特表 2024-543152 改善された抗原結合受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-19

(54)【発明の名称】改善された抗原結合受容体

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241112BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241112BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20241112BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20241112BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241112BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241112BHJP

   C07K 14/55 20060101ALN20241112BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/705 ZNA

C07K16/30

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N5/10

C12N5/0783

C12N15/867 Z

A61P35/00

A61P17/00

A61P7/00

A61K35/17

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K39/395 D

A61K39/395 E

C07K14/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531293

(86)(22)【出願日】2022-11-23

(85)【翻訳文提出日】2024-07-16

(86)【国際出願番号】 EP2022082898

(87)【国際公開番号】W WO2023094413

(87)【国際公開日】2023-06-01

(31)【優先権主張番号】21210364.2

(32)【優先日】2021-11-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514099673

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チェン， クオチー

(72)【発明者】

【氏名】ダロフスキ， ダイアナ

(72)【発明者】

【氏名】フライモサー－グルントショーバー， アン

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】メスナー， エッケハルト

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ， ホアフォン

(72)【発明者】

【氏名】シュイ， ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】シュイ， タン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087NA07

4C087ZA51

4C087ZA89

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は一般に、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに特異的に結合することができるヒト化抗原結合受容体に関する。本発明はまた、治療用抗体の変異Ｆｃドメインに特異的に結合する／それと相互作用することによって動員される抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体。

【請求項2】

配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体。

【請求項3】

配列番号１２９のアミノ酸配列からなる抗原結合受容体。

【請求項4】

配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体。

【請求項5】

配列番号１３２のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体。

【請求項6】

配列番号１３２のアミノ酸配列からなる抗原結合受容体。

【請求項7】

配列番号１９のアミノ酸配列を含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項9】

配列番号１３０の配列を含む単離されたポリヌクレオチド。

【請求項10】

配列番号１３３の配列を含む単離されたポリヌクレオチド。

【請求項11】

請求項８～１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。

【請求項12】

請求項８～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。

【請求項13】

請求項８～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターを含む、形質導入Ｔ細胞。

【請求項14】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞。

【請求項15】

（Ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。

【請求項16】

（Ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。

【請求項17】

（Ａ）請求項８～１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項１２に記載のベクター；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。

【請求項18】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項19】

前記標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項20】

医薬としての使用のための、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項21】

前記抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞が、標的細胞抗原に、特にがん細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与される、医薬としての使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体又は請求項１３若しくは１４に記載の形質導入Ｔ細胞。

【請求項22】

疾患の治療における使用のための、特にがんの治療における使用のための、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項23】

前記治療が、前記抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞を、がん細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与することを含む、がんの治療における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体又は請求項１３若しくは１４に記載の形質導入Ｔ細胞。

【請求項24】

前記がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される、請求項２２又は２３に記載の、抗原結合受容体、形質導入Ｔ細胞又は使用のためのキット。

【請求項25】

がん抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の、抗原結合受容体、形質導入Ｔ細胞又は使用のためのキット。

【請求項26】

前記形質導入Ｔ細胞が、治療される前記対象から単離された細胞に由来する、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の、抗原結合受容体、形質導入Ｔ細胞又は使用のためのキット。

【請求項27】

前記形質導入Ｔ細胞が、治療される前記対象から単離された細胞に由来しない、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の、抗原結合受容体、形質導入Ｔ細胞又は使用のためのキット。

【請求項28】

対象における疾患を治療する方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞を前記対象に投与することと、前記形質導入Ｔ細胞の投与の前、投与と同時又は投与の後に、標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の治療的有効量を投与することとを含む、方法。

【請求項29】

前記対象からＴ細胞を単離することと、前記単離されたＴ細胞を請求項８～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターで形質導入することによって前記形質導入Ｔ細胞を生成することとを追加的に含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記Ｔ細胞が、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター構築物、又は非ウイルスベクター構築物で形質導入される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記形質導入Ｔ細胞が、静脈内注入によって前記対象に投与される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記形質導入Ｔ細胞を、前記対象への投与前に、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させる、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記形質導入Ｔ細胞を、前記対象への投与前に少なくとも１つのサイトカインと接触させ、好ましくはインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）及び／若しくはインターロイキン－２１又はそれらのバリアントと接触させる、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記疾患ががんである、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

標的細胞の溶解を誘導する方法であって、標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の存在下で、前記標的細胞を、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞と接触させることを含む、方法。

【請求項37】

前記標的細胞ががん細胞である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記標的細胞が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される抗原を発現する、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

医薬の製造のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体、請求項８～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１４に記載の形質導入Ｔ細胞の使用。

【請求項40】

前記医薬ががんの治療のためのものである、請求項３９に記載の使用。

【請求項41】

前記がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに特異的に結合することができるヒト化抗原結合受容体に関する。本発明はまた、治療用抗体の変異Ｆｃドメインに特異的に結合する／それと相互作用することによって動員される抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、がん特異的Ｔ細胞を使用する強力な治療手法である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３０）（２０１５），６２－６８）。ＡＣＴは、天然に存在する腫瘍特異的細胞、又はＴ細胞若しくはキメラ抗原受容体を使用した遺伝子操作によって特異的にされたＴ細胞を使用し得る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３０）（２０１５），６２－６８）。ＡＣＴは、進行性及び他の治療抵抗性疾患、例えば、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫又は黒色腫に罹患している患者でさえも、治療に成功し、寛解を誘導することができる（Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（３２）（２００８），５２３３－５２３９；Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１６）（２０１３），１５０９－１５１８；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）３３（６）：５４０－５４９，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１４．５６．２０２５．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｕｇ ２５）。

【0003】

しかし、ＡＣＴは、顕著な臨床有効性にもかかわらず、治療関連毒性によって制限される。ＡＣＴで使用される操作されたＴ細胞の特異性並びに結果として生じるオンターゲット及びオフターゲット効果は、主に、抗原結合受容体に実装された腫瘍標的化抗原結合部分によって駆動される。腫瘍抗原の非排他的発現又は発現レベルの時間差は重篤な副作用を引き起こしたり、治療の許容できない毒性のためにＡＣＴの中止に至ることさえある。

【0004】

さらに、効率的な腫瘍細胞溶解のための腫瘍特異的Ｔ細胞の利用可能性は、操作されたＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの長期生存と増殖能力に依存している。一方、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生存及び増殖はまた、健常組織の損傷をもたらし得る制御されないＴ細胞応答の持続に起因する望ましくない長期効果をもたらし得る（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１６）：１５０９－１８，Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１４ ２０１４ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７１（１６）：１５０７－１７）。

【0005】

重篤な治療関連毒性を抑制し、ＡＣＴの安全性を向上させるための手法の一つは、免疫シナプスにアダプター分子を導入することによってＴ細胞の活性化及び増殖を制限することである。そのようなアダプター分子は、例えば最近記載された葉酸－ＦＩＴＣスイッチ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１５；１３７：２８３２－２８３５）のような小分子二峰性スイッチを含む。さらなる手法には、Ｔ細胞の特異性を誘導して腫瘍細胞を標的化するタグを含む人工的に改変された抗体が含まれた（Ｍａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１６；１１３（４）：Ｅ４５０－４５８，Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ２０１６；１２８：１－６，Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１６；１１３（４）：Ｅ４５９－４６８，Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２；１８（２３）：６４３６－６４４５）。

【0006】

しかし、既存の手法にはいくつかの限界がある。分子スイッチに依存する免疫シナプスには、免疫応答を誘発したり非特異的なオフターゲット効果をもたらす可能性のあるエレメントを追加的に導入する必要がある。さらに、そのような多成分システムの複雑さは、治療有効性及び忍容性を制限する可能性がある。一方、既存の治療用モノクローナル抗体にタグ構造を導入することで、これらの構築物の有効性及び安全性プロファイルに影響を与える可能性がある。さらに、タグを付加することにより、当該抗体の製造をより複雑にする追加の改変工程及び精製工程が必要となるうえに、追加の安全性試験も必要となる。

【0007】

さらに、非ヒト抗体又は部分的ヒト抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用は、抗イディオタイプ又はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成をもたらし得る（Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７，９６－１０６（１９９７））。これらのＡＤＡは、薬物動態特性、投与された抗体の安全性及び機能性に影響を及ぼす可能性があり、ヒト化はこれに取り組むために適用されている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ８９，４２８５－４２８９（１９９２））。同様に、ＡＤＡがマウスベースのＣＡＲ－Ｔ細胞について認められている。ヒト抗マウスＩｇＧ抗体は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共に発生することが知られているが、有害な臨床結果を有しないと考えられてきた。Ｍａｕｓらは、ＣＡＲに特異的なＩｇＥ抗体を介している可能性が最も高い、ＣＡＲ改変Ｔ細胞に起因するアナフィラキシーを初めて記載した。これらの結果は、マウス抗体に由来する抗原結合受容体の潜在的な免疫原性が、特に断続的な投薬スケジュールを用いて投与される場合、安全性の問題であり得ることを示している（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １，２６－３１（２０１３））。したがって、がん患者のニーズを満たすためには、標的腫瘍療法、特に養子Ｔ細胞療法を改善する必要がある。したがって、ＡＣＴの安全性及び有効性を改善し、上記の欠点を克服する可能性を有する改善された手段を提供することが依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、改善された特性を有する抗原結合受容体、特に、形質導入細胞において安定であり高度に発現されるヒト化抗原結合受容体を提供する。

【0009】

本明細書では、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１２９のアミノ酸配列からなる。

【0010】

一実施態様では、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１３２のアミノ酸配列からなる。

【0011】

一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含まない。
一実施態様では、本明細書で上述したような抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0012】

一実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１３０の配列を含む。

【0013】

一実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１３３の配列を含む。

【0014】

一実施態様では、本明細書で上述したような単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが提供される。

【0015】

一実施態様では、本明細書で上述したようなポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターが提供される。

【0016】

一実施態様では、本明細書で上述したようなポリヌクレオチド又はベクターを含む形質導入Ｔ細胞が提供される。

【0017】

一実施態様では、本明細書で上述したような抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞が提供される。

【0018】

一実施態様では、
（Ａ）本明細書で上述したような抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットが提供される。

【0019】

一実施態様では、
（Ａ）本明細書で上述したような抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットが提供される。

【0020】

一実施態様では、
（Ａ）本明細書で上述したような単離されたポリヌクレオチド又はベクター；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットが提供される。

【0021】

一実施態様では、該Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。

【0022】

一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される。

【0023】

一実施態様では、医薬としての使用のための、本明細書で上述したようなキットが提供される。

【0024】

一実施態様では、医薬としての使用のための、本明細書で上述したような抗原結合受容体又は形質導入Ｔ細胞が提供され、ここで、抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞は、標的細胞抗原に、特にがん細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与される。

【0025】

一実施態様では、疾患の治療における使用のための、特にがんの治療における使用のための、本明細書で上述したようなキットが提供される。

【0026】

一実施態様では、がんの治療における使用のための、本明細書で上述したような抗原結合受容体又は形質導入Ｔ細胞が提供され、ここで、該治療は、抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞を、がん細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与することを含む。

【0027】

一実施態様では、前記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される。

【0028】

一実施態様では、がん抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される。

【0029】

一実施態様では、形質導入Ｔ細胞は、治療される対象から単離された細胞に由来する。

【0030】

一実施態様では、形質導入Ｔ細胞は、治療される対象から単離された細胞に由来しない。

【0031】

一実施態様では、対象における疾患を治療する方法であって、本明細書で上述したような抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞を対象に投与することと、形質導入Ｔ細胞の投与の前、投与と同時又は投与の後に、標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の治療的有効量を投与することとを含む方法が提供される。

【0032】

一実施態様では、該方法は、対象からＴ細胞を単離することと、単離されたＴ細胞を本明細書で上述したようなポリヌクレオチド又はベクターで形質導入することによって形質導入Ｔ細胞を生成することを追加的に含む。

【0033】

一実施態様では、該Ｔ細胞は、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター構築物、又は非ウイルスベクター構築物で形質導入される。

【0034】

一実施態様では、該形質導入Ｔ細胞は、静脈内注入によって対象に投与される。

【0035】

一実施態様では、該形質導入Ｔ細胞を、対象への投与前に、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させる。

【0036】

一実施態様では、該形質導入Ｔ細胞を、対象への投与前に少なくとも１つのサイトカインと接触させ、好ましくはインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）及び／若しくはインターロイキン－２１又はそれらのバリアントと接触させる。

【0037】

一実施態様では、疾患はがんである。

【0038】

一実施態様では、がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される。

【0039】

一実施態様では、標的細胞の溶解を誘導する方法であって、標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の存在下で、標的細胞を、本明細書で上述したような抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞と接触させることを含む方法が提供される。

【0040】

一実施態様では、標的細胞はがん細胞である。

【0041】

一実施態様では、標的細胞は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される抗原を発現する。

【0042】

一実施態様では、医薬の製造のための、本明細書で上述したような抗原結合受容体、ポリヌクレオチド、又は形質導入Ｔ細胞の使用が提供される。

【0043】

一実施態様では、医薬は、がんの治療のためのものである。

【0044】

一実施態様では、前記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1A-B】ｓｃＦｖフォーマットの抗Ｐ３２９Ｇ結合部分を有する第２世代キメラ抗原結合受容体の概略図。ＶＨ×ＶＬ ｓｃＦｖ（図１Ａ）配向及びＶＬ×ＶＨ（図１Ｂ）配向。図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示される抗原結合受容体をコードするＤＮＡ構築物を示す。

【図1C-D】ｓｃＦｖフォーマットの抗Ｐ３２９Ｇ結合部分を有する第２世代キメラ抗原結合受容体の概略図。ＶＨ×ＶＬ ｓｃＦｖ（図１Ａ）配向及びＶＬ×ＶＨ（図１Ｂ）配向。図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示される抗原結合受容体をコードするＤＮＡ構築物を示す。

【図2】異なるヒト化ｓｃＦｖバリアントのＣＡＲ表面発現（図２Ａ）及び形質導入対照としての役割を果たす相関するＧＦＰ発現（図２Ｂ）を示す。

【図3A】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図3B】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図3C】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図3D】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図3E】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図3F】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4A】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4B】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4C】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4D】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4E】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4F】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4G】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4H】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図4I】高い（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）及び低い（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１^＋標的細胞の存在下で、ＦｏｌＲ１に対する高い（１６Ｄ５）、中程度（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低い（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせて、異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図5】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の活性化。レポーター細胞の活性を、ＩｇＧ及びＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１^＋）標的細胞を標的とする抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１の存在下で評価した（図５Ａ）。抗体の用量依存性活性化を、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用したＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価し、曲線下面積を計算した（図５Ｂ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図6】結合部分としてＰ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バージョンを使用する抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の活性化。レポーター細胞の活性を、ＩｇＧ及びＨｅＬａ（ＨＥＲ２^＋）標的細胞を標的とする抗ＨＥＲ２（ペルツズマブ）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１の存在下で評価した（図６Ａ）。抗体の用量依存性活性化を、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用したＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価し、曲線下面積を計算した（図６Ｂ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。

