特表 2024-537096 がんの治療のための代替的なＰＤ１－ＩＬ７ｖイムノコンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】がんの治療のための代替的なＰＤ１－ＩＬ７ｖイムノコンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241003BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241003BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20241003BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K14/54

C12N15/13

C12N15/24

C12N15/62 Z

A61K47/68

A61K47/65

A61P35/00

A61P43/00 111

A61K39/395 N

A61K39/395 U

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519981

(86)(22)【出願日】2022-10-12

(85)【翻訳文提出日】2024-04-23

(86)【国際出願番号】 EP2022078327

(87)【国際公開番号】W WO2023062048

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】21202552.2

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】コダッリ ディーク， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】ドゥリニ， グレタ

(72)【発明者】

【氏名】フライモサー－グルントショーバー， アン

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ラウナー， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】メスナー， エッケハルト

(72)【発明者】

【氏名】ニコリーニ， バレリア

(72)【発明者】

【氏名】シュレンブルク， シンディ

(72)【発明者】

【氏名】ウマーニャ， パブロ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、概して、がんの治療における使用のためのイムノコンジュゲート、特に、変異型インターロイキン７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、そのようなイムノコンジュゲートの使用、及び前記イムノコンジュゲートを投与することを含むがんの治療方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんの治療における使用のためのイムノコンジュゲートであって、イムノコンジュゲートが、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド及び（ｉｉ）抗体を含み、抗体が、ＰＤ１に結合し、配列番号１によるＶＨドメイン及び配列番号２によるＶＬドメインを含み、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、配列番号１４を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較してＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる、使用のためのイムノコンジュゲート。

【請求項2】

がんの治療のための医薬の製造におけるイムノコンジュゲートの使用であって、イムノコンジュゲートが、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド及び（ｉｉ）抗体を含み、抗体が、ＰＤ１に結合し、配列番号１によるＶＨドメイン及び配列番号２によるＶＬドメインを含み、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、配列番号１４を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較してＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる、使用。

【請求項3】

治療的有効量のイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、前記個体におけるがんを治療する方法であって、イムノコンジュゲートが、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド及び（ｉｉ）抗体を含み、抗体が、ＰＤ１に結合し、配列番号１によるＶＨドメイン及び配列番号２によるＶＬドメインを含み、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、配列番号１４を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較してＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる、方法。

【請求項4】

配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位のアミノ酸置換がＧ８５Ｅである、請求項１に記載の使用のためのイムノコンジュゲート、請求項２に記載の使用、又は請求項３に記載の方法。

【請求項5】

変異型インターロイキン－７ポリペプチドが、Ｋ８１位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項6】

変異型インターロイキン－７ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ８１Ｅを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項7】

イムノコンジュゲートが、最大１つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項8】

抗体が、第１のサブユニットと第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項9】

Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである、請求項８に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項10】

ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項８又は９に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項11】

抗体が、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである、請求項８から１０のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項12】

Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項13】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に位置決め可能な突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の突起が位置決め可能である空洞が生成される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項14】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項８から１３のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項15】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に３４９位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項８から１４のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項16】

変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、そのアミノ末端アミノ酸で、任意選択的にリンカーペプチドを通じて、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つの、特にＦｃドメインの第１のサブユニットの、カルボキシ末端アミノ酸に融合している、請求項８から１５のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項17】

リンカーペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項18】

Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合、及び／又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項８から１７のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項19】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）からなる群より選択される１つ又は複数の位置におけるものである、請求項１８に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項20】

Ｆｃドメインの各サブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、請求項８から１９のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【請求項21】

配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、がんの治療における使用のためのイムノコンジュゲート、特に、変異型インターロイキン－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、そのようなイムノコンジュゲートの使用、及び前記イムノコンジュゲートを投与することを含むがんの治療方法に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン－７（ＩＬ－７）は、主にリンパ系組織中の間質細胞によって分泌されるサイトカインである。ＩＬ－７は、例えば、多能性造血幹細胞のリンパ芽球への分化を刺激することによって、リンパ球の成熟に関与する。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生及び生存、並びに成熟Ｔ細胞の恒常性に不可欠である。ＩＬ－７が不足すると、未熟な免疫細胞の停止が引き起こされる（Ｌｉｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７（３）：９６３－９６７）。

【0003】

ＩＬ－７は、ＩＬ－７ Ｒアルファ鎖（ＩＬ－７Ｒα、ＣＤ１２７）と共通ガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２、ＩＬ－２Ｒγ）とから構成されるＩＬ－７受容体に結合し、インターロイキンＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１と相互作用する（Ｒｏｃｈｍａｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４８０－４９０）。γｃはほとんどの造血細胞によって発現されるのに対して、ＩＬ－７Ｒαはリンパ系統の細胞によってほぼ排他的に発現される（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｒｕｍ Ｓ．Ｋ．（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２）：１４４－５４）。ＩＬ－７Ｒαは、ナイーブ細胞からエフェクター細胞への分化とともにＴ細胞の表面上にみられるが、その発現は最終分化Ｔ細胞上で低下し、制御性Ｔ細胞の表面には実質的に存在しない。ＩＬ－７Ｒα ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルはＩＬ－２によって負に制御されるため、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）を発現する最近活性化されたＴ細胞ではＩＬ－７Ｒαが下方制御され（Ｘｕｅ Ｈ．Ｈ，ｅｔ ａｌ．２００２，ＰＮＡＳ．９９（２１）：１３７５９－６４）、このメカニズムは、最近感作刺激されたＴ細胞のＩＬ－２媒介の迅速なクローン増殖を確実にする一方、ＩＬ－７の役割はすべてのＴ細胞クローンを均等に維持することである。ＩＬ－７Ｒαはまた、ＰＤ－１遮断に応答するがん患者の腫瘍において見出される、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＣＦ－１＋ＰＤ－１＋幹様ＣＤ８ Ｔ細胞の新たに特徴づけられた前駆体集団についても最近報告された（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５１，１０４３－１０５８；Ｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１７，ｎｏ．８，４２９２－４２９９；Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０，１９５－２１１；Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１；ｅａａｙ６８６３（２０１９）；Ｖｏｄｎａｌａ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ５７６，１９／２６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９）。今日まで、幹様ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＩＬ－７の効果に関する科学的説明はないが、チェックポイント阻害剤に応答する患者の数を増加させるために、ＩＬ－７を使用して腫瘍反応性Ｔ細胞のこの集団を増殖させ得た。

【0004】

ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒα及びγｃは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ（ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）－シグナル伝達及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ））経路並びにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ（ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ））シグナル伝達カスケードを介してシグナル伝達する三成分複合体を形成し、Ｂ細胞及びＴ細胞の発達及び恒常性をもたらすＮｉｕ Ｎ．ａｎｄ Ｑｉｎ Ｘ．（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（３）：１８７－１８９，Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４（７）：３４６１－３４６９）。

【0005】

ＩＬ－７は、２５ｋＤａの４ヘリックスバンドル、単量体タンパク質である。ヘリックス長は１３から２２アミノ酸までに及び、これはインターロイキンに結合する他の一般的なガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２、ＩＬ－２Ｒγ）のヘリックス長と同様である。しかしながら、ＩＬ－７は、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα相互作用を安定化させることが示されたＡヘリックスにおいて独特のターンモチーフを示す（ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １７：５４－６５）。Ａヘリックスは受容体鎖ＩＬ－７Ｒα及びγｃの両者と相互作用するが、Ｃヘリックスは主にＩＬ－７Ｒαと相互作用し、Ｄヘリックスはγｃ鎖と相互作用する（ＰＤＢ：３ＤＩ２及びＰＤＢ：２ＥＲＪに基づく配列及び構造アラインメント）。異種性を減少させる及び／又は親和性／効力を減少させる修飾を有するバリアントＩＬ－７は、国際公開第２０２０／１２７３７７ Ａ１号及び同第２０２０／２３６６５５ Ａ１号に記載されている。

【0006】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＣＤ２７９）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーであり、これには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ－１は、細胞表面受容体であり、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄細胞上で発現される（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ－１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様細胞外ドメインと、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する細胞質ドメインとからなる単量体１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１に対する２つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が同定されており、これらはＰＤ－１への結合時にＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔａｌ（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は両方とも、ＰＤ－１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ－１に対する１つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１は、さまざまなヒトのがんにおいて豊富に存在する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介増殖の減少をもたらし、がん細胞による免疫回避を可能にする（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所相互作用を阻害することによって逆転させることができ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２の相互作用も同様にブロックされると、効果は相加的である（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ７．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ ＵＳＡ ９９：１２２９３－７；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７－６６）。

【0007】

ＰＤ－１に結合する抗体は、例えば国際公開第２０１７／０５５４４３号に記載されている。承認されている治療用ＰＤ－１抗体には、ペムブロリズマブとニボルマブがある。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＰＤ－１に結合する抗体への変異型ＩＬ－７ポリペプチドの抱合を介して、免疫療法のための有利な特性を有するＩＬ－７の変異体形態を、腫瘍細胞ではなく細胞傷害性Ｔリンパ球などの免疫エフェクター細胞に直接標的化する新規なアプローチを提供する。これは、ＰＤ－１発現免疫サブセット、特に腫瘍反応性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋ＰＤ１＋ＴＣＦ＋Ｔ細胞サブセット及びそれらの子孫へのＩＬ－７変異体のシス送達をもたらす。

