特表 2024-537335 新規インターロイキン－７イムノコンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】新規インターロイキン－７イムノコンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/54 20060101AFI20241003BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241003BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C07K14/54 ZNA

C07K14/705

C07K19/00

C12N15/24

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N1/21

C12N1/19

C12N1/15

C12P21/02 A

A61P35/00

A61K38/20

A61K39/395 U

A61P43/00 121

A61K47/65

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522171

(86)(22)【出願日】2022-10-12

(85)【翻訳文提出日】2024-06-05

(86)【国際出願番号】 EP2022078330

(87)【国際公開番号】W WO2023062050

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】21202553.0

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】カーピー グティエレス チルロス， アレハンドロ

(72)【発明者】

【氏名】コダッリ ディーク， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】ドゥリニ， グレタ

(72)【発明者】

【氏名】フライモサー－グルントショーバー， アン

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】コール， ヨハン

(72)【発明者】

【氏名】ラウナー， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】メスナー， エッケハルト

(72)【発明者】

【氏名】ニコリーニ， バレリア

(72)【発明者】

【氏名】シュレンブルク， シンディ

(72)【発明者】

【氏名】ウマーニャ， パブロ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG03

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA99

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA12

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085CC23

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045DA02

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA22

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、概して、変異型インターロイキン－７ポリペプチド、イムノコンジュゲート、特に、変異型インターロイキン－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、変異型インターロイキン－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド分子、並びにそのようなポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、変異型インターロイキン－７ポリペプチド、イムノコンジュゲートを産生するための方法、それを含む薬学的組成物、及びその使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドであって、配列番号２８によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、配列番号２８を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較して、ＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる、変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項2】

前記アミノ酸置換がＧ８５Ｅである、請求項１に記載の変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項3】

Ｋ８１位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１又は２に記載の変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項4】

アミノ酸置換Ｋ８１Ｅを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項5】

Ｔ９３及びＳ１１８の群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み、前記アミノ酸置換が、前記アミノ酸置換を伴わない変異型インターロイキン－７ポリペプチドと比較して、変異型インターロイキン－７ポリペプチドのグリコシル化を減少させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項6】

前記アミノ酸置換がＴ９３Ａ及びＳ１１８Ａからなる群より選択される、請求項５に記載の変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項7】

アミノ酸置換Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の変異型インターロイキン－７ポリペプチド。

【請求項8】

（ｉ）請求項１から７のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと（ｉｉ）抗体とを含む、イムノコンジュゲート。

【請求項9】

抗体がＰＤ－１に結合する、請求項８に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項10】

抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、及びＫａｂａｔ番号付けによる位置７１～７３に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項８又は９に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項11】

抗体が、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項12】

抗体が、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項13】

最大１つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項14】

抗体が、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項８から１３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項15】

Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ_１サブクラスのＦｃドメインである、請求項１４に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項16】

Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項１４又は１５に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項17】

抗体が、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリンである、請求項８から１６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項18】

Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項19】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である、請求項１４から１８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項20】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基と置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に、３６６位のトレオニン残基がセリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基と置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項21】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基と置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基と置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基と置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項２０に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項22】

変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つ、特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットの、カルボキシ末端アミノ酸に、任意選択的にリンカーペプチドを介して融合している、請求項１４から２１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項23】

リンカーペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項24】

Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１４から２３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項25】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）の群から選択される１つ又は複数の位置にある、請求項２４に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項26】

Ｆｃドメインの各サブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）を含む、請求項１４から２５のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項27】

配列番号３３の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群より選択される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、請求項８から２６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項28】

リンカー配列によって連結された、変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びＩｇＧ_１免疫グロブリン分子から本質的になる、請求項８から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項29】

配列番号１９のリンカーによって連結された、変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びＩｇＧ_１免疫グロブリン分子から本質的になる、請求項８から２８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項30】

請求項１から７のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は請求項８から２９のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートをコードする、１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項31】

請求項３０に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ又は複数のベクター、特に発現ベクター。

【請求項32】

請求項３０に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド又は請求項３１に記載の１つ又は複数のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項33】

変異型ＩＬ－７ポリペプチド、又は変異型ＩＬ－７ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）請求項３２に記載の宿主細胞を、変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養すること、及び任意選択的に（ｂ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを回収することを含む、方法。

【請求項34】

請求項３３に記載の方法によって産生される、変異型ＩＬ－７ポリペプチド、又は変異型ＩＬ－７ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲート。

【請求項35】

請求項１から７若しくは３４のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は請求項８から２９若しくは３４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。

【請求項36】

医薬としての使用のための、請求項１から７若しくは３４のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド、又は請求項８から２９若しくは３４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項37】

疾患の治療における使用のための、請求項１から７若しくは３４のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド、又は請求項８から２９若しくは３４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項38】

前記疾患ががんである、請求項３７に記載の疾患の治療における使用のための変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。

【請求項39】

疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１から７若しくは３４のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は請求項８から２９若しくは３４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートの使用。

【請求項40】

前記疾患ががんである、請求項３９に記載の使用。

【請求項41】

個体の疾患を治療する方法であって、前記個体に対して、薬学的に許容される形態で請求項１から７若しくは３４のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は請求項８から２９若しくは３４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む治療的有効量の組成物を投与することを含む方法。

【請求項42】

前記疾患が、がんである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

個体の免疫系を刺激する方法であって、前記個体に対して、薬学的に許容される形態で請求項１から７及び３４のいずれか一項に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は請求項８から２９若しくは３４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む治療的有効量の組成物を投与することを含む方法。

【請求項44】

上に記載されるとおりの発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、変異型インターロイキン－７ポリペプチド、イムノコンジュゲート、特に、変異型インターロイキン－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、変異型インターロイキン－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド分子、並びにそのようなポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、変異型インターロイキン－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを産生するための方法、それを含む薬学的組成物、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン－７（ＩＬ－７）は、リンパ系組織中の間質細胞によって主に分泌されるサイトカインである。ＩＬ－７は、例えば多能性造血幹細胞のリンパ芽球への分化を刺激することによって、リンパ球の成熟に関与する。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生及び生存、並びに成熟Ｔ細胞の恒常性に不可欠である。ＩＬ－７の欠乏は、未熟な免疫細胞停止を引き起こす（Ｌｉｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７（３）：９６３－９６７）。

【0003】

ＩＬ－７は、ＩＬ－７ Ｒアルファ鎖（ＩＬ－７Ｒα、ＣＤ１２７）と共通ガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２、ＩＬ－２Ｒγ）で構成されるＩＬ－７受容体に結合し、インターロイキンＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１と相互作用するｈｍａｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４８０－４９０）。γｃはほとんどの造血細胞によって発現するのに対して、ＩＬ－７ Ｒαはリンパ系統の細胞によってほぼ排他的に発現する（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｒｕｍ Ｓ．Ｋ．（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２）：１４４－５４）。ＩＬ－７Ｒαは、ナイーブ細胞からエフェクター細胞への分化にわたってＴ細胞の表面上にみられるが、その発現は最終分化Ｔ細胞上で低下し、制御性Ｔ細胞の表面には実質的に存在しない。ＩＬ－７Ｒα ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルは、ＩＬ－２によって負に調節されるため、ＩＬ－７Ｒαは、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）を発現させる活性化されたばかリのＴ細胞において下方制御され（Ｘｕｅ Ｈ．Ｈ，ｅｔ ａｌ．２００２，ＰＮＡＳ．９９（２１）：１３７５９－６４）、このメカニズムは、ＩＬ－２を介した感作されたばかりのＴ細胞の迅速なクローン増殖を確実にするが、ＩＬ－７の役割はすべてのＴ細胞クローンを均等に維持することである。ＩＬ－７Ｒαはまた、ＰＤ－１遮断に応答するがん患者の腫瘍において見出される、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＣＦ－１＋ＰＤ－１＋幹様ＣＤ ８ Ｔ細胞の新たに特徴づけられた前駆体集団についても最近報告された（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５１，１０４３－１０５８；Ｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１７，ｎｏ．８，４２９２－４２９９；Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０，１９５－２１１；Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１；ｅａａｙ６８６３（２０１９）；Ｖｏｄｎａｌａ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ５７６，１９／２６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９）。今日まで、幹様ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＩＬ－７の効果に関する科学的説明はないが、チェックポイント阻害剤に応答する患者の数を増加させるために、ＩＬ－７を使用して腫瘍反応性Ｔ細胞のこの集団を増殖させ得た。

【0004】

ＩＬ－７、ＩＬ－７Ｒα及びγｃは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ（ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）－シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ））経路並びにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ（ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ））シグナル伝達カスケードを通じてシグナル伝達する三成分複合体を形成し、Ｂ細胞及びＴ細胞の発達及び恒常性をもたらす（Ｎｉｕ Ｎ．ａｎｄ Ｑｉｎ Ｘ．（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（３）：１８７－１８９，Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４（７）：３４６１－３４６９）。

【0005】

ＩＬ－７は、２５ｋＤａの４ヘリックスバンドルの単量体タンパク質である。ヘリックス長は１３から２２アミノ酸まで変化し、これはインターロイキンに結合する他の一般的なガンマ鎖（γｃ、ＣＤ１３２、ＩＬ－２Ｒγ）のヘリックス長と同様である。しかしながら、ＩＬ－７は、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα相互作用を安定化させることが示されたＡヘリックスにおいて独特のターンモチーフを示す（ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １７：５４－６５）。Ａヘリックスは受容体鎖ＩＬ－７Ｒα及びγｃの両者と相互作用するが、Ｃヘリックスは主にＩＬ－７Ｒαと相互作用し、Ｄヘリックスはγｃ鎖と相互作用する（ＰＤＢ：３ＤＩ２及びＰＤＢ：２ＥＲＪに基づく配列及び構造アラインメント）。不均一性を減少させるための修飾及び／又は親和性／効力の減少を伴う変異型ＩＬ－７は、国際公開第２０２０／１２７３７７Ａ１号及び同第２０２０／２３６６５５Ａ１に記載されている。

【0006】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＣＤ２７９）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーであり、これには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ－１は、細胞表面受容体であり、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞で発現している（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ－１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様の細胞外ドメインと、免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する細胞質ドメインとからなるモノマー１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化を下方制御することが示されたＰＤ－１の２つのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が同定された（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔａｌ（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、両方ともＰＤ－１に結合するＢ７ホモログであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。ＰＤ－１に対する１つのリガンドのＰＤ－Ｌ１は、さまざまなヒトのがんにおいて豊富にある（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用により、腫瘍浸潤リンパ球が減少し、Ｔ細胞受容体媒介増殖が減少し、がん性細胞による免疫回避が可能になる（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌｌとの局所的相互作用を阻害することによって逆転させ得、その効果は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用も遮断される場合に相加的である（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ７．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ９９：１２２９３－７；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７－６６）。

【0007】

ＰＤ－１に結合する抗体は、例えば国際公開第２０１７／０５５４４３号に記載されている。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＰＤ－１に結合する抗体への変異型ＩＬ－７ポリペプチドのコンジュゲーションを介して、免疫療法のための有利な特性を有するＩＬ－７の変異型形態を、腫瘍細胞ではなく細胞傷害性Ｔリンパ球などの免疫エフェクター細胞に直接標的化する新規アプローチを提供する。これは、ＰＤ－１発現免疫サブセット、特に腫瘍反応性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋ＰＤ１＋ＴＣＦ＋Ｔ細胞サブセット及びそれらの子孫へのＩＬ－７変異体のシス送達をもたらす。

【0009】

本発明で使用されるＩＬ－７変異体は、サイトカイン免疫療法に関連する問題、特にＶＬＳの誘導によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘導によって引き起こされる腫瘍寛容、及びＴ_ｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制を克服するように設計されている。上記の腫瘍標的化からの腫瘍の回避を避けることに加えて、免疫エフェクター細胞へのＩＬ－７変異体の標的化は、ＣＴＬよりもＴｒｅｇ上のＰＤ－１及びＩＬ－７Ｒα発現レベルが低いため、免疫抑制Ｔ_ｒｅｇ細胞よりも腫瘍特異的ＣＴＬの優先的活性化をさらに増加させ得る。ＰＤ－１に結合する抗体を使用することにより、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用によって誘導されるＴ細胞活性の抑制がさらに逆転され得、したがって免疫応答がさらに増強され得る。