【図7】ジスルフィド安定化ＶＨｘＶＬ１ ｓｃＦｖバリアントのＣＡＲ表面発現を示す。

【図8】ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ ＣＡＲ構築物の概略図。ＨｕＲ９６８４Ｍ構築物にはＩｇＧ４Ｍ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８ＣＳＤ－ＣＤ３ｚを、ＨｕＲ９６８ＢにはＧ４Ｓ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢＣＳＤ－ＣＤ３ｚを用いた。

【図9】描かれているのは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨｕＲ９６８ＢとＨｕＲ９６８４Ｍの発現である。

【図10A】それぞれのＰＧ ＣＡＲ構築物ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ（図９Ａ）並びに非形質導入対照（図９Ａ）の発現を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。ＣＡＲの総発現量は１８％から３６％の範囲にある。

【図10B】それぞれのＰＧ ＣＡＲ構築物ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ（図９Ａ）並びに非形質導入対照（図９Ａ）の発現を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。ＣＡＲの総発現量は１８％から３６％の範囲にある。

【図11】ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅによって測定された、ＨｕＲ９６８Ｂ、ＨｕＲ９６８４Ｍ構築物、及び従来の８Ｅ５ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用したＰＧ ＣＡＲの死滅効果が実証されている。標的細胞としてクローディン１８．２発現ＤＡＮ－Ｇ１８．２腫瘍細胞を使用し、ＨｕＲ９６８４Ｍ又はＨｕＲ９６８Ｂ ＰＧ ＣＡＲを発現するドナー（ＰＣＨ２０２０１１００００４）Ｔ細胞と試験した。Ｅ：Ｔ比１：２として、ＩｇＧ濃度として１００ｎｇ／ｍｌのＰ３２９Ｇ クローディン１８．２ Ａ６抗体を使用した。

【図12】ＬＤＨ放出によって測定された、異なる濃度のＡ６又はＺｍａｂ ＰＧ ＩｇＧと組み合わせたＨｕＲ９６８Ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅効果を示す。ＣＬＤＮ１８．２を発現するＤＡＮ－Ｇ１８．２を標的細胞として使用し、ＨｕＲ９６８Ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。

【発明を実施するための形態】

【0046】

定義
以下で別途定義されない限り、用語は当技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。

【0047】

本明細書の目的では、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。

【0048】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。

【0049】

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（「ＡＤＣＣ」）は、抗体でコートされた標的細胞の免疫エフェクター細胞による溶解につながる免疫機構である。該標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介してＦｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低下」という用語は、上で定義したＡＤＣＣの機構により、標的細胞を取り囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生産、精製、製剤化及び保存方法（これらは当業者に知られている）を用いて、同じ種類の宿主細胞によって生産された同じ抗体であるが操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。例えば、ＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメインにこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照）。

【0050】

薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。

【0051】

「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。別段示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原との）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性のことを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書中に記載のものも含め、当技術分野で知られている一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例となる例示的な方法を以下に記載する。

【0052】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされているアミノ酸と、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、Ｏ－ホスホセリンなど、後に修飾されるアミノ酸のことである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持ちながら、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号のいずれかによって表され得る。

【0053】

本明細書で使用される「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴（例えば、Ｆｃ受容体への結合の減少又は別のペプチドとの会合の増加）を有することを条件として、置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達することができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変化させるためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０種類の標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ることが考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用され得る。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ_３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示され得る。

【0054】

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。

【0055】

「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ、及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。

【0056】

「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0057】

本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及びその誘導体、例えばその断片、並びに抗原結合受容体及びその誘導体である。

【0058】

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、該抗原結合部分を含む抗原結合受容体を発現している細胞）を標的部位へ、例えば、抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質へと誘導することができる。抗原結合部分には、本明細書でさらに定義される抗体及びその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ断片）を含む。特定の実施態様では、該抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、且つ当技術分野で知られている抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５種類のアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域には、２つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかが含まれる。

【0059】

本発明の文脈において、「抗原結合受容体」という用語は、アンカー膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む抗原結合分子に関する。抗原結合受容体は、異なる供給源からのポリペプチド部分から作ることができる。したがって、抗原結合受容体は、「融合タンパク質」及び／又は「キメラタンパク質」としても理解され得る。通常、融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子（好ましくはｃＤＮＡ）を結合して作られるタンパク質である。この融合遺伝子（又は融合ｃＤＮＡ）を翻訳すると、好ましくは、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療における使用のために、組換えＤＮＡ技術によって人工的に作られる。本発明の抗原結合受容体のさらなる詳細は、本明細書において後述する。本発明の文脈において、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、それ自体が細胞内シグナル伝達ドメインに融合しているアンカー膜貫通ドメインにスペーサー配列によって融合された抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解される。

【0060】

「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。

【0061】

「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体又は抗原結合受容体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0062】

本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のタンパク質を包含する。この用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。

【0063】

本発明による「変異Ｆｃドメインを含む抗体」、すなわち治療用抗体は、１、２、３又はそれ以上の結合ドメインを有してよく、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であってもよい。該抗体は、単一種からの完全長であっても、キメラ化若しくはヒト化されていてもよい。２つを超える抗原結合ドメインを持つ抗体の場合、一部の結合ドメインが同一であり、且つ／又は同じ特異性を有する場合がある。

【0064】

本明細書で使用される「ＡＴＤ」という用語は、細胞の１つ又は複数の細胞膜に組み込むことができるポリペプチドストレッチを画定する「アンカー膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＭは細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインに融合することができ、これらの細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインは、細胞膜に限局している。本発明の抗原結合受容体の場合、ＡＴＭは、本発明の抗原結合受容体の膜付着及び限局を付与する。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのＡＴＭと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む。また、ＡＴＭは細胞内シグナル伝達ドメインに融合している場合もある。

【0065】

「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用から区別できることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係なタンパク質に対する抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

【0066】

本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、当技術分野で周知の「相補性決定領域」に関する。ＣＤＲは、免疫グロブリン又は抗原結合受容体の一部であり、前記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触させるものである。ＣＤＲは該分子の最も可変的な部分であり、このような分子の抗原結合多様性に寄与している。各Ｖドメインには、３つのＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ－Ｈは可変重鎖のＣＤＲ領域を表し、ＣＤＲ－Ｌは可変軽鎖のＣＤＲ領域を表す。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１－９１７）又は「Ｃｈｏｔｈｉａ」（Ｎａｔｕｒｅ ３４２（１９８９），８７７－８８３）に記載されるように決定され得る。

【0067】

「ＣＤ３ｚ」という用語は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖を指し、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」及び「ＣＤ２４７」としても知られる。

【0068】

「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、スペーサー配列によって細胞内シグナル伝達ドメイン／共シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８のもの）に融合された、抗原結合部分の細胞外部分（例えば一本鎖抗体ドメイン）から構成された抗原結合受容体を指す。

【0069】

抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧ_１アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異を有するＩｇＧ_１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ_２アイソタイプのものである。ある特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ_４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ_４アイソタイプのものである。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。

【0070】

本出願で使用される用語「ヒト起源由来の定常領域」又は「ヒト定常領域」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域、及び／又は定常軽鎖カッパ領域若しくはラムダ領域を示す。そのような定常領域は、ヒト又はヒト化抗体において使用することができ、当技術分野において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている（また、例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５－２７８８も参照）。本明細書で特に明記されない限り、定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。

【0071】

「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖の可変ドメインとＦａｂ軽鎖の可変ドメインが交換されている（すなわち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖とを含む。明確にするために本明細書では、Ｆａｂ軽鎖の可変ドメインとＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖をクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。

【0072】

本明細書で使用される「ＣＳＤ」という用語は、共刺激シグナル伝達ドメインを指す。

【0073】

「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。

【0074】

本明細書で使用される場合、「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらの手法の組み合わせが含まれる。

【0075】

「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

【0076】

「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）とからなるタンパク質を指す。

【0077】

本明細書の「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域が含まれる。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう定義されている。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により、宿主細胞によって産生される抗体は、完全長重鎖を含むことも、完全長重鎖の切断されたバリアント（本明細書では「切断されたバリアント重鎖」とも呼ぶ）を含むこともある。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施態様では、本明細書で定義されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含んでいる。本発明の一実施態様では、本明細書で定義されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含んでいる。本明細書に記載の薬学的組成物など、本発明の組成物は、本発明の抗原結合分子の集団を含んでいる。抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と、切断されたバリアント重鎖を有する分子とを含み得る。抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断されたバリアント重鎖を有する分子との混合物から構成されてもよく、抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、切断されたバリアント重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明の抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗原結合分子を含んでいる。本発明の一実施態様では、本発明の抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む免疫活性化Ｆｃドメイン結合分子を含んでいる。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子から構成される抗原結合分子の集団；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）；及び追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチドを有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含んでいる。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記も参照）に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」）は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

【0078】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の配列で現れる。ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。

【0079】

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0080】

「融合した」とは、成分同士（例えば、Ｆａｂ及び膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合により、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して結合されていることを意味する。

【0081】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫とが含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。

【0082】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

【0083】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），１－３巻におけるようなサブグループである。一態様では、ＶＬについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループカッパＩである。一態様では、ＶＨについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループＩＩＩである。

【0084】

「ヒト化」抗体（例えば、ヒト化ｓｃＦｖ断片）とは、非ヒトＣＤＲのアミノ酸残基とヒトＦＲのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ＣＤＲの全部又は実質的に全部が非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全部又は実質的に全部がヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0085】

本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列が超可変であり、抗原結合特異性を決定する抗体可変ドメインの各領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を指す。

【0086】

一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ中にあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬ中にある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；及び
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部位（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。

【0087】

別途指定されない限り、ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って決定される。当業者であれば、ＣＤＲの命名はまた、上掲のＣｈｏｔｈｉａ、上掲のＭｃＣａｌｌｕｍ、又は任意の他の科学的に認められた命名法に従って決定され得ることを理解するであろう。

【0088】

「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

【0089】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。

【0090】

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法によって決定された場合、９５％又は９９％よりも高い純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照。

【0091】

「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）にさらに分類することできる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。

【0092】

「単離された核酸」分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子であるＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物と、陽性及び陰性の鎖形態、及び二本鎖形態を含む。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。

【0093】

本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で発生しても、これらの末端位置の間の任意の位置で発生してもよく、参照配列内の残基間に個別に散在しているか又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続したグループで散在しているかのいずれかである。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて後で考察するもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）のような公知のコンピュータプログラムを用いて、従来通りに決定することができる。

【0094】

「単離された」ポリペプチド又はそのバリアント若しくは誘導体とは、その天然の環境に存在しないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現された組換え生産ポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明のために単離されたものと見なされる。

【0095】

「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、この修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電的に有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に起こり、これらは、サブユニットの各々に融合したさらなる構成成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。

【0096】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる変異を含む、一般的に、少量存在する可能なバリアント抗体を除いて、集合を構成する個々の抗体は同一であり、且つ／又は同じエピトープを結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、限定するものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な手法によって作製され得、このような方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。

【0097】

「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートされない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的組成物で存在してもよい。

【0098】

「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。

【0099】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後の、アライメントのためにいかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成され得る。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。

【0100】

別途指示がない限り、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム、又はその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって記載されており、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから一般に入手可能である。代替的に、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アライメントヘッダーに示される。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドが構成するプリン塩基とピリミジン塩基とを含む塩基の配列に関係するものであり、前記塩基は核酸分子の一次構造を表すものである。ここで、核酸分子という用語には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成型、及びこれらの分子を２種以上含む混合ポリマーが含まれる。また、核酸分子という用語には、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が含まれる。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、当業者には容易に理解されるように、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。

【0101】

「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに通例含まれる説明書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。

【0102】

「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性を有効にし、製剤が投与される対象に対して受け入れられないほど毒性である付加的な構成要素を含まないような形態での製剤を指す。薬学的組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体をさらに含む。

【0103】

「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の、薬学的組成物中の成分であって、対象にとって毒性でない成分を指す。薬学的に許容される担体には、バッファー、添加物、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0104】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。

【0105】

「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これら用語の代わりに、又はこれらと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図されており、このような産物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるものでも組換え技術により生産されるものでもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものであるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上又は２０００以上のアミノ酸からなる大きさのものであってよい。ポリペプチドは、明確に定義された三次元構造を有する場合もあるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。明確に定義された三次元構造を有するポリペプチドは、「フォールディングされた」と言われ、明確に定義された三次元構造を有せずに多数の異なるコンフォメーションを採りうるポリペプチドは、「フォールディングされていない」といわれる。

【0106】

「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は一般的ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。核酸分子という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。

【0107】

「結合の減少」、例えばＦｃ受容体への結合の減少は、例えばＳＰＲによって測定される、それぞれの相互作用に対する親和性の減少を指す。明確にするために、この用語には、親和性がゼロ（又は分析法の検出限界未満）に低下すること、つまり相互作用が完全に消失することも含まれる。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。

【0108】

「調節配列」という用語は、連結されるコード配列の発現を効果的にするために必要なＤＮＡ配列を指す。このような調節配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物において、調節配列にはプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターが通常含まれる。真核生物においては、調節配列にはプロモーター、ターミネーター、場合によってはエンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子が通常含まれる。「調節配列」という用語は、発現に必要な全ての構成要素を最低限含むことを意図しており、且つ追加の有利な構成要素も含み得る。

【0109】

本明細書で使用される場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合により直線状に結合したアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一方は、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより連結されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。そのような特定の実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に連結している。好ましい実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ断片である。

【0110】

本明細書で使用される「ＳＳＤ」という用語は、「共刺激シグナル伝達ドメイン」を指す。

【0111】

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法上の変化形）は、治療される個体の疾患の自然な経過を変化させる試みに対する臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理学の過程で行われ得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0112】

本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１つ又は複数の細胞応答を指す。本発明の免疫活性化Ｆｃドメイン抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。

【0113】

薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。

【0114】

本明細書で使用される「価」という用語は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、その抗原に特異的な１つ（且つ１つを超えない）の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。

【0115】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、類似の構造を一般に有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離し、それぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照。