【0009】

本発明で使用されるＩＬ－７の変異体は、サイトカイン免疫療法に関連する問題、特にＶＬＳの誘導によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘導によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴ_ｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制を克服するように設計されてきた。上記の腫瘍標的化からの腫瘍の回避を避けることに加えて、免疫エフェクター細胞へのＩＬ－７変異体の標的化は、ＣＴＬよりもＴｒｅｇ上のＰＤ－１及びＩＬ－７Ｒα発現レベルが低いため、免疫抑制Ｔ_ｒｅｇ細胞よりも腫瘍特異的ＣＴＬの優先的活性化をさらに増加させ得る。ＰＤ－１に結合する抗体を使用することにより、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用によって誘導されるＴ細胞活性の抑制がさらに逆転され得、したがって免疫応答がさらに増強され得る。

【0010】

本発明は、がんの治療における使用のためのイムノコンジュゲートを提供し、ここで、イムノコンジュゲートは、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド及び（ｉｉ）抗体を含み、抗体は、ＰＤ１に結合し、配列番号１によるＶＨドメイン及び配列番号２によるＶＬドメインを含み、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、配列番号１４を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較してＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる。

【0011】

さらに、本発明は、がんの治療のための医薬の製造におけるイムノコンジュゲートの使用を提供し、ここで、イムノコンジュゲートは、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド及び（ｉｉ）抗体を含み、抗体は、ＰＤ１に結合し、配列番号１によるＶＨドメイン及び配列番号２によるＶＬドメインを含み、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、配列番号１４を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較してＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる。

【0012】

さらに、本発明は、治療的有効量のイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、個体におけるがんを治療する方法を提供し、ここで、イムノコンジュゲートは、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド及び（ｉｉ）抗体を含み、抗体は、ＰＤ１に結合し、配列番号１によるＶＨドメイン及び配列番号２によるＶＬドメインを含み、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、配列番号１４を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較してＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる。

【0013】

一態様では、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位におけるアミノ酸置換は、Ｇ８５Ｅである。

【0014】

さらなる態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、Ｋ８１位にアミノ酸置換をさらに含む。一態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ８１Ｅを含む。

【0015】

一態様では、イムノコンジュゲートは、最大１つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。

【0016】

一態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧクラス、特に、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。さらなる態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一態様では、抗体はＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。

【0017】

別の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。別の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基で置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、任意に３６６位のスレオニン残基はセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基はアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。またさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0018】

一態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つ、特に、Ｆｃの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して、融合する。一態様では、リンカーペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。

【0019】

別の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。別の態様では、前記１つ又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）からなる群より選択される１つ又は複数の位置にある。一態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む。

【0020】

一態様では、本発明による、使用のためのイムノコンジュゲート、使用、又は方法は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】２つのＦａｂドメイン（可変ドメイン、定常ドメイン）、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、及びＦｃドメインのＣ末端に融合された変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むＩｇＧ－ＩＬ－７イムノコンジュゲートフォーマットの概略図。

【図2】ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１と比較した、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ｗｔで処理した場合の共培養したＰＤ１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。ＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）を、曝露１２分後の共培養したＰＤ１^＋（実線）及びＰＤ－１を予め遮断された（点線）ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５－Ｐの頻度として示した。３名のドナーの平均±ＳＥＭ。

【図3】ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１と比較した、参照分子５～８で処理した場合の共培養したＰＤ１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。ＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）を、曝露１２分後の共培養したＰＤ１^＋（実線）及びＰＤ－１を予め遮断された（点線）ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５－Ｐの頻度として示した。３名のドナーの平均±ＳＥＭ。

【図4】ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１と比較した、参照分子９及び１０で処理した場合の共培養したＰＤ１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。ＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）を、曝露１２分後の共培養したＰＤ１^＋（実線）及びＰＤ－１を予め遮断された（点線）ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５－Ｐの頻度として示した。３名のドナーの平均±ＳＥＭ。

【発明を実施するための形態】

【0022】

定義
本明細書に開示されるイムノコンジュゲートは、本明細書に記載される使用及び方法において特に有用であり得る。

【0023】

以下で別途定義されない限り、本明細書では、当該技術分野で一般的に使用される用語を使用する。

【0024】

本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴、例えばＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγへの結合が減少する限り、置換、欠失、挿入及び修飾のいかなる組み合わせも最終構築物に到達させ得る。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。末端欠失の例は、完全長ヒトＩＬ－７の１位における残基の欠失である。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、ＩＬ－７ポリペプチドの結合特徴を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること）が特に好ましい。好ましいアミノ酸置換は、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸によって置き換えることを含む。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０の標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当該技術分野でよく知られている遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子工学以外の方法、例えば化学修飾によるアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用であり得ると考えられる。

【0025】

「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合的相互作用の合計強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができ、それは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含み得る。親和性は、ここに記載のものを含む当該技術分野で既知の確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0026】

ＩＬ－７は、ＩＬ－７Ｒアルファ鎖（本明細書では、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ７Ｒα、ＩＬ－７ａ、ＩＬ７Ｒａ又はＣＤ１２７とも呼ばれる）並びに共通ガンマ鎖（本明細書では、γｃ、ＣＤ１３２、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－２Ｒｇ、ＩＬ２Ｒｇ、ＩＬ－２Ｒγ又はＩＬ２Ｒγとも呼ばれる）で構成されるＩＬ－７受容体に結合し、これはインターロイキンＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１と相互作用する（Ｒｏｃｈｍａｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４８０－４９０）。

【0027】

ＩＬ－７受容体に対する変異型又は野生型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器及び組み換え発現（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８，１１９７－１２０２（２０００））を参照）によって得られ得る受容体サブユニットを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されている方法に従って測定され得る。あるいは、ＩＬ－７受容体に対するＩＬ－７変異体の結合親和性は、受容体の１つ又は他のそのような形態を発現することが公知の細胞株を用いて評価され得る。結合親和性を測定するための具体的で説明的な例示的実施態様を、以下に記載する。

【0028】

本明細書で使用される「インターロイキン－７」又は「ＩＬ－７」という用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＩＬ７を指す。この用語は、未処理のＩＬ－７と、細胞におけるプロセシングから生じるＩＬ－７の任意の形態を包含する。この用語は、ＩＬ－７の天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＩＬ－７のアミノ酸配列は配列番号１４に示される。

【0029】

本明細書で使用される「ＩＬ－７変異体」又は「変異型ＩＬ－７ポリペプチド」という用語は、完全長ＩＬ－７、ＩＬ－７の切断型、及びＩＬ－７が融合又は化学的コンジュゲーション等によって別の分子に連結した形態を含む、ＩＬ－７分子の様々な形態のあらゆる変異形態を包含することを意図している。「完全長」は、ＩＬ－７に関して使用される場合、成熟した天然の長さのＩＬ－７分子を意味することを意図している。例えば、完全長ヒトＩＬ－７は、配列番号１４によるポリペチド配列を有する分子を指す。様々な形態のＩＬ－７変異体は、ＩＬ－７とＩＬ７Ｒアルファ及び／又はＩＬ２Ｒガンマとの相互作用に影響を及ぼす少なくとも１つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、その位置に通常位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、トランケーション又は修飾を含み得る。アミノ酸置換によって得られる変異体が好ましい。別途指示がない限り、ＩＬ－７変異体は、本明細書中では、変異型ＩＬ－７ペプチド配列、変異型ＩＬ－７ポリペプチド、変異型ＩＬ－７タンパク質、変異型ＩＬ－７類似体又はＩＬ－７バリアントと称される場合がある。

【0030】

ＩＬ－７の様々な形態の命名は、本明細書では、配列番号１４に示される配列に対して行われる。同じ変異を示すために、本明細書では様々な名称が使用され得る。例えば、位置１５のバリンからアラニンへの変異は、１５Ａ、Ａ１５、Ａ_１５、Ｖ１５Ａ、又はＶａｌ１５Ａｌａとして示され得る。

【0031】

本明細書で使用される「ヒトＩＬ－７分子」とは、配列番号１４のヒトＩＬ－７配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９６％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－７分子を意味する。特に、配列同一性は、少なくとも約９５％、より詳しくは、少なくとも約９６％である。特定の実施態様では、ヒトＩＬ－７分子は、完全長ＩＬ－７分子である。

【0032】

本明細書で使用されるＩＬ－７の「野生型」形態は、野生型形態が、変異型ＩＬ－７ポリペプチドの各アミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと同じＩＬ－７の形態である。例えば、ＩＬ－７変異体が完全長ＩＬ－７である（すなわちＩＬ－７が、任意の他の分子に融合又はコンジュゲートしていない）場合、この変異体の野生型形態は完全長天然ＩＬ－７である。ＩＬ－７変異体が、ＩＬ－７とＩＬ－７の下流（例えば、抗体鎖）をコードする別のポリペプチドとの融合である場合、このＩＬ－７異性体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドに融合した、野生型アミノ酸配列を有するＩＬ－７である。さらに、ＩＬ－７変異体が、ＩＬ－７の切断型（ＩＬ－７のトランケートされていない部分の中の変異した形態又は修飾された形態）である場合、このＩＬ－７変異体の野生型形態は、同様に、野生型配列を有するトランケートされたＩＬ－７である。ＩＬ－７受容体結合親和性、ＩＬ－７受容体結合又は様々な形態のＩＬ－７変異体の生物学的活性を対応する野生型形態のＩＬ－７と比較する目的で、野生型という用語は、天然に存在する天然のＩＬ－７と比較してＩＬ－７受容体結合に影響を及ぼさない１つ又は複数のアミノ酸変異を含むＩＬ－７の形態を包含する。本発明による特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－７ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。