【0010】

一態様では、本発明は、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドであって、配列番号２８によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、配列番号２８を含むインターロイキン－７ポリペプチドと比較して、ＩＬ－７Ｒαに対する変異型インターロイキン－７ポリペプチドの結合親和性を低下させる、変異型インターロイキン－７ポリペプチドを提供する。一態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｇ８５Ｅを含む。さらなる態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、Ｋ８１にアミノ酸置換をさらに含む。別の態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ８１Ｅを含む。

【0011】

一態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、Ｔ９３及びＳ１１８からなる群より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み、ここで、前記アミノ酸置換は、前記アミノ酸置換を伴わない変異型インターロイキン－７ポリペプチドと比較して、変異型インターロイキン－７ポリペプチドのグリコシル化を減少させる。一態様では、前記アミノ酸置換（１つ又は複数）は、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａの群から選択される。別の態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａを含む。

【0012】

またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、（ｉｉ）抗体と、を含むイムノコンジュゲートを提供する。一態様では、前記抗体はＰＤ－１に結合する。一態様では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、及びＫａｂａｔ番号付けによる位置７１～７３に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0013】

一態様では、抗体は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。さらなる態様では、抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0014】

一態様では、イムノコンジュゲートは、最大１つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。

【0015】

別の態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧクラス、特に、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。さらなる態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。

【0016】

一態様では、抗体は、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。

【0017】

一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。別の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のトレオニン残基はトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基と置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のトレオニン残基はセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。またさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、３５４位のセリン残基はシステイン残基と置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基は、システイン残基と置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、３４９位のチロシン残基はシステイン残基と置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0018】

一態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つ、特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に、任意選択的にはリンカーペプチドを介して融合する。一態様では、リンカーペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。

【0019】

別の態様では、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一態様では、前記１つ又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）の群から選択される１つ又は複数の位置にある。一態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）を含む。

【0020】

一態様では、本発明は、配列番号３３の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０からなる群より選択される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0021】

一態様では、イムノコンジュゲートは、リンカー配列によって連結された、変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる。別の態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号１９のリンカー配列によって連結された、変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びＩｇＧ１免疫グロブリン分子から本質的になる。

【0022】

一態様では、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は本発明のイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。一態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）を含む、１つ又は複数のベクター、特に発現ベクターを提供する。一態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）又はベクター（複数可）を含む宿主細胞を提供する。

【0023】

一態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチド、又は変異型ＩＬ－７ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを産生する方法であって、（ａ）宿主細胞を、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養すること、及び任意選択的に（ｂ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを回収することを含む、方法が提供される。一態様では、本発明は、前記方法によって産生される、変異型ＩＬ－７ポリペプチド、又は変異型ＩＬ－７ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0024】

一態様では、本発明は、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。

【0025】

一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。

【0026】

一態様では、本発明は、疾患の治療における使用のための、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。一態様では、前記疾患はがんである。

【0027】

さらなる態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造における、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一態様では、前記疾患はがんである。

【0028】

一態様では、本発明は、個体における疾患を治療する方法であって、前記個体に、治療的有効量の、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。一態様では、前記疾患はがんである。

【0029】

一態様では、本発明は、個体の免疫系を刺激する方法であって、前記個体に、有効量の、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】２つのＦａｂドメイン（可変ドメイン、定常ドメイン）、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、及びＦｃドメインのＣ末端に融合した変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む、ＩｇＧ－ＩＬ－７イムノコンジュゲートフォーマットの概略図。

【図2】ＰＤ１－ＩＬ７バリアントのＮ－グリコシル化プロファイル（Ｆｃ－及びＩＬ７部分から放出されたＮ－グリカン）実線のトレースは安定形質転換ＣＨＯ細胞で発現したバリアントからのものであり、点線のトレースは一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞で発現したものである。安定形質転換（Ａ）ＣＨＯ細胞及び一過性トランスフェクト（Ｄ）ＣＨＯ細胞で発現した、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１。安定形質転換（Ｂ）ＣＨＯ細胞及び一過性トランスフェクト（Ｅ）ＣＨＯ細胞で発現した、部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１。安定形質転換（Ｃ）ＣＨＯ細胞及び一過性トランスフェクト（Ｆ）ＣＨＯ細胞で発現した、部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１。

【図3A-B】完全に及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１（図３Ａ）並びに完全に及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１（図３Ｂ）での治療時の、共培養した、ＰＤ１を予め遮断した及びＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。曝露１２分後の共培養したＰＤ１^＋（実線）及びＰＤ－１を予め遮断した（点線）ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５－Ｐ Ｔ細胞の頻度として示したＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。完全に及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１については、異なる発現系（一過性発現及び安定発現）を有する２つの異なる産生バッチのデータをプールした（平均値±ＳＥＭ）。

【図4】完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１、完全グリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１、及びＰＤ１－ＩＬ７ｗｔの１回目及び２回目の皮下投与の４時間後及び７２時間後の、ヒト化マウスの血清中で検出可能な薬物薬物濃度としての曝露。

【図5A-B】完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１と比較した、参照分子５～８（図５Ａ）及び参照分子９～１０（図５Ｂ）での処理時の、共培養した、ＰＤ１を予め遮断した及びＰＤ１^＋ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。曝露１２分後の共培養したＰＤ１^＋（実線）及びＰＤ－１を予め遮断した（点線）ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５－Ｐの頻度として示したＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）。３名のドナーの平均±ＳＥＭ。

【発明を実施するための形態】

【0031】

定義
以下で別途定義されない限り、用語は当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。

【0032】

本明細書で使用される「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終コンストラクトが、所望の特徴、例えばＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγへの結合の減少を有する限り、置換、欠失、挿入及び修飾のいかなる組み合わせも最終コンストラクトに到達させ得る。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び挿入が含まれる。末端欠失の例は、完全長ヒトＩＬ－７の１位における残基の欠失である。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、ＩＬ－７ポリペプチドの結合特徴を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること）が特に好ましい。好ましいアミノ酸置換は、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸によって置き換えることを含む。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０種類の標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリシン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当該技術分野でよく知られた遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ることが考えられる。

【0033】

「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合的相互作用の合計強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができ、それは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、ここに記載するものを含め、当該技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0034】

ＩＬ－７は、ＩＬ－７Ｒアルファ鎖（本明細書では、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ７Ｒα、ＩＬ－７ａ、ＩＬ７Ｒａ又はＣＤ１２７とも呼ばれる）及び共通ガンマ鎖（本明細書では、γｃ、ＣＤ１３２、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－２Ｒｇ、ＩＬ２Ｒｇ、ＩＬ－２Ｒγ又はＩＬ２Ｒγとも呼ばれる）で構成されるＩＬ－７受容体に結合し、これはインターロイキンＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１と相互作用する（Ｒｏｃｈｍａｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４８０－４９０）。

【0035】

ＩＬ－７受容体に対する変異型又は野生型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器及び組み換え発現（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８，１１９７－１２０２（２０００）を参照されたい）によって得られ得る受容体サブユニットを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されている方法に従って測定し得る。あるいは、ＩＬ－７受容体に対するＩＬ－７変異体の結合親和性は、受容体の１つ又は他のそのような形態を発現することが公知の細胞株を用いて評価され得る。結合親和性を測定するための具体的で説明的な例示的実施態様を、以下に記載する。

【0036】

本明細書で使用される「インターロイキン－７」又は「ＩＬ－７」という用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＩＬ－７を指す。この用語は、未処理のＩＬ－７と、細胞におけるプロセシングから生じるＩＬ－７の任意の形態を包含する。この用語は、ＩＬ－７の天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を配列番号２８に示す。

【0037】

本明細書で使用される「ＩＬ－７変異体」又は「変異型ＩＬ－７ポリペプチド」という用語は、完全長ＩＬ－７、ＩＬ－７の切断型、及びＩＬ－７が融合又は化学的コンジュゲーション等によって別の分子に連結した形態を含む、ＩＬ－７分子の様々な形態のあらゆる変異形態を包含することを意図している。「完全長」は、ＩＬ－７に関して使用される場合、成熟した天然の長さのＩＬ－７分子を意味することを意図している。例えば、完全長ヒトＩＬ－７は、配列番号２８に従うポリペチド配列を有する分子を指す。様々な形態のＩＬ－７変異体は、ＩＬ－７とＩＬ７Ｒアルファ及び／又はＩＬ２Ｒガンマとの相互作用に影響を及ぼす少なくとも１つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、その位置に通常位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、切断又は修飾を含み得る。アミノ酸置換によって得られる変異体が好ましい。特に示されない限り、ＩＬ－７変異体は、本明細書中では、変異型ＩＬ－７ペプチド配列、変異型ＩＬ－７ポリペプチド、変異型ＩＬ－７タンパク質、変異型ＩＬ－７類似体又はＩＬ－７バリアントと称される場合がある。

【0038】

ＩＬ－７の様々な形態の命名は、本明細書では、配列番号２８に示される配列に対して行われる。同じ変異を示すために、本明細書では様々な名称が使用され得る。例えば、位置１５のバリンからアラニンへの変異は、１５Ａ、Ａ１５、Ａ_１５、Ｖ１５Ａ、又はＶａｌ１５Ａｌａとして示され得る。

【0039】

本明細書で使用される「ヒトＩＬ－７分子」とは、配列番号２８のヒトＩＬ－７配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９６％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－７分子を意味する。特に、配列同一性は、少なくとも約９５％、より詳しくは、少なくとも約９６％である。特定の実施態様では、ヒトＩＬ－７分子は、完全長ＩＬ－７分子である。

【0040】

本明細書で使用されるＩＬ－７の「野生型」形態は、野生型形態が、変異型ＩＬ－７ポリペプチドの各アミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと同じＩＬ－７の形態である。例えば、ＩＬ－７変異体が完全長ＩＬ－７である（すなわちＩＬ－７が、任意の他の分子に融合又はコンジュゲートしていない）場合、この変異体の野生型形態は完全長天然ＩＬ－７である。ＩＬ－７変異体が、ＩＬ－７とＩＬ－７の下流（例えば、抗体鎖）をコードする別のポリペプチドとの融合である場合、このＩＬ－７異性体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドに融合した、野生型アミノ酸配列を有するＩＬ－７である。さらに、ＩＬ－７変異体が、ＩＬ－７の切断型（ＩＬ－７のトランケートされていない部分の中の変異した形態又は修飾された形態）である場合、このＩＬ－７変異体の野生型形態は、同様に、野生型配列を有するトランケートされたＩＬ－７である。ＩＬ－７受容体結合親和性、ＩＬ－７受容体結合又は様々な形態のＩＬ－７変異体の生物学的活性を対応する野生型形態のＩＬ－７と比較する目的で、野生型という用語は、天然に存在する天然のＩＬ－７と比較してＩＬ－７受容体結合に影響を及ぼさない１つ又は複数のアミノ酸変異を含むＩＬ－７の形態を包含する。本発明によるある特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－７ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。

【0041】

「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔ_ｒｅｇ細胞」とは、末梢寛容と呼ばれる、他のＴ細胞の応答を抑制し得る特殊なタイプのＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ＩＬ－２受容体のα－サブユニット（ＣＤ２５）の発現上昇、ＩＬ－７Ｒα（ＣＤ１２７）及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の低値又は非存在を特徴とし（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２，５３１－６２（２００４））、腫瘍によって発現されるものを含む抗原に対する末梢自己寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たす。本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、生存及び／又は恒常性がＩＬ－７によって影響されるリンパ球の集団を指す。エフェクター細胞には、メモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞、並びに腫瘍反応性幹様Ｔ細胞を含む最近プライミングされたＴ細胞が含まれる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「ＰＤ１」、「ヒトＰＤ１」、「ＰＤ－１」又は「ヒトＰＤ－１」（プログラムされた細胞死タンパク質１、又はプログラムされた死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １）としても知られる）は、ヒトタンパク質ＰＤ１（配列番号２１、シグナル配列を含まないタンパク質）／（配列番号２２、シグナル配列を含むタンパク質）を指す。ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１５１１６（バージョン１５６）も参照。本明細書で使用される場合、「ＰＤ－１に結合する」、「ＰＤ－１に特異的に結合する」、「ＰＤ－１に結合する」又は「抗ＰＤ－１抗体」とは、ＰＤ－１、特に細胞表面に発現するＰＤ－１ポリペプチドに十分な親和性で結合できる抗体を指し、その抗体がＰＤ－１を標的とする診断薬及び／又は治療薬として有用であることを指す。一実施態様では、無関係な非ＰＤ－１タンパク質に対する抗ＰＤ－１抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、ＰＤ－１に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ＰＤ－１に結合する抗体は、ヒトＰＤ－１への結合についての結合親和性のＫＤ値が、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。一実施態様では、結合親和性のＫＤ値は、ヒトＰＤ－１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ－１－ＥＣＤ、配列番号２７を参照）を抗原として用いた表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。

