０１２、ＥＳＨ－８、ＥＳＨ－４、ＲＦＦ－ＶＩＩＩＣ／８、ＲＦＦ－ＶＩＩＩＣ／５、及びＮ５５１９５Ｍである。
【0092】
発色ＦＶＩＩＩアッセイにおける応答は、ＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩを捕捉するために使用される抗体に応じて、かなり異なった。それにもかかわらず、用量依存的応答が全てのそれらの抗体について観察され、これは明確なシグナルを提供した。ＦＶＩＩＩの重鎖のＡ２ドメインに対して指向される、抗体ＧＭＡ－８０２４は、評価される３つ全てのＦＶＩＩＩ濃度について最も高いシグナルを提供し、したがって、以下の実施例において使用された。
【0093】
実施例３：ヒト参照血漿調製物で得られたアッセイ較正曲線
０．９７ＩＵ／ｍＬ（ロット番号５０３２６７）の標識ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト参照血漿調製物ＯＲＫＬ１７（Ｓｉｅｍｅｎｓ）をアッセイ較正曲線に使用した。この曲線は、６つの段階希釈（１／１０、１／２０、１／４０、１／８０、１／１６０、及び１／３２０）を含み、３．０３～９７．０ｍＩＵ／ｍＬの範囲であった。表２は、６つのアッセイキャリブレーターＤ１～Ｄ６及びブランクについての平均ブランク補正光学密度（ＯＤ）を示す。表２はまた、アッセイ標準Ｄ１～Ｄ６のブランク補正ＯＤ及びＦＶＩＩＩ濃度の対数間で計算された、ｌｏｇ－ｌｏｇ回帰曲線の属性を示す。特に、勾配、ｙ－切片（ｙ－ｉｎｔ）、相関係数ｒ、及び相対総合誤差（ＲＴＥ）が示される。ＲＴＥは、式ＲＴＥ＝｜ｘｎ－ｘｃ｜＋２ ＳＤ ｘｃ×１００に従って計算し、式中、ｘｎ及びｘｃは、それぞれ、アッセイ標準の公称及び計算濃度を表す。アッセイ標準の計算濃度ｘｃは、較正曲線の式において較正曲線標準のブランク補正ＯＤを挿入することによって得られた。得られた濃度にそれぞれの希釈係数を乗じ、最終的に、６つの結果を平均化し、この平均の標準偏差（ＳＤ ｘｃ）も計算した。これらの較正曲線属性について、１０８の曲線の最小及び最大値ならびに平均及び対応する相対標準偏差が示される。
０．９７ＩＵ／ｍＬ（ロット番号５０３２６７）の標識ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト参照血漿調製物ＯＲＫＬ１７（Ｓｉｅｍｅｎｓ）をアッセイ較正曲線に使用した。この曲線は、６つの段階希釈（１／１０、１／２０、１／４０、１／８０、１／１６０、及び１／３２０）を含み、３．０３～９７．０ｍＩＵ／ｍＬの範囲であった。表２は、６つのアッセイキャリブレーターＤ１～Ｄ６及びブランクについての平均ブランク補正光学密度（ＯＤ）を示す。表２はまた、アッセイ標準Ｄ１～Ｄ６のブランク補正ＯＤ及びＦＶＩＩＩ濃度の対数間で計算された、ｌｏｇ－ｌｏｇ回帰曲線の属性を示す。特に、勾配、ｙ－切片（ｙ－ｉｎｔ）、相関係数ｒ、及び相対総合誤差（ＲＴＥ）が示される。ＲＴＥは、式ＲＴＥ＝｜ｘｎ－ｘｃ｜＋２ ＳＤ ｘｃ×１００に従って計算し、式中、ｘｎ及びｘｃは、それぞれ、アッセイ標準の公称及び計算濃度を表す。アッセイ標準の計算濃度ｘｃは、較正曲線の式において較正曲線標準のブランク補正ＯＤを挿入することによって得られた。得られた濃度にそれぞれの希釈係数を乗じ、最終的に、６つの結果を平均化し、この平均の標準偏差（ＳＤ ｘｃ）も計算した。これらの較正曲線属性について、１０８の曲線の最小及び最大値ならびに平均及び対応する相対標準偏差が示される。
【表2】
【0094】
３．０３～９７．０ｍＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍＬの範囲の、１０８のｌｏｇ－ｌｏｇ較正曲線は、同様の形状、良好な正確性、及び適切な精度を実証した。よって、アッセイ標準Ｄ１～Ｄ６について決定された平均ブランク補正ＯＤのＲＳＤは、より低い濃度について示されたより高いＲＳＤで１５．２％を超えなかったＲＳＤを有した。ｌｏｇ－ｌｏｇ較正曲線の平均勾配及び平均ｙ－切片についてのＲＳＤは、それぞれ、４．３％及び－５．３％であり、較正曲線の同様の形状を実証した。０．９９７７～１．００００の範囲である個々の値での０．９９９６の平均相関係数、及び１．６％～１８．３％の範囲である個々の値での６．５％の低い平均ＲＴＥは両方、適用された曲線フィッティングモデルの正確性を確認した。留意すべきことに、ＲＴＥは、所与の較正曲線の適切なフィッティングを示す２５％を超えるべきではない。図３は、平均較正曲線及びバックフィットアッセイ較正のそれらの公称値との一致を示す。
【0095】
キャリブレーターバックフィッティングの結果は、全てのバックフィット値がそれらのそれぞれの公称値から±１４％未満逸脱したため、較正曲線の良好な正確性を裏付けた。これは明らかに、例えば、生体分析方法の検証のためのＥＭＡガイドラインによって、定義された±２０％範囲内である［２］。３．０３ｍＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍＬ、Ｄ６の正確で精度の高い決定を可能にする、アッセイの感度は、従来の発色アッセイのそれと同様であり、明らかに低減していないように思われたが、ＦＶＩＩＩは、発色試験を実行する前に抗体によって捕捉されなければならなかった。
【0096】
実施例４：ヒトＢドメイン欠失（ＢＤＤ）組換えＦＶＩＩＩで得られたアッセイ較正曲線
較正曲線は、実施例１に記載される方法を使用して７５０ＩＵ／ｍＬの活性でヒト組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ調製物を使用して構築した。較正曲線は、２．９～９３．８ｍＩＵ／ｍＬの範囲であった。表３は、４つのｌｏｇ－ｌｏｇ較正曲線について計算された、アッセイキャリブレーターＤ１～Ｄ６についての平均ブランク補正ＯＤ、ブランク及び勾配、ｙ－切片、相関係数ｒ、及びＲＴＥを示す。
較正曲線は、実施例１に記載される方法を使用して７５０ＩＵ／ｍＬの活性でヒト組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ調製物を使用して構築した。較正曲線は、２．９～９３．８ｍＩＵ／ｍＬの範囲であった。表３は、４つのｌｏｇ－ｌｏｇ較正曲線について計算された、アッセイキャリブレーターＤ１～Ｄ６についての平均ブランク補正ＯＤ、ブランク及び勾配、ｙ－切片、相関係数ｒ、及びＲＴＥを示す。
【表3】
【0097】
重鎖のＡ２ドメインに位置する、捕捉抗体ＧＭＡ－８０２４のエピトープの位置を考慮すると、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ調製物で得られたシグナルは、全長血漿ＦＶＩＩＩのものと高さが同様であった。４つのｌｏｇ－ｌｏｇ較正曲線は、同様の形状、良好な正確性、及び適切な精度を実証した。よって、平均ブランク補正ＯＤについて決定されたＲＳＤは、７．１％を超えなかったが、勾配及びｙ切片についてのＲＳＤは、それぞれ、２．０％及び１．８％と低かった。０．９９８９の平均相関係数及び１２．０％の平均ＲＴＥは、適用された曲線フィッティングモデルの正確性を確認した。較正曲線フィッティングの適切な正確性は、全てバックフィット値がそれらのそれぞれの公称値から±１３％未満逸脱した、キャリブレーターバックフィッティングの結果によって裏付けられた。アッセイ標準Ｄ６に含有される２．９ｍＵ ＦＶＩＩＩ／ｍＬの正確で精度の高い決定を可能にする、アッセイの感度は、発色試験を実行する前にモノクローナル抗体によってＦＶＩＩＩを捕捉する追加のステップにもかかわらず、従来の発色アッセイのそれと同様であった。更に、同じ規模の勾配は、血漿由来全長ＦＶＩＩＩ及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩについて得られ、捕捉ステップが両方のＦＶＩＩＩ分子について効率的に機能したことを証明した。図４は、ＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ調製物を使用することによって得られた平均較正曲線及びバックフィットアッセイ較正のそれらの公称値との一致を示す。