【0033】

「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔ_ｒｅｇ細胞」とは、末梢寛容と呼ばれる、他のＴ細胞の応答を抑制し得る特殊なタイプのＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ＩＬ－２受容体のα－サブユニット（ＣＤ２５）の発現上昇、ＩＬ－７Ｒα（ＣＤ１２７）及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の低値又は非存在を特徴とし（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２，５３１－６２（２００４））、腫瘍によって発現されるものを含む抗原に対する末梢自己寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たす。本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、生存及び／又は恒常性がＩＬ－７によって影響されるリンパ球の集団を指す。エフェクター細胞には、メモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞、並びに腫瘍反応性幹様Ｔ細胞を含む最近プライミングされたＴ細胞が含まれる。

【0034】

本明細書で使用される場合、「ＰＤ１」、「ヒトＰＤ１」、「ＰＤ－１」又は「ヒトＰＤ－１」（プログラムされた細胞死タンパク質１、又はプログラムされた死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １）としても知られる）は、ヒトタンパク質ＰＤ１（配列番号７、シグナル配列を含まないタンパク質）／（配列番号８、シグナル配列を含むタンパク質）を指す。ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１５１１６（バージョン１５６）も参照。本明細書で使用される場合、「ＰＤ－１に結合する」、「ＰＤ－１に特異的に結合する」、「ＰＤ－１に結合する」又は「抗ＰＤ－１抗体」とは、ＰＤ－１、特に細胞表面に発現するＰＤ－１ポリペプチドに十分な親和性で結合できる抗体を指し、その抗体がＰＤ－１を標的とする診断剤及び／又は治療剤として有用であることを指す。一実施態様では、無関係な非ＰＤ－１タンパク質に対する抗ＰＤ－１抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、ＰＤ－１に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＰＤ－１に結合する抗体は、ヒトＰＤ－１への結合についての結合親和性のＫＤ値が、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍから１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９から１０^－１３Ｍ）である。結合親和性のＫＤ値は、ヒトＰＤ－１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ－１－ＥＣＤ、配列番号１３を参照）を抗原として用いた表面プラズモン共鳴アッセイで決定され得る。

【0035】

「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用と区別できることを意味する。抗体が特定の抗原（例えば、ＰＤ－１）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は当業者によく知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定され得る。一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体の、無関係なタンパク質に対する結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。本明細書に記載されるような使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、ＰＤ－１に特異的に結合する。

【0036】

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に連結した単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の鎖を指すのであって、特定の長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すのに使用される他のいかなる用語も「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれの用語の代わりに、又はそれらと互換的に使用されてもよい。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図されており、このような生成物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から誘導されてもよく、又は組み換え技術によって生成されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で生成され得る。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有することができるが、そのような構造を必ずしも有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると称され、規定の三次元構造を有さずに多数の異なる立体配座を採用することのできるポリペプチドは、折りたたまれていないと称される。

【0037】

「単離された」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体は、その自然の環境にないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞に発現される組み換え生成されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって、分離されるか、断片化されるか、又は部分的に若しくは実質的に精製された天然ポリペプチド又は組み換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。

【0038】

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ，Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。ただし、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを備えたＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－ ２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．から公的に入手可能である。又は、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用し、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダ中に与えられる。

【0039】

「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。

【0040】

「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、本発明による使用のためのポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物、並びに陽性及び陰性の鎖形態、及び二本鎖形態を含む。単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。

【0041】

「［例えば、本発明のイムノコンジュゲート］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖並びに／又はＩＬ－７ポリペプチド（又はその断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおけるそのような１つ又は複数のポリヌクレオチド分子と、宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するそのような１つ又は複数の核酸分子とを含む。

【0042】

「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組み換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片中に取り込まれ得る。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。発現カセットは、本発明による使用のためのイムノコンジュゲート又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0043】

「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、細胞内でそれが作用可能に会合される特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクターと、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターとを含む。発現ベクターは、発現カセットを含み得る。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構により産生される。発現ベクターは、本発明による使用のためのイムノコンジュゲート又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み得る。

【0044】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートを生成するために使用され得る任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。

【0045】

本明細書での「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。

【0046】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、例えば、天然に存在する突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、あり得るバリアント抗体（そのようなバリアントは通常微量で存在する）を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な手法によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書中に記載される。

【0047】

「単離された」抗体は、その自然環境の構成要素から分離された（すなわち、その天然環境にはない）ものである。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離された抗体は、その天然環境又は自然環境から除去することができる。宿主細胞内で発現する組み換え産生された抗体は、任意の適切な技術によって、分離され、画分化され、又は部分的に若しくは実質的に精製された、天然又は組み換え抗体と同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。このように、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、単離される。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）法によって決定して、純度が９５％又は９９％より大きくなるまで精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばＦｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照のこと。

【0048】

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用されて、天然抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体を指す。

【0049】

「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子である。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、様々な技術によって作製され得る。

【0050】

「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分類することできる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。

【0051】

「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合するとともに抗原の一部又は全部に相補的であるエリアを含む、抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域ともいう）によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。

【0052】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。可変領域配列に関して本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に従って番号付けされる。

【0053】

本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載される、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の６４７～６６０頁を参照）を、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１～７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と言及することによって本明細書でさらに明確にしている。

【0054】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。本発明の例示的なＨＶＲとして、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。

【0055】

別途指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされている。

【0056】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）に次の順序で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0057】

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。このような可変ドメインを、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ぶ。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復するか又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生み出すために定常領域が元の抗体の定常領域からさらに修飾又は変更されたものである。

【0058】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、あるいは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット又はウサギに由来する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片もまた、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。

【0059】

抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0060】

本明細書の「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう定義されている。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により、宿主細胞によって生産される抗体は、完全長重鎖を含むことも、完全長重鎖の切断されたバリアント（本明細書では「切断バリアント重鎖」とも呼ぶ）を含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とリジン（Ｋ４４７）は、存在してもしなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別途指示がない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明による使用のための組成物、例えば、本明細書に記載の薬学的組成物は、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの集合を含む。イムノコンジュゲートの集合は、完全長重鎖を有する分子と、切断されたバリアント重鎖を有する分子とを含み得る。イムノコンジュゲートの集合は、完全長重鎖を有する分子と、切断されたバリアント重鎖を有する分子との混合物からなっていてもよく、イムノコンジュゲートの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、切断されたバリアント重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの集合を含む組成物は、さらなるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むイムノコンジュゲートを含む。本発明の一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの集合を含む組成物は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むイムノコンジュゲートを含む。本発明の一実施態様では、そのような組成物は、本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子と、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子と、さらなるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子とで構成される本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの集合を含む。本明細書に別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記も参照）に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用される場合のＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

【0061】

「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、この修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、これらＦｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を、それらの会合がそれぞれ立体的に又は静電的に望ましいものになるように変化させる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に起こり、これらは、サブユニットの各々に融合したさらなる構成成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれにおける別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。

【0062】

「エフェクター機能」という用語は、抗体に言及して使用される場合、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。

【0063】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体でコーティングされた標的細胞の溶解につながる免疫機構である。標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語「ＡＤＣＣの低下」は、上で定義したＡＤＣＣの機構により、標的細胞を取り囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存方法（これらは当業者には既知である）を用いて、同じタイプの宿主細胞によって産生されたが操作されたことがない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。例えば、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換をＦｃドメインに含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。

【0064】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの係合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。

【0065】

本明細書において使用される「操作する、操作された、操作」という用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、これらの手法の組み合わせとが含まれる。

【0066】

「結合の低下」、例えば、Ｆｃ受容体又はＣＤ２５に対する結合の低下は、例えばＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確にするために、この用語には、親和性をゼロ（又は分析方法の検出限界未満）に減少させること、すなわち相互作用の完全な消失も含まれる。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。

【0067】

本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、少なくとも１つのＩＬ－７分子と少なくとも１つの抗体とを含むポリペプチド分子を指す。ＩＬ－７分子は、様々な相互作用によって、本明細書に記載の様々な構成で、抗体に接続し得る。特定の実施態様では、ＩＬ－７分子は、ペプチドリンカーを介して抗体に融合する。本発明による使用のための特定のイムノコンジュゲートは、１つ又は複数のリンカー配列によって結合された、１つのＩＬ－７分子及び抗体から本質的になる。

【0068】

「融合した」とは、構成要素（例えば、抗体及びＩＬ－７分子）が、ペプチド結合によって直接的に、又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して、結合されることを意味する。

【0069】

本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインサブユニット等に関する「第１」及び「第２」という用語は、それぞれの種類の部分が複数存在する場合に、区別するのが簡便なように使用される。これらの用語の使用は、明示的に述べられていない限り、イムノコンジュゲートの特定の順序又は配向を付与することを意図しない。

【0070】

「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理的変化をもたらすために必要な量である。

【0071】

薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び期間において有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、減少させ、遅延させ、最小限にし、又は防止する。

【0072】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。

【0073】

「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物活性を有効にするような形態の調製物であって、組成物が投与される対象にとって許容できない毒性を有する追加成分を含まない調製物を指す。

【0074】

「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の、薬学的組成物中の成分であって、対象にとって毒性でない成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、添加物、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0075】