【0116】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

【0117】

変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体
本発明は、抗体、例えばがん細胞を標的とする治療用抗体の変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体に関する。好ましい態様では、本発明は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体に関する。本発明の抗原結合受容体は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することはできるが、親非変異型Ｆｃドメインには特異的に結合することができない少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。好ましい実施態様では、抗原結合受容体の抗原結合部分は、ヒト化又はヒト抗原結合部分、例えばヒト化又はヒトｓｃＦｖである。好ましい一実施態様では、アミノ酸変異はＰ３２９Ｇであり、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異Ｆｃドメインへの特異的結合は２５°ＣでＳＰＲによって測定される。

【0118】

本発明はさらに、本明細書に記載の抗原結合受容体を用いた、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞などのＴ細胞の形質導入、及び変異Ｆｃドメイン（例えば、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメイン）を含む抗体分子、例えば治療用抗体による、例えば腫瘍へのそれらの標的化動員に関する。一実施態様では、抗体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に特異的に結合することができる。

【0119】

添付の実施例に示すように、概念実証として、本発明のアンカー膜貫通ドメイン及びヒト化細胞外ドメイン（配列番号２０に示すＤＮＡ配列によってコードされる配列番号７）を含む抗原結合受容体が構築され、これは、Ｐ３２９Ｇ変異を含む治療用抗体（配列番号１０２の重鎖及び配列番号１０３の軽鎖を含む抗ＣＤ２０抗体によって表される）に特異的に結合することができる。ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号７）を発現する形質導入Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞）は、ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む抗ＣＤ２０抗体とＣＤ２０陽性腫瘍細胞との共インキュベーションによって強く活性化することができた。

【0120】

Ｐ３２９Ｇ変異を含む腫瘍抗原に対する抗体と、ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号７）を発現する形質導入Ｔ細胞との組み合わせによる腫瘍細胞の治療は、驚くべきことに、ＶＬ１ＶＨ３－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ（配列番号３３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号３１）を発現する形質導入Ｔ細胞と比較して、形質導入Ｔ細胞のより強い活性化をもたらす。

【0121】

さらなる概念実証として、本発明による抗原結合受容体（それぞれ配列番号１２９及び１３２）、及びそれぞれ配列番号１３０及び１３３に示されるＤＮＡ配列によってコードされる抗原結合受容体が構築された。抗原結合受容体の発現と機能は、Ｔ細胞株とヒトドナーのＴ細胞で示された。両受容体は、本発明によるＶＨＶＬ（すなわちＶＨ３ＶＬ１）コンフォメーションでヒト化抗原結合部分を構成する。

【0122】

ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質において、ＶＨドメイン（ＶＨ３）は、そのＣ末端において、ペプチドリンカーを介してＶＬドメイン（ＶＬ１）のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖを形成する。ｓｃＦｖは、そのＣ末端（ＶＬドメインのＣ末端）において、ペプチドリンカーを介してアンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）に融合される。一方、ＶＬ１ＶＨ３－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質において、ＶＬドメイン（ＶＬ１）は、そのＣ末端において、ペプチドリンカーを介してＶＨドメイン（ＶＨ３）のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖを形成する。ｓｃＦｖは、そのＣ末端（ＶＨドメインのＣ末端）において、ペプチドリンカーを介してアンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）に融合される。理論に拘束されるものではないが、ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質が、ＶＬ１ＶＨ３－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤと比較して、形質導入Ｔ細胞のより強い活性化をもたらすという観察結果は、ＶＬドメインとアンカードメインとの（ペプチドリンカーを介した）融合が、より強力な抗原結合受容体をもたらすことを示唆している。これは予想外であり、驚くべきことである。

【0123】

ＶＨドメインＶＨ３とＶＬドメインＶＬ１との組み合わせ（両方とも本発明者らによって同定された）は、これらの可変ドメインがヒト化抗体ドメインであるため、特に好ましい。理論に拘束されるものではないが、ヒト化抗体ドメインは、そのようなヒト化抗体ドメインを含む抗原結合部分をヒト患者に適用する場合、副作用が少ない（例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成がより少ない）と予想され得るので好ましい。しかしながら、ヒト化は、抗原結合部分（例えば、非ヒト源に由来するもの）の結合の喪失をもたらし得る。添付の実施例に示すように、ヒト化ＶＨ３及びＶＬ１ドメインは、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインへの結合を保持する。この結果は、例えば、他のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインと同等の結合を保持できないことによって示されるように予想外である。

【0124】

したがって、本発明の好ましい一実施態様では、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに特異的に結合することができるヒト化抗原結合部分を含む抗原結合受容体が提供される。本発明の概念及びその構成要素（ヒト化抗原結合受容体及び治療用抗体）は、本明細書において以下にさらに詳細に記載される。

【0125】

本発明によれば、変異Ｆｃドメインを含む（例えば、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む）腫瘍特異的抗体、すなわち治療用抗体と、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部位を含む細胞外ドメインを含む／からなる抗原結合受容体を導入したＴ細胞のペアリングにより、Ｔ細胞の特異的活性化及びその後の腫瘍細胞の溶解が得られる。この手法は、変異Ｆｃドメインを含む抗体の非存在下ではＴ細胞は不活性であるため、従来のＴ細胞ベースの手法に比べて安全性に大きな利点がある。したがって、本発明は、ＩｇＧ型抗体がＴ細胞の誘導として腫瘍細胞をマーク又は標識するために使用され、ＩｇＧ型抗体の変異Ｆｃドメインに対する特異性を提供することによって、形質導入されたＴ細胞が腫瘍細胞に特異的に標的化される、汎用的な治療プラットフォームを提供する。腫瘍細胞の表面上の抗体の変異Ｆｃドメインに結合した後、本明細書に記載の形質導入Ｔ細胞は活性化され、腫瘍細胞はその後溶解される。このプラットフォームは、多様な（既存又は新しく開発された）標的抗体の使用、又は抗原特異性は異なるがＦｃドメインに同じ変異（例えば、Ｐ３２９Ｇ変異など）を含む複数の抗体の共投与を可能にすることにより、柔軟且つ特異的である。Ｔ細胞活性化の程度は、共投与される治療用抗体の投与量を調整することによって、又は異なる抗体特異性若しくはフォーマットに切り替えることにより、さらに調整することができる。本発明による形質導入Ｔ細胞は、変異Ｆｃドメインを含む標的抗体の共投与がなくても不活性である。なぜなら、本明細書に記載のＦｃドメインに対する変異は、天然免疫グロブリン又は非変異型免疫グロブリンでは生じないからである。したがって、一実施態様では、変異Ｆｃドメインは、（ヒト）免疫グロブリンには天然には存在しない。

【0126】

したがって、本発明は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む抗原結合受容体であって、少なくとも１つの抗原結合部分が親非変異型Ｆｃドメインに特異的に結合することができない、抗原結合受容体に関する。エフェクター機能は、本明細書で詳述するように、抗体ベースの腫瘍治療の深刻な副作用につながる可能性があるため、がん治療においてエフェクター機能が低下した治療用抗体を用いることが特に望ましい。

【0127】

本発明の文脈において、抗原結合受容体は、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に天然には存在しない細胞外ドメインを含む。このように、抗原結合受容体は、本発明による抗原結合受容体を発現する細胞に対して目的に適った結合特異性を付与することができる。本発明の１つ又は複数の抗原結合受容体で形質導入された細胞、例えばＴ細胞は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合できるようになるが、非変異型親Ｆｃドメインには特異結合できるようにならない。特異性は、抗原結合受容体の細胞外ドメインの抗原結合部分によって提供される。本発明の文脈において、本明細書中で説明されるように、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分は、変異Ｆｃドメインに結合／と相互作用するが、非変異型親Ｆｃドメインには／とは結合しない。

【0128】

抗原結合部分
本発明の例示的な実施態様では、概念実証として、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるヒト化抗原結合受容体及び該抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞が提供される。Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体への結合とそれに伴うエフェクター機能を低下させる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異型Ｆｃドメインと比較して低下した又は消失した親和性でＦｃγ受容体に結合する。

【0129】

一実施態様では、抗原結合部分は、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成される変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる。一実施態様では、該Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一実施態様では、変異Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。一実施態様では、該Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。

【0130】

好ましい実施態様では、変異Ｆｃドメインは、Ｐ３２９Ｇ変異を含んでいる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインは、非変異型Ｆｃドメインと比較して低下した又は消失した親和性でＦｃγ受容体に結合する。

【0131】

一実施態様では、抗原結合受容体は、抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。一実施態様では、抗原結合部分は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに特異的に結合することができる。

【0132】

一実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）
の少なくとも１つを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0133】

一実施態様では、抗原結合部分は、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
の少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0134】

好ましい実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）；
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0135】

特定の一実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）；
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0136】

別の特定の実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳのＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）；
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰのＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0137】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８、配列番号４１及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0138】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0139】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0140】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0141】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0142】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0143】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0144】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

【0145】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

【0146】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

【0147】

他の実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１２７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

【0148】

好ましい実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

【0149】

別の好ましい実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

【0150】

一実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。好ましい実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖである。

【0151】

一実施態様では、抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨドメインは、特にペプチドリンカーを介してＶＬドメインに連結されている。一実施態様では、ＶＬドメインのＣ末端は、特にペプチドリンカーを介してＶＨドメインのＮ末端に連結されている。好ましい実施態様では、ＶＨドメインのＣ末端は、特にペプチドリンカーを介してＶＬドメインのＮ末端に連結されている。一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）を含む。

【0152】

一実施態様では、抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦｖであり、ここで、前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構成：ａ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はｂ）ＶＬ－リンカー－ＶＨの１つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬの構成を有する。

【0153】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０、配列番号１２２及び配列番号１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0154】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0155】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。

【0156】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。

【0157】

重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合部分、例えば本明細書に記載のｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド架橋を導入することによってさらに安定化され得る。したがって、一実施態様では、本発明による抗原結合受容体に含まれるｓｃＦｖ断片（複数可）及び／又はｓｃＦａｂ断片（複数可）は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される。一実施態様では、システインによるアミノ酸の少なくとも１つの置換（特に、Ｋａｂａｔ番号付けによる、可変重鎖の４４位及び／又は可変軽鎖の１００位における）を含む、上記のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列のいずれか１つが提供される。

【0158】

一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。

【0159】

アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）
本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有しないことを特徴としてもよい。本発明の文脈において、プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解できるタンパク質分解酵素のことをいう。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、ＣＤ命名法で特に規定されているような、膜貫通タンパク質の任意のアンカー膜貫通ドメインが本発明の抗原結合受容体を生成するために使用され得る。

【0160】

したがって、本発明の文脈において、アンカー膜貫通ドメインは、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）の膜貫通ドメインの一部、又は好ましくはヒトの膜貫通ドメインの一部を含み得る。このようなアンカー膜貫通ドメインの例は、例えば本明細書において配列番号１１に示されるアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を有するＣＤ８の膜貫通ドメインである。本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含み得る／から構成され得る。

【0161】

別の実施態様では、本明細書で提供される抗原結合受容体は、配列番号６１に示されるヒト全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３～１７９、１５４～１７９、１５５～１７９、１５６～１７９、１５７～１７９、１５８～１７９、１５９～１７９、１６０～１７９、１６１～１７９、１６２～１７９、１６３～１７９、１６４～１７９、１６５～１７９、１６６～１７９、１６７～１７９、１６８～１７９、１６９～１７９、１７０～１７９、１７１～１７９、１７２～１７９、１７３～１７９、１７４～１７９、１７５～１７９、１７６～１７９、１７７～１７９又は１７８～１７９（配列番号７０に示されるｃＤＮＡによってコードされている）に位置するＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み得る。

【0162】

あるいは、特にＣＤ命名法によって提供される膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質を、本発明の抗原結合受容体タンパク質のアンカー膜貫通ドメインとして使用することができる。

【0163】

いくつかの実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、抗原結合受容体を当該膜に固定する能力を保持する、ＣＤ２７（配列番号５８によってコードされる配列番号５９）、ＣＤ１３７（配列番号６６によってコードされる配列番号６７）、ＯＸ４０（配列番号７０によってコードされる配列番号７１）、ＩＣＯＳ（配列番号７４によってコードされる配列番号７５）、ＤＡＰ１０（配列番号７９によってコードされる配列番号８０）、ＤＡＰ１２（配列番号８２によってコードされる配列番号８３）、ＣＤ３ｚ（配列番号８７によってコードされる配列番号８８）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号９１によってコードされる配列番号９０）、ＮＫＧ２Ｄ（配列番号９５によってコードされる配列番号９４）、ＣＤ８（配列番号１２０によってコードされる配列番号１１９）からなる群のうちのいずれか１つの膜貫通ドメイン又はその膜貫通部の断片を含む。

【0164】

ヒト配列は、例えば、アンカー膜貫通ドメイン（の一部）が細胞外空間からアクセス可能であり、したがって患者の免疫系にアクセス可能である可能性があるため、一般的な発明の文脈において有益である可能性がある。好ましい実施態様では、アンカー膜貫通ドメインはヒト配列を含む。そのような実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、抗原結合受容体を当該膜に固定する能力を保持する、ヒトＣＤ２７（配列番号５６によってコードされる配列番号５７）、ヒトＣＤ１３７（配列番号６４によってコードされる配列番号６５）、ヒトＯＸ４０（配列番号６８によってコードされる配列番号６９）、ヒトＩＣＯＳ（配列番号７２によってコードされる配列番号７３）、ヒトＤＡＰ１０（配列番号７７によってコードされる配列番号７８）、ヒトＤＡＰ１２（配列番号８０によってコードされる配列番号８１）、ヒトＣＤ３ｚ（配列番号８５によってコードされる配列番号８６）、ヒトＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８９によってコードされる配列番号８８）、ヒトＮＫＧ２Ｄ（配列番号９３によってコードされる配列番号９２）、ヒトＣＤ８（配列番号１１８によってコードされる配列番号１１７）からなる群のうちのいずれか１つの膜貫通ドメイン又はその膜貫通部の断片を含む。

【0165】

刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）及び共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）
好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞活性化をもたらす刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又はヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（バージョン番号１７７、配列番号２）であり；マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２４１６１（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（二次引用可能アクセッション番号）、バージョン番号１４３、配列番号１）である）、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（バージョン番号１７８、配列番号２）である）、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（バージョン番号１５１、配列番号１）であり；マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０９（バージョン番号１３２、配列番号２）である）の断片／ポリペプチド部分である刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0166】