【0098】
実施例５：実験動物クエン酸血漿試料についての選択性調査
抗体ベース発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの選択性は、１／１０の最小希釈での異なるクエン酸実験動物血漿試料の測定によって確認された。表４は、得られた結果を示し、２．９ｍＵ／ｍＬの最も低いＦＶＩＩＩ濃度でのアッセイ標準Ｄ６の平均ＯＤ、ブランクについての平均ＯＤ、及び１／１０希釈動物血漿試料について測定されたものを提供した。加えて、「Δブランク％」及び「ΔＤ６％」というカラムは、１／１０希釈血漿試料について決定されたシグナルを、ブランク及びアッセイ標準Ｄ６のものと関連付け、それぞれ、（ＯＤ血漿－ＯＤブランク）／ＯＤブランク６×１００及び（ＯＤ血漿－ＯＤＤ６）／ＯＤＤ６×１００として計算された相対差を示す。
抗体ベース発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの選択性は、１／１０の最小希釈での異なるクエン酸実験動物血漿試料の測定によって確認された。表４は、得られた結果を示し、２．９ｍＵ／ｍＬの最も低いＦＶＩＩＩ濃度でのアッセイ標準Ｄ６の平均ＯＤ、ブランクについての平均ＯＤ、及び１／１０希釈動物血漿試料について測定されたものを提供した。加えて、「Δブランク％」及び「ΔＤ６％」というカラムは、１／１０希釈血漿試料について決定されたシグナルを、ブランク及びアッセイ標準Ｄ６のものと関連付け、それぞれ、（ＯＤ血漿－ＯＤブランク）／ＯＤブランク６×１００及び（ＯＤ血漿－ＯＤＤ６）／ＯＤＤ６×１００として計算された相対差を示す。
【表4】
【0099】
６つのクエン酸動物血漿試料の中で、ヒツジ血漿試料のみは、アッセイブランクよりもわずかに高いシグナルを示し、他の全ては、ブランクよりもわずかに低いシグナルを提供した。しかしながら、これらのわずかな差は、アッセイとの実質的な干渉を示さなかったが、むしろ測定変動性を反映した。２．９ｍＵ ＦＶＩＩＩ／ｍＬを含有する最も低いアッセイ標準のパーセントとして表され、１／１０希釈動物血漿試料によって誘発されたシグナルは、少なくとも２０．４％低かった。これらのデータは、内因性動物ＦＶＩＩＩがアッセイに干渉したという証拠がなかったため、ヒトＦＶＩＩＩについての抗体ベース発色ＦＶＩＩＩアッセイの選択性を確認した。
【0100】
実施例６：実験動物血清試料についての選択性調査
抗体ベース発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの選択性は、１／１０の最小試料希釈での異なる動物血清試料の測定によって確認された。表５は、得られた結果を示し、２．９ｍＵ／ｍＬの最も低いＦＶＩＩＩ濃度でのアッセイ標準Ｄ６の平均ＯＤ、ブランクについての平均ＯＤ、及び１／１０希釈動物血清試料について測定されたものを提供した。加えて、「Δブランク％」及び「ΔＤ６％」というカラムは、血清試料について決定されたシグナルを、ブランク及びアッセイ標準Ｄ６のものと関連付け、それぞれ、（ＯＤ血漿－ＯＤブランク）／ＯＤブランク×１００及び（ＯＤ血漿－ＯＤＤ６）／ＯＤＤ６×１００として計算された相対差を示す。
抗体ベース発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイの選択性は、１／１０の最小試料希釈での異なる動物血清試料の測定によって確認された。表５は、得られた結果を示し、２．９ｍＵ／ｍＬの最も低いＦＶＩＩＩ濃度でのアッセイ標準Ｄ６の平均ＯＤ、ブランクについての平均ＯＤ、及び１／１０希釈動物血清試料について測定されたものを提供した。加えて、「Δブランク％」及び「ΔＤ６％」というカラムは、血清試料について決定されたシグナルを、ブランク及びアッセイ標準Ｄ６のものと関連付け、それぞれ、（ＯＤ血漿－ＯＤブランク）／ＯＤブランク×１００及び（ＯＤ血漿－ＯＤＤ６）／ＯＤＤ６×１００として計算された相対差を示す。
【表5】
【0101】
全ての血清試料は、ブランクよりもわずかに低いシグナルを提供し、ブランクとの差は、２．５％を超えなかった。２．９ｍＵ ＦＶＩＩＩ／ｍＬを含有する最も低いアッセイ標準のパーセントとして表され、１／１０希釈血清試料によって誘発されたシグナルは、少なくとも２３．３％低かった。これらのデータは、内因性動物タンパク質がアッセイに干渉したという証拠がなかったため、ヒトＦＶＩＩＩについての抗体ベース発色ＦＶＩＩＩアッセイの選択性を確認した。
【0102】
実施例７：クエン酸実験動物血漿試料中のヒトＦＶＩＩＩ回収率
クエン酸動物血漿試料を、１００ｍＵのヒトＦＶＩＩＩでスパイクし、１／１０の最終希釈で測定した。得られたＦＶＩＩＩ回収率は、許容可能、すなわち、一般に許容される８０～１２０％の範囲［２］内であり、スパイク－回収率実験に使用された１００ｍＵ／ｍＬの低ＦＶＩＩＩ濃度にもかかわらず、８３．３％から１１６．９％まで変動した。これらのデータは、回収率を明らかに増加させたであろう、内因性動物第ＶＩＩＩ因子からのシグナルがなかったため、抗体駆動捕捉ステップによって導入された選択性を確認した。そのような上昇した回収率は、ヒトＦＶＩＩＩに特異的ではない従来の発色第ＶＩＩＩ因子アッセイを実行するときに観察されたであろう。図５は、クエン酸動物血漿種にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについて決定された個々の回収率を示す。
クエン酸動物血漿試料を、１００ｍＵのヒトＦＶＩＩＩでスパイクし、１／１０の最終希釈で測定した。得られたＦＶＩＩＩ回収率は、許容可能、すなわち、一般に許容される８０～１２０％の範囲［２］内であり、スパイク－回収率実験に使用された１００ｍＵ／ｍＬの低ＦＶＩＩＩ濃度にもかかわらず、８３．３％から１１６．９％まで変動した。これらのデータは、回収率を明らかに増加させたであろう、内因性動物第ＶＩＩＩ因子からのシグナルがなかったため、抗体駆動捕捉ステップによって導入された選択性を確認した。そのような上昇した回収率は、ヒトＦＶＩＩＩに特異的ではない従来の発色第ＶＩＩＩ因子アッセイを実行するときに観察されたであろう。図５は、クエン酸動物血漿種にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについて決定された個々の回収率を示す。
【0103】
実施例８：実験動物血清試料中のヒトＦＶＩＩＩ回収率分析
動物血清試料を、１００ｍＵのヒトＦＶＩＩＩでスパイクし、１／１０の最終希釈で測定した。図６は、動物血清試料にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについて決定された回収率を示す。
動物血清試料を、１００ｍＵのヒトＦＶＩＩＩでスパイクし、１／１０の最終希釈で測定した。図６は、動物血清試料にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについて決定された回収率を示す。