【0043】

「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用と区別できることを意味する。抗体が特定の抗原（例えば、ＰＤ－１）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施態様では、無関係なタンパク質に対する抗体の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。本明細書に記載のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、ＰＤ－１に特異的に結合する。

【0044】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の鎖を指すのであって、特定の長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、又は互換的に使用されてもよい。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含め、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことを意図している。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるものでも組み換え技術により産生されるものでもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものであるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の様式で生成され得る。ポリペプチドは、明確に定義された三次元構造を有する場合もあるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。明確に定義された三次元構造を有するポリペプチドは、「フォールディングされた」と言われ、明確に定義された三次元構造を有せずに多数の異なるコンフォメーションを採り得るポリペプチドは、「フォールディングされていない」といわれる。

【0045】

「単離された」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体は、その自然の環境にないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現した組み換え生産ポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術により分離、断片化又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組み換えポリペプチドと同様に、本発明のために単離されたものと見なされる。

【0046】

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列アライメントを行うための適切なパラメータを決定し得る。しかしながら、ここでの目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを用いて又はその後ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」 Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－ ２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって著されており、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．から公的に入手可能である。あるいは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して、ローカルではなくグローバルのアラインメントの実施を確実にして、配列を比較するためにｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用することができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダ中に与えられる。

【0047】

「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。

【0048】

「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物と、陽性及び陰性の鎖形態、及び二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。

【0049】

「［例えば、本発明のイムノコンジュゲート］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖並びに／又はＩＬ－７ポリペプチド（若しくはその断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおけるこのようなポリヌクレオチド分子（１つ又は複数）及び宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するこのような核酸分子（１つ又は複数）を含む。

【0050】

「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組み換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれ得る。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。ある特定の実施態様では、発現カセットは、本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

【0051】

「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、細胞に作用可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入及び指令するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へ組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞内転写及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。

【0052】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。元々の形質転換細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートを生成するために使用され得る任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物若しくは培養植物、又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。

【0053】

「抗体」という用語は、ここでは最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、所望な抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。

【0054】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、少量で通常存在しているバリアント、例えば天然に生じる変異を含んでいるか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生するような、あり得るバリアント抗体を除き、集団に含まれる個々の抗体は同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載される。

【0055】

「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された（すなわち、その天然環境にはない）ものである。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離された抗体は、そのネイティブ環境又は天然環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現する組み換え産生された抗体は、任意の適切な技術によって、分離され、分画され、又は部分的に若しくは実質的に精製された、ネイティブ又は組み換え抗体と同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。このように、本発明のイムノコンジュゲートは、単離される。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％又は９９％より大きくなるまで精製される。抗体精製の試験方法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

【0056】

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用されて、ネイティブ抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体を指す。

【0057】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、及び組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、様々な技術によって作製され得る。

【0058】

「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）にさらに分類することができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。

【0059】

「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的なエリアを含む、抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0060】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分であり得る。可変領域配列に関して本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって規定された番号付けシステムを指す。

【0061】

本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載される、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の第６４７～６６０頁を参照）が、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１～７２３頁を参照されたい）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用され、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と言及することによって本明細書でさらに明確にしている。

【0062】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。本明細書中の例示的なＨＶＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）、及び９４－１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。

【0063】

別途指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。

【0064】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）で次の順序で表示される：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0065】

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。そのような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復するか又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生み出すために定常領域が元の抗体の定常領域からさらに修飾又は変更されたものである。

【0066】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体のアミノ酸配列、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ある特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット又はウサギに由来する。ある特定の実施態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片も、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。

【0067】

抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0068】

本明細書の「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸長するよう定義されている。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数の、特に１つ又は２つの、アミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により宿主細胞によって産生された抗体は、完全長重鎖を含んでいても、完全長重鎖の切断されたバリアント（本明細書では「切断されたバリアント重鎖」ともいう）を含んでいてもよい。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリシン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリシン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別途指示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の組成物、例えば、本明細書に記載の薬学的組成物は、本発明のイムノコンジュゲートの集合を含む。イムノコンジュゲートの集合は、完全長重鎖を有する分子と、切断されたバリアント重鎖を含む分子とを含み得る。イムノコンジュゲートの集合は、完全長重鎖を有する分子と、切断されたバリアント重鎖を有する分子との混合物からなっていてもよく、イムノコンジュゲートの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、切断されたバリアント重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートの集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むイムノコンジュゲートを含む。本発明の一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートの集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含むイムノコンジュゲートを含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子と、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子と、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む本明細書で明記されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子とで構成されるイムノコンジュゲートの集合を含む。本明細書に別途明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記も参照）に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用される場合のＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

【0069】

「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低下させるか又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、この修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電的に有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に起こり、これらは、サブユニットの各々に融合したさらなる構成成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。

【0070】

「エフェクター機能」という用語は、抗体に言及しつつ使用される場合、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。

【0071】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体でコーティングされた標的細胞の免疫エフェクター細胞による溶解につながる免疫機構である。この標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低下」という用語は、上で定義したＡＤＣＣの機構により、標的細胞を取り囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存方法（これらは当業者には既知である）を用いて、同じタイプの宿主細胞によって産生された同じ抗体であるが操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。例えば、ＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメインにこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号を参照）。

【0072】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる係合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。

【0073】

本明細書で使用される場合、「操作する、操作された、操作」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、これらの手法の組み合わせとが含まれる。

【0074】

「結合の低下」、例えば、Ｆｃ受容体又はＣＤ２５に対する結合の低下は、例えばＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確にするために、この用語には、親和性をゼロ（又は分析方法の検出限界未満）に低下させること、すなわち相互作用の完全な消失も含まれる。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。

【0075】

本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、少なくとも１つのＩＬ－７分子と少なくとも１つの抗体とを含むポリペプチド分子を指す。ＩＬ－７分子は、様々な相互作用によって、本明細書に記載の様々な構成で、抗体に結合され得る。特定の実施態様では、ＩＬ－７分子は、ペプチドリンカーを介して抗体に融合する。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、１つ又は複数のリンカー配列によって結合される、１つのＩＬ－７分子及び抗体から本質的になる。

【0076】

「融合する」とは、構成要素（例えば、抗体及びＩＬ－７分子）が、ペプチド結合によって直接的に、又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。

【0077】

本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインサブユニット等に関する「第１」及び「第２」という用語は、それぞれの種類の部分が１つより多く存在する場合に、区別するのが簡便なように使用される。これらの用語の使用は、明示的に述べられていない限り、イムノコンジュゲートの特定の順序又は配向を付与することを意図しない。

【0078】

「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理的変化をもたらすために必要な量である。

【0079】

薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び期間において有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。

【0080】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。

【0081】

「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性を有効にするような形態の調製物であって、その組成物が投与される対象にとって許容できないほど有毒の追加成分を含まない調製物を指す。

【0082】

「薬学的に許容される担体」は、有効成分以外の、薬学的組成物中の成分であって、対象にとって毒性でない成分を指す。薬学的に許容される担体には、バッファー、添加物、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0083】

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法上の変化形）は、治療される個体の疾患の自然な経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理学の過程で行われ得る。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患進行率を低下させること、症状の改善又は緩和、及び回復又は改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートを使用して、疾患の発生を遅らせるか又は疾患の進行を遅らせる。

【0084】

実施態様の詳細な説明
変異型ＩＬ－７ポリペプチド
本発明によるＩＬ－７バリアントは、免疫療法に有利な特性を有する。

【0085】

本発明による変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、ＩＬ－７受容体のα－サブユニット及び／又はＩＬ－２Ｒγサブユニットに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。

【0086】

ＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγ ７Ｒαに対する親和性が低下したヒトＩＬ－７（ｈＩＬ－７）の変異体は、例えば、アミノ酸位置８１若しくは８５又はこれらの組み合わせ（ヒトＩＬ－７配列配列番号２８に対する番号付け）でのアミノ酸置換によって生成され得る。例示的なアミノ酸置換にはＫ８１Ｅ及びＧ８５Ｅが含まれる。一実施態様では、本発明による変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号２８によるヒトＩＬ－７のＧ８５位にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号２８によるアミノ酸置換Ｇ８５Ｅを含む。さらなる実施態様では、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号２８によるヒトＩＬ－７のＫ８１位及びＧ８５位にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、配列番号２８によるアミノ酸置換Ｋ８１Ｅ及びＧ８５Ｅを含む。

【0087】

本発明による変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、好ましくはアミノ酸９３位及び１１８位のうちの１つ又はそれらの組み合わせにおいて、ポリペプチドの均一性を改善する少なくとも一つのアミノ酸変異を含み得る。例示的なアミノ酸置換にはＴ９３Ａ及びＳ１１８Ａが含まれる。一実施態様では、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａをさらに含む。一実施態様では、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｇ８５Ｅ、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａを含む。一実施態様では、変異型インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ８１Ｅ、Ｇ８５Ｅ、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａを含む。

【0088】

本発明のいくつかの実施態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施態様では、変異型インターロイキン－７ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。本発明の特定のＩＬ－７変異体は、配列番号２８によるヒトＩＬ－７のＫ８１Ｅ、Ｇ８５Ｅ、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａの群から選択されるアミノ酸変異を含む。本発明の特定のＩＬ－７変異体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。本発明の特定のＩＬ－７変異体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。本発明の特定のＩＬ－７変異体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。本発明の特定のＩＬ－７変異体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。これらの変異体は、野生型形態のＩＬ－７変異体と比較して、インターロイキン７受容体に対する親和性が実質的に低下している。

【0089】

本明細書に開示されるＩＬ－７変異体の他の特徴としては、ＰＤ１－ＩＬ－７イムノコンジュゲート中では主にトランスで（近接した細胞上）送達される野生型ＩＬ－７と比較して、ＰＤ－１発現ＣＤ４ Ｔ細胞上のシスで（同じ細胞上）ＩＬ－７のＰＤ－１媒介送達を可能にするために、ＩＬ－７Ｒαに対して親和性が低下していることが挙げられる。

【0090】

ある特定の実施態様では、前記アミノ酸変異は、ＩＬ－Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγ対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を少なくとも５倍、具体的には少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも２５倍低下させる。

【0091】

ＩＬ－７のＮ－グリコシル化の排除と組み合わせたＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγに対するＩＬ－７の親和性の低下は、特性が改善されたＩＬ－７タンパク質をもたらす。例えば、Ｎ－グリコシル化部位の排除は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドがＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞において発現するとき、より均一な産物をもたらす。ＩＬ－７のＮ－グリコシル化部位の排除は、ヒトＩＬ－７の残基７２、９３又は１１８に対応する位置でのアミノ酸変異によって達成され得る。

【0092】

したがって、ある特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、ヒトＩＬ－７の残基９３又は１１８に対応する位置でのＩＬ－７のＮ－グリコシル化部位を排除するさらなるアミノ酸変異を含む。一実施態様では、ヒトＩＬ－７の残基９３又は１１８に対応する位置でのＩＬ－７のＮ－グリコシル化部位を排除する前記さらなるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。具体的な実施態様では、前記さらなるアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｔ９３Ａである。別の具体的な実施態様では、前記さらなるアミノ酸変異はアミノ酸置換Ｓ１１８Ａである。別の具体的な実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａを含む。ある特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、本質的に完全長ＩＬ－７分子である。ある特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、ヒトＩＬ－７分子である。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、前記変異のない配列番号２８を含むＩＬ－７ポリペプチドと比較して、ＩＬ－７Ｒαに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号２８の配列を含む。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、前記変異のない配列番号２８を含むＩＬ－７ポリペプチドと比較して、ＩＬ－７Ｒα又はＩＬ－２Ｒγに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号２８の配列を含む。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、前記変異のない配列番号２８を含むＩＬ－７ポリペプチドと比較して、ＩＬ－７Ｒα及びＩＬ－２Ｒγに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号２８の配列を含む。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、前記変異のない配列番号２８を含むＩＬ－７ポリペプチドと比較して、ＩＬ－７Ｒα及び／又はＩＬ－２Ｒγに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号２８の配列を含む。