したがって、本明細書において提供される抗原結合受容体において含まれる刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの完全長の断片／ポリペプチド部分であってもよい。マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長ＣＤ３ｚ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８６（ＣＤ３ｚ）、９０（Ｆｃｇｒ３Ａ）又は９４（ＮＫＧ２Ｄ）として示される（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）は、配列番号８７（ＣＤ３ｚ）、９１（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９５（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。ヒト完全長ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８４（ＣＤ３ｚ）、８８（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９２（ＮＫＧ２Ｄ）として示される（ヒトは、配列番号８５（ＣＤ３ｚ）、８９（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９３（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むことを条件として、刺激ドメインとしてＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの断片を含み得る。特に、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの任意の部分／断片は、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフが含まれる限り、刺激ドメインとして適切である。しかし、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源から得られるポリペプチドを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、本明細書において配列番号８４（ＣＤ３ｚ）、８８（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９２（ＮＫＧ２Ｄ）として示されるアミノ酸配列を含む（ヒトは配列番号８５（ＣＤ３ｚ）、８９（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９３（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。一実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列（配列番号２６に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含み得るか、又はそれからなり得る。さらなる実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１３に示される配列を含むか、又は配列番号１３と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の置換、欠失若しくは挿入を有し、且つ刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）を含む抗原結合受容体の具体的な構成は、本明細書では以下及び実施例と図面に示されている。刺激シグナル伝達活性は、例えば、サイトカイン放出の増強（ＥＬＩＳＡで測定）（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）、増殖活性の増強（細胞数の増加で測定）又は溶解活性の増強（ＬＤＨ放出アッセイで測定）によって決定することができる。

【0167】

さらに、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞にさらなる活性を提供する少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又はヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ１０７４７（バージョン番号１７３、配列番号１であり；マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ３１０４１（バージョン番号１３４、配列番号２）である）、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４５、配列番号１）であり；マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１３９、配列番号１）である）、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２３５１０（バージョン番号１３８、配列番号１）であり；マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４３４８８（バージョン番号１１９、配列番号１）である）、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９Ｙ６Ｗ８（配列番号１、バージョン番号１２６）であり；マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＷＶ４０（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９ＪＬ１７（二次引用可能アクセッション番号）、バージョン番号１０２、配列番号２）である）、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６８４２（バージョン番号１６０、配列番号２）であり；マウスＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４１２７２（バージョン番号１３７、配列番号１）である）、４－１－ＢＢ（マウス４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１４０、配列番号１）であり；ヒト４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４６、配列番号）である）、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＵＢＪ５（バージョン番号２５、配列番号２）であり；マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＱＵＪ０（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能アクセッション番号）、バージョン番号１０１、配列番号１）である）又はＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ４３９１４（バージョン番号１４６、配列番号１）であり；マウスＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ０５４８８５（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能アクセッション番号）、バージョン番号１２３、配列番号１）である）の断片／ポリペプチド部分である共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。本発明の特定の実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、本明細書に記載の１つ又は複数、すなわち１、２、３、４、５、６又は７つの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。したがって、本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体は、第１の共刺激シグナル伝達ドメインとして、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１３７の断片／ポリペプチド部分、又は、好ましくはヒトＣＤ１３７の断片／ポリペプチド部分を含み得、第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、マウス若しくは好ましくはヒトＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２又はそれらの断片からなる群から選択される。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源から得られる共刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体に含まれている１つ又は複数の刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含み得るか又はそれからなり得る。

【0168】

したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体に任意選択で含まれる共刺激シグナル伝達ドメインは、完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号５９（ＣＤ３ｚ）、６３（ＣＤ２８）、６７（ＣＤ１３７）、７１（ＯＸ４０）、７５（ＩＣＯＳ）、７９（ＤＡＰ１０）又は８３（ＤＡＰ１２）として示される（マウスは、配列番号５８（ＣＤ２７）、６２（ＣＤ２８）、６６（ＣＤ１３７）、７０（ＯＸ４０）、７４（ＩＣＯＳ）、７８（ＤＡＰ１０）又は８２（ＤＡＰ１２）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。しかし、本発明の文脈ではヒト配列が最も好ましいため、本明細書で提供される抗原結合受容体タンパク質に任意選択で含まれ得る共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号５７（ＣＤ２７）、６１（ＣＤ２８）、６５（ＣＤ１３７）、６９（ＯＸ４０）、７３（ＩＣＯＳ）、７７（ＤＡＰ１０）又は８１（ＤＡＰ１２）として示される（ヒトは配列番号５６（ＣＤ２７）、６０（ＣＤ２８）、６４（ＣＤ１３７）、６８（ＯＸ４０）、７２（ＩＣＯＳ）、７６（ＤＡＰ１０）又は８０（ＤＡＰ１２）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。

【0169】

好ましい一実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８又はその断片を含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、ＣＤ２８の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８の断片を含み得る。特に、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれる限り、ＣＤ２８の任意の部分／断片が本発明の抗原結合受容体に適している。共刺激シグナル伝達ドメインＰＹＡＰ（ＣＤ２８のＡＡ２０８から２１１）及びＹＭＮＭ（ＣＤ２８のＡＡ１９１から１９４）は、ＣＤ２８ポリペプチドの機能及び上に列挙した機能的効果にとって有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列は配列番号９６に示されており、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列は配列番号９７に示されている。したがって、本発明の抗原結合受容体において、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、配列ＹＭＮＭ（配列番号９６）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号９７）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメイン由来の配列を含む。他の実施態様では、本発明の抗原結合受容体において、これらのドメインの一方又は両方が、それぞれＦＭＮＭ（配列番号９８）及び／又はＡＹＡＡ（配列番号９９）に変異している。これらの変異のいずれも、抗原結合受容体を含む形質導入された細胞の、自身の増殖能力に影響を与えずにサイトカインを放出する能力を低下させ、且つ、有利には、形質導入された細胞の生存を延長させ、ひいてはその治療能力を高めるために使用することができる。すなわち、言い換えれば、このような非機能性変異は、好ましくは、本明細書で提供される抗原結合受容体がｉｎ ｖｉｖｏで形質導入された細胞の持続性を高めるものである。しかしながら、これらのシグナル伝達モチーフは、本明細書で提供される抗原結合受容体の細胞内ドメイン内の任意の部位に存在し得る。

【0170】

別の好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ１３７又はその断片を含む。本明細書で提供される抗原結合受容体は、ＣＤ１３７の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ１３７の断片を含み得る。特に、ＣＤ１３７のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれる限り、ＣＤ１３７の任意の部分／断片が本発明の抗原結合受容体に適している。好ましい実施態様では、本発明の抗原結合受容体タンパク質に含まれるＣＤ１３７ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされるもの）を含むか、又はそれからなる。

【0171】

共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含む抗原結合受容体の具体的な構成は、本明細書の以下及び実施例及び図面に提供される。共刺激シグナル伝達活性は、例えば、サイトカイン放出の増強（ＥＬＩＳＡで測定）（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）、増殖活性の増強（細胞数の増加で測定）又は溶解活性の増強（ＬＤＨ放出アッセイで測定）によって決定することができる。上述のように、本発明の実施態様では、抗原結合受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、形質導入Ｔ細胞のような、本明細書に記載の形質導入細胞のサイトカイン産生、増殖及び溶解活性であると定義されるヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７遺伝子Ｔ細胞活性に由来してもよい。ＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７の活性は、ＥＬＩＳＡによるサイトカインの放出、又はインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）若しくはインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインのフローサイトメトリー、例えばｋｉ６７測定によって測定されるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞定量化、又は標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価される溶解活性によって測定することができる（例えば、Ｔｈａｋｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．３５（１）（２０１２），５０３－５０６；Ｋｒｕｔｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６９９（２０１１），１７９－２０２；Ｅｋｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７５（５）（２００７），２２９１－２２９６；Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９（５）（２００２），２９８３－２９８８；Ｄｕｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２１（１２）（２０１４），１８２５－１８３７（正誤表はＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２１（１２）（２０１４），１６１）記載されているＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ機器を使用することによって）。

【0172】

リンカー及びシグナルペプチド
さらに、本明細書において提供される抗原結合受容体は、少なくとも１つのリンカー（又は「スペーサー」）を含み得る。リンカーは通常、２０アミノ酸までの長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の長さを有し得る。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン間にリンカーを含み得る。さらに、本明細書で提供される抗原結合受容体は、抗原結合部分に、特に抗原結合部分の免疫グロブリンドメイン間（例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインの間）にリンカーを含み得る。このようなリンカーには、抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメイン）が独立してフォールディングされ、予想通りに機能する確率が高まるという利点がある。したがって、本発明の文脈において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、一本鎖多機能ポリペプチドに含まれ得る。一本鎖融合構築物は、例えば、少なくとも１つの抗原結合部分を含む（１つ又は複数の）細胞外ドメイン、（１つ又は複数の）アンカー膜貫通ドメイン、（１つ又は複数の）共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／又は（１つ又は複数の）刺激シグナル伝達ドメインから構成され得る。したがって、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるように、１つ又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって連結され得る。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を含むか、又はそれらから構成され得る。別の実施態様では、抗原結合部分とアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。したがって、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激ドメインは、ペプチドリンカーによって、あるいはドメインの直接融合によって互いに連結され得る。

【0173】

本発明による好ましい実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、これは、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性を高めるためのグリシンと、溶解性を高めるためのセリン又はスレオニンを豊富に含んでおり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端を連結したり、その逆を連結したりすることができる。好ましい実施態様では、リンカーは、ＶＬドメインのＮ末端をＶＨドメインのＣ末端に連結する。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、リンカーは、配列番号１６に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列を有し得る。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。

【0174】

本発明によるいくつかの実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドである一本鎖Ｆａｂ断片又はｓｃＦａｂであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。

【0175】

本明細書で提供される抗原結合受容体又はその一部は、シグナルペプチドを含み得る。このようなシグナルペプチドは、タンパク質をＴ細胞膜の表面に運ぶことになる。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、シグナルペプチドは、配列番号１００に示されるアミノ酸及びアミノ酸配列（配列番号１０１に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を有し得る。

【0176】

変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるＴ細胞活性化抗原結合受容体
本明細書に記載の抗原結合受容体の構成要素は、様々な構成で互いに融合して、Ｔ細胞活性化抗原結合受容体を生成することができる。

【0177】

いくつかの実施態様では、抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメインに連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成される細胞外ドメインを含む。好ましい実施態様では、ＶＨドメインは、Ｃ末端で該ＶＬドメインのＮ末端に、任意選択でペプチドリンカーを介して融合される。他の実施態様では、抗原結合受容体は、刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。特定のそのような実施態様では、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、及び任意選択で、刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカリー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。任意選択で、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様の１つでは、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、刺激シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。別の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりにアンカー膜貫通ドメインに連結される。好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、本質的に、１つ又は複数のペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び刺激シグナル伝達ドメインからなり、ここで、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。

【0178】

抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、並びに刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、互いに直接融合されてもよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２～２０アミノ酸を含む１つ又は複数のペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーが含まれ、ここで「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の数である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を連結するのに好ましいペプチドリンカーは、配列番号１７によるＧＧＧＧＳ（Ｇ_４Ｓ）である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を連結するための別の好ましいペプチドリンカーは、配列番号１９によるＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（ＣＤ８ストーク）である。可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を連結するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１６によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ_４Ｓ）_４である。

【0179】

さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特に、抗原結合部分がアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合される場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合され得る。

【0180】

本明細書に記載のとおり、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有する抗原結合受容体は、特に抗原結合受容体の高発現が必要な場合に有用であり、好ましい。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、抗原結合受容体の発現効率を制限し得る。しかしながら、他の場合には、例えば、標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分を含む抗原結合受容体を有することが有利であろう。

【0181】

特定の一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含む変異Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメインに特異的に結合することができる１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異型親Ｆｃドメインに特異的に結合することができない抗原結合部分は、ｓｃＦｖである。

【0182】

一実施態様では、抗原結合部分は、ｓｃＦｖ断片のＣ末端において、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に、任意にペプチドリンカーを介して融合されている。一実施態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１９）を含む。一実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメイン又はその断片である。好ましい実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン又はその断片である。特定の実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）をさらに含む。一実施態様では、抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で、共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。一実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書で前述したような、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、又はそれらの断片からなる群から個別に選択される。好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８の細胞内ドメイン又はその断片である。好ましい一実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、又はＣＤ２８シグナル伝達を保持するその断片を含む。別の好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメイン、又はＣＤ１３７シグナル伝達を保持するその断片を含む。特定の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１２を含むか、又は配列番号１２からなる。一実施態様では、抗原結合受容体は、刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。一実施態様では、抗原結合受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で、刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。一実施態様では、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、又はそれらの断片からなる群から個別に選択される。好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚの細胞内ドメイン、又はＣＤ３ｚシグナル伝達を保持するその断片である。特定の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１３を含むか、又は配列番号１３からなる。

【0183】

一実施態様では、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にＧＦＰ又はその増強されたアナログに融合している。一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｃ末端で、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）のＮ末端に、任意選択で本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、融合している。好ましい実施態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１８によるＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）である。

【0184】

特定の実施態様では、抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、ここで、少なくとも１つの抗原結合部分は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるが、非変異型親Ｆｃドメインに特異的に結合することはできないｓｃＦｖであり、変異ＦｃドメインはＰ３２９Ｇ変異を含む（ＥＵ番号付けによる）。Ｐ３２９Ｇ変異はＦｃγ受容体の結合を減少させる。一実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）、共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）、及び刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）を含む。そのような一実施態様では、抗原結合受容体はｓｃＦｖ－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤという構成を有する。好ましい実施態様では、抗原結合受容体はＶＨ－ＶＬ－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤという構成を有する。より具体的なそのような実施態様では、抗原結合受容体は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤという構成を有する。

【0185】

特定の実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるｓｃＦｖであり、ここで、抗原結合部分は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。

【0186】

別の特定の実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるｓｃＦｖであり、ここで、抗原結合部分は、配列番号１、配列番号４０、及び配列番号３からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0187】

好ましい実施態様では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができるｓｃＦｖであり、ここで、抗原結合部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１のアミノ酸配列ＲＹＷＭＮ（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２のアミノ酸配列ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３のアミノ酸配列ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）、軽鎖相補決定領域（ＣＤＲ Ｌ）１のアミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２のアミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）、及びＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）を含む。

【0188】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0189】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0190】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に
（ｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
ここで、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＥＵ番号付けに従って、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに結合する抗原結合部分を形成することができ、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0191】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0192】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に
（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0193】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に
（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0194】

一実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順に
（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉ）共刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
（ｖｉｉ）刺激シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激シグナル伝達ドメイン
を含む抗原結合受容体を提供する。

【0195】

一実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。一実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0196】

一実施態様では、配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。一実施態様では、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0197】

一実施態様では、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。一実施態様では、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0198】