【0104】
回収率は、良好、すなわち、一般に許容される８０～１２０％の範囲［２］内であり、スパイク－回収率実験に使用された１００ｍＵ／ｍＬの低ＦＶＩＩＩ濃度にもかかわらず、８６．７％から１１５．８％まで変動した。データは、動物アルブミン及び免疫グロブリンを含む主要血清タンパク質について比較的高い濃度でアッセイに導入された、動物血清タンパク質の存在によって引き起こされた干渉がなかったことによって、アッセイの選択性を確認した。
【0105】
実施例９：動物血漿及び血清試料中のスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての平行性調査
アッセイ較正曲線が緩衝液で希釈された標準で構築されるとき、試料の濃度－応答曲線のアッセイ標準のそれに対する十分な平行性が前提条件である。しかしながら、緩衝液ベースの較正曲線の使用は、アッセイの頑健性を増加するだけでなく、生体試薬の数を低減することによって、及び異なる動物マトリックスの個々の較正曲線の構築を必要としないことによって、その複雑性を軽減することも意図される。血漿／血清マトリックスの影響がないことを実証する緩衝液及び動物マトリックス中の分析物の希釈系列間の適切な平行性は、この簡素化を可能にすることができる。したがって、平行性は、１００ｍＵ／ｍＬのヒトＦＶＩＩＩでスパイクされた血漿／血清試料について得られた結果を用いてチェックした。図７は、クエン酸ヤギ、ヒツジ、及びカニクイザル血漿にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩの用量－応答曲線を示す。
アッセイ較正曲線が緩衝液で希釈された標準で構築されるとき、試料の濃度－応答曲線のアッセイ標準のそれに対する十分な平行性が前提条件である。しかしながら、緩衝液ベースの較正曲線の使用は、アッセイの頑健性を増加するだけでなく、生体試薬の数を低減することによって、及び異なる動物マトリックスの個々の較正曲線の構築を必要としないことによって、その複雑性を軽減することも意図される。血漿／血清マトリックスの影響がないことを実証する緩衝液及び動物マトリックス中の分析物の希釈系列間の適切な平行性は、この簡素化を可能にすることができる。したがって、平行性は、１００ｍＵ／ｍＬのヒトＦＶＩＩＩでスパイクされた血漿／血清試料について得られた結果を用いてチェックした。図７は、クエン酸ヤギ、ヒツジ、及びカニクイザル血漿にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩの用量－応答曲線を示す。
【0106】
クエン酸ヤギ、ヒツジ、及びカニクイザル血漿についての濃度－応答曲線の勾配は、１／１０の希釈で開始して、高濃度の動物タンパク質の存在にもかかわらず、アッセイ標準のそれと同様の勾配を有した。よって、動物試料の勾配は、アッセイ標準のそれと８％未満で異なった。それらの直線性は、ほぼ同一であり、全ての決定係数は、少なくとも０．９９５であった。これらのデータは、アッセイに対する動物タンパク質マトリックスの本質的な影響がない可能性が最も高いことを実証し、よって、緩衝液ベースの較正曲線を使用することの重要なアッセイ簡素化を支持した。図８は、クエン酸ウサギ及びラット血漿ならびにマウス血清にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。
【0107】
クエン酸ラット及びウサギ血漿ならびにマウス血清についての濃度－応答曲線の勾配は、希釈１／１０で開始して、７％未満のアッセイ標準との差でアッセイ標準と同様の勾配を有した。それらの直線性は、ほぼ同一であり、決定係数は、少なくとも０．９９２であった。これらのデータは、アッセイに対する動物タンパク質マトリックスの本質的な影響がない可能性が最も高いことを実証し、よって、緩衝液ベースの較正曲線を使用することの重要なアッセイ簡素化を支持した。図９は、クエン酸アカゲザル血漿及びモルモット血清にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。
【0108】
アカゲザル血漿及びモルモット血清についての濃度－応答曲線の勾配は、アッセイ標準のそれと同様の勾配を有し、動物試料の用量－応答曲線の勾配は、アッセイ標準のそれと６％未満で異なった。それらの直線性は、同一であった（Ｒ２＝０．９９９）。これらのデータは、アッセイに対する動物タンパク質マトリックスの本質的な影響がない可能性が最も高いことを実証し、よって、緩衝液ベースの較正曲線を使用することの重要なアッセイ簡素化を支持した。図１０は、ブタ及びハムスター血清にスパイクされたヒトＦＶＩＩＩについての用量－応答曲線を示す。
【0109】
ブタ及びハムスター血清についての濃度－応答曲線の勾配は、アッセイ標準のそれと同様の勾配を有し、動物試料の勾配は、アッセイ標準のそれと５％未満で異なった。それらの直線性は、少なくとも０．９９９の相関係数で、ほぼ同一であった。これらのデータは、アッセイに対する動物タンパク質マトリックスの本質的な影響がない可能性が最も高いことを実証し、よって、緩衝液ベースの較正曲線を使用することの重要なアッセイ簡素化を支持した。
【0110】
実施例１０：カニクイザル血漿中の選択されたアッセイ性能特徴
この試験のために、アッセイを、Ｓｉｅｍｅｎｓ参照血漿の代わりにアッセイ較正のために０．８８ＩＵ／ｍＬの割り当てられたＦＶＩＩＩ濃度で参照血漿ＳＳＣ／ＩＳＴＨ ＃０４を使用して実施例１に記載されるように実施した。これは、２．８～８８ｍＩＵ／ｍＬの較正範囲で感度のわずかな増加をもたらしたが、較正曲線の品質属性には影響を及ぼさなかった。カニクイザル血漿中の性能特徴の中で、ヒトＦＶＩＩＩ測定についての選択性は、天然及びヒトＦＶＩＩＩでスパイクされた後のクエン酸カニクイザル血漿の測定によって確認された。このスパイクは、組換えヒト全長ＦＶＩＩＩ及びヒト組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩで実施した。スパイクされた試料は、アッセイ正確性についての尺度としてＦＶＩＩＩ回収率を計算するために使用し、一方、それらの繰り返された分析は、アッセイの繰り返し性に関するデータを提供した。最後に、スパイクされた試料の希釈系列について得られた濃度－応答曲線は、標準と試料との間の平行性の評価を可能にした。表６は、２．８ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度を表す、クエン酸カニクイザル血漿プールの、及び対応するアッセイ標準Ｄ６の、６つの１／１０希釈について決定された、ブランク補正ＯＤを示す。
この試験のために、アッセイを、Ｓｉｅｍｅｎｓ参照血漿の代わりにアッセイ較正のために０．８８ＩＵ／ｍＬの割り当てられたＦＶＩＩＩ濃度で参照血漿ＳＳＣ／ＩＳＴＨ ＃０４を使用して実施例１に記載されるように実施した。これは、２．８～８８ｍＩＵ／ｍＬの較正範囲で感度のわずかな増加をもたらしたが、較正曲線の品質属性には影響を及ぼさなかった。カニクイザル血漿中の性能特徴の中で、ヒトＦＶＩＩＩ測定についての選択性は、天然及びヒトＦＶＩＩＩでスパイクされた後のクエン酸カニクイザル血漿の測定によって確認された。このスパイクは、組換えヒト全長ＦＶＩＩＩ及びヒト組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩで実施した。スパイクされた試料は、アッセイ正確性についての尺度としてＦＶＩＩＩ回収率を計算するために使用し、一方、それらの繰り返された分析は、アッセイの繰り返し性に関するデータを提供した。最後に、スパイクされた試料の希釈系列について得られた濃度－応答曲線は、標準と試料との間の平行性の評価を可能にした。表６は、２．８ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度を表す、クエン酸カニクイザル血漿プールの、及び対応するアッセイ標準Ｄ６の、６つの１／１０希釈について決定された、ブランク補正ＯＤを示す。
