特表 2024-540290 ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを含むハイブリッド多価インフルエンザワクチン及びそれを使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを含むハイブリッド多価インフルエンザワクチン及びそれを使用する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/145 20060101AFI20241024BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20241024BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20241024BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/44 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 7/04 20060101ALN20241024BHJP

【ＦＩ】

A61K39/145

A61P37/04

A61K39/39

A61K9/127

A61K47/34

A61K47/28

A61K47/24

A61K47/18

A61P31/16

C07K14/11 ZNA

C12N9/24

C12N15/44

C12N15/56

C12N7/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024526564

(86)(22)【出願日】2022-11-04

(85)【翻訳文提出日】2024-05-17

(86)【国際出願番号】 EP2022080875

(87)【国際公開番号】W WO2023079113

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】63/276,247

(32)【優先日】2021-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ティモシー・アレファンティス

(72)【発明者】

【氏名】マリオ・バロ

(72)【発明者】

【氏名】サランヤ・シュリダー

(72)【発明者】

【氏名】トーステン・ヴォーゲル

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム・ワレン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB10

4B065AC20

4B065BA30

4B065CA24

4B065CA27

4B065CA45

4C076AA19

4C076AA24

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB27

4C076DD50

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C085AA04

4C085BA55

4C085CC04

4C085DD62

4C085EE06

4C085FF30

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むハイブリッド多価ワクチン又は免疫原性組成物が本明細書中で開示される。また、本ワクチン又は免疫原性組成物を使用する方法も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質と、
（ｉｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、１種類以上のリボ核酸分子と、
を含む、免疫原性組成物。

【請求項2】

（ｉ）における前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、組み換えインフルエンザウイルスタンパク質である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

（ｉ）における前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、不活性化インフルエンザウイルス（ＩＩＶ）中に存在する、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記１種類以上のリボ核酸分子がｍＲＮＡ分子である、請求項１～３の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

８種類を超えない（ｉ）におけるインフルエンザウイルスタンパク質と、８種類を超えないインフルエンザウイルスタンパク質をコードする（ｉｉ）におけるリボ核酸分子と、を含む、請求項１～４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

（ｉ）の前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類のインフルエンザウイルスタンパク質を含み；
（ｉｉ）の前記１種類以上のリボ核酸分子が、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、
請求項１～５の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

４種類を超えない（ｉ）におけるインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）における４種類を超えないインフルエンザウイルスタンパク質をコードするリボ核酸分子と、を含む、請求項１～６の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

８価の免疫原性組成物である、請求項１～７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

（ｉ）における前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が４種類の組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含み；
前記１種類以上のリボ核酸分子が、４種類のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする、
請求項１～８の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

（ｉ）における前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が４種類の組み換えインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み；
前記１種類以上のリボ核酸分子が、４種類のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードする、
請求項１～８の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

１６価免疫原性組成物である、請求項１～６の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

（ｃ）前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、
第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ１ ＨＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ３ ＨＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；及び
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質
を含み；
（ｄ）前記１種類以上のリボ核酸分子が、
第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ１ ＮＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ２ ＮＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；及び
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質
をコードする、
請求項１～６の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記Ｈ１ ＨＡが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｈ３ ＨＡが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｎ１ ＮＡが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｎ２ ＮＡが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記Ｈ１ ＨＡ及び前記Ｎ１ ＮＡが、同じＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡが、同じＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＨＡのそれぞれが、組み換えインフルエンザウイルスＨＡである、請求項１２～１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記１種類以上のリボ核酸分子が、４種類の全長インフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする、請求項１～９又は１１～１５の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

（ｃ）前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、
第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ１ ＮＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ２ ＮＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質
を含み；
（ｄ）前記１種類以上のリボ核酸分子が、
第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ１ ＨＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ３ ＨＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；及び
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質
をコードする、
請求項１～６の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

前記Ｎ１ ＮＡがＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｎ２ ＮＡがＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｈ１ ＨＡがＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡがＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、請求項１７に記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

前記Ｈ１ ＨＡ及び前記Ｎ１ ＮＡが、同じＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡ及び前記Ｎ２ ＮＡが、同じＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、請求項１８に記載の免疫原性組成物。

【請求項20】

前記第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質のそれぞれが、組み換えインフルエンザウイルスＮＡである、請求項１７～１９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

前記第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質のそれぞれが、４個の修飾された組み換え単量体ＮＡ分子を含む修飾された組み換え四量体インフルエンザウイルスＮＡであり、前記修飾された組み換え単量体ＮＡ分子のそれぞれが、前記インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域及び異種四量体化ドメインを含むが、前記インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てを欠き、宿主細胞で発現される場合に、前記４個の修飾された組み換え単量体ＮＡ分子が、修飾された組み換え四量体ＮＡを形成する、請求項２０に記載の免疫原性組成物。

【請求項22】

前記異種四量体化ドメインが、スタフィロテルムス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラチオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質からの四量体化ドメイン又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである、請求項２１に記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

前記第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質が、４種類の修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２を含む修飾された組み換え四量体Ｎ２ ＮＡであり、前記修飾された単量体インフルエンザウイルスＮ２のそれぞれが、
インフルエンザウイルスＮ２の頭部領域を含み、
前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２が、インフルエンザウイルスＮ２の、細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てを含有せず、前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２が、異種オリゴマー化ドメインを含まない、請求項２０に記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２が、前記インフルエンザウイルスＮ２の、アミノ酸１～７０、１～７１、１～７２、１～７３、１～７４、１～７５、１～７６、１～７７、１～７８、１～７９、１～８０、１～８１、１～８２、１～８３又は１～８４を欠く、請求項２３に記載の免疫原性組成物。

【請求項25】

前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質のうち少なくとも１つが、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有するインフルエンザウイルスＨＡタンパク質及び／又はインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み、及び／又は前記１種類以上のリボ核酸分子の少なくとも１つが、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有する１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、請求項１～２４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項26】

アジュバントをさらに含む、請求項１～２５の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項27】

前記アジュバントが、水中スクアレンアジュバント又はリポソームベースのアジュバントを含む、請求項２６に記載の免疫原性組成物。

【請求項28】

前記１種類以上のリボ核酸分子が、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～２７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項29】

前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドが、シュードウリジン、任意選択的にＮ１－メチルシュードウリジン、２’－フルオロリボヌクレオチド、２’－メトキシリボヌクレオチド及び／又はホスホロチオエート結合を含む、請求項２８に記載の免疫原性組成物。

【請求項30】

前記１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質が、培養される昆虫細胞においてバキュロウイルス発現系により産生される組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質である、請求項１～２９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項31】

前記インフルエンザウイルスＮＡタンパク質の１つ以上が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される組み換えインフルエンザウイルスＮＡである、請求項１～３０の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項32】

前記１種類以上のリボ核酸分子が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入される、請求項１～３１の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項33】

ＬＮＰ中に前記１種類以上のリボ核酸分子が封入され、アジュバントをさらに含まない、請求項１～３２の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項34】

同じＬＮＰ中に封入される少なくとも２種類のリボ核酸分子を含む、請求項１～３３の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項35】

同じＬＮＰ中に封入される少なくとも４種類のリボ核酸分子を含む、請求項１～３４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項36】

（ｉ）における前記インフルエンザウイルスタンパク質及び／又は（ｉｉ）における前記リボ核酸分子が、標準治療インフルエンザ株由来である、請求項１～３５の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項37】

前記ＬＮＰが、陽イオン性脂質、ポリエチレングリコール複合化（ＰＥＧ化）脂質、コレステロールに基づく脂質及びヘルパー脂質を含む、請求項３２～３６の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項38】

前記ＬＮＰが、
３５％～４５％のモル比の陽イオン性脂質、
０．２５％～２．７５％のモル比のＰＥＧ化脂質、
２５％～３５％のモル比のコレステロールに基づく脂質及び
２５％～３５％のモル比のヘルパー脂質
を含む、請求項３７に記載の免疫原性組成物。

【請求項39】

前記ＬＮＰが、
４０％のモル比の陽イオン性脂質、
１．５％のモル比のＰＥＧ化脂質、
２８．５％のモル比のコレステロールに基づく脂質及び
３０％のモル比のヘルパー脂質
を含む、請求項３８に記載の免疫原性組成物。

【請求項40】

前記陽イオン性脂質が、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０及びＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を含む群から選択される、請求項３７～３９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項41】

前記陽イオン性脂質がｃＫＫ－Ｅ１０である、請求項３７～４０の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項42】

前記ＰＥＧ化脂質がジミリストイル－ＰＥＧ２０００である、請求項３７～４１の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項43】

前記コレステロールに基づく脂質がコレステロールである、請求項３７～４２の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項44】

前記ヘルパー脂質がジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンである、請求項３７～４３の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項45】

前記ＬＮＰが、
４０％のモル比のｃＫＫ－Ｅ１０；
１．５％のモル比のジミリストイル－ＰＥＧ２０００；
２８．５％のモル比のコレステロール；及び
３０％のモル比のジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン
を含む、請求項３７～４４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項46】

前記ＬＮＰが、（ｉ）陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）ＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）コレステロールを含む、請求項３２～３７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項47】

前記ＬＮＰが、（ｉ）約２５％～約６５％のモル比の陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）約０．５％～約２．６％のモル比のＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール、（ｉｉｉ）約５％～約１５％のモル比のヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）約２０％～約６０％のモル比のコレステロール、例えばｉ）約４６．３％のモル比の陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）約１．６％のモル比のＰＥＧ化脂質としてのＡＬＣ－０１５９、ｉｉｉ）約９．４％のモル比のヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）約４２．７％のモル比のコレステロールなどを含む、請求項３２～３７又は４６の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項48】

（ｉ）における前記インフルエンザウイルスタンパク質のそれぞれが、前記免疫原性組成物中に、約０．１μｇ～約９０μｇの範囲の量、任意選択的に約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇなどの量で存在する、請求項１～４７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項49】

前記リボ核酸分子のそれぞれが、約０．１μｇ～約１５０μｇ、任意選択的に約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記免疫原性組成物中に存在する、請求項１～４８の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項50】

筋肉内注射用に処方される、実施形態１～４９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項51】

請求項１～５０の何れか１項に記載の免疫原性組成物と、医薬担体と、を含む、ワクチン。

【請求項52】

請求項５１に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む、インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与する方法。

【請求項53】

前記対象におけるインフルエンザウイルス感染を予防する、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記対象において防御免疫反応を生じさせる、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

前記防御免疫反応が、ＨＡ抗体応答及び／又はＮＡ抗体応答を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記対象が、ヒトである、請求項５２～５５の何れか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記ワクチンが、筋肉内に、皮内に、皮下に、静脈内に、鼻腔内に、吸入により、又は腹腔内に、投与される、請求項５２～５６の何れか１項に記載の方法。

【請求項58】

季節性インフルエンザ株及びパンデミックインフルエンザ株の何れか又は両方によって引き起こされる疾患を処置又は予防する、請求項５２～５７の何れか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記対象がヒトであり、前記ヒトが、６カ月齢以上、１８歳未満、少なくとも６カ月齢及び１８歳未満、少なくとも１８歳及び６５歳未満、少なくとも６カ月齢及び５歳未満、少なくとも５歳及び６５歳未満、少なくとも６０歳又は少なくとも６５歳である、請求項５２～５８の何れか１項に記載の方法。

【請求項60】

請求項５１に記載のワクチンの予防的有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を軽減する方法。

【請求項61】

対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化する方法であって、請求項５１に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含み、前記ワクチンが、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン効力を約５％～約１００％の範囲、例えば少なくとも約２０％などの量、向上させる、方法。

【請求項62】

前記標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物が、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からの不活性化インフルエンザウイルスを含む不活性化インフルエンザウイルス組成物である、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物が、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からの組み換えインフルエンザウイルスＨＡを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

２～６週間、任意選択的に４週間の間隔で、２用量の前記ワクチンを前記対象に投与することを含む、請求項５２～６３の何れか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、その全体の内容が本明細書中で参照により組み込まれる２０２１年１１月５日提出の米国仮出願第６３／２７６，２４７号明細書の優先権を主張し、その提出日に依存する

【0002】

配列リスト
本願は、ＸＭＬ方式で電子提出された配列リストを含有し、これはその全体において参照により本明細書によって組み込まれる。２０２２年１０月１４日作成の前記ＸＭＬのコピーの名称は、０１７１＿００６８＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌであり、サイズは２，４０８バイトである。

【0003】

本開示の分野
インフルエンザウイルス抗原及びインフルエンザウイルス抗原をコードするリボ核酸分子の両方を含むインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及びインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）の両方に対する免疫を誘導するためのハイブリッド多価インフルエンザワクチン又は免疫原性組成物並びにハイブリッド多価インフルエンザワクチン又は免疫原性組成物を使用する方法が本明細書中で開示される。

【背景技術】

【0004】

本開示の背景
インフルエンザは、主に鼻、咽喉及び気管支を含む上気道を攻撃し、稀に肺も攻撃するウイルスによって引き起こされる。感染は通常、約１週間続く。それは、高熱、筋肉痛、頭痛及び重度の倦怠感、乾性咳嗽、咽頭痛及び鼻炎の突然の発症を特徴とする。殆どの者が、如何なる医学的処置も必要とせずに、１～２週間以内に回復する。しかしながら、幼い子供、高齢者及び肺疾患、糖尿病、癌、腎臓又は心臓の問題などの医学的状態に罹患している者においては、インフルエンザは深刻なリスクをもたらす。これらの者では、感染が基礎疾患、肺炎及び死亡の重度の合併症をもたらし得るが、健康な成人及び年長の小児であっても同様に影響を受け得る。毎年の季節性インフルエンザの流行により、世界中で毎年、３００万～５００万人が重症化し、２５０，０００～５００，０００人が死亡すると考えられている。

【0005】

インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。インフルエンザウイルスには、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型及びインフルエンザＣ型と呼ばれる３つの主なサブタイプがある。インフルエンザビリオンは、以下のタンパク質をコードするセグメント化されたマイナスセンスＲＮＡゲノムを含有する：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクス（Ｍ１）、プロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１及びＭ２は膜結合型であるが、一方でＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＳ２はヌクレオカプシド結合型タンパク質である。ＨＡ及びＮＡタンパク質はエンベロープ糖タンパク質であり、それぞれ、細胞へのウイルスの付着及びウイルス粒子の侵入、並びに細胞からの放出に主に関与している。

【0006】

特定の既知の認可されたインフルエンザワクチン組成物は、全ビリオン、若しくは脂質を溶解する薬剤で処理したビリオン（「スプリット」ワクチン）、細胞培養において発現された糖タンパク質の精製物（「サブユニットワクチン」）を含有する不活性化ワクチン又は弱毒生ワクチンである。ＲＮＡ／ＤＮＡに基づくもの、ウイルスベクターに基づくものなどの他のタイプのワクチンが開発されている。これらのワクチンは、一部、ＨＡなどのインフルエンザ抗原に対する抗体の産生を誘導することによって防御をもたらす。抗原ドリフトとも呼ばれる突然変異によるインフルエンザウイルスの抗原進化の結果、ＨＡ及び、比較的規模は小さいがＮＡにおいて修飾が起こる。従って、ＨＡ及びＮＡを含むインフルエンザの主要な抗原のアミノ酸配列は、特定の群、サブタイプ及び／又は株にわたって変動性が大きい。

【0007】

従って、利用可能なワクチンは、同一又は交差反応性エピトープを含む表面糖タンパク質を有する株のみを防御し得る。より広範な抗原スペクトルを提供するために、従来のワクチンは、Ａ型及びＢ型インフルエンザの両方からの株を含む、いくつかの異なるウイルス株からの構成成分を含む。現在の季節性インフルエンザワクチンでの使用のための株の選択は、抗原ドリフトを把握し、急速に進化するウイルス株に対抗するために毎年見直され、世界保健機構（ＷＨＯ）の推奨に基づいている。これらの推奨は国際的な疫学的観察を反映している。

【0008】

製造用に使用される多収性ウイルス株を作製するために使用される再集合手順ゆえに、ワクチン産生のための現在のインフルエンザウイルスシードは、適切なＨＡ抗原を有することが示されなければならな。しかし、現在、インフルエンザワクチン中のＮＡ含量に対する要件又は制限はない。ワクチン中のＮＡレベルが非常にばらついていることを示す証拠がある。Ｋｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｒｔｈｅｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ａｆｔｅｒ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｐｒｉｍｅｄ ａｎｄ Ｕｎｐｒｉｍｅｄ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ１９８０；２９（３）：９６６－９７１は、異なるロットについて、ＮＡ特異的な活性がおよそ４０倍の範囲で変動し得ることを報告した。Ｋｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．も、６カ月の保管中のＮＡ活性の急速な低下に言及した。結果として、ＨＡ応答と比較して（抗体陽転率６４％）、ＮＡに対する抗体応答の頻度は低かった（平均抗体陽転率１８％）。

【0009】

さらに、ＮＡ特異的な抗体がヒトにおける疾患に対する抵抗性と相関することを示す証拠が増えているものの、現在のワクチン接種ストラテジーは、組み換えＨＡタンパク質を含むＦＬＵＢＬＯＫ（登録商標）４価ワクチンの場合のように、ほぼ完全にＨＡ抗原に又は完全にＨＡ抗原に焦点を当てている。さらに、特にＨＡに対するデータと比較した場合、インフルエンザ感染中のＮＡに対する免疫学的応答に関して利用可能なデータは限られている（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｒｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ Ａｇｅ－ ａｎｄ Ｓｕｂｔｙｐｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ ａｆｔｅｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２０２０；９４（７）：ｅ０１３８５－１９）。インフルエンザウイルスは天然に、ＨＡと比較して、ウイルス表面上に含有するＮＡが約１０分の１であり、ＨＡ抗原を濃縮するための確立された工程は、その酵素活性のある及び四量体の立体構造でＮＡを維持するのに適していない可能性がある。従って、現在利用可能な不活性化インフルエンザウイルスワクチンがＮＡを含有し得る一方で、量及び質が広く変動し、均一ではない。さらに、ＮＡは、ＨＡと一緒に免疫系に提示された場合に、免疫的にサブドミナント（ｉｍｍｕｎｏｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）であることが記載されている（Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ２０１９；１９：３８３－３９７）。言い換えれば、ＨＡは、ＮＡを上回り免疫優勢であることが知られている。同文献。従来のインフルエンザワクチンで観察されるこの免疫優勢の現象は、依然として、特にＨＡなどの免疫優勢のタンパク質を含有する多価ワクチンについて、及び／又はワクチンにおける価数が増加する場合、複数の抗原又はエピトープに対する多価免疫反応を首尾よく達成し得る多価ワクチンの開発に対する障害になっている。Ｗｏｏｄｒｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｅｌｐ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｒａｒｅ－Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ＣＥＬＬ ＲＥＰＯＲＴＳ ２０１８；２５：３２１～２７。

【0010】

従って、ＨＡ及びＮＡの両方に対するロバストな免疫反応を誘導することにより循環するインフルエンザ株に対する防御増強及び／又は防御のより広い幅を付与し得るインフルエンザウイルスＨＡ又はインフルエンザウイルスＮＡをコードする少なくとも１種類のｍＲＮＡ分子を含むさらなる抗原でワクチン中の標準治療インフルエンザ株を補う能力が所望される。しかし、インフルエンザタンパク質及びそれをコードするリボ核酸の両方を含む、及びＮＡ及び／又はＨＡ免疫反応を強化し、特に現在利用可能な標準治療インフルエンザワクチンと比較した場合に、循環するインフルエンザ株に対する防御増強及び／又は防御のより広い幅を付与するハイブリッド多価ワクチン組成物になるようにインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザウイルスＮＡを組み合わせることは、挑戦的な課題であり得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示は、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチン又は免疫原性組成物を提供する。

【0012】

特定の実施形態では、この１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質は、組み換えインフルエンザウイルスタンパク質であり、特定の実施形態では、この１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質は、不活性化インフルエンザウイルス（ＩＩＶ）において存在する。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子はｍＲＮＡ分子である。従って、特定の実施形態では、（ｉ）組み換えＨＡタンパク質、組み換えＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上の組み換えインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のｍＲＮＡ分子と、を含むワクチン又は免疫原性組成物が本明細書中で開示される。

【0013】

本開示の一態様では、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）における８種類を超えない、例えば８種類など、又は４種類を超えない、例えば４種類など、のインフルエンザウイルスタンパク質と、８種類を超えない、例えば８種類など、又は４種類を超えない、例えば４種類など、のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする（ｉｉ）におけるリボ核酸分子と、を含む。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、８価ワクチン又は免疫原性組成物であり、特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、１６価ワクチン又は免疫原性組成物である。他の多価ワクチン又は免疫原性組成物も本明細書中に記載される。

【0014】

本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物の様々な実施形態では、（ｉ）の１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする（ｉｉ）の１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。

【0015】

特定の実施形態では、（ｉ）における１種類以上のインフルエンザタンパク質は、４種類の組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含み、１種類以上のリボ核酸分子は、４種類のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、４種類の全長インフルエンザウイルスＮＡタンパク質（例えば野生型又は機械学習ＮＡ）をコードする。特定の実施形態では、（ｉ）における１種類以上のインフルエンザタンパク質は、４種類の組み換えインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み、１種類以上のリボ核酸分子は、４種類のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードする。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、４種類の全長インフルエンザウイルスＨＡタンパク質（例えば、野生型又は機械学習ＮＡ）をコードする。

【0016】

特定の実施形態では、（ｉ）における１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質は、第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（ここで第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ１ ＨＡである）；第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（ここで第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ３ ＨＡである）；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含み、特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（ここで第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ１ ＮＡである）；第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（ここで第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ２ ＮＡである）；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする。特定の実施形態では、第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質のそれぞれは、組み換えインフルエンザウイルスＨＡである。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、４種類の全長インフルエンザウイルスＮＡタンパク質（例えば、野生型又は機械学習ＮＡ）をコードする。

【0017】

（ｉ）における１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（ここで、第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ１ ＮＡである）；第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（ここで、第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ２ ＮＡである）；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含む実施形態も本明細書中で開示され、特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸が、第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（ここで第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ１ ＨＡである）；第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（ここで第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ３ ＨＡである）；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードする。

【0018】

特定の実施形態では、第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質のそれぞれは、組み換えインフルエンザウイルスＮＡである。特定の実施形態では、第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質のそれぞれは、修飾された組み換えインフルエンザウイルスＮＡである。

【0019】

本明細書中で開示される特定の実施形態では、１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも１つは、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有するインフルエンザウイルスＨＡタンパク質及び／又はインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み、特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子の少なくとも１つは、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有する１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする。

【0020】

特定の実施形態では、Ｈ１ ＨＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、Ｈ３ ＨＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来であり、Ｎ１ ＮＡは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又はＮ２ ＮＡは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である。特定の実施形態では、Ｈ１ ＨＡ及びＮ１ ＮＡは、同じＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又はＨ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡは、同じＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である。

【0021】

特定の実施形態によれば、本ワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバント、例えば水中スクアレンアジュバント又はリポソームに基づくアジュバントをさらに含む。特定の実施形態では、この１種類以上のリボ核酸分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入され、本ワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含まない。

【0022】

特定の実施形態では、この１種類以上のリボ核酸分子は、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含み、特定の実施形態では、この少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドは、シュードウリジン、特にＮ１－メチルシュードウリジン、２’－フルオロリボヌクレオチド、２’－メトキシリボヌクレオチド及び／又はホスホロチオエート結合を含む。

【0023】

１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質が組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質である特定の実施形態では、組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、培養される昆虫細胞においてバキュロウイルス発現系により産生され、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質が組み換えインフルエンザウイルスＮＡタンパク質である特定の実施形態では、組み換えインフルエンザウイルスＮＡタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される。

【0024】

特定の実施形態では、（ｉ）におけるインフルエンザウイルスタンパク質及び／又は（ｉｉ）におけるリボ核酸分子は、標準治療インフルエンザ株由来である。

【0025】

本明細書中で開示される様々な実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、ＬＮＰ中に封入され、特定の実施形態では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質、ポリエチレングリコール複合化（ＰＥＧ化）脂質、コレステロールに基づく脂質及びヘルパー脂質を含む。特定の態様では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、少なくとも２種類、例えば少なくとも４種類の、同じＬＮＰ中に封入されるリボ核酸分子を含む。特定の実施形態では、ＬＮＰは、３５％～４５％のモル比の、例えば４０％などのモル比の陽イオン性脂質；０．２５％～２．７５％のモル比の、例えば１．５％などのモル比のＰＥＧ化脂質；２５％～３５％のモル比の、例えば２８．５％などのモル比のコレステロールに基づく脂質；及び２５％～３５％のモル比の、例えば３０％などのモル比のヘルパー脂質を含み、これらのモル比は全て、ＬＮＰの総脂質含量に対するものである。