一実施態様では、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。一実施態様では、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0199】

一実施態様では、抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にＧＦＰ又はその増強されたアナログに融合している。一実施態様では、抗原結合受容体は、Ｃ末端で、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）のＮ末端に、任意選択で本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、融合している。好ましい実施態様では、ペプチドリンカーは配列番号１８のＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）である。

【0200】

一実施態様では、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0201】

好ましい実施態様では、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。そのような一実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１２９のアミノ酸配列からなる。

【0202】

一実施態様では、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0203】

一実施態様では、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体が提供される。

【0204】

一実施態様では、配列番号１３２のアミノ酸配列からなる抗原結合受容体が提供される。

【0205】

一実施態様では、配列番号１９のアミノ酸配列を含まない、本明細書に記載の抗原結合受容体が提供される。

【0206】

本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入細胞
本発明のさらなる態様は、本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞である。本明細書に記載の抗原結合受容体とは、天然にはＴ細胞内及び／又はＴ細胞表面上には含まれず、正常な（非形質導入）Ｔ細胞内又は表面上で（内因的に）発現しない分子をいう。このように、Ｔ細胞内及び／又は表面上の本発明の抗原結合受容体は、Ｔ細胞に人工的に導入される。本発明の文脈において、前記Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に定義されるように治療される対象から単離／取得され得る。したがって、人工的に導入され、続いて前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される本明細書に記載の抗原結合受容体は、（Ｉｇ由来）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のＦｃドメインに（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで）アクセス可能な１つ又は複数の抗原結合部分を含むドメインを含む。本発明の文脈において、これらの人工的に導入された分子は、本明細書において以下に記載されるように（レトロウイルス、レンチウイルス又は非ウイルス）形質導入後に前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される。したがって、形質導入後、本発明によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは本明細書に記載のＦｃドメインに特定の変異を含む（治療用）抗体によって、標的細胞の存在下で活性化され得る。

【0207】

本発明はまた、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞に関する。したがって、本発明の文脈において、形質導入細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子、又は本発明の抗原結合受容体を発現する本発明のベクターを含み得る。

【0208】

本発明の文脈において、「形質導入Ｔ細胞」という用語は、遺伝子改変されたＴ細胞（すなわち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）に関する。本明細書で提供される形質導入Ｔ細胞は、本発明のベクターを含み得る。好ましくは、本明細書で提供される形質導入Ｔ細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子及び／又は本発明のベクターを含む。本発明の形質導入Ｔ細胞は、外来ＤＮＡ（すなわち、Ｔ細胞に導入された核酸分子）を一過性に又は安定的に発現するＴ細胞であり得る。特に、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子は、レトロウイルス又はレンチウイルス形質導入を使用することにより、Ｔ細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。ｍＲＮＡトランスフェクションを使用することにより、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を一過性に発現させることができる。好ましくは、本明細書で提供される形質導入Ｔ細胞は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を介してＴ細胞に核酸分子を導入することによって遺伝子改変されている。したがって、抗原結合受容体の発現は構成的である可能性があり、抗原結合受容体の細胞外ドメインが細胞表面上で検出可能である可能性がある。抗原結合受容体のこの細胞外ドメインは、本明細書で定義される抗原結合受容体の完全な細胞外ドメインを含み得るが、その一部も含み得る。抗原結合受容体における抗原結合部分の大きさは、必要最小限の大きさである。

【0209】

抗原結合受容体が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下でＴ細胞に導入される場合、発現は条件的又は誘導性であってもよい。このような誘導性又は抑制性プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターとトランス活性化因子タンパク質ＡｌｃＲとを含む転写系を挙げることができる。ａｌｃＡプロモーターに結合した目的の遺伝子の発現を制御するために、異なる農業用アルコールベースの製剤が使用される。さらに、テトラサイクリン応答性プロモーター系は、テトラサイクリン存在下で遺伝子発現系を活性化するか又は抑制するかのいずれかの機能を有し得る。これらの系のエレメントとしては、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びＴｅｔＲと単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化配列との融合体であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）などがある。さらに、ステロイド応答性プロモーター、金属調節プロモーター又は病原性関連（ＰＲ）タンパク質関連プロモーターを使用することができる。

【0210】

この発現は、使用する系によって、恒常的又は構成的であり得る。本発明の抗原結合受容体は、本明細書で提供される形質導入Ｔ細胞の表面に発現させることができる。抗原結合受容体の細胞外部分（すなわち抗原結合受容体の細胞外ドメイン）は細胞表面で検出可能であり得るが、一方、細胞内部分（すなわち共刺激シグナル伝達ドメイン（１つ又は複数）及び刺激シグナル伝達ドメイン）は細胞表面で検出不可能である。抗原結合受容体の細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使用することによって、又は細胞外ドメインが結合することができる変異Ｆｃドメインによって行うことができる。細胞外ドメインは、これらの抗体又はＦｃドメインを使用して、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によって検出することができる。

【0211】

他の細胞もまた、本発明の抗原結合受容体で形質導入され、それによって標的細胞に対して指向され得る。これらのさらなる細胞には、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、自然リンパ球系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞又は好中球が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、前記免疫細胞はリンパ球であろう。白血球の表面上の本発明の抗原結合受容体がトリガーとなり、その細胞が由来する系統に関係なく、変異Ｆｃドメインを含む治療用抗体と併用して、その細胞を標的細胞に対して細胞傷害性にする。細胞傷害性は、抗原結合受容体として選択された刺激シグナル伝達ドメイン又は共刺激シグナル伝達ドメインに関係なく起こり、追加のサイトカインの外因性供給には依存しない。したがって、本発明の形質導入細胞は、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ミエロイド細胞又は間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、本明細書で提供される形質導入細胞はＴ細胞（例えば、自己Ｔ細胞）であり、より好ましくは、形質導入細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。さらに、本発明の文脈において、形質導入細胞は自己Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入細胞は、好ましくは自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。対象から分離した自己細胞（例えば、Ｔ細胞）の使用に加えて、本発明は、同種異系細胞の使用も包含する。したがって、本発明の文脈において、形質導入細胞は、同種異系ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの同種異系細胞であってもよい。同種異系という用語は、例えば本明細書に記載の抗原結合受容体発現型の形質導入細胞によって治療される個体／対象とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する非血縁ドナー個体／対象に由来する細胞を指す。自己細胞とは、本明細書に記載の形質導入細胞で治療される対象から上記のように単離／取得された細胞を指す。

【0212】

本発明の形質導入細胞は、さらなる核酸分子、例えばサイトカインをコードする核酸分子を共形質導入され得る。

【0213】

本発明はまた、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞の製造方法であって、Ｔ細胞を本発明のベクターで形質導入する工程と、前記形質導入細胞の中又は上での抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で前記形質導入Ｔ細胞を培養する工程と、前記形質導入Ｔ細胞を回収する工程とを含む方法に関する。

【0214】

本発明の文脈において、本発明の形質導入細胞は、好ましくは対象（好ましくはヒト患者）から細胞（例えば、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）を単離することによって製造される。患者から又はドナーから細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）を単離／取得する方法は当技術分野において周知であり、患者から又はドナーからの本細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の文脈では、例えば細胞は採血又は骨髄の除去によって単離され得る。患者の試料として細胞を単離／取得した後、細胞（例えばＴ細胞）を試料の他の成分から分離する。試料から細胞（例えばＴ細胞）を分離するいくつかの方法が知られており、限定されないが、例えば、患者又はドナーの末梢血試料から細胞を得るための白血球搬出法、ＦＡＣＳ細胞選別装置を使用することにより細胞を単離／取得する方法などが挙げられる。単離／取得された細胞Ｔ細胞は、その後、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用することによって、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用することによって、且つ／又は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びインターロイキン２（ＩＬ－２）を使用することによって培養及び増殖される（例えば、Ｄｕｄｌｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６（２００３），３３２－３４２又はＤｕｄｌｅｙ，Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（２００８），５２３３－５２３９を参照）。

【0215】

その後の工程において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６（２００４），３７４－３８６を参照）によって人工的／遺伝子的に改変／形質導入される。細胞（例えばＴ細胞）に形質導入する方法は当技術分野で公知であり、限定されないが、核酸又は組換え核酸が形質導入される場合、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法又はリポソーム法などが挙げられる。導入する核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えばリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１６６８０２７）を使用することにより、従来通りに高効率で形質導入することができる。ベクターを使用する場合、ベクターがプラスミドベクター（すなわち、ウイルスベクターではないベクター）である限り、ベクターは、上記の核酸と同様に形質導入することができる。本発明の文脈において、細胞（例えば、Ｔ細胞）に形質導入する方法としては、レトロウイルス又はレンチウイルスＴ細胞形質導入、非ウイルスベクター（例えば、スリーピングビューティーミニサークルベクター）、並びにｍＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。「ｍＲＮＡトランスフェクション」とは、形質導入される細胞内で目的のタンパク質、例えば本発明の抗原結合受容体を一過性に発現させる当業者に周知の方法を指す。簡単に言えば、細胞は、エレクトロポレーションシステム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用することによって、本発明の抗原結合受容体をコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションされ、その後、上記の標準的な細胞（例えば、Ｔ細胞）培養プロトコールによって培養され得る（ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（１）（２００６），１５１－１５９を参照）。本発明の形質導入細胞は、レンチウイルス形質導入、又は最も好ましくはレトロウイルス形質導入によって生成することができる。

【0216】

これに関連して、細胞に形質導入するための適切なレトロウイルスベクターは当技術分野で知られており、例えば、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Ｃｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１９９９），５０７－５１３），ＬＺＲＳ－ｉｄ３－ＩＨＲＥＳ（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６（１９９７），１５９７－１６０２），ＦｅＬＶ（Ｎｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０８（１９８４），８１４－８２０），ＳＡＸ（Ｋａｎｔｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６），６５６３－６５６７），ｐＤＯＬ（Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７（１９８８），３７２－３８８），Ｎ２（Ｋａｓｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（１９９０），４７３－４７７），ＬＮＬ６（Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４（１９９４），１３３３－１３４１），ｐＺｉｐＮＥＯ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３（１９９４），３６３０－３６３８），ＬＡＳＮ（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１９９６），１１２３－１１２９），ｐＧ１ＸｓＮａ（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４（１９９６），２０３１－２０３６），ＬＣＮＸ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１９９７），１０４１－１０４８），ＳＦＧ（Ｇａｌｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９０（１９９７）、及びＬＸＳＮ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１９９７），１０４１－１０４８），ＳＦＧ（Ｇａｌｌａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９０（１９９７），９５２－９５７），ＨＭＢ－Ｈｂ－Ｈｕ（Ｖｉｅｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７），１１５９５－１１６００），ｐＭＶ７（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４６（１９９８），６１－６６），ｐＳＴＩＴＣＨ（Ｗｅｉｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５（１９９８），１１９５－１２０３），ｐＬＺＲ（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（１９９９），１２３－１３２），ｐＢＡＧ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（１９９９），９７７－９８２），ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Ｇｉｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２５（２００２），１３９－１５１），ｐＬＧＳＮ（Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２００３），１１５５－１１６８），ｐＭＰ７１（Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２００３），１１５５－１１６８），ｐＧＣＳＡＭ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（２００３），３２８７－３２９５），ｐＭＳＧＶ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（２００５），４４１５－４４２３）、又はｐＭＸ（ｄｅ Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（２００８），５１２８－５１３６）などである。本発明の文脈において、細胞（例えばＴ細胞）に形質導入するための適切なレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ－ＳＩＮレンチウイルスベクター（Ｈｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６（５）（２００９），３７０－３７６），ｐ１５６ＲＲＬ－ｓｉｎＰＰＴ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Ｃａｍｐｅａｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（８）（２００９），ｅ６５２９），ｐＣＭＶＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：２２０３６），ＦＵＧＷ（Ｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５（５５５６）（２００２），８６８－８７２，ｐＬＶＸ－ＥＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：６４３６８），ｐＬＶＥ（Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（９）（２０１４），Ｅ７９８－８０６），ｐＣＤＨ１－ＭＣＳ１－ＥＦ１（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７（１１）（２００９），１７５６－１７７０），ｐＳＬＩＫ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（４）（２０１４），３４５－３５６），ｐＬＪＭ１（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４５（１２）（２０１３），１４２８－３０），ｐＬＸ３０２（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．６（２８７）（２０１３），ｒｓ１３），ｐＨＲ－ＩＧ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．３３（１２）（２０１３），１８７５－８５），ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：６２０５３），ｐＬＳ（Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）（１９９８），８１５０－８１５７），ｐＬＬ３．７（Ｌａｚｅｂｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８３（７）（２００８），１１０７８－８２），ＦＲＩＧ（Ｒａｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７（２０１３），２３－３２），ｐＷＰＴ（Ｒｉｔｚ－Ｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４６（６）（２００３），８１０－８２１），ｐＢＯＢ（Ｍａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（１－２）（２００４），５－１１）、又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号：２７９７６）である。

【0217】

本発明の形質導入細胞は、好ましくは、それらの自然環境の外で、制御された条件下で増殖される。特に、「培養」という用語は、多細胞真核生物（好ましくはヒト患者由来）に由来する細胞（例えば、本発明の形質導入細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることを意味する。細胞培養は、元の組織源から分離された細胞生存させておくための実験技術である。ここで、本発明の形質導入細胞は、前記形質導入細胞中又は前記形質導入細胞上で本発明の抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で培養される。導入遺伝子（すなわち、本発明の抗原結合受容体）の発現を可能にする条件は、当技術分野で一般的に知られており、例えば、アゴニスト抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、並びにインターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などのサイトカインの添加が含まれる。本発明の抗原結合受容体を培養された形質導入細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ）内で発現させた後、形質導入細胞を培養物（すなわち、培養培地）から回収（すなわち、再抽出）する。

【0218】

したがって、本発明には、本発明の方法によって得られる本発明の核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する形質導入細胞、好ましくはＴ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞も含まれる。