【表6】
【0111】
アッセイ標準Ｄ６は、２．８ｍＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度を表した。
【0112】
６つの１／１０希釈されたクエン酸カニクイザル血漿試料は、０．００１及び－０．００３の平均でゼロに近いブランク補正ＯＤを有したが、最も低いＦＶＩＩＩ濃度（２．８ｍＩＵ／ｍＬ）を含有する対応するアッセイ標準は、それぞれ、０．１０７及び０．１００のブランク補正ＯＤを示した。よって、クエン酸カニクイザル血漿について見出されたＦＶＩＩＩ濃度は、＜０．０３ＩＵ／ｍＬであり、アッセイの定量下限を表した。
【0113】
カニクイザル血漿中のスパイク－回収率試験のために、７部の希釈緩衝液を、２部のクエン酸カニクイザル血漿、ならびに、それぞれ、１．６３及び１．７６ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度を表す、１部の希釈された全長組換えＦＶＩＩＩまたは組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩと混合した。次いで、これらの試料を、プレート上で直接１＋１で段階希釈し、１／１０のカニクイザル血漿の最終希釈、ならびに全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩでスパイクされた試料について、それぞれ、８１．５及び８８．１ｍＩＵ／ｍＬの公称ＦＶＩＩＩ濃度をもたらした。表７は、クエン酸カニクイザル血漿試料にスパイクされた、全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩについて決定された回収率を示す。
【表7】
【0114】
決定された全ての回収率は、スパイクされた全長ｒＦＶＩＩＩ調製物について決定されたわずかに良好な回収率で、一般的に許容される１００±２０％範囲内にあった［２］。特に、平均回収率は、それぞれ、全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ調製物について１０２．７％及び９２．４％であった。三重スパイクの平均について決定されたＲＳＤは、２．８％を超えなかった。これらのデータは、本発明のアッセイによって、内因性サルＦＶＩＩＩによる干渉なしに、ヒトＦＶＩＩＩの正確かつ精度の高い測定を達成することができることを確認した。表８は、用量－応答曲線の勾配、相対勾配（列「勾配％」）、及び相関係数を示す。
【表8】
【0115】
「勾配％」という行は、対応するアッセイ標準の用量－応答曲線の勾配のパーセントとして表される、相対的な勾配を示す。
【0116】
スパイクされたサル血漿試料の用量－応答曲線について決定された勾配は、アッセイ標準とは６％以下で異なった。用量－応答曲線の平均相対勾配は、それぞれ、全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩでスパイクされた血漿試料について、１０４．９％及び１００．５％であった。
【0117】
実施例１１：緩衝液における選択されたアッセイ性能特徴
凍結乾燥されたヒト参照血漿調製物ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＬｏｇｉｃ）をアッセイ対照として使用した。図１１Ａ～１１Ｄは、この期間にわたる精度及び正確性を実証するために、６ヶ月の期間にわたって３人のオペレーターによって実施された、１０８の測定のデータを示す。
凍結乾燥されたヒト参照血漿調製物ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＬｏｇｉｃ）をアッセイ対照として使用した。図１１Ａ～１１Ｄは、この期間にわたる精度及び正確性を実証するために、６ヶ月の期間にわたって３人のオペレーターによって実施された、１０８の測定のデータを示す。
【0118】
６ヶ月の期間にわたって３人のオペレーターによって実施された、１０８の測定によって得られた平均は、０．５７±０．０６ＩＵ／ｍＬ（ＲＳＤ １０．４％）であった。データは、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎ検定で確認されるように正規分布した（ｐ＝０．１１７４、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３で計算されたＡＮＯＶＡは、３人のオペレーターによって得られた結果間に統計的に有意な差がなかったことを示した（ｐ＝０．３４０７）。これらのデータは、６ヶ月の長期間にわたるアッセイの適切な中間精度及び頑健性を確認した。表９は、全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ調製物で行われた、繰り返し性試験の結果を示す。
【表9】
【0119】
両方のｒＦＶＩＩＩ調製物は、３０ＩＵ／ｍＬよりも高いＦＶＩＩＩ活性を有し、よって、全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩ調製物の測定のために調製された段階希釈系列は、それぞれ、希釈１／４００及び１／２００００で開始した。１実行で６倍の測定について得られたＲＳＤは、低かった：全長及びＢＤＤ ｒＦＶＩＩＩについて、それぞれ、３．０％及び１．８％のＲＳＤを決定した。よって、これらの結果は、生体分析方法の一般的な精度要件を満たした［２］。
【0120】
実施例１２：抗体ベース発色ＦＶＩＩＩアッセイに対する溶媒－洗浄剤ウイルス不活性化溶液の影響
ＦＶＩＩＩの抗体ベース捕捉、続いて発色活性測定は、これまでのところアッセイへのかなりの干渉のために測定に適していない試料マトリックス中のＦＶＩＩＩ活性を測定する追加の選択肢を提供する。本発明のアッセイの利点は、捕捉ステップに影響がない限り、捕捉されたＦＶＩＩＩを洗浄することによって、発色アッセイに干渉する物質を除去することができることである。
ＦＶＩＩＩの抗体ベース捕捉、続いて発色活性測定は、これまでのところアッセイへのかなりの干渉のために測定に適していない試料マトリックス中のＦＶＩＩＩ活性を測定する追加の選択肢を提供する。本発明のアッセイの利点は、捕捉ステップに影響がない限り、捕捉されたＦＶＩＩＩを洗浄することによって、発色アッセイに干渉する物質を除去することができることである。
【0121】