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変えようとする試行における臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の経過の間に実施することができる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0076】

実施態様の詳細な説明
変異型ＩＬ－７ポリペプチド
本発明による使用のためのイムノコンジュゲートのＩＬ－７バリアントは、免疫療法に有利な特性を有する。

【0077】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、ＩＬ－７受容体のα－サブユニット及び／又はＩＬ－２Ｒγサブユニットに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。

【0078】

ＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγに対する親和性が減少したヒトＩＬ－７（ｈＩＬ－７）の変異体は、例えば、アミノ酸位置８１若しくは８５又はこれらの組み合わせ（ヒトＩＬ－７配列、配列番号１４に対する番号付け）でのアミノ酸置換によって生成され得る。例示的なアミノ酸置換には、Ｋ８１Ｅ及びＧ８５Ｅが含まれる。一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、前記変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号１４によるアミノ酸置換Ｇ８５Ｅを含む。さらなる実施態様では、使用のためのイムノコンジュゲートの前記変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号１４によるヒトＩＬ－７のＫ８１及びＧ８５位にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、前記変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号１４によるアミノ酸置換Ｋ８１Ｅ及びＧ８５Ｅを含む。

【0079】

変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、好ましくはアミノ酸位置９３及び１１８のうちの１つ又はそれらの組み合わせにおいて、ポリペプチドの相同性を改善する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み得る。例示的なアミノ酸置換には、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａが含まれる。

【0080】

本発明のいくつかの実施態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。これらの変異体は、野生型形態のＩＬ－７変異体と比較して、インターロイキン７受容体に対する親和性の実質的な低下を示している。

【0081】

本明細書に開示されるＩＬ－７変異体の他の特徴としては、ＰＤ１－ＩＬ－７イムノコンジュゲート中では主にトランスで（近接した細胞上で）送達される野生型ＩＬ－７と比較して、ＰＤ－１発現ＣＤ４ Ｔ細胞上のシスで（同じ細胞上で）ＩＬ－７のＰＤ－１媒介送達を可能にするために、ＩＬ－７Ｒαに対して親和性が低下していることが挙げられる。

【0082】

特定の実施態様では、前記アミノ酸変異は、ＩＬ－Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を、少なくとも５分の１、具体的には少なくとも１０分の１、より具体的には少なくとも２５分の１まで低下させる。

【0083】

ＩＬ－７のＮ－グリコシル化の除去と組み合わせたＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγに対するＩＬ－７の親和性の低下は、特性が改善されたＩＬ－７タンパク質をもたらす。例えば、Ｎ－グリコシル化部位を除去すると、変異型ＩＬ－７ポリペプチドがＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞において発現される場合、より均一な産物をもたらす。ＩＬ－７のＮ－グリコシル化部位の除去は、ヒトＩＬ－７の残基７２、９３又は１１８に相当する位置におけるアミノ酸変異によって達成され得る。

【0084】

具体的な実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、Ｔリンパ球細胞の増殖、プライミングされたＴリンパ球細胞のエフェクター機能、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞の増殖、活性化Ｂ細胞の分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖、ＮＫ細胞の分化、活性化Ｔ細胞又はＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞傷害性からなる群より選択される細胞応答のうちの１つ又は複数をさらに誘発することができる。

【0085】

一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－２配列、例えば、配列番号１４のヒトＩＬ－７配列と比較して、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下のアミノ酸変異を含む。特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートの変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－７配列、例えば、配列番号１４のヒトＩＬ－７配列と比較して、５以下のアミノ酸変異を含む。

【0086】

イムノコンジュゲート
本明細書に記載のイムノコンジュゲートは、ＩＬ－分子及び抗体を含む。このようなイムノコンジュゲートは、ＩＬ－７を例えば腫瘍微小環境に直接的に標的化することによって、ＩＬ－７治療の有効性を顕著に高める。本発明によれば、イムノコンジュゲートに含まれる抗体は、全抗体若しくは免疫グロブリン、又は抗原特異的な結合親和性等の生物学的機能を有するこれらの一部若しくはバリアントであり得る。

【0087】

イムノコンジュゲート治療の一般的な利益は、容易に明らかである。例えば、イムノコンジュゲートに含まれる抗体は、腫瘍特異的なエピトープを認識し、腫瘍部位に対するイムノコンジュゲート分子の標的化をもたらす。したがって、高濃度のＩＬ－７が腫瘍微小環境に送達され得、それによって、コンジュゲートされていないＩＬ－７で必要とされるよりもかなり少ない用量のイムノコンジュゲートを用い、本明細書に述べた様々な免疫エフェクター細胞の活性化及び増殖が引き起こされる。しかしながら、ＩＬ－７イムノコンジュゲートのこの特徴は、ＩＬ－７分子の潜在的な副作用を再び悪化させる場合がある。血流中のＩＬ－７イムノコンジュゲートの血中半減期が、コンジュゲートされていないＩＬ－７と比較して、顕著に長いため、ＩＬ－７又は融合タンパク質部分の他の部分が、血管系内に通常存在する成分を活性化する可能性が高まる。同じ問題を、Ｆｃ又はアルブミン等の別の部分に融合したＩＬ－７を含む他の融合タンパク質にも適用し、血中のＩＬ－７の半減期を長くする。したがって、野生型形態のＩＬ－７と比較して毒性が低下した本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートが特に有利である。

【0088】

本明細書で上述したように、腫瘍細胞ではなく、免疫エフェクター細胞に対してＩＬ－７を直接的に標的化することは、ＩＬ－７免疫療法にとって有利であり得る。

【0089】

したがって、本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書で上述したような変異型ＩＬ－７ポリペプチド、及びＰＤ－１に結合する抗体を提供する。一実施態様では、前記変異型ＩＬ－７ポリペプチドと抗体とが融合タンパク質を形成し、すなわち、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは抗体とペプチド結合を共有する。いくつかの実施態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。具体的な実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して、融合する。いくつかの実施態様では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、より具体的にはＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリン分子である。このような一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のうちの１つと、アミノ末端ペプチド結合を共有している。ある特定の実施態様では、抗体は、抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体は、Ｆａｂ分子又はｓｃＦｖ分子である。一実施態様では、抗体はＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗体はｓｃＦｖ分子である。イムノコンジュゲートはまた、複数の抗体を含み得る。複数の抗体、例えば第１の抗体及び第２の抗体が、イムノコンジュゲートに含まれる場合、各抗体は、様々な形態の抗体及び抗体断片から独立して選択され得る。例えば、第１の抗体はＦａｂ分子であってもよく、第２の抗体はｓｃＦｖ分子であってもよい。具体的な実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれはｓｃＦｖ分子であるか、又は前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれはＦａｂ分子である。特定の実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれは、Ｆａｂ分子である。一実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれはＰＤ－１に結合する。

【0090】

イムノコンジュゲートフォーマット
例示的なイムノコンジュゲートフォーマットは、ＰＣＴ国際公開第２０１１／０２０７８３号に記載されており、その文献全体が参照により本明細書に援用される。これらのイムノコンジュゲートは、少なくとも２つの抗体を含む。したがって、一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、少なくとも第１の抗体及び第２の抗体とを含む。特定の実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、Ｆｖ分子、特にｓｃＦｖ分子とＦａｂ分子とからなる群より独立して選択される。特定の実施態様では、当該変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、当該第１の抗体と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、当該第２の抗体は、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は（ｉｉ）第１の抗体と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、１つ又は複数のリンカー配列によって結合する、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、第１の抗体及び第２の抗体、特にＦａｂ分子とから本質的になる。そのようなフォーマットは、それらが標的抗原（ＰＤ－１）に高い親和性で結合するが、ＩＬ－７受容体への単量体結合のみを提供し、したがって、標的部位以外の場所で免疫細胞を有するＩＬ－７受容体へのイムノコンジュゲートの標的化を回避するという利点を有する。特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子は、第１の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子と、カルボキシ末端ペプチドを共有する。特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１の重鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の重鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の軽鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合によって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドに結合し、さらに、アミノ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に結合する。別の実施態様では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合によって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドに結合し、さらに、カルボキシ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に結合する。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ 重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、１つ又は複数のｓｃＦＶ分子とアミノ末端ペプチド結合を共有するとともに、１つ又は複数のｓｃＦＶ分子と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。

【0091】

しかしながら、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートための特に好適なフォーマットは、抗体として免疫グロブリン分子を含む。このようなイムノコンジュゲートフォーマットは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0092】

したがって、特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ_１分子とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、最大１つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。一実施態様では、免疫グロブリン分子は、ヒトである。一実施態様では、免疫グロブリン分子は、ヒト定常領域、例えば、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含む。一実施態様では、免疫グロブリンは、ヒトＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、免疫グロブリン分子と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、１つ又は複数のリンカー配列によって結合された免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ_１分子とから本質的になる。特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、免疫グロブリン重鎖のうちの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によってはリンカーペプチドを介して、融合する。

【0093】

変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、抗体に直接的に、又は１つ又は複数のアミノ酸、典型的には、約２～２０アミノ酸を含むリンカーペプチドを介して、融合され得る。リンカーペプチドは当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎリンカーペプチドが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施態様では、リンカーペプチドは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施態様では、５～１００アミノ酸長、さらなる実施態様では、１０～５０アミノ酸長を有する。特定の実施態様では、リンカーペプチドは、１５アミノ酸長を有する。一実施態様では、リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）_ｎ又は（ＧｘＳ）_ｎＧ_ｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、さらなる実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝３、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２、及びｍ＝４である。特定の実施態様では、リンカーペプチドは、（Ｇ_４Ｓ）_２Ｇ_４（配列番号５）である。一実施態様では、リンカーペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する（又はそれからなる）。配列番号６のアミノ酸配列を含む代替的なリンカーペプチドが使用されてもよい。