【0219】

核酸分子
本発明のさらなる態様は、本発明の１つ又は複数の抗原結合受容体をコードする核酸及びベクターである。本発明の抗原結合受容体をコードする例示的な核酸分子を配列番号２０に示す。本発明の核酸分子は、調節配列の制御下にあり得る。例えば、本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が採用され得る。本発明の文脈において、核酸分子は構成的又は誘導性プロモーターの制御下で発現される。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＵＢＣプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１），ＰＧＫ（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＥＦ１Ａプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＡＧＧプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＳＶ４０プロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＴＲＥプロモーター（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（２００４），Ｓ３６７－Ｓ３６７（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．０６．９０４））、又はＮａｎｏｇプロモーター（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５（５）（２００５），３１７－２４）である。したがって、本発明は、本発明に記載の核酸分子を含むベクター（複数可）にも関する。ここでベクターという用語は、それが導入された細胞内で自律的に複製できる環状又は直鎖状の核酸分子を指す。分子生物学の当業者には多くの適切なベクターが知られているが、その選択は所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子工学で従来から使用されている他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を用いて、種々のプラスミド及びベクターを構築することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．）及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載された技術を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに再構成することができる。詳細は後述するが、ＤＮＡの個々の配列を単離するためにクローニングベクターを使用した。特定のポリペプチドの発現が必要な場合には、関連配列を発現ベクターに導入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８、及びｐＧＢＴ９が挙げられる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。

【0220】

本発明はまた、本明細書で定義される抗原結合受容体をコードする前記核酸分子（複数可）に作動可能に連結された調節配列である核酸分子（複数可）を含むベクターに関する。本発明の文脈において、ベクターはポリシストロニックであってもよい。このような調節配列（制御エレメント）は、当業者に知られており、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクターに挿入物を導入するための翻訳及び挿入部位を含み得る。本発明の文脈において、前記核酸分子（複数可）は、真核細胞又は原核細胞での発現を可能にする前記発現制御配列に作動可能に連結される。前記ベクターは、本明細書で定義される抗原結合受容体をコードする核酸分子（複数可）を含む発現ベクター（複数可）であることが想定される。作動可能に連結されるとは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましく使用されることは当業者にとって明らかである。

【0221】

本発明の文脈において、記載されたベクター（複数可）は発現ベクター（複数可）である。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができる構築物であり、選択された細胞内でコード配列の発現を提供する。発現ベクターは、例えばクローニングベクター（複数可）、バイナリベクター（複数可）、又は統合ベクター（複数可）であり得る。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物及び／又は真核細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者には周知である。真核細胞の場合、それらは通常、転写の開始を確実にするプロモーターと、任意で転写の終止と転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞での発現を可能にする可能性のある調節エレメントとしては、例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられ、真核宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例としては、酵母のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、又は哺乳動物及びその他の動物細胞におけるＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、又はグロビンイントロンが挙げられる。

【0222】

転写の開始を担うエレメントの他に、そのような調節エレメントには、ポリヌクレオチドの下流にあるＳＶ４０－ポリＡ部位又はｔｋ－ポリＡ部位などの転写終止シグナルも含まれ得る。さらに、使用される発現システムに応じて、ポリペプチドを細胞区画に誘導するか、又は培地に分泌することができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列を、記載された核酸配列のコード配列に追加することができ、これは当技術分野で周知である；例えば、添付の実施例も参照のこと。

【0223】

リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始及び終止配列と適切な段階で組み立てられ、好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部の細胞周辺腔又は細胞外培地への分泌を誘導できるリーダー配列である。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化又は簡便な精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む抗原結合受容体をコードすることができる；上掲を参照のこと。これに関連して、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ又はｐＥＦ－ｎｅｏ（Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１），１４１－１５０）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）など、当技術分野で公知である。

【0224】

本発明の文脈において、発現制御配列は、真核細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができるベクター内の真核性プロモーター系であろうが、原核細胞用の制御配列もまた使用され得る。ベクターが適切な細胞に組み込まれると、その細胞はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で、所望に応じて維持される。追加の調節エレメントには、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーが含まれる場合がある。有利には、本発明の上記のベクターは、選択可能及び／又はスコア付け可能な（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーを含む。形質転換細胞並びに例えば植物組織及び植物の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は、当業者に周知であり、例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４），１４３－１４９）、アミノグリコシドのネオマイシン、カナマイシン、及びパロマイシンに耐性を与えるｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３），９８７－９９５）、及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ ３２（１９８４），４８１－４８５）の選択の基礎としての代謝拮抗剤耐性を含んでいる。追加の選択遺伝子が記載されており、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５（１９８８），８０４７）；細胞がマンノースを利用できるようにするマンノース－６－リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）及びオルニチン脱炭酸酵素阻害剤である２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチン脱炭酸酵素）ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）又はブラストサイジンＳに対する耐性を付与するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５），２３３６－２３３８）である。

【0225】

有用なスコア付け可能な（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーも当業者に知られており、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６），５９－７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６），１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６），４４－４７）、又はβ－グルクロニダーゼをコードする遺伝子である（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．６（１９８７），３９０１－３９０７）。この実施態様は、記載されたベクターを含む細胞、組織、及び生物の簡単且つ迅速なスクリーニングに特に有用である。

【0226】

上記のように、記載された核酸分子は、例えば養子Ｔ細胞療法のためだけでなく、遺伝子治療の目的でも、細胞内で本発明の抗原結合受容体を発現させるために、単独で又はベクター（複数可）の一部として使用することができる。本明細書に記載の抗原結合受容体のいずれか１つをコードするＤＮＡ配列（複数可）を含む核酸分子又はベクター（複数可）が細胞に導入され、次いで、目的のポリペプチドが産生される。遺伝子治療は、体外又は体内の技術によって治療遺伝子を細胞に導入することに基づいており、遺伝子導入の最も重要な応用の１つである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法又は遺伝子送達システムに適したベクター、方法又は遺伝子送達システムは文献に記載されており、当業者に知られている；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６），５３４－５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１－９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２），８０８－８１３；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９４），２３９；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６），３７０－３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５），１０７７－１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｂｌｏｏｄ ９１（１９９８），３０－３６；Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９８），６９２－６９９；Ｎａｂｅｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７），２８９－２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８），２２４３－５１；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６），７１４－７１６；国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号；米国特許第５，５８０，８５９号；米国特許第５，５８９，４６６号；又はＳｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６），６３５－６４０を参照のこと。記載された核酸分子及びベクターは、細胞への直接導入用、又はリポソーム若しくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入用に設計することができる。本発明の文脈において、前記細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞であり、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。

【0227】

上記に従い、本発明は、本明細書において定義される抗原結合受容体のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子工学において従来から使用されているベクター、特にプラスミド、コスミド及びバクテリオファージを誘導する方法に関する。本発明の文脈において、前記ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子導入ベクター若しくはターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的細胞集団への上記のポリヌクレオチド又はベクターの送達に使用することができる。

【0228】

当業者に周知の方法が、組換えベクター（複数可）を構築するために使用され得る；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．），Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９，ｌｏｃ ｃｉｔ．）又は他の標準的な教科書に記載された技術を参照のこと。あるいは、上記の核酸分子及びベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに再構成することができる。本発明の核酸分子を含むベクターは、細胞宿主の種類に応じて異なる周知の方法によって宿主細胞に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般的に原核細胞に用いられるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主に用いられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲を参照）。記載のベクターは、特に、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ又はｐＥＦ－ｎｅｏであり得る。ベクターｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ及びｐＥＦ－ｎｅｏは、当技術分野において、例えば、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１９９５），７０２１－７０２５及びＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１），１４１－１５０に記載されている。

【0229】

本発明はまた、本明細書に記載のベクターで形質導入されたＴ細胞も提供する。前記Ｔ細胞は、上記ベクターの少なくとも１つ又は上記核酸分子の少なくとも１つをＴ細胞又はその前駆細胞に導入することによって産生され得る。Ｔ細胞における前記少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在は、変異Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む上記の抗原結合受容体をコードする遺伝子の発現を媒介する。本発明のベクターはポリシストロニックであってもよい。

【0230】

Ｔ細胞又はその前駆体細胞に導入される記載された核酸分子（複数可）又はベクター（複数可）は、細胞のゲノムに組み込まれるか、又は染色体外に維持され得る。

【0231】

標的細胞抗原
上述したように、変異Ｆｃドメイン、特にアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇ（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメインからなる本明細書に記載の抗体の（Ｉｇ由来）ドメインは、標的細胞表面分子、例えば腫瘍細胞表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対して特異性を有する抗原相互作用部位を含む。本発明の文脈において、このような抗体は、本発明の抗原結合受容体を含む本明細書に記載の形質導入Ｔ細胞を標的細胞（例えば腫瘍細胞）と物理的に接触させ、形質導入Ｔ細胞が活性化される。本発明の形質導入Ｔ細胞の活性化は、本明細書に記載されているように、標的細胞の溶解を優先的にもたらす。

【0232】

標的細胞（腫瘍など）の表面に自然に発生する標的細胞抗原（腫瘍マーカーなど）の例が本明細書で以下に示され、限定されないが、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮成長因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮成長因子３）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン－１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、炭素脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、及び／又はヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドが挙げられる。

【0233】

したがって、本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体は、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇ（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメイン、すなわち、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮成長因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮成長因子３）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン－１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、炭素脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、及び／又はヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドからなる群から選択される腫瘍細胞の表面上に天然に存在する抗原／マーカーに特異的に結合することができる治療用抗体に結合する。

【0234】

Ａ３３抗原、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、炭素脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮成長因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮成長因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮成長因子３）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＭＵＣ－１（ムチン－１）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の（ヒト）メンバーの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースにおいて入手可能であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｒｅｖｉｅｗｅｄ％３Ａｙｅｓから取得できる。これらの（タンパク質）配列は、注釈付き修飾配列にも関連している。本発明はまた、本明細書で提供される簡潔な配列の相同配列、及び遺伝的対立遺伝子バリアントなどが使用される技術及び方法も提供する。好ましくは、本明細書の簡潔な配列のそのようなバリアントなどが使用される。好ましくは、そのようなバリアントは遺伝子バリアントである。当業者は、これらの（タンパク質）配列の関連するコード領域を、ｍＲＮＡ／ＤＮＡだけでなくゲノムＤＮＡのエントリーを含むこれらのデータバンクのエントリーから容易に推測することができる。（ヒト）ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１２８８４（エントリーバージョン１６８、配列バージョン５）から取得できる；（ヒト）ＣＥＡ（癌胎児性抗原）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６７３１（エントリーバージョン１７１、配列バージョン３）から取得できる；（ヒト）ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４２２（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＭＳＬＮ（メソテリン）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１３４２１（バージョン番号１３２、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８８８（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ１３４１４（二次アクセッション番号）、バージョン番号１６５、配列バージョン２から取得できる；（ヒト）ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン番号１１８、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１５３２８（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ５３ＥＷ２（二次アクセッション番号）、バージョン番号１５３及び配列バージョン３から取得できる；（ヒト）栄養芽細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０９７５８（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ１５６５８（二次アクセッション番号）、バージョン番号１７２及び配列バージョン３から取得できる；（ヒト）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｏ４３６５３（一次引用可能アクセッション番号）又はＱ６ＵＷ９２（二次アクセッション番号）、バージョン番号１３４及び配列バージョン１から取得できる；（ヒト）ＨＥＲ－１（上皮成長因子受容体）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３（エントリーバージョン１７７、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＨＥＲ－２（受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４６２６（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から取得できる；（ヒト）ＨＥＲ－３（受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－３）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８６０（エントリーバージョン１４０、配列バージョン１）から取得できる；（ヒト）ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から取得できる；（ヒト）ＣＤ２２（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２２）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０２７３（エントリーバージョン１３５、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＣＤ３３（Ｂリンパ球抗原ＣＤ３３）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０１３８（エントリーバージョン１２９、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＣＡ－１２－５（ムチン１６）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＸＩ７（エントリーバージョン６６、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＨＬＡ－ＤＲの配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ２９９００（エントリーバージョン５９、配列バージョン１）から取得できる；（ヒト）ＭＵＣ－１（ムチン－１）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９４１（エントリーバージョン１３５、配列バージョン３）から取得できる；（ヒト）Ａ３３（細胞表面Ａ３３抗原）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９７９５（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から取得できる；（ヒト）ＰＳＭＡ（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４６０９（エントリーバージョン１３３、配列バージョン１）から取得できる；（ヒト）トランスフェリン受容体の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＰ５２（エントリーバージョン９９、配列バージョン１）及びＰ０２７８６（エントリーバージョン１５２、配列バージョン２）から取得できる；（ヒト）ＴＮＣ（テネイシン）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４８２１（エントリーバージョン１４１、配列バージョン３）から取得できる；又は、（ヒト）ＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６７９０（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から取得できる。

【0235】

好ましい実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）からなる群から選択される。

【0236】

上記の標的細胞抗原のいずれかに特異的に結合できる抗体は、哺乳動物免疫系を免疫化すること、及び／又は組換えライブラリーを用いたファージディスプレイなど、当技術分野で周知の方法を用いて生成することができる。

【0237】

本発明に従って使用される抗体は、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメインを含む。Ｐ３２９Ｇ変異はＦｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させ、結合及び／又はエフェクター機能に影響を及ぼすさらなるＦｃ変異と組み合わせて用いることができる。したがって、さらなる実施態様では、抗体の変異Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施態様では、変異Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃ変異ドメインを含む抗体）は、天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満を示し、且つ／又は、天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、エフェクター機能の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満を示す。一実施態様では、変異Ｆｃドメイン（又は前記変異Ｆｃドメインを含む抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ以上である。特定の実施態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一実施態様では、変異Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ_１ Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に変化した結合親和性を示す。一実施態様では、変異Ｆｃドメインを含む抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満を示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体それぞれへの結合が低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。

【0238】

特定の実施態様では、抗体のＦｃドメインは、非変異型Ｆｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように変異している。エフェクター機能の低下には、限定されないが、以下のうちの１つ又は複数を挙げることができる：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の低下、標的結合抗体の架橋の低下、樹状細胞の成熟の低下、又はＴ細胞のプライミングの低下。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む抗体）によって誘発されるＡＤＣＣの２０％未満である。

【0239】

一実施態様では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４及び／又はＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい実施態様では、Ｆｃドメインは、ＥＵ番号付けに従ってアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ_１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（及び相補体）の結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体の結合又はエフェクター機能などの特性を決定する方法も記載する。

【0240】

特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化が除去されている。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７のアミノ酸変異、特にアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）に置き換えるアミノ酸変異を含む。

【0241】

本明細書に記載され、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載されるＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換（米国特許第６，７３７，０５６号）も含む。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び２９７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに変異した、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0242】

変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝学的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。

【0243】

Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。

【0244】

Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む抗体のエフェクター機能は、当技術分野で知られている方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。

【0245】

いくつかの実施態様では、補体成分、特にＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が減少する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能を低下させるように操作されるいくつかの実施態様では、前記低下したエフェクター機能にはＣＤＣの低下が含まれる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑと結合できるかどうか、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２，１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照）。

