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特表2024-534216ＲＮＡアフィニティー精製のための組成物および方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】ＲＮＡアフィニティー精製のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/115 20100101AFI20240910BHJP

C12N 15/11 20060101ALI20240910BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20240910BHJP

C12N 15/19 20060101ALI20240910BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240910BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240910BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240910BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP

C12N 15/10 20060101ALI20240910BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240910BHJP

A61K 31/7105 20060101ALI20240910BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP

A61K 39/00 20060101ALI20240910BHJP

A61K 9/127 20060101ALI20240910BHJP

A61K 9/107 20060101ALI20240910BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20240910BHJP

【ＦＩ】

C12N15/115 Z

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/19

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/10 112Z

C12N15/10 110Z

A61K48/00

A61K31/7105

A61K39/395 D

A61K39/00 H

A61K9/127

A61K9/107

A61P37/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513920

(86)(22)【出願日】2022-09-01

(85)【翻訳文提出日】2024-04-26

(86)【国際出願番号】 IB2022058234

(87)【国際公開番号】W WO2023031856

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/240,027

(32)【優先日】2021-09-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】22315159.8

(32)【優先日】2022-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安智

(72)【発明者】

【氏名】ジアンピン・ツイ

(72)【発明者】

【氏名】トン－ミン・フー

(72)【発明者】

【氏名】アリソン・ジェシカ・マシューズ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA17

4C076AA19

4C076CC07

4C076FF11

4C084AA13

4C084MA22

4C084MA24

4C084NA14

4C084ZB09

4C085AA03

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA22

4C086MA24

4C086NA14

4C086ZB09

(57)【要約】

本開示は、ＲＮＡアフィニティー精製のための方法および組成物を提供する。特に本開示は、組成物、およびアフィニティーリガンドと特異的に結合する１つまたはそれ以上のアプタマーを含むｍＲＮＡを製造および使用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡ。

【請求項2】

ＲＮＡアプタマーはＲＮＡスカフォールドに埋め込まれている、請求項１に記載のｍＲＮＡ。

【請求項3】

ＲＮＡスカフォールドは少なくとも１つの二次構造モチーフを含む、請求項２に記載のｍＲＮＡ。

【請求項4】

二次構造モチーフはテトラループ、シュードノット、またはステムループである、請求項３に記載のｍＲＮＡ。

【請求項5】

ＲＮＡスカフォールドは少なくとも１つの三次構造を含む、請求項２～４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項6】

二次構造モチーフおよび／または三次構造はヌクレアーゼ耐性である、請求項２～５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項7】

ＲＮＡスカフォールドはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはリボザイムである、請求項２～６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項8】

リボザイムは触媒的に不活性である、請求項７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項9】

ＲＮＡスカフォールドはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、請求項２～７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項10】

ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡのｔＲＮＡヘアピンループに埋め込まれている、請求項９に記載のｍＲＮＡ。

【請求項11】

ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡのｔＲＮＡアンチコドンループに埋め込まれている、請求項９に記載のｍＲＮＡ。

【請求項12】

ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡのｔＲＮＡＤループに埋め込まれている、請求項９に記載のｍＲＮＡ。

【請求項13】

ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡのｔＲＮＡＴループに埋め込まれている、請求項９に記載のｍＲＮＡ。

【請求項14】

ＲＮＡアプタマーは５’ＵＴＲに位置する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項15】

ＲＮＡアプタマーはＯＲＦの３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間に配置されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項16】

ＲＮＡアプタマーは３’ＵＴＲに位置する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項17】

ＲＮＡアプタマーは３’ＵＴＲの３’末端とポリＡ配列の５’末端との間に配置されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項18】

ＲＮＡアプタマーはポリＡ配列の３’末端に配置されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項19】

ｍＲＮＡは１つのＲＮＡアプタマーを含むか、または１つのＲＮＡアプタマーからなる、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項20】

ｍＲＮＡは１～４個のＲＮＡアプタマーを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項21】

ＲＮＡアプタマーは同一である、請求項１～２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項22】

ＲＮＡアプタマーは別個のものである、請求項１～２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項23】

ＲＮＡアプタマーは合成により得られる、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項24】

ＲＮＡアプタマーはスプリットアプタマーまたはＸアプタマーである、請求項２３に記載のｍＲＮＡ。

【請求項25】

ＲＮＡアプタマーは天然由来のものである、請求項１～２４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項26】

ＲＮＡアプタマーはヘアピンＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはリボスイッチに由来する、請求項２５に記載のｍＲＮＡ。

【請求項27】

ＲＮＡアプタマーは生体直交性のスカフォールドに埋め込まれている、請求項１～２６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項28】

生体直交性のスカフォールドはＶ５、Ｆ２９、Ｆ３０、またはそれらのバリアントである、請求項２７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項29】

生体直交性のスカフォールドは配列番号３４の５’ヌクレオチド配列および配列番号３５の３’ヌクレオチド配列を含み、アプタマー配列は配列番号３４と配列番号３５との間に配置されている、請求項２８に記載のｍＲＮＡ。

【請求項30】

生体直交性のスカフォールドは配列番号３９の５’ヌクレオチド配列、配列番号４０の内部ヌクレオチド配列、および配列番号４１の３’ヌクレオチド配列を含み、第１のアプタマー配列は配列番号３９と配列番号４０との間に配置され、第２のアプタマー配列は配列番号４０と配列番号４１との間に配置され、場合により、第１および第２のアプタマーは同一であるか、または異なるものである、請求項２８に記載のｍＲＮＡ。

【請求項31】

ＲＮＡアプタマーが埋め込まれた生体直交性のスカフォールドは、配列番号２９または配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載のｍＲＮＡ。

【請求項32】

ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに結合する、請求項１～３１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項33】

アフィニティーリガンドはプロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、グルタチオン、デキストラン、または蛍光分子を含む、請求項３２に記載のｍＲＮＡ。

【請求項34】

アフィニティーリガンドはストレプトアビジンを含む、請求項３２または３３に記載のｍＲＮＡ。

【請求項35】

アフィニティーリガンドはクロマトグラフィー樹脂上に固定化されている、請求項３２～３４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項36】

ＲＮＡアプタマーはＳ１ｍまたはＳｍである、請求項１～３５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項37】

１～４個のＳ１ｍまたはｓｍＲＮＡアプタマーを含む、請求項３６に記載のｍＲＮＡ。

【請求項38】

Ｓ１ｍまたはｓｍＲＮＡアプタマーは、
１）ＯＲＦの３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間；
２）３’ＵＴＲ内；
３）３’ＵＴＲの３’末端とポリＡ配列の５’末端との間；および／または
４）ポリＡ配列の３’末端
に配置されている、請求項３６または３７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項39】

ＲＮＡアプタマーは配列番号２または配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項３６～３８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項40】

ＲＮＡアプタマーが埋め込まれたｔＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項３６～３８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項41】

ｍＲＮＡは少なくとも１つのポリペプチドをコードする、請求項１～４０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項42】

ポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチド、治療用ポリペプチド、または抗原性ポリペプチドである、請求項４１に記載のｍＲＮＡ。

【請求項43】

抗原性ポリペプチドは抗体またはそのフラグメント、酵素補充ポリペプチド、またはゲノム編集ポリペプチドを含む、請求項４２に記載のｍＲＮＡ。

【請求項44】

治療用ポリペプチドは抗体重鎖、抗体軽鎖、酵素、またはサイトカインを含む、請求項４２に記載のｍＲＮＡ。

【請求項45】

生物学的に活性なポリペプチドはゲノム編集ポリペプチドを含む、請求項４２に記載のｍＲＮＡ。

【請求項46】

ｍＲＮＡはキメラ５’または３’ＵＴＲを含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項47】

ｍＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項48】

化学修飾はシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、または２－Ｏ－メチルウリジンである、請求項４７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項49】

化学修飾はシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、またはそれらの組み合わせである、請求項４７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項50】

化学修飾はＮ１－メチルシュードウリジンである、請求項４７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項51】

ポリＡ配列は少なくとも１０個の連続するアデノシン残基である、請求項１～５０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項52】

ポリＡ配列は１０～５００個の連続するアデノシン残基である、請求項１～５１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項53】

２つのポリＡ配列を含み、各ポリＡ配列は１０～５００個の連続するアデノシン残基を含み、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーが埋め込まれたｔＲＮＡが２つのポリＡ配列の間に配置されている、請求項１～５２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項54】

ｍＲＮＡは５’キャップを含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項55】

ｍＲＮＡの翻訳効率は、ＲＮＡアプタマーを含まないｍＲＮＡと比較して実質的に同じである、請求項１～５４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項56】

ｍＲＮＡはｉｎｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を用いて合成される、請求項１～５５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項57】

ｍＲＮＡはｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで発現される、請求項１～５５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。

【請求項58】

請求項１～５７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡをコードするベクター。

【請求項59】

ベクターが５’から３’の向きに少なくとも以下の要素ａ～ｅ：
ａ．ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；
ｂ．５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列；
ｃ．ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド配列；
ｄ．３’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列；および
ｅ．少なくとも１つのＲＮＡアプタマーをコードするポリヌクレオチド配列
を含む、請求項５８に記載のベクター。

【請求項60】

ｆ．ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項５９に記載のベクター。

【請求項61】

請求項５８～６０のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項62】

請求項１～５７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡを含む医薬組成物。

【請求項63】

ｍＲＮＡを精製するための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１～５７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡを含む試料をクロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程であって、ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、工程；
（ｂ）クロマトグラフィー樹脂からｍＲＮＡを溶出させる工程；および
（ｃ）試料からｍＲＮＡを精製する工程
を含む方法。

【請求項64】

接触工程（ａ）と溶出工程（ｂ）との間に１つまたはそれ以上の洗浄工程を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

ＲＮＡを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＲＮＡを含む試料をクロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程；
（ｂ）クロマトグラフィー樹脂からＲＮＡを溶出させる工程；および
（ｃ）試料からＲＮＡを単離する工程
を含み、
ＲＮＡは少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含み、
ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、
方法。

【請求項66】

ＲＮＡは少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

ＲＮＡは少なくとも約５００ヌクレオチド長、少なくとも約７５０ヌクレオチド長、少なくとも約１，０００ヌクレオチド長、少なくとも約１，５００ヌクレオチド長、少なくとも約２，０００ヌクレオチド長、少なくとも約２，５００ヌクレオチド長、少なくとも約３，０００ヌクレオチド長、少なくとも約３，５００ヌクレオチド長、少なくとも約４，０００ヌクレオチド長、少なくとも約４，５００ヌクレオチド長、または少なくとも約５，０００ヌクレオチド長である、請求項６５または６６に記載の方法。

【請求項68】

ＲＮＡは５’キャップを含む、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

ＲＮＡはｍＲＮＡである、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

ｍＲＮＡは純度９０％以上である、請求項６５～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

ｍＲＮＡを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）ｍＲＮＡを含む試料をクロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程；
（ｂ）クロマトグラフィー樹脂からｍＲＮＡを溶出させる工程；および
（ｃ）試料からｍＲＮＡを単離する工程
を含み、
ｍＲＮＡは少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列、および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含み、
ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、
方法。

【請求項72】

ｍＲＮＡは純度９０％以上である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

疾患または障害を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項６２に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【請求項74】

複数のｍＲＮＡ分子を含む医薬組成物であって、ｍＲＮＡの少なくとも約９０％が、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列、および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含む、医薬組成物。

【請求項75】

少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのｔＲＮＡを含むｍＲＮＡ。

【請求項76】

少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーが埋め込まれたｔＲＮＡを含むｍＲＮＡ。

【請求項77】

少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーが埋め込まれた生体直交性のスカフォールドを含むｍＲＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年９月２日に出願された米国仮出願第６３／２４０，０２７号および２０２２年７月２０日に出願されたＥＰ優先権出願第２２３１５１５９．８号の優先権の利益を主張するものであり、各々の内容は、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み入れられる。

【背景技術】

【0002】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬は、様々な疾患の治療においてますます重要なアプローチとなりつつあり、タンパク質補充療法、抗体療法、従来的なワクチン療法、および／または遺伝子療法に代わる新たな選択肢である。ｍＲＮＡ治療では、目的のタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡが、患者または患者の標的細胞に送達される。ｍＲＮＡが患者の標的細胞に入ると、患者の翻訳装置が目的のタンパク質またはペプチドを生成し、それに続いて発現させる。よって、高純度で安全なｍＲＮＡ産物を確実に生成することが重要である。

【0003】

治療薬のためのｍＲＮＡはしばしば、鋳型プラスミドＤＮＡからｍＲＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼのような酵素を用いたｉｎｖｉｔｒｏ転写系を用いて合成され、それと同時にまたはその後に５’－キャップの付加および３’－ポリアデニル化が行われる。そのような反応の結果は、全長ｍＲＮＡと様々な望ましくない汚染物質、例えば、タンパク質、非ＲＮＡ核酸、望ましくないＲＮＡ種、スペルミジン、ＤＮＡ、ピロリン酸塩、エンドトキシン、界面活性剤、および有機溶媒を含む組成物である。治療用途に適したクリーンで均質なｍＲＮＡを提供するためには、これらの汚染物質を精製しなければならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

潜在的な治療用途のために、大規模製造プロセスからＲＮＡを精製する、より効果的で信頼性が高く、安全な方法が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書における説明から、本開示は、限定はされないが以下を含む複数の側面および実施形態を包含することが理解されるであろう：