【0094】

特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、変異型ＩＬ－７分子と、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリン分子とを含み、変異型ＩＬ－７分子は、そのアミノ末端アミノ酸において、配列番号５のリンカーペプチドを介して免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合されている。

【0095】

特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、変異型ＩＬ－７分子とＰＤ－１に結合する抗体とを含み、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含み、変異型ＩＬ－７分子は、そのアミノ末端アミノ酸において、配列番号５のリンカーペプチドを介してＦｃドメインのサブユニットの一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合されている。

【0096】

ＰＤ－１抗体
本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１が発現される標的部位、特に、ＰＤ－１を発現する、例えば腫瘍に関連するＴ細胞に、変異型ＩＬ－７ポリペプチドを誘導し得る。

【0097】

本明細書によるがんの治療、使用、又は方法のためのイムノコンジュゲートにおいて使用され得る適切なＰＤ－１抗体は、治療用ＰＤ－１抗体の、例えばペンブロリズマブ又はニボルマブの、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。

【0098】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、２つ以上の抗体を含んでもよく、これらは同じ抗原又は異なる抗原に結合し得る。しかしながら、特定の実施態様では、これらの抗体のそれぞれＰＤ－１に結合する。一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、単一特異性的である。特定の実施態様では、前記イムノコンジュゲートは、単一の単一特異性抗体、特に単一特異性免疫グロブリン分子を含む。

【0099】

抗体は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１への特異的結合を保持する任意の種類の抗体又はその断片であり得る。抗体断片としては、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）_２分子が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、特定の実施態様では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗体は免疫グロブリン、特にＩｇＧクラス、より具体的にはＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリンである。

【0100】

いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。

【0101】

いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0102】

特定の実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0103】

いくつかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。一実施態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号１０及び１１（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号１２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列、特に配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載のＦｃドメインにアミノ酸変異を含み得る。

【0104】

Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、最大１つのＦｃドメインを含む。

【0105】

一実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ_４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。またさらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号９に示されている。

【0106】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した変異型ＩＬ－７ポリペプチド、特に単一の（最大１つの）変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には、２つの同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組み換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組み換え産生におけるイムノコンジュゲートの収率及び純度を改善するため、抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。

【0107】

したがって、特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。

【0108】

ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾に複数の手法が存在し、それらは例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインの両方は、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がそれ自体ともはやホモ二量体化することがなく、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することができるように、（よって第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、二つの第１のＣＨ３ドメイン又は二つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されないように）相補的に操作される。

【0109】

具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する当該修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。

【0110】

ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進するとともにホモ二量体形成を妨害するように、空洞内に位置決めされ得る。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作成される。

【0111】

したがって、特定の実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、また、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。

【0112】

好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。

【0113】

好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される。

【0114】

突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作製され得る。

【0115】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のスレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメイン（「ホール」サブユニット）の第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のチロシン残基が、バリン残基と置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、位置３６６のスレオニン残基が、セリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0116】

またさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらに二量体を安定させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0117】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0118】

いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）をさらに含む。

【0119】

特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（場合によってはリンカーペプチドを介して）融合している。理論によって束縛されることを望まないが、Ｆｃドメインのノブを含有するサブユニットへの変異型ＩＬ－７ポリペプチドの融合は、２つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートの生成を（さらに）最小化する（２つのノブを含有するポリペプチドの立体的な衝突）。

【0120】

ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾のための他の技術が本発明による代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。

【0121】

一実施態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体の１つの好ましい実施態様は、アミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＫ３７０Ｅ、及びアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他の１つにおけるＥ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。

【0122】

別の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらに、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0123】

別の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらに、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0124】

一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択されるアミノ酸変異をさらに含む。

【0125】

一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２に、例えば、（ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、（ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、（ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、（ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、（ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、（ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択される、さらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0126】

一実施態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量化手法が代わりに使用され、例えば、３６８及び４０９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸修飾を有する。

【0127】

一実施態様では、上述のノブ・イントゥ・ホール技術をやはり使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0128】

一実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ_２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。

【0129】

代替的な一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体形成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを含む。そのような一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換を含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を、さらに又は代替的に含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0130】

なおさらなる実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0131】

さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用してもよい。

【0132】

一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0133】

Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、イムノコンジュゲートに、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び望ましい組織血液分布比を含む望ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への、イムノコンジュゲートの望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化がサイトカイン放出につながる場合があり、これが、ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートの長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び全身投与時の重篤な副作用をもたらす。したがって、特定の実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／エフェクター機能の低下を示す。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）は、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を示し、且つ／又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）が、天然のＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）の約７０％超、特に約８０％超、さらには特に約９０％超のＦｃＲｎに対する結合親和性を示すときに達成される。

【0134】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を有するように操作される。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。一実施態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１低下させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を低下させる、複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又はさらには少なくとも５０分の１低下させ得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含む抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、より詳しくは５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合は低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）が、Ｆｃドメインの操作されていない形態（又は前記Ｆｃドメインの操作されていない形態を含む抗体）の約７０％超の、ＦｃＲｎに対する結合親和性を示すときに達成される。Ｆｃドメイン又は本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下には、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の低下、標的結合抗体の架橋の低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１つ又は複数を含み得る。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの低下である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。

【0135】

一実施態様では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）。具体的には、特定の実施態様では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基が、グリシン残基と置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ_１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に、補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能を決定するための方法も記載されている。

【0136】

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を示す。したがって、いくつかの実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、具体的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、ＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、その全体は参照により本明細書に援用される。

【0137】

特定の実施態様では、天然のＩｇＧ_１Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0138】

特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は除去されている。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸変異、具体的には、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0139】

本明細書上記及びＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ変異体には、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含め、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。

【0140】

変異型Ｆｃドメインは、当該技術分野でよく知られている遺伝学的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製され得る。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。

【0141】

Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価され得る。

【0142】

Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法により測定され得る。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例が、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。

【0143】

いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、具体的にはＣ１ｑに対する結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低下したエフェクター機能を有するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む抗体がＣ１ｑに結合し得、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定し得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。

【0144】

ＦｃＲｎ結合、及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。

【0145】

本発明の上の態様のいずれかによる一実施態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンであり、ここで、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のスレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に、位置３６６のスレオニン残基は、セリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換えられており（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、さらに、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む。この実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、配列番号５のリンカーペプチドを介し、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合され得る。

【0146】

一態様では、本発明は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、がんの治療における使用のためのイムノコンジュゲートを提供する。

【0147】

一態様では、本発明は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、がんの治療における使用のためのイムノコンジュゲートを提供する。

【0148】

一態様では、本発明は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、がんの治療のための医薬の製造におけるイムノコンジュゲートの使用を提供する。

【0149】

一態様では、本発明は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、がんの治療のための医薬の製造におけるイムノコンジュゲートの使用を提供する。

【0150】

一態様では、本発明は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、前記個体におけるがんを治療する方法を提供する。

【0151】

一態様では、本発明は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、前記個体におけるがんを治療する方法を提供する。

【0152】

組み換え法
本発明で有用な変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、当該技術分野でよく知られている遺伝的方法又は化学的方法を用い、欠失、置換、挿入又は修飾によって調製され得る。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。天然のヒトＩＬ－７の配列を配列番号１４に示す。置換又は挿入は、天然アミノ酸残基及び非天然アミノ酸残基を含み得る。アミノ酸修飾は、例えば、グリコシル化部位の付加又は炭水化物の接続等といった化学修飾のよく知られている方法を含む。

【0153】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組み換え産生によって得られてもよい。組み換え産生について、イムノコンジュゲート（断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば、上述のものは、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る。一実施態様では、本発明による使用のためのポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、イムノコンジュゲート（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組み換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、イムノコンジュゲート（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写要素若しくは翻訳制御要素と共に作用可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。ここで使用される「コード領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。これに加え、ベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、異種コード領域をコードし、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合されてもよく、又はされなくてもよい。異種コード領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊な要素又はモチーフが含まれる。作用可能な会合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の調節配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに会合するプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作用可能に会合」している。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合していると思われる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作用可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写調節領域がここに開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン－Ａと合わさった最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子由来のもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン類を誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の染色体組み込み要素等の他の特徴を含み得る。

【0154】

ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、ポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合し得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体にわたる成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生成することを認識している。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。

【0155】

後の精製を容易にするために使用可能な短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）又はイムノコンジュゲートを標識するのに役立つ短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードするイムノコンジュゲート（断片）の末端に、又は末端の中に含まれていてもよい。

【0156】

さらなる実施態様では、本発明による使用のための１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連してここに記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。このような一実施態様では、宿主細胞は、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、形質転換されるか又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を指す。イムノコンジュゲートを複製し、その発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野でよく知られている。このような細胞は、必要に応じて、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に播種するために大量のベクターを含む細胞を成長させて、臨床用途に十分な量のイムノコンジュゲートを得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等を含む。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌中で生成され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これを昆虫細胞と組み合わせて使用することができ、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用され得る。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用される。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に記載される２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３，２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載される）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ^－ ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ．２５５－２６８（２００３）を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。