有効なウイルス不活性化溶液としてしばしば使用され、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．３％のポリソルベート８０、及び０．３％のリン酸トリ－ｎ－ブチル（ｔｎＢＰ）を含有する溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）溶液は、発色活性アッセイと不適合性である特定のマトリックスの一例である。しかしながら、Ｓ／Ｄ溶液の成分の存在は、プレート結合抗体によるＦＶＩＩＩの捕捉に干渉することは予想されなかった。図１２は、Ｓ／Ｄ溶液、すなわち、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００、０．３％のポリソルベート８０、及び０．３％のｔｎＢＰの存在下、１０ＩＵのヒトＦＶＩＩＩ／ｍＬ、ならびにＰＢＳ緩衝液中の同じＦＶＩＩＩ濃度（＝天然ＦＶＩＩＩ）を含有する試料について得られた濃度－応答曲線を示す。
【0122】
Ｓ／Ｄ溶液及び緩衝液中のＦＶＩＩＩについて得られたほぼ同一の希釈－反応曲線は、Ｓ／Ｄ混合物がアッセイ性能に対する影響を有さなかったことを示した。勾配及び二乗相関係数は、両方の試料間の類似性を示した。図１３は、同様の実験の結果を示すが、１ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ濃度のみを使用し、１０倍低い試料希釈を必要とし、よって抗体ベースＦＶＩＩＩ捕捉中にＳ／Ｄ成分のレベルを著しく増加させる。
【0123】
より低い濃度のＦＶＩＩＩを使用する条件下では、はるかに高い濃度のＳ／Ｄ成分が初期捕捉ステップ中に存在し、両方の希釈－反応曲線は、勾配及び直線性において非常に類似していた。よって、Ｓ／Ｄ溶液の存在は、アッセイ性能に対する最小限の影響を有したか、または影響を有さなかった。図１４は、Ｓ／Ｄ溶液中の３つのレベルのヒトＦＶＩＩＩ（１０、１、及び０．１ＩＵ／ｍＬ）及びＳ／Ｄ溶液の個々の成分の回収率を示す。図１５は、Ｓ／Ｄウイルス不活性化溶液の個々の成分の存在下でのアッセイ性能を示す。
参考文献
［１］Ｒｏｔｂｌａｔ Ｆ，Ｇｏｏｄａｌｌ ＡＨ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＤＰ，Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｅ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ Ｓ，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ ＥＧＤ（１９８３）：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ．Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １０１，７３６－４６．
［２］ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＥＷＰ／１９２２１７／２００９．Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（２０１１）．
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参考文献
［１］Ｒｏｔｂｌａｔ Ｆ，Ｇｏｏｄａｌｌ ＡＨ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＤＰ，Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｅ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ Ｓ，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ ＥＧＤ（１９８３）：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ．Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １０１，７３６－４６．
［２］ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＥＷＰ／１９２２１７／２００９．Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（２０１１）．
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【0124】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えた本発明の様々な修飾は、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【0125】
本明細書で引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及び他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するための方法であって、前記試料は１つ以上のＦＶＩＩＩ活性模倣剤を含み、前記方法は、ａ）前記試料を、前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、１つ以上のＦＶＩＩＩ活性模倣剤の存在下で前記捕捉剤が前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップであって、それによって反応混合物を形成し、前記捕捉剤が固体支持体に結合している、前記ステップ、
ｂ）前記反応混合物からヒトＦＶＩＩＩの非結合画分を除去するステップ、及び
ｃ）発色アッセイを使用して、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を測定するステップ
を含む、前記方法。
【請求項2】
ｄ）ＦＶＩＩＩ参照調製物と比較することによって、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記発色アッセイが、ｃ１）前記反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、前記反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすること、
ｃ２）前記反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、前記反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすること、
ｃ３）任意に、前記反応混合物に、停止剤を添加して、前記ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止すること、及び
ｃ４）前記反応混合物から生成された前記シグナルを測定すること
によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記発色基質がＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、及び／または前記停止剤が酢酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに選択的に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＢドメインに結合しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記試料が、非ヒト動物または実験動物由来の血漿及び／または血清を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記非ヒト動物が、ヒツジ、ヤギ、カニクイザル、ウサギ、ラット、アカゲザル、マウス、ブタ、ハムスター、ミニピッグ、またはモルモットである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、抗体、抗原結合断片、ペプチド、核酸、または小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、二重特異性抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記二重特異性抗体が、エミシズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