【0093】

具体的な実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、さらに、Ｔリンパ球細胞における増殖、プライミングされたＴリンパ球細胞におけるエフェクター機能、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞又はＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞傷害性からなる群より選択される細胞応答のうちの１つ又は複数を誘発し得る。

【0094】

一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－２配列、例えば、配列番号２８のヒトＩＬ－７配列と比較して、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下のアミノ酸変異を含む。特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－７配列、例えば、配列番号２８のヒトＩＬ－７配列と比較して、５以下のアミノ酸変異を含む。

【0095】

イムノコンジュゲート
本明細書に記載のイムノコンジュゲートは、ＩＬ－分子及び抗体を含む。このようなイムノコンジュゲートは、ＩＬ－７を例えば腫瘍微小環境に直接的に標的化することによって、ＩＬ－７治療の有効性を有意に増加させる。本発明によれば、イムノコンジュゲートに含まれる抗体は、全抗体又は免疫グロブリン、又は抗原特異的な結合親和性等の生物学的機能を有するこれらの一部又はバリアントであってもよい。

【0096】

イムノコンジュゲート治療の一般的な利益は、容易に明らかである。例えば、イムノコンジュゲートに含まれる抗体は、腫瘍特異的なエピトープを認識し、腫瘍部位に対し、イムノコンジュゲート分子が標的化される。したがって、高濃度のＩＬ－７は腫瘍微小環境に送達され得、それによって、コンジュゲートされていないＩＬ－７で必要とされるよりもかなり少ない用量のイムノコンジュゲートを用い、本明細書で言及された様々な免疫エフェクター細胞の活性化及び増殖がもたらされる。しかしながら、ＩＬ－７イムノコンジュゲートのこの特徴は、ＩＬ－７分子の潜在的な副作用を再び悪化させる場合がある。血流中のＩＬ－７イムノコンジュゲートの循環半減期がコンジュゲートされていないＩＬ－７と比較して顕著に長いため、ＩＬ－７又は融合タンパク質の他の部分が、血管系内に通常存在する成分を活性化する可能性が高まる。同じ懸念は、Ｆｃ又はアルブミン等の別の部分に融合したＩＬ－７を含む他の融合タンパク質にも当てはまりし、循環するＩＬ－７の半減期が長くなる。したがって、野生型形態のＩＬ－７と比較して毒性が低下した本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートが特に有利である。

【0097】

本明細書で上述したように、腫瘍細胞ではなく、免疫エフェクター細胞に対してＩＬ－７を直接的に標的化することは、ＩＬ－７免疫療法にとって有利であり得る。

【0098】

したがって、本発明は、本明細書で上に記載されるような変異型ＩＬ－７ポリペプチド、及びＰＤ－１に結合する抗体を提供する。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと抗体とが融合タンパク質を形成し、すなわち、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは抗体とペプチド結合を共有する。いくつかの実施態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。具体的な実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、任意選択的にリンカーペプチドを介して、融合する。いくつかの実施態様では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、より具体的にはＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリン分子である。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の１つと、アミノ末端ペプチド結合を共有する。ある特定の実施態様では、本抗体は、抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体はＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子である。一実施態様では、抗体はＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗体はｓｃＦｖ分子である。イムノコンジュゲートはまた、２つ以上の抗体を含み得る。２つ以上の抗体、例えば第１の抗体及び第２の抗体がイムノコンジュゲートに含まれる場合、各抗体は、様々な形態の抗体及び抗体断片から独立して選択され得る。例えば、第１の抗体はＦａｂ分子であり得、第２の抗体はｓｃＦｖ分子であり得る。具体的な実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれはｓｃＦｖ分子であるか、又は前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれはＦａｂ分子である。特定の実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれは、Ｆａｂ分子である。一実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体のそれぞれは、ＰＤ－１に結合する。

【0099】

イムノコンジュゲートフォーマット
例示的なイムノコンジュゲートフォーマットは、その全体が本明細書に参照として援用されるＰＣＴ国際公開第２０１１／０２０７８３号に記載されている。これらのイムノコンジュゲートは、少なくとも２つの抗体を含む。したがって、一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートは、本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、少なくとも第１の抗体及び第２の抗体とを含む。特定の実施態様では、前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、Ｆｖ分子、特に、ｓｃＦｖ分子とＦａｂ分子とからなる群より独立して選択される。具体的な実施態様では、前記変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、前記第１の抗体と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第２の抗体は、（ｉ）変異型ＩＬ－７ポリペプチド又は（ｉｉ）第１の抗体のいずれかと、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、１つ又は複数のリンカー配列によって結合する、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、第１及び第２の抗体、特にＦａｂ分子とから本質的になる。そのようなフォーマットは、それらが標的抗原（ＰＤ－１）に高い親和性で結合するが、ＩＬ－７受容体への単量体結合のみを提供し、したがって、標的部位以外の場所で免疫細胞を有するＩＬ－７受容体へのイムノコンジュゲートの標的化を回避するという利点を有する。特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１の抗体、特に第１のＦａｂ分子は、第１の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗体、特に第２のＦａｂ分子と、カルボキシ末端ペプチドを共有する。特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１の重鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の重鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の軽鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合によって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドに結合し、さらに、アミノ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に結合する。別の実施態様では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合によって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドに結合し、さらに、カルボキシ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に結合する。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、１つ又は複数のｓｃＦＶ分子とアミノ末端ペプチド結合を共有するとともに、１つ又は複数のｓｃＦＶ分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。

【0100】

しかしながら、本発明によるイムノコンジュゲートのための特に好適なフォーマットは、抗体として免疫グロブリン分子を含む。そのようなイムノコンジュゲートフォーマットは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0101】

したがって、特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、本明細書中に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ_１分子とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、最大１つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含む。一実施態様では、免疫グロブリン分子は、ヒトである。一実施態様では、免疫グロブリン分子は、ヒト定常領域、例えば、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含む。一実施態様では、免疫グロブリンは、ヒトＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む。一実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、免疫グロブリン分子と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、１つ又は複数のリンカー配列によって連結された、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ_１分子とから本質的になる。具体的な実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、免疫グロブリン重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、任意選択的にはリンカーペプチドを介して、融合する。

【0102】

変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、抗体に直接的に、又は１つ又は複数のアミノ酸、典型的には、約２～２０アミノ酸を含むリンカーペプチドを介して、融合していてもよい。リンカーペプチドは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎリンカーペプチドが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施態様では、リンカーペプチドは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施態様では、５～１００アミノ酸長、さらなる実施態様では、１０～５０アミノ酸長を有する。特定の実施態様では、リンカーペプチドは、１５アミノ酸長を有する。一実施態様では、リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）_ｎ又は（ＧｘＳ）_ｎＧ_ｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、さらなる実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝３、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２、及びｍ＝４である。特定の実施態様では、リンカーペプチドは、（Ｇ_４Ｓ）２（配列番号１９）である。一実施態様では、リンカーペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を有する（又はそれからなる）。代替的なリンカーペプチドは、配列番号２０によるアミノ酸配列を含む。

【0103】

特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、変異型ＩＬ－７分子と、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリン分子とを含み、変異型ＩＬ－７分子は、そのアミノ末端アミノ酸において、配列番号１９のリンカーペプチドを介して免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合されている。

【0104】

特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、変異型ＩＬ－７分子とＰＤ－１に結合する抗体とを含み、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含み、変異型ＩＬ－７分子は、そのアミノ末端アミノ酸において、配列番号１９のリンカーペプチドを介してＦｃドメインのサブユニットの一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合されている。

【0105】

ＰＤ－１抗体
本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１が発現する標的部位、特にＰＤ－１を発現させる、例えば腫瘍に関連するＴ細胞に変異型ＩＬ－７ポリペプチドを誘導することが可能である。

【0106】

本発明のイムノコンジュゲートに使用され得る好適なＰＤ－１抗体は、国際公開第２０１７／０５５４４３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0107】

本発明のイムノコンジュゲートは、同一の又は異なる抗原に結合し得る２つ以上の抗体を含み得る。しかしながら、特定の実施態様では、これらの抗体のそれぞれはＰＤ－１に結合する。一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は単一特異性である。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、単一の単一特異性抗体、特に単一特異性免疫グロブリン分子を含む。

【0108】

抗体は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１への特異的結合を保持する任意の種類の抗体又はその断片であり得る。抗体断片としては、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）_２分子が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、特定の実施態様では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗体は、免疫グロブリン、特にＩｇＧクラス、より具体的にはＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリンである。

【0109】

いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。

【0110】

いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、Ｋａｂａｔ番号付けによる位置７１～７３に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

【0111】

いくつかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、及びＫａｂａｔ番号付けによる位置７１～７３に配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒト化可変領域を含む。いくつかの実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0112】

いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

【0113】

いくつかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒト化可変領域を含む。いくつかの実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0114】

いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0115】

いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0116】

いくつかの実施態様では、抗体はヒト化抗体である。一実施態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号２４及び２５（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）及び配列番号２６（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号２４又は配列番号２５のアミノ酸配列、特に配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載のＦｃドメインにアミノ酸変異を含み得る。

【0117】

Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、最大１つのＦｃドメインを含む。

【0118】

一実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ_４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。さらにより特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号２３に示されている。

【0119】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明によるイムノコンジュゲートは、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した変異型ＩＬ－７ポリペプチド、特に単一の（最大１つの）変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含み、よって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には、２つの同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組み換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組み換え産生におけるイムノコンジュゲートの収率及び純度を改善するため、抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。

【0120】

したがって、特定の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間でタンパク質間相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。

【0121】

ヘテロ二量体化を強制するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインを修飾するためのいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分説明されている。典型的には、そのような手法の全てにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインの両方が相補的な様式で操作されて、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）はもはやそれ自体とホモ二量体化することはないが、相補的に操作された他方のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化を強制される（そのため、第１と第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン間又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間にはホモ二量体は形成されない）。

【0122】

具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。

【0123】

ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般に、この方法は、突起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの界面に、及び対応する空洞（「ホール」）を第２のポリペプチドの界面に導入し、これによって、突起が空洞部に位置決めされて、それによりヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げることを伴う。突起は、第１のポリペプチドの界面にある小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えることによって構築される。突起に対して同一又は同様のサイズの相補的な空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）に置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。

【0124】

したがって、特定の実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置決め可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置決め可能である。

【0125】

好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。

【0126】

好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される。

【0127】

突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作製することができる。

【0128】

具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメイン（「ホール」サブユニット）の第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基が、バリン残基と置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、３６６位のトレオニン残基が、セリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0129】

なおさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、３５４位のセリン残基が、システイン残基と置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基と置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、３４９位のチロシン残基が、システイン残基と置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋が生成し、二量体をさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0130】

特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0131】

いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）をさらに含む。

【0132】

特定の実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（任意選択的にはリンカーペプチドを介して）融合している。理論によって束縛されることを望まないが、Ｆｃドメインのノブを含有するサブユニットに対する変異型ＩＬ－７ポリペプチドの融合は、２つの変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートの生成を（さらに）最小化する（２つのノブを含有するポリペプチドの立体的な衝突）。

【0133】

ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮されており、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９，国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。

【0134】

一実施態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。この手法は、Ｆｃ ドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づいている。本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体の１つの好ましい実施態様は、アミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＫ３７０Ｅ及びアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他の１つにおけるＥ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。

【0135】

別の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにさらなるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0136】

別の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0137】

一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択されるアミノ酸変異をさらに含む。

【0138】

一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２にあるさらなるアミノ酸変異、例えば、（ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、（ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、（ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、（ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、（ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、（ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0139】

一実施態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量化手法が代わりに使用され、例えば、３６８及び４０９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸修飾を有する。

【0140】

一実施態様では、上に記載するノブ・イントゥ・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量化手法が、代わりに使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

【0141】

一実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ_２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。

【0142】

代替的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果に介在する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの接触面における１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。そのような一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によるアミノ酸置換を追加的に又は代替的に含む。