【0157】

これらの系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術が、当該技術分野で知られている。抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかに融合した変異型ＩＬ－７ポリペプチドを発現する細胞は、発現した変異型ＩＬ－７の融合産物が重鎖と軽鎖の両方を含む抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように操作され得る。

【0158】

一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートを産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるように、イムノコンジュゲートの発現に適した条件下で、イムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からイムノコンジュゲートを回収することとを含む。

【0159】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートでは、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、抗体に遺伝的に融合されていてもよく、又は抗体に化学的にコンジュゲートされていてもよい。抗体に対するＩＬ－７ポリペプチドの遺伝的融合は、ＩＬ－７配列がポリペプチドに直接的に融合されるか又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように、設計され得る。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野でよく知られている方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。特定のリンカーペプチドは、本明細書に記載される。融合の個々の構成成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を必要に応じて含めることもできる。これに加え、ＩＬ－７融合タンパク質は、当該技術分野でよく知られているように、ポリペプチド合成方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）を用い、化学的に合成されてもよい。変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、よく知られている化学的コンジュゲート方法を用い、他の分子（例えば抗体）に化学的にコンジュゲートされてもよい。二官能架橋試薬（例えば、当該技術分野でよく知られているホモ官能性及びヘテロ官能性架橋試薬）がこの目的で使用され得る。使用する架橋試薬の種類は、ＩＬ－７にカップリングする分子の性質に依存し、当業者なら容易に特定し得る。代替的に又は追加的に、変異型ＩＬ－７及び／又はコンジュゲートされることを意図した分子は、これも当該技術分野で知られるように、これらの２つが別個の反応でコンジュゲートされ得るように化学的に誘導体化されてもよい。

【0160】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、抗体を含む。抗体を産生するための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照されたい）。天然には存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組み換え的に産生することができ、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）。イムノコンジュゲート、抗体、及びそれらを産生するための方法も、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０２０７８３号、同第２０１２／１０７４１７号、及び同第２０１２／１４６６２８号に詳述されており、これらの文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。

【0161】

任意の動物種の抗体が、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートに使用され得る。本発明において有用な非限定的な抗体は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。イムノコンジュゲートがヒトへの使用を意図したものである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野でよく知られている方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域上にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域上にグラフトすること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することを含め、様々な方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）にて総説されており、さらに、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティングを記述）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記述）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記述）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えばＳｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えばＡｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えばＢａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が含まれる。

【0162】

ヒト抗体は、当該技術分野で知られる様々な技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は一般的にｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５，３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０，４５０－４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製され得る。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に置き変わるか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照のこと。また、例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。

【0163】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体もＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。

【0164】

ヒト抗体はまた、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリーからの単離によって生成されてもよい。

【0165】

本発明に有用な抗体は、所望の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されてもよい。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．によるＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）で総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成し、所望の結合特性を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。このような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．のｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．のＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ ＢｒａｄｂｕｒｙのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）で総説されている。

【0166】

特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリー内でランダムに組み換えられ、その後、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載のように、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、一般的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーをクローン化し（例えば、ヒトから）て、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．のＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、免疫化することなく、非自己抗原及び自己抗原の広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最終的に、ナイーブなライブラリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ ＷｉｎｔｅｒのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）で説明されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再整列を達成することによって、合成によって作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号。所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当該技術分野で知られている方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）、並びにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）で総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．のＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。

【0167】

本発明における使用のためのイムノコンジュゲートのさらなる化学修飾が望ましい場合がある。例えば、免疫原性及び半減期の問題は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）等の実質的に直鎖のポリマーへのコンジュゲーションによって改善され得る（例えば、国際公開第８７／０００５６号を参照）。

【0168】

本明細書で記載するように調製されるイムノコンジュゲートは、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当該技術分野で既知の技術によって精製され得る。特定のタンパク質を精製するのに使用される実際の条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依拠し、当業者には明らかであろう。アフィニティクロマトグラフィー精製の場合、イムノコンジュゲートが結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いてもよい。本発明のイムノコンジュゲートのアフィニティクロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用してもよい。例えば、連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に記載されるようにイムノコンジュゲートを本質的に単離することができる。イムノコンジュゲートの純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等の任意の様々なよく知られている分析方法によって決定することができる。

【0169】

組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に記載される使用のためのイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される使用のためのイムノコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される使用のためのイムノコンジュゲートのいずれかと、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。

【0170】

さらに提供されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態で本発明による使用のためのイムノコンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）イムノコンジュゲートを得ることと、（ｂ）イムノコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを配合して、それによりイムノコンジュゲートの調製物をｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために配合することを含む、方法である。

【0171】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散した、治療的有効量のイムノコンジュゲートを含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。イムノコンジュゲートと、任意選択的に追加の有効成分とを含む薬学的組成物の調製は、本明細書に参照により援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示されるように、本開示の観点から当業者には既知であることになる。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与について、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する当局によって要求される無菌状態、発熱性、一般的な安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、当業者に既知であるように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、添加物、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質及び組み合わせが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照（参照により本明細書に援用される））。従来の担体が活性成分と不適合でない限り、治療組成物又は薬学的組成物におけるその使用が企図される。

【0172】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、鼻内を含む任意の適切な手段によって投与されてもよく、必要に応じて、局所治療では、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。

【0173】

非経口組成物には、注射による投与、例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明のイムノコンジュゲートは、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理学的に適合するバッファー中で配合され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。あるいは、イムノコンジュゲートは、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質を含まない水での構成用に、粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する様々な他の成分と共に、本発明のイムノコンジュゲートを必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。通常、分散体は、様々な滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。必要に応じて、液体媒体を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又ははリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる化合物、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等を含んでいてもよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液としても調製され得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。

【0174】

活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ－（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施態様では、注射可能組成物の持続的な吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせトいった、吸収を遅らせる薬剤の組成物における使用によってもたらされ得る。

【0175】

先述の組成物に加えて、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、デポー調製物として配合され得る。そのような徐放性配合物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、イムノコンジュゲートは、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば、難溶性の塩として配合されてもよい。

【0176】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、添加物又はタンパク質を医薬として使用可能な調製物へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来のように配合されてもよい。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。

【0177】

イムノコンジュゲートは、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は有機酸で形成されるもの、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸等の有機酸が含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。

【0178】

治療方法
本明細書で提供されるイムノコンジュゲートは、治療方法及び使用に使用され得る。イムノコンジュゲートは、例えば、がんの治療において、免疫療法剤として使用され得る。

【0179】

本発明による治療方法における使用の場合、イムノコンジュゲートは、適正医療規範に則って、配合、調薬、及び投与される。これに関連して考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に知られている他の要因が含まれる。

【0180】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、宿主の免疫系の刺激が有益である疾患状態、特に、細胞免疫応答の増強が望ましい状態の治療において特に有用であり得る。これらは、宿主免疫応答が不十分であるか又は不足している病状を含み得る。イムノコンジュゲートが投与され得る疾患状態は、例えば、細胞免疫応答が、特定の免疫にとって重大な機構となる腫瘍又は感染を含む。本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、そのまま投与されてもよく、又は任意の適切な薬学的組成物中で投与されてもよい。

【0181】

さらなる態様では、本発明は、個体において疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、この方法は、このような疾患を有する個体に、治療的有効量のイムノコンジュゲートを投与することを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む組成物が、前記個体に投与される。一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一部の実施態様では、方法は、個体に対して治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、個体に有効量のイムノコンジュゲートを投与して、免疫系を刺激することを含む、個体における免疫系を刺激するための方法を提供する。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうちの任意の１つ又は複数を含み得る。

【0182】

一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のイムノコンジュゲートを使用して治療され得る他の細胞増殖性障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。一部の実施態様では、がんは、腎臓がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、前立腺がん及び膀胱がんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合に、イムノコンジュゲートが、治癒をもたらすわけではないが部分的な利益のみを与える場合があることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、何らかの利益を有する生理的変化も治療的に有益であると考慮される。したがって、いくつかの実施態様では、生理学的変化をもたらすイムノコンジュゲートの量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。

【0183】

いくつかの実施態様では、有効量のイムノコンジュゲートが細胞に投与される。他の実施態様では、治療的有効量の本発明のイムノコンジュゲートが、疾患の治療のために個体に投与される。

【0184】

疾患の予防又は治療に関し、本発明のイムノコンジュゲートの適切な投薬量（単独で使用される場合、又は１つ又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、分子の種類（例えば、Ｆｃドメインを含むか否か）、疾患の重症度及び経過、イムノコンジュゲートが予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及びイムノコンジュゲートに対する応答、並びに主治医の判断によって変わることになる。いずれにせよ、投与を担当する施術者は、組成物中の１つ又は複数の有効成分の濃度及び個々の対象に対する１つ又は複数の適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。

【0185】

イムノコンジュゲートは、一度に、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）のイムノコンジュゲートが、例えば、１回又は複数回の別個の投与によるか又は連続的な注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初回の候補投用量となり得る。典型的な１日の投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の所望の抑制が起こるまで継続されるものとする。イムノコンジュゲートの１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となり得る。他の非限定的な例では、投与量はまた、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上、及びそこから導出可能な任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から導出可能な範囲の非限定的な例では、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラムから体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム等が、上記の数に基づいて投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ又は複数の用量が患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が、約２回から約２０回、又は例えば約６回のイムノコンジュゲートの投薬を受けるように）投与されてもよい。初回の高負荷用量の後、１回又は複数回の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