【0006】

１つの側面において、本開示は、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡを提供する。

【0007】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ＲＮＡスカフォールドに埋め込まれている。

【0008】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡスカフォールドは、少なくとも１つの二次構造モチーフを含む。いくつかの実施形態では、二次構造モチーフはテトラループ、シュードノット、またはステムループである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡスカフォールドは、少なくとも１つの三次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造モチーフおよび／または三次構造はヌクレアーゼ耐性である。

【0009】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡスカフォールドは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはリボザイムである。いくつかの実施形態では、リボザイムは触媒的に不活性である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡスカフォールドは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ｔＲＮＡのｔＲＮＡヘアピンループに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ｔＲＮＡのｔＲＮＡアンチコドンループに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ｔＲＮＡのｔＲＮＡＤループに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ｔＲＮＡのｔＲＮＡＴループに埋め込まれている。

【0010】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ＯＲＦの３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間に配置されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、３’ＵＴＲの３’末端とポリＡ配列の５’末端との間に配置されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ポリＡ配列の３’末端に配置されている。

【0011】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つのＲＮＡアプタマーを含むか、または１つのＲＮＡアプタマーからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１～４個のＲＮＡアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは同一である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは別個のものである。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは合成により得られる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはスプリットアプタマーまたはＸアプタマーである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは天然由来のものである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ヘアピンＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはリボスイッチに由来する。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは生体直交性のスカフォールドに埋め込まれている。

【0014】

いくつかの実施形態では、生体直交性のスカフォールドは、Ｖ５、Ｆ２９、Ｆ３０、またはそれらのバリアントである。

【0015】

いくつかの実施形態では、生体直交性のスカフォールドは、配列番号３４の５’ヌクレオチド配列および配列番号３５の３’ヌクレオチド配列を含み、アプタマー配列は配列番号３４と配列番号３５との間に配置されている。

【0016】

いくつかの実施形態では、生体直交性のスカフォールドは、配列番号３９の５’ヌクレオチド配列、配列番号４０の内部ヌクレオチド配列、および配列番号４１の３’ヌクレオチド配列を含み、第１のアプタマー配列は配列番号３９と配列番号４０との間に配置され、第２のアプタマー配列は配列番号４０と配列番号４１との間に配置され、場合により、第１および第２のアプタマーは同一であるか、または異なるものである。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーが埋め込まれた生体直交性のスカフォールドは、配列番号２９または配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、アフィニティーリガンドはプロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、グルタチオン、デキストラン、または蛍光分子を含む。いくつかの実施形態では、アフィニティーリガンドはストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、アフィニティーリガンドはクロマトグラフィー樹脂上に固定化されている。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはＳ１ｍまたはＳｍである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１～４個のＳ１ｍまたはｓｍＲＮＡアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１ｍまたはｓｍＲＮＡアプタマーは、１）ＯＲＦの３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間；２）３’ＵＴＲ内；３）３’ＵＴＲの３’末端とポリＡ配列の５’末端との間；および／または；４）ポリＡ配列の３’末端に配置されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは配列番号２または６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーが埋め込まれたｔＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは少なくとも１つのポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチド、治療用ポリペプチド、または抗原性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメント、酵素補充ポリペプチド、またはゲノム編集ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体重鎖、抗体軽鎖、酵素、またはサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、ゲノム編集ポリペプチドを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはキメラ５’または３’ＵＴＲを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、または２－Ｏ－メチルウリジンである。いくつかの実施形態では、化学修飾はシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１－メチルシュードウリジンである。

【0023】

いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１０個の連続するアデノシン残基である。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は１０～５００個の連続するアデノシン残基である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは２つのポリＡ配列を含み、各ポリＡ配列は１０～５００個の連続するアデノシン残基を含み、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーが埋め込まれたｔＲＮＡが、２つのポリＡ配列の間に配置されている。

【0024】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’キャップを含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの翻訳効率は、ＲＮＡアプタマーを含まないｍＲＮＡと比較して実質的に同じである。

【0026】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはｉｎｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を用いて合成される。

【0027】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで発現される。

【0028】

１つの側面において、本開示は、上記のｍＲＮＡをコードするベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは５’から３’の向きに少なくとも以下の要素ａ～ｅを含む：ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｂ）５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列；ｃ）ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド配列；ｄ）３’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列；およびｅ）少なくとも１つのＲＮＡアプタマーをコードするポリヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。

【0029】

別の側面において、本開示は、上記のベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0030】

別の側面において、本開示は、上記のｍＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、疾患または障害を治療または予防する方法において、それを必要とする対象に投与される。

【0031】

別の側面において、本明細書に開示されるものは、（ａ）ｍＲＮＡを含む試料をクロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程であって、ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、工程；（ｂ）クロマトグラフィー樹脂からｍＲＮＡを溶出させる工程；および（ｃ）試料からｍＲＮＡを精製する工程を含む、ｍＲＮＡを精製するための方法である。いくつかの実施形態では、方法は、接触工程（ａ）と溶出工程（ｂ）との間に１つまたはそれ以上の洗浄工程を含む。

【0032】

別の側面において、本明細書に開示されるものは、ＲＮＡを精製する方法であって、（ａ）ＲＮＡを含む試料をクロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程；（ｂ）クロマトグラフィー樹脂からＲＮＡを溶出させる工程；および（ｃ）試料からＲＮＡを単離する工程を含み、ここで、ＲＮＡは少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含み、ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、方法である。

【0033】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列をさらに含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも約５００ヌクレオチド長、少なくとも約７５０ヌクレオチド長、少なくとも約１，０００ヌクレオチド長、少なくとも約１，５００ヌクレオチド長、少なくとも約２，０００ヌクレオチド長、少なくとも約２，５００ヌクレオチド長、少なくとも約３，０００ヌクレオチド長、少なくとも約３，５００ヌクレオチド長、少なくとも約４，０００ヌクレオチド長、少なくとも約４，５００ヌクレオチド長、または少なくとも約５，０００ヌクレオチド長である。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0036】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは純度９０％以上である。

【0037】

別の側面において、本明細書に開示されるものは、ｍＲＮＡを精製する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡを含む試料をクロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程；（ｂ）クロマトグラフィー樹脂からｍＲＮＡを溶出させる工程；および（ｃ）試料からｍＲＮＡを単離する工程を含み、ここで、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列、および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含み、ＲＮＡアプタマーは、アフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、方法である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは純度９０％以上である。

【0038】

別の側面において、本明細書に開示されるものは、複数のｍＲＮＡ分子を含む医薬組成物であって、ｍＲＮＡの少なくとも約９０％が、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列、および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含む、医薬組成物である。

【0039】

別の側面において、本明細書に開示されるものは、少なくとも１つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのｔＲＮＡを含むｍＲＮＡである。

【0040】

【0041】

【0042】

本開示の上記および他の特徴および利点は、添付の図面と併せて解釈される以下の例示的な実施形態の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】図１は、アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのアフィニティー精製プロセスの工程を図式化したものである。

【図2】図２は、ストレプトアビジンセファロースビーズとのインキュベーション前（入力）、またはランダムアプタマーもしくはＳ１ｍアプタマーのいずれかを用いたストレプトアビジンアフィニティー結合精製および溶出工程後（未結合対溶出）にＮａｎｏｄｒｏｐで測定したＲＮＡ濃度（ｎｇ）を示している。アフィニティー精製後に回収されたＲＮＡの割合は、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する相対値である。

【図3】図３は、４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたＡＲＥエレメントを有するｐＡＭ１４（２，４９６ｂｐ）またはタグ付けされていないＡＲＥエレメントを有するｐＡＭ１５プラスミド（２，１６８ｂｐ）のプラスミドマップを示している。

【図4】図４は、ストレプトアビジンセファロースビーズとのインキュベーション前（入力）、またはＴＮＦα－５３でタグ付けされた４×Ｓ１ｍアプタマーｍＲＮＡもしくはＴＮＦα－５３ｍＲＮＡ陰性対照のいずれかを用いたストレプトアビジンアフィニティー結合精製および溶出工程後（未結合対溶出）にＮａｎｏｄｒｏｐで測定したＲＮＡ濃度（ｎｇ）を示している。精製されたＲＮＡの割合は、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する相対値である。

【図5】図５は、以下のコンストラクトを含む以下のプラスミドマップを示している：（１）ｐＡＭ２２、Ｍ．サームオートトロフィカス（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓｔ）のｔＲＮＡ^ＧＬＮ２スカフォールドを保持する２，１７３ｂｐの対照プラスミド（ｐＡＭ２２（ｔＲＮＡ）；プラスミドマップには、Ｇｌｎ２アンチコドンループに対するアンチコドンアームの位置に注釈が付けられている）、（２）ｐＡＭ２０、Ｓｍアプタマーを保持する２，１３４ｂｐの対照プラスミド（ｐＡＭ２０（Ｓｍ））、（３）ｐＡＭ２１、ｔＲＮＡアンチコドンアーム配列が両側に隣接するアンチコドンループｔＲＮＡ^ＧＬＮ２配列の一部に埋め込まれたＳｍアプタマー配列を保持する２，２０６ｂｐの実験用プラスミド（ｐＡＭ２１（ｔＲＮＡＳｍ）、および（４）ｐＡＭ２３、Ｓｍ－ｔＲＮＡ^ＧＬＮ２コンストラクトのタンデム２リピート構成を保持する２，３０６ｂｐの実験用プラスミド（２×ｔＲＮＡＳｍ）。各タグはＴ７プロモーターにより駆動された。

【図6】図６は、ストレプトアビジンセファロースビーズとのインキュベーション前（入力）、またはＳｍ、ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ－Ｓｍ、および２×ｔＲＮＡＳｍアプタマータグを含むｍＲＮＡのいずれかを用いたストレプトアビジンアフィニティー結合精製洗浄工程（洗浄１～３）および溶出工程（溶出）後にＮａｎｏｄｒｏｐで測定したＲＮＡ濃度（ｎｇ）を示している。アフィニティー精製後におけるＲＮＡ回収の割合は、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する相対値である。

【図7】図７は、アプタマー－転写産物の局在化、アプタマーのコピー数、ｔＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたアプタマー、およびｔＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたアプタマーのタンデムリピートコピーに基づく、最適化された結合親和性とｍＲＮＡの翻訳のためのアプタマータグ付けストラテジーを示している。

【図8】図８は、ヒト化強化緑色蛍光タンパク質（ｈＥＧＦＰ）を保持するｐＡＭ１１（３，５４１ｂｐ）および４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｈＥＧＦＰを保持するｐＡＭ８プラスミド（３，２１３ｂｐ）のプラスミドマップを示している。

【図9】図９は、ｈＥＧＦＰ（レーン１、ｐＡＭ１１由来）および４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｈＥＧＦＰ（レーン２、ｐＡＭ８由来）のＰＣＲ産物鋳型のＩＶＴ反応から生成されたｍＲＮＡを含むアガロースゲルの画像である。

【図10】図１０は、ストレプトアビジンセファロースビーズとのインキュベーション前（入力）、またはｈＥＧＦＰもしくは４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｈＥＧＦＰを含むｍＲＮＡのいずれかを用いたストレプトアビジンアフィニティー結合精製および溶出工程（溶出）後にＮａｎｏｄｒｏｐで測定したＲＮＡ濃度（ｎｇ）を示している。精製されたＲＮＡの割合は、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する相対値である。

【図11】図１１は、ｈＥＧＦＰまたはｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の２４時間後における代表的な蛍光顕微鏡画像である。

【図12】図１２は、２４時間後にｈＥＧＦＰ（左列、上パネル）、ｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍ（左列、下パネル）、長いポリＡテールを有するｈＥＧＦＰ（右列、上パネル）、または長いポリＡテールを有するｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍ（右列、下パネル）ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を撮影した代表的な蛍光顕微鏡画像のパネルを示している。

【図13】図１３Ａ～図１３Ｂは、Ｓ１ｍアプタマーのトポロジー的順序が下流のｍＲＮＡアフィニティー精製に影響を与えるかどうかをテストしている。図１３Ａは、ｍＲＮＡ転写産物中のＳ１ｍアプタマーの位置をテストするために設計された実験用コンストラクトの概略図である。Ｓ１ｍアプタマーを（１）５’ＵＴＲの直に上流、（２）３’ＵＴＲの直に上流、（３）３’ＵＴＲ中、（４）３’ＵＴＲの直に下流、または（５）ポリＡ配列の３’末端のいずれかに配置した。図１３Ｂは、ストレプトアビジン結合および溶出工程（未結合対溶出）の後、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する、アフィニティー精製後に回収されたＲＮＡの割合を示している。

【図14】図１４は、転写産物中のアプタマーのコピー数（価数）が下流のｍＲＮＡアフィニティー精製に影響を与えるかどうかをテストしている。図１４は、１から６コピーのＳ１ｍアプタマーを含むｍＲＮＡコンストラクトを用いたストレプトアビジン結合および溶出工程（未結合対溶出）の後、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する、アフィニティー精製後に回収されたＲＮＡの割合を示している。

【図15】図１５は、２×Ｓ１ｍ、４×Ｓ１ｍ、または異なるタンパク質コード配列（シンガポール’１６ヘマグルチニン）および異なるＵＴＲを含むｔＲＮＡＳ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡを用いたストレプトアビジン結合および溶出工程（未結合対溶出）の後、アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する、ｍＲＮＡアフィニティー精製後に回収されたＲＮＡの割合を示している。