【0143】

なおさらなる実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0144】

さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用してもよい。

【0145】

一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0146】

Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、イムノコンジュゲートに、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期と好ましい組織血液分布比とを含む、好ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞へのイムノコンジュゲートの望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化によって、サイトカインが放出され、ＩＬ－７ポリペプチドと長い半減期のイムノコンジュゲートとの組み合わせで、全身投与の際にサイトカイン受容体が過剰に活性化し、重篤な副作用が起こる。したがって、特定の実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）は、ネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を示し、且つ／又はネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様では、Ｆｃドメインドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）が、ネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）の約７０％超、特に約８０％超、より具体的には約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに示す場合に達成される。

【0147】

ある特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能が、操作されていないＦｃドメインと比較して低下するように操作される。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一実施態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍低下させる。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる、２つ以上のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又はさらには少なくとも５０倍低下させ得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含む抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、より具体的には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれに対する結合が低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む抗体）が、Ｆｃドメインの操作されていない形態（又は前記Ｆｃドメインの操作されていない形態を含む抗体）の約７０％超の、ＦｃＲｎに対する結合親和性を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。ある特定の実施態様では、イムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低下、標的結合抗体との架橋の低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの低下である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。

【0148】

一実施態様では、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）。具体的には、特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基が、グリシン残基と置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ_１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に、補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異型Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。

【0149】

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する低下した結合親和性及び低下したエフェクター機能を示す。したがって、いくつかの実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートに含まれる抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換を含み、具体的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、具体的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。

【0150】

特定の実施態様では、ネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0151】

ある特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位にアミノ酸変異、特に、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0152】

本明細書上記及びＰＣＴ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を有するものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が含まれ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0153】

変異型Ｆｃドメインは、当該技術分野でよく知られている遺伝学的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製され得る。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。

【0154】

Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組み換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価され得る。

【0155】

Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法により測定され得る。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、評価され得る。

【0156】

いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、具体的にはＣ１ｑに対する結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低下したエフェクター機能を有するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む抗体がＣ１ｑに結合することが可能であり、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを、決定し得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。

【0157】

ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野で知られている方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照のこと）。

【0158】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｇ８５Ｅ（配列番号２８のヒトＩＬ－７配列に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－７分子であり、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0159】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ８１Ｅ及びＧ８５Ｅ（配列番号２８のヒトＩＬ－７配列に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－７分子であり、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0160】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｇ８５Ｅ、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａ（配列番号２８のヒトＩＬ－７配列に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－７分子であり、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0161】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ８１Ｅ、Ｇ８５Ｅ、Ｔ９３Ａ及びＳ１１８Ａ（配列番号２８のヒトＩＬ－７配列に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－７分子であり、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0162】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0163】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0164】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0165】

一態様では、本発明は、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと、ＰＤ－１に結合する抗体とを含むイムノコンジュゲートであって、変異型ＩＬ－７ポリペプチドが、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、イムノコンジュゲートを提供する。

【0166】

本発明の上記の態様のいずれかによる一実施態様では、抗体は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む、ＩｇＧクラス免疫グロブリンであり、
Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基は、バリン残基と置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に、３６６位のトレオニン残基は、セリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基は、アラニン残基と置き換えられており（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、さらに、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。この実施態様では、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、配列番号１９のリンカーペプチドを介して、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合する。

【0167】

一態様では、本発明は、配列番号３３の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３７の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0168】

一態様では、本発明は、配列番号３３の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３８の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0169】

一態様では、本発明は、配列番号３３の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３９の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0170】

一態様では、本発明は、配列番号３３の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号４０の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0171】

ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載のイムノコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様では、前記断片は、抗原結合断片である。

【0172】

本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドは、完全なイムノコンジュゲートをコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現する複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現してもよい。共発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的なイムノコンジュゲートを形成し得る。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖と変異型ＩＬ－７ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、イムノコンジュゲートを形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち１つと変異型ＩＬ－７ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートの一部は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方を含むイムノコンジュゲートの一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現する場合、Ｆｃドメインサブユニットは会合して、Ｆｃドメインを形成する。

【0173】

いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明によるイムノコンジュゲート全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明によるイムノコンジュゲートに含まれるポリペプチドをコードする。

【0174】

一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲートに含まれる抗体の重鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖）及び変異型ＩＬ－７ポリペプチドをコードする。別の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲートに含まれる抗体の軽鎖をコードする。

【0175】

一部の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。

【0176】

組み換え法
本発明で有用な変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、当該技術分野でよく知られている遺伝的方法又は化学的方法を用い、欠失、置換、挿入又は修飾によって調製され得る。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。天然のヒトＩＬ－７の配列を配列番号２８に示す。置換又は挿入は、天然アミノ酸残基及び非天然アミノ酸残基を含み得る。アミノ酸修飾は、グリコシル化部位の付加又は炭水化物の接続等といった化学修飾のよく知られている方法を含む。

【0177】

本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組み換え産生によって得られてもよい。組み換え産生について、例えば上述の、イムノコンジュゲート（断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、イムノコンジュゲート（断片）のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組み換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、イムノコンジュゲート（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写要素若しくは翻訳制御要素と作用可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合は、コード領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一のベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の（異なる）ベクター上に、存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含有してもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、異種コード領域をコードし、本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合してもよく、又は融合しなくてもよい。異種コード領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊な要素又はモチーフが含まれる。作用可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を１つ又は複数の制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の制御配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに関連付けられたプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作用可能に会合」している。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合していると思われる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作用可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写調節領域がここに開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロンＡと併せた最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス等）が含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子由来のもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン類を誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の染色体組み込み要素等の他の特徴を含み得る。

【0178】

本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と関連し得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体にわたる成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生成することを承知している。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。

【0179】

後の精製を容易にするため（例えば、ヒスチジンタグ）又はイムノコンジュゲートを標識するのを補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードするイムノコンジュゲート（断片）の内部又はその末端に含まれていてもよい。

【0180】

さらなる実施態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターには、ポリヌクレオチド及びベクターのそれぞれに関連してここに記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。このような一実施態様では、宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、形質転換されたか又はトランスフェクトされた）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を指す。イムノコンジュゲートを複製し、その発現を助けるのに適した宿主細胞は、当該技術分野でよく知られている。そのような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか又は形質導入されてもよく、大規模な酵槽に播種するために大量のベクターを含む細胞を成長させて、臨床用途に十分な量のイムノコンジュゲートを得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等を含む。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌中で生成され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、昆虫細胞と組み合わせて使用されてもよく、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用されてもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に記載される、２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３，２４３－２５１（１９８０）に記載される、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載されるようなもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ^－ ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ．２５５－２６８（２００３）を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物若しくは培養植物、又は動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。ある実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。

【0181】

これらの系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当該技術分野で知られている。抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかに融合する変異型ＩＬ－７ポリペプチドを発現させる細胞は、発現した変異型ＩＬ－７の融合産物が、重鎖と軽鎖の両方を含む抗体であるように、抗体鎖の他方も発現させるように操作されてもよい。

【0182】

一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートを製造する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるように、イムノコンジュゲートの発現に適した条件下でイムノコンジュゲートをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）からイムノコンジュゲートを回収することとを含む。

【0183】

本発明のイムノコンジュゲートでは、変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、抗体に遺伝的に融合されていてもよく、又は抗体に化学的にコンジュゲートされていてもよい。抗体に対するＩＬ－７ポリペプチドの遺伝的融合は、ＩＬ－７配列がポリペプチドに直接的に融合するか又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計され得る。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野でよく知られている方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。特定のリンカーペプチドが、本明細書に記載される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を含めることもできる。加えて、ＩＬ－７融合タンパク質は、当該技術分野でよく知られているように、ポリペプチド合成方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）を用いて化学的に合成され得る。変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、よく知られている化学的コンジュゲーション法を用いて他の分子（例えば抗体）に化学的にコンジュゲートされ得る。二官能架橋試薬（例えば、当該技術分野でよく知られているホモ官能性及びヘテロ官能性架橋試薬）をこの目的で使用してもよい。使用する架橋試薬の種類は、ＩＬ－７にカップリングする分子の性質に依存し、当業者により容易に特定され得る。代替的に又は追加的に、変異型ＩＬ－７及び／又はコンジュゲートされることを意図した分子は、これも当該技術分野でよく知られているように、これら２つが別個の反応でコンジュゲートされ得るように化学的に誘導体化されてもよい。

【0184】

本発明のイムノコンジュゲートは、抗体を含む。抗体を製造する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、ペプチド固相合成法を使用して構築することができ、組み換え的に産生することができるか（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は、例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）。イムノコンジュゲート、抗体、及びこれらを製造するための方法も、ＰＣＴ国際公開第２０１１／０２０７８３号、同第２０１２／１０７４１７号及び同第２０１２／１４６６２８号に記載されており、それぞれが参照により本明細書に援用される。

【0185】

任意の動物種の抗体が、本発明のイムノコンジュゲートに使用され得る。本発明において有用な非限定的な抗体は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。イムノコンジュゲートがヒトへの使用を意図したものである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野でよく知られている方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するために重要なもの）の保持の有無にかかわらず、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域上にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域上にグラフトすること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することを含む、様々な方法によって達成され得る。ヒト化抗体及びそれらの作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイド付き選択」手法を記載）で説明されている。ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。

【0186】

ヒト抗体は、当該技術分野において既知の様々な技術を用いて産生することができる。ヒト抗体は一般的にｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５，３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０，４５０－４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製してもよい。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に置き換わるか又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び米国特許第６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。

【0187】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。

【0188】

ヒト抗体はまた、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリーからの単離によって生成され得る。

【0189】

本発明に有用な抗体は、所望の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されてもよい。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えばＬｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．のＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）において総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野で知られている。このような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．のｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．のＨｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．のＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）に、並びにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ ＢｒａｄｂｕｒｙのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）において総説されている。

【0190】

ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換えられており、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．のＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）で説明されるように抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーをクローン化し（例えば、ヒトから）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．のＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、免疫化することなく、非自己から自己抗原までの広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最終的に、ナイーブなライブラリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）によって説明されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、及びランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再整列を達成することによって、合成により作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許刊行物としては、例えば、以下のものが挙げられる：米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号。所望の活性（１つ又は複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当該技術分野で知られている方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）、並びにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）で総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．のＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。

【0191】

本発明のイムノコンジュゲートのさらなる化学修飾が望ましい場合がある。例えば、免疫原性及び短い半減期の問題は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）等の実質的に直鎖のポリマーへのコンジュゲーションによって改善され得る（例えば、国際公開第８７／０００５６号を参照）。

【0192】

本明細書で記載されるように調製されるイムノコンジュゲートは、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の当該技術分野で既知の技術によって精製され得る。特定のタンパク質を精製するのに使用される実際の条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依拠し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、イムノコンジュゲートが結合する、抗体、リガンド、受容体、又は抗原が使用され得る。例えば、変異型ＩＬ－７ポリペプチドと特異的に結合する抗体が使用され得る。本発明のイムノコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はＧを含むマトリックスが使用され得る。例えば、連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載されるように、イムノコンジュゲートを単離することができる。イムノコンジュゲートの純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等の任意の様々なよく知られている分析方法によって決定することができる。

【0193】

組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書に記載のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるイムノコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるイムノコンジュゲートのいずれかと、少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。

【0194】

さらに提供されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態で本発明のイムノコンジュゲートを製造する方法であって、（ａ）本発明によるイムノコンジュゲートを得ることと、（ｂ）イムノコンジュゲートと少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを配合し、それによって、イムノコンジュゲートの調製物を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために配合することとを含む、方法である。

【0195】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散した治療的有効量のイムノコンジュゲートを含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。イムノコンジュゲートと、任意選択的には、さらなる有効成分とを含む薬学的組成物の調製は、本明細書に参照により援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当業者によく知られているであろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与について、製剤は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって要求される無菌状態、発熱性、一般的な安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られているように（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照）、ありとあらゆる溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、添加物、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、そのような類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。従来の担体が有効成分と不適合でない限り、治療用組成物又は薬学的組成物におけるその使用が企図される。

【0196】

本発明のイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻内を含む任意の適切な手段によって投与されてもよく、所望な場合、局所治療では、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注入といった注入により行われてもよい。