（１）前記試料が、ステップａ）の前に希釈される；（２）ステップａ）におけるインキュベーションが、室温で約１時間にわたって行われる；
（３）ステップｃ１）におけるインキュベーションが、室温で約１５分にわたって行われる；
（４）ステップｃ２）におけるインキュベーションが、室温で約２５分にわたって行われる；及び／または
（５）ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の除去が、前記固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄することによって行われる
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記試料が、ステップａ）の前に、１：１～約１：１００，０００倍希釈される、１：２～約１：２０，０００倍希釈される、または約１：１０倍希釈される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ヒトＦＶＩＩＩが、組換えＦＶＩＩＩである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ヒトＦＶＩＩＩが、全長ＦＶＩＩＩ、またはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するためのキットであって、ｉ．前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤であって、固体支持体に結合している捕捉剤、
ｉｉ．活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンのうちの１つ以上を含む第１のバイアル、
ｉｉｉ．ＦＸａ特異的発色基質を含む第２のバイアル、及び／または
ｉｖ．任意に、停止剤を含む第３のバイアル
を含む、前記キット。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0125】
本明細書で引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及び他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するための方法であって、
ａ）前記試料を、前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、前記捕捉剤が前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップであって、それによって反応混合物を形成し、前記捕捉剤が、固体支持体に結合している、前記ステップと、
ｂ）前記反応混合物からヒトＦＶＩＩＩの非結合画分を除去するステップと、
ｃ）発色アッセイを使用して、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を測定するステップと、を含む、前記方法。
［実施態様２］
ｄ）ＦＶＩＩＩ参照調製物と比較することによって、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を決定することを更に含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記発色アッセイが、
ｃ１）前記反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、前記反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ２）前記反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、前記反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ３）任意に、前記反応混合物に、停止剤を添加して、前記ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止することと、
ｃ４）前記反応混合物から生成された前記シグナルを測定することと、によって行われる、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
前記発色基質が、ＣＨ ３ ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］
前記停止剤が、酢酸である、実施態様３または４に記載の方法。
［実施態様６］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、実施態様１～５のいずれかに記載の方法。
［実施態様７］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ａ２ドメインに選択的に結合する、実施態様１～６のいずれかに記載の方法。
［実施態様８］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインに結合しない、実施態様１～６のいずれかに記載の方法。
［実施態様９］
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、実施態様１～８のいずれかに記載の方法。
［実施態様１０］
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、実施態様９に記載の方法。
［実施態様１１］
前記試料が、非ヒト動物由来の血漿及び／または血清を含む、実施態様１～１０のいずれかに記載の方法。
［実施態様１２］
前記非ヒト動物が、実験動物である、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
前記非ヒト動物が、ヒツジ、ヤギ、カニクイザル、ウサギ、ラット、アカゲザル、マウス、ブタ、ハムスター、ミニピッグ、またはモルモットである、実施態様１２に記載の方法。
［実施態様１４］
前記試料が、クエン酸血漿を含む、実施態様９～１３のいずれかに記載の方法。
［実施態様１５］
前記試料が、１つ以上のＦＶＩＩＩ活性模倣剤を含む、実施態様１～１４のいずれかに記載の方法。
［実施態様１６］
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、抗体、抗原結合断片、ペプチド、核酸、または小分子である、実施態様１５に記載の方法。
［実施態様１７］
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、二重特異性抗体である、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