【0026】

特定の実施形態では、陽イオン性脂質は、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０及びＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を含む群から選択され、例えばｃＫＫ－Ｅ１０などであり、特定の実施形態では、ＰＥＧ化脂質はジミリストイル－ＰＥＧ２０００である。特定の実施形態では、コレステロールに基づく脂質は、コレステロールであり、ヘルパー脂質は、ジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンである。本明細書中で開示される特定の実施形態では、ＬＮＰは、例えば４０％のモル比のｃＫＫ－Ｅ１０、例えば１．５％のモル比のジミリストイル－ＰＥＧ２０００、例えば２８．５％のモル比のコレステロール及び例えば３０％のモル比のジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含む。

【0027】

特定の実施形態では、ＬＮＰは（ｉ）陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）ＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール（例えばＡＬＣ－０１５９）、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）コレステロールを含む。特定の実施形態では、ＬＮＰは、（ｉ）約２５％～約６５％、例えば約４６．３％のモル比の、陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５；（ｉｉ）約０．５％～約２．６％、例えば１．６％のモル比の、ＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール（例えばＡＬＣ－０１５９）；（ｉｉｉ）約５％～約１５％、例えば９．４％のモル比の、ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ；及び（ｉｖ）約２０％～約６０％、例えば４２．７％のモル比のコレステロールを含む。

【0028】

本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物の特定の実施形態では、（ｉ）におけるインフルエンザウイルスタンパク質のそれぞれは、約０．１μｇ～約９０μｇ、例えば約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇなどの範囲の量で本組成物中に存在し、特定の実施形態では、リボ核酸分子のそれぞれは、約０．１μｇ～約１５０μｇ、例えば約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇなどの範囲の量で本組成物中に存在する。特定の実施形態では、本組成物は、筋肉内注射用に処方される。

【0029】

別の態様では、本明細書中で開示される免疫原性組成物と、医薬担体と、を含むワクチンが本明細書中で開示される。

【0030】

本開示の別の態様は、対象にインフルエンザウイルスに対して免疫付与する方法を対象とし、この方法は、本明細書中で開示されるようなワクチンの免疫学的有効量を対象に投与することを含む。インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与する方法での使用のための本明細書中で開示されるようなワクチンも本明細書中で開示される。インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与する方法での使用のためのワクチンの製造のための本明細書中で開示されるような免疫原性組成物も本明細書中で開示される。特定の実施形態では、本方法又は使用は、対象におけるインフルエンザウイルス感染を予防し、特定の実施形態では、本方法又は使用は、対象において防御免疫反応、例えばＨＡ抗体応答及び／又はＮＡ抗体応答などを生じさせる。特定の実施形態では、対象はヒトであり、特定の実施形態では、ワクチンは、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、鼻腔内、吸入により、又は腹腔内に投与されるか又は投与されるように調製される。

【0031】

本開示の別の態様は、インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を軽減する方法を対象とし、本方法は、本明細書中で開示されるワクチンの予防的有効量を対象に投与することを含む。インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を軽減する方法での使用のための本明細書中で開示されるようなワクチンも開示される。インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を軽減する方法での使用のためのワクチンの製造のための本明細書中で開示されるような免疫原性組成物も開示される。

【0032】

本開示の別の態様は、対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化する方法を対象とし、本方法は、本明細書中で開示されるワクチンの免疫学的有効量を対象に投与することを含み、本ワクチンは、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン効力を約５％～約１００％、例えば少なくとも約２０％など又は約４０％～約８０％、例えば約４０％～約６０％などの範囲の量、向上させる。対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化する方法での使用のための本明細書中で開示されるようなワクチンも開示され、この方法は、本明細書中で開示されるワクチンの免疫学的有効量を対象に投与することを含み、このワクチンは、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン効力を約５％～約１００％、例えば少なくとも約２０％など又は約４０％～約８０％、例えば約４０％～約６０％などの範囲の量、向上させる。対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化する方法での使用のためのワクチンの製造のための本明細書中で開示されるような免疫原性組成物も開示され、この方法は、本明細書中で開示されるワクチンの免疫学的有効量を対象に投与することを含み、このワクチンは、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン効力を、約５％～約１００％、例えば少なくとも約２０％など又は約４０％～約８０％、例えば約４０％～約６０％などの範囲の量、向上させる。特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からの不活性化インフルエンザウイルスを含む不活性化インフルエンザウイルス組成物である。特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からの組み換えインフルエンザウイルスＨＡを含む。

【0033】

様々な実施形態では、本明細書中で開示される方法又は使用及び組成物は、季節性インフルエンザ株及びパンデミックインフルエンザ株の何れか又は両方によって引き起こされる疾患を処置又は予防する。本明細書中で開示される方法又は使用の特定の実施形態では、対象はヒトであり、ヒトは、６カ月齢以上、１８歳未満、少なくとも６カ月齢及び１８歳未満、少なくとも１８歳及び６５歳未満、少なくとも６カ月齢及び５歳未満、少なくとも５歳及び６５歳未満、少なくとも６０歳又は少なくとも６５歳である。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法又は使用は、２～６週間の間隔、例えば４週間の間隔などで、２用量のワクチンを対象に投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1A】図１Ａは、実施例３に記載のようなハイブリッド８価ワクチン組成物の投与後の、Ｎ１インフルエンザウイルス株及びＴｅｔ標準物に対する第４２日でのフェレット血清におけるＮ１異種パネル結合レベルを示すグラフである。

【図1B】図１Ｂは、実施例３に記載のようなハイブリッド８価ワクチン組成物の投与後の、ＮＢインフルエンザウイルス株及びＴｅｔ標準物に対する第４２日でのフェレット血清におけるＮＢ相同パネル結合レベルを示すグラフである。

【図1C】図１Ｃは、実施例３に記載のようなハイブリッド８価ワクチン組成物の投与後の、Ｎ２インフルエンザウイルス株及びＴｅｔ標準物に対する第４２日でのフェレット血清におけるＮ２異種パネル結合レベルを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0035】

いくつかのウイルスは、それらのエンベロープ糖タンパク質成分の構造を実質的に変化させ得る。例えば、インフルエンザウイルスは、そのエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列を絶えず変化させる。主要なアミノ酸変異（抗原シフト）又は軽微な変異（抗原ドリフト）の何れかが、新しいエピトープを生じさせ得、ウイルスが免疫系を回避することを可能にする。抗原変異は、インフルエンザの流行が繰り返されることが主な原因である。サブタイプ（例えばＨ１又はＨ３）内の抗原変異体が出現し、優勢なウイルスとして徐々に選択される一方で、先行するウイルスは、集団において生じる特異的抗体によって抑制される。一般に、１つの変異体に対する抗体の中和は、連続的に変異体が生じるにつれて、効果が次第に低下する。サブタイプ内の変異体に対する免疫反応は、宿主の以前の経験に依存し得る。

【0036】

ＨＡ及びＮＡはかなり異なって進化する。例えば、ＨＡに対する遺伝子を含む、インフルエンザウイルスの全ての遺伝子に対して、サイレントヌクレオチド置換の速度は、コードヌクレオチド置換の速度よりも速いことが示されている（Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ． Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ，ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ ＲＥＶＳ．１９９２；５６（１）：１５２－１７９）。しかし、ＨＡは、内部タンパク質よりもはるかに高いコード変化速度を有する。他の遺伝子と比較した場合にＨＡ遺伝子におけるコードヌクレオチド変化の速度が速いことは、免疫選択がその進化における重要な因子であるという証拠として採用されている（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ，Ｂ，ａｎｄ Ｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ，ＳＣＩＥＮＣＥ１９８２；２１５（４５３９）：１４６８－７４）。あらゆる非特異的立体障害を排除するために再集合抗原を用いて、Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅらは、１０年間にわたってヒトから単離した疫学的に重要なＨＡ及びＮＡ抗原の進化速度を研究し、ＨＡがＮＡよりも急速に進化することを見出した（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｐａｒａｔｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＮＡＳ １９９０；８７（２）：７８６－７９０）。これは、Ａ型Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ウイルスの両方で示され、より最近の株を用いたその後の実験によって確認されている。進化速度が明らかに異なる理由は不明であるが、ＨＡに対する抗体がウイルスを中和し、感染を防ぐという事実に起因し得る。これにより、部分的に免疫性の集団においてそれ自身維持されるように、ＨＡにより大きな選択圧がかかり得る。従って、ＮＡは、ＨＡと比較した場合、より緩やかな抗原ドリフトを受けるので、ＨＡ及びＮＡの両方を含むワクチン又は免疫原性組成物は、抗原ドリフトされたＨＡ抗原を含有するインフルエンザの株に対する（ＮＡ抗体の形態での）より広範な防御をもたらし得る。

【0037】

インフルエンザウイルスは天然に、ＨＡと比較して、ウイルス表面上に含有するＮＡが約１０分の１であるので、及びＨＡ抗原を濃縮するための確立された工程はその酵素的に活性のある及び四量体の立体構造でＮＡを維持することに適していない可能性があるので、不活性化ウイルスワクチンなどのワクチン組成物中で検出可能なＮＡの量は、かなりばらつきがあり得る。従って、本明細書中で開示されるようなワクチン又は免疫原性組成物への組み換えＮＡ又はＮＡをコードするｍＲＮＡの添加により、ワクチン又は免疫原性組成物中に含有されるＮＡの量を超えてより良好な制御が可能になり得る。組み換えによるか又はＮＡをコードするｍＲＮＡを通じた安定なＮＡの作製及びそれをＨＡ抗原、例えば組み換えにより産生されたＨＡ抗原又はＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡなど、に添加することによって、現在利用可能なワクチンと比較した場合、本ワクチン又は免疫原性組成物を受容する対象においてＨＡ及びＮＡ免疫反応の両方のより良好な釣り合わせが可能になり、次に、循環するインフルエンザ株に対して、防御が増強され得、及び／又は防御の幅が広がり得る。

【0038】

従って、例えばインフルエンザウイルスＨＡ（例えば、組み換えＨＡ）及び１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸（例えばｍＲＮＡ）分子を含むハイブリッド多価インフルエンザワクチン組成物を含め、１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ又はＮＡをコードする１種類以上のリボ核酸に加えてインフルエンザウイルスＨＡ又はＮＡを含むハイブリッド多価インフルエンザワクチン又は免疫原性組成物が本明細書中で開示される。

【0039】

定義
本開示をより容易に理解するために、ある一定の用語を最初に以下で定義する。本明細書を通して、以下の用語及び他の用語のさらなる定義を記載し得る。以下に記載する用語の定義が、参照により組み込まれる出願又は特許中の定義と矛盾する場合、その用語の意味は、本出願に記載の定義を使用して理解されるべきである。

【0040】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別段示されない限り、複数の参照物を含む。従って、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されるタイプの１つ以上の方法及び／又は段階を含み、及び／又はそれは本開示などを読めば当業者にとって明らかになるであろう。

【0041】

請求項の要素を変更するための請求項における「第１の」、「第２の」、「第３の」などの序数用語の使用は、それ自体、１つの請求項要素の別の請求項要素に対する重要度、優先度若しくは順序、又は方法の操作が実行される時間的順序を意味するものではなく、単に、請求項要素を区別するために、ある名称を有するある１つの請求項要素を、同じ名称を有する別の請求項要素から区別する（但し、序数用語の使用のための）ラベルとして使用される。

【0042】

アジュバント：本明細書中で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ワクチン又は免疫原性組成物の抗原成分に対する免疫反応を増強するために使用され得る物質又は物質の組み合わせを指す。

【0043】

抗原：本明細書中で使用される場合、「抗原」という用語は、生物に曝露又は投与された場合に、免疫反応を誘発する薬剤；及び／又は（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示された場合）又は抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生された）に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、生物において、液性反応（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発し；代替的に又は追加的に、いくつかの実施形態では、抗原は、生物において、細胞性反応（例えば、受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞が関与する）を誘発する。当業者であれば、特定の抗原が、標的生物（例えば、マウス、フェレット、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つ以上のメンバーにおいて免疫反応を誘発し得るが、標的生物種の全てのメンバーで誘発し得るわけではないことは、理解されよう。いくつかの実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫反応を誘発する。いくつかの実施形態では、抗原は、抗体及び／又はＴ細胞受容体に結合し、生物において特定の生理学的反応を誘導することもあれば又は誘導しないこともある。いくつかの実施形態では、例えば、抗原はインビトロで抗体及び／又はＴ細胞受容体に結合し得、これは、そのような相互作用がインビボで生じるか否かにかかわらない。いくつかの実施形態では、抗原は、特定の液性又は細胞性免疫の産物と反応し、そのような産物には異種免疫原によって誘導されるものも含まれる。抗原は、本明細書中に記載のようなＮＡ及びＨＡの形態を含む。

【0044】

およそ：本明細書中で使用される場合、１つ以上の対象の値に適用される場合、「およそ」又は「約」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。いくつかの実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、記載された基準値のどちらの方向でも（それより大きい、又はそれより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満に入る値の範囲を指す（そのような数があり得る値の１００％を超える場合を除く）。

【0045】

担体：本明細書中で使用される場合、「担体」という用語は、組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。いくつかの例示的な実施形態では、担体には、例えば、水及び油、例えば石油、動物油、植物油又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの滅菌液体が含まれ得る。いくつかの実施形態では、担体は、１つ以上の固体成分であるか、又はそれを含む。

【0046】

エピトープ：本明細書中で使用される場合、「エピトープ」という用語には、免疫グロブリン（例えば、抗体又は受容体）結合成分によって、全体的又は部分的に、特異的に認識される何らかの部分が含まれる。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子又は化学基から構成される。いくつかの実施形態では、そのような化学原子又は化学基は、抗原が関連する三次元構造をとるときに表面に露出される。いくつかの実施形態では、そのような化学原子又は化学基は、抗原がそのような構造をとるとき、空間内で物理的に互いに近接する。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかのそのような化学原子又は化学基は、抗原が代替的構造をとる（例えば、線状化される）とき、互いから物理的に離される。

【0047】

賦形剤：本明細書中で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の一貫性又は安定化効果を付与するか、又はそれに寄与するために、医薬組成物に含まれ得る非治療薬を指す。好適な医薬品賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ソルビトール、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

【0048】

Ｈ１：本明細書中で使用される場合、「Ｈ１」は、インフルエンザウイルスサブタイプ１ ヘマグルチニン（ＨＡ）を指す。Ａ型インフルエンザウイルスは、群１及び２にさらに分けられる。群１及び２はさらに、ウイルス表面の２つのタンパク質ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の配列に基づくウイルスの分類を指すサブタイプに分類される。現在、１８種類のＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）が認められている。従って、Ｈ１は、Ｈ２～Ｈ１８を含む他のＨＡサブタイプとは異なる。

【0049】

Ｈ３：本明細書中で使用される場合、「Ｈ３」は、インフルエンザウイルスサブタイプ３ＨＡを指す。従って、Ｈ３は、Ｈ１、Ｈ２及びＨ４～Ｈ１８を含め、他のＨＡサブタイプとは異なる。

【0050】

免疫反応：本明細書中で使用される場合、「免疫反応」という用語は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ又は多形核球などの免疫系の細胞の、抗原、免疫原又はワクチンなどの刺激に対する反応を指す。免疫反応は、例えば、インターフェロン又はサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御反応に関与する身体のあらゆる細胞を含み得る。免疫反応としては、自然免疫反応及び／又は適応免疫反応が挙げられるが限定されない。免疫反応を測定する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞又はＴ細胞など）の増殖及び／又は活性の測定、サイトカイン又はケモカインの分泌の測定、炎症の測定、抗体産生の測定などが挙げられる。抗体反応又は液性反応は、抗体が産生される免疫反応である。「細胞性免疫反応」は、Ｔ細胞及び／又は他の白血球が介在するものである。

【0051】

免疫原：本明細書中で使用される場合、「免疫原」又は「免疫原性」という用語は、適切な条件下で、動物に注入又は吸収される組成物を含む、動物における抗体の産生又はＴ細胞反応などの免疫反応を刺激することが可能な、化合物、組成物又は物質を指す。本明細書中で使用される場合、「免疫原性組成物」という用語は、防御免疫反応であってもよいし又はなくてもよい免疫反応を生じる組成物を指す。本明細書中で使用される場合、「免疫する」とは、感染性疾患（例えばインフルエンザ）に対する防御免疫反応を対象に誘導することを意味する。

【0052】

免疫学的有効量：本明細書中で使用される場合、「免疫学的有効量」という用語は、対象に免疫付与するのに十分な量を意味する。

【0053】

いくつかの実施形態では：本明細書中で使用される場合、「いくつかの実施形態では」という用語は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、本開示の全ての態様の実施形態を指す。

【0054】

機械学習：本明細書中で使用される場合、「機械学習」という用語は、経験を通して及び／又はデータの使用によって自動的に改善するアルゴリズムの使用を指す。機械学習は、予測モデルを通して候補抗原を選択するように設計されたアルゴリズムの使用を含む、データの予測を可能にするためのインフルエンザ抗原性のモデルなどの予測モデルの構築を含み得る。標的株を同定し得、次に選択アルゴリズムを構築し得る。機械学習アルゴリズム及び方法の例は、例えば、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）及び国際公開第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）に見出すことができ、これらの両文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。機械学習にはまた、本明細書中で使用される場合、データを分析し解釈するための計算ツール、例えば、系統発生解析などのバイオインフォマティクス解析の適用も含まれ得る。同様に、「機械学習インフルエンザウイルスＨＡ」は、機械学習により同定されたか又は設計されたインフルエンザウイルスＨＡを示し、「機械学習インフルエンザウイルスＮＡ」は、機械学習により同定されたか又は設計されたインフルエンザウイルスＮＡを示す。「機械学習モデル」は、候補抗原などのデータを予測するために、経験を通して、及び／又はデータの使用によって、自動的に改善するアルゴリズムを使用するモデルを示す。

【0055】

修飾される：本明細書中で使用される場合、修飾されたＨＡ又はＮＡなどの「修飾された」という用語は、タンパク質又は核酸の野生型形態と比較した場合に異なるアミノ酸又は核酸配列を有する何らかのＨＡ又はＮＡタンパク質又は核酸を指す。例えば、修飾されたインフルエンザＮＡは、野生型ＮＡタンパク質又は核酸配列とは異なるアミノ酸又は核酸配列を有するインフルエンザＮＡを指す。修飾されたインフルエンザＮＡは、野生型インフルエンザＮＡと比較して、１個以上のアミノ酸欠失及び／又は置換を含み得る。

【0056】

単量体のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ：野生型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、４個の同一である単量体の四量体である。野生型インフルエンザＮＡにおける各ＮＡ単量体は、４個の異なる構造ドメイン：酵素性頭部領域、ストーク領域、膜貫通領域及び細胞質尾部からなる。本明細書中で使用される場合、「単量体インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ」という用語は、四量体ＮＡを形成するために３個の他のＮＡ単量体と組み合わせ得るＮＡ単量体を指す。本明細書中に記載のように、修飾された単量体インフルエンザウイルスノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域を含み得るが、異種四量体化ドメイン又はその分画を含み、及び／又細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域のうち１つ以上の少なくとも一部を欠く。

【0057】

Ｎ１：本明細書中で使用される場合、「Ｎ１」は、インフルエンザウイルスサブタイプ１ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を指す。Ａ型インフルエンザウイルスは、群１及び２に分類される。群１及び２はさらにサブタイプに分類され、これは、ウイルスの表面上の２つのタンパク質、ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の配列に基づくウイルスの分類を指す。現在、１１種類のＮＡサブタイプ（Ｎ１～Ｎ１１）が認められている。従って、Ｎ１は、Ｎ２～Ｎ１１を含む他のＮＡサブタイプとは異なる。Ｎ２：本明細書中で使用される場合、「Ｎ２」は、インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を指す。従って、Ｎ２は、Ｎ１及びＮ３～Ｎ１１を含む他のＮＡサブタイプとは異なる。

【0058】

インフルエンザＢ株は、２つの系統：Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）に分類される。

【0059】

パンデミック株：「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団などの対象集団のパンデミック感染を引き起こしたか、又は引き起こす能力を有するものである。いくつかの実施形態では、パンデミック株は、パンデミック感染を引き起こしている。いくつかの実施形態では、そのようなパンデミック感染は、複数の地域にわたるエピデミック感染を含み、いくつかの実施形態では、パンデミック感染は、感染が通常それらの間で伝わることがないように、（例えば、山によって、水域によって、別個の大陸の一部としてなど）互いに離れている地域にわたる感染を含む。

【0060】

予防：「予防」という用語は、本明細書中で使用される場合、特定の疾患、障害又は状態（例えば、インフルエンザウイルスによる感染）の１つ以上の症状の、予防、疾患発現の回避、発症の遅延、及び／又は頻度及び／若しくは重症度の低減を指す。いくつかの実施形態では、予防は、集団ベースで評価され、疾患、障害又は状態の１つ以上の症状の発生、頻度及び／又は強度の統計学的に有意な減少が疾患、障害又は状態に罹りやすい集団において観察される場合、薬剤が特定の疾患、障害又は状態を「予防する」と見なされる。

【0061】

組み換え体：本明細書中で使用される場合、「組み換え体」という用語は、組み換え手段によって設計され、操作され、調製され、発現され、作製され又は単離されるポリペプチド（例えば、本明細書中に記載のＨＡ及び／又はＮＡポリペプチド）、例えば、宿主細胞に遺伝子移入された組み換え発現ベクターを使用して発現されるポリペプチド、組み換え、コンビナトリアルポリペプチドライブラリから単離されるポリペプチド、又は選択された配列要素を互いにスプライシングすることを含む何らかの他の手段によって調製され、発現され、作製され又は単離されるポリペプチドを指すことが意図されている。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上は天然で見出される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上はインシリコで設計される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上は、既知の配列要素の突然変異誘発（例えば、インビボ又はインビトロで）から、例えば天然又は合成源から生じる。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上は、同じポリペプチドに天然には存在しない複数の（例えば２つ以上の）既知の配列要素（例えば、２つの別々のＨＡ又はＮＡポリペプチドからの２つのエピトープ）の組み合わせから生じる。組み換えＨＡは、ｒＨＡであり、組み換えＮＡはｒＮＡである。

【0062】

季節性株：「季節性」インフルエンザ株は、ヒト集団などの対象集団の季節性感染（例えば、毎年のエピデミック）を引き起こしたか、又は引き起こす能力を有するものである。いくつかの実施形態では、季節性株は、季節性感染を引き起こしている。

【0063】

配列同一性：アミノ酸又は核酸の配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表され、それ以外の場合、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、同一性（又は類似性若しくは相同性）のパーセンテージの観点から測定されることが多く；パーセンテージが大きいほど、２つの配列はより類似している。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。所与の遺伝子又はタンパク質の相同体又は変異体は、標準的な方法を用いてアラインさせた場合、比較的高度の配列同一性を有する。

【0064】

「％同一の」、「％同一性」という用語又は類似の用語は特に、比較しようとする配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図される。前記パーセンテージは純粋に統計学的であり、２つの配列間の差異は、比較しようとする配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしも分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に、セグメント又は「比較の窓」に関して、前記配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアライメントは、手動で、又はＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４による類似性検索アルゴリズムを用いて、又は前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）を用いて行い得る。

【0065】

同一性パーセンテージは、比較しようとする配列が対応する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除し、この結果に１００を乗ずることによって得られる。

【0066】

いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０又は約２００個のヌクレオチドについて、いくつかの実施形態では連続ヌクレオチドで、与えられる。いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。

【0067】

所与の核酸配列又はアミノ酸配列に対してそれぞれ特定の程度の同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列は、前記所与の配列の少なくとも１つの機能的及び／又は構造的特性を有し得、例えば、いくつかの例では、前記所与の配列と機能的及び／又は構造的に同等である。いくつかの実施形態では、所与の核酸配列又はアミノ酸配列に対して特定の程度の同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列は、前記所与の配列と機能的及び／又は構造的に同等である。

【0068】

標準治療株：世界保健機関（ＷＨＯ）は、毎年、集中的なサーベイランスの試みに基づいて、季節性ワクチン製剤に含まれるべきインフルエンザ株を選択する。本明細書中で使用される場合、「標準治療株」又は「ＳＯＣ株」という用語は、季節性ワクチン製剤に含まれるように、世界保健機関（ＷＨＯ）によって選択されるインフルエンザ株を指す。標準治療株には、過去の標準治療株、現在の標準治療株又は将来の標準治療株が含まれ得る。

【0069】

対象：本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、動物界のあらゆるメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、「対象」は、ヒトを指す。いくつかの実施形態では、「対象」は、非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、対象に、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類及び／又は蠕虫が含まれるが限定されない。いくつかの実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、フェレット、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類及び／又はブタ）である。いくつかの実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物及び／又はクローンであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、成人、青年又は乳幼児である。いくつかの実施形態では、「個体」又は「患者」という用語が使用され、「対象」と交換可能であるものとする。