【0186】

本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、通常、意図した目的を達成するのに効果的な量で使用されることになる。疾患状態を治療又は予防するための使用の場合、イムノコンジュゲート又はその薬学的組成物が、治療的有効量で投与されるか又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0187】

全身投与の場合、治療的に有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に推定することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ_５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量は製剤化され得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。

【0188】

また、初回投薬量は、当該技術分野でよく知られている技術を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから推定され得る。当業者は、動物データに基づきヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。

【0189】

投薬量及び投薬間隔は、治療効果を維持するのに十分なイムノコンジュゲートの血漿レベルを提供するように、個別に調整され得る。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、複数用量を各日投与することによって達成され得る。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定され得る。

【0190】

局所投与又は選択的な取り込みの場合には、イムノコンジュゲートの効果的な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者は、過度の実験を行うことなく、治療的に有効な局所投薬量を最適化することができるであろう。

【0191】

本明細書に記載のイムノコンジュゲートの治療に有効な用量は、通常、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療利益を与える。イムノコンジュゲートの毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ_５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示すイムノコンジュゲートが好ましい。一実施態様では、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した投薬量の範囲を製剤化するために使用できる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくないＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、用いられる投薬形態、利用される投与経路、対象の状態等に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な配合、投与経路及び投薬量は、患者の状態の観点から、個々の医師によって選択され得る。（例えば、その全体が参照により本明細書に援用されるＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照のこと）。

【0192】

イムノコンジュゲートで治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全等によって、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合、治療をより高いレベルに調整することも知っている（毒性を除いて）。対象となる障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度、及び投与経路等によって変わる。状態の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価され得る。さらに、用量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。

【0193】

本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートの最大治療用量は、野生型ＩＬ－７を含むイムノコンジュゲートに使用するものから増加してもよい。

【0194】

他の薬剤及び治療
本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、治療において、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、イムノコンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含み得る。一部の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。

【0195】

そのような他の薬剤は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要因に依存する。イムノコンジュゲートは、通常、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、若しくは経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0196】

上記のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明のイムノコンジュゲートの投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時、及び／又は投与後に行われてもよい。また、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、放射線療法と組み合わせて使用され得る。

【0197】

製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それだけで、又は状態を治療、予防及び／又は診断するために有効な別の組成物との組み合わせで、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明のイムノコンジュゲートである。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートを含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物が、さらなる細胞毒性剤又はその他の治療剤を含む、第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、特定の症状を治療するために上記組成物が使用可能であることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。

【0198】

【実施例】

【0199】

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

【0200】

本発明によるイムノコンジュゲートの例示的なフォーマットを図１で概略図として示す。ＩｇＧ－ＩＬ７イムノコンジュゲートは、２つのＦａｂドメイン（可変ドメイン、定常ドメイン）、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、及びＦｃドメインのＣ末端に融合した変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。ＩｇＧ－ＩＬ７イムノコンジュゲートは、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４によるアミノ酸配列のポリペプチドで構成されている。

【0201】

例示的なフォーマットに提供された配列は、ＩＬ－７野生型配列を有するイムノコンジュゲートに関連している。しかしながら、本明細書に開示されるような任意の変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、野生型ＩＬ－７の代わりに前記フォーマットに組み込まれてもよい。

【0202】

実施例１
実施例１．１ ＰＤ１抗体ＩＬ７ｖ融合タンパク質の産生及び分析
表１に記載される抗体ＩＬ７バリアント融合コンストラクトを、ＣＨＯ細胞中で産生させた。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。最終生成物の分析は、単量体含有量の決定（分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる）及びメインピークのパーセンテージ（非還元キャピラリーＳＤＳ電気泳動：ＣＥ－ＳＤＳによって決定）からなる。参照分子６は、国際公開第２０２０／１２７３７７ Ａ１号に開示されるようなＩＬ７部分を含む。参照分子９及び１０は、国際公開第２０２０／２３６６５５ Ａ１号に開示されるようなＩＬ７部分を含む。それらは、ＰＤ－１抗体のＮ末端に融合した１つのＩＬ７部分を含む、本明細書に開示される他の融合コンストラクトと同じフォーマットである（図１）。ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ｗｔ、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は、配列番号１の配列によるＶＨドメインと、配列番号２の配列によるＶＬドメインとを有するＰＤ１結合剤を含む。ＰＤ１－ＩＬ７ｗｔ及び参照分子５～１０は、配列番号３の配列によるＶＨドメインと、配列番号４の配列によるＶＬドメインとを有するＰＤ１結合剤を含む。

【0203】

【0204】

クローニング。全ての遺伝子の発現は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にある。

【0205】

ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造。本明細書に記載されている抗体を、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって、同社独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用して、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞を使用して、調製した。生産のために、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓは市販の既知組成培地を使用し、トランスフェクション後の細胞を次の条件下で培養した：３６．５℃＋６％ 二酸化炭素。

【0206】

遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。

【0207】

力価決定（ＰＡ－ＨＰＬＣ）。上清中のＦｃ含有コンストラクトの定量を、ＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ ＳｙｓｔｅｍでプロテインＡ－ＨＰＬＣにより実施した。上清をＰＯＲＯＳ ２０ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に注入する。２８０ｎｍの溶出ピーク面積を積分し、同じランで分析した標準物質による検量線を用いて濃度に変換する。

【0208】

ＩｇＧ様タンパク質の精製。標準的なプロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡ－アフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出に続いて、直ちにサンプルのｐＨを中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５；Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィー（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ＆ ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００；どちらも以前はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅとして知られていたＣｙｔｉｖａによる）により、単量体タンパク質から分離した。

【0209】

ＩｇＧ様タンパク質の分析。Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３によるアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより（以前はＤｒｏｐｓｅｎｓｅ １６として知られていたＬｉｔｔｌｅ Ｌｕｎａｔｉｃ；Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ ｌａｂｓ）、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ）を用いて、２５℃でのＨＰＬＣクロマトグラフィーにより、凝集体含有量の決定を実施した。

【0210】

【0211】

【0212】

結果。精製されたＰＤ１－ＩＬ７バリアントコンストラクトを、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製された材料の品質分析から、分析用サイズ排除クロマトグラフィー分析により単量体含有量が９３％超であること（表２）、非還元キャピラリー電気泳動によりメイン生成物ピークが９５％と９９％の間であることが明らかになった（表３）。結論として、すべてのＰＤ１－ＩＬ７バリアントが良好な品質で産生された。

【0213】

実施例１．２ さらなるＰＤ１－ＩＬ７ｖ融合タンパク質（参照分子５、７及び８）の産生及び分析
表４に記載される抗体ＩＬ７バリアント融合コンストラクトを、ＣＨＯ細胞中で産生させた。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。最終生成物の分析は、単量体含有量の決定（分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる）及びメインピークのパーセンテージ（非還元キャピラリーＳＤＳ電気泳動：ＣＥ－ＳＤＳによって決定）からなる。参照分子５、７及び８は、国際公開第２０２０／１２７３７７ Ａ１号に開示されるようなＩＬ７部分を含む。それらは、ＰＤ－１抗体のＮ末端に融合した１つのＩＬ７部分を含む、本明細書に開示される他の融合コンストラクトと同じフォーマットである（図１）。参照分子５、７及び８は、配列番号３の配列によるＶＨドメインと、配列番号４の配列によるＶＬドメインとを有するＰＤ１結合剤を含む。

【0214】

【0215】

クローニング。対応するｃＤＮＡを、従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用してｅｖｉｔｒｉａのベクター系にクローニングした。ｅｖｉｔｒｉａベクタープラスミドを遺伝子合成した。プラスミドＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づく低エンドトキシン条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、波長２６０ ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。配列の正確性は、サンガー配列決定（プラスミド１つ当たり２つの配列決定反応による）により検証した。

【0216】

ＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生。本明細書に記載される抗体ＩＬ７融合コンストラクトを、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、同社独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて産生させた。産生にあたっては、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により、上清を回収した。

【0217】

ＩｇＧ様タンパク質の精製。標準的なプロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、プロテインＡ－アフィニティクロマトグラフィー（平衡化バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）によって細胞培養上清からＦｃ含有タンパク質を精製した。ｐＨ３．０で溶出を達成し、続いて直ちにサンプルのｐＨを中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５；Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。

【0218】

ＩｇＧ様タンパク質の分析。Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳによりタンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集物含有量の決定を、ランニング緩衝液（２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ_３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。

【0219】

【0220】

【0221】

結果。精製されたＰＤ１－ＩＬ７バリアントコンストラクトを、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。参照分子７をＣＥ－ＳＤＳ分析の前にＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化して、均一なピークを得た。精製された材料の品質分析から、分析用サイズ排除クロマトグラフィー分析により単量体含有量が９４％超であること（表５）、非還元キャピラリー電気泳動によりメイン生成物ピークが９１％と９９％の間であることが明らかになった（表６）。結論として、すべてのＰＤ１－ＩＬ７バリアントが良好な品質で産生された。