【図16】図１６Ａ～図１６Ｃは、ｍＲＮＡ転写産物におけるアプタマーの配置が、ＨＳＫＭｃ細胞における翻訳動態に影響を及ぼすかどうかをテストしている。図１６Ａは、ｍＲＮＡの他のトポロジー的順序の成分に対するＳ１ｍアプタマーの位置の影響をテストするために設計された実験用コンストラクトの概略図である。図１６Ｂは、タグ付けされていない対照ｍＲＮＡまたは図１６Ａに示した５つの、アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＳＫＭｃ細胞について、フローサイトメトリー解析により算出したＧＦＰ陽性細胞の総数（パーセントで表示）の棒グラフである。図１６Ｃは、図１６ＢにおけるＧＦＰ陽性高細胞数（パーセントで表示）を示す棒グラフである。

【図17】図１７Ａ～図１７Ｃは、ｍＲＮＡ転写産物におけるアプタマーの配置が、Ｈｅｌａ細胞における翻訳動態に影響を及ぼすかどうかをテストしている。図１７Ａは、ｍＲＮＡの他のトポロジー的順序の成分に対するＳ１ｍアプタマーの位置の影響をテストするために設計された実験用コンストラクトの概略図である。図１７Ｂは、タグ付けされていない対照ｍＲＮＡまたは図１７Ａに示した５つの、アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞について、フローサイトメトリー解析により算出したＧＦＰ陽性細胞の総数（パーセントで表示）の棒グラフである。図１７Ｃは、図１７ＢにおけるＧＦＰ陽性高細胞数（パーセントで表示）のみを示した棒グラフである。

【図18】図１８は、対照、またはポリＡテール長を増加させたアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡ（「アプタマー、ポリ（Ａ）２×６０＿６＋Ａ’ｓ」と表示）のいずれかをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞について、フローサイトメトリー解析により算出したＧＦＰ陽性細胞の総数（パーセントで表示）の棒グラフを示している。

【図19】図１９Ａ～図１９Ｂは、ｔＲＮＡスカフォールドによるＳ１ｍアプタマーの安定化が、ｍＲＮＡアフィニティー精製およびその後のｍＲＮＡ翻訳効率に影響を及ぼすかどうかを調べている。図１９Ａは、タグ付けされていないｍＲＮＡ対照、２×Ｓ１ｍアプタマー、４×Ｓ１ｍアプタマー転写産物、またはｔＲＮＡＳ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡを用いたストレプトアビジン結合および溶出工程（未結合対溶出）後の、入力試料に対するｍＲＮＡアフィニティー精製後に回収されたＲＮＡの割合を示す棒グラフである。図１９Ｂは、タグ付けされていないｍＲＮＡ対照またはｔＲＮＡＳ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡ（「ｔＲＮＡ安定化アプタマー」と表示）をトランスフェクションした後、フローサイトメトリー解析により算出したＧＦＰ陽性Ｈｅｌａ細胞の総数（パーセントで表示）の棒グラフである。

【図20】図２０Ａは、Ｆ３０－アプタマーによって形成される二次ＲＮＡ構造である。図２０Ｂは、タグ付けされていないｍＲＮＡ対照、４×Ｓ１ｍアプタマー、Ｆ３０スカフォールドで安定化させた１×Ｓ１ｍアプタマー（Ｆ３０－１×Ｓ１ｍ）、またはＦ３０スカフォールドで安定化させた２×Ｓ１ｍアプタマー（Ｆ３０－２×Ｓ１ｍ）でタグ付けされたｍＲＮＡを用いたストレプトアビジン結合および溶出工程（未結合対溶出）の後、入力試料に対するｍＲＮＡアフィニティー精製後に回収されたＲＮＡの割合を示す棒グラフである。図２０Ｃは、ストレプトアビジンセファロースビーズとのインキュベーション前（入力）、またはタグ付けされていないｍＲＮＡ対照、４×Ｓ１ｍアプタマー、Ｆ３０－２×Ｓ１ｍアプタマー、またはＦ３０－１×Ｓ１ｍでタグ付けされたｍＲＮＡのいずれかを用いたストレプトアビジンアフィニティー結合精製および溶出工程（溶出）後にＮａｎｏｄｒｏｐで測定したＲＮＡ濃度（ｎｇ）を示している。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本開示は、特に、新規のｍＲＮＡ組成物およびＲＮＡアフィニティー精製のための方法を対象とする。特に、本開示は、少なくとも１つのＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡ組成物に関する。開示されたｍＲＮＡ組成物に関連するＲＮＡアプタマーは、効果的なアフィニティー精製法の使用を可能にし、なおかつ翻訳効率および免疫原性への最小限の影響を有する。また、本明細書には、これらのｍＲＮＡでタグ付けされたアプタマー組成物を製造する方法も開示される。

【0045】

Ｉ．定義
本明細書中で他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に使用される。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書が優先するものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される学術用語、および技術は、当該技術分野において周知であり、そして一般的に使用されている。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように、製造元の仕様書に従って実施される。さらに、文脈によって別段要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態を通じて、用語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された整数または整数の群を含むことを意味すると理解されるが、他のいかなる整数または整数の群も除外するものではない。本明細書において言及された全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。本明細書では多数の文献が引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における一般常識の一部を形成することを認めるものではない。

【0046】

「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語は、その実体の１つまたはそれ以上を指すことに留意されたい；例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を表すものと理解される。したがって、本明細書では、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたはそれ以上の（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」という用語は互換的に使用される。

【0047】

さらに、本明細書で使用される「および／または」は、２つの指定された特徴または成分の各々について、他方を伴うか伴わないかにかかわらず、具体的な開示とみなされる。よって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ（単独）」、および「Ｂ（単独）」を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される「および／または」という用語は、以下の各側面を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0048】

側面が「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という言葉で本明細書において記載されている場合は常に、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ（からなる）」および／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ（から本質的になる）」の観点で記載される類似の側面もまた提供されることが理解される。

【0049】

特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、この開示の関連する当該技術分野の通常の熟練者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ＣｏｎｃｉｓｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第２版、２００２年、ＣＲＣＰｒｅｓｓ；ＴｈｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓおよびＯｘｆｏｒｄＤｉｃｔｉｏｎａｒｙＯｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、改訂版、２０００年、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供しうる。

【0050】

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記される。数値範囲は、範囲を定義する数値を含んでいる。特に断りのない限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な側面を限定するものではない。したがって、すぐ下に定義した用語は、本明細書の全体を参照することによって、より完全に定義される。

【0051】

「およそ」または「約」という用語は、本明細書において、およそ、おおよそ、その周辺、またはその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、それは記載された数値の上下の境界を拡張することによって、その範囲を修正する。一般的に、「約」という用語は、例えば、１０パーセントの上下（高低）の変動によって、記載された値の上下に数値を修正しうる。いくつかの実施形態では、本用語は、指し示された数値から±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％、±０．１％、±０．０５％、または±０．０１％の偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±１０％の偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±５パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±４パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±３パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±２パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±１パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．９パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．８パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．７パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．６パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．５パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．４パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．３パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．１パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．０５パーセントの偏差を指し示す。いくつかの実施形態では、「約」は指し示された数値から±０．０１パーセントの偏差を指し示す。

【0052】

文脈に応じて、「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単数の核酸および複数の核酸を包含しうる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるようなアミド結合）を含む。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する１つまたはそれ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを指しうる。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドにより、その本来の環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含まれる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本開示の目的では単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中で維持された、または溶液中の他のポリヌクレオチドから（部分的または実質的に）精製された組換えポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子には、本開示のポリヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏＲＮＡ転写産物が含まれる。本開示に従う単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに合成的に生成されたそのような分子を含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルのような調節エレメントを含みうる。

【0053】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および複数形の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を意味し、特定の長さの産物を指すものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つの鎖または複数の鎖を指すために使用される他のいかなる用語も、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用される。「ポリペプチド」という用語はまた、限定はされるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然起源のアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するものでも、組換え技術によって産生されたものでもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものである必要はない。それは、化学合成を含め、どのような方法でも生成される。

【0054】

「単離された」ポリペプチド、またはそのフラグメント、バリアント、または誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製が要求されることはない。例えば、単離されたポリペプチドは、単純にその本来の環境または自然環境から取り除かれる。宿主細胞中で発現された組換え生成ポリペプチドおよびタンパク質は、本開示の目的のために単離されたものとみなされ、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えのポリペプチドも同様である。

【0055】

本明細書で使用される場合、「投与する」または「投与すること」とは、本明細書に記載の組成物、例えば、キメラタンパク質を対象に送達することを指す。組成物、例えば、キメラタンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いて対象に投与される。特に、組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、または任意の粘膜表面、例えば、経口、舌下、頬側、鼻腔、直腸、膣、または肺経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、投与は静脈内投与である。いくつかの実施形態では、投与は皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は自己投与である。いくつかの実施形態では、親が子供にキメラタンパク質を投与する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、医師、衛生士、看護師のような医療従事者によって対象に投与される。

【0056】

ＩＩ．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
本明細書で開示するのは、ＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡ組成物である。ｍＲＮＡは典型的には、ＤＮＡからリボソームへ情報を伝達するタイプのＲＮＡと考えられている。ｍＲＮＡの存在は典型的に非常に短く、プロセシングと翻訳、それに続く分解を含む。典型的には、真核生物では、ｍＲＮＡのプロセシングは、Ｎ末端（５’）に「キャップ」を、Ｃ末端（３’）に「テール」を付加することを含む。

【0057】

典型的なキャップは、５’－５’－三リン酸結合を介して最初の転写ヌクレオチドに連結されるグアノシンの７－メチルグアノシンキャップである。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を与える上で重要である。５’キャップは典型的には、次のようにして追加される：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸を残す；次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸連結が生成される；そして、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによってメチル化される。

【0058】

テールは典型的には、ポリアデニル化イベントであり、それによってポリアデニリル部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加される。この「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを守る役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡはリボソームによって、タンパク質を構成する一連のアミノ酸へと翻訳される。

【0059】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つまたはそれ以上の要素を含む５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは約５０から５００ヌクレオチド長でありうる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、ポリアデニル化シグナル、細胞内のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質への結合部位、またはｍｉＲＮＡに対する１つまたはそれ以上の結合部位のうちの１つまたはそれ以上を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは５０から５００ヌクレオチド長以上であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写産物によってコードされる遺伝子とは異なる遺伝子に由来する５’または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、キメラである５’または３’ＵＴＲを含む。

【0060】

本明細書に開示のｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成されうる。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を介して合成されてもよい。ｉｎｖｉｔｒｏ転写の方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｇｅａｌｌら、（２０１３年）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２）：１５２～１５９頁；Ｂｒｕｎｅｌｌｅら、（２０１３年）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５３０：１０１～１４頁を参照されたい。簡単に説明すると、ＩＶＴは典型的には、プロモーターを含む直鎖状もしくは環状のＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含みうるバッファー系、および適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅインヒビターを用いて行われる。正確な条件は、具体的な用途によって変動するであろう。これらの試薬の存在は、最終的なｍＲＮＡ産物には望ましくなく、治療用途に適したクリーンで均質なｍＲＮＡを提供するために精製されなければならない不純物または汚染物質とみなされる。いくつかの実施形態では、ｉｎｖｉｖｔｒｏ転写反応から提供されるｍＲＮＡが望ましい場合があるが、細菌、真菌、植物、および／または動物から生成される野生型ｍＲＮＡを含む、他のｍＲＮＡ源が本開示に従って使用されてもよい。

【0061】

本明細書に開示の方法は、様々なヌクレオチド長のｍＲＮＡを精製するために使用されうる。いくつかの実施形態において、開示の方法は、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂを超える長さのｍＲＮＡを精製するために使用されうる。本明細書に開示のｍＲＮＡは、修飾されていても修飾されていなくてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、典型的にはＲＮＡの安定性を高める１つまたはそれ以上の修飾を含む。例示的な修飾は、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、ならびにプリンおよびピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として、例えば、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニルアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－チオシトシン、３－メチルシトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチルシトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、クエオシン、β－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、およびイノシンを含むがこれらに限定されない、天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されうる。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、および２－Ｏ－メチルウリジンからなるが、限定はされない、少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含む。そのような類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および米国特許第５，７００，６４２号から、当業者には公知である。

【0062】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、単一の遺伝子または単一の合成もしくは発現コンストラクト由来のｍＲＮＡを含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物は、複数のｍＲＮＡ転写産物を含み、各々が１つまたはそれ以上のタンパク質をコードしうるか、または集合的にコードする。

【0063】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示のＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡは、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体重鎖、抗体軽鎖、酵素、またはサイトカインを含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡはサイトカインをコードする。サイトカインの非限定的な例は、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＦＳ、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、成長因子、およびｈＧＨを含む。

【0065】

１つの実施形態では、ＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡは、ゲノム編集ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ゲノム編集ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮを含むＴＡＬＥ）、またはジンクフィンガータンパク質（ＺＦヌクレアーゼ、ＺＦＮを含むＺＦ）である。例えば、国際公開第ＷＯ２０２０１３９７８３号を参照されたい。

【0066】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、酵素補充療法において利用される酵素をコードする。酵素補充療法の例は、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳＩ、ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳＶＩ、およびグリコーゲン貯蔵病ＩＩ型のようなライソゾーム病を含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡは、目的の抗原をコードする。抗原は、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＭＥＲＳ関連ウイルス）、エボラウイルス、デングウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ジカウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、またはチクングニアウイルスに由来するポリペプチドでありうる。