【0070】

四量体ＮＡ分子：本明細書中で使用される場合、「四量体ＮＡ分子」という用語は、４個のＮＡ単量体のポリペプチド単位を含む化合物を指す。いくつかの実施形態では、ある種の四量体ＮＡ化合物における各単量体ＮＡ分子は、球状の頭部ドメイン、ストーク領域、疎水性膜貫通ドメイン及び短いＮ末端細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、所与の単量体ＮＡ分子のこれらのドメイン又は領域の１つ以上は、参照野生型単量体ＮＡ分子と比較して、短縮されるか、全く存在しないか又は修飾される。

【0071】

四量体化ドメイン：本明細書中で使用される場合、「四量体化ドメイン」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質の四量体アセンブリを生じさせるドメインをコードするアミノ酸配列を指す。特定のタンパク質にとってネイティブではない四量体化ドメインは、人工的又は異種の四量体化ドメインと呼ばれ得る。代表的な四量体化ドメインは、テトラブラチオン（Ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）からの配列、ＧＣＮ４ロイシンジッパー又は血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）を含むが限定されない。

【0072】

ワクチン組成物：本明細書中で使用される場合、「ワクチン組成物」又は「ワクチン」という用語は、対象において防御免疫反応を生じさせる組成物を指す。本明細書中で使用される場合、「防御免疫反応」は、感染から対象を保護する（感染を予防するか、又は感染に関連する疾患の発症を予防する）か、又は感染（例えば、インフルエンザウイルスによる感染）の症状を軽減する免疫反応を指す。ワクチンは、予防（防止）反応及び治療反応の両方を誘発し得る。投与方法はワクチンによって異なるが、接種、摂取、吸入又は他の投与形態が含まれ得る。接種は、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、鼻腔内、吸入による、又は筋肉内などの非経口を含む多くの経路の何れかによって送達され得る。ワクチンは、免疫反応を増強するためにアジュバントと共に投与され得る。

【0073】

ワクチン接種：本明細書中で使用される場合、「ワクチン接種する」などの用語は、対象における防御免疫反応、例えばインフルエンザウイルスなどの疾患を引き起こす病原体に対する反応を生成するためのワクチン組成物の投与を指す。ワクチン接種は、疾患を引き起こす病原体への曝露の前、曝露中及び／又は曝露後に、及び／又は１つ以上の症状の発現の前、発現中及び／又は発現後に、いくつかの実施形態では、病原体への曝露前、曝露中及び／又は曝露直後に行われ得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン組成物の適切な時間間隔を置いた複数回の投与を含む。

【0074】

ワクチン効力：本明細書中で使用される場合、「ワクチン効力」又は「ワクチン有効性」という用語は、ワクチン組成物を投与された対象間での疾患のエビデンスの減少のパーセンテージに関する目安を指す。例えば、５０％のワクチン効力は、非ワクチン接種対象の群又は異なるワクチンを投与された対象の群と比較した場合に、ワクチン接種された対象の群の間での疾患症例数が５０％減少することを示す。

【0075】

野生型（ＷＴ）：当技術分野で理解されているように、「野生型」という用語は一般に、天然に見出されるような、正常な形態のタンパク質又は核酸を指す。例えば、野生型ＨＡ及びＮＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然単離株中で見出される。ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースにおいて様々な異なる野生型ＨＡ及びＮＡ配列が見出され得る。

【0076】

インフルエンザウイルスに対する命名法
インフルエンザウイルスを分類するために使用される全ての命名法は、当業者によって一般的に使用されるものである。従って、インフルエンザウイルスのタイプ又は群は、次の３つの主要なタイプのインフルエンザを指す：ヒトに感染する、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ又はＣ型インフルエンザ。インフルエンザＡ及びＢは、毎年、かなりの罹患率及び死亡率を引き起こす。特定のタイプとしてのウイルスの指定が、それぞれのＭｌ（マトリクス）タンパク質又はＰ（核タンパク質）における配列の違いに関連することは、当業者に理解される。Ａ型インフルエンザウイルスは、群１及び群２にさらに分けられる。これらのグループはさらに、ウイルス表面の２つのタンパク質、ＨＡ及びＮＡの配列に基づくウイルスの分類を指すサブタイプに分類される。現在、１８の認識されたＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）及び１１の認識されたＮＡサブタイプ（Ｎ１～Ｎ１１）が存在する。群１は、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５及びＮ８と、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８とを含有する。群２は、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７及びＮ９と、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５とを含有する。Ｎ１０及びＮ１１は、コウモリから単離されたインフルエンザ様ゲノムにおいて同定されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，２２（４）：１８３－９１）。潜在的に１９８の異なるインフルエンザＡサブタイプの組み合わせが存在するが、自然界では約１３１のサブタイプしか検出されていない。季節的な大流行を引き起こす、ヒト集団において一般的に循環しているＡ型インフルエンザウイルスの現在のサブタイプとしては、Ａ（Ｈ１Ｎ１）及びＡ（Ｈ３Ｎ２）が挙げられる。

【0077】

インフルエンザＡサブタイプはさらに、異なる遺伝的「クレード」及び「サブクレード」に分類され得る。例えば、ＡサブタイプＡ（Ｈ１Ｎ１）は、クレード６Ｂ．１及びサブクレード６Ｂ．１Ａを含む。ＡサブタイプのＡ（Ｈ３Ｎ２）は、クレード３Ｃ．２Ａ及び３Ｃ．３Ａ、並びにサブクレード３Ｃ．２Ａ１、３Ｃ．２Ａ２、３Ｃ２Ａ３及び３Ｃ．２Ａ４を含有する。同様に、ＢサブタイプＶｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）はクレードＶ１Ａ及びサブクレードＶ１Ａ．１、Ｖ１Ａ．２及びＶ１Ａ．３を含有し、一方、ＢサブタイプＹａｍａｇａｔａ（山形）はクレードＹ１、Ｙ２及びＹ３を含有する。最後に、株という用語は、それらのゲノムに小さな遺伝的変異を有するという点で互いに異なるサブタイプ内のウイルスを指す。

【0078】

便宜上、本明細書中に記載のタンパク質コンストラクト及びその一部を指すために、特定の略語を使用し得る。例えば、ＨＡは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質を指し得る。Ｈ１は、インフルエンザサブタイプ１株由来のＨＡを指す。Ｈ３は、インフルエンザサブタイプ３株由来のＨＡを指す。同様に、ＮＡは、インフルエンザノイラミニダーゼタンパク質又はその一部を指し得る。Ｎ２は、インフルエンザサブタイプ２株由来のノイラミニダーゼを指す。ｔｅｔ－ＮＡ又はｒＴＥＴ－ＮＡという用語は、細胞中で発現される場合、四量体ＮＡを形成する異種四量体化ドメインを含む組み換えＮＡを指す。ＨＡは、ヘマグルチニン又はその一部を指す。

【0079】

ヘマグルチニン（ＨＡ）
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、ＮＡとともに、２つの主要なインフルエンザ表面タンパク質のうちの１つである。ＮＡ及びＨＡの両方の機能には、細胞の表面上で発現される糖タンパク質又は糖脂質上の糖部分に結合する末端分子であるシアル酸との相互作用が含まれる。細胞表面のシアル酸にＨＡが結合することにより、細胞によるウイルスのエンドサイトーシスが誘導され、ウイルスが細胞に侵入し、感染することが可能になる。シアル酸はまた、感染細胞内で起こるグリコシル化過程の一部としてＨＡ及びＮＡに付加される。

【0080】

ＨＡは、宿主細胞へのインフルエンザウイルスの付着、及び細胞へのウイルスの浸透の間のウイルス－細胞膜融合に介在すると考えられている。ＨＡ分子における抗原性の変異は、インフルエンザの頻繁な流行及び免疫付与による感染の制御が限定的であることの原因である。

【0081】

ＨＡは、成熟インフルエンザウイルス中に三量体として存在する。各ＨＡ単量体は、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチド（ＨＡ１及びＨＡ２）からなる。これらのポリペプチドは、インフルエンザウイルスの成熟中の単一前駆体タンパク質ＨＡ０の開裂によって誘導される。一部には、これらの分子はしっかりと折り畳まれているので、ＨＡ０並びに成熟ＨＡ１及びＨＡ２は、立体構造及び抗原の特徴が僅かに異なる。さらに、ＨＡ０はより安定であり、変性及びタンパク質分解に対して耐性がある。

【0082】

所望のＨＡ遺伝子をクローニングするためのインフルエンザウイルス株の単離、増殖及び精製は、当技術分野で公知の何れかの方法、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７６２，９３９号明細書に開示されている方法などによって行われ得る。

【0083】

本開示の方法及び組成物は、野生型ＨＡ、修飾された非野生型ＨＡ、季節性又はパンデミックインフルエンザウイルス株由来のＨＡ、組み換えＨＡ、不活性化インフルエンザウイルス（ＩＩＶ）及び／又は再集合ウイルス中に存在するＨＡ、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有するＨＡ、リボ核酸分子によりコードされるＨＡ及び／又は当技術分野で公知の何れかの他の形態のＨＡを含む何れかの形態のＨＡの使用を含み得る。

【0084】

一次ＨＡ遺伝子産物は、プロセシングされていない全長ＨＡ（ｒＨＡ０）であり、分泌されないが、感染細胞の周辺膜と結合したままである。昆虫細胞において、このｒＨＡ０は、Ｎ結合高マンノース型グリカンでグリコシル化されており、ｒＨＡ０が翻訳後に三量体を形成し、次に細胞質細胞膜に蓄積している証拠がある。

【0085】

ｒＨＡ０は、非変性非イオン性界面活性剤を用いて、又は細胞、例えば昆虫細胞から組み換えタンパク質を精製するための当技術分野で公知の他の方法、例えばアフィニティー若しくはゲルクロマトグラフィー、抗原結合、ＤＥＡＥイオン交換又はレンチルレクチンアフィニティークロマトグラフィーなど、を用いて、周辺膜から選択的に抽出され得る。次いで、精製ｒＨＡ０を等張の緩衝溶液中で再懸濁し得る。特定の実施形態では、ｒＨＡ０は、少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％まで精製される。

【0086】

本明細書中で開示されるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、不活性化されたビリオン中に存在するインフルエンザウイルスＨＡを含む。特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、再集合ウイルス中に存在する。特定の実施形態では、不活性化及び／又は再集合ウイルスは、スプリット不活性化ウイルスである。特定の実施形態では、不活性化及び／又は再集合ウイルス中に存在するインフルエンザウイルスＨＡが本明細書中で開示され、ここで、ＨＡは、標準治療インフルエンザウイルス由来のＨ１ ＨＡ、標準治療インフルエンザウイルス由来のＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡ、又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の標準治療インフルエンザウイルス由来のＨＡから選択される。

【0087】

本明細書中で開示される特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡは、１種類以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡ、例えば、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有する組み換え機械学習インフルエンザウイルスＨＡなどである。特定の実施形態では、機械学習組み換えインフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統からのＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からのＨＡ又はそれらの組み合わせのうち１つ以上から選択され得る。１種類以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡを選択する際、例えば本明細書中に記載のようなものを含め、何れかの機械学習アルゴリズム又はモデルが使用され得る。

【0088】

本明細書中で開示されるインフルエンザウイルスＨＡは、単独で又は他のインフルエンザウイルスＨＡ抗原と及び／又は以下で論じられるようなインフルエンザウイルスＮＡと組み合わせて、処方され、包装され得る。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８種類又はそれを超えるインフルエンザウイルスＨＡ抗原を含む。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、４価ワクチン又は免疫原性組成物を作製するために４種類のインフルエンザウイルスＨＡを含む。特定の実施形態では、４種類のインフルエンザウイルスＨＡは、８価ワクチン又は免疫原性組成物を作製するために、４種類のインフルエンザウイルスＮＡ抗原とともに処方される。特定の実施形態では、４種類の組み換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原などの４種類のインフルエンザウイルスＨＡ抗原は、８価ワクチン又は免疫原性組成物を作製するために４種類のインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードするリボ核酸分子とともに処方される。

【0089】

本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物中に存在するインフルエンザウイルスＨＡは、標準治療インフルエンザウイルス株からのインフルエンザウイルスＨＡ及び／又は本明細書中で開示されるような機械学習インフルエンザウイルスＨＡの何れかの組み合わせを含み得る。例えば、特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡは、野生型インフルエンザＨＡ、非野生型インフルエンザＨＡ、季節性又はパンデミックインフルエンザウイルス株由来のＨＡ及び／又は当技術分野で公知の何れかの他の形態のインフルエンザＨＡであり得る。特定の実施形態では、組み換えインフルエンザウイルスＨＡが本明細書中で開示され、ＨＡは、標準治療インフルエンザウイルス由来のＨ１ ＨＡ、標準治療インフルエンザウイルス由来のＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の標準治療インフルエンザウイルス由来のＨＡから選択される。

【0090】

本明細書中で開示される特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡは、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９及び／又はＨ１０を含む、パンデミック株又はパンデミック潜在性を有する株由来である。

【0091】

ヘマグルチニン活性は、例えばヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＡＩ）を含め、当技術分野で公知の技術を使用して測定され得る。ＨＡＩは、赤血球（ＲＢＣ）表面のシアル酸受容体がインフルエンザウイルス（及びいくつかの他のウイルス）の表面で見出されるヘマグルチニン糖タンパク質に結合し、ウイルス粒子に濃度依存的に生じる、相互接続されたＲＢＣ及びウイルス粒子のネットワーク又は格子構造を作り出す、赤血球凝集反応と呼ばれる赤血球凝集反応の過程を適用する。これは、体内の病原体を標的とする細胞上の類似のシアル酸受容体に結合するウイルスの機能に関する代用として取られる物理的測定である。別のウイルス（アッセイにおいてＲＢＣに結合するために使用されるウイルスと遺伝的に類似又は異なり得る）に対するヒト又は動物の免疫反応において生じた抗ウイルス抗体の導入は、ウイルス－ＲＢＣ相互作用を妨害し、アッセイにおいて赤血球凝集が観察される濃度を変えるのに十分なウイルスの濃度を変化させる。ＨＡＩの１つの目標は、アッセイにおいて赤血球凝集を阻害するそれらの能力と比較して、抗体を含有する抗血清又は他の試料中の抗体の濃度を特徴付けることであり得る。赤血球凝集を防止する抗体の最も高い希釈はＨＡＩ力価（即ち、測定された反応）と呼ばれる。

【0092】

ＨＡ抗体応答を測定するための別のアプローチは、ヒト又は動物の免疫反応によって誘発される抗体の潜在的により大きいセットを測定することであり、これらは、ＨＡＩアッセイにおいて赤血球凝集に必ずしも影響を及ぼし得ない。このための一般的なアプローチは、ＥＬＩＳＡ技術を利用するものであり、ウイルス抗原（例えばヘマグルチニン）を固体表面に固定化し、次いで、抗血清由来の抗体を抗原に結合させる。読み取りは、抗血清由来の抗体、又はそれ自体が抗血清の抗体に結合する他の抗体の何れかに複合化された外因性酵素の基質の触媒作用を測定する。基質の触媒作用によって、容易に検出可能な生成物が生じる。この種のインビトロアッセイには多くのバリエーションがある。そのようなバリエーションの１つは、抗体法医学（ＡＦ）と呼ばれ、これは多くの抗原に対して同時に単一の血清試料を測定することを可能にする多重ビーズアレイ技術である。これらの測定は、ＨＡＩ力価と比較した場合、濃度及び総抗体認識を特徴付けるものであり、これらはヘマグルチニン分子によるシアル酸結合の干渉とより特異的に関連すると考えられている。従って、抗血清の抗体は、いくつかの場合において、別のウイルスのヘマグルチニン分子と比較して、１つのウイルスのヘマグルチニン分子について対応するＨＡＩ力価よりも比例的に高いか又は低い測定値を有し得；言い換えれば、これらの２つの測定値、ＡＦ及びＨＡＩは、線形的に相関し得ない。

【0093】

ＨＡ抗体応答を測定する別の方法は、ウイルス中和アッセイ（例えば、マイクロ中和アッセイ）を含み、この場合、ウイルスを抗体／血清試料の連続希釈物とインキュベートした後の許容培養細胞において、特異的中和アッセイ技術に依存して、プラーク、フォーカス及び／又は蛍光シグナルの減少により、抗体力価が測定される。

【0094】

各インフルエンザウイルスＨＡは、本明細書中で開示される組成物中に、組成物が投与される対象において免疫反応を誘導するのに有効な量で含まれ得る。特定の実施形態では、各インフルエンザウイルスＨＡは、例えば、約０．１μｇ～約５００μｇ、例えば約５μｇ～約１２０μｇ、約１μｇ～約６０μｇ、約１０μｇ～約６０μｇ、約１５μｇ～約６０μｇ、約４０μｇ～約５０μｇ、約４２μｇ～約４７μｇ、約５μｇ～約４５μｇ、約１５μｇ～約４５μｇ、約０．１μｇ～約９０μｇ、約５μｇ～約９０μｇ、約１０μｇ～約９０μｇ又は約１５μｇ～約９０μｇなどの範囲の量で本明細書中に開示されるワクチン又は免疫原性組成物中に存在する。特定の実施形態では、各組み換えＨＡは、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ又は約９０μｇの量で本明細書中に開示されるワクチン又は免疫原性組成物中に存在し得る。

【0095】

ノイラミニダーゼ（ＮＡ）
ＨＡとともに、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、第２の主要なインフルエンザ表面タンパク質である。ＮＡは、新生ビリオン上で、細胞性糖タンパク質及び糖脂質から及び新規合成ＨＡ及びＮＡからシアル酸を除去する。ＮＡによるシアル酸の除去は、ウイルス粒子の凝集を防ぐことによって、感染細胞の表面からのウイルス粒子の効果的な放出を促進する。これは、ウイルス感染のさらなる拡大を促進する、既に感染した死んだ細胞へのＨＡを介したウイルスの結合も防ぐ。ＮＡが、従来のワクチンにおけるか又はインタクトなビリオン上での何れかで、免疫原性形態で存在する場合、これは少数の成分であり、従って免疫優勢ＨＡとの抗原競合の継続に対して従属的である。競合的な機序ゆえに、ＮＡに対する免疫原性応答は、より頻繁に生じるＨＡ抗原に有利に、部分的に抑制されると思われる（Ｊｏｈａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐｒｉｏｒ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ． １９８７；１３９（６）：２０１０－２０１４；及びＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．１９７６；１３４（４）：３８４－９４）。結果として、ＮＡ免疫の効果は一般に、中和ＨＡ抗体によって目立たなくされ得る。

【0096】

本開示の方法及び組成物は、野生型ＮＡ、修飾された、非野生型ＮＡ、季節性又はパンデミックインフルエンザウイルス株由来のＮＡ、組み換えＮＡ、ＩＩＶ及び／又は再集合ウイルス中に存在するＮＡ、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有するＮＡ、リボ核酸分子によりコードされるＮＡ及び／又は当技術分野で公知の何れかの他の形態のＮＡを含め、あらゆる形態のＮＡの使用を含み得る。

【0097】

ａ．野生型インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ
本明細書中で開示される組成物及び方法は、特定の実施形態では、４個の野生型単量体ＮＡ分子を含む四量体ＮＡポリペプチドの使用を含み得る。ＮＡは、４個の同一である単量体の四量体としてウイルス表面上で集合するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。野生型単量体の分子量は一般的に、インフルエンザのサブタイプに依存して約５５～７２ｋＤａであり；この四量体の分子量は一般的に、インフルエンザサブタイプに依存して約２４０～２６０ｋＤａである。各単量体は、４つの異なる構造ドメイン：酵素性頭部領域、ストーク領域、膜貫通領域及び細胞質尾部からなる。最大ドメインは頭部領域であり、これは、膜貫通領域及び最終的にＮ末端細胞質ドメインに連結されるストーク領域によってウイルス膜に係留される。

【0098】

Ｎ１及びＮ２を含む異なるインフルエンザＡウイルスサブタイプの間のストーク領域は、大きさ及びアミノ酸構造が顕著に変動し得る（Ｂｌｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ’ｓｔａｌｋ’ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｉｇｈｔ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ Ａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １９８２、２１（１７）：４００１－４００７）。ストークの長さの差は、酵素性頭部領域の距離を調節し、細胞表面受容体上のシアル酸にＮＡが接近する能力に影響を与えると考えられ、ストーク領域が短いことは、シアリダーゼ活性が低いことと相関する（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｙｐｅ １ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｓ Ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ Ｂｏｔｈ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｈｅａｄ Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ ２０１３，２８８（１）：６４４－５３；及びＭｃＡｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ＦＲＯＮＴＩＥＲＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２０１９，１０（３９））。異なるサブタイプのストーク領域間での変動性にもかかわらず、ＮＡストーク領域は、少なくとも１つのシステイン残基及び潜在的なグリコシル化部位を含め、いくつかの構造特性も共有する。システイン残基は、ＮＡ単量体間のジスルフィド結合の形成に関与し得、安定化されたＮＡ四量体の形成に役立ち、一方でグリコシル化部位は、四量体安定化に寄与し得る（ＭｃＡｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。例えば、Ｎ２ ＮＡのアミノ酸位置７８の保存されたシステイン残基は、四量体組み立て機序に関与すると考えられる（Ｓｈｔｙｒｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＡＣＴＡ ＮＡＴＵＲＡＥ ２００９；１（２）：２６－３２）。

【0099】

酵素性頭部領域は、４個の単量体から構成される。頭部の各単量体は、保存された６枚ブレード型プロペラ構造を形成する。各ブレードは、ジスルフィド結合により安定化され、様々な長さのループによって連結される４枚の逆平行β－シートを有する。ＭｃＡｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９。単量体の四量体化は、活性部位の形成及び酵素活性のあるＮＡの合成に重要である。Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｔｈａｔ Ａｆｆｅｃｔ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｈ５Ｎ１ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２０１６，９０（２０）：９４５７－７０。

【0100】

Ｎ１及びＮ２など、異なるインフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプの間で、及び特に異なるインフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプのＮＡストーク領域の間で、ＮＡのアミノ酸配列及び長さが顕著に変動し得るにもかかわらず、異なるインフルエンザ株由来のＮ２のアミノ酸配列の長さは一般的に約４６９アミノ酸であり、いくつかの株は、一般的には頭部領域において約１又は２個（又はそれを超える）アミノ酸挿入又は欠失を有する。野生型Ｎ２における特異的なアミノ酸残基に言及する場合、特異的なアミノ酸残基番号は、当技術分野で理解される場合、Ｎ２付番に基づく。Ｎ末端細胞質尾部は一般的に、野生型Ｎ２配列のアミノ酸１～６に相当し、一方で膜貫通ドメインは一般的に野生型Ｎ２配列のアミノ酸７～３５に相当する。例えば、株Ａ／ＰＥＲＴＨ（パース）／１６／２００９（配列番号１）の野生型ＮＡ配列において、細胞質領域は、配列番号１のアミノ酸１～６に対応し、一方で膜貫通領域は、配列番号１のアミノ酸７～３５に対応する。Ｎ２ストーク領域の長さは一般的に約４６アミノ酸長であり、野生型Ｎ２配列の、アミノ酸３６前後で始まり、アミノ酸８２前後で終わる。例えば、株Ａ／ＰＥＲＴＨ（パース）／１６／２００９の野生型ＮＡ配列（配列番号１）において、ストーク領域は、配列番号１のアミノ酸３６～アミノ酸８２前後に対応する。しかし、Ｎ２ストーク領域の最後とＮ２頭部領域の始めとの間の正確な境界は、Ｘ線結晶学により解決されていない。

【0101】

ｂ．組み換え及び／又は修飾インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ
本開示の方法及び組成物は、修飾組み換えＮＡ、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有する修飾ＮＡ及び／又はリボ核酸分子によりコードされる修飾ＮＡを含む、修飾形態のインフルエンザウイルスＮＡの使用を含み得る。

【0102】

特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＮＡは、宿主細胞で発現される場合、可溶性の四量体ＮＡを形成する４個の修飾単量体ＮＡ分子を含む。一態様では、修飾された単量体ＮＡ分子は、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域及び異種オリゴマー化ドメインを含むが、インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の１つ以上の少なくとも一部を欠く。

【0103】

例えば、修飾された単量体ＮＡは、インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の１つ以上を置換するか又はインフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て若しくは実質的に全てを置換する異種四量体化ドメインを含み得る。特定の実施形態では、異種四量体化ドメインは、例えば、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／００３４５７８号明細書で開示されるような四量体化ドメインである。Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏｓ ＯＮＥ，２０１１，６（２）：ｅ１６２８４；Ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１３，２８８（１）：６４４－５３；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９０（２０）：９４５７－７０；Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８４（１９）：１０３６６－７４；Ｐｒｅｖａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＰＬｏｓ ＯＮＥ，１０（８）：ｅ０１３５４７４も参照のこと。他の実施形態では、異種四量体化ドメインは、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる国際公開第２０１６／０９７７６９号パンフレットに記載のような、ヤツメウナギＶＬＲ－Ｂ抗体の極端なＣ末端（即ち、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる国際公開第２００８／０１６８５４号パンフレットの図１１Ｃで「Ｃ－ＴＥＲＭ」と呼ばれるドメイン）で見出されるペプチド、例えば国際公開第２０１６／０９７７６９号パンフレットの配列番号１又は配列番号２など、である。