【0197】

非経口組成物には、注入による投与、例えば、皮下注射、皮内注射、病巣内注射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注入の場合、本発明のイムノコンジュゲートは、水溶液中、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液中で、製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。あるいは、イムノコンジュゲートは、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌されたパイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には、以下に列挙する様々な他の成分と共に、本発明のイムノコンジュゲートを必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、様々な滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容される担体には、限定されないが、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意選択的に、懸濁液は、好適な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。

【0198】

有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースも若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施態様において、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされ得る。

【0199】

先述の組成物に加えて、イムノコンジュゲートは、デポー調製物として製剤化されてもよい。そのような徐放性調製物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、イムノコンジュゲートは、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。

【0200】

本発明のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、添加物、又はタンパク質を薬学的に使用され得る調製物へと加工するのを容易にする補助剤を用いて、従来の様式で配合され得る。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。

【0201】

イムノコンジュゲートは、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物中に配合され得る。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は有機酸で形成されるもの、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、又はマンデル酸等の有機酸が含まれる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。薬学的な塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。

【0202】

治療方法及び組成物
本明細書中に提供される変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートのいずれも、治療方法において使用され得る。本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、免疫療法剤として、例えばがんの治療に使用され得る。

【0203】

治療方法における使用の場合、本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、適正な医療行為と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に知られている他の因子が含まれる。

【0204】

本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、宿主の免疫系の刺激が有益である疾患状態、特に細胞性免疫応答の増強が望ましい状態の治療に特に有用であり得る。これらは、宿主免疫応答が不十分であるか又は不足している疾患状態を含んでいてもよい。本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートを投与し得る疾患状態は、例えば、細胞性免疫応答が特異的免疫にとって重要な機構となる腫瘍又は感染を含む。本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、それ自体で、又は任意の適切な薬学的組成物中で投与され得る。

【0205】

一態様では、医薬として使用するための本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施態様では、治療方法における使用のための本発明の変異型ＩＬ－７ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。一実施態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体に、疾患の治療における使用のための本明細書に記載のイムノコンジュゲートを提供する。一実施態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療おける使用のための本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドを提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、個体に治療的有効量のイムノコンジュゲートを投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための変異型ＩＬ－７及びイムノコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。ある特定の実施態様では、方法は、個体に対して治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、免疫系を刺激することにおける使用のためのイムノコンジュゲートを提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、個体における免疫系を刺激する方法における使用のための変異型ＩＬ－７及び／又はイムノコンジュゲートであって、有効量のイムノコンジュゲートを個体に投与して免疫系を刺激することを含む、変異型ＩＬ－７及び／又はイムノコンジュゲートを提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうちの任意の１つ又は複数を含み得る。

【0206】

さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の変異型ＩＬ－７及び／又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療のためのものである。一実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。ある特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、本方法は、治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、免疫系を刺激するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、個体に有効量の医薬を投与して免疫系を刺激することを含む、個体における免疫系を刺激する方法における使用のためのものである。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうちの任意の１つ又は複数を含み得る。

【0207】

さらなる態様では、本発明は、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、そのような疾患を有する個体に、治療的有効量の本発明の変異型 ＩＬ－７及び／又はイムノコンジュゲートを投与することを含む。一実施態様では、本発明の変異型ＩＬ－７及び／又はイムノコンジュゲートを薬学的に許容され得る形態で含む組成物が、前記個体に投与される。ある特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。ある特定の実施態様では、方法は、個体に対して治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、個体における免疫系を刺激する方法であって、個体に対して有効量の変異型ＩＬ－７及び／又はイムノコンジュゲートを投与して免疫系を刺激することを含む、方法を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。上記実施態様のいずれかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、及びナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加等のうちの任意の１つ又は複数を含み得る。

【0208】

一部の実施態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のイムノコンジュゲートを用いて治療され得る他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。ある特定の実施態様では、がんは、腎臓がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、前立腺がん及び膀胱がんからなる群より選択される。当業者は、多くの場合に、イムノコンジュゲートが、治癒を与えないが、部分的な利益のみを与える場合があることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、何らかの利益を有する生理的変化も治療的に有益であると考慮される。したがって、いくつかの実施態様では、生理学的変化を与えるイムノコンジュゲートの量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。

【0209】

いくつかの実施態様では、有効量の本発明のイムノコンジュゲートが細胞に投与される。他の実施態様では、治療的有効量の本発明のイムノコンジュゲートが、疾患の治療のために個体に投与される。

【0210】

疾患の予防又は治療のために、本発明のイムノコンジュゲートの適切な投薬量（単独で使用される場合、又は１つ若しくは複数の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、分子の種類（例えば、Ｆｃドメインを含むか否か）、疾患の重症度及び経過、イムノコンジュゲートが予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及びイムノコンジュゲートに対する応答、及び主治医の判断に依拠する。いずれにせよ、投与を担当する施術者は、組成物中の１つ又は複数の有効成分の濃度及び個々の対象に対する１つ又は複数の適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。

【0211】

イムノコンジュゲートは、一度に、又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のイムノコンジュゲートが、例えば、１回又は複数回の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための最初の候補投薬量であり得る。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投薬量は、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。イムノコンジュゲートの１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。他の非限定的な例では、用量はまた、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで、又は投与あたりさらに多くを含んでもよく、これらから誘導可能な任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等が、上述の数に基づいて投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ又は複数の用量が患者に投与され得る。このような投薬量は、（例えば、患者が、約２～約２０回、又は例えば約６回のイムノコンジュゲートの投薬を受けるように）断続的に、例えば、毎週又は３週間ごとに投与され得る。最初のより高い負荷用量、続いて１回又は複数回のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

【0212】

本発明のイムノコンジュゲートは、概して、意図した目的を達成するのに効果的な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のイムノコンジュゲート又はその薬学的組成物が、治療的有効量で投与されるか又は塗布される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。

【0213】

全身投与の場合、治療的に有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に推定することができる。次いで、細胞培養で決定されるようなＩＣ_５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量が動物モデルにおいて製剤化され得る。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。

【0214】

また、初期投薬量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野でよく知られている技術を使用して、概算され得る。当業者は、動物のデータに基づきヒトへの投与を容易に最適化することができる。

【0215】

治療効果を維持するのに十分なイムノコンジュゲートの血漿レベルを提供するために、投薬量及び投薬間隔は個別に調整され得る。注入による投与のための通常の患者投与量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、典型的には約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定されてもよい。

【0216】

局所投与又は選択的な取り込みの場合には、イムノコンジュゲートの有効な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者であれば、過度の実験をせずとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。

【0217】

本明細書に記載のイムノコンジュゲートの治療に有効な用量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、一般的に治療利益を与える。イムノコンジュゲートの毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ_５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示すイムノコンジュゲートが好ましい。一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートは、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した投薬量の範囲を製剤化するために使用できる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくないＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、用いられる剤形、利用される投与経路、対象の状態等に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい。（例えば、その全文が本明細書に参照により援用される、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５の「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１」を参照のこと。）

【0218】

本発明のイムノコンジュゲートで治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全等に起因して、どのように、及びいつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合、治療をより高いレベルに調整することも知っている（毒性を除いて）。対象となる障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度、及び投与経路等によって変わる。状態の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価され得る。さらに、用量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変わる。

【0219】

本明細書に記載の変異型ＩＬ－７ポリペプチドを含むイムノコンジュゲートの最大治療用量は、野生型ＩＬ－７を含むイムノコンジュゲートに使用するものから増加してもよい。

【0220】

他の薬剤及び治療
本発明によるイムノコンジュゲートは、治療において、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のイムノコンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療剤と一緒に投与されてもよい。「治療剤」という用語は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含み得る。ある特定の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。

【0221】

そのような他の薬剤は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依拠する。イムノコンジュゲートは、通常、本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0222】

上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明のイムノコンジュゲートの投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時、及び／又は投与後に行われてもよい。また、本発明のイムノコンジュゲートを、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。

【0223】

製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それだけで、又は状態を治療、予防及び／又は診断するために有効な別の組成物と組み合わされて、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明のイムノコンジュゲートである。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が本発明のイムノコンジュゲートを含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物がさらなる細胞毒性剤又はその他の治療剤を含む、第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、特定の症状を治療するために上記組成物が使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

【0224】

アミノ酸配列

【0225】

ＩＬ－７のアミノ酸配列

【実施例】

【0226】

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施態様が実施されてもよいことは理解される。

【0227】

本発明によるイムノコンジュゲートの例示的なフォーマットを図１に概略図として示す。ＩｇＧ－ＩＬ－７イムノコンジュゲートは、２つのＦａｂドメイン（可変ドメイン、定常ドメイン）、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、及びＦｃドメインのＣ末端に融合した変異型ＩＬ７ポリペプチドを含む。ＩｇＧ－ＩＬ７イムノコンジュゲートは、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０によるアミノ酸配列のポリペプチドで構成されている。

【0228】

例示的なフォーマットに提供される配列は、ＩＬ－７野生型配列を有するイムノコンジュゲートに関する。しかしながら、本明細書で開示される任意の変異型ＩＬ－７ポリペプチドは、野生型ＩＬ－７の代わりに前記フォーマットに組み込まれてもよい。

【0229】

実施例１
実施例１．１ ＰＤ１－ＩＬ７ｖ融合タンパク質の産生及び分析
表１にあるような抗体ＩＬ７バリアント（ＩＬ７ｖ）融合コンストラクトをＣＨＯ細胞中で産生させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。最終生成物の分析は、モノマー含有量の測定（分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる）及び主ピークのパーセンテージ（非還元キャピラリーＳＤＳ電気泳動：ＣＥ－ＳＤＳ によって測定）からなる。

【0230】

表１：試験したＰＤ１－ＩＬ７融合タンパク質のポリペプチドアミノ酸配列

【0231】

ＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生。本明細書に記載された抗体ＩＬ７融合コンストラクトのいくつかを、振とうフラスコ培養を使用して又はフェドバッチ発酵プロセスを使用して産生した。振とうフラスコ培養による組み換え産生を、定義された無血清培地中で、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ^ＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって行った。抗体ＩＬ７バリアント融合コンストラクトの産生のため、細胞を、それぞれの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含有するプラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションには、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｇｉｂｃｏ）を使用した。細胞培養上清をトランスフェクションの１０～１２日後に回収した。フェドバッチ発酵には、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞中での安定なタンパク質発現のための独自のベクター系を使用した。タンパク質は、ロシュ独自の化学的に定義された細胞培養培地及び飼料を用いて、自動化されたミニバイオリアクターでのフェドバッチ発酵プロセス中にトランスフェクトされた細胞のプールによって発現した。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により、上清を回収した。

【0232】

ＩｇＧ様タンパク質の精製。標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡バッファー：ＰＢＳ ｐＨ７．４；溶出バッファー：１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちにサンプルのｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５；Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によって濃縮し、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、凝集したタンパク質を単量体タンパク質から分離した。

【0233】

ＩｇＧ様タンパク質の分析。精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２）で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用するＨＰＬＣ クロマトグラフィーによって行った。

【0234】

表２：分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された単量体生成物のピークと、非還元ＣＥ－ＳＤＳによって決定された主生成物のピーク。

【0235】

結果。ＰＤ１－ＩＬ７バリアントコンストラクトを、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製した物質の品質分析の結果、分析用サイズ排除クロマトグラフィー分析で測定した場合の単量体含有量は８５％超であった（表２）。主生成物のピークは非還元キャピラリー電気泳動では＞７０％であった（表２）。結論として、すべてのＰＤ１－ＩＬ７バリアントを良好な品質で産生させた。

【0236】

実施例１．２ さらなるＰＤ１－ＩＬ７ｖ融合タンパク質（参照分子５、７及び８）の産生及び分析
表３に記載の抗体ＩＬ７バリアント融合コンストラクトをＣＨＯ細胞中で産生させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。最終生成物の分析は、モノマー含有量の測定（分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる）及び主ピークのパーセンテージ（非還元キャピラリーＳＤＳ電気泳動：ＣＥ－ＳＤＳ によって測定）からなる。参照分子５、７及び８は、国際公開第２０２０／１２７３７７Ａ１号に開示されているＩＬ７部分を含む。これらは、ＰＤ－１抗体のＮ末端に融合した１つのＩＬ７部分を含む、本明細書に開示した他の融合コンストラクトと同じ形式である（図１）。