【0222】

実施例２
実施例２．ヒトＩＬ７受容体に対するＰＤ１－ＩＬ７バリアントの親和性決定

【0223】

ＳＰＲ実験はＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋで実施し、ＨＢＳ－ＥＰ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡをランニングバッファーとして用いた。抗Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ内部）を、Ｃ１チップ（Ｃｙｔｉｖａ）上にアミンカップリングにより直接固定化した。ＰＤ１－ＩＬ７コンストラクトを５ｎＭで１４０秒間捕捉した。２．３４から３００ｎＭのヒトＩＬ７Ｒａ－ＩＬ２Ｒｇ－Ｆｃヘテロ二量体からの２倍連続希釈系列３つを、３０μｌ／分で２４０秒間リガンド上に通過させ、会合相を記録した。解離相を、８００秒間モニターし、サンプル溶液からランニングバッファーへ切り替えることによってトリガーした。チップ表面を、１０ｍＭ グリシン、ｐＨ２を６０秒間で２回注入することにより、各サイクル後に再生した。参照フローセル（固定化された抗Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ特異性ＩｇＧのみを含有）で得られた応答を差し引くことにより、全体の屈折率の差を補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングによって、動態速度定数から親和性定数を導出した。

【0224】

以下のＰＤ１－ＩＬ７バリアントを、ＩＬ７受容体への結合について分析した（表８）。

【0225】

【0226】

結果。ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７バリアント及び参照分子を、ヒトＩＬ７受容体への結合について比較した（表９）。ＩＬ７受容体に対するＩＬ７バリアントの親和性を、ヒトＦｃに融合した共通のＩＬ２受容体ガンマ鎖及びＩＬ７受容体アルファ鎖の細胞外ドメインの組み換えヘテロ二量体を用いて決定した。

【0227】

ＩＬ７バリアントＶＡＲ２１（Ｇ８５Ｅ）及びＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１（Ｋ８１Ｅ、Ｇ８５Ｅ）はいずれも、野生型ＩＬ７に比べてヒトＩＬ７受容体に対する親和性の低下を示した。ＩＬ７単一変異体ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１は、ヒトＩＬ７受容体に約６ｎＭの親和性で結合し、二重変異体ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は、２０倍低い約１３０ｎＭの親和性で結合する。

【0228】

参照分子５、８及び９は、ヒトＩＬ７受容体に対してより高い親和性（約０．６から０．９ｎＭ）を有し、参照分子６及び１０は、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７－ＶＡＲ２１（Ｇ８５Ｅ）に近く、親和性はそれぞれ１０ｎＭと５ｎＭである。参照分子７はこの条件下ではほとんど結合せず、不活性であると考えられる。

【0229】

結論。ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１（Ｇ８５Ｅ）及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１（Ｋ８１Ｅ、Ｇ８５Ｅ）のＩＬ７に導入された変異体は、野生型ＩＬ７と比較してヒトＩＬ７受容体に対する親和性を低下させ、二重変異体は単一変異体と比較して２０倍低い親和性を有する。

【0230】

実施例３．１ 漸増用量のＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７バリアントで処理された場合の活性化されたＰＤ－１^＋及びＰＤ－１^－ ＣＤ４ Ｔ細胞でのＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）
この実験では、分子ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ＶＡＲ２１及び分子ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１のシス標的化及びＳＴＡＴ－５Ｐシグナル伝達の効力をＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ｗｔと比較した。

【0231】

この目的のために、ＩＬ７Ｒシグナル伝達を、前述のように単離、活性化、共培養したＰＤ１^＋及びＰＤ１^－（抗ＰＤ１前処理）ＣＤ４ Ｔ細胞を漸増濃度の免疫標的サイトカインに曝露させた後に測定した。

【0232】

図２のデータは、ＰＤ－１^＋及びＰＤ－１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞でのＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ｗｔの効力の違いを示している。

【0233】

ＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞で測定された効力は、ＰＤ１依存性及び独立性のＩＬ－７送達の組み合わせを反映している。対照的に、ＰＤ１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞での効力測定は、ＰＤ１結合部位がすべてＰＤ－１結合を防止するために占有されているため、ＰＤ１独立的なＩＬ－７の送達を表している。

【0234】

表１０では、各ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ｖ分子のシス活性、ＰＤ１依存性及び独立性の ＩＬ－７の送達の関連を、ＰＤ－１を予め遮断された細胞のＥＣ５０をＰＤ１^＋Ｔ細胞のＥＣ５０で割ることにより計算した。これにより、細胞が同じレベルのＩＬ－７Ｒａ／共通ガンマ鎖を発現している場合、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７コンストラクトのそれぞれについて、ＰＤ１依存性のＩＬ－７の送達の強度を測定することができる。

【0235】

【0236】

ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７バリアントは、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ｗｔと比較した場合にＰＤ－１^＋Ｔ細胞での効力減少を示すが、ＰＤ－１^－Ｔ細胞での活性の低下もさらに顕著であり、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は実質的に不活性である。

【0237】

実施例３．２ 漸増用量のＰＤ１－ＩＬ７バリアントで処理された場合の活性化されたＰＤ－１^＋及びＰＤ－１^－ ＣＤ４ Ｔ細胞でのＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）
この実験では、配列番号３及び４を有する遮断ＰＤ１結合剤に変異型ＩＬ－７を融合することによって生成された参照分子５～１０のシス標的化及びＳＴＡＴ－５Ｐシグナル伝達における効力を、分子ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１及びＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１と比較した。

【0238】

この目的のために、ＩＬ７Ｒシグナル伝達を、前述のように単離、活性化、共培養したＰＤ１^＋及びＰＤ１^－（抗ＰＤ１前処理）ＣＤ４ Ｔ細胞を漸増濃度の免疫標的サイトカインに曝露させた後に測定した。

【0239】

ＣＤ４ Ｔ細胞をＣＤ４ビーズ（１３０－０４５－１０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて健康なドナーＰＢＭＣから選別し、１μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（一晩プレコート、クローンＯＫＴ３、＃３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ ２８．２、＃３０２９２３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体の存在下で３日間活性化して、ＰＤ－１発現を誘導した。３日後、細胞を回収し、数回洗浄して内因性ＩＬ－２を除去した。その後、細胞を２つの群に分け、そのうちの１つを飽和濃度の抗ＰＤ１抗体（社内分子、１０μｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートした。

【0240】

過剰な非結合抗ＰＤ－１抗体を除去するための数回の洗浄工程の後、抗ＰＤ１前処理細胞及び未処理細胞（５０μｌ、４＊１０^６細胞／ｍｌ）をＶ底プレートに播種し、その後、漸増濃度の処理抗体（５０μｌ、１：１０希釈工程、最高濃度６６ｎＭ）で３７℃で１２分間処理した。リン酸化状態を保存するために、等量のＰｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（１００μｌ、５５７８７０、ＢＤ）を、様々なコンストラクトとの１２分間のインキュベーションの直後に添加した。その後、細胞を３７℃でさらに３０分間インキュベートした後、Ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ）を用いて８０℃で一晩透過処理した。翌日、そのリン酸化形態のＳＴＡＴ－５を、抗ＳＴＡＴ－５Ｐ抗体（４７／Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）クローン、５６２０７６、ＢＤ）を使用することによって４℃で３０分間染色した。

【0241】

細胞を、ＦＡＣＳ ＢＤ－ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｖ１０）を用いてＳＴＡＴ－５Ｐの頻度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてプロットした。

【0242】

図３及び４のデータは、ＰＤ－１^＋及びＰＤ－１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞でのＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１及び参照分子の効力の違いを示している。

【0243】

ＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞で測定された効力は、ＰＤ１依存性及び独立性のＩＬ－７送達の組み合わせを反映している。対照的に、ＰＤ１を予め遮断されたＣＤ４ Ｔ細胞での効力測定は、ＰＤ１結合部位がすべてＰＤ－１結合を防止するために占有されているため、ＰＤ１独立的なＩＬ－７の送達を表している。

【0244】

表１１では、各ＰＤ１－ＩＬ７ｖ分子のシス活性、ＰＤ１依存性及び独立性の ＩＬ－７の送達の関連を、ＰＤ－１を予め遮断された細胞のＥＣ５０をＰＤ１^＋Ｔ細胞のＥＣ５０で割ることにより計算した。これにより、細胞が同じレベルのＩＬ－７Ｒａ／共通ガンマ鎖を発現している場合、ＰＤ１－ＩＬ７コンストラクトのそれぞれについて、ＰＤ１依存性のＩＬ－７の送達の強度を測定することができる。

【0245】

【0246】

参照分子５と参照分子９はＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１と同程度の効力を示すが、両参照分子はＰＤ－１^－Ｔ細胞に対しても活性を示し、その活性はＰＤ－１^＋Ｔ細胞に対するよりも２倍及び２．５倍低いだけであり、これはＩＬ－７バリアントのＰＤ－１の独立的な送達を示しており、その一方、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１は、ＰＤ－１^－Ｔ細胞でおよそ１６０倍低い活性を有する。

【0247】

参照分子６と参照分子１０は、ＰＤ－１^＋Ｔ細胞と比較して、ＰＤ－１^－Ｔ細胞に対してそれぞれ３２倍及び２０倍の活性低下を示し、ＰＤ－１を介したＩＬ－７Ｒアゴニズムのシス送達を支持したが、両分子とも、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１よりも１２倍及び２３倍の効力低下を示した（表１１、図３及び４）。

【0248】

ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は、ＰＤ１（ａｌｔ）－ＩＬ７ ＶＡＲ２１よりも効力が低く、最大活性も低下しているが、ＰＤ－１^－Ｔ細胞では実質的に不活性であり、ＰＤ－１による強力なシス媒介送達を実証している（図３及び４並びに表１１）。

【0249】

前述の発明は明確な理解のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】