【0104】

特定の実施形態では、修飾された単量体インフルエンザウイルスＮＡは、インフルエンザウイルスＮＡの、シグナルペプチド、異種四量体化ドメイン及び頭部領域を含み、宿主細胞における修飾された単量体インフルエンザウイルスＮＡの発現の結果、四量体ＮＡの分泌が起こる。

【0105】

野生型ＮＡタンパク質は、膜貫通ドメインを含む膜結合性タンパク質である。可溶性ＮＡタンパク質を作製するために、膜貫通ドメインを欠失させ、シグナルペプチドを付加することが可能である。シグナルペプチドは、組み換えＮＡタンパク質を分泌経路に標的化して、組み換えＮＡが発現される宿主細胞から組み換えＮＡタンパク質が分泌されるようにする。修飾された単量体ＮＡ核酸が宿主細胞の内部でポリペプチドに翻訳される場合、ポリペプチドは、シグナルペプチドを含有する。しかし、翻訳後プロセシング中、シグナルペプチドが切断され、分泌されたポリペプチドがもはやシグナルペプチドを含有しないようになる。それ自体、修飾された単量体ＮＡが修飾された単量体ＮＡを分泌経路に標的化するために翻訳後にシグナルペプチドを含み得るにもかかわらず、翻訳後プロセシングを通じてシグナルペプチドが除去され、修飾された単量体ＮＡを発現する宿主細胞から得られる可溶性四量体ＮＡがシグナルペプチドをもはや含有しない４個の修飾されたＮＡ単量体から構成されるようになる。

【0106】

特定の実施形態では、例えば、四量体ＮＡは、４個の修飾された単量体インフルエンザウイルスＮＡを含み、この修飾された単量体インフルエンザウイルスＮＡは、インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域及び異種四量体化ドメインを含む。

【0107】

特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＮＡの、細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てを、シグナルペプチド及び異種四量体化ドメインにより置き換え得る。異種四量体化ドメインを含む修飾ＮＡは、ＮＡストーク領域全体を欠き得るか、又はこれは、ＮＡストーク領域の実質的に全てを欠き得、即ち修飾されたＮＡコンストラクトは、ＮＡストーク領域のＣ末端部分を含み得る。例えば、異種四量体化ドメインを含む修飾ＮＡは、ＮＡストーク領域の最もＣ末端のアミノ酸の約１～１３を含み得る。当技術分野で理解されるように、ストーク領域の最もＣ末端のアミノ酸は、ＮＡ頭部領域にすぐに隣接する残基である。さらなる例として、異種四量体化ドメインコンストラクトを含む修飾されたＮＡは、ＮＡストーク領域の最もＣ末端のアミノ酸の１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３又は１～２を含み得る。さらなる例として、異種四量体化ドメインコンストラクトを含む修飾されたＮＡは、ＮＡストーク領域の最もＣ末端のアミノ酸の約８個を含み得る。

【0108】

特定の実施形態では、異種四量体化ドメインは、スタフィロテルムス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラチオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質の四量体化ドメイン又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである。

【0109】

さらなる例として、その全体において参照により本明細書によって組み込まれるＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０３９９８０号明細書で開示されるように、異種四量体化ドメインの付加なしでも、細胞において発現される場合、ストークドメインの全て又は実質的に全てを欠く修飾された単量体インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）が可溶性四量体ＮＡを形成し得ることが発見された。ストークドメインの全て又は実質的に全てを欠く全てのＮ２株が検出可能な量の可溶性四量体ＮＡを産生するわけではないものの、試験したＮ２株の殆どが検出可能な量の可溶性四量体ＮＡを産生し、短縮されたストーク設計ストラテジーが様々なＮ２インフルエンザ株由来のＮＡタンパク質へと広く適用され得ることが示される。使用されるＮ２株に依存して、この修飾された単量体ＮＡ設計ストラテジーの結果、宿主細胞で発現される場合に、優勢的に四量体ＮＡ又は単量体ＮＡ及び四量体の混合物の産生が起こり得る。従って、ある特定のＮ２株及び特異的なＮ２株のある特定のストーク欠失変異体は、細胞で発現される場合、可溶性の四量体ＮＡのより高い収率を生じさせる。何れかの例において、宿主細胞においてこのような修飾されたＮＡコンストラクトが発現される場合、産生される四量体ＮＡを精製することが所望され得る。

【0110】

本明細書中で使用される場合、インフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）の「ストーク領域の実質的に全て」は、インフルエンザウイルスＮ２のストーク領域のアミノ酸３６～少なくともアミノ酸６９を指す。従って、細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の実質的に全てを欠く修飾Ｎ２は、インフルエンザウイルスサブタイプ２ＮＡのアミノ酸１～７０、１～７１、１～７２、１～７３、１～７４、１～７５、１～７６、１～７７、１～７８、１～７９、１～８０又は１～８１を欠き得る。言い換えれば、本明細書中に記載の修飾Ｎ２は、インフルエンザウイルスサブタイプ２ＮＡのストーク領域の最もＣ末端のアミノ酸の最大１３個を含み得、ストーク領域の最もＣ末端のアミノ酸は一般的にＮ２のアミノ酸７０～８２を指す。特定の実施形態では、細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域全体（例えばアミノ酸１～８２）が修飾Ｎ２から除去されている。

【0111】

いくつかの実施形態では、例えば四量体ＮＡは、４個の修飾されたインフルエンザウイルスサブタイプ２ノイラミニダーゼ分子を含み、ここで修飾されたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの頭部領域を含み、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの、細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てを欠き、ここで四量体ＮＡは異種四量体化ドメインを含有しない。これらの実施形態のいくつかでは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てが、シグナルペプチドにより置換されている。シグナルペプチドは通常、翻訳後プロセシング中に正常に切断されて、分泌されたＮＡポリペプチドは一般的にシグナルペプチドを含有しないようになる。これらの実施形態のいくつかでは、例えば、野生型Ｎ２インフルエンザウイルスＮＡのアミノ酸１から少なくともアミノ酸７０～８２までがシグナルペプチドにより置き換えられ得る。細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン及びストーク領域の全て又は実質的に全てがシグナルペプチドにより置換され、細胞で発現される場合に四量体ＮＡを形成するこれらの修飾Ｎ２コンストラクトはまた、その全体において参照により本明細書によって組み込まれるＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０３９９８０号明細書でさらに詳述される。

【0112】

これらの修飾された単量体ＮＡにより形成される四量体ＮＡ分子は一般に、流体試料中で実質的に可溶性であり、一般的に触媒として活性でもある（例えば、ノイラミン酸のグリコシド結合を酵素的に切断可能である）。しかし、四量体ＮＡ分子はまた、例えば突然変異ゆえに触媒的に不活性でもあり得る。

【0113】

例えば、ＭＵＮＡＮＡアッセイ、ＥＬＬＡアッセイ又はＮＡ－Ｓｔａｒ（登録商標）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含め、当技術分野で公知の技術を使用してノイラミニダーゼ活性を測定し得る。ＭＵＮＡＮＡアッセイにおいて、２’－（４－メチルウンベリフェリル）－アルファ－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）が基質として使用される。試料中に含有される何れの酵素活性ノイラミニダーゼも、ＭＵＮＡＮＡ基質を切断し、４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）、蛍光化合物を放出する。従って、試験試料中のノイラミニダーゼ活性の量は、放出される４－ＭＵの量と相関し、これは、蛍光強度（ＲＦＵ、相対的蛍光単位）を使用して測定され得る。

【0114】

本開示の可溶性四量体ＮＡのノイラミニダーゼ活性を決定する目的のために、次の条件を使用してＭＵＮＡＮＡアッセイが行われるべきである：可溶性四量体ＮＡを緩衝液［３３．３ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）、４ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０ｍＭ ＢＳＡ］及び基質（１００μＭ ＭＵＮＡＮＡ）と混合し、振盪しながら３７℃で１ｈインキュベートし；アルカリｐＨ溶液（０．２Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３）を添加することにより反応を停止させ；それぞれ３５５及び４６０ｎｍの励起及び発光波長を使用して蛍光強度を測定し；４ＭＵ参照物に対する酵素活性を計算する。必要に応じて、ノイラミニダーゼ酵素活性を測定するために、同等のアッセイを使用し得る。

【0115】

組み換え機械学習インフルエンザウイルスＮＡを含め、本明細書中に記載のように、機械学習モデルを使用して同定又は設計される１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ（「機械学習インフルエンザウイルスＮＡ」）も本明細書中で開示される。特定の実施形態では、機械学習インフルエンザウイルスＮＡは、Ｎ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統からのＮＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からのＮＡ又はその組み合わせの１つ以上から選択され得る。例えば本明細書中で記載のようなものを含め、１種類以上の機械学習インフルエンザウイルスＮＡを選択する場合、あらゆる機械学習アルゴリズム又はモデルが使用され得る。

【0116】

本明細書中で論じられるように、単独で又は他のインフルエンザウイルスＮＡ抗原と及び／又はインフルエンザウイルスＨＡと組み合わせて、本明細書中で開示されるインフルエンザウイルスＮＡが、処方され得、包装され得る。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８種類又はそれを超えるインフルエンザウイルスＮＡ抗原を含む。特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＮＡを３種類のさらなるインフルエンザウイルスＮＡ抗原とともに処方して、４価ワクチン又は免疫原性組成物を作製する。特定の実施形態では、４種類のインフルエンザウイルスＮＡを４種類のインフルエンザウイルスＨＡ抗原とともに処方して、８価ワクチン又は免疫原性組成物を作製する。特定の実施形態では、４種類のインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードするリボ核酸分子を４種類のインフルエンザウイルスＨＡ抗原、例えば４種類の組み換えインフルエンザウイルスＨＡ抗原などとともに処方して、８価ワクチン又は免疫原性組成物を作製する。

【0117】

本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物に存在するインフルエンザウイルスＮＡは、標準治療インフルエンザウイルス株からのインフルエンザウイルスＮＡ及び／又は本明細書中で開示されるような機械学習インフルエンザウイルスＮＡの何れかの組み合わせを含み得る。例えば、特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＮＡは、野生型インフルエンザＮＡ、非野生型インフルエンザＮＡ、季節性又はパンデミックインフルエンザウイルス株からのＮＡ及び／又は当技術分野で公知の何れかの他の形態のインフルエンザＮＡであり得る。特定の実施形態では、組み換えインフルエンザウイルスＮＡが本明細書中で開示され、ここでＮＡは、標準治療インフルエンザウイルスからのＮ１ ＮＡ、標準治療インフルエンザウイルスからのＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の標準治療インフルエンザウイルス由来のＮＡから選択される。

【0118】

本明細書で開示される特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＮＡは、例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ７及び／又はＮ９を含む、パンデミック株又はパンデミック潜在性を有する株由来である。

【0119】

各インフルエンザウイルスＮＡは、本明細書中で開示される組成物中に、組成物が投与される対象において免疫反応を誘導するのに有効な量で存在し得る。特定の実施形態では、各インフルエンザウイルスＮＡは、例えば１μｇ～約５００μｇ、例えば約５μｇ～約１２０μｇ、約１μｇ～約６０μｇ、約１０μｇ～約６０μｇ、約１５μｇ～約６０μｇ、約５μｇ～約４５μｇ、約１５μｇ～約４５μｇ、約０．１μｇ～約９０μｇ、約５μｇ～約９０μｇ、約１０μｇ～約９０μｇ、約１５μｇ～約９０μｇ、約５μｇ～約２５μｇ又は約１０μｇ～約２０μｇ又は約１２μｇ～１８μｇの範囲の量で本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物中に存在し得る。特定の実施形態では、各組み換えＮＡは、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ又は約９０μｇの量で本明細書中に開示されるワクチン又は免疫原性組成物中に存在し得る。

【0120】

ＨＡ又はＮＡをコードするリボ核酸
本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、本明細書中で開示される、１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ又は１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡをコードする、１種類以上のリボ核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡなどのリボ核酸分子は、インフルエンザウイルスＮＡ、例えばＮ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統からのＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からのＮＡの組み合わせの何れか１つをコードし得る。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、Ｎ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統からのＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からのＮＡをコードする。一般的には、ｍＲＮＡなどのリボ核酸分子は、全長ＮＡ（例えば、野生型又は機械学習ＮＡ）をコードするが、これらは、修飾されたＮＡもコードし得る。

【0121】

特定の実施形態では、ｍＲＮＡなどのリボ核酸分子は、インフルエンザウイルスＨＡ、例えばＨ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統からのＨＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からのＨＡの組み合わせの何れか１つなどをコードし得る。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統からのＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からのＨＡをコードする。一般的には、ｍＲＮＡなどのリボ核酸分子は、全長ＨＡ（例えば、野生型又は機械学習ＮＡ）をコードするが、これらは修飾されたＨＡもコードし得る。

【0122】

特定の実施形態では、リボ核酸分子は、脂質－ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入される。

【0123】

代表的なｍＲＮＡ及びＬＮＰは、例えば、その全体の内容が本明細書中で参照により組み込まれる、「Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」という題名のＰＣＴ出願である国際公開第２０２２／０９９００３号パンフレットで開示される。

【0124】

あらゆる公知のＬＮＰ製剤が、本明細書中で開示される実施形態において使用され得る。特定の実施形態では、ＬＮＰは以下の４種類の脂質の混合物を含む：イオン化（例えば、陽イオン性）脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合化脂質、コレステロールに基づく脂質、及びリン脂質などのヘルパー脂質。ＬＮＰはリボ核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を封入するために使用される。封入されたｍＲＮＡ分子は、天然のリボヌクレオチド、化学修飾されたヌクレオチド又はこれらの組み合わせから構成され得、１種類以上のタンパク質をそれぞれ又は集合的にコードし得る。

【0125】

イオン化脂質はｍＲＮＡ封入を促進し、陽イオン性脂質であり得る。陽イオン性脂質は、低ｐＨで正に荷電した環境を与え、負に荷電したｍＲＮＡ製剤原料の効率的なカプセル化を促進する。

【0126】

企図されるＰＥＧ化脂質としては、誘導体化セラミド（例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）］（Ｃ８ ＰＥＧセラミド））などの、Ｃ_６～Ｃ_２０（例えば、_８、Ｃ_１０、Ｃ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６又はＣ_１８）長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した、最大５ｋＤａ長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）；１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＬＰＥ－ＰＥＧ）；１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－ポリエチレングリコール（ＤＳＧ－ＰＥＧ）；Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール（例えば、ＡＬＣ－０１５９）；又は１－モノメトキシポリエチレングリコール－２，３－ジミリスチルグリセロール（例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）である。

【0127】

ＰＥＧは、好ましくは高分子量、例えば２０００～２４００ｇ／ｍｏｌを有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００（又はＰＥＧ－２Ｋ）である。特定の実施形態では、本明細書中のＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＬＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００又はＣ８ ＰＥＧ２０００である。ＰＥＧ化脂質成分は、ナノ粒子の粒径及び安定性に対する制御を提供する。このような成分を添加することにより、複雑な凝集が防止され、循環寿命を延ばし、標的組織への脂質－核酸医薬組成物の送達を増大させるための手段を提供し得る（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６８（１）：２３５－７）。これらの成分は、インビボで医薬組成物から迅速に交換されるように選択され得る（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照されたい）。

【0128】

コレステロール成分は、ナノ粒子内の脂質二重層構造に安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のコレステロールに基づく脂質を含む。適切なコレステロールに基づく脂質としては、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．（１９９１）１７９：２８０；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７）２３：１３９；米国特許第５，７４４，３３５号明細書）、イミダゾールコレステロールエステル（「ＩＣＥ」；国際公開第２０１１／０６８８１０号パンフレット）、β－シトステロール、フコステロール、スチグマステロール及びコレステロールの他の修飾形態が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰで使用されるコレステロールに基づく脂質は、コレステロールである。

【0129】

ヘルパー脂質は、ＬＮＰの構造的安定性を増強し、エンドソーム脱出におけるＬＮＰを助ける。それは、ｍＲＮＡ薬物ペイロードの取り込み及び放出を改善する。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、薬物ペイロードの取り込み及び放出を増強するための融合特性を有する双性イオン脂質である。特定の実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の例は、１，２－ジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）；１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）；及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＯＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及び１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）である。

【0130】

他の例示的なヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＳＯＰＥ）又はこれらの組み合わせである。

【0131】

本明細書中で開示される特定の実施形態では、ＬＮＰは、（ｉ）ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４、ＡＬＣ－０３１５又はＳＭ－１０２から選択される陽イオン性脂質；（ｉｉ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；（ｉｉｉ）コレステロール；及び（ｉｖ）ＤＯＰＥを含む。

【0132】

本明細書中で開示される特定の実施形態では、ＬＮＰは（ｉ）陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）ＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール（例えば、ＡＬＣ－０１５９）、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）コレステロールを含む。特定の実施形態では、ＬＮＰは、（ｉ）約２５％～約６５％、例えば約４６．３％のモル比の陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５；（ｉｉ）約０．５％～約２．６％、例えば１．６％のモル比のＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール（例えばＡＬＣ－０１５９）；（ｉｉｉ）約５％～約１５％、例えば９．４％のモル比のヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ；及び（ｉｖ）約２０％～約６０％、例えば４２．７％のモル比のコレステロールを含む。

【0133】

上記のＬＮＰ成分のモル比は、ｍＲＮＡの送達におけるＬＮＰの有効性を高め得る。陽イオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロールに基づく脂質及びヘルパー脂質のモル比は、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ（ここで、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％）である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するＬＮＰ中の陽イオン性脂質のモル比（即ちＡ）は、３５～５０％である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するＰＥＧ化脂質成分のモル比（即ちＢ）は、０．２５～２．７５％である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するコレステロールに基づく脂質のモル比（即ちＣ）は、２０～５０％である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するヘルパー脂質のモル比（即ちＤ）は、５～３５％である。いくつかの実施形態では、（ＰＥＧ化脂質＋コレステロール）成分は、ヘルパー脂質と同じモル量を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質に対する陽イオン性脂質のモル比は、１超である。

【0134】

ＬＮＰ製剤中に含まれる各脂質の実際の量を計算するために、最初に、陽イオン性脂質のモル量を、所望のＮ／Ｐ比（ここで、Ｎは陽イオン性脂質中の窒素原子の数であり、Ｐは、ＬＮＰによって輸送しようとするｍＲＮＡ中のリン酸基の数である）に基づいて決定する。次に、陽イオン性脂質のモル量及び選択したモル比に基づいて、他の脂質のそれぞれのモル量を計算する。次いで、これらのモル量を、各脂質の分子量を用いて重量に変換する。

【0135】

特定の実施形態では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロールに基づく脂質及びヘルパー脂質を、４０：１．５：２８．５：３０のモル比で含有する。さらなる特定の実施形態では、ＬＮＰは、（ｉ）ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０又はＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４、（ｉｉ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００；（ｉｉｉ）コレステロール；及び（ｉｖ）ＤＯＰＥを、４０：１．５：２８．５：３０で含有する。

【0136】

所望であれば、ＬＮＰ又はＬＮＰ製剤は多価であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、同じ又は異なる病原体由来の２種類以上の抗原、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類又はそれを超える抗原をコードするリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を保有し得る。例えば、ＬＮＰは、それぞれが異なる抗原をコードする複数のリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を保有し得るか；又は２種類以上の抗原に翻訳され得るポリシストロン性ｍＲＮＡを保有し得る（例えば、各抗原コード配列は、２Ａペプチドなどの自己開裂ペプチドをコードするヌクレオチドリンカーによって分離される）。異なるリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を保有するＬＮＰは、典型的には各ｍＲＮＡ分子の複数のコピーを含む（封入する）。例えば、２種類の異なるリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を保有又は封入するＬＮＰは、典型的には２種類の異なるリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）のそれぞれの複数のコピーを保有する。

【0137】

いくつかの実施形態では、単一のＬＮＰ製剤は、複数種（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）のＬＮＰを含み得、各種は異なるリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を保有する。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＨＡ、及び／又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＨＡから選択される１種類以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種類）のインフルエンザウイルスタンパク質に由来するポリペプチドをコードするリボ核酸分子を含む。さらなる実施形態では、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、４種類のリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を含有し、第１のリボ核酸分子は第１の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨ１ ＨＡをコードし、第２のリボ核酸分子は第２の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨ３ ＨＡをコードし、第３のリボ核酸分子はＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の第３の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡをコードし、第４のリボ核酸分子はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の第４の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡをコードする。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、Ｎ１ ＨＡ、Ｎ２ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＨＡ及び／又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＨＡから選択される１種類以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種類）のインフルエンザウイルスタンパク質に由来するポリペプチドをコードするリボ核酸分子を含む。さらなる実施形態では、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、４種類のリボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を含有し、第１のリボ核酸分子は第１の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＮ１ ＨＡをコードし、第２のリボ核酸分子は第２の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＮ２ ＨＡをコードし、第３のリボ核酸分子はＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の第３の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡをコードし、第４のリボ核酸分子はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の第４の標準治療インフルエンザウイルス株由来のＨＡをコードする。

【0140】

特定の実施形態では、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスＨＡをコードする１種類以上の自己増幅ｍＲＮＡなどの１種類以上の自己増幅リボ核酸又はインフルエンザウイルスＮＡをコードする１種類以上の自己増幅ｍＲＮＡを含み得る。従来のｍＲＮＡからの抗原発現は、ワクチン又は免疫原性組成物から対象に首尾よく送達されるｍＲＮＡ分子の数に比例する。しかしながら、自己増幅ｍＲＮＡは、自己複製ウイルスに由来する遺伝子操作されたレプリコンを含み、従って、同等の結果を達成しながら、従来のｍＲＮＡよりも低用量でワクチン又は免疫原性組成物に添加され得る。

【0141】

自己増幅ｍＲＮＡは、例えばＨ３ ＨＡ、Ｈ１ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＨＡ及び／又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＨＡを含め、本明細書中で開示されるインフルエンザウイルスＨＡの何れかをコードし得る。特定の実施形態では、自己増幅ｍＲＮＡは、例えばＮ１ ＮＡ、Ｎ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＮＡ及び／又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＮＡを含め、本明細書中で開示されるインフルエンザウイルスＮＡの何れかをコードし得る。

【0142】

本リボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）は、非修飾（即ち、ホスホジエステル結合によって連結された天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、及び／又はＧのみを含有する）であってもよいし、又は化学修飾（例えば、シュードウリジン（例えば、Ｎ－１－メチルシュードウリジン）、２’－フルオロリボヌクレオチド、及び２’－メトキシリボヌクレオチド、及び／又はホスホロチオエート結合）などのヌクレオチド類似体を含む）されていてもよい。本リボ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）は、５’キャップ及びポリＡテールを含み得る。特定の実施形態では、１種類以上のリボ核酸分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、特定の実施形態では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。特定の実施形態では、リボ核酸分子中の全てのウリジンは、シュードウリジン、例えばメチルシュードウリジン、例えば１Ｎ－メチルシュードウリジンによって置き換えられる。

【0143】

各リボ核酸分子は、本明細書中で開示される組成物中において、組成物が投与される対象に免疫反応を誘導するのに有効な量で存在し得る。特定の実施形態では、各リボ核酸分子は、本明細書中で開示されるワクチン又は免疫原性組成物中に、例えば、約０．１μｇ～約１５０μｇ、例えば約５μｇ～約１２０μｇ、約１０μｇ～約６０μｇ、又は約１５μｇ～約４５μｇの範囲の量で存在し得る。特定の実施形態では、各リボ核酸分子は、ワクチン又は免疫原性組成物中に、例えば、約５μｇ～約１２０μｇ、例えば約１０μｇ～約６０μｇ、又は約１５μｇ～約４５μｇなどのインフルエンザウイルスＨＡ又はＮＡをコードするのに十分な量で存在する。

【0144】

核酸及び／又はＬＮＰを安定化するために（例えば、ワクチン又は免疫原性組成物の貯蔵寿命を延長するために）、ＬＮＰ医薬組成物の投与を容易にするために、及び／又は核酸のインビボ発現を増強するために、核酸及び／又はＬＮＰは、１つ以上の担体、標的指向性リガンド、安定化試薬（例えば、保存剤及び抗酸化剤）及び／又は他の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて処方され得る。そのような賦形剤の例は、パラベン、チメロサール、チオマーサル、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム及びキレート剤（例えばＥＤＴＡ）である。

【0145】

本開示のＬＮＰ組成物は、凍結液体形態又は凍結乾燥形態として提供され得る。様々な凍結保護剤、例えば、スクロース、トレハロース、グルコース、マンニトール、マンノース、デキストロースなどを含むが限定されないものを使用し得る。凍結保護剤は、ＬＮＰ組成物の５～３０％（ｗ／ｖ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、トレハロース、例えば５～３０％（例えば１０％）（ｗ／ｖ）を含む。凍結保護剤と共に処方されたら、ＬＮＰ組成物は、－２０℃～－８０℃で凍結（又は凍結乾燥及び凍結保存）され得る。ＬＮＰ組成物は、緩衝水溶液で患者に提供され得る（予め凍結されている場合には解凍され、又は予め凍結乾燥されている場合にはベッドサイドにて緩衝水溶液中で再構成され得る）。緩衝液は等張であることが好ましく、例えば筋肉内又は皮内注射に適している。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