【0237】

表３：試験したＰＤ１－ＩＬ７融合タンパク質のポリペプチドアミノ酸配列

【0238】

クローニング。対応するｃＤＮＡを、従来の（非ＰＣＲベース）クローニング技術を使用してｅｖｉｔｒｉａのベクター系にクローニングした。ｅｖｉｔｒｉａベクタープラスミドを遺伝子合成した。プラスミドＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づく低エンドトキシン条件下で調製した。ＤＮＡ濃度は、波長２６０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。配列の正確性は、サンガー配列決定（プラスミド１つ当たり２つの配列決定反応による）により検証した。

【0239】

ＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生。本明細書に記載の抗体ＩＬ７融合コンストラクトは、Ｅｖｉｔｒｉａにより、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用して、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａで懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて産生された。産生には、Ｅｖｉｔｒｉａは、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を使用した。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により、上清を回収した。

【0240】

ＩｇＧ様タンパク質の精製。標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡バッファー：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちにサンプルのｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５；Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によって濃縮し、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、凝集したタンパク質を単量体タンパク質から分離した。

【0241】

ＩｇＧ様タンパク質の分析。精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳによりタンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集物含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ_３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。

【0242】

表４：分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定された、単量体生成物ピーク、高分子量（ＨＭＷ）及び低分子量（ＬＭＷ）副生成物。

【0243】

表５：非還元ＣＥ－ＳＤＳによって決定された主生成物ピーク

【0244】

結果．精製したＰＤ１－ＩＬ７バリアントコンストラクトを、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。参照分子７をＣＥ－ＳＤＳ分析の前にＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化し、均一なピークを得た。精製した物質の品質分析から、分析用サイズ排除クロマトグラフィー分析により単量体含有量が９４％超であること（表４）、及び非還元キャピラリー電気泳動により主生成物ピークが９１％と９９％の間であることが明らかになった（表５）。結論として、すべてのＰＤ１－ＩＬ７バリアントを良好な品質で産生させた。

【0245】

実施例１．３ さらなるＰＤ１－ＩＬ７ｖ融合タンパク質（ＰＤ１－ＩＬ７ｗｔ、参照分子６、９及び１０）の産生及び分析
表６に記載の抗体ＩＬ７バリアント融合コンストラクトをＣＨＯ細胞中で産生させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。最終生成物の分析は、モノマー含有量の測定（分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる）及び主ピークのパーセンテージ（非還元キャピラリーＳＤＳ電気泳動：ＣＥ－ＳＤＳ によって測定）からなる。参照分子６は、国際公開第２０２０／１２７３７７Ａ１号に開示されているＩＬ７部分を含む。参照分子９及び１０は、国際公開第２０２０／２３６６５５Ａ１号に開示されているＩＬ７部分を含む。これらは、ＰＤ－１抗体に融合した１つのＩＬ７部分を含む、本明細書に開示した他の融合コンストラクトと同じ形式である（図１）。

【0246】

表６：試験したＰＤ１－ＩＬ７融合タンパク質のポリペプチドアミノ酸配列。

【0247】

クローニング。全ての遺伝子の発現は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にある。

【0248】

ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の産生。本明細書に記載の抗体は、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって、同社独自のベクター系を使用して、従来の（非ＰＣＲベース）クローニング技術及び懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞を用いて調製された。産生には、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓは、市販の化学的に定義された培地を使用し、トランスフェクション後の細胞を以下の条件で培養した：３６．５Ｃ＋６％ 二酸化炭素。

【0249】

遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。

【0250】

力価測定（ＰＡ－ＨＰＬＣ）。上清中のＦｃ含有コンストラクトの定量は、ＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムでプロテインＡ－ＨＰＬＣにより行った。上清をＰＯＲＯＳ ２０ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に注入する。２８０ｎｍの溶出ピーク面積を積分し、同じランで分析した標準による検量線を用いて濃度に変換する。

【0251】

ＩｇＧ様タンパク質の精製。標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。溶出に続いて直ちにサンプルのｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５；Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によって濃縮し、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ａｅｋｔａ Ｐｕｒｅ ＆ ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００；どちらも正式にはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅとして知られるＣｙｔｉｖａより）によって、凝集したタンパク質を単量体タンパク質から分離した。

【0252】

ＩｇＧ様タンパク質の分析。精製したタンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した（正式にはＤｒｏｐｓｅｎｓｅ １６として知られるＬｉｔｔｌｅ Ｌｕｎａｔｉｃ；Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ ｌａｂｓ）。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含有量の決定を、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ）を用いて、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより行った。

【0253】

表７：分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定された、単量体生成物ピーク、高分子量（ＨＭＷ）及び低分子量（ＬＭＷ）副生成物。

【0254】

表８：非還元ＣＥ－ＳＤＳによって決定された主生成物ピーク

【0255】

結果。精製されたＰＤ１－ＩＬ７バリアントコンストラクトを、ＰｒｏｔｅｉｎＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。参照分子９を、ＣＥ－ＳＤＳ分析の前にＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化して、均一なピークを得た。精製した物質の品質分析から、単量体含有量は分析用サイズ排除クロマトグラフィー分析で９３％超であり（表７）、非還元キャピラリー電気泳動で主生成物ピークは９５％と９９％の間であることが明らかになった（表８）。結論として、すべてのＰＤ１－ＩＬ７バリアントを良好な品質で産生させた。

【0256】

実施例１．４ 放出したオリゴ糖の２－ＡＢ－標識及びＨＩＬＩＣクロマトグラフィーによるＮ－グリカンパターンの分析
表９：分析設定

【0257】

表１０：ＰＤ１抗体のＦｃ部分とＩＬ７部分とに結合したＮ－グリカンについて分析したサンプル

各サンプル２００μｇをＮａｎｏＳｅｐ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ １０ Ｋに充填した。ほぼ乾燥するまで３回遠心分離して３５０μＬずつ再充填することにより、消化バッファー（１０ｍＭギ酸アンモニウム ｐＨ８．６）へのバッファー交換を行った。最後の遠心分離工程後、４８μＬの消化バッファー、２μＬのＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、グリセロール非含有、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号 １１ ３６５ １８５ ００１）及び２０μＬのトリプシン溶液（再懸濁バッファー中１，０ｍｇ／ｍＬ、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｖ５１１Ｂ）を加え、ＮａｎｏＳｅｐユニット内で３７℃、１６～１８時間（一晩）インキュベートした。Ｆｃ部分及びＩＬ７部分から放出されたＮ－結合オリゴ糖は、フロースルー遠心分離によってＮａｎｏＳｅｐユニットから１．５ｍＬのエッペンドルフ・スクリューキャップ・チューブに集められた。放出されたＮ－グリカンの２－ＡＢ標識を、Ｓｉｇｎａｌ ２－ＡＢ－ｐｌｕｓ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｚｙｍｅ ＧＫＫ－８０４）を用いて、供給元の指示に従って行った（注意：反応は暗所で行うこと）。２－Ａｂ標識Ｎ－グリカンの洗浄では、ＨｙｐｅｒＳｅｐ－９６ジオールカートリッジを、Ｇｌｙｋｏ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｔａｔｉｏｎ上で、１ｍＬの水、続いて１ｍＬの９６％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで平衡化し、真空をかけることにより調製した（未使用のウェルはシーリングプラグのストリップで遮断した）。２－ＡＢ標識Ｎ－グリカンサンプルを、１ｍＬの９６％（ｖ／ｖ）アセトニトリルと混合し、平衡化したＨｙｐｅｒＳｅｐ－９６ジオールカートリッジにロードし、超低真空をかけた。カートリッジを３×０．７５ｍＬの９６％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで洗浄し、サンプルを２ｍｌの遠心装置でＨｙｐｅｒＳｅｐ－９６ジオールカートリッジから移した。１００μＬの２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水を加え、２～３分間浸透させた。グリカンを、フロースルー遠心分離（５０００ｒｃｆで約２分間）（又はＧｌｙｋｏ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｔａｔｉｏｎの真空）により溶出し、クロマトグラフィー分析用に９６％アセトニトリル（ｖ／ｖ）で１：１に希釈した。各オリゴ糖サンプル１０μＬをＨＩＬＩＣ－ＢＥＨグリカンカラムにロードし、以下のクロマトグラフィーパラメーターを適用して分離した：

勾配：

【0258】

結果。ＰＤ１－ＩＬ７バリアントを、すべてのネイティブＮ－グリコシル化セクオン（Ｎ７０、Ｎ９１及びＮ１１６）を含有する完全にグリコシル化されたバージョン（完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１［Ｐ１ＡＧ３７２４］）として、また、１つのネイティブＮ－グリコシル化セクオンＮ７０のみを含有するとともにセクオンＮ９１及びＮ１１６が変異した部分的にグリコシル化されたバージョン（部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１［Ｐ１ＡＧ３７２５］及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１［Ｐ１ＡＧ３７２７］）として作製した。ＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１の両バージョンは、ＩＬ７のアミノ酸配列において同じＧ８５Ｅ変異を示すが、Ｎ－結合グリコール構造が占める可能性のあるアミノ酸配列のＮ－グリコシル化部位の数が異なる。エピソームベクターで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞又は安定な組み込み発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細胞のいずれかを使用する発現系で、別の潜在的な変数が同定された。どちらの変数もグリコシル化パターンに影響を与える可能性がある（図２）。全体的なグリコシル化の程度は、ＩＬ－７部分で利用可能なＮ－グリコシル化部位の数に影響される。すべてのＮ－グリコシル化部位で完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１は、Ｎ－グリコシル化部位が変異したバリアント（部分的にグリコシル化されたもの；図２、Ａ～Ｃ）よりも、より複雑なシアル化（ｓｉａｌｉｄａｔｅｄ）グリカンシグナルを示した。Ｎ－グリコ構造の種類は、発現様式によって影響を受ける可能性がある。安定なトランスフェクトＣＨＯ細胞で発現したＰＤ１－ＩＬ７バッチは、ＩＬ７部分に有意な量の複合型、シアル化された二、三、四及び五分岐Ｎ－グリカンを示したが、一過性発現由来のバッチは、複合型、シアル化構造をほとんど持たず、主に中性グリカンを有するか又はＩＬ７にグリカンが結合していない可能性がある（図２ Ａ～Ｃ ｖｓ Ｅ～Ｆ）。したがって、「完全にグリコシル化された」又は「部分的にグリコシル化された」という呼称は、必ずしも分子の有効なグリコシル化状態を反映するものではなく、Ｎ－グリコシル化セクオンの存在を表すために用いられる。グリコシル化の程度及び／又は種類は、実施例２及び３に示されるように、ＩＬ７受容体へのＩＬ７の結合特性には影響しないようである。

【0259】

実施例２
実施例２．１ ヒトＩＬ７受容体に対するＰＤ１－ＩＬ７バリアントの親和性決定
表１１：ＳＰＲ実行パラメータ

【0260】

ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋで、ＳＰＲ実験を実施した。抗Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ内部）をＣ１チップ（Ｃｙｔｉｖａ）上にアミンカップリングにより直接固定した。ＰＤ１－ＩＬ７コンストラクトを１４０秒間にわたって５ｎＭで捕捉した。トリプリケート（Ｐ１ＡＧ３７２７－ ０８３はデュプリケート）の２．３４～３００ｎＭのヒトＩＬ７Ｒａ－ＩＬ２Ｒｇ－Ｆｃヘテロ二量体の２倍連続希釈系列を、３０μｌ／分で２４０秒間リガンド上に通過させ、会合相を記録した。解離相を、８００秒間モニターし、サンプル溶液をランニングバッファーへと切り替えることによってトリガーした。チップ表面を、１０ｍＭ グリシン、ｐＨ２を６０秒間２回注入することにより、各サイクルの後に再生した。バルク屈折率の差を、参照フローセル（固定化抗Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ特異性ＩｇＧのみを含有）で得られた応答を差し引くことで補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、親和定数を運動速度定数から導出した。

【0261】

以下のＰＤ１－ＩＬ７バリアントをＩＬ７受容体への結合について分析した（表１２）。

【0262】

表１２：ＩＬ７受容体への結合について分析されたサンプルの説明。

【0263】

結果。ＰＤ１－ＩＬ７バリアント及び参照分子をヒトＩＬ７受容体への結合について比較した（表１３）。ＰＤ１－ＩＬ７バリアントのＩＬ７受容体に対する親和性を、ＩＬ７受容体アルファ鎖の細胞外ドメインと共通のＩＬ２受容体ガンマ鎖の組み換えヘテロ二量体をヒトＦｃに融合したものを用いて決定した。