【0246】

キット
本発明のさらなる態様は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸、及び／又は細胞、好ましくは本発明の抗原結合受容体による形質導入のためのＴ細胞／該受容体で形質導入されるＴ細胞、並びに任意で、変異したＦｃドメインを含む抗体／抗体（複数）からなるキットであり、ここで抗原結合受容体は変異したＦｃドメインに特異的に結合することができる。

【0247】

したがって、
（Ａ）本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入Ｔ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットが提供される。

【0248】

さらに、
（Ａ）本発明の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド及び／又はベクター；並びに
（Ｂ）標的細胞抗原に結合し、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットが提供される。

【0249】

本発明のキットは、形質導入Ｔ細胞、単離されたポリヌクレオチド及び／又はベクター、並びにＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む１つ又は複数の抗体を含み得る。特定の実施態様では、抗体は治療用抗体、例えば本明細書で上述したような腫瘍特異的抗体である。腫瘍特異的抗原は当技術分野で知られており、本明細書で上述した。本発明の文脈において、抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される。本発明によるキットは、形質導入Ｔ細胞、又は形質導入Ｔ細胞を生成するためのポリヌクレオチド／ベクターを含む。この文脈では、形質導入Ｔ細胞は、特定の腫瘍に特異的ではなく、変異したＦｃドメインを含む治療用抗体を使用することで任意の腫瘍を標的とすることができるため、ユニバーサルＴ細胞である。本明細書では、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の例（たとえば、配列番号１０２～１１５）が提供されるが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む任意の抗体を本発明に従って使用することができ、本明細書で提供されるキットに含めることができる。

【0250】

特定の実施態様では、変異Ｆｃ領域を含む抗体は、ＣＤ２０に特異的に結合することができ、配列番号１０２の重鎖配列及び配列番号１０３の軽鎖配列を含む。一実施態様では、変異Ｆｃ領域を含む抗体は、ＦＡＰに特異的に結合することができ、配列番号１０４の重鎖配列及び配列番号１０５の軽鎖配列を含む。一実施態様では、変異Ｆｃ領域を含む抗体はＣＥＡに特異的に結合することができ、配列番号１０６の重鎖配列及び配列番号１０７の軽鎖配列、配列番号１０８の重鎖配列及び配列番号１０９の軽鎖配列、配列番号１１０の重鎖配列及び配列番号１１１の軽鎖配列、又は配列番号１１２の重鎖配列及び配列番号１１３の軽鎖配列を含む。さらなる実施態様では、変異Ｆｃ領域を含む抗体は、テネイシン（ＴＮＣ）に特異的に結合することができ、配列番号１１４の重鎖配列及び配列番号１１５の軽鎖配列を含む。

【0251】

本発明の一実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１０２の重鎖及び配列番号１０３の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。このキットはＣＤ２０陽性がんの治療に使用することができる。

【0252】

別の実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１０４の重鎖及び配列番号１０５の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。このキットはＦＡＰ陽性がんの治療に使用することができる。

【0253】

別の実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１０６の重鎖及び配列番号１０７の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。あるいは、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１０８の重鎖及び配列番号１０９の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。このキットはＦＡＰ陽性がんの治療に使用することができる。あるいは、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ２８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１１０の重鎖及び配列番号１１１の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。別の実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１１２の重鎖及び配列番号１１３の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。これらのキットはＣＥＡ陽性がんの治療に使用することができる。

【0254】

別の実施態様では、配列番号７のアミノ酸配列（「ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現することができる形質導入Ｔ細胞を含むキットが提供され、又は、キットは、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、キットは配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドを含む）と、配列番号１１４の重鎖及び配列番号１１５の軽鎖を含む抗体とを組み合わせて含む。このキットはＴＮＣ陽性がんの治療に使用することができる。

【0255】

さらに、本発明のキットの一部は、バイアル又はボトルに個別に包装することができ、あるいは容器又は複数容器ユニットに組み合わせて包装することができる。さらに、本発明のキットは、患者細胞、好ましくは本明細書に記載のＴ細胞を本発明の抗原結合受容体（複数可）で形質導入することができ、ＧＭＰ（欧州委員会がｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｅｕｄｒａｌｅｘ／ｉｎｄｅｘ＿ｅｎ．ｈｔｍの下で公表した適正製造規範のためのガイドラインに記載されている適正製造規範）条件下でインキュベートすることができる（密閉式）バッグ細胞インキュベーションシステムを含み得る。さらに、本発明のキットは、単離／取得された患者のＴ細胞を本発明の抗原結合受容体で形質導入し、ＧＭＰ下でインキュベートすることができる（密閉式）バッグ細胞インキュベーションシステムを含む。さらに、本発明の文脈において、キットは、本明細書に記載の抗原結合受容体（複数可）をコードするベクターも含み得る。本発明のキットは、特に、本発明の方法を実施するために有利に使用され得、本明細書で言及される様々な用途、例えば、研究ツール又は医療ツールとして採用され得る。キットの製造は、好ましくは当業者に知られている標準的手順に従う。

【0256】

この文脈において、患者由来の細胞、好ましくはＴ細胞は、上記のようなキットを用いて、本明細書に記載の変異Ｆｃドメインに特異的に結合できる本発明の抗原結合受容体で形質転換することができる。変異Ｆｃドメインに特異的に結合できる抗原結合部分を含む細胞外ドメインは、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に天然には存在しない。したがって、本発明のキットで形質導入された患者由来細胞は、抗体、例えば治療用抗体の変異Ｆｃドメインに特異的に結合する能力を獲得し、変異Ｆｃドメインを含む治療用抗体（この治療用抗体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する（つまり、内因的に発現される）腫瘍特異的抗原に結合することができる）との相互作用を介して標的細胞の排除／溶解を誘導することができるようになる。本明細書に記載の抗原結合受容体の細胞外ドメインの結合により、そのＴ細胞は活性化され、変異Ｆｃドメインを含む治療用抗体を介してそれを腫瘍細胞と物理的に接触させる。非形質導入Ｔ細胞又は内在性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、変異Ｆｃドメインを含む治療用抗体の変異Ｆｃドメインに結合することができない。変異Ｆｃドメインに特異的に結合できる細胞外ドメインを含む抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞は、本明細書に記載のＦｃドメインの変異を含まない治療用抗体の影響を受けない状態である。したがって、本発明の抗原結合受容体分子を発現するＴ細胞は、本明細書に記載のＦｃドメインの変異を含む抗体の存在下で、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞を溶解する能力を有する。対応する標的細胞は、本明細書に記載の治療用抗体の少なくとも１つ、好ましくは２つの結合ドメインによって認識される表面分子、すなわち腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原を発現する細胞を含む。このような表面分子は、本明細書において以下のように特徴づけられる。

【0257】

標的細胞の溶解は、当技術分野で公知の方法によって検出することができる。したがって、このような方法は、特に生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを含む。このような生理学的アッセイは、例えば細胞膜の完全性の喪失による細胞死をモニターすることができる（例えば、ＦＡＣＳベースのヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出定（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ）アッセイ（ＬＤＨ）、放射性５１Ｃｒ放出（ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ）アッセイ、蛍光定量ユーロピウム放出（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）アッセイ及びカルセインＡＭ放出アッセイ）。さらなるアッセイは、例えば、測光ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ－１及びアラマーブルーアッセイ、放射性３Ｈ－Ｔｈｄ取り込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、及びミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン１２３アッセイによる細胞生存能力のモニターを含む。さらに、アポトーシスは、例えば、ＦＡＣＳベースのホスファチジルセリン曝露アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのＴＵＮＥＬ試験、カスパーゼ活性アッセイ（測光、蛍光測定又はＥＬＩＳＡベース）によって、又は変化した細胞形態（収縮、膜小疱形成）を分析することによってモニターすることができる。

【0258】

治療用途及び治療の方法
本明細書で提供される分子又は構築物（例えば、抗原結合受容体、形質導入Ｔ細胞及びキット）は、特にがんの治療のために医療現場で特に有用である。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞上の標的抗原に結合し、且つ変異Ｆｃドメイン（すなわち、ＥＵ番号付けによるＰ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメイン）を含む治療用抗体と併せて、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞で治療することができる。したがって、特定の実施態様では、抗原結合受容体、形質導入Ｔ細胞又はキットは、がん、特に上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんの治療において使用される。

【0259】

該治療の腫瘍特異性は、標的細胞抗原に結合する治療用抗体によってもたらされ、該抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入Ｔ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。この文脈では、該形質導入Ｔ細胞は、所定の腫瘍に特異的ではないが、本発明に従って使用される治療用抗体の特異性に応じて任意の腫瘍を標的とすることができるため、ユニバーサルＴ細胞である。

【0260】

上記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん／癌であっても、血液のがんであってもよい。一実施態様では、上記がん／癌は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸管がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、上咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、皮膚がん（メラノーマ）、尿生殖器管のがん、例えば精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、及び甲状腺のがん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫若しくは骨肉腫などの他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。

【0261】

例えば、腫瘍性疾患及び／又はリンパ腫は、これらの医学的適応症を対象とする特定の構築物を用いて治療され得る。例えば、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異抗原としての）（ヒト）ＥｐＣＡＭに対して向けられる抗体で治療することができる。

【0262】

胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、ＨＥＲ１、好ましくはヒトＨＥＲ１に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。さらに、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＭＣＳＰ、好ましくはヒトＭＣＳＰに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＦＯＬＲ１、好ましくはヒトＦＯＬＲ１に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、Ｔｒｏｐ－２、好ましくはヒトＴｒｏｐ－２に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＰＳＣＡ、好ましくはヒトＰＳＣＡに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、好ましくはヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＭＳＬＮ、好ましくはヒトＭＳＬＮに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんは、ＨＥＲ２、好ましくはヒトＨＥＲ２に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃がん及び／又は肺がんは、ＨＥＲ３、好ましくはヒトＨＥＲ３に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ＣＤ２０、好ましくはヒトＣＤ２０に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。骨髄性白血病は、ＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。卵巣がん、肺がん、乳がん、及び／又は胃腸がんは、ＣＡ１２－５、好ましくはヒトＣＡ１２－５に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、白血病、及び／又は上咽頭癌は、ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくはヒトＨＬＡ－ＤＲに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、及び／又は膵臓がんは、ＭＵＣ－１、好ましくはヒトＭＵＣ－１に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。結腸がんは、Ａ３３、好ましくはヒトＡ３３に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。前立腺がんは、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。膵臓がん、肺がん、及び／又は乳がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒト受容体に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。腎臓がんは、ＣＡ－ＩＸ、好ましくはヒトＣＡ－ＩＸに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入Ｔ細胞で治療することができる。

【0263】

また、本発明は、疾患、例えば上皮、内皮若しくは中皮由来のがん及び／又は血液のがんなどの悪性疾患の治療方法に関するものでもある。本発明の文脈において、前記対象はヒトである。

【0264】

本発明の文脈において、疾患の治療のための特定の方法は、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、本明細書に記載の抗原結合受容体で形質導入する工程；及び
（ｃ）形質導入Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む。

【0265】

本発明の文脈において、前記形質導入Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び／又は１つ若しくは複数の治療用抗体は、静脈内注入によって前記対象に共投与される。

【0266】

さらに、本発明の文脈において、本発明は、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、本明細書に記載の抗原結合受容体で形質導入する工程；
（ｃ）任意で、前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞をＴ細胞受容体で共形質導入する工程；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって該Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を増殖させる工程；及び
（ｅ）形質導入Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む疾患の治療方法を提供する。

【0267】

上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体によるＴＩＬなどのＴ細胞の増殖工程を指す）は、インターロイキン２及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などの（刺激性）サイトカインの存在下で実施することもできる。本発明の文脈において、上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体によるＴＩＬなどのＴ細胞の増殖工程を指す）は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）及び／又はインターロイキン２１（ＩＬ－２１）の存在下で実施することもできる。

【0268】

治療方法は、さらに、本発明に従って使用される抗体の投与を含む。前記抗体は、形質導入Ｔ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与され得る。本発明の文脈において、形質導入Ｔ細胞の投与は、静脈内注入によって行われるであろう。本発明の文脈において、その形質導入Ｔ細胞は、治療対象から単離／取得される。

【0269】

本発明はさらに、他の化合物、例えば、免疫エフェクター細胞、細胞増殖又は細胞刺激のための活性化シグナルを提供することができる分子との同時投与プロトコールを想定している。前記分子は、例えば、Ｔ細胞のさらなる一次活性化シグナル（例えば、さらなる共刺激分子：Ｂ７ファミリーの分子、Ｏｘ４０Ｌ、４．１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１）、又はさらなるサイトカインインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）であってもよい。

【0270】

また、上記のような本発明の組成物は、任意選択で検出のための手段及び方法をさらに含む、診断用組成物であってもよい。

【0271】

組成物
さらに、本発明は、変異Ｆｃドメイン（複数可）を有する抗体分子（複数可）、並びに／又は本発明の抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞（複数可）、並びに／又は本発明による抗原結合受容体をコードする核酸分子（複数可）及びベクター（複数可）を含む組成物（医薬）を提供する。さらに、本発明は、１つ又は複数の前記組成物を含むキットを提供する。本発明の文脈では、該組成物は、担体、安定剤及び／又は添加物である適切な製剤を任意選択でさらに含む薬学的組成物である。したがって、本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞及び／又は前記形質導入Ｔ細胞を含む組成物と組み合わせて投与される、本明細書で定義されている変異Ｆｃドメインを含む抗体分子を含む薬学的組成物（医薬）が提供され、ここで、前記抗体分子は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。

【0272】

用語「組み合わせて」の使用は、治療レジメンの構成要素が対象に投与される順序を制限するものではない。したがって、本明細書に記載の薬学的組成物／医薬は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞の投与前、投与と同時又は投与後での、本明細書で定義されているような抗体の投与を包含する。本明細書で使用される「組み合わせて」はまた、上で定義したような抗体と、本明細書で定義されているような抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞の投与のタイミングを制限するものではない。したがって、これら２つの構成要素が同時に／共に投与されない場合、これらの投与は、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間若しくは７２時間、又は当業者によって且つ／若しくは本明細書に記載のように容易に決定される任意の適切な時間、間隔が空いてもよい。

【0273】

本発明の文脈では、「組み合わせて」という用語はまた、本明細書で定義した抗体と、本発明による抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞が、対象への投与前に一緒にプレインキュベートされるという状態も包含する。したがって、これら２つの構成要素を、投与前に、例えば、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分若しくは１時間、又は当業者が容易に決定できる任意の適切な時間、プレインキュベートしてもよい。別の好ましい実施態様では、本発明は、本明細書で定義した抗体と、本明細書で定義した抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞とが、同時に／共に投与される治療レジメンに関する。本発明の文脈において、本明細書で定義した抗体は、抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞の投与前に投与されてもよい。