【0146】

ワクチン又は免疫原性組成物
特定の実施形態では、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチン又は免疫原性組成物が本明細書中で開示される。

【0147】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、インフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１～８種類（１、２、３、４、５、６、７又は８種類など）のインフルエンザウイルスタンパク質と、１～８種類（１、２、３、４、５、６、７又は８種類など）のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１～８種類（１、２、３、４、５、６、７又は８種類など）のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする１～８種類（１、２、３、４、５、６、７又は８種類）のリボ核酸分子と、を含むか、又は特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、５価ワクチン、例えば４種類のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質と、インフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする１種類のリボ核酸分子と、を含む、又は４種類のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質と、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードする１種類のリボ核酸分子と、を含む、５価ワクチン又は免疫原性組成物である。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、６価ワクチン又は免疫原性組成物である。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、７価ワクチン又は免疫原性組成物である。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、８価ワクチン又は免疫原性組成物である。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、９価ワクチン若しくは免疫原性組成物、１０価ワクチン若しくは免疫原性組成物、１１価ワクチン若しくは免疫原性組成物、１２価ワクチン若しくは免疫原性組成物、１３価ワクチン若しくは免疫原性組成物、１４価ワクチン若しくは免疫原性組成物、１５価ワクチン若しくは免疫原性組成物又は１６価ワクチン若しくは免疫原性組成物である。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、１６種類を超える異なるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、インフルエンザウイルスＮＡタンパク質及び／又はインフルエンザウイルスＨＡ及び／又はインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードするリボ核酸分子を含む多価ワクチン又は免疫原性組成物である。

【0148】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類（１、２、３、４、５、６、７又は８種類など）のインフルエンザウイルスタンパク質を含む。特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類（１、２、３、４、５、６、７又は８種類など）のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子を含む。

【0149】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される、少なくとも４種類、例えば４種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類を超えない、例えば４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0150】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡから選択される、少なくとも４種類、例えば４種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類を超えない、例えば４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、本インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0151】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0152】

さらなる実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）組み換えインフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、組み換えインフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の組み換えインフルエンザウイルスＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の組み換えインフルエンザウイルスＨＡから選択される４種類の組み換えインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、本インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0153】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）ＩＩＶ中に存在するインフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、ＩＩＶ中に存在するインフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、ＩＩＶ中に存在するＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＩＩＶ中に存在するＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、本インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0154】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、本インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0155】

さらなる実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）組み換えインフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、組み換えインフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の組み換えインフルエンザウイルスＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の組み換えインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類の組み換えインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0156】

特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、（ｉ）ＩＩＶ中に存在するインフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、ＩＩＶ中に存在するインフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、ＩＩＶ中に存在するＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ及びＩＩＶ中に存在するＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質と、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡから選択される４種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む。他の箇所に記載のように、インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡは、標準治療インフルエンザ株由来のインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡを含むが限定されない。

【0157】

特定の態様では、本明細書中に記載のワクチン又は免疫原性組成物は、１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡタンパク質及び／又は１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子をさらに含む。特定の実施形態では、１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡタンパク質は、機械学習モデルを使用して同定されるか又は設計される。

【0158】

本ワクチン又は免疫原性組成物はまた、アジュバントもさらに含み得る。本明細書中で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原への免疫反応を非特異的に増強する物質又はビヒクルを指す。アジュバントとしては、抗原が吸着される、鉱物の懸濁液（ミョウバン、アルミニウム塩（例えば水酸化アルミニウム／オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ_４）、アルミニウムヒドロキシホスファート硫酸塩（ＡＡＨＳ）及び／又は硫酸アルミニウムカリウムを含む））；又は抗原溶液が鉱油中で乳化された油中水型エマルション（フロイント不完全アジュバント）（抗原性をさらに増強するために、死んだマイコバクテリアが含まれることもある（フロイント完全アジュバント））が挙げられ得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むものなど）もアジュバントとして使用され得る（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号明細書；同第６，２０７，６４６号明細書；同第６，２１４，８０６号明細書；同第６，２１８，３７１号明細書；同第６，２３９，１１６号明細書；同第６，３３９，０６８号明細書；同第６，４０６，７０５号明細書；及び同第６，４２９，１９９号明細書を参照）。アジュバントとしてはまた、脂質及び共刺激分子などの生体分子も挙げられる。代表的な生物学的アジュバントとしては、ＡＳ０４（Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，ＡＳ０４，ａｎ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｓａｌｔ－ａｎｄ ＴＬＲ４ Ａｇｏｎｉｓｔ－Ｂａｓｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．２００９，１８３：６１８６－６１９７）、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ及び４１ ＢＢＬが挙げられる。

【0159】

特定の実施形態では、アジュバントは、少なくとも：スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤及び疎水性非イオン性界面活性剤を含む水中油型アジュバントエマルションを含むスクアレンに基づくアジュバントである。特定の実施形態では、エマルションは熱可逆性であり、任意選択的に、油滴の体積基準で集団の９０％が２００ｎｍ未満のサイズを有する。

【0160】

特定の実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、式ＣＨ_３－（ＣＨ_２）_ｘ－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨ（式中、ｎは１０～６０の整数であり、ｘは１１～１７の整数である）のものである。特定の実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤は、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテルである。

【0161】

特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の９０％が１６０ｎｍ未満のサイズを有する。特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の９０％が１５０ｎｍ未満のサイズを有する。特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の５０％が１００ｎｍ未満のサイズを有する。特定の実施形態では、油滴の体積基準で集団の５０％が９０ｎｍ未満のサイズを有する。

【0162】

特定の実施形態では、アジュバントは、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールを含むが限定されない、少なくとも１つのアルジトールをさらに含む。

【0163】

特定の実施形態では、親水性非イオン性界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）は１０以上である。特定の実施形態では、疎水性非イオン性界面活性剤のＨＬＢは９未満である。特定の実施形態では、親水性非イオン性界面活性剤のＨＬＢは１０以上であり、疎水性非イオン性界面活性剤のＨＬＢは９未満である。

【0164】

特定の実施形態では、疎水性非イオン性界面活性剤は、ソルビタンモノオレアートなどのソルビタンエステル、又はマンニドエステル界面活性剤である。特定の実施形態では、スクアレンの量は５～４５％である。特定の実施形態では、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤の量は、０．９～９％である。特定の実施形態では、疎水性非イオン性界面活性剤の量は、０．７～７％である。特定の実施形態では、アジュバントは、ｉ）３２．５％スクアレン、ｉｉ）６．１８％ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル、ｉｉｉ）４．８２％ソルビタンモノオレアート、及びｉｖ）６％マンニトールを含む。

【0165】

特定の実施形態では、アジュバントは、アルキルポリグリコシド及び／又は凍結保護剤、例えば糖、特にドデシルマルトシド及び／又はスクロースをさらに含む。

【0166】

特定の実施形態では、アジュバントは、Ｋｌｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＦ０３，ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｑｕａｌｅｎｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｊ．ＰＨＡＲＭ．Ｓｃｉ．２０１２，１０１（１２）：４４９０－４５００（その全体において参照により本明細書によって組み込まれる）に記載のようなＡＦ０３を含む。特定の実施形態では、アジュバントは、例えば、国際公開第２０２２／０９０３５９号パンフレット（この文献はその全体において参照により本明細書によって組み込まれる）に記載のようなＳＰＡ１４などのリポソームに基づくアジュバントを含む。ＳＰＡ１４は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト（Ｅ６０２０）及びサポニン（ＱＳ２１）を含有するリポソームに基づくアジュバントである。

【0167】

１種類以上の核酸がＬＮＰ中に封入される特定の実施形態を含む特定の実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバントを含まない。特定の実施形態では、１種類以上のｍＲＮＡ分子などの１種類以上のリボ核酸分子は、本組成物中のインフルエンザウイルスタンパク質の１種類以上を補助するために働き得るＬＮＰ中に封入される。例えば、Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ，Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｃｔｓ ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｓｐｌｉｔ Ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ＶＡＣＣＩＮＥＳ ２０２０，８（４３３）：１－１８を参照のこと。

【0168】

ＮＡ、ＨＡ又はＮＡ及び／又はＨＡをコードするｍＲＮＡ及び任意選択的なアジュバントに加えて、本ワクチン又は免疫原性組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤もさらに含み得る。一般に、賦形剤の性質は、使用される特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的に及び生理学的に許容可能な流体を含む注入可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤又はカプセル形態）に対して、従来の非毒性固体担体として、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与しようとするワクチン又は免疫原性組成物は、少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、浸透圧を調整するための薬学的に許容可能な塩、保存剤、安定化剤、緩衝剤、糖、アミノ酸及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含有し得る。

【0169】

典型的には、本ワクチン又は免疫原性組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、皮内又は筋肉内などの非経口投与用に処方された無菌の液体溶液である。本ワクチン又は免疫原性組成物はまた、鼻腔内又は吸入投与用に処方され得る。本ワクチン又は免疫原性組成物はまた、何らかの他の意図される投与経路のために処方され得る。

【0170】

いくつかの実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物は、皮内注射、鼻腔内投与又は筋肉内注射用に処方される。いくつかの実施形態では、注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液として、注射前に液体の溶液若しくは懸濁液とするのに適した固体形態として、又はエマルションとしての何れかで、従来の形態で調製される。いくつかの実施形態では、注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末又は顆粒から調製される。これらの経路による投与のための医薬品の処方及び製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９^ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５（参照により本明細書中に組み込まれる）で見出され得る。現在、経口又は経鼻スプレー又はエアロゾル経路（例えば、吸入による）は、治療薬を肺及び呼吸器系に直接送達するために最も一般的に使用される。いくつかの実施形態では、本ワクチン又は免疫原性組成物は、ワクチン組成物を定量送達する装置を使用して投与される。本明細書中に記載の皮内用医薬組成物の送達に使用するのに好適な装置としては、短針装置、例えば米国特許第４，８８６，４９９号明細書、米国特許第５，１９０，５２１号明細書、米国特許第５，３２８，４８３号明細書、米国特許第５，５２７，２８８号明細書、米国特許第４，２７０，５３７号明細書、米国特許第５，０１５，２３５号明細書、米国特許第５，１４１，４９６号明細書、米国特許第５，４１７，６６２号明細書（これらは全て参照により本明細書中に組み込まれる）に記載のものなどが挙げられる。皮内用組成物はまた、皮膚への針の有効な貫入長を制限する装置、例えば国際公開第１９９９／３４８５０号パンフレット（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるもの、及びその機能的等価物によっても投与され得る。また、液体ジェット式注射器を介して、又は角質層を穿孔し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して、液体ワクチンを真皮に送達するジェット式注射装置も好適である。ジェット式注射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号明細書、米国特許第５，５９９，３０２号明細書、米国特許第５，３３４，１４４号明細書、米国特許第５，９９３，４１２号明細書、米国特許第５，６４９，９１２号明細書、米国特許第５，５６９，１８９号明細書、米国特許第５，７０４，９１１号明細書、米国特許第５，３８３，８５１号明細書、米国特許第５，８９３，３９７号明細書、米国特許第５，４６６，２２０号明細書、米国特許第５，３３９，１６３号明細書、米国特許第５，３１２，３３５号明細書、米国特許第５，５０３，６２７号明細書、米国特許第５，０６４，４１３号明細書、米国特許第５，５２０，６３９号明細書、米国特許第４，５９６，５５６号明細書、米国特許第４，７９０，８２４号明細書、米国特許第４，９４１，８８０号明細書、米国特許第４，９４０，４６０号明細書、国際公開第１９９７／３７７０５号パンフレット及び国際公開第１９９７／１３５３７号パンフレット（これらは全て参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。また、皮膚の外層を通って真皮まで粉末形態のワクチンを加速するための圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達装置も好適である。さらに、皮内投与の古典的なマントー法において、従来のシリンジが使用され得る。

【0171】

非経口投与のための製剤には、典型的には滅菌した水性又は非水性の溶液、懸濁液及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルション又は懸濁液、例えば生理食塩水、緩衝媒体など、が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充物、電解質補充物（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存剤及び他の添加剤、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなども存在し得る。

【0172】

キット
本明細書中で開示されるようなワクチン又は免疫原性組成物のためのキットが本明細書中でさらに開示される。キットには、ワクチン組成物を含む適切な容器又は、本ワクチン組成物の異なる構成成分を含む複数の容器が、任意選択的に使用説明書と共に含まれ得る。

【0173】

特定の実施形態では、本キットは、例えば、本明細書中で開示されるような１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせを含む第１の容器と、１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子を含む第２の容器と、を含む、複数の容器を含み得る。

【0174】

例えば、特定の実施形態では、（ｉ）Ｈ１ ＨＡである第１のインフルエンザウイルスＨＡ；Ｈ３ ＨＡである第２のインフルエンザウイルスＨＡ；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡ；Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡを含む第１の容器と、（ｉｉ）Ｎ１ ＮＡである第１のインフルエンザウイルスＮＡ；Ｎ２ ＮＡである第２のインフルエンザウイルスＮＡ；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡ；及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡをコードする１種類以上のリボ核酸分子を含む第２の容器と、を含むキットが本明細書中で開示される。特定の実施形態では、本キットは、任意選択的なアジュバントを含む第３の容器をさらに含み得、特定の実施形態では、第１の容器は、組み換えインフルエンザウイルス抗原に加えて任意選択的なアジュバントを含み得る。

【0175】

特定の実施形態では、本キットは、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又は本明細書中で開示されるようなそれらの組み合わせのそれぞれと、（ｉｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又は本明細書中で開示されるようなそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子のそれぞれと、を含む単一の容器を含み得る。例えば、特定の実施形態では、本キットは、Ｈ１ ＨＡである第１のインフルエンザウイルスＨＡ；Ｈ３ ＨＡである第２のインフルエンザウイルスＨＡ；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡ；Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡ；及びＮ１ ＮＡである第１のインフルエンザウイルスＮＡ；Ｎ２ ＮＡである第２のインフルエンザウイルスＮＡ；Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡ；及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡをコードする１種類以上のリボ核酸分子を含む単一容器を含み得る。単一容器は、任意選択的なアジュバントも含み得る。

【0176】

使用説明書は、第１及び第２の容器の内容が投与前に合わせられ得ること又は第１及び第２の容器の内容が合わせられず、個別に投与されることを指示し得る。

【0177】

核酸、クローニング及び発現系
本開示は、開示されるインフルエンザウイルスＨＡ及びＮＡをコードする人工核酸分子をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得、全体又は部分的に合成であってもよいし又は組み換えであってもよい。本明細書中に記載のヌクレオチド配列への言及は、文脈上別段の要求がない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＵがＴ、又はシュードウリジン、特にＮ１－メチルシュードウリジンなどのその誘導体又は類似体に置換されている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。他のヌクレオチド誘導体又は修飾ヌクレオチドが、開示されるＨＡ及びＮＡをコードする核酸分子に組み込まれ得る。

【0178】

本開示はまた、本明細書中で開示されるようなＨＡ又はＮＡをコードする核酸分子を含むベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、転写又は発現カセット、人工染色体など）の形態のコンストラクトを提供する。本開示はさらに、上記のような１つ以上のコンストラクトを含む宿主細胞を提供する。

【0179】

また、これらの核酸分子によってコードされるＨＡ又はＮＡを作製する方法も提供する。ＨＡ又はＮＡポリペプチドは、組み換え技術を用いて作製され得る。組み換えタンパク質の作製及び発現は当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ Ｅｄ．２０１２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓに開示されているような従来の手順を用いて行われ得る。例えば、ＨＡ又はＮＡポリペプチドの発現は、本明細書中で開示されるようなＨＡ又はＮＡをコードする人工核酸分子を含有する宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成され得る。例えば、組み換えＨＡ又はＮＡポリペプチドの発現は、本明細書中で開示されるようなＨＡ又はＮＡをコードする核酸分子を含有する宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成され得る。発現による産生後、何れかの適切な技術を用いてＨＡ又はＮＡを単離及び／又は精製し、次いで、必要に応じて使用し得る。

【0180】

様々な異なる宿主細胞におけるクローニング及びポリペプチド発現のための系は、当技術分野で周知である。本明細書中で開示されるコンストラクトに適合する何れかのタンパク質発現系（例えば、安定又は一過性）を使用して、本明細書中に記載のＨＡ又はＮＡを作製し得る。

【0181】

好適なベクターは、適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含有するように選択又は構築され得る。

【0182】

組み換えＨＡ又はＮＡを発現させるために、ＨＡ又はＮＡをコードする核酸を宿主細胞に導入し得る。導入は、あらゆる利用可能な技術を使用し得る。真核細胞については、好適な技術として、リン酸カルシウム遺伝子移入、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子移入及びレトロウイルス若しくは他のウイルス、例えばワクシニア、又は昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを使用する形質導入を挙げ得る。細菌細胞については、好適な技術として、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いた遺伝子移入が挙げられ得る。これらの技術は当技術分野で周知である。（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１０を参照）。ＤＮＡ導入に続いて、ベクターを含有する細胞を選択するための選択方法（例えば、抗生物質耐性）を行い得る。

【0183】

宿主細胞は、植物細胞、酵母細胞又は動物細胞であり得る。動物細胞は、無脊椎動物細胞（例えば、昆虫細胞）、非哺乳類脊椎動物細胞（例えば、鳥類、爬虫類及び両生類）及び哺乳動物細胞を包含する。一実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；マウスセルトリ細胞；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ）などが挙げられるが限定されない。一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

【0184】

特定の実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。例えば、組み換えＨＡ又はＮＡは、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９２２８号明細書で開示されるように、微細藻類細胞中で発現され得る。

【0185】

特定の実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。さらなる例として、組み換えＨＡ又はＮＡは、例えばその全体において参照により本明細書によって組み込まれる米国特許第５，９７６，５５２号明細書で開示されるように、ウイルス－ＨＡ ベクター、例えばバキュロウイルスベクターなどを感染させた昆虫細胞中で発現され得る。バキュロウイルスは、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、主に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）の昆虫種（例えば、チョウ及びガ）に限定される狭い宿主範囲を有することが知られている。例えば、バキュロウイルスオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、感受性培養昆虫細胞において効率的に複製する。ＡｃＮＰＶは、約１３０，０００塩基対の二本鎖閉鎖環状ＤＮＡゲノムを有し、宿主範囲、分子生物学及び遺伝学に関して十分に特徴付けられている。

【0186】

ＡｃＮＰＶを含む多くのバキュロウイルスは、感染細胞の核内に大きなタンパク質結晶性閉塞を形成する。ポリヘドリンと呼ばれる単一のポリペプチドは、これらの閉塞体のタンパク質の質量のおよそ９５％を占める。ポリヘドリンの遺伝子は、ＡｃＮＰＶウイルスゲノム中に単一コピーとして存在する。ポリヘドリン遺伝子は、培養細胞におけるウイルス複製に必要とされないので、これは外来遺伝子を発現するように容易に修飾され得る。ポリヘドリンプロモーターの転写制御下に存在するように、外来遺伝子配列を、ＡｃＮＰＶ遺伝子のポリヘドリンプロモーター配列のちょうど３’に挿入し得る。組み換えＨＡ又はＮＡタンパク質をコードする、組み換えバキュロウイルスを含む組み換えバキュロウイルスを、次いで、様々な昆虫細胞株において複製し得る。組み換えＨＡ又はＮＡタンパク質はまた、例えばエントモポックスウイルス（昆虫のポックスウイルス）、細胞質多角体病ウイルス（ＣＰＶ）及び組み換えＨＡ遺伝子による昆虫細胞の形質転換を含め、他の発現ベクターにおいて発現され得る。

【0187】

不活性化／再集合インフルエンザウイルス
本明細書中で開示される特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡは、不活性化インフルエンザウイルス中に存在する。特定の認可されたインフルエンザワクチンは、例えばインフルエンザＡサブタイプＨ１Ｎ１、インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ、及び／又はインフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａを含む、複数のインフルエンザサブタイプからのホルマリン不活化全サブユニット調製物又は化学的に分割されたサブユニット調製物を含み得る。このようなインフルエンザＡ及びＢワクチンのためのシードウイルスは、ニワトリ卵の尿膜腔又は培養細胞において高力価に複製する天然の株（即ち野生型株）であり得る。

【0188】

或いは、株は正しい表面抗原遺伝子を有する再集合体ウイルスであり得る。再集合体ウイルスは、ウイルスゲノムのセグメント化により、各親株の特徴を有するものである。２種類以上のインフルエンザウイルス株が細胞に感染する場合、これらのウイルスセグメントは混合されて、両方の親由来の様々な種類の遺伝子を含有する子孫ビリオンを作る。感染性の再集合ウイルスを作製するために使用される逆遺伝学法は、当業者にとって周知であり、Ｎｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ、ＰＲＯＣ ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ ＳＣＩ ＵＳＡ １９９９，９６（１６）：９３４５－９３５０；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＰＲＯＣ ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ ＳＣＩ ＵＳＡ ２００５，１０２（４６）：１６８２５－１６８２９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａ Ｏｎｅ－Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｕｓｅ ｉｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｊ ＶＩＲＯＬ ２００９，８３（１８）：９２９６－９３０３；Ｍａｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ Ｕｓｅ ｆｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ａｖｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ ＶＩＲＯＬ ２００５，７９（２１）：１３８１１－１３８１６；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ： Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈ５Ｎ１ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｊ ＶＩＲＯＬ ２００８，８２（３）：１６０５－１６０９に記載のプラスミド；及び／又はＮｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｍａｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ、２００５；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｋｏｕｄｓｔａａｌ ｅｔ ａｌ，－Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＰＥＲ．Ｃ６ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ａｎｄ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＶＡＣＣＩＮＥ ２００９，２７（１９）：２５８８－２５９３；Ｓｃｈｉｃｋｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ－ｏｎｌｙ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，ＰＨＩＬＯＳ ＴＲＡＮＳ Ｒ ＳＯＣ ＬＯＮＤ ＢＩＯＬ ＳＣＩ ２００１，３５６（１４１６）：１９６５－１９７３；Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｎ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａｎ Ｈ５Ｎ１ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｎｄｅｒ ａ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍ，ＶＡＣＣＩＮＥ ２００５，２３（２２）：２９４３－２９５２；Ｌｅｇａｓｔｅｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａ／Ｈ５Ｎ１ ａｎｄ Ａ／Ｈ７Ｎ１ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｅｒｏ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｃｅｌｌｓ，ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＯＴＨＥＲ ＲＥＳＰＩＲ ＶＩＲＵＳＥＳ ２００７，１（３）：９５－１０４；Ｗｈｉｔｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ － ｒｅｈｅａｒｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎ Ｈ７Ｎ１ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｔｈｒｅａｔ，ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ ＯＴＨＥＲ ＲＥＳＰＩＲ ＶＩＲＵＳＥＳ ２００７，１（４）：１５７－１６６に記載の細胞を使用する方法が挙げられるが限定されない。

【0189】

機械学習
１種類以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡを選択する際、あらゆる機械学習アルゴリズムが使用され得る。例えば、本明細書においては、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）及び国際公開第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、米国仮特許出願第６３／３１９，６９２号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）及び米国仮特許出願第６３／３１９，７００号明細書（発明の名称：Ｍａｃｈｉｎｅ－Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（これらは全てその全体において参照により本明細書に組み込まれる）で開示されるあらゆる機械学習アルゴリズム及び方法が想定される。

【0190】

特定の実施形態では、インフルエンザ抗原性の予測機械学習モデルを構築して、動物モデル及び／又はヒトにおける抗体力価の予測を可能にし得る。特定の実施形態では、機械学習モデルは、トレーニングセットの入力データから特徴値を抽出し得、特徴は入力データ項目が関連する特性を有するか否かにかかわらず、潜在的に関連すると見なされる変数である。入力データのための特徴の順序付きリストは、入力データのための特徴ベクトルと呼ばれ得る。特定の実施形態では、機械学習モデルは、次元削減を（例えば、線形判別分析（ＬＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、ニューラルネットワークからの学習された深層特徴などを介して）適用して、入力データに対する特徴ベクトルにおけるデータの量を、より小さく、より代表的なデータのセットに削減する。次いで、防御しようとする一連のインフルエンザ配列（例えば、標的株）を同定し、選択アルゴリズムを構築し得る。