前記二重特異性抗体が、エミシズマブである、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
前記試料が、ステップａ）の前に希釈される、実施態様１～１８のいずれかに記載の方法。
［実施態様２０］
前記試料が、１：１～約１：１００，０００倍希釈される、実施態様１９に記載の方法。
［実施態様２１］
前記試料が、１：２～約１：２０，０００倍希釈される、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
前記試料が、約１：１０倍希釈される、実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２３］
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、実施態様１～２２のいずれかに記載の方法。
［実施態様２４］
ステップａ）における前記インキュベーションが、室温で約１時間にわたって行われる、実施態様１～２３のいずれかに記載の方法。
［実施態様２５］
ステップｃ１）における前記インキュベーションが、室温で約１５分にわたって行われる、実施態様１～２４のいずれかに記載の方法。
［実施態様２６］
ステップｃ２）における前記インキュベーションが、室温で約２５分にわたって行われる、実施態様１～２５のいずれかに記載の方法。
［実施態様２７］
ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の前記除去が、前記固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄することによって行われる、実施態様１～２６のいずれかに記載の方法。
［実施態様２８］
ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の前記除去が、前記固体支持体をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液で約３回洗浄することによって行われる、実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
前記ヒトＦＶＩＩＩが、組換えＦＶＩＩＩである、実施態様１～２８のいずれかに記載の方法。
［実施態様３０］
前記ヒトＦＶＩＩＩが、全長ＦＶＩＩＩである、実施態様１～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３１］
前記ヒトＦＶＩＩＩが、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、実施態様１～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３２］
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するためのキットであって、
ｉ．前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤であって、前記捕捉剤が、固体支持体に結合している、前記捕捉剤、
ｉｉ．活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンのうちの１つ以上を含む、第１のバイアル、
ｉｉｉ．ＦＸａ特異的発色基質を含む、第２のバイアル、及び／または
ｉｖ．任意に、停止剤を含む、第３のバイアルを含む、前記キット。
［実施態様３３］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、実施態様３２に記載のキット。
［実施態様３４］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ａ２ドメインに選択的に結合する、実施態様３２または３３に記載のキット。
［実施態様３５］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインに結合しない、実施態様３２または３３に記載のキット。
［実施態様３６］
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、実施態様３２～３５のいずれかに記載のキット。
［実施態様３７］
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、実施態様３６に記載のキット。
［実施態様３８］
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、実施態様３２～３７のいずれかに記載のキット。
［実施態様３９］
前記発色基質が、ＣＨ ３ ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、実施態様３２～３８のいずれかに記載のキット。
［実施態様４０］
前記停止剤が、酢酸である、実施態様３２～３９のいずれかに記載のキット。
［実施態様４１］
反応緩衝液、ＦＶＩＩＩ希釈緩衝液、洗浄緩衝液、及び／またはＦＶＩＩＩ参照調製物のうちの１つ以上を更に含む、実施態様３２～４０のいずれかに記載のキット。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するための方法であって、
ａ）前記試料を、前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤と、前記捕捉剤が前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合することを可能にするのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートするステップであって、それによって反応混合物を形成し、前記捕捉剤が、固体支持体に結合している、前記ステップと、
ｂ）前記反応混合物からヒトＦＶＩＩＩの非結合画分を除去するステップと、
ｃ）発色アッセイを使用して、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を測定するステップと、を含む、前記方法。
［実施態様２］
ｄ）ＦＶＩＩＩ参照調製物と比較することによって、前記反応混合物中の前記ヒトＦＶＩＩＩの活性を決定することを更に含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記発色アッセイが、
ｃ１）前記反応混合物に、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンを添加し、前記反応混合物を、活性化ＦＸ（ＦＸａ）を生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ２）前記反応混合物に、ＦＸａ特異的発色基質を添加し、前記反応混合物を、測定可能なシグナルを生成するのに十分な条件下及び時間にわたってインキュベートすることと、
ｃ３）任意に、前記反応混合物に、停止剤を添加して、前記ＦＸａ特異的発色基質からのシグナル生成を停止することと、
ｃ４）前記反応混合物から生成された前記シグナルを測定することと、によって行われる、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
前記発色基質が、ＣＨ ３ ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］