【0068】

抗原は、細菌、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、モラクセラ（例えば、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）；耳炎、呼吸器感染症、および／または副鼻腔炎を引き起こす）、クラミジア・トラコーマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（クラミジアを引き起こす）、ボレリア（例えば、ライム病を引き起こすボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、炭疽菌（炭疽を引き起こす）、腸チフス菌（腸チフスを引き起こす）、結核菌（結核を引き起こす）、アクネ菌（ニキビを引き起こす）、または非定型インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に由来するものでありうる。

【0069】

望まれる場合、ＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡは、複数の抗原をコードしていてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の抗原をコードする。これらの抗原は、同じ病原体、または異なる病原体由来のものでありうる。例えば、複数の抗原に翻訳可能なポリシストロニックｍＲＮＡ（例えば、各抗原コード配列が２Ａペプチドのような自己切断ペプチドをコードするヌクレオチドリンカーによって分離されている）が、さらにアプタマーに融合される。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物はワクチンにおいて使用される。ｍＲＮＡワクチンは、病原体由来の抗原タンパク質を含む従来的なサブユニットワクチンの有望な代替物を提供する。ｍＲＮＡをベースとするワクチンは、ワクチン接種対象における複雑な抗原のｄｅｎｏｖｏ発現を可能とし、その結果、適切な翻訳後修飾と、抗原の、その天然のコンフォメーションでの提示とを可能とする。さらに、ｍＲＮＡワクチンの製造プロセスは、一度確立されれば、様々な抗原に使用することができ、ｍＲＮＡワクチンの迅速な開発と展開が可能となる。ｍＲＮＡワクチンの詳細な議論は、Ｐａｒｄｉら、（２０１８年）ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ１７、２６１～２７９頁に見出される。

【0071】

ＩＩＩ．アプタマー
ＲＮＡのアフィニティー精製の広範な使用は、効率的なＲＮＡ融合タグの欠如のために制限されてきた。精製されるＲＮＡが、固定相（すなわち、クロマトグラフィー樹脂）に固定化できる標的に対する強い親和性を持つ配列を自然に含んでいない限り、ＲＮＡは、タンパク質科学で使用されるポリヒスチジンタグに類似した、そうするための特定の配列によるタグ付けを必要としうる。

【0072】

本明細書で開示するのは、少なくとも１つのアプタマーを含むｍＲＮＡ組成物である。これらのｍＲＮＡ組成物に関連するアプタマーは、アフィニティー精製の使用を可能にし、翻訳効率および免疫原性への最小限の影響を有する。また、本明細書には、そのようなｍＲＮＡでタグ付けされたアプタマー組成物を製造する方法も開示される。

【0073】

本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、特定の標的に対する非共有結合部位を有する任意の核酸配列を指す。例示的なアプタマー標的には、核酸配列、タンパク質、ペプチド、抗体、小分子、ミネラル、抗生物質などが含まれる。アプタマー結合部位は、アプタマーの二次構造、三次構造、またはコンフォメーション構造に起因して生じうる。

【0074】

本明細書で使用される「ＲＮＡアプタマー」という用語は、ＲＮＡから構成されるアプタマーを意味する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡアプタマーはｍＲＮＡ転写産物のヌクレオチド配列中に含まれる。他の実施形態では、ＲＮＡアプタマーはｍＲＮＡ転写産物のヌクレオチド配列から分離されている。

【0075】

アプタマーは典型的には、高い親和性と特異性で特定の標的に結合することができる。アプタマーは、他の結合タンパク質（例えば、抗体）と比べて、いくつかの利点を有する。例えば、アプタマーは完全にｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、ＳＥＬＥＸアプタマー選択法を介して）改変することができ、化学合成によって製造することができ、望ましい保存特性を有し、そして、治療用途において免疫原性をほとんど、あるいは全く誘発しない。一般的には、Ｐｒｏｓｋｅら、（２００５年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ６９：３６７～３７４頁を参照されたい。

【0076】

アプタマーは歴史的には、リガンドに直接結合することによって遺伝子発現を調節するために使用されてきた。これらのアプタマーは制御タンパク質と同様に作用し、標的に対して非常に特異的な結合ポケットを形成し、その後、コンフォメーションが変化する。

【0077】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは合成により得られる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、原核生物および／または真核生物から天然に由来する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ヘアピンＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはリボスイッチに由来する。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはリボスイッチに由来する。リボスイッチは、遺伝子の転写および翻訳を制御する小分子センサーとして機能する制御性ＲＮＡエレメントである。いくつかのリボスイッチのクラスが、当技術分野で知られている。例示的なリボスイッチは、Ｂ_１２リボスイッチ、ＴＰＰリボスイッチ、ＳＡＭリボスイッチ、グアニンリボスイッチ、ＦＭＮリボスイッチ、リジンリボスイッチ、およびＰｒｅＱ１リボスイッチを含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはスプリットアプタマーである。スプリットアプタマーは、スプリット－タンパク質系（β－ガラクトシダーゼなど）に類似したものであり、特定の標的が存在すると、より高次の構造へと集合する２つまたはそれ以上の短い核酸鎖に依存する。Ｄｅｂａｉｓら、（２０２０年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４８（７）：３４００～３４２２頁。例示的なスプリットアプタマーはＡＴＰ－アプタマーである。ＳａｓｓａｎｆａｒとＳｚｏｓｔａｋ（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ３６４（６４３７）－５５０～５５３頁。ＡＴＰアプタマーは、ステムを閉じるループを取り除き、安定性の損失を補うための追加のヌクレオチドにより各フラグメントを延長することで、２つのＲＮＡフラグメントに分割されたＲＮＡアプタマーである。２つのＲＮＡフラグメントはどちらも単独ではＡＴＰと結合しないが、ＡＴＰの存在下では結合能力が再活性化される。Ｄｅｂｉａｉｓら、（２０２０年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４８（７）：３４００～３４２２頁。

【0080】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはＸ－アプタマーである。Ｘ－アプタマーは、結合親和性、特異性、および汎用性を向上させるために、天然ヌクレオチドと化学修飾ヌクレオチドを組み合わせて改変されている。Ｘ－アプタマーの例示的な実施形態はＰＳ２－アプタマーである。ＰＳ２－アプタマーは、ＲＮＡアプタマーの１ヌクレオチドにホスホロジチオエート（すなわち、ＰＳ２）置換を含むＲＮＡアプタマーであり、アプタマーの結合親和性がナノモルからピコモルの範囲に高められている。Ａｂｅｙｄｅｅｒａら、（２０１６年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４４（１７）：８０５２～８０６４頁。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドはアフィニティー精製系で利用される。いくつかの実施形態において、アフィニティーリガンドは、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、グルタチオン（ＧＳＨ）、デキストラン（セファデックス）、セルロース（例えば、ジエチルアミノエチルセルロース）または蛍光分子を含む。いくつかの実施形態では、アフィニティーリガンドはクロマトグラフィー樹脂上に固定化されている。

【0082】

いくつかの実施形態において、アフィニティーリガンドは、プロテインＡを含む。ＤＮＡアプタマーは、プロテインＡを標的とすることが以前に示されている。例えば、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇら、（２０１６年）ＳｃｉＲｅｐ．６：３３８１２を参照されたい。

【0083】

いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡアプタマーはストレプトアビジンと結合する。ストレプトアビジン結合アプタマーについては、例えば、ＳｒｉｓａｗａｔとＥｎｇｅｌｋｅ（２００１年）ＲＮＡ７（４）：６３２～６４１頁に記載されている。

【0084】

また、セファデックスに結合するＲＮＡアプタマーも本明細書に開示される。セファデックス結合アプタマーは、例えば、Ｓｒｉｓａｗａｔら、（２００１年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ２９（２）：ｅ４に記載されている。

【0085】

グルタチオン（ＧＳＨ）に結合するＲＮＡアプタマーも本明細書に開示される。グルタチオン結合アプタマーについては、例えば、Ｂａｌａら、（２０１１年）、ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ８（１）：１０１～１１１頁に記載されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはＧＳＨａｐｔ８．１７またはＧＳＨａｐｔ５．３９である。

【0086】

また、蛍光分子に結合するＲＮＡアプタマーも本明細書に開示される。そのようなアプタマーの例は、例えば、Ｐａｉｇｅら、（２０１１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３３（６０４２）：６４２～６４６頁に記載されている。

【0087】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはＳ１ｍアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、本開示に従って使用されるＳ１ｍアプタマーは、Ｂａｃｈｌｅｒら、（１９９９年）ＲＮＡ５（１１）：１５０９～１５１６頁、ＳｒｉｓａｗａｔとＥｎｇｅｌｋｅ（２００１年）ＲＮＡ７（４）：６３２～６４１頁、またはＬｉとＡｌｔｍａｎ、（２００２年）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３０（１７）：３７０６～３７１１頁に記載されているアプタマーである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡアダプターは配列番号２のヌクレオチド配列を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはＳｍアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡアダプターは配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

【0089】

Ａ．アプタマーの位置
ｍＲＮＡ中へのアプタマーの導入は、翻訳に影響を与えることが報告されている。ｍＲＮＡ上のアプタマーの位置は、翻訳への影響の大きさを部分的に決定しうる。例えば、構造化したＲＮＡを転写産物の５’－ＵＴＲに挿入すると、タンパク質の翻訳レベルが低下すると一般に考えられている。Ｂａｂｅｎｄｕｒｅら、（２００６年）、ＲＮＡ１２：８５１～８６１頁；Ｋｏｔｔｅｒら、（２００９年）ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３７（１８）：ｅ１２０。アプタマーをｍＲＮＡ分子の５’ＵＴＲに挿入するとヘアピンループが形成され、ｍＲＮＡの構造が変化してリボソームへのアクセスが阻害され、翻訳が妨げられる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１３６８２７号を参照されたい。

【0090】

本明細書では、ｍＲＮＡのＯＲＦに関して様々な位置にあるアプタマーを含むＲＮＡアプタマーが開示される。ｍＲＮＡ上のＲＮＡアプタマーの位置の選択は、翻訳の制御の大きさと基礎発現レベルの両方に関して評価される。例えば、キャップまたは開始コドンから０～１００塩基の間の５’－ＵＴＲ内の様々な位置にアプタマーを含むレポーターコンストラクトが構築されうる。いくつかの実施形態では、アプタマーの後の下流領域は、ペプチドリーダー配列を保存するために維持でき、それにより、アプタマーに対する上流配列の改変が制限される。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、５’ＵＴＲに続いて、タンパク質をコードするＯＲＦの直前に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に続いて、３’ＵＴＲの直前に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ＯＲＦの３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間に配置されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは３’ＵＴＲに配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは３’ＵＴＲの下流、ポリＡテールの直前に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、３’ＵＴＲの３’末端とポリＡ配列の５’末端との間に配置されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはポリＡテールの直後（すなわち、転写産物の末端）に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ポリＡ配列の３’末端に配置されている。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはｍＲＮＡに直接結合していなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはリンカーに結合している。例えば、Ｅｌｅｎｋｏら、（２００９年）ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ．１３１（２９）：９８６６～９８６７頁を参照されたい。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはアフィニティー精製後にｍＲＮＡから除去される。これは、例えば、ＲＮＡアプタマーまたはＲＮＡスカフォールドにハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて達成されうる。その結果生じる二重鎖は、その後、ＲＮａｓｅＨのような酵素で切断される。例えば、ＢａｔｅｙＲＴ、（２０１４年）、ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ．２６：１～８頁を参照されたい。

【0094】

Ｂ．アプタマーのコピー数
アプタマーのコピー数の増加は、アプタマーがより大きな三次元構造を形作ること（すなわち、利用可能なアフィニティーリガンド結合部位の数を高めること、またはユニークなリガンド結合部位を形成すること）を可能にしうる。アプタマーコピーを戦略的に配置することで、同族のアフィニティーリガンドとのアビディティーの増強が可能となりうる。

【0095】

いくつかの実施形態において、開示された方法および組成物において使用されるｍＲＮＡは、アプタマーの複数のコピーを含む。これまでの報告によると、５’－ＵＴＲにおいて低分子結合アプタマーを１つ使用すると、リガンド添加時に翻訳の８倍の抑制が可能となるが、アプタマーを３つ使用すると３７倍抑制される。Ｋｏｔｔｅｒら、（２００９年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３７（１８）：ｅ１２０。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡに導入されるアプタマーのコピー数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは複数のコピーのアプタマー配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡアプタマーは配列番号５のヌクレオチド配列を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、アプタマーのコピーは、反復タンデム構成にある。本明細書に開示の４×Ｓ１ｍアプタマーは、反復タンデム構成の複数コピーアプタマーの一例である。

【0098】

ＩＶ．ＲＮＡスカフォールド
いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物は、ＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたＲＮＡアプタマーを含む。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡスカフォールド」という用語は、目的の機能モジュールの特性を組織化、保護、または強化するための空間アーキテクチャを形作る、予め定義された構造を有するように集合しうるノンコーディングＲＮＡ分子を指す。例示的な機能モジュールは、核酸（例えば、アプタマー）またはタンパク質でありうる。いくつかの実施形態において、本開示に従う使用に適したＲＮＡスカフォールドは、ＲＮＡ構造を破壊することなくＲＮＡと会合しうる。さらに、適切なＲＮＡスカフォールドは、ＲＮＡ構造を破壊することなく、ＲＮＡアプタマーの埋め込みを可能とする。いくつかの実施形態において、本開示に従って使用されるＲＮＡスカフォールドは、ＲＮＡの発現または翻訳に有意な悪影響を及ぼさない任意のＲＮＡスカフォールドでありうる。