【0191】

特定の実施形態では、ワクチンを設計するためのシステムが提供される。システムは、１つ以上のプロセッサを含む。システムは、１つ以上のプロセッサによって実行される場合、１つ以上のプロセッサに１つ以上の操作を実行させる、実行可能なコンピュータ命令を保存するコンピュータストレージを含む。１つ以上の操作は、１つ以上の分子配列を表す出力データを生成するように構成された複数のドライバモデルを第１の時系列データセットに適用することを含み、第１の時系列データセットは、１つ以上の分子配列、及び１つ以上の分子配列のそれぞれについて、その分子配列を天然抗原として含む病原性株の１回以上の循環を示す。１つ以上の操作は、複数のドライバモデルのそれぞれについて、以下によってドライバモデルを訓練することを含む：ｉ）ドライバモデルから、受け取った第１の時系列データセットに基づく１つ以上の予測分子配列を表す出力データを受け取り；ｉｉ）予測された１つ以上の分子配列を表す出力データに、複数の並進軸についての分子配列に対する生物学的反応を予測するように構成された並進モデルを適用して、出力データの１つ以上の予測分子配列に基づいて複数の並進軸の特定の並進軸に対応する１つ以上の第１の並進応答を表す第１の並進応答データを生成させ；ｉｉｉ）第１の並進応答データに基づいてドライバモデルの１つ以上のパラメータを調整し；ｉｖ）段階ｉ～ｉｉｉを多数回繰り返して、特定の並進軸に対応する１つ以上の訓練された並進応答を表す訓練された並進応答データを生成させる。１つ以上の操作は、１つ以上の訓練された並進応答に基づいて、複数のドライバモデルのうちの訓練されたドライバモデルのセットを選択することを含む。１つ以上の操作は、訓練されたドライバモデルのセットの各訓練されたドライバモデルについて、特定の季節のための１つ以上の予測分子配列を表す訓練された出力データを生成させるために、訓練されたドライバモデルを第２の時系列データセットに適用し；複数の並進軸の各並進軸について、１つ以上の第２の並進応答を表す第２の並進応答データを生成させるために、並進モデルを最終出力データに適用し；第２の並進応答データに基づいて、訓練されたドライバモデルのセットの訓練されたドライバモデルのサブセットを選択することを含む。

【0192】

複数のドライバモデルのうち少なくとも１つは、リカレントニューラルネットワークを含み得る。複数のドライバモデルのうちの少なくとも１つは、長・短期記憶リカレントニューラルネットワークを含む。

【0193】

受信された第１の時系列データセットに基づく１つ以上の予測分子配列を表す出力データは、複数の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）のそれぞれについての抗原を表す出力データを含み得る。複数の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）のそれぞれについての抗原を表す出力データは、特定の季節に対する循環中の全ての病原性株にわたって最大化された凝集生物学的反応を生成する分子配列を予測することによって決定される抗原を含み得る。複数の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）のそれぞれについての抗原を表す出力データは、特定の季節の循環中のウイルスの最大数に対して効果的に免疫付与する反応を生成させる分子配列を予測することによって決定される抗原を含み得る。

【0194】

複数の並進軸は、フェレット抗体法医学（ＡＦ）軸、フェレット赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）軸、マウスＡＦ軸、マウスＨＡＩ軸、ヒトレプリカＡＦ軸、ヒトＡＦ軸又はヒトＨＡＩ軸のうちの少なくとも１つを含み得る。反復回数は、所定の反復回数に基づき得る。反復回数は、所定の誤差値に基づき得る。１つ以上の第１の並進応答は、予測フェレットＨＡＩ力価、予測フェレットＡＦ力価、予測マウスＡＦ力価、予測マウスＨＡＩ力価、予測ヒトレプリカＡＦ力価、予測ヒトＡＦ力価又は予測ヒトＨＡＩ力価のうち少なくとも１つを含み得る。

【0195】

複数のドライバモデルのうちの訓練されたドライバモデルのセットを選択することは、複数のドライバモデルの各ドライバモデルをドライバモデルのクラスに割り当てることを含み得、各クラスはそのドライバモデルを訓練するために使用される複数の並進軸の特定の並進軸に関連付けられる。複数のドライバモデルの訓練されたドライバモデルのセットを選択することは、複数のドライバモデルの各ドライバモデルについて、そのドライバモデルのうち１つ以上の訓練された並進応答を、そのドライバモデルと同じクラスに割り当てられた少なくとも１つの他のドライバモデルのうち１つ以上の訓練された並進応答と比較することを含み得る。

【0196】

操作は、訓練されたドライバモデルのサブセットの各訓練されたドライバモデルについて、その訓練されたドライバモデルに対応する第２の並進応答データを、観察された実験応答データと比較することによって、その訓練されたドライバモデルを検証し；その訓練されたドライバモデルの検証に応答して、その訓練されたドライバモデルに対応する訓練された出力データによって表される１つ以上の分子配列を含むワクチンを生成させることをさらに含み得る。

【0197】

一態様では、システムが提供される。システムは、コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読メモリを含む。システムは、１つ以上の分子配列を予測するように訓練された少なくとも１つの機械学習モデルを含む実行可能ロジックを実行するように構成された少なくとも１つのプロセッサを含み、その少なくとも１つのプロセッサがコンピュータ実行可能命令を実行しているとき、少なくとも１つのプロセッサは、１つ以上の操作を実行するように構成されている。１つ以上の操作は、１つ以上の分子配列を示す時系列データを受信すること、及び１つ以上の分子配列のそれぞれについて、天然抗原としてその分子配列を含む病原性株の１回以上の循環を受信することを含む。１つ以上の操作は、機械学習モデルに含まれる実行可能ロジックの１つ以上の部分を保存する１つ以上のデータ構造を通して時系列データを処理し、この時系列データに基づいて１つ以上の分子配列を予測することを含む。

【0198】

時系列データに基づいて１つ以上の分子配列を予測することは、予測された１つ以上の分子配列が将来の使用に与える１つ以上の免疫学的特性を予測することを含み得る。時系列データに基づいて１つ以上の分子配列を予測することは、時系列データの全ての病原性株にわたって最大化された凝集生物学的反応を生成する１つ以上の分子配列を予測することを含み得る。時系列データに基づいて１つ以上の分子配列を予測することは、時系列データの最大数の病原性株を効果的にカバーする生物学的反応を生成する１つ以上の分子配列を予測することを含み得る。予測された１つ以上の分子配列を使用して、時系列データの１回以上の循環の後の時間に循環する病原性株のためのワクチンを設計し得る。

【0199】

機械学習モデルは、リカレントニューラルネットワークを含み得る。

【0200】

特定の実施形態では、生物学的反応を予測するためのデータ処理システムが提供される。システムは、コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読メモリを含む。このシステムは、生物学的反応を予測するように訓練された少なくとも１つの機械学習モデルを含む実行可能ロジックを実行するように構成された少なくとも１つのプロセッサを含み、その少なくとも１つのプロセッサがコンピュータ実行可能命令を実行しているとき、少なくとも１つのプロセッサは、１つ以上の操作を実行する。１つ以上の操作は、第１の分子配列の第１の配列データを受信することを含む。１つ以上の操作は、第２の分子配列の第２の配列データを受信することを含む。１つ以上の操作は、受信した第１及び第２の配列データに少なくとも部分的に基づいて、第２の分子配列に対する生物学的反応を予測することを含む。

【0201】

１つ以上の操作は、第１の分子配列及び第２の分子配列に対応する非ヒト生物学的反応データを受信することを含み得る。１つ以上の操作は、さらに非ヒト生物学的反応データに少なくとも部分的に基づいて生物学的反応を予測することを含み得る。１つ以上の操作は、第１の配列データ及び第２の配列データをアミノ酸ミスマッチとしてコードすることを含み得る。

【0202】

第１の分子配列は、候補抗原を含み得る。第２の分子配列は、既知のウイルス株を含み得る。

【0203】

生物学的反応を予測することは、ヒト生物学的反応を予測することを含み得る。生物学的反応を予測することは、少なくとも１つのヒト生物学的反応、及び少なくとも１つの非ヒト生物学的反応を予測することを含み得る。生物学的反応は、抗体力価を含み得る。機械学習モデルは、深層ニューラルネットワークを含み得る。

【0204】

機械学習技術は、偽陽性及び偽陰性の発生率が低下するように、生物学的反応を予測する機械学習モデルを訓練するために使用し得る。記載のシステム及び方法のうちの少なくともいくつかは、従来の手法と比較した場合、例えば、データの次元を削減することによって、本質的に疎なデータを効率的に処理するために使用し得る。記載のシステム及び方法の少なくともいくつかは、従来の手法と比較して予測精度を高めるために、受信データにおける非線形関係を利用し得る。記載のシステム及び記載の方法の少なくともいくつかは、ヒト生物学的反応及び非ヒト生物学的反応を同時に予測するために使用し得る。記載のシステム及び方法の少なくともいくつかは、実験的に観察されない結果を予測するために使用し得る。

【0205】

特定の実施形態では、１つ以上のコンピュータのシステムは、操作中にシステムに動作を実行させる、システムに搭載されたソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はこれらの組み合わせを有することによって、特定の操作又は動作を実行するように構成され得る。１つ以上のコンピュータプログラムは、データ処理装置によって実行されると、装置に動作を実行させる命令を含むことによって、特定の操作又は動作を実行するように構成され得る。一般的な一態様には、連続データアルゴリズムを使用することによってワクチンを製造するための方法が含まれる。本方法は、複数の第１の離散値を含み得る離散データオブジェクトを受信することを含み、離散データオブジェクトは、１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。本方法はまた、離散データオブジェクトを、複数の第１の連続値を含み得る連続データオブジェクトに変換することを含む。本方法はまた、連続データオブジェクトに、連続データアルゴリズムを適用して、複数の第２の連続値を含み得る連続結果オブジェクトを生成させることを含む。本方法はまた、連続結果オブジェクトを、複数の第２の離散値を含み得る離散結果オブジェクトに変換することを含む。本方法はまた、ｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質、ｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な核酸及びｉｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの少なくとも１つを含み得るワクチンを製造することを含む。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置及び１つ以上のコンピュータ記憶装置に記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれが方法の動作を実行するように構成されている。

【0206】

実装形態には、以下の特徴の１つ以上が含まれ得る。１つ以上のアミノ酸配列が、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を含み得る方法であって、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列のそれぞれが、それぞれの１文字又はそれぞれの文字列を含む、方法。離散データオブジェクトの連続データオブジェクトへの変換は、各第１の離散値について、重み値の重みベクトルを生成させること（各重み値は、第１の離散値が特定のアミノ酸を表す尤度を表す）；各重みベクトルの各重み値について、特性値の特性ベクトルを生成させること（各特性値は、特定のアミノ酸の物理化学的特性を表す）；及び重みベクトルと特性ベクトルとを組み合わせて、連続データオブジェクトの第１の連続値を生成させることを含み得る。各重みベクトルは２０個の重み値を有し、各重み値は、２０個の可能なアミノ酸のうち１つに対応する。連続結果オブジェクトの離散結果オブジェクトへの変換は、各第２の連続値について、それぞれの単一のアミノ酸を決定することを含み得、決定された単一のアミノ酸は複数の第２の離散値を形成する。本方法はさらに、複数の候補離散結果オブジェクトを生成させること；及び複数の候補離散結果オブジェクトから、製造可能性試験に失敗したアミノ酸を特定する少なくとも１つの離散結果オブジェクトを除外することを含み得る。連続結果オブジェクトを生成させるための連続データアルゴリズムの適用は、複数の損失基準に基づいて損失値を決定する損失関数を用いた勾配降下法を適用することを含み得、損失関数には、２つのアミノ酸配列が与えられた免疫学的反応に基づく第１の損失基準；正しく折り畳まれないと予測される野生型配列又はサブ配列のデータセットにおいて見出されないサブ配列についての損失値を修正する第２の損失基準；及び各重みベクトルについて、第２の連続値における最大値に基づいて損失値を修正する第３の損失基準が含まれ得る。記載される技術の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。

【0207】

一般的な一態様には、アミノ酸配列を生成させるためのシステムが含まれ、このシステムは、コンピュータメモリを含み得る。このシステムはまた、１つ以上のプロセッサも含み得る。このシステムはまた、プロセッサによって実行されるときに、操作をプロセッサに実行させる命令を保存するコンピュータメモリも含み得、その操作には、複数の第１の離散値を含む離散データオブジェクトを受信すること（離散データオブジェクトは１つ以上のアミノ酸配列を含む）；この離散データオブジェクトを複数の第１の連続値を含む連続データオブジェクトに変換すること；この連続データオブジェクトに連続データアルゴリズムを適用して、複数の第２の連続値を含む連続結果オブジェクトを生成させること；この連続結果オブジェクトを、複数の第２の離散値を含む離散結果オブジェクトに変換すること；及びｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質、ｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルのうち少なくとも１つを含むワクチンを製造することが含まれ得る。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置及び１つ以上のコンピュータ記憶装置に記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、方法の動作を実行するように構成されている。

【0208】

実装形態には、以下の特徴の１つ以上が含まれ得る。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸配列が、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を含み得、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列のそれぞれが、それぞれの１文字又はそれぞれの文字列を含む、システムがある。離散データオブジェクトの連続データオブジェクトへの変換は、各第１の離散値について、重み値の重みベクトルを生成させること（各重み値は、第１の離散値が特定のアミノ酸を表す尤度を表す）；各重みベクトルの各重み値について、特性値の特性ベクトルを生成させること（各特性値は、特定のアミノ酸の物理化学的特性を表す）；及び重みベクトルと特性ベクトルとを組み合わせて、連続データオブジェクトの第１の連続値を生成させることを含み得る。各重みベクトルは２０個の重み値を有し、各重み値は、２０個の可能なアミノ酸のうちの１つに対応する。連続結果オブジェクトの離散結果オブジェクトへの変換は、各第２の連続値について、それぞれの単一のアミノ酸を決定することを含み得、決定された単一のアミノ酸は複数の第２の離散値を形成する。操作はさらに：複数の候補離散結果オブジェクトを生成させること；及び複数の候補離散結果オブジェクトから、製造可能性試験に失敗したアミノ酸を特定する少なくとも１つの離散結果オブジェクトを除外することを含み得る。連続結果オブジェクトを生成させるための連続データアルゴリズムの適用は、複数の損失基準に基づいて損失値を決定する損失関数を用いた勾配降下法を適用することを含み得、損失関数には、２つのアミノ酸配列が与えられた免疫学的反応に基づく第１の損失基準；正しく折り畳まれないと予測される野生型配列又はサブ配列のデータセットに見出されないサブ配列の損失値を修正する第２の損失基準；及び各重みベクトルについて、第２の連続値における最大値に基づいて損失値を修正する第３の損失基準が含まれ得る。記載される手法の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。

【0209】

一般的な一態様は、１つ以上のプロセッサによって実行されると、１つ以上のプロセッサに、以下を含み得る操作を実行させる命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体を含む：複数の第１の離散値を含む離散データオブジェクトを受信すること（離散データオブジェクトは１つ以上のアミノ酸配列を含む）；この離散データオブジェクトを複数の第１の連続値を含む連続データオブジェクトに変換すること；この連続データオブジェクトに連続データアルゴリズムを適用して、複数の第２の連続値を含む連続結果オブジェクトを生成させること；この連続結果オブジェクトを、複数の第２の離散値を含む離散結果オブジェクトに変換すること、及びｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質、ｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義定されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）離散結果オブジェクトによって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルのうち少なくとも１つを含むワクチンを製造することが含まれ得る。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置及び１つ以上のコンピュータ記憶装置に記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、方法の動作を実行するように構成されている。

【0210】

実装形態には、以下の特徴の１つ以上が含まれ得る。１つ以上のアミノ酸配列が、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を含み得る媒体（第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列のそれぞれは、それぞれの１文字又はそれぞれの文字列を含む）。離散データオブジェクトの連続データオブジェクトへの変換は、各第１の離散値について、重み値の重みベクトルを生成させること（各重み値は、第１の離散値が特定のアミノ酸を表す尤度を表す）、各重みベクトルの各重み値について、特性値の特性ベクトルを生成させること（各特性値は、特定のアミノ酸の物理化学的特性を表す）；及び重みベクトルと特性ベクトルとを組み合わせて、連続データオブジェクトの第１の連続値を生成させることを含む。各重みベクトルは２０個の重み値を有し、各重み値は、２０個の可能なアミノ酸のうちの１つに対応する。連続結果オブジェクトの離散結果オブジェクトへの変換は、各第２の連続値について、それぞれの単一のアミノ酸を決定することを含み得、決定された単一のアミノ酸は複数の第２の離散値を形成する。記載される技術の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。

【0211】

特定の実施形態では、ワクチンとして使用するためのインフルエンザ抗原を生成させ得るアルゴリズムが本明細書中で開示される。一実装形態では、これには以下が含まれ得る：１）次の２つの段階を使用する機械学習（例えば、変分オートエンコーダアーキテクチャ）を通じて、全ての野生型ヘマグルチニン配列に対する削減次元空間を生成させること：
ａ）削減された空間に可変的に埋め込むこと（例えば、モデルが予測された平均及び分散を有する正規分布から選択された埋め込まれた座標を用いて、入力配列から平均及び分散を予測する）；
ｂ）次いで、削減された空間位置「オートエンコーダ」損失関数から元の配列にデコードし、入力及び出力配列の類似性によって削減すること。
２）削減次元空間における抗原（ワクチン候補）及びリードアウト株（標的配列）の位置に基づく免疫反応予測モデルを訓練すること［入力：段階１のモデルにより埋め込まれた抗原及びリードアウト、出力：抗体力価などの免疫反応の尺度］。
３）削減空間から候補ワクチン成分表現をサンプリングし、段階２に記載のモデルを用いて標的配列に対する予測性能によって候補ワクチン成分表現をランク付けし、上位候補を特定すること。
４）上位候補表現をデコードして［段階１ｂからのモデルを使用する］、元の野生型セットで観察された可能性又は観察されなかった可能性のあるヘマグルチニン配列を放出すること。

【0212】

１つ以上のコンピュータからなるシステムは、操作中にシステムに動作を実行させる、システムに搭載されたソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア又はこれらの組み合わせを有することによって、特定の操作又は動作を実行するように構成され得る。１つ以上のコンピュータプログラムは、データ処理装置によって実行されると装置に動作を実行させる命令を含むことによって、特定の操作又は動作を実行するように構成され得る。一般的な一態様には、アミノ酸配列を生成するための次元削減方法が含まれ、この方法は、１つ以上のコンピュータからなるシステムによって実行される。本方法は、複数の野生型アミノ酸配列を定義する１つ以上のデータオブジェクトを受信することを含む。本方法はまた、１つ以上のデータオブジェクトから、削減次元空間内の複数の削減次元配列を生成させることを含み、各削減次元配列は野生型アミノ酸配列の少なくとも１つのそれぞれのデータを含有し、削減次元空間は野生型アミノ酸配列よりも低次元であり、複数の削減次元配列は、削減次元空間の各次元に沿った値の分布を定義する。本方法はまた、複数の削減次元配列を使用して、削減次元空間内に複数の候補配列を生成させることを含む。本方法はまた、ウイルスアミノ酸配列を定義する１つ以上のデータオブジェクトを受信することを含む。本方法はまた、削減次元空間内に少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を生成させることを含む。本方法はまた、力価予測因子への入力として、候補配列のそれぞれ及び少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を提供することも含む。本方法はまた、力価予測因子からの出力として、候補配列のそれぞれについての候補スコアを受信することも含む。本方法はまた、候補配列の中から少なくとも１つの候補配列を選択することも含む。本方法はまた、選択された候補配列のそれぞれについて少なくとも１つの新しいアミノ酸配列を生成させることを含む。本方法はまた、生成された少なくとも１つのアミノ酸配列を提供することも含む。この方法はまた、生成されたアミノ酸配列のそれぞれが、それぞれのワクチンを製造するのに適している操作も含み、ワクチンは、ｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質、ｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの少なくとも１つを含み得る。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置及び１つ以上のコンピュータ記憶装置に記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、方法の動作を実行するように構成されている。

【0213】

実装形態には、以下の特徴の１つ以上が含まれ得る。本方法は、複数の削減次元配列の生成が、入力データの平均値及び分散値を予測する変分オートエンコーダを使用して野生型アミノ酸配列の表現を作成することを含み得る操作を含む。削減次元配列のそれぞれは、それぞれの値の群を含み、削減次元空間における複数の候補配列の生成は、複数の削減次元配列の値の分布をサンプリングすることを含み得る。力価予測因子は、入力として、ｉ）削減次元空間内の第１の配列、及びｉｉ）削減次元空間内の第２の配列を受信し；出力として、候補スコアとしての力価スコアを提供し、力価スコアは、第１の配列と第２の配列との間の生物学的反応の尺度を定義するように構成される。選択された候補配列として少なくとも１つの候補配列を選択することは、最も高い候補スコアを有するｎ個の候補配列を選択することを含み得る。本方法は、単一の候補配列が選択されるように、ｎが１の値である操作を含む。本方法は、複数の候補配列が選択されるように、ｎが１より大きい値である操作を含む。少なくとも１つの候補配列を選択された候補配列として選択することは、それぞれの候補スコアが閾値よりも大きい候補配列を選択することを含み得る。生成されたアミノ酸配列のそれぞれは、野生型アミノ酸配列の何れとも異なる。候補配列のうちの少なくとも１つは、複数の削減次元配列内にある。記載される技術の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。

【0214】

一般的な一態様には、アミノ酸配列を生成させるためのシステムが含まれ、このシステムは、コンピュータメモリを含み得る。このシステムはまた、１つ以上のプロセッサも含む。このシステムはまた、プロセッサによって実行されるときに、操作をプロセッサに実行させる命令を記憶するコンピュータメモリも含み、その操作には、複数の野生型アミノ酸配列を定義する１つ以上のデータオブジェクトを受信すること；その１つ以上のデータオブジェクトから、削減次元空間において複数の削減次元配列を生成させること（ここで、各削減次元配列は、野生型アミノ酸配列の少なくとも１つのそれぞれのデータを含有し、削減次元空間は、野生型アミノ酸配列よりも低次元であり、複数の削減次元配列は、削減次元空間の各次元に沿った値の分布を定義する）、複数の削減次元配列を使用して削減次元空間内に複数の候補配列を生成させること；ウイルスアミノ酸配列を定義する１つ以上のデータオブジェクトを受信すること；削減次元空間内に少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を生成させること；候補配列のそれぞれ及び削減次元ウイルス配列のうちの少なくとも１つを力価予測因子に入力として提供すること；候補配列のそれぞれに対する候補スコアを力価予測子から出力として受信すること；候補配列の中から少なくとも１つの候補配列を選択すること；選択された候補配列のそれぞれについて少なくとも１つの新しいアミノ酸配列を生成させること；及び生成された少なくとも１つのアミノ酸配列を提供すること（ここで、生成されたアミノ酸配列のそれぞれは、ｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質、ｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの少なくとも１つを含むそれぞれのワクチンを製造するのに好適である）が含まれ得る。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置及び１つ以上のコンピュータ記憶装置に記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、方法の動作を実行するように構成されている。

【0215】

実装形態には、以下の特徴の１つ以上が含まれ得る。複数の削減次元配列の生成が、入力データの平均値及び分散値を予測する変分オートエンコーダを使用して野生型アミノ酸配列の表現を作成することを含み得るシステム。削減次元配列のそれぞれは、それぞれの値のグループを含み、削減次元空間における複数の候補配列の生成は、複数の削減次元配列の値の分布をサンプリングすることを含み得る。力価予測因子は、入力として、ｉ）削減次元空間内の第１の配列、及びｉｉ）削減次元空間内の第２の配列を受信し；出力として、候補スコアとしての力価スコアを提供するように構成され、力価スコアは、第１の配列と第２の配列との間の生物学的反応の尺度を定義する。選択された候補配列として少なくとも１つの候補配列を選択することは、最も高い候補スコアを有するｎ個の候補配列を選択することを含み得る。記載される技術の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。

【0216】

一般的な一態様は、１つ以上のプロセッサによって実行されるときに、１つ以上のプロセッサに、以下を含む操作を実行させる、命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体を含む：複数の野生型アミノ酸配列を定義する１つ以上のデータオブジェクトを受信すること；その１つ以上のデータオブジェクトから、削減次元空間において複数の削減次元配列を生成させ（ここで、各削減次元配列は、野生型アミノ酸配列の少なくとも１つのそれぞれのデータを含有し、削減次元空間は、野生型アミノ酸配列よりも低次元であり、複数の削減次元配列は、削減次元空間の各次元に沿った値の分布を定義する）、複数の削減次元配列を使用して削減次元空間内に複数の候補配列を生成させること；ウイルスアミノ酸配列を定義する１つ以上のデータオブジェクトを受信すること；削減次元空間内に少なくとも１つの削減次元ウイルス配列を生成させること；候補配列のそれぞれ及び削減次元ウイルス配列のうちの少なくとも１つを力価予測因子に入力として提供すること；候補配列のそれぞれに対する候補スコアを力価予測子から出力として受信すること；候補配列の中から少なくとも１つの候補配列を選択すること；選択された候補配列のそれぞれについて少なくとも１つの新しいアミノ酸配列を生成させること；及び生成された少なくとも１つのアミノ酸配列を提供すること（ここで、生成されたアミノ酸配列のそれぞれは、ｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質、ｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な核酸、及びｉｉｉ）生成されたアミノ酸配列によって定義されるタンパク質を生成可能な送達ビヒクルの少なくとも１つを含むそれぞれのワクチンを製造するのに好適である）が含まれる。この態様の他の実施形態は、対応するコンピュータシステム、装置及び１つ以上のコンピュータ記憶装置に記録されたコンピュータプログラムを含み、それぞれ、方法の動作を実行するように構成されている。