【0274】

さらに、本明細書で使用される「組み合わせて」は、開示の治療レジメンを、本明細書で定義した抗体及び本発明の抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞（好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の連続した順序での投与（すなわち、これら２つの構成要素の一方の投与に続いて（一定の時間間隔で）、間にいかなる他の治療プロトコールの投与及び／又は実施なしで、他方を投与する）に限定しない。したがって、本治療レジメンは、本明細書で定義した抗体分子と、本発明による抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞（好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の別々の投与をも包含し、これらの投与は、疾患又はその症状の治療又は予防に必要且つ／又は適した１つ又は複数の治療プロトコールによって切り離されている。このような介在する治療プロトコールの例としては、鎮痛剤の投与、化学療法剤の投与、疾患又はその症状の外科的処置などが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に開示される治療レジメンは、本明細書で定義した抗体と本明細書で定義した抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞（好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）とを、疾患又はその症状の治療又は予防に適した１つ又は複数の治療プロトコールと一緒に、本明細書に記載のように又は当技術分野で知られているように投与することを含む。

【0275】

特に、前記１つ又は複数の薬学的組成物／医薬は、点滴又は注射を介して患者に投与されることが想定される。本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入Ｔ細胞は、点滴又は注射を介して患者に投与されることになる。好適な組成物／医薬の投与は、異なる方法、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与によって行われ得る。

【0276】

本発明の薬学的組成物／医薬は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。好適な薬学的担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などがある。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投与レジメンは、主治医と臨床的要因によって決定される。医療分野においてよく知られているように、患者１名に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身状態、並びに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。通常、本薬学的組成物の定期投与としてのレジメンは、１日当たり１μｇ～５ｇ単位の範囲であることが望ましい。しかし、持続的注入のより好ましい投与量は、１時間あたり体重１ｋｇあたり０．０１μｇ～２ｍｇ、好ましくは０．０１μｇ～１ｍｇ、より好ましくは０．０１μｇ～１００μｇ、さらに好ましくは０．０１μｇ～５０μｇ、最も好ましくは０．０１μｇ～１０μｇ単位の範囲であろう。特に好ましい投与量は、本明細書に後述される。定期的な評価により、進捗をモニターすることができる。投与量は様々だが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい投与量は、ＤＮＡ分子のおよそ１０^６から１０^１２コピーである。

【0277】

本発明の該組成物は局所投与でも全身投与でもよい。通常、投与は非経口（例えば、静脈内）であり、形質導入されたＴ細胞を、例えばカテーテルで、標的部位に直接、動脈内の部位に投与することもできる。非経口投与のための調製物には、滅菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性の溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。水性の担体としては、生理食塩水及び緩衝培地を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、補液，及び栄養補給剤、電解質補給剤（例えばブドウ糖リンゲル液ベースのもの）などが挙げられる。防腐剤及びその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在してよい。さらに、本発明の薬学的組成物は、例えば、血清アルブミン又は免疫グロブリン（好ましくはヒト由来のもの）のような、タンパク質性の担体を含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、（本発明に記載の）タンパク質性の抗体構築物若しくはそれをコードする核酸分子若しくはベクター、及び／又は細胞に加えて、薬学的組成物の使用目的に応じてさらなる生物学的に活性な薬剤を含むことが想定される。このような薬剤は、胃腸系に作用する薬物、細胞分裂停止剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、循環器系に作用する薬物、及び／又は当技術分野で知られているＴ細胞共刺激分子又はサイトカインなどの薬剤であってもよい。

【0278】

これら及びその他の実施態様は、本発明の説明及び実施例によって開示され、包含される。本発明に従って採用される抗体、方法、使用及び化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子機器を使用して公共の図書館及びデータベースから検索することができる。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌから、例えばインターネット上で公開されている公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。さらなるデータベース及びアドレス、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／などが当業者に知られており、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍからアクセス可能である。

【0279】

例示的配列
表２：例示的なＶＨ３ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表３：例示的なＶＨ３ ｘ ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲ ＤＮＡ配列：

表４：例示的なＶＬ１ＶＨ３ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表５：例示的なＶＬ１ＶＨ３ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲ ＤＮＡ配列：

表６：例示的な抗Ｐ３２９Ｇ抗体
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表７：Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１ Ｆｃバリアント

表８

表９：例示的なＶＨ１ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表１０：例示的なＶＨ２ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表１１：例示的なジスルフィド安定化ＶＨ３ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表１２：さらなる例示的なＶＨ３ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列（ＨｕＲ９６８Ｂ）：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表１３：さらなる例示的なＶＨ３ＶＬ１ Ｐ３２９Ｇ－ＣＡＲアミノ酸配列（ＨｕＲ９６８４Ｍ）：
ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義

表１４：さらなる例示的な抗体ＶＨ／ＶＬドメイン：

【実施例】

【0280】

実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

【0281】

組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に示される。

【0282】

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。

【0283】

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手できない場合は、最も近い相同体からの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全ての構築物は、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計された。

【0284】

ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造
抗体及び二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０７４３０２９）に置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、補充物（総容積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を付加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充物（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を加えた。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、以下に示す標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。

【0285】

ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造
代替的に、本明細書に記載の抗体及び二重特異性抗体は、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。製造のために、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を使用した。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。

【0286】

ＩｇＧ様タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、溶出バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６））によって濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、凝集したタンパク質を単量体タンパク質から分離した。

【0287】

ＩｇＧ様タンパク質の分析
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。タンパク質の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。凝集物含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。

【0288】

レンチウイルス上清の調製とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞への形質導入
約８０％コンフルエントなＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１６）及びＣＡＲをコードする移入ベクター並びにパッケージングベクターｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ及びｐｓＰＡＸ２を２：２：１のモル比で使用して、リポフェクタミンＬＴＸ（商標）に基づくトランスフェクションを行った（Ｇｉｒｙ－Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７３７：１８３－２０９，Ｍｙｂｕｒｇｈ Ｒ，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１４）。６６時間後、上清を回収し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍポリエーテルスルホンフィルターで濾過してウイルス粒子を回収し、精製した。ウイルス粒子は直接使用するか、濃縮して（Ｌｅｎｔｉ－ｘ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、タカラ）、９００×ｇ、２時間、３１℃で、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ，Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）のスピンフェクションに使用した。

【0289】

Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイは、ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）のＴ細胞活性化を測定するものである。この不死化Ｔ細胞株は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように遺伝子操作されている。さらに、該細胞株は、ＣＤ３ｚシグナル伝達メインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を発現する。ＣＡＲと固定化されたアダプター分子（腫瘍抗原結合アダプター分子など）との結合により、ＣＡＲの架橋が起こり、Ｔ細胞活性化とルシフェラーゼの発現に至る。基質の添加後、ＮＦＡＴ活性の細胞変化を相対光単位として測定することができる（Ｄａｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｍａｙ ２０１９，Ｐａｇｅｓ ２０７－２１８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｚ０２７）。一般に、このアッセイは３８４プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３９６３ 白色、透明底）で実施された。標的細胞（ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞）とエフェクター細胞を１：５の比率（標的細胞２０００個、エフェクター細胞１００００個）で１０μｌずつ、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に３連で播種した。増殖培地でさらに、目的の抗体の段階希釈液を、アッセイプレートで最終濃度が６７ｎＭから０．００００６７ｎＭ、最終体積が１ウェルあたり合計３０μｌとなるように調製した。３８４ウェルプレートを３００ｇ、室温で１分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ_２で、湿度雰囲気中インキュベートした。７時間のインキュベーション後、最終容量の２０％のＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ（Ｅ６１２０，Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを３５０×ｇで１分間遠心分離した。その後、直ちにＴｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダーを使用して、１秒／ウェルあたりの相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ バージョン７を用いて、濃度反応曲線をフィッティングさせ、ＥＣ_５０値を算出した。ｐ値として、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７に記載されているＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅスタイルを使用した。^＊はＰ≦０，０３３；^＊＊はＰ≦０，００２；^＊＊＊はＰ≦０，００１を意味する。

【0290】

実施例１
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体の生成及び特性評価
親抗Ｐ３２９Ｇ抗体及びヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体はＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。全ての抗体は、高品質で精製された（表２）。

【0291】

表２－抗Ｐ３２９Ｇ抗体の生化学的分析単量体含有量は、分析サイズ排除クロマトグラフィーで測定した。純度は、非還元型ＳＤＳキャピラリー電気泳動法で測定した。

【0292】

抗Ｐ３２９ＧバインダーＭ－１．７．２４の親及び６つのヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合
機器：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００
チップ：ＣＭ５（＃７７２）
Ｆｃ１～４：抗ヒトＦａｂ特異的（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９５８３－２５）
捕捉：５０ｎＭ ＩｇＧ、６０秒
分析物：ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）（Ｐ１ＡＤ９０００－００４）
ランニングバッファー：ＨＢＳ－ＥＰ
Ｔ°：２５℃
希釈：ＨＢＳ－ＥＰで０．５９から３７．５ｎＭまで２倍希釈
流量：３０μｌ／分
会合２４０秒
解離：８００秒
再生：１０ｍＭグリシン ｐＨ２．１ ２ｘ６０秒間

【0293】

ＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で実行された。抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９５８３－２５）を、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にアミンカップリングにより直接固定化した。ＩｇＧを、５０ｎＭで６０秒間捕捉した。ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）の２倍希釈系列を、３０μｌ／分で２４０秒間リガンド上を通過させ、会合相を記録した。解離相を、８００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋へと切り替えることによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．１を６０秒間２回注入することにより、サイクルごとに再生された。バルク屈折率の差は、参照フローセル１で得られた応答を差し引くことによって補正された。親和定数は、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合に適合させることにより、速度定数から導出された。測定は、独立した希釈系列でトリプリケートで行われた。

【0294】

以下の試料について、ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）との結合を解析した（表３）。

【0295】

表３：ヒト Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合について分析された試料の説明。

【0296】

ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）は、ヒトＩｇＧ１のプラスミン消化と、続いてプロテインＡによるアフィニティー精製及びサイズ排除クロマトグラフィーによって調製された。

【0297】

抗Ｐ３２９ＧバインダーＭ－１．７．２４の親及び６つのヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合
解離相を１本の曲線に適合させ、オフレートを特徴づけるのに役立てた。結合と捕捉反応レベルの比率を算出した。（表４）

【0298】

表４：ヒト Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合に関する６つのヒト化バリアントの結合評価。

【0299】

抗Ｐ３２９ＧバインダーＭ－１．７．２４の親及び３つのヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）に対する親和性
親と同様の結合パターンを持つ３種類のヒト化バリアントを、より詳細に評価した。１：１のラングミュア結合の速度定数を表５にまとめた。

【0300】

表５：速度定数（１：１ラングミュア結合）。独立したトリプリケート（同じ実験内では独立した希釈系列）の平均値と標準偏差（括弧内）。

【0301】

結論
６つのヒト化バリアントが生成された。それらのうちの３つ（ＶＨ４ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３）は、親Ｍ－１．７．２４と比較して、ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合の減少を示した。他の３つのヒト化バリアント（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）は、親バインダーと非常に似た結合反応速度を示し、ヒト化によって親和性が失われることはなかった。

【0302】

実施例２
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の調製
ヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントの機能性を評価するために、Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ変異に特異的なバインダーをコードする重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の異なる可変ドメインＤＮＡ配列を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）結合部分としてクローニングし、第二世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインとして使用した。

【0303】

Ｐ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バリアントは、Ｉｇ重鎖可変メインドメイン（ＶＬ）とＩｇ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ＶＨとＶＬは（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して連結されている。ｓｃＦｖ 抗原結合ドメインは、アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）ＣＤ８ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１７３２［１８３－２０３］）に融合され、これが細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）ＣＤ１３７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１ＡＡ ２１４－２５５）に融合され、さらに刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）ＣＤ３ζ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０９６３ ＡＡ ５２－１６４）に融合される。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲのｓｃＦｖは、ＶＨｘＶＬ（図１Ａ）又はＶＬｘＶＨ（図１Ｂ）の２つの異なる方向で構築された。ＶＨＶＬ構成についての例示的な発現構築物（ＧＦＰレポーターを含む）の図解を図１Ｃに示し、ＶＬＶＨ構成について図１Ｄに示す。

【0304】

実施例３
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞における抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体をＪｕｒｋａｔ（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）細胞へウイルス形質導入した。

【0305】

抗Ｐ３２９Ｇ抗原結受容体の発現をフローサイトメトリーで評価した。異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体を使用するＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、９６ウェル平底プレートにウェル当たり５０，０００細胞で播種した。異なる濃度（１：５の５００ｎＭ～０ｎＭ段階希釈）のＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む抗体で暗所及び冷蔵庫内（４～８°Ｃ）で４５分間染色した後、試料をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、１０％の０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８及び０．５ｇ／Ｌ ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、試料を２．５μｇ／ｍＬポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的及びＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ断片抗体で、冷蔵庫内の暗所で３０分間染色し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＢＤ）で分析した。さらに、抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体には細胞内ＧＦＰレポーターが含まれていた（図１Ｃを参照）。

【0306】

Ｐ３２９Ｇバインダーのヒト化バージョン（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、及びＶＨ３ＶＬ１）と比較して、元の非ヒト化バインダーは細胞表面で弱いＣＡＲ標識化を示すが（図２Ａ）、ＧＦＰ発現は同等である。興味深いことに、ＶＬ１ＶＨ１構築物（図１Ｄを参照）は高いＧＦＰ発現を示すが、細胞表面での弱いＣＡＲ標識化も示し、これはバインダーの好ましくないコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）であることを示している。

【0307】

全体として、予想外に、ＶＨ３ＶＬ１バージョンが最も高いＧＦＰ発現とＣＡＲ表面発現を示す。さらに、ＶＨＶＬコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の試験された全ての構築物（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、及びＶＨ３ＶＬ１）は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に形質導入すると、元の非ヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体、さらには興味深いことにＶＬＶＨコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の構築物（ＶＬ１ＶＨ３）と比較して、増強されたＧＦＰシグナルを示す。

【0308】

結論として、ＶＨＶＬコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）は、抗原結合受容体の発現レベル及び細胞表面への正確な標的化に有利であると思われる。

【0309】

さらに、ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の選択性、特異性及び安全性を特徴づけるために、様々な試験を実施した。

【0310】

実施例４
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的化抗体の存在下での特異的なＴ細胞活性化
様々なヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアントの非特異的結合を除外するために、これらのバリアントを含む抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化を、ＣＤ２０陽性ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞及び様々なＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、ＬＡＬＡ変異、Ｄ２４６Ａ変異又