【0099】

ＲＮＡスカフォールドの予め定義された構造は、ヘアピンステム間の塩基対形成（キッシングループ）のような自己集合のためのＲＮＡ特異的配列モチーフ、および／または化学修飾を含む。ＭｙｈｒｖｏｌｄとＳｉｌｖｅｒ（２０１５年）ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏ２２（１）：８～１０頁。ＲＮＡ特異的配列モチーフは、二次構造（すなわち、二次元構造）および／または三次構造（すなわち、三次元構造）を形成しうる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡスカフォールドは、少なくとも１つの二次構造モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡスカフォールドは、少なくとも１つの三次構造モチーフを含む。一般的な二次および／または三次ＲＮＡ構造モチーフは、オープンおよびスタック型の３方向ジャンクション、４方向ジャンクション、ホリデイ構造に類似した４方向ジャンクション、ステムループ（すなわち、ヘアピンループ）、内部ループ（すなわち、インターナルループ）、バルジ、テトラループ、マルチブランチループ、シュードノットおよびノット、９０°キンク、ならびに偽ねじれ角を含む。Ｓｈａｎｎａら、（２０２１年）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６（５）：１４２２。

【0100】

ＲＮＡスカフォールドは、天然由来のもの（例えば、アテニュエーター、ｔＲＮＡ、リボスイッチ、ターミネーター）または二次もしくは三次ＲＮＡ構造を形成するように人工的に改変されたもののいずれかでありうる。Ｄｅｌｅｂｅｃｑｕｅら、（２０１２年）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ７（１０）：１７９７～１８０７頁。典型的には、ＲＮＡスカフォールドの所定の構造を保持するために、ＲＮＡスカフォールドのＲＮＡループ（例えば、ヘアピンループ）が、目的の機能モジュールを埋め込むための標的領域となる。例えば、米国特許出願公開第２００５０２８２１９０Ａ１号を参照されたい。しかしながら、ＲＮＡスカフォールドの所定の構造は、さらに望ましい特性を持つように修正される。例えば、エキソヌクレアーゼ消化とエンドヌクレアーゼ消化の一方または両方に対して耐性を持つように、所定のＲＮＡスカフォールド構造が修正されうる。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に埋め込まれたＲＮＡアプタマーを含む。ｔＲＮＡは標準的な安定したクローバーリーフ構造に折り畳まれ、アンフォールディングに耐性があり、ヌクレアーゼ分解からＲＮＡ融合物を保護することができることから、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）スカフォールドは、アフィニティー精製系における魅力的なタグ付けの候補となる。アプタマーをｔＲＮＡスカフォールドのアンチコドンループに埋め込むと、適切なフォールディングが促進されることが実証されている。一般に、ＰｏｎｃｈｏｎとＤａｒｄｅｌ（２００７年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４（７）：５７１～５７６頁；Ｐｏｎｃｈｏｎら、（２０１３年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４１：ｅ１５０を参照されたい。ｔＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたＲＮＡアプタマーを使用すると、細胞溶解物から転写産物特異的なＲＮＡ結合タンパク質を首尾良くプルダウンできることが実証されている。ＩｉｏｋａＨら、（２０１１年）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（８）：ｅ５３。

【0102】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物は、配列番号７のヌクレオチド配列を含むｔＲＮＡに埋め込まれたＲＮＡアプタマーを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、ｔＲＮＡのｔＲＮＡヘアピンループに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡアンチコドンループに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡＤループに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはｔＲＮＡＴループに埋め込まれている。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物は、生体直交性のスカフォールドに埋め込まれたＲＮＡアプタマーを含む。生体直交性のスカフォールドの顕著な特徴は、細胞内ヌクレアーゼによって認識されず、分解の標的とならないことである。Ｆｉｌｏｎｏｖら、（２０１５年）ＣｈｅｍＢｉｏｌ．２２（５）：６４９～６６０頁。生体直交性のスカフォールドの例は、Ｖ５、Ｆ２９、Ｆ３０、またはそれらのバリアントを含む。同上。Ｆ２９とＦ３０は、天然に存在するリボスイッチおよびウイルスＲＮＡに見られるのと同じ３方向ジャンクションモチーフを共有している。Ｓｈｕら、（２０１４年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２、ｅ１０．Ｆ３０は、内部のターミネーター配列を除去するために変異させたＦ２９の改変バージョンである。Ｆｉｌｏｎｏｖら、（２０１５年）ＣｈｅｍＢｉｏｌ．２２（５）：６４９～６６０頁。

【0105】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物は、生体直交性のスカフォールドに埋め込まれたＲＮＡアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、生体直交性のスカフォールドは、Ｖ５、Ｆ２９、Ｆ３０、またはそれらのバリアントである。

【0106】

【0107】

【0108】

【0109】

他の例示的なＲＮＡスカフォールドには、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびリボザイムが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはリボソームＲＮＡに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、リボソームＲＮＡは５ＳｒＲＮＡまたはその誘導体である。例示的な５ＳｒＲＮＡスカフォールドおよびその誘導体は、Ｓｔｅｐａｎｏｖら、（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．２３２３：７５～９７頁、２０２１年）にさらに詳細に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。

【0110】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーはリボザイムに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、リボザイムは触媒的に不活性である。

【0111】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマーは、Ｔ－カセットに埋め込まれている。いくつかの実施形態では、Ｔ－カセットＲＮＡスカフォールドは、以下の配列を含む：

【化1】

（配列番号４３、ここで、太字の下線部テキストはアプタマー挿入部位に対応している。アプタマーは１つ、２つ、または３つ全てのアプタマー挿入部位に挿入されうる。いくつかの実施形態では、Ｔ－カセットＲＮＡスカフォールドには、１、２、または３個のアプタマーが埋め込まれている。いくつかの実施形態では、アプタマーは同一である。他の実施形態では、アプタマーは異なる。さらに他の実施形態では、３つのアプタマーのうち２つが異なる。さらに他の実施形態では、２つまたは３つのアプタマーは同一である。

【0112】

いくつかの実施形態において、Ｔ－カセットＲＮＡスカフォールドは、ＧＡＡＣＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＴＡＡＧＴＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＧＣＧ（配列番号４４）のポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0113】

Ｔ－カセットスカフォールドは、さらに詳細には、Ｗｕｒｓｔｅｒら、（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、３７（１８）：６２１４～６２２４頁、２００９年）に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。

【0114】

Ｖ．ＲＮＡのアフィニティー精製
１つの側面において、本明細書に開示されるのは、ｍＲＮＡ試料を精製するための方法である。いくつかの実施形態において、開示の方法に従って精製されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ合成からの不純物を実質的に含まない。このような不純物には、例えば、早期に中断されたＲＮＡ配列、ＤＮＡ鋳型、および／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬が含まれる。

【0115】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡを精製するための開示の方法は、以下の工程を含む：（ａ）少なくとも１つのアプタマーを含むｍＲＮＡを含む試料を、クロマトグラフィー樹脂上に固定化されたアフィニティーリガンドと接触させる工程であって、ＲＮＡアプタマーはアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡをクロマトグラフィー樹脂から溶出させる工程；および（ｃ）試料からｍＲＮＡを精製する工程。

【0116】

アフィニティークロマトグラフィーは、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物および方法と共に使用される１つの精製方法である。本明細書に開示のＲＮＡアプタマーは、選択されたアフィニティーリガンドに対する結合親和性を含む。選択されたアフィニティーリガンドは、クロマトグラフィー樹脂に固定化（例えば架橋）される。したがって、ＲＮＡアプタマーを含むｍＲＮＡは、アフィニティーリガンドを含む樹脂と結合する。クロマトグラフィー樹脂材料は、カラム内に存在することが好ましく、ＲＮＡを含む試料はカラムの上部に負荷され、溶出液はカラムの下部で回収される。本明細書に開示のアフィニティー精製法の一般的な図解については、例えば、図１を参照されたい。

【0117】

クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィー法において固定相として使用されることが知られている任意の材料でありうる。本明細書に開示のＲＮＡアプタマーと相互作用するアフィニティーリガンドとして使用される分子のタイプは、様々なタイプでありうる。アフィニティーリガンドの非網羅的な例は、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、色素、ボロン酸基、またはキレート化金属イオンである。固定相は、有機物および／または無機物で構成されていてもよい。

【0118】

最も広く使用されている固定相材料は、架橋アガロースおよび合成コポリマー材料のような親水性炭水化物である。これらの材料は、セルロースの誘導体、ポリスチレン、合成ポリアミノ酸、合成ポリアクリルアミドゲル、またはガラス表面を含みうる。クロマトグラフィー樹脂として使用できる材料のさらなる例は、ポリスチレンジビニルベンゼン、シリカゲル、非極性残基で修飾されたシリカゲル、またはデキストラン、セファデックス、アガロース、デキストラン／アガロース混合物、および当技術分野で知られている他のもののような、ゲルクロマトグラフィーもしくは他のクロマトグラフィー法に適した他の材料である。

【0119】

クロマトグラフィー樹脂は、ＲＮＡアプタマーが結合親和性を有するアフィニティーリガンドを用いて官能化される。いくつかの実施形態では、樹脂は、アガロース培地、またはフェニル基で官能化された膜（例えば、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）またはＳａｒｔｏｒｉｕｓのＰｈｅｎｙｌＭｅｍｂｒａｎｅ）、ＴｏｓｏｈＨｅｘｙｌ、ＣａｐｔｏＰｈｅｎｙｌ、低または高置換のＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦａｓｔＦｌｏｗ、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＯｃｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤＰｒｏｐｙｌもしくはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤＰｈｅｎｙｌ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標）ＭｅｔｈｙｌもしくはＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標）ｔ－Ｂｕｔｙｌｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア）；ＷＰＨＩ－Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニル、もしくはブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）でありうる。ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰＰＧ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＰｈｅｎｙｌ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＢｕｔｙｌ、およびＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎＨｅｘｙｌは、硬質メタクリルポリマービーズをベースとしている。ＧＥＨｉＳｃｒｅｅｎＢｕｔｙｌＦＦおよびＨｉＳｃｒｅｅｎＯｃｔｙｌＦＦは、高流量のアガロースベースのビーズをベースにしている。好ましいものは、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＥｔｈｅｒ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＰｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＢｕｔｙｌ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨｅｘｙｌ－６５０Ｃ（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）、ＰＯＲＯＳ－ＯＨ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、またはそれぞれＯＨ、硫酸、もしくはブチルリガンドを含むＣＩＭ－ＯＨ、ＣＩＭ－ＳＯ３、ＣＩＭ－Ｃ４Ａ、およびＣＩＭＣ４ＨＤＬのようなメタクリレートベースのモノリシックカラムである（ＢＩＡＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）。

【0120】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はアフィニティーリガンドとしてプロテインＡを含む。例示的なプロテインＡ樹脂は、ＢｙｚｅｎＰｒｏＰｒｏｔｅｉｎＡ樹脂（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ；１８８８７）、ＤｙｎａｂｅａｄｓＰｒｏｔｅｉｎＡ磁気ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１０００１Ｄ）、ＰｉｅｒｃｅＰｒｏｔｅｉｎＡＡｇａｒｏｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；２０３３４）、ＰｉｅｒｃｅＰｒｏｔｅｉｎＡ／ＧＰｌｕｓＡｇａｒｏｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；２０４２３）、ＰｉｅｒｃｅＰｒｏｔｅｉｎＡＰｌｕｓＵｌｔｒａＬｉｎｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；５３１４２）、ＰｉｅｒｃｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎＡＡｇａｒｏｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＰＯＲＯＳＭａｂＣａｐｔｕｒｅＡＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティーリガンドとしてストレプトアビジンを含む。例示的なストレプトアビジン樹脂は、ストレプトマイセス・アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉ）由来のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｇａｒｏｓｅ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ；Ｓ１６３８）、ＰｉｅｒｃｅＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＰｌｕｓＵｌｔａＬｉｎｋＲｅｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；５３１１７）、ＰｉｅｒｃｅＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＡｇａｒｏｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；２０３５７）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ６ＨＣＡｇａｒｏｓｅＲｅｓｉｎ（ＡＢＴ；ＳＴＶ６ＨＣ－５）、ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＲｅｓｉｎ－Ａｍｉｎｔｒａ（Ａｂｃａｍ；ａｂ２７０５３０）を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はアフィニティーリガンドとしてグルタチオン（ＧＳＨ）を含む。例示的なＧＳＨ樹脂は、ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＲｅｓｉｎ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；Ｌ００２０６）、ＰｉｅｒｃｅＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＡｇａｒｏｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；１６１０２ＢＩＤ）、ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＢＧＳＴ－ｔａｇｇｅｄＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｉｎ９Ｃｙｔｉｖａ；１７０７５６０５）；ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎ－Ａｍｉｎｔｒａ（Ａｂｃａｍ；ａｂ２７０２３７）を含む。