【0217】

実装形態には、以下の特徴の１つ以上が含まれ得る。複数の削減次元配列の生成が、入力データの平均値及び分散値を予測する変分オートエンコーダを使用して野生型アミノ酸配列の表現を作成することを含み得る媒体。削減次元配列のそれぞれは、それぞれの値の群を含み、削減次元空間における複数の候補配列の生成は、複数の削減次元配列の値の分布をサンプリングすることを含み得る。力価予測因子は、入力として、ｉ）削減次元空間内の第１の配列及びｉｉ）削減次元空間内の第２の配列を受信し；出力として、候補スコアとしての力価スコアを提供するように構成され、力価スコアは、第１の配列と第２の配列との間の生物学的反応の尺度を定義する。記載される技術の実装形態には、ハードウェア、方法若しくはプロセス、又はコンピュータにアクセス可能な媒体上のコンピュータソフトウェアが含まれ得る。

【0218】

これら及び他の態様、特徴及び実装形態は、方法、装置、システム、構成要素、プログラム製品、ビジネスを行う方法、機能を実行するための手段又は段階として、及び他の方法で表され得、特許請求の範囲を含む以下の説明から明らかになるであろう。

【0219】

本開示の実装形態は、以下の利点を提供し得る。従来の技術と比較した場合、ワクチンを将来の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）に向けて設計し、その将来の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）の少なくとも１つの病原性株に対する生物学的反応量の観点から、より多くの防御を付与し得る。従来の手法と比較した場合、ワクチンを将来の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）に向けて設計し、将来の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）の複数の病原性株を有効にカバーする範囲の広さ（即ち、将来の発病シーズン（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｅａｓｏｎ）において多くの病原性株に対し有効な免疫学的反応を誘発する）の観点から、より多くの防御を付与し得る。従来の技術とは異なり、頻繁に観察される株よりも多くの株と交差反応するので、「より多くの防御」を与え得る、稀にしか観察されない株が評価され得、それらのワクチン接種の有効性が予測され得る。

【0220】

使用方法
本開示は、本明細書中に記載のワクチンを対象に投与する方法を提供する。本方法は、対象にインフルエンザウイルスに対してワクチン接種するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種方法は、インフルエンザウイルスに対して対象にワクチン接種するために有効な量で、ワクチン接種を必要とする対象に、例えば（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと、（ｉｉ）本明細書中に記載のようなインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチンを含む、本明細書中に記載のワクチンの何れかを投与することを含む。同様に、本開示は、例えば、インフルエンザウイルスに対する対象へのワクチン接種における使用のための、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチンを含む、インフルエンザウイルスに対する対象へのワクチン接種における使用のための本明細書中に記載のワクチンの何れかを提供する。インフルエンザウイルスに対する対象へのワクチン接種における使用のためのワクチンの製造のための、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む免疫原性組成物も本明細書中で開示される。

【0221】

本開示はまた、例えば、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチンを含む、本明細書中に記載のワクチンの何れかの免疫学的有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与する方法も提供する。同様に、本開示は、インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与することにおける使用のための、例えば、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチンを含む、インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与することにおける使用のための、本明細書中に記載のワクチンの何れかを提供する。また、インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与することにおける使用のためのワクチンの製造のための、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む免疫原性組成物も本明細書中で開示される。

【0222】

いくつかの実施形態では、本方法又は使用は、対象におけるインフルエンザウイルス感染又は疾患を予防する。いくつかの実施形態では、本方法又は使用は、対象において防御免疫反応を引き起こす。いくつかの実施形態では、防御免疫反応は、抗体反応である。

【0223】

本明細書で提供される免疫付与の方法（又は関連する使用）は、１種類以上のインフルエンザウイルスに対する中和免疫反応を広く誘発し得る。従って、様々な実施形態では、本明細書中に記載の組成物は、様々なタイプのインフルエンザウイルスに対して広範な交差防御を提供し得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、トリ、ブタ、季節性及び／又はパンデミックインフルエンザウイルスに対する交差防御を提供する。いくつかの実施形態では、免疫付与の方法（又は関連する使用）は、１種類以上の季節性インフルエンザ株（例えば標準治療株）に対し、改善された免疫反応を誘発可能である。例えば、改善された免疫反応は、改善された液性免疫反応であり得る。いくつかの実施形態では、免疫付与の方法（又は関連する使用）は、１種類以上のパンデミックインフルエンザ株に対し、改善された免疫反応を誘発し得る。いくつかの実施形態では、免疫付与の方法（又は関連する使用）は、１種類以上のブタインフルエンザ株に対する改善された免疫反応を誘発可能である。いくつかの実施形態では、免疫付与の方法（又は関連する使用）は、１種類以上のトリインフルエンザ株に対する改善された免疫反応を誘発可能である。

【0224】

特定の実施形態では、対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化する方法が本明細書中で提供され、この方法は、免疫学的有効量の本明細書中で開示されるワクチンの何れかを対象に投与することを含む。同様に、本開示は、例えば（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子とを含むワクチンを含む、対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化することにおける使用のための本明細書中に記載のワクチンの何れかを提供する。対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化することにおける使用のためのワクチンの製造のための、本明細書中に記載のような免疫原性組成物も本明細書中で開示される。特定の実施形態では、本明細書中で開示されるワクチンは、約５％～約１００％、例えば約１０％～約２５％、約２０％～約１００％、約１５％～約７５％、約１５％～約５０％、約２０％～約７５％、約２０％～約５０％又は約４０％～約８０％など、例えば約４０％～約６０％又は約６０％～約８０％などの範囲の量で、標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン効力を向上させる。特定の実施形態では、本明細書中で開示されるワクチンは、標準治療インフルエンザウイルスワクチンのワクチン効力よりも少なくとも５％大きいワクチン効力、例えば、標準治療インフルエンザウイルスワクチンのワクチン効力よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも１００％大きいワクチン効力を有する。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示されるワクチンは、標準治療インフルエンザウイルスワクチンのワクチン効力と少なくとも等しいワクチン効力を有する。

【0225】

特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチンは、不活性化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）、例えば３価又は４価ＩＩＶであり得る。一般的には、標準治療、不活性化インフルエンザウイルスワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統からの不活性化されたインフルエンザウイルスを含む。特定の実施形態では、標準治療インフルエンザウイルスワクチンは、組み換えインフルエンザウイルスＨＡを含み得、例えば組み換えインフルエンザウイルスＨＡを含む３価又は４価ワクチン組成物などである。一般的には、標準治療、組み換えＨＡワクチン組成物は、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の組み換えＨＡを含む。ワクチン効力は、ワクチン接種した集団と非ワクチン接種集団又は異なるワクチンが投与された集団との間での疾患の軽減の割合として表され得る。特定の実施形態では、ワクチン効力は、次の式に従い、ワクチン接種した集団における疾患症例の比率を非ワクチン接種での疾患症例の比率から差し引き、非接種集団での疾患症例の比率によって除することによって計算され得る：［（非接種集団における疾患の比率）－（接種集団における疾患の比率）／（非接種集団における疾患の比率）×１００］。

【0226】

対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防するための有効量で、例えば（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチンを含め、本明細書中に記載のワクチンの何れかを対象に投与することを含む、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防する方法も提供される。同様に、本開示は、例えば、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含むワクチンを含め、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防することにおける使用のための本明細書中に記載のワクチンの何れかを提供する。対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防することにおける使用のためのワクチンの製造のための、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む免疫原性組成物も本明細書中で開示される。

【0227】

また、例えば（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子とを含むワクチンを含む本明細書中に記載のワクチンの何れかを対象に投与することを含む、対象においてインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザウイルスＮＡに対する免疫反応を誘導する方法も提供される。同様に、本開示は、例えば（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせと（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又はそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子とを含むワクチン組成物を含む、対象においてインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザウイルスＮＡに対して免疫反応を誘導することにおける使用のための本明細書中に記載のワクチンの何れかを提供する。また、対象においてインフルエンザウイルスＨＡ及びインフルエンザウイルスＮＡに対する免疫反応を誘導することにおける使用のためのワクチンの製造のための、（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡ、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせと、（ｉｉ）インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ又は本明細書中に記載のようなそれらの組み合わせをコードする１種類以上のリボ核酸分子と、を含む免疫原性組成物も本明細書中で開示される。

【0228】

本明細書中に記載のようなＨＡ、ＮＡ及び／又はリボ核酸分子及び任意選択的なアジュバントを含むワクチンは、インフルエンザ感染の１つ以上の症状の発症前又は発症後に投与され得る。即ち、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のワクチンは、インフルエンザ感染を予防するか又は可能性があるインフルエンザ感染の症状を改善するために、予防的に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象が季節性又はパンデミックインフルエンザウイルスに感染していることが知られているか又は疑われる他の個体又は家畜（例えばブタ）と接触する場合、及び／又はインフルエンザ感染が知られているか又は流行している若しくはエンデミックであると考えられる地域に対象が存在している場合、対象はインフルエンザウイルス感染のリスクがある。いくつかの実施形態では、本ワクチンは、インフルエンザ感染に罹患している対象に投与されるか、又は対象は、インフルエンザ感染に一般に関連する１つ以上の症状を示している。いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されていると分かっているか又は曝露されていると考えられている。いくつかの実施形態では、対象がインフルエンザウイルスに曝露されていると分かっているか又は曝露されていると考えられている場合、対象はインフルエンザに感染するリスクがあるか又は感染し易い。いくつかの実施形態では、パンデミックインフルエンザウイルスに感染していると分かっているか又は疑われる他の個体又は家畜（例えばブタ）と対象が接触している場合、及び／又はインフルエンザ感染が流行している若しくはエンデミックであることが知られているか又はそのように考えられる地域に対象が存在するか若しくは存在したことがある場合、対象はインフルエンザウイルスに曝露されていることが分かっているか又は曝露されていると考えられる。本明細書中で開示されるワクチンは、季節性及びパンデミックインフルエンザ株の何れか又は両方によって引き起こされる疾患を処置又は予防するために使用され得る。

【0229】

本開示によるワクチンは、所望の転帰を達成するのに適切な何れかの量又は用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、所望の転帰は、季節性株及びパンデミック株の両方を含む広範囲のインフルエンザ株に対する持続的な適応免疫反応の誘導である。いくつかの実施形態では、所望の転帰は、インフルエンザ感染の１つ以上の症状の強度、重症度及び／又は頻度の低下及び／又は発症の遅延である。必要とされる用量は、対象の種、年齢、体重及び全身状態、処置される感染症の重症度、使用される特定の組成物及びその投与方法に応じて、対象ごとに変動し得る。

【0230】

様々な実施形態では、本明細書中に記載のワクチンが対象に投与され、対象は動物界のあらゆるメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト対象は、鳥類（例えば、ニワトリ又はトリ）、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／又は蠕虫である。いくつかの実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、フェレット、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類及び／又はブタ）である。

【0231】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のワクチンは、ヒト対象に投与される。特定の実施形態では、ヒト対象は、６カ月齢以上、６カ月齢～３５カ月齢、少なくとも２歳、少なくとも３歳、３６カ月齢～８歳、９歳以上、少なくとも６カ月齢及び５歳未満、少なくとも６カ月齢及び１８歳未満又は少なくとも３歳及び１８歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、乳幼児（３６カ月未満）である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、小児又は青年（１８歳未満）である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、少なくとも６カ月齢及び５歳未満の小児である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、少なくとも５歳及び６０歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、少なくとも５歳及び６５歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、高齢者（少なくとも６０歳又は少なくとも６５歳）である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、非高齢成人（少なくとも１８歳及び６５歳未満又は少なくとも１８歳及び６０歳未満）である。

【0232】

一般的には、本明細書中に記載の方法及びワクチンの使用は、対象への単回投与を含む（即ちブースター投与なし）。しかし、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法及びワクチンの使用は、プライムブーストワクチン接種ストラテジーを含む。プライムブーストワクチン接種は、プライムワクチンを投与し、その後、ある期間が経過した後、ブーストワクチンを対象に投与することを含む。免疫反応は、プライムワクチンの投与時に「予備刺激」され、ブーストワクチンの投与時に「強化」される。プライムワクチンは、本明細書中に記載のようなインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ及び／又はリボ核酸分子と任意選択的なアジュバントとを含むワクチンを含み得る。同様に、ブーストワクチンは、本明細書中に記載のようなインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ及び／又はリボ核酸分子と任意選択的なアジュバントとを含むワクチンを含み得る。プライムワクチンはブーストワクチンと同じであり得るが、同じである必要はない。ブーストワクチンの投与は一般に、プライム組成物の投与から数週間又は数カ月後、好ましくは約２～３週間後、又は４週間後、又は８週間後、又は１６週間後、又は２０週間後、又は２４週間後、又は２８週間後、又は３２週間後である。特定の実施形態では、プライムブーストワクチン接種のレシピエントは、無感作の対象、一般的には無感作の乳幼児又は小児である。

【0233】

本ワクチンは、上記で論じるように、例えば非経口送達を含む、何らかの適切な投与経路を用いて投与され得る。

【0234】

一般的には、本明細書中に記載のようなインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ及び／又はリボ核酸分子並びに任意選択的なアジュバントは、同じワクチン組成物の構成成分として一緒に投与される。しかし、本明細書中に記載のようなインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ及び／又はリボ核酸分子は、同じワクチン組成物の一部として投与される必要はない。即ち、必要に応じて、本明細書中に記載のようなインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＡ、リボ核酸分子及び／又は任意選択的なアジュバントは、対象に個別に投与され得る。例えば、少なくとも４種類のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、例えば４種類の組み換えインフルエンザウイルスＨＡなどを含む第１のワクチンは、１種類以上の、例えば４種類のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸を含む第２のワクチンとは別個に対象に投与され得る。第１及び第２のワクチンが別個に投与される場合、第１及び第２のワクチンは、異なる部位で対象に投与され得る。

【0235】

本開示は、以下の実施例を参照することによってより深く理解されるであろう。

【0236】

本開示の代表的な実施形態
１．
（ｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質と、
（ｉｉ）１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１種類以上のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質又はそれらの組み合わせから選択される１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１種類以上のリボ核酸分子と、
を含む、免疫原性組成物。
２．（ｉ）における１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が組み換えインフルエンザウイルスタンパク質である、実施形態１に記載の免疫原性組成物。
３．（ｉ）における１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が不活性化インフルエンザウイルス（ＩＩＶ）中に存在する、実施形態１又は２に記載の免疫原性組成物。
４．前記１種類以上のリボ核酸分子がｍＲＮＡ分子である、実施形態１～３の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
５．前記免疫原性組成物が、８種類を超えない（ｉ）におけるインフルエンザウイルスタンパク質と、８種類を超えないインフルエンザウイルスタンパク質をコードする（ｉｉ）におけるリボ核酸分子と、を含む、実施形態１～４の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
６．実施形態１～５の何れか１つに記載の免疫原性組成物であって、
（ｉ）の前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類のインフルエンザウイルスタンパク質を含み；
（ｉｉ）の１種類以上のリボ核酸分子が、インフルエンザウイルスＨ１ ＨＡ、インフルエンザウイルスＨ３ ＨＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮ１ ＮＡ、インフルエンザウイルスＮ２ ＮＡ、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡ又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のインフルエンザウイルスＮＡから選択される１～８種類のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、免疫原性組成物。
７．４種類を超えない（ｉ）におけるインフルエンザウイルスタンパク質と、４種類を超えないインフルエンザウイルスタンパク質をコードする（ｉｉ）におけるリボ核酸分子と、を含む、実施形態１～６の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
８．８価免疫原性組成物である、実施形態１～７の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
９．（ｉ）における前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が４種類の組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含み；前記１種類以上のリボ核酸分子が、４種類のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする、実施形態１～８の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
１０．（ｉ）における前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、４種類の組み換えインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み；前記１種類以上のリボ核酸分子が、４種類のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードする、実施形態１～８の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
１１．１６価免疫原性組成物である、実施形態１～６の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
１２．実施形態１～６の何れか１つに記載の免疫原性組成物であって、
（ａ）前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、
第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ１ ＨＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ３ ＨＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；及び
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質
を含み；
（ｂ）前記１種類以上のリボ核酸分子が、
第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ１ ＮＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ２ ＮＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；及び
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質
をコードする、免疫原性組成物。
１３．前記Ｈ１ ＨＡが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｈ３ ＨＡが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｎ１ ＮＡが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｎ２ ＮＡが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、実施形態１２に記載の免疫原性組成物。
１４．前記Ｈ１ ＨＡ及び前記Ｎ１ ＮＡが同じＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡ及びＮ２ ＮＡが同じＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、実施形態１３に記載の免疫原性組成物。
１５．前記第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質のそれぞれが組み換えインフルエンザウイルスＨＡである、実施形態１２～１４の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
１６．前記１種類以上のリボ核酸分子が、４種類の全長インフルエンザウイルスＮＡタンパク質をコードする、実施形態１～９又は１１～１５の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
１７．実施形態１～６の何れか１つに記載の免疫原性組成物であって、
（ａ）前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質が、
第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ１ ＮＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質はＮ２ ＮＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質
を含み；
（ｂ）前記１種類以上のリボ核酸分子が、
第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第１のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ１ ＨＡである）；
第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（前記第２のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質はＨ３ ＨＡである）；
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）インフルエンザウイルス系統由来の第３のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；及び
Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）インフルエンザウイルス系統由来の第４のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質
をコードする、免疫原性組成物。
１８．前記Ｎ１ ＮＡが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｎ２ ＮＡが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来であり、前記Ｈ１ ＨＡが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、実施形態１７に記載の免疫原性組成物。
１９．前記Ｈ１ ＨＡ及び前記Ｎ１ ＮＡが、同じＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株由来であり、及び／又は前記Ｈ３ ＨＡ及び前記Ｎ２ ＮＡが、同じＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株由来である、実施形態１８に記載の免疫原性組成物。
２０．前記第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質のそれぞれが組み換えインフルエンザウイルスＮＡである、実施形態１７～１９の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
２１．前記第１、第２、第３及び第４のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質のそれぞれが、４個の修飾された組み換え単量体ＮＡ分子を含む修飾された組み換え四量体インフルエンザウイルスＮＡであり、前記修飾された組み換え単量体ＮＡ分子のそれぞれが前記インフルエンザウイルスＮＡの頭部領域及び異種四量体化ドメインを含むが、前記インフルエンザウイルスＮＡの細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てを欠き、宿主細胞で発現される場合に前記４個の修飾された組み換え単量体ＮＡ分子が修飾された組み換え四量体ＮＡを形成する、実施形態２０に記載の免疫原性組成物。
２２．前記異種四量体化ドメインが、スタフィロテルムス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）テトラブラチオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）四量体化ドメイン、ＧＣＮ４ロイシンジッパー四量体化ドメイン、パラミクソウイルスリン酸化タンパク質からの四量体化ドメイン又はヒト血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）四量体化ドメインである、実施形態２１に記載の免疫原性組成物。
２３．前記第２のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質が、４個の修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２を含む修飾された組み換え四量体Ｎ２ ＮＡであり、前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２のそれぞれが、
インフルエンザウイルスＮ２の頭部領域を含み、
前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２のそれぞれが、前記インフルエンザウイルスＮ２の、細胞質尾部、膜貫通領域及びストーク領域の全て又は実質的に全てを含有せず、前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２のそれぞれが異種オリゴマー化ドメインを含有しない、実施形態２０に記載の免疫原性組成物。
２４．前記修飾された組み換え単量体インフルエンザウイルスＮ２が、前記インフルエンザウイルスＮ２のアミノ酸１～７０、１～７１、１～７２、１～７３、１～７４、１～７５、１～７６、１～７７、１～７８、１～７９、１～８０、１～８１、１～８２、１～８３又は１～８４を欠く、実施形態２３に記載の免疫原性組成物。
２５．前記１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質の少なくとも１つが、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有するインフルエンザウイルスＨＡタンパク質及び／又はインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み、及び／又は前記１種類以上のリボ核酸分子の少なくとも１つが、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有する１種類以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、実施形態１～２４の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
２６．アジュバントをさらに含む、実施形態１～２５の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
２７．前記アジュバントが、水中スクアレンアジュバント又はリポソームに基づくアジュバントを含む、実施形態２６に記載の免疫原性組成物。
２８．前記１種類以上のリボ核酸分子が少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、実施形態１～２７の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
２９．前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオチドが、シュードウリジン、任意選択的にＮ１－メチルシュードウリジン、２’－フルオロリボヌクレオチド、２’－メトキシリボヌクレオチド及び／又はホスホロチオエート結合を含む、実施形態２８に記載の免疫原性組成物。
３０．前記１種類以上のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質が、培養される昆虫細胞においてバキュロウイルス発現系により産生される組み換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質である、実施形態１～２９の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３１．前記インフルエンザウイルスＮＡタンパク質の１つ以上が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される組み換えインフルエンザウイルスＮＡタンパク質である、実施形態１～３０の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３２．前記１種類以上のリボ核酸分子が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入される、実施形態１～３１の何れか１つ記載の免疫原性組成物。
３３．ＬＮＰ中に前記１種類以上のリボ核酸分子が封入されており、アジュバントをさらに含まない、実施形態１～３２の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３４．同じＬＮＰ中に封入される少なくとも２種類のリボ核酸分子を含む、実施形態１～３３の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３５．同じＬＮＰ中に封入される少なくとも４種類のリボ核酸分子を含む、実施形態１～３４の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３６．（ｉ）における前記インフルエンザウイルスタンパク質及び／又は（ｉｉ）における前記リボ核酸分子が、標準治療インフルエンザ株由来である、実施形態１～３５の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３７．前記ＬＮＰが、陽イオン性脂質、ポリエチレングリコール複合化（ＰＥＧ化）脂質、コレステロールに基づく脂質及びヘルパー脂質を含む、実施形態３２～３６の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
３８．前記ＬＮＰが、
３５％～４５％のモル比の陽イオン性脂質、
０．２５％～２．７５％のモル比のＰＥＧ化脂質、
２５％～３５％のモル比のコレステロールに基づく脂質、及び
２５％～３５％のモル比のヘルパー脂質
を含む、実施形態３７に記載の免疫原性組成物。
３９．前記ＬＮＰが、
４０％のモル比の陽イオン性脂質、
１．５％のモル比のＰＥＧ化脂質、
２８．５％のモル比のコレステロールに基づく脂質及び
３０％のモル比のヘルパー脂質
を含む、実施形態３８に記載の免疫原性組成物。
４０．前記陽イオン性脂質が、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０及びＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４を含む群から選択される、実施形態３７～３９の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４１．前記陽イオン性脂質がｃＫＫ－Ｅ１０である、実施形態３７～４０の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４２．前記ＰＥＧ化脂質がジミリストイル－ＰＥＧ２０００である、実施形態３７～４１の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４３．前記コレステロールに基づく脂質がコレステロールである、実施形態３７～４２の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４４．前記ヘルパー脂質がジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンである、実施形態３７～４３の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４５．前記ＬＮＰが、４０％のモル比のｃＫＫ－Ｅ１０；１．５％のモル比のジミリストイル－ＰＥＧ２０００；２８．５％のモル比のコレステロール；及び３０％のモル比のジオレオイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含む、実施形態３７～４４の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４６．前記ＬＮＰが、（ｉ）前記陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）ＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール、（ｉｉｉ）前記ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）コレステロールを含む、実施形態３２～３７の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４７．前記ＬＮＰが、（ｉ）約２５％～約６５％のモル比の前記陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）約０．５％～約２．６％のモル比の前記ＰＥＧ化脂質としてのＮ，Ｎジテトラデシルアセトアミド－ポリエチレングリコール、（ｉｉｉ）約５％～約１５％のモル比の前記ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）約２０％～約６０％のモル比のコレステロール、例えばｉ）約４６．３％のモル比の前記陽イオン性脂質としてのＡＬＣ－０３１５、（ｉｉ）約１．６％のモル比のＰＥＧ化脂質としてのＡＬＣ－０１５９、ｉｉｉ）約９．４％のモル比の前記ヘルパー脂質としてのＤＳＰＣ及び（ｉｖ）約４２．７％のモル比のコレステロールなど、を含む、実施形態３２～３７又は４６の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４８．（ｉ）における前記インフルエンザウイルスタンパク質のそれぞれが、約０．１μｇ～約９０μｇ、任意選択的に約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記免疫原性組成物中に存在する、実施形態１～４７の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
４９．前記リボ核酸分子のそれぞれが、約０．１μｇ～約１５０μｇ、任意選択的に約１μｇ～約６０μｇ又は約５μｇ～約４５μｇの範囲の量で前記免疫原性組成物中に存在する、実施形態１～４８の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
５０．筋肉内注射用に処方される、実施形態１～４９の何れか１つに記載の免疫原性組成物。
５１．請求項１～５０の何れか１つに記載の免疫原性組成物と、医薬担体と、を含むワクチン。
５２．インフルエンザウイルスに対して対象に免疫付与する方法であって、実施形態５１に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
５３．前記対象においてインフルエンザウイルス感染を予防する、実施形態５２に記載の方法。
５４．前記対象において防御免疫反応を生じさせる、実施形態５２又は５３に記載の方法。
５５．前記防御免疫反応が、ＨＡ抗体応答及び／又はＮＡ抗体応答を含む、実施形態５４に記載の方法。
５６．前記対象がヒトである、請求項５２～５５の何れか１つに記載の方法。
５７．前記ワクチンが、筋肉内に、皮内に、皮下に、静脈内に、鼻腔内に、吸入により、又は腹腔内に投与される、実施形態５２～５６の何れか１つに記載の方法。
５８．季節性インフルエンザ株及びパンデミックインフルエンザ株の何れか又は両方によって引き起こされる疾患を処置又は予防する、実施形態５２～５７の何れか１つに記載の方法。
５９．前記対象がヒトであり、前記ヒトが、６カ月齢以上、１８歳未満、少なくとも６カ月齢及び１８歳未満、少なくとも１８歳及び６５歳未満、少なくとも６カ月齢及び５歳未満、少なくとも５歳及び６５歳未満、少なくとも６０歳又は少なくとも６５歳である、実施形態５２～５８の何れか１つに記載の方法。
６０．実施形態５１に記載のワクチンの予防的有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の１つ以上の症状を軽減する方法。
６１．対象において防御的免疫反応を増強するか又は広幅化する方法であって、実施形態５１に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記対象に投与することを含み、前記ワクチンが標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物のワクチン効力を、約５％～約１００％の範囲の量、例えば少なくとも約２０％など、向上させる、方法。
６２．前記標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物が、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の不活性化インフルエンザウイルスを含む不活性化インフルエンザウイルス組成物である、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記標準治療インフルエンザウイルスワクチン組成物が、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来の組み換えインフルエンザウイルスＨＡを含む、実施形態６１に記載の方法。
６４．２～６週間、任意選択的に４週間の間隔で、前記ワクチンの２回分を前記対象に投与することを含む、実施形態５２～６３の何れか１つに記載の方法。