【0264】

表１３：ＰＤ１－ＩＬ７バリアントのヒトＩＬ７受容体への結合：２５℃で表面プラズモン共鳴により決定した親和定数。トリプリケートの平均値（Ｐ１ＡＧ３７２７－０８３はデュプリケート）、括弧内は標準偏差。

【0265】

完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は、ヒトＩＬ７受容体に１０～２０ｎＭの親和性で結合し、部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は、６～１２倍低い、およそ１２０ｎＭの親和性で結合する。参照分子５、８、及び９はヒトＩＬ７受容体に対してより高い親和性（およそ約０．６から０．９ｎＭ）を有し、参照分子６及び１０は、完全に又は部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１に近く、親和性はそれぞれ１０ｎＭと５ｎＭである。参照分子７はこれらの条件下ではほとんど結合せず、不活性であると考えられる。

【0266】

結論。完全に又は部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１及び完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１のＩＬ７に導入された変異は、ヒトＩＬ７受容体に対する親和性を低下させ、部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１はＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１コンストラクトよりも６～１２倍低い親和性を有する。

【0267】

実施例２．２ ヒトＩＬ７受容体に対するＰＤ１－ＩＬ７バリアントの親和性決定
ＳＰＲによる親和性測定は、異なる日に数回繰り返され、測定されたＫＤ値は測定ごとに一定の範囲内で変動した。表１４は、さまざまな測定値の概要である。すべての測定は、上記の「設定」と同じセットアップで行い、チップのみを変更している（常にＣ１タイプのチップ）。

【0268】

表１４：発現系の異なるＰＤ１－ＩＬ７バリアントのヒトＩＬ７受容体への結合。分析：日付、複製、チップ識別子。ｎ＞１の場合：カッコ内は平均及び標準偏差。ＩＬ７のグリコシル化：Ｆｃ－及び／又はＩＬ－７部位における複雑な、シアル化された、Ｎ－グリコシル化の含有量：＋＋ 高度含有、＋ 中程度含有、ｏ 低度含有。

【0269】

結果。実施例１．４で上述したように、全体的なグリコシル化の程度は、ＩＬ－７部分の利用可能なＮ－グリコシル化部位の数と発現様式によるグリコ構造の種類とによって影響を受ける。

【0270】

グリコシル化の違いにもかかわらず、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１と部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７－ＶＡＲ２１はどちらも、ＩＬ７Ｒに対して同じ桁で一貫して同程度の親和性を示す（表１４）。ＫＤ値は４．７～２３．７ｎＭで平均１５ｎＭであり、野生型ＩＬ７（平均ＫＤ ０．５ｎＭ）と比較して親和性が低下している。グリコシル化の程度及び／又は種類は、ＩＬ７受容体へのＩＬ７の結合特性には影響しない。

【0271】

実施例３
実施例３．１ 漸増用量のＰＤ１－ＩＬ７バリアントでの治療時の活性化ＰＤ－１^＋及びＰＤ－１^－ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）
次の実験では、グリコシル化パターンがＰＤ－１^＋及びＰＤ－１^－ Ｔ細胞上のＩＬ－７受容体を介した変異型ＩＬ－７のシグナル伝達強度に影響を及ぼすかどうかを評価するために、完全に及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７分子を、シス標的化及びＳＴＡＴ５－Ｐ効力シグナル伝達アッセイで比較した。この目的のために、前述のように単離、活性化、及び共培養したＰＤ１^＋及びＰＤ１^－（抗ＰＤ１前処理）ＣＤ４ Ｔ細胞について、それらを漸増濃度のグリコシル化された及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１又は部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１に曝露した後、ＩＬ７Ｒシグナル伝達を測定した。この目的のため、ＣＤ４ Ｔ細胞をＣＤ４ビーズ（１３０－０４５－１０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて健康なドナーＰＢＭＣから選別し、１μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（一晩プレコート、クローンＯＫＴ３、＃３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ ２８．２、＃３０２９２３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体の存在下で３日間活性化して、ＰＤ－１発現を誘導した。３日後、細胞を回収し、数回洗浄して内因性ＩＬ－２を除去した。その後、細胞を２つの群に分け、そのうちの１つを飽和濃度の抗ＰＤ１抗体（社内分子、１０μｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートした。過剰な未結合抗ＰＤ－１抗体を除去するための数回の洗浄工程の後、抗ＰＤ１前処理細胞及び未処理細胞（５０μｌ、４＊１０^６細胞／ｍｌ）をＶ底プレートに播種し、その後、漸増濃度のＰＤ１－ＩＬ７バリアント（５０μｌ、１：１０希釈工程、最高濃度６６ｎＭ）で３７℃で１２分間処理した。リン酸化状態を保存するために、等量のＰｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（１００μｌ、５５７８７０、ＢＤ）を、様々なコンストラクトとの１２分間のインキュベーションの直後に添加した。次いで、細胞を３７℃で更に３０分間インキュベートした後、Ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ）を用いて８０℃で一晩透過処理した。翌日、そのリン酸化形態のＳＴＡＴ－５を、抗ＳＴＡＴ－５Ｐ抗体（４７／Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）クローン、５６２０７６、ＢＤ）を使用することによって４℃で３０分間染色した。細胞を、ＦＡＣＳ ＢＤ－ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得した。ＳＴＡＴ－５Ｐの頻度はＦｌｏｗＪｏ（Ｖ１０）を用いて測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてプロットした。

【0272】

図３Ａ及び３Ｂ並びに表１５のデータは、ＰＤ１－ＩＬ７ｗｔ、完全に及び部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１、部分的にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１のＰＤ－１^＋ ＣＤ４細胞及びＰＤ－１を予め遮断したＣＤ４ Ｔ細胞に対する効力の違いを示している。ＰＤ１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞で測定された効力は、ＩＬ－７のＰＤ１依存性及び非依存性の送達の組み合わせを反映している。対照的に、ＰＤ１を予め遮断したＣＤ４ Ｔ細胞での効力測定は、ＰＤ１結合部位がすべてＰＤ－１結合を阻止するために占有されているため、ＩＬ－７のＰＤ１非依存的な送達を表している。

【0273】

表１５：健常なドナーのＰＤ－１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞及びＰＤ－１を予め遮断したＣＤ４ Ｔ細胞における、選択された変異体のＥＣ５０、シス活性、及び用量反応ＳＴＡＴ－５リン酸化の力価の倍率減少。

各ＰＤ１－ＩＬ７バリアントのＰＤ１依存性のＩＬ－７送達と非依存性のＩＬ－７送達との関係であるシス活性は、ＰＤ－１を予め遮断した細胞のＥＣ５０をＰＤ１^＋Ｔ細胞のＥＣ５０で割って表１５に算出した。これにより、細胞が同レベルのＩＬ－７Ｒａ／共通ガンマ鎖を発現しているとき、ＰＤ１－ＩＬ７コンストラクトのそれぞれについて、ＰＤ１依存的なＩＬ－７の送達の強さを測定することができる。

【0274】

ＰＤ１－ＩＬ７ｗｔをコントロールとして、天然型ＩＬ－７とＰＤ－１非依存性のＩＬ－７のＰＤ－１^－Ｔ細胞への送達の効力を示した。さらに表１５では、ＰＤ１－ＩＬ７バリアントのＥＣ５０をＰＤ１－ＩＬ７ｗｔのＥＣ５０で割ることにより、ＰＤ１－ＩＬ７バリアントとＰＤ１－ＩＬ７ｗｔの間のＥＣ５０倍率減少を算出した。このことは、ＩＬ－７Ｒａに対する親和性の低下により、ＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１の効力が低下していることを示している。

【0275】

ＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１のグリコシル化パターンはＰＤ－１^＋ Ｔ 細胞ではその活性に影響せず、部分的にグリコシル化されたバリアントは完全にグリコシル化されたバリアントと同等の効力を維持したが、ＰＤ１－ＩＬ７ｗｔの活性が２．７９倍減少したのと比較して、ＰＤ－１^－Ｔ細胞では活性は７７～１００倍減少し、高いシス活性を示した（図３Ａ及び表１５）。ＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１の完全に及び部分的にグリコシル化されたコンストラクトのデータについては、２つの異なるサンプルバッチのデータをプールした。一方のバッチを安定発現系（Ｐ１ＡＧ３７２４－１８３及びＰ１ＡＧ３７２５－１５３）を用いて、他方のバッチを一過性発現系（Ｐ１ＡＧ３７２４－０８３及びＰ１ＡＧ３７２５－０８３）を用いて生産した。実施例１．４で上述したように、異なるバッチは異なるグリコシル化レベルを示す。バッチ間の標準偏差の低さは、グリコシル化パターンがＩＬ７活性に影響しないことをさらに実証している。

【0276】

部分的にグリコシル化され、ＰＤ１－ＩＬ７ｗｔ及びＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１よりも効力が低く、かつ最大活性が減少しているＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は、ＰＤ－１^－ Ｔ細胞では実質的に不活性であり、ＰＤ－１による強力なシス媒介送達を実証している（図３Ｂ及び表１５）。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ試験で実証されたように、ＩＬ－７成分が減少し、したがってＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１の末梢シンクが減少するという点で有益である。非腫瘍担持ヒト化マウスにＰＤ１－ＩＬ７ｗｔ、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１、又は完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１のいずれかを２回皮下処理し、マウス血清中の薬物曝露量を測定するために、１回目と２回目の処理の両方の後、４時間後と７２時間後に採血した。完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ｗｔ及びＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１は処理後数時間で血清から速やかに消失するが、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ１８／ＶＡＲ２１は７２時間後にも血清中で検出可能であり、２回目の投与後に蓄積する（図４）。ＩＬ－７Ｒに対するＩＬ－７の親和性がさらに低下することには、より広い治療域及び抗薬物抗体による曝露損失を克服するための用量投与能力のようなさらなる利点がある可能性がある。

【0277】

実施例３．２ ＰＤ１－ＩＬ７ＶＡＲ２１と比較した、漸増用量の参照分子での治療時の活性化ＰＤ－１^＋及びＰＤ－１^－ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＬ－７Ｒシグナル伝達（ＳＴＡＴ５－Ｐ）
この実験では、ＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１に使用されたのと同じブロッキングＰＤ１バインダーにＩＬ－７バリアントを融合して生成されたＰＤ１－ＩＬ７参照分子５～１０のシス標的性とＳＴＡＴ－５Ｐシグナル伝達における効力とを、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１と比較した。この目的のために、前述のように単離、活性化、及び共培養したＰＤ１^＋及びＰＤ１^－（抗ＰＤ１前処理）ＣＤ４ Ｔ細胞について、細胞を漸増濃度の免疫標的化サイトカインに曝露した後、ＩＬ７Ｒシグナル伝達を測定した。

【0278】

参照分子５及び参照分子９は、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１よりも９．４倍及び７．３倍強力であるが、両参照分子ともＰＤ－１^－Ｔ細胞に対しても活性を示し、その活性はＰＤ－１^＋Ｔ細胞よりも２倍及び２．５倍低いだけであり、実施例３．２のＰＤ１－ＩＬ７ｗｔで観察されたのと同様に、ＩＬ－７バリアントのＰＤ－１非依存的な送達を示している。参考分子６及び参考分子１０のみが、ＰＤ－１^＋Ｔ細胞と比較して、ＰＤ－１^－Ｔ細胞に対してそれぞれ３２倍と２０倍の活性低下を示し、ＰＤ－１を介したＩＬ－７Ｒアゴニズムのシス送達を支持したが、完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１は３９倍の活性低下を示した（表１６、図５）。さらに、参考分子１０は完全にグリコシル化されたＰＤ１－ＩＬ７ ＶＡＲ２１よりも２．２倍効力が低い。

【0279】

表１６：健常なドナーのＰＤ－１^＋ ＣＤ４ Ｔ細胞及びＰＤ－１を予め遮断したＣＤ４ Ｔ細胞における、選択された変異体のＥＣ５０、シス活性、及び用量反応ＳＴＡＴ－５リン酸化の力価の倍率減少。

【0280】

前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例としてある程度詳細に説明されているが、説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2024537335000001.xml

【国際調査報告】