【0123】

特定の実施形態において、本明細書に開示の精製プロセスは、ｍＲＮＡ合成中またはｍＲＮＡ合成後に実施されうる。例えば、ｍＲＮＡを本明細書に記載のように精製してから、キャップおよび／またはテールをｍＲＮＡに付加してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはキャップおよび／またはテールがｍＲＮＡに付加された後に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはキャップの付加後に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはキャップおよび／またはテールがｍＲＮＡに付加される前と後の両方で精製される。一般に、本明細書に記載の精製工程は、ｍＲＮＡ合成の各工程の後に、場合により透析および／または濾過などの他の精製プロセスと一緒に行ってもよい。例えば、ｍＲＮＡは最初の合成後に透析を受けて短鎖を除去し（例えば、テールの有無にかかわらず）、その後、本明細書に記載の精製に供してもよい。本明細書に開示の精製方法は、ｍＲＮＡ試料に複数回適用してもよい。

【0124】

ＶＩ．ベクター
１つの側面において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示のｍＲＮＡ組成物を含むベクターである。目的のタンパク質をコードする核酸配列（例えば、治療用ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）は、多くのタイプのベクター中にクローニングされる。例えば、核酸はプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むが、これらに限定はされないベクター中にクローニングされる。特に注目されるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シークエンシングベクター、およびｉｎｖｉｔｒｏ転写に最適化されたベクターを含む。

【0125】

１つの実施形態では、ベクターは宿主細胞内でｍＲＮＡを発現させるために使用される。別の実施形態では、ベクターはＩＶＴの鋳型として使用される。治療用途に適した最適に翻訳されたＩＶＴｍＲＮＡの構築は、Ｓａｈｉｎら、（２０１４年）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．１３、７５９～７８０頁；Ｗｅｉｓｓｍａｎ（２０１５年）、ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ１４、２６５～２８１頁に詳細に開示されている。

【0126】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示のベクターは、５’から３’の向きに少なくとも以下のものを含む：ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列；ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド配列；３’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列；および少なくとも１つのＲＮＡアプタマーをコードするポリヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のベクターはまた、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列も含む。

【0127】

様々なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが当技術分野で知られている。１つの実施形態では、プロモーターはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野で知られている。

【0128】

また、本明細書に開示のベクターまたはＲＮＡ組成物を含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）も本明細書に開示される。

【0129】

ポリヌクレオチドは、多数の異なる方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーション（ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ケルン、ドイツ））、（ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（ＨａｒｖａｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ボストン、マサチューセッツ）またはＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、デンバー、コロラド）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、ハンブルク、ドイツ）、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、「遺伝子銃」のような微粒子銃送達系（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（２００１年）、ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．１２（８）：８６１～７０頁を参照）、またはＴｒａｎｓＩＴ－ＲＮＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｒｕｓ、マジソン、ウィスコンシン）を含むがこれらに限定されない市販の方法を使用して標的細胞中に導入される。

【0130】

宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための化学的な手段は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズのようなコロイド分散系、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。Ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0131】

外因性核酸を宿主細胞に導入するため、または細胞を本発明のインヒビターに曝露するために使用される方法に関係なく、宿主細胞におけるｍＲＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施されうる。そのようなアッセイは当業者にはよく知られている。

【0132】

ＶＩＩ．医薬組成物
本発明に従って精製されたＲＮＡは、例えばワクチンとして使用するための医薬組成物の成分として有用である。これらの組成物は典型的には、ＲＮＡと薬学的に許容される担体を含む。本発明の医薬組成物はまた、低分子免疫増強剤（例えば、ＴＬＲアゴニスト）などの１つまたはそれ以上の追加成分も含みうる。本発明の医薬組成物は、リポソーム、水中油型エマルション、または微粒子のようなＲＮＡのための送達系も含みうる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。１つの実施形態では、組成物はＬＮＰ内にカプセル化された抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは少なくとも１つのカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合（ＰＥＧ化）脂質、コレステロールベースの脂質、およびヘルパー脂質を含む。

【0133】

本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は説明のためのみのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。

【0134】

実施例
特定の実施形態に関する前述の説明は、本開示の一般的な性質を十分に明らかにするものであるため、当業者であれば、当業者が備えている技能の範囲内で知識を適用することにより、過度な実験を行うことなく、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途向けに容易に修正および／または適合させることができる。したがって、そのような適合および修正は、本明細書に提示された教示および指針に基づいて、開示されている実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図されている。本明細書における語法または用語は説明を目的とするものであり、限定するものではないため、本明細書における用語または語法は、教示および指針に照らして当業者によって解釈されるべきであることを理解されたい。

【実施例1】

【0135】

アプタマー合成
２つのＲＮＡアプタマー配列を化学合成した。第１のＲＮＡアプタマーヌクレオチド配列は、陰性対照として機能するランダム配列アプタマーであった（配列番号１）。第２の配列は、ストレプトアビジンに結合することが以前に報告されているＳ１ｍアプタマーである（配列番号２）。Ｂａｃｈｌｅｒら、（１９９９年）、ＲＮＡ５（１１）：１５０９～１５１６頁；Ｓｒｉｓａｗａｔ，Ｃ．とＥｎｇｅｌｋｅ，Ｄ．Ｒ．、（２００１年）、ＲＮＡ７（４）：６３２～６４１頁；Ｌｉ，Ｙ．とＡｌｔｍａｎ、Ｓ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２００２年）、３０（１７）：３７０６～３７１１頁。ランダムアプタマー（配列番号１）およびＳ１ｍアプタマー（配列番号２）のヌクレオチド配列を以下に示す。

【0136】

【表1】

【実施例2】

【0137】

ストレプトアビジンセファロースビーズアフィニティー精製およびＲＮＡ定量
アプタマーの結合を、セファロースビーズアフィニティー精製ストラテジーを使用して分析し、それに続き、ＲＮＡ回収率を定量した。

【0138】

ＲＮＡアプタマーと結合用のストレプトアビジンビーズを調製する方法には、以下の工程が含まれる：（１）ストレプトアビジンセファロースビーズの調製。ビーズ保存液を除去するため、２０μＬのストレプトアビジンセファロースビーズ（１試料あたり）を６００×ｇ、１分間、４℃でスピンし、結合バッファー（１試料あたり５００μＬ）で２回洗浄した。続いて、ビーズをＲＮａｓｉｎＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（３μＬ／１００ユニット）を含む２０μＬの結合バッファーに再懸濁させ、その後、氷上で１５分間インキュベートした。（２）ＲＮＡアプタマーの調製。２．５μｇのＲＮＡアプタマーを１０μＬの結合バッファーに再懸濁させた。５６℃で５分間、３７℃で１０分間加熱した後、室温で５分間インキュベートしてアプタマーの構造をリフォールディングさせることにより、ＲＮＡアプタマーのリフォールディングを行った。ＲＮＡアプタマー調製手順の最後に、総ＲＮＡアプタマー収量の対照（入力対照）として、結合バッファーと１：２で混合した２μＬのランダムアプタマーおよびＳ１ｍアプタマーを回収した。（３）インキュベーション条件。ｍＲＮＡ（２．５μｇ）アプタマーを含む１０μＬのリフォールディングさせたアプタマーをビーズに添加し、ローテーター上、４℃で２時間インキュベートした。続いて、ビーズを１００μＬの結合バッファーで３回洗浄し、アプタマーの二次構造を維持するため、残りの手順の間は氷上に保持した。（４）ビーズからのＲＮＡアプタマーの溶出。溶出は、以下の手順で２５０μＬのフェノール系試薬を使用して行った。５０μＬの冷クロロホルムをビーズに加え、１０秒間激しく振盪した後、１２，０００×ｇで１５分間スピンした（４℃）。ＲＮＡを含む各試料の水性上相（１試料あたり約１２５μＬ）をＭｏｎａｒｃｈクリーンアップカラムに直接加え、製造元の指示に従った（ＭｏｎａｒｃｈＲＮＡＣｌｅａｎｕｐＫｉｔ；ＮＥＢ）。ＲＮＡを各Ｍｏｎａｒｃｈカラムから５０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶出させた。ストレプトアビジンアフィニティー精製後のＲＮＡ濃度は、製造元の仕様によって設定されたパラメーターを用いてＮａｎｏｄｒｏｐで定量した。

【0139】

実施例１で調製したアプタマーをストレプトアビジンセファロースビーズでアフィニティー精製し、溶出させ、溶出液中のＲＮＡ回収量を上記の方法を用いて定量した。ランダムアプタマー配列の試料は、ＲＮＡの回収をもたらさなかった（Ｎａｎｏｄｒｏｐの検出限界は２．５ｎｇ／μＬ）。対照的に、Ｓ１ｍアプタマーの試料は、ストレプトアビジンビーズとのインキュベーション前に回収したＳ１ｍアプタマーＲＮＡ試料（約９，６００ｎｇ／μＬ）に対して、約１３％のＲＮＡ回収率（１，２５０ｎｇ／μＬ）を示した（図２）。この結果は、実施例１で設計したＳ１ｍアプタマーがストレプトアビジンでアフィニティー精製でき、よって、ストレプトアビジンアフィニティーベースの精製系における機能性タグとして適切となりうることを示している。

【実施例3】

【0140】

複数コピー（４×）アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡの合成とアフィニティー精製
結合親和性に対するアプタマーのコピー数の影響を分析するために、複数コピーアプタマーをｍＲＮＡに導入し、アプタマーを含まないｍＲＮＡと比較した。

【0141】

タンデム４リピート構成におけるＳ１ｍアプタマーの配置（４×Ｓ１ｍ；配列番号５）は、セファロースビーズに対してより高い親和性を有することが以前に示されている。ＬｅｐｐｅｋとＳｔｏｅｃｋｌｉｎ、（２０１４年）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２（２）：ｅ１３。ＲＮＡアプタマーのコピー数が結合親和性に及ぼす影響を調べるために、ｉｎｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）用のｃＤＮＡ鋳型を生成するＤＮＡプラスミドを構築して、ｍＲＮＡにタグ付けされた４×Ｓ１ｍアプタマーが作製された。同上。

【0142】

ＤＮＡプラスミドｐＡＭ１４およびｐＡＭ１５を、以前に記載されたようにして、Ｔ７プロモーターによって駆動されるマウスＴＮＦαの３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）ＲＮＡをコードする５３ｂｐヌクレオチド配列を含むように改変した。ＳｔｏｅｃｋｌｉｎＧら、（２００４年）、ＥＭＢＯＪ２３（６）：１２１２～１３２４頁；ＬｅｐｐｅｋとＳｔｏｅｃｋｌｉｎ、（２０１４年）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２（２）：ｅ１３。ｐＡＭ１４（２，４９６ｂｐ）は、ｐＡＭ１５（２，１６８ｂｐ）と同じベクター骨格に由来するものであるが、５’から３’方向に３０ｍｅｒのポリＡテールが隣接する４×Ｓ１ｍアプタマーを含んでいる。

【0143】

ＩＶＴ用のｃＤＮＡ鋳型（配列番号５）を得るために、ＴＮＦα－５３－４×Ｓ１ｍのヌクレオチド配列をｐＡＭ１４プラスミドからＡＭ５／６プライマー対で増幅させた。陰性対照のｃＤＮＡ鋳型は、プラスミドｐＡＭ１５から同じＡＭ５／６プライマー対を用いて増幅させて、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ隣接部を含む配列（それぞれ配列番号３および４）を生成した。ＡＭ５／６プライマー結合部位の位置は、図３に示されているように、ｐＡＭ１４およびｐＡＭ１５のプラスミドマップに注釈が付けられている。

【0144】

その後、市販のＲＮＡ試薬と手順を用いて、実験群、ＴＮＦα－５３－４×Ｓ１ｍｍＲＮＡ、および対照群のＩＶＴ反応を実施した。（ＨｉＳｃｒｉｂｅＴ７ＡＲＣＡｍＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔｗｉｔｈｔａｉｌｉｎｇ、ＮＥＢ）。キャップおよびテール反応の後、濾過したｍＲＮＡを使用するまで－２０℃で保存した。

【0145】

５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および４×Ｓ１ｍアプタマーのヌクレトチド配列を以下に示す。

【0146】

【表2】

【0147】

ＴＮＦα－５３－４×Ｓ１ｍアプタマーｍＲＮＡのアフィニティー結合を分析するために、アプタマーｍＲＮＡをストレプトアビジンセファロースビーズでアフィニティー精製し、溶出させ、溶出液中のＲＮＡ回収量を上記の方法を用いて定量した。ストレプトアビジンセファロースビーズとＴＮＦα－５３でタグ付けされた４×Ｓ１ｍｍＲＮＡまたはＴＮＦα－５３ｍＲＮＡ陰性対照試料との結合親和性を評価し、比較した。アフィニティー精製したＴＮＦα－５３でタグ付けされた４×Ｓ１ｍｍＲＮＡは、ストレプトアビジンビーズとのインキュベーション前に回収した４×Ｓ１ｍｍＲＮＡ試料（約２，８００ｎｇ／μＬ）に対して、５４％のＲＮＡ回収率（１，５００ｎｇ／μｌ）を示した（図４）。対照的に、アフィニティー精製したＴＮＦα－５３陰性対照のＲＮＡ回収率はわずか２％であった。この結果は、複数のアプタマーコピー（例えば、４×Ｓ１ｍ）を導入することで、ｍＲＮＡのアフィニティー精製効率を改善できる可能性を示している。

【実施例4】

【0148】

ＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたアプタマーでタグ付けされた異なるｍＲＮＡの合成とアフィニティー精製
下流のｍＲＮＡアフィニティー精製プロセスにおけるｔＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたＲＮＡアプタマーの効率をテストするために、４つのベクターを構築した。