前記停止剤が、酢酸である、実施態様３または４に記載の方法。
［実施態様６］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、実施態様１～５のいずれかに記載の方法。
［実施態様７］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ａ２ドメインに選択的に結合する、実施態様１～６のいずれかに記載の方法。
［実施態様８］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインに結合しない、実施態様１～６のいずれかに記載の方法。
［実施態様９］
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、実施態様１～８のいずれかに記載の方法。
［実施態様１０］
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、実施態様９に記載の方法。
［実施態様１１］
前記試料が、非ヒト動物由来の血漿及び／または血清を含む、実施態様１～１０のいずれかに記載の方法。
［実施態様１２］
前記非ヒト動物が、実験動物である、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
前記非ヒト動物が、ヒツジ、ヤギ、カニクイザル、ウサギ、ラット、アカゲザル、マウス、ブタ、ハムスター、ミニピッグ、またはモルモットである、実施態様１２に記載の方法。
［実施態様１４］
前記試料が、クエン酸血漿を含む、実施態様９～１３のいずれかに記載の方法。
［実施態様１５］
前記試料が、１つ以上のＦＶＩＩＩ活性模倣剤を含む、実施態様１～１４のいずれかに記載の方法。
［実施態様１６］
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、抗体、抗原結合断片、ペプチド、核酸、または小分子である、実施態様１５に記載の方法。
［実施態様１７］
前記ＦＶＩＩＩ活性模倣剤が、二重特異性抗体である、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
前記二重特異性抗体が、エミシズマブである、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
前記試料が、ステップａ）の前に希釈される、実施態様１～１８のいずれかに記載の方法。
［実施態様２０］
前記試料が、１：１～約１：１００，０００倍希釈される、実施態様１９に記載の方法。
［実施態様２１］
前記試料が、１：２～約１：２０，０００倍希釈される、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
前記試料が、約１：１０倍希釈される、実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２３］
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、実施態様１～２２のいずれかに記載の方法。
［実施態様２４］
ステップａ）における前記インキュベーションが、室温で約１時間にわたって行われる、実施態様１～２３のいずれかに記載の方法。
［実施態様２５］
ステップｃ１）における前記インキュベーションが、室温で約１５分にわたって行われる、実施態様１～２４のいずれかに記載の方法。
［実施態様２６］
ステップｃ２）における前記インキュベーションが、室温で約２５分にわたって行われる、実施態様１～２５のいずれかに記載の方法。
［実施態様２７］
ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の前記除去が、前記固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄することによって行われる、実施態様１～２６のいずれかに記載の方法。
［実施態様２８］
ステップｂ）におけるヒトＦＶＩＩＩの非結合画分の前記除去が、前記固体支持体をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液で約３回洗浄することによって行われる、実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
前記ヒトＦＶＩＩＩが、組換えＦＶＩＩＩである、実施態様１～２８のいずれかに記載の方法。
［実施態様３０］
前記ヒトＦＶＩＩＩが、全長ＦＶＩＩＩである、実施態様１～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３１］
前記ヒトＦＶＩＩＩが、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、実施態様１～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３２］
試料中のヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性を測定するためのキットであって、
ｉ．前記ヒトＦＶＩＩＩに選択的に結合する捕捉剤であって、前記捕捉剤が、固体支持体に結合している、前記捕捉剤、
ｉｉ．活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、カルシウムイオン、リン脂質、及びトロンビンのうちの１つ以上を含む、第１のバイアル、
ｉｉｉ．ＦＸａ特異的発色基質を含む、第２のバイアル、及び／または
ｉｖ．任意に、停止剤を含む、第３のバイアルを含む、前記キット。
［実施態様３３］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、またはＣ２ドメインに選択的に結合する、実施態様３２に記載のキット。
［実施態様３４］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ａ２ドメインに選択的に結合する、実施態様３２または３３に記載のキット。
［実施態様３５］
前記捕捉剤が、ヒトＦＶＩＩＩの前記Ｂドメインに結合しない、実施態様３２または３３に記載のキット。
［実施態様３６］
前記捕捉剤が、抗体、抗原結合断片、アフィボディ、アプタマー、またはアフィニティリガンドである、実施態様３２～３５のいずれかに記載のキット。
［実施態様３７］
捕捉抗体が、ＧＭＡ－８０２４、ＧＭＡ－８０２３、またはその抗原結合断片もしくはバリアントである、実施態様３６に記載のキット。
［実施態様３８］
前記固体支持体が、フラスコ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチウェルプレート、フィルム、チューブ、シート、カラム、またはミクロ粒子である、実施態様３２～３７のいずれかに記載のキット。
［実施態様３９］
前記発色基質が、ＣＨ ３ ＯＣＯ－Ｄ－シクロヘキシルアラニン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡである、実施態様３２～３８のいずれかに記載のキット。
［実施態様４０］
前記停止剤が、酢酸である、実施態様３２～３９のいずれかに記載のキット。
［実施態様４１］
反応緩衝液、ＦＶＩＩＩ希釈緩衝液、洗浄緩衝液、及び／またはＦＶＩＩＩ参照調製物のうちの１つ以上を更に含む、実施態様３２～４０のいずれかに記載のキット。
【国際調査報告】