【実施例】

【0237】

以下の実施例は例示的なものと見なされるべきであり、上記の開示の範囲を限定するものではない。

【0238】

動物実験は、実験動物の人道的管理と使用（Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に関する公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）（ＰＨＳ）規範、及び実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に準拠して行い、Ｓａｎｏｆｉ動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）からの承認された動物プロトコールで実施した。動物は全て、特定の病原体を含まない条件下で、餌及び水を自由に与えて飼育した。

【0239】

インフルエンザウイルス：逆遺伝学によって、酵素連結レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）で使用される再集合Ｈ６ウイルスを作製し、各再集合物は、標的とされるＮＡ抗原、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ（マガモ）／Ｓｗｅｄｅｎ（スウェーデン）／８１／２００２ Ｈ６Ｎ１由来のＨＡ及びＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（プエルトリコ）／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１由来の内部遺伝子（「ＰＲ８」）を発現した。非コード領域を含むＨＡ及びＮＡセグメントは、カスタム遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ）によって作製され、ＰＲ８セグメントは、ウイルス単離株由来であった。ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）Ｉ及びＰｏｌ ＩＩプロモーターの組み込みにより、ｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に由来する二方向性転写プラスミドへと全てのセグメントをクローニングした。簡潔に述べると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ＣＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、各インフルエンザウイルスセグメントに相当する全部で８種類のプラスミドを遺伝子移入した。２４時間後に、ＴＰＣＫ処理したトリプシン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、遺伝子移入した細胞にＭＤＣＫ－ＡＴＬ細胞（ＡＴＣＣ）を添加して、インフルエンザウイルスが増殖するようにした。ＭＤＣＫ添加の７日後にインフルエンザウイルスを含有する細胞培養上清を回収し、８～１０日齢の有胚ニワトリ卵において継代した（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。接種を行った卵を３７℃にて４８時間インキュベートし、次いで４℃に１２時間冷却し、回収し、低速遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）によって清澄化した。ＭＤＣＫ細胞上でプラークアッセイによってウイルス力価を決定した。

【0240】

ＨＡＩ検査に含まれたＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７（Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統）、Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６（Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統）及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０７３／２０１３（Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統）の、卵で増殖させたストックは、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ）により提供された。フェレットでの試験で使用された野生型インフルエンザＡ／Ｐｅｒｔｈ（パース）／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）は、ＩＩＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）により提供された。ウイルスは全て、使用まで－６５℃未満で保管した。

【0241】

ワクチン抗原：組み換え、可溶性インフルエンザＮＡの発現のために、コンストラクトを設計した。四量体及び単量体の両方のＮＡコンストラクト設計には、Ｎ末端ＣＤ５分泌シグナルペプチド、任意選択的な６ＨＩＳタグ（精製のため）及び球状ノイラミニダーゼ頭部ドメインが含まれる。四量体設計（ｒＴＥＴ－ＮＡ）は、多量体化のためにＨＩＳタグと球状頭部との間にテトラブラチオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）ドメインも含有する。定められたアミノ酸配列を使用して、オリゴヌクレオチド及び／又はＰＣＲ産物からコドン最適化された合成遺伝子を組み立て、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に断片を挿入した。形質転換された細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、遺伝子移入に適切な濃度を達成するために調整した。ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞においてタンパク質発現を行った。分泌されたタンパク質を細胞から分離するために清澄化段階を行った。アフィニティー（ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム－ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いて陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｑ ＨＰ－ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）、１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）への透析及び０．２μｍ滅菌ろ過によって、宿主細胞タンパク質からＮＡタンパク質を精製した。カレント・グッド・リサーチ・プラクティシーズ（ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｏｏｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ｃＧＲＰ）に従って、ＮＡワクチン調製物を作製した。

【0242】

ＮＡＩ応答の酵素連結レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）評価：Ｃｏｕｚｅｎｓ，Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｌｅｃｔｉｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４，２１０：７－１４において以前記載されたようなＥＬＬＡによって、関心対象の株由来のＮＡを含有するＨ６再集合ウイルスに対してＮＡＩ抗体応答を測定した。簡潔に述べると、最大ＮＡ酵素活性の７０％を提供するウイルスの標準量を決定するために、フェチュインでコーティングされた９６ウェルプレート中で関心対象の株由来のＮＡを含有するＨ６再集合ウイルスを滴定した。熱不活性化血清の２倍連続希釈を行うことによって、血清中に存在するＮＡＩ抗体の滴定を達成した。次に、フェチュインコーティングしたプレート中で５０μＬの、最大ＮＡ酵素活性の７０％に対応する希釈したウイルスに、全部で５０μＬの希釈血清を添加した。血清－ウイルス混合物を３７℃で一晩インキュベートした。プレートを４回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ－（ＨＲＰ－）複合化ピーナツアグルチニン（ＰＮＡ）とともにインキュベートし、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）の添加による発色前に再び洗浄した。ウイルス対照と比較した低シグナル又はシグナルなしは、ＮＡ特異的な抗体が存在することによるＮＡ活性の阻害を示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形４パラメータロジスティック（４ＰＬ）曲線を用いてＮＡＩ力価を近似し、５０％最大阻害濃度（ＩＣ_５０）を計算した。

【0243】

ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイ：ＨＡＩアッセイの前に、血清を受容体破壊酵素（ＲＤＥ；Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ，Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）で処理して、非特異的阻害剤を不活性化した。ｖ底マイクロタイタープレート中で、ＲＤＥ処理した血清を連続希釈した（２倍希釈）。ＨＡＩリードアウトパネルからの各ウイルスの等量を各ウェルに添加した（１ウェル当たり４赤血球凝集単位（ＨＡＵ））。本実施例に対して、別段示されない限り、相同ウイルスパネルには、卵において増殖させたＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７又はＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６（Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統）及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０７３／２０１３（Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統）ウイルスが含まれた。プレートを被覆し、室温で２０分間（又は４５～６０分間）インキュベートし、続いて、ＰＢＳ中の、ニワトリ赤血球（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）；ＣＲＢＣ）の１％混合物又はシチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の０．５％混合物を添加した。プレートを撹拌によって混合し、被覆し、ＲＢＣを室温でおよそ３０分～１時間静置した。ＨＡＩ力価は、非凝集ＲＢＣを含有する最後のウェルの希釈率の逆数によって決定した。

【0244】

ＨＩＮＴ ｍＮＴインフルエンザプロトコール：インフルエンザ株に対する中和力価は、Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ３Ｎ２） ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１１－２０１８，Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ９，２６７６（２０１９）に記載のように測定した。簡潔に記載すると、ＲＤＥ処理した血清の１：２０～１：２，５６０の連続２倍希釈物を、等体積のウイルス、約１０００フォーカス形成単位（ＦＦＵ）と混合し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベート後、ＭＤＣＫ－ＳＩＡＴ１細胞懸濁液をウイルス：血清混合物に添加し、約２２時間インキュベートした。単層をメタノールで固定し、染色用に調製した。次いで、核タンパク質（ＮＰ）に対する抗インフルエンザモノクローナル抗体、続いて、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８コンジュゲート二次抗体と共にウェルをインキュベートした細胞を洗浄し、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｖ２上でプレートをスキャンした。プレートからのカウントをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアに移して、シグモイド曲線から５０％のフォーカスの減少を達成する中和力価を計算した。このアッセイは、トリプシンを含まず、血清不含ウイルス投入対照ウェルと比較した場合のウイルス侵入の阻害を測定する。カウントは個々の感染細胞であり、このアッセイは、Ｈ１、Ｈ３、ＢＶｉｃ及びＢＹａｍを含む全ての生ウイルスサブタイプに適切である。

【0245】

続く実施例に対して、組み換えＨＡタンパク質はＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。簡潔に述べると、Ｓｆ９細胞由来であり、血清不含培地中で増殖させた連続継代性の昆虫細胞株（ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋（登録商標））において精製ＨＡタンパク質を作製した。有胚ニワトリ卵において増殖させたインフルエンザウイルスからＩＩＶを調製し、ホルムアルデヒドで不活性化し、濃縮し、スクロース勾配上でのゾーン遠心分離法によって精製し、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で分離し、さらに精製し、次いでリン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液中で懸濁した。０．２μｍシリンジフィルターを用いて調製物を滅菌ろ過した。生インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ（ＬＶＮＡ）を有胚ニワトリ卵中で増殖させたインフルエンザウイルスから単離した。スクロース勾配超遠心分離によってウイルスを精製し、界面活性剤可溶化によってＮＡを抽出し、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液中で懸濁した。０．２μｍシリンジフィルターを用いて調製物を滅菌ろ過した。

【0246】

実施例１－マウスにおける多価ＨＡ及びＮＡ免疫原性の評価
第０日にマウスにプライムワクチンを注射し、第２１日に同じ投与量のブースターワクチンを注射した。第１、２０、２２及び３５日に血液を回収した。

【0247】

ＨＡ抗原をコードするｍＲＮＡを含有する１価組成物に対して、次のもののそれぞれをコードするｍＲＮＡを個々に使用した：Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＨＡ（具体的に株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）。Ｎ１、Ｎ２、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＮＡ（具体的に株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）のそれぞれをコードするｍＲＮＡを含有する４価ワクチン組成物を調製し、４価ワクチンとして又はハイブリッド８価ワクチンを作製するために４価ｒＨＡワクチン組成物と組み合わせて投与した。以下の表１を参照のこと。さらに、Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＨＡのそれぞれをコードするｍＲＮＡを含有する４価ワクチン組成物を調製し、以下表１で示されるように、４価ワクチンとして投与した。１価及び４価組成物の両方に対する各ｍＲＮＡは、０．４μｇ／株の量で添加した。対照として、２０１８／２０１９標準治療インフルエンザ株を含有する不活性化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）を使用した（ＱＩＶ（２０１８／２０１９））。

【0248】

組み換え抗原について、以下表１で示されるように、Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統由来のＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統由来のＨＡのそれぞれとともにｒＨＡを含有する４価ワクチン組成物を使用した（具体的に株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）。以下表１で示されるように、０．１μｇ／株又は１μｇ／株の何れかの量で、及びアジュバント（ＡＦ０３）あり又はなしで、各組み換えＨＡを組成物に添加した。

【0249】

各群に対して、ｎ＝６匹のマウス。次のインフルエンザウイルス株に対してＨＡＩ力価を測定した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３（卵で増殖）。脂質ナノ粒子希釈剤を陰性対照として使用した。結果を以下の表１で報告する。

【0250】

【表1】

【0251】

４価の応答と８価の応答との間で干渉は観察されなかった。上で示されるように、４価ＮＡ ｍＲＮＡ及び４価組み換えＨＡの８価ハイブリッド組み合わせ（１μｇ／株及びＡＦ０３）（列１２）は、４価組み換えＨＡ（１μｇ／株及び－ＡＦ０３）単独（列７）を超えるＨＡＩの顕著な改善を示した。従って、４価ＮＡワクチン及び４価ｒＨＡの組み合わせは予想外にＨＡＩ反応を増強した。８価ハイブリッド組み合わせは、評価した全ての４種類のインフルエンザ株に対して、４価組み換えＨＡの４倍以内であった。

【0252】

同様に、次の４種類のインフルエンザウイルス株を用いてマウスにおいてＮＡＩ力価を同じように評価した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３。結果を以下の表２で示す。

【0253】

【表2】

【0254】

表２で示されるように、４種類のＮＡをコードするｍＲＮＡ及び４種類の組み換えＨＡの８価のワクチン組み合わせでのワクチン接種は、４価ＮＡ ｍＲＮＡで観察されたＮＡＩ力価と同等のＮＡＩ力価を示した。従って、表１及び２からのデータから、ハイブリッド８価ワクチンがロバストなＨＡ及びＮＡ免疫反応を誘導可能であったこと及び４種類の異なるインフルエンザ株由来の免疫優勢ＨＡの存在が抗ＮＡ免疫反応を抑制しないか又は妨害しないと思われることが明らかになる。例えば、表２の列６を列９及び１０と比較する。さらに、標準治療ＩＩＶワクチン（２０１８／２０１９から）と比較した場合、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）及びＢ Ｙａｍａｇａｔａ（山形）株に対する８価ワクチン（０．１μｇ／株）により誘導されるＮＡ力価は上昇した。

【0255】

実施例２－フェレットにおける多価ＨＡ及びＮＡ免疫原性の評価
多価ハイブリッドワクチン免疫原性を評価するために使用されたフェレットに、以下表３で示されるように、（１）ＮＡ抗原（Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ及びＢｙＮＡ）をコードする４種類のｍＲＮＡの混合物（具体的に株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）、（２）ＨＡ抗原（Ｈ１、Ｈ３、ＢｖＨＡ及びＢｙＨＡ）をコードする４種類のｍＲＮＡの混合物（具体的に株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）、（３）４種類の組み換えＨＡ抗原（Ｈ１、Ｈ３、ＢｖＨＡ及びＢｙＨＡ）の混合物又は（４）ＮＡ抗原（Ｎ１、Ｎ２、ＢｖＮＡ及びＢｙＮＡ）をコードする４種類のｍＲＮＡの混合物を４種類の組み換えＨＡ抗原（Ｈ１、Ｈ３、ＢｖＨＡ及びＢｙＨＡ）の混合物と組み合わせたものを、２１日あけて２回ワクチン接種した。各ＨＡは、次の４種類の株のうち１つ由来のＨＡを含む：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５（Ｈ１）；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３）；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）系統）；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０７３／２０１３（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）系統）。全抗原を１：１比で、アジュバントなしで投与した。

【0256】

フェレットは全て、ベースライン、ブースターの１日前又は直前、ブースターワクチン接種時及び必要に応じて免疫負荷の２週間後に鎮静下で採血した。ＥＬＬＡによって血清試料（必要になるまで－２０℃で保管）を試験してＮＡＩ活性を評価した。さらに、多価ワクチン接種後にヘマグルチニン抗原に対する抗体応答を評価するために、ＨＩＮＴ ｍＮＴアッセイを試みた。

【0257】

各群に対してｎ＝６匹のフェレット。次のインフルエンザウイルス株に対してＨＩＮＴ力価を測定した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｉｏｗａ（アイオワ）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６リードアウト株は卵において増殖させ、他の３種類の株は細胞増殖させたウイルスであった）。結果を以下の表３で報告する。第０日にフェレットにプライムワクチンを注射し、第２１日に同じ投与量のワクチンをブースト注射した。第－７、１、２０、２２及び４２日に血液を回収した。

【0258】

【表3】

【0259】

上で示されるように、４価ＮＡ ｍＲＮＡ及び４価組み換えＨＡの８価ハイブリッド組み合わせは、４価組み換えＨＡと比較して顕著な力価の上昇を示し、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６（３３０．２ｖ．９０）、Ｂ／Ｉｏｗａ（アイオワ）／０６／２０１７（１０８．３ｖ．１１．７）及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３（２７５．２ｖ．７７．９）に対して４倍を超える上昇が見られた。実際に、４価ＮＡ ｍＲＮＡ及び４価組み換えＨＡの８価ハイブリッド組み合わせは、４価ＮＡ ｍＲＮＡ及び４価組み換えＨＡが個々に投与された場合に観察されるＨＡＩ力価と比較した場合、相乗性を示した。

【0260】

同様に、インフルエンザウイルスの次の４種類の株を用いてフェレットにおいてＮＡ力価を同じように評価した：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３。結果を以下の表４（第２０日）及び表５（第４２日）で示す。

【0261】

【表4】

【0262】

【表5】

【0263】

上の表４で示されるように、単回プライム投与後、４価ＮＡ ｍＲＮＡ及び４価組み換えＨＡの８価ハイブリッド組み合わせでのワクチン接種は、４価ＮＡ ｍＲＮＡでのワクチン接種と同様のＮＡＩ力価を誘導した。表５で示されるように、４価ＮＡ ｍＲＮＡ及び４価組み換えＨＡの８価ハイブリッド組み合わせのブースター投与は、単回プライム投与（３５．４）を超える全体的なＮＡＩ力価（３７．４）の上昇を示した。従って、表３～５からのデータは、ハイブリッド８価ワクチンがロバストなＨＡ及びＮＡ免疫反応を誘導可能であったこと及び４種類の異なるインフルエンザ株由来の免疫優勢ＨＡの存在は抗ＮＡ免疫反応を抑制しないか又は妨害しないと思われることを示す。

【0264】

実施例３－フェレットにおける多価ＨＡ及びＮＡワクチンのイメージ（ｉｍａｇｅｓ）を用いた幅広いＮＡＩ免疫原性の評価
ハイブリッド８価ワクチンを作製するために、以下の表６で示されるように、Ｎ１、Ｎ２、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）ＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）ＮＡ（具体的には株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）のそれぞれでのＮＡ ｍＲＮＡを含有する４価ワクチン組成物を、Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）ＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）ＨＡ（具体的には株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）のそれぞれでのｒＨＡを含有する４価ワクチン組成物と組み合わせた。第０日にフェレットにプライムワクチンを注射し、第２１日に同じ投与量のブーストワクチンを注射した。第０日及び第２１日に、対照フェレットにＰＢＳ又はＮＡ ｍＲＮＡを含有しない組み換えＨＡ４価ワクチンの何れかを投与した。全群に対して、第１、２０、２２及び４２日に血液を回収した。次のインフルエンザウイルス株に対して、ＮＡＩ力価を測定した：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ａ／Ｈａｔａｙ（ハタイ）／４９９０／２０１６；Ａ／Ｓｗｅｄｅｎ（スウェーデン）／３／２０１７；Ａ／Ｌｏｕｉｓｉａｎａ（ルイジアナ）／１３／２０１７；Ａ／Ｔｏｗｎｓｖｉｌｌｅ（タウンズビル）５１／２０１６；Ａ／Ａｋｓａｒａｙ（アクサライ）／４０４８／２０１６；Ａ／Ｐｅｒｔｈ（パース）／１６／２００９；及びＡ／Ｏｈｉｏ（オハイオ）１３／２０１７。結果を以下の表６で報告する。

【0265】

【表6】

【0266】

上で示されるように、ハイブリッドワクチン組み合わせの投与後、株にわたって幅広いＮＡＩ反応が明らかになった。

【0267】

Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ＥＬＩＳＡチップを介して、ＮＡ異種幅（ＮＡ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｂｒｅａｄｔｈ）の評価を行い、ここで、１６種類のＴｅｔＮＡ及びＴＥＴ－ＨＡへの結合について１つの希釈で第４２日からのフェレット血清プールを評価した。Ｎ１／ＮＢ及びＮ２異種パネルを以下の表７に示すように相同株（Ｎ１ Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５又はＮ２ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／Ｉｎｆｉｍｈ／１６００１９／２０１６）からのアミノ酸距離により選別した。

【0268】

【表7】

【0269】

Ｎ１異種パネル及びＮＢ相同株に対する１：４０００希釈での結合を図１Ａ及び図１Ｂでそれぞれ示す。Ｎ２相同パネルに対する１：１０００希釈での結合を図１Ｃで示す。図１Ｃで示されるように、Ｎ２異種結合レベルは、異種株がより遠くなる（即ち、よりアミノ酸の相違が大きくなる）につれて低下し、最も遠い株（即ち、６３アミノ酸の距離のＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／８４／２９１６）は最低のＮ２結合を示す。

【0270】

実施例４－免疫前フェレットモデルにおける多価ＨＡ及びＮＡワクチンのイメージ（ｉｍａｇｅｓ）
ｆｌｕ陰性ＨＡＩ状態の確認後、次のウイルスインプリンティング株［１×１０^５ｆｆｕ／株；０．５ｍＬ／鼻孔（全部で１ｍＬ）］：Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ（ニューカレドニア）／２０／１９９９；Ａ／Ｐｅｒｔｈ（パース）／１６／２００９；Ｂ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ（香港）３３０／２００１；及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ（フロリダ）／４／２００６を用いて、免疫前フェレットに第０日に鼻腔内感染させた。第２１日に、以下の表８で示されるように、Ｈ１、Ｈ３、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）ＨＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）ＨＡ（具体的には、株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ（メリーランド）／１５／２０１６；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）のそれぞれでのｒＨＡを含有する４価ワクチン組成物と組み合わせたＮ１、Ｎ２、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ビクトリア）ＮＡ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ（山形）ＮＡ（具体的には、株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ（ミシガン）／４５／２０１５；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６；Ｂ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ（コロラド）／０６／２０１７；及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ（プーケット）／３０３７／２０１３由来）のそれぞれでのＮＡ ｍＲＮＡを含有するハイブリッド８価ワクチン組成物の免疫付与物をフェレットに投与した。ＰＢＳ、ＮＡ ｍＲＮＡを含有しない組み換えＨＡ４価ワクチン（３５μｇ／株）又はＩＩＶ ＨＡ４価ワクチン（１５μｇ／株）の何れかを対照フェレットに投与した。ベースライン力価（ウイルス鼻腔内予備免疫の後）を確立するために第２０日に血液を採取し、免疫付与後にＥＬＬＡ抗体応答を測定するために第４２日に血液を再び採取した。結果を以下の表８で示し、各群に対する平均ＩＣ５０比を以下の表９で示す。

【0271】

【表8】

【0272】

【表9】

【0273】

上の表８及び９で示されるように、ハイブリッド８価ワクチン組成物は、ＳＯＣ２０１８／２０１９株の殆どに対して強いＥＬＬＡ反応を誘導した。

【0274】

さらに、ＨＩＮＴ ｍＮＴプロトコールを使用して、ＨＡ中和力価を測定した。結果を以下の表１０で示す。

【0275】

【表10】

【0276】

表１０で示されるように、第２０日～第４２日に、免疫付与後の全群において同様のＨＩＮＴ力価が観察され、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／Ｉｎｆｉｍｈ１６００１９／２０１６に対するＨＩＮＴ応答が見られた。

【0277】

また、本開示及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。任意選択の又は任意選択により、は、後に記載される事象又は状況が起こることも起こらないこともあることを意味し、説明は、事象又は状況が起こる場合も起こらない場合も含むことを意味する。例えば、組成物が任意選択的に組み合わせを含み得る、という句は、説明が組み合わせ及び組み合わせの非存在（即ち、組み合わせの個々のメンバー）の両方を含むように、組成物が異なる分子の組み合わせを含むことも、組み合わせを含まないこともあることを意味する。範囲は、本明細書においては、約１つの特定の値から、及び／又は約別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって、値が近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。範囲のそれぞれの両端点が、他方の端点と関連して、及び他方の端点とは独立して、の両方の意味を有していることがさらに理解されよう。本開示で引用される全ての参照文献は、その全体において本明細書によって本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【配列表】

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【国際調査報告】