【0149】

Ｓｍアプタマーを分析のために選択した。Ｓｍアプタマー（配列番号６）およびｔＲＮＡ－Ｓｍアプタマー（配列番号７）のヌクレオチド配列を以下に示す。

【0150】

【表3】

【0151】

目的のプラスミドのマップが図５に示されている。簡単に説明すると、これらは：（１）ｐＡＭ２２、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓｔ）のｔＲＮＡ^ＧＬＮ２スカフォールドを保持する対照コンストラクト（ｐＡＭ２２（ｔＲＮＡ）；プラスミドマップには、Ｇｌｎ２アンチコドンループに対するアンチコドンアームの位置に注釈が付けられている）、（２）ｐＡＭ２０、Ｓｍアプタマーを保持する対照コンストラクト（ｐＡＭ２０（Ｓｍ））、（３）ｐＡＭ２１、ｔＲＮＡアンチコドンアーム配列が両側に隣接するアンチコドンループｔＲＮＡ^ＧＬＮ２配列の一部に埋め込まれたＳｍアプタマー配列を保持する実験用コンストラクト（ｐＡＭ２１（ｔＲＮＡＳｍ）、および（４）ｐＡＭ２３、Ｓｍ－ｔＲＮＡ^ＧＬＮ２コンストラクトのタンデム２リピート構成を保持する実験用コンストラクト（２×ｔＲＮＡＳｍ）である。各タグはＴ７プロモーターにより駆動された。

【0152】

ＩＶＴ用のｃＤＮＡ鋳型を得るために、実施例３に記載のようにして、アプタマータグのヌクレオチド配列をフランキングプライマーにより増幅させた。その後、市販のＲＮＡ試薬と手順を用いて、実験群、ｔＲＮＡＳｍ、２×ｔＲＮＡＳｍｍＲＮＡ、および対照群のＩＶＴ反応を実施した。（ＨｉＳｃｒｉｂｅＴ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔｗｉｔｈｔａｉｌｉｎｇ、ＮＥＢ）。キャップおよびテール反応の後、濾過したｍＲＮＡを使用するまで－２０℃で保存した。

【0153】

Ｓｍ、ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ－Ｓｍ、および２×ｔＲＮＡＳｍアプタマータグのアフィニティー結合を分析した。実施例２と同じ結合および溶出方法を適用した。

【0154】

図６に示されているように、ｔＲＮＡ（ｐＡＭ２２）タグまたはＳｍアプタマー（ｐＡＭ２０）タグのいずれを用いても、同程度のＲＮＡ回収率が得られたが、これは、テストした実験条件下における非特異的な結合を指し示している。対照的に、ｔＲＮＡスカフォールドに１コピー（ｐＡＭ２１）または２コピー（ｐＡＭ２３）埋め込まれたＳｍアプタマーを使用すると、入力ＲＮＡに対して６０％のＲＮＡ回収率が得られ、精製効率が有意に向上することが示された。この結果は、ｔＲＮＡのようなＲＮＡスカフォールド構造を使用することで、アプタマータグの結合効率が向上しうることを示している。

【実施例5】

【0155】

複数コピーアプタマー（ｅＨＧＦＰ－４×Ｓ１ｍ）でタグ付けされたｈＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡの合成とアフィニティー精製
本例は、ＲＮＡアプタマータグを含めることがｍＲＮＡの発現とタンパク質の翻訳に及ぼす影響を研究するものである。アプタマーはｍＲＮＡの一部となるように設計されるため、アプタマータグが翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある。

【0156】

翻訳効率に対するＲＮＡアプタマーの潜在的な影響をテストするために、ヒト化強化緑色蛍光タンパク質（ｈＥＧＦＰ；以下に示す配列番号８）のＯＲＦを５’および３’ＵＴＲ配列で挟み、Ｔ７プロモーターにより駆動させ、５’から３’の方向に３０ｍｅｒのポリＡテールで終結するプラスミドを構築した（ｐＡＭ１１）。実験用プラスミドｐＡＭ８は、４×Ｓ１ｍアプタマー配列（配列番号５）を３’ＵＴＲの下流、ポリＡテールの直前に導入することにより作製した。図８はｐＡＭ１１およびｐＡＭ８のプラスミドマップを示している。

【0157】

【表4】

【0158】

ＩＶＴｃＤＮＡ鋳型を得るために、ｈＥＧＦＰまたはｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたヌクレオチド配列をＡＭ５／６プライマー対で増幅させた。プライマー対の設計および配向は、実施例３において開示したストラテジーと同様である。ＩＶＴ反応は、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔを用いて、製造元の指示に従って実施した。追加のポリアデニル化工程を避けるため、ＩＶＴ用の鋳型ＤＮＡで３０ｍｅｒのアデノシンテール部を作製した。

【0159】

図９のアガロースゲルに示されているように、得られたｍＲＮＡは期待されるサイズ（レーン１ｈＥＧＦＰおよびレーン２ｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍ）を有し、良質であった。

【0160】

アフィニティー結合に対する４×Ｓ１ｍアプタマーの効果をテストするために、ｈＥＧＦＰまたはｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍを含むｍＲＮＡをそれぞれストレプトアビジンセファロースビーズでアフィニティー精製した。実施例２で概説したのと同じ結合および溶出方法を適用した。

【0161】

４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｈＥＧＦＰは、入力対照試料と比較して６３％のＲＮＡ回収率をもたらし、これはアプタマー無しのｈＥＧＦＰのＲＮＡ回収率よりも有意に高かった（図１０）。

【実施例6】

【0162】

複数コピーアプタマー（ｅＨＧＦＰ－４×Ｓ１ｍ）でタグ付けされたｍＲＮＡのタンパク質翻訳と機能の分析
タンパク質の翻訳と機能に対するＲＮＡアプタマータグの効果を、細胞内のＧＦＰ発現を直接可視化することで評価した。この効果をテストするため、ｐＡＭ８およびｐＡＭ１１から生成されたｈＥＧＦＰｍＲＮＡをアフィニティー精製後に単離し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。製造元の指示に従ってＭｉｒｕｓＴｒａｎｓＩＴＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬を使用し、０．５μｇのＲＮＡを２４ウェルプレートのＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、蛍光顕微鏡で細胞を調査した。

【0163】

図１１に示すように、４×Ｓ１ｍアプタマーを含むｍＲＮＡは、アプタマーを含まないｍＲＮＡ（左パネル）よりも低い強度のシグナルを生じる（右パネル）。したがって、ストレプトアビジンアプタマータグ（４×Ｓ１ｍ）を４コピー導入すると、ｈＥＧＦＰ発現の翻訳効率の減少が導かれうると思われる。この結果は、ある種のアプタマーをｍＲＮＡに導入すると、タンパク質の翻訳に悪影響を及ぼしうることを示している。

【実施例7】

【0164】

複数コピーアプタマーでタグ付けされ、長くしたポリＡテールを含むｍＲＮＡのタンパク質翻訳と機能の分析
短いポリＡテール（３０ｍｅｒのアデノシン）が、アプタマー配列のために翻訳効率に影響を及ぼしているのではないかという仮説が立てられた。翻訳効率に対するポリＡテールの影響を調べるため、ｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡを、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７６Ｓ）を用いた追加のポリアデニル化反応に供した。

【0165】

ポリアデニル化は、アガロースゲル上でのｍＲＮＡ産物のシフトによって確認された（データは示さず）。ｍＲＮＡを上記のようにしてアフィニティー精製し、より長いポリＡを有するｍＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。図１２に示すように、より長いポリＡテールを持つｈＥＧＦＰ－４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡは、より短い（３０ｍｅｒ）ポリＡテールを持つｍＲＮＡよりも有意に高いＥＧＦＰ発現を示した。この結果は、ポリＡテールの長さが、特定のアプタマー配列を含むｍＲＮＡの翻訳効率に影響を与えうることを示唆している。

【実施例8】

【0166】

ＲＮＡ回収におけるアプタマーの位置の分析
アプタマー配列はｍＲＮＡの一部となるように設計されており、潜在的なアプタマーの構造またはその配置が発現に悪影響を及ぼす可能性がある。そのような影響を理解するために、アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡコンストラクトを設計して、（１）他のトポロジー的順序のｍＲＮＡ成分に対するアプタマーの位置、（２）アプタマーのコピー数（すなわちアプタマーの価数）、（３）周囲のスカフォールディング（すなわち安定化ｔＲＮＡスカフォールド）、または図７に示すような構成の組み合わせをテストした。

【0167】

具体的には、この例では、４×Ｓ１ｍアプタマー配列の位置の変更が、ｍＲＮＡ内の他のトポロジー的順序の部分に対し、ｍＲＮＡアフィニティー精製後のＲＮＡ回収に影響を与えるかどうかを調べる。設計されたｍＲＮＡコンストラクトのパネルを図１３Ａに示す。

【0168】

とりわけ、４×Ｓ１ｍアプタマーを、（１）５’ＵＴＲの直に上流、（２）３’ＵＴＲの直に上流、（３）３’ＵＴＲ中、（４）３’ＵＴＲの直に下流、または（５）ポリＡ配列の３’末端への埋め込みのいずれかに局在化させた。

【0169】

ｃＤＮＡ鋳型を生成し、ＩＶＴを使用して特定のアプタマー構成を持つｍＲＮＡを生成した。ｍＲＮＡは、ストレプトアビジンセファロースビーズを使用してアフィニティー精製し、実施例２に記載されているようにして定量した。

【0170】

テストした各アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのアフィニティー精製ＲＮＡ収量（アフィニティー精製を行わなかった入力試料に対する、ストレプトアビジン結合および溶出工程後の相対値）（未結合対溶出）を図１３Ｂに示し、各試料（未結合および溶出）の平均値および標準偏差値を以下の表１に示す。

【0171】

【表5】

【0172】

図１３Ｂおよび表１に示すように、４×Ｓ１ｍアプタマーを含むｍＲＮＡは、アプタマーの位置に関係なく、アプタマーを欠く対照ｍＲＮＡと比較して特異的な結合を生じた。この結果は、４×Ｓ１ｍアプタマーをｍＲＮＡの複数の位置のうちの１つに導入しても、アフィニティー精製収率には影響しないことを示している。

【実施例9】

【0173】

ＲＮＡ回収におけるアプタマーの価数の分析
ｍＲＮＡ転写産物内のアプタマー位置と同様に、アプタマーの価数（すなわちアプタマーのコピー数）は、ＲＮＡ回収に影響を与えうる別の変数である。実施例３で行った分析をさらに拡張するため、Ｓ１ｍアプタマーの１～６個のタンデムリピートコピー（１×Ｓ１ｍから６×Ｓ１ｍと表示）を含むようにアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡコンストラクトのパネルを設計した。この試験では、アプタマータグを３’ＵＴＲの後に配置した。

【0174】

ｃＤＮＡ鋳型を生成し、ＩＶＴを使用して、特定のアプタマーの価数を持つｍＲＮＡを生成した。ｍＲＮＡは、ストレプトアビジンセファロースビーズを用いて、アフィニティー精製し、実施例２に記載されているようにして定量した。

【0175】

テストした各アプタマーの価数のｍＲＮＡコンストラクトのアフィニティー精製ＲＮＡ収量（未結合対溶出）を図１４に示し、各試料（未結合および溶出）の平均値および標準偏差値を以下の表２に示す。

【0176】

【表6】

【0177】

図１４に示すように、精製効率は３コピーのアプタマー（３×Ｓ１ｍ）まで上昇し、それ以降は後続のコピー（４×Ｓ１ｍ～６×Ｓ１ｍ）を加えてもＲＮＡアフィニティー精製収率の改善は見られなかった。この結果は、アプタマーの価数を上げると結合親和性が向上することを示している。

【実施例10】

【0178】

ＲＮＡ回収における代替的なｍＲＮＡの文脈でのアプタマー結合の分析
アフィニティー精製において効率的な結合を提供するアプタマーが、代替的なＲＮＡの文脈において機能的であることを実証するため、実施例３に示されているものとは異なるタンパク質コード領域（シンガポール’１６ヘマグルチニン）と異なるＵＴＲをコードするｍＲＮＡのパネルを設計した。

【0179】

試験した各コンストラクトのストレプトアビジンアフィニティー結合精製プロセス後のＲＮＡ収量（未結合対溶出）を図１５に示す。各試料（未結合および溶出）の平均値および標準偏差値を以下の表３に示す。

【0180】

【表7】

【0181】

図１５に示すように、アプタマーは、隣接配列の変化にもかかわらず、ストレプトアビジンセファロースビーズに対する特異的な結合を提供する。この結果は、本明細書に開示のストレプトアビジンアプタマーｍＲＮＡの設計が、代替的なＲＮＡの文脈においてロバストであることを実証している。

【実施例11】

【0182】

タンパク質の翻訳におけるアプタマーの位置の分析
ｍＲＮＡ翻訳動態がｍＲＮＡ転写産物内のアプタマーの配置によって影響を受けるかどうかを理解するために、実施例８で設計したコンストラクトのパネルからのｍＲＮＡをｍＲＮＡ翻訳効率アッセイで評価し、ＧＦＰの発現を検出した。

【0183】

簡単に説明すると、ヒト化ＥＧＦＰ（ｈＥＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって生成した後、トランスフェクション試薬と混合した。次に、混合物をＨｅｌａ細胞またはヒト骨格筋（ＨＳＫＭｃ）細胞にアプライした。２４時間のインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞のＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリー解析によって定量した。細胞内のＧＦＰ蛍光強度は、ｈＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡ転写産物の翻訳効率に正比例する。

【0184】

以下の工程は、ｍＲＮＡ翻訳効率アッセイのトランスフェクション手順を説明するものである：
（１）細胞株の調製。ＨｅｌａまたはＨＳＫＭｃ細胞株を１２ウェルプレート中の完全増殖培地に播種し、８０～９０％コンフルエントまで増殖させた。Ｈｅｌａ２２９細胞の培地条件はＤＭＥＭおよび１０％のＦＢＳであり、ＨＳＫＭｃ細胞の培地条件は１９９培地、２０％のＦＢＳ、および１％のＰｅｎＳｔｒｅｐであった。
（２ａ）ＨｓｋＭｃ細胞株のためのＭｉｒｕｓＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬を用いたｍＲＮＡの調製。ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクション試薬およびｍＲＮＡブースト試薬を使用前に室温まで温め、軽くボルテックスした。ｍＲＮＡトランスフェクションのために製造元のプロトコールに従い、テストする各ｍＲＮＡのチューブに４００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに対して５μｇのｍＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬのｍＲＮＡを１０μＬ）を含めた。陰性対照では、ｍＲＮＡの代わりに培地を添加した。その後、８μＬのｍＲＮＡＢｏｏｓｔＲｅａｇｅｎｔを加え、ピペッティングによりチューブをよく混合した。次に、８μＬのＴｒａｎｓｉｔｍＲＮＡＲｅａｇｅｎｔを加え、よく混合した後、室温で２～５分間インキュベートし、複合体が形成されるのに十分な時間をとった。
（３ａ）ＨｓｋＭｃ細胞株のトランスフェクション。１０６．５μＬのｍＲＮＡミックスを１２ウェルプレートの各ウェルに滴下して添加し（約１．２５μｇｍＲＮＡ／ウェル；各コンストラクトにつき、３重にウェルをセットアップ）、軽く揺すってＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ：ｍＲＮＡＢｏｏｓｔ：ＲＮＡ複合体を均一に分散させた。続いて、プレートを２４時間インキュベートした。
（２ｂ）Ｈｅｌａ細胞株に対するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬を用いたｍＲＮＡの調製。ｍＲＮＡトランスフェクションチューブの製造元のプロトコールに従い、３１２μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに４μｇのｍＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬのｍＲＮＡを８μＬ）を加えてテストされる各ｍＲＮＡを調製し、よく混合した。陰性対照では、ｍＲＮＡの代わりに培地を添加した。別のチューブで、８μＬのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬を３１２μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加え、よく混合した。その後、ｍＲＮＡチューブの容量をトランスフェクション混合チューブに加え、室温で１５分間インキュベートし、複合体が形成されるのに十分な時間をとった。
（３ｂ）Ｈｅｌａ細胞株のトランスフェクション。２ｂで説明した１６０μＬ／ウェルのｍＲＮＡミックスを１２ウェルプレートの各ウェルに滴下して添加した（約１μｇｍＲＮＡ／ウェル；各コンストラクトにつき、３重にウェルをセットアップ）。続いて、プレートを２４時間インキュベートした。

【0185】

以下の工程は、ｍＲＮＡ翻訳効率アッセイで使用されるフローサイトメトリー解析のための細胞染色およびソーティング手順を説明するものである：
（１）細胞の採取。細胞単層から培地を吸引し、１ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、１ウェルあたり２５０μＬの１×Ａｃｃｕｔａｓｅで解離させ、室温で５分間インキュベートした。２５０μＬのＰＢＳを各ウェルに添加し、細胞を１．５ｍｌの微量遠心チューブ中に採取した。
（２）細胞染色。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色は、製造元の説明書（Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＦａｒＲｅｄＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎＫｉｔ）に従って全試料に対して実施した。細胞の固定はオプショナルであったが、必須の工程ではなかった。続いて、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄することによって過剰な染色を除去し、２０℃で５分間３００ｒｃｆを実行して細胞をペレットにし、古い上清を除去し、試料を４００μＬの染色バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁した。
（３）補正ビーズ。補正対照試料は、製造元の指示に従って、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ反応性ＡｒＣ補正ビーズを調製するか、またはＧＦＰＢｒｉｇｈｔＣｏｍｐｅＢｅａｄｓを使用して作製した。
（４）ＦＡＣＳ解析。ＨｓｋＭｃおよびＨｅｌａ細胞株については、１３０μｍのソーティングチップを使用した。非染色ビーズおよび染色補正ビーズを最初に流して、ＦＳＣ／ＳＳＣ電圧設定を調整し、ゲートウィンドウを設定した。

【0186】

図１６Ａ～図１６Ｃおよび図１７Ａ～図１７Ｂに示すように、ｍＲＮＡ内のアプタマーの配置が異なるアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのｍＲＮＡ翻訳効率を、それぞれＨｓｋＭｃ細胞株およびＨｅｌａ細胞株のいずれかで評価した。発現は、バックグラウンド以上のＧＦＰシグナルを持つ細胞の総数（％ＧＦＰ＋Ｃｅｌｌｓ）と、あるシグナル強度の閾値以上の細胞の数（％ｈｉｇｈＧＦＰ＋Ｃｅｌｌｓ）として定量した。

【0187】

全長ｍＲＮＡ配列内のアプタマータグの位置は、翻訳効率に有意な影響を与える。アプタマーをｍＲＮＡの５’末端に配置すると翻訳が排除されるが、それ以外の位置では様々なレベルの翻訳が可能であった。アプタマーを３’ＵＴＲの後に配置すると、ＧＦＰ強度の増加によって示されるように、翻訳効率が最も高くなった。この傾向は、ＨｓｋＭｃとＨｅｌａの両細胞株で再現可能であった。

【実施例12】

【0188】

翻訳効率に及ぼす長くしたポリＡテール長の分析
実施例７では、ポリＡテールの長さを長くすることで、アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡの翻訳効率が高まることを実証した。

【0189】

翻訳増強の量を定量するために、長くしたポリＡテールをＳ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡに付加し、実施例１１に記載のｍＲＮＡ翻訳効率アッセイでテストした。ＩＶＴに使用されるベクターには、コード化されたポリＡテール、具体的には６０個のＡを持つセグメント化されたポリＡテール、ＮｓｉＩ制限酵素切断部位、そしてさらに６０個のＡが含まれていた。
上記のベクターから生成されるｍＲＮＡは全て、セグメント化されたポリＡテールを含み、ＡＲＣＡでキャップされていた。図１８の右側の２つの条件には、１μｌの大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７６）をバッファーと追加のＡＴＰとともに４５分間インキュベートする追加のポリアデニル化工程が含まれており、典型的には、図１８に示した各ＲＮＡの末端におよそ２００個のＡが追加されることになるが、ＧＦＰ陽性Ｈｅｌａ細胞の総数（パーセントで表示）は、対照と比較して、長くしたポリＡテールを持つアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡの方が有意に多くなっていた。この結果は、アプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのポリＡテール長を長くすることで、細胞内の下流のｍＲＮＡ翻訳動態を改善できることを確認している。

【実施例13】

【0190】

ＲＮＡスカフォールドに埋め込まれたアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのＲＮＡ回収および翻訳効率の分析
実施例５の所見を確認し、拡張するために、ｔＲＮＡスカフォールドタグに埋め込まれたＳ１ｍアプタマー（実施例５参照）を、ストレプトアビジンアフィニティー精製後のＲＮＡ回収およびｍＲＮＡ翻訳効率に関して、２×Ｓ１ｍおよび４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡと比較した。

【0191】

図１９Ａに示すように、Ｓ１ｍアプタマーを囲む安定化配列の追加により、４×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡの結合効率と同等のＲＮＡ精製収率が得られ、ＲＮＡスカフォールドがアフィニティー精製収率を有意に増加させることが実証された。ｔＲＮＡスカフォールドによるＳ１ｍアプタマーの安定化は、図１９Ｂに示すようにｍＲＮＡの翻訳効率に影響を与えなかった。結果を以下の表４にまとめる。

【0192】

【表8】

【実施例14】

【0193】

生体直交性のＲＮＡスカフォールド中で安定化されたアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡの合成とアフィニティー精製
ｔＲＮＡをスカフォールドとするアプタマーは、細菌細胞および哺乳動物細胞中でのエンドヌクレアーゼ切断により、ＲＮＡの安定性が低下することがよくある。Ｆｉｌｏｎｏｖら、（２０１５年）ＣｈｅｍＢｉｏｌ．２２（５）：６４９～６６０頁。ｔＲＮＡスカフォールドの代替物は、生体直交性のスカフォールドである。生体直交性のスカフォールドは、Ｖ５、Ｆ２９、またはＦ３０スカフォールドのように、細胞内ヌクレアーゼに認識されにくく、分解の標的となりにくい。同上。

【0194】

生体直交性のスカフォールドがＳ１ｍアプタマーを安定化させ、下流のｍＲＮＡアフィニティー精製プロセスの効率を改善しうるかどうかをテストするために、１×Ｓ１ｍアプタマーを安定化させるＦ３０スカフォールド（Ｆ３０－１×Ｓ１ｍアプタマー）または２×Ｓ１ｍアプタマーを安定化させるＦ３０スカフォールド（Ｆ３０－２×Ｓ１ｍアプタマー）のいずれかを含む２つのベクターを構築した。Ｆ３０－１×Ｓ１ｍアプタマーおよびＦ３０－２×Ｓ１ｍアプタマーの配列を以下に示す。

【0195】

Ｆ３０－１×Ｓ１ｍアプタマーをコードするＤＮＡ配列（下線を付した太字がＦ３０セグメント）：

【化2】

【0196】

Ｆ３０－１×Ｓ１ｍアプタマー（下線を付した太字がＦ３０セグメント）：

【化3】

【0197】

Ｆ３０－２×Ｓ１ｍアプタマーをコードするＤＮＡ配列（下線を付した太字がＦ３０セグメント）：

【化4】

【0198】

Ｆ３０－２×Ｓ１ｍアプタマー（下線を付した太字がＦ３０セグメント）：

【化5】

【0199】

他の目的のアプタマーがＦ３０スカフォールドに容易に挿入されうる。１×アプタマー構成では、左のＦ３０配列と「１×右」のＦ３０配列が１つのアプタマーに隣接する。２×アプタマー構成では、左のＦ３０配列と中央のＦ３０配列が第１のアプタマーに隣接し、中央のＦ３０配列と「２×右」のＦ３０配列が第２のアプタマーに隣接する。Ｆ３０－１×アプタマーおよびＦ３０－２×アプタマーの配列を以下に示す。

【0200】

Ｆ３０－１×アプタマーをコードするＤＮＡ配列：
ＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧ（左Ｆ３０配列、配列番号３２）－アプタマー配列－ＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ（「１×右」Ｆ３０配列、配列番号３３）

【0201】

Ｆ３０－１×アプタマー：
ＵＵＧＣＣＡＵＧＵＧＵＡＵＧＵＧＧＧ（左Ｆ３０配列、配列番号３４）－アプタマー配列－ＣＣＣＡＣＡＵＡＣＵＣＵＧＡＵＧＡＵＣＣＵＵＣＧＧＧＡＵＣＡＵＵＣＡＵＧＧＣＡＡ（「１×右」Ｆ３０配列、配列番号３５）

【0202】

Ｆ３０－２×アプタマーをコードするＤＮＡ配列：
ＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧ（左Ｆ３０配列、配列番号３６）－アプタマー配列－ＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣ（中央Ｆ３０配列、配列番号３７）－アプタマー配列－ＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ（「２×右」Ｆ３０配列、配列番号３８）

【0203】

Ｆ３０－２×Ｓ１ｍアプタマー（下線を付した太字がＦ３０セグメント）：
ＵＵＧＣＣＡＵＧＵＧＵＡＵＧＵＧＧＧ（左Ｆ３０配列、配列番号３９）－アプタマー配列－ＣＣＣＡＣＡＵＡＣＵＣＵＧＡＵＧＡＵＣＣ（中央Ｆ３０配列、配列番号４０）－アプタマー配列－ＧＧＡＵＣＡＵＵＣＡＵＧＧＣＡＡ（「２×右」Ｆ３０配列、配列番号４１）

【0204】

Ｆ３０－１×Ｓ１ｍおよびＦ３０－２×Ｓ１ｍアプタマーｍＲＮＡのアフィニティー結合を分析するために、アプタマーｍＲＮＡをストレプトアビジンセファロースビーズでアフィニティー精製し、溶出させ、溶出液中のＲＮＡ回収量を上記の方法を用いて定量した。ストレプトアビジンセファロースビーズとタグ付けされていないｍＲＮＡ（アプタマー無し対照）、４×Ｓ１ｍアプタマー、Ｆ３０－１×Ｓ１ｍアプタマー、またはＦ３０－２×Ｓ１ｍアプタマーでタグ付けされたｍＲＮＡのいずれかとの結合親和性を評価し、比較した。

【0205】

以下の表５にも示されているように、アフィニティー精製されたＦ３０－１×Ｓ１ｍおよびＦ３０－２×Ｓ１ｍｍＲＮＡは、ストレプトアビジンビーズとのインキュベーション前に回収した入力試料に対して、約３０～４０％のＲＮＡ回収率をもたらした（図２０Ｂ）。

【0206】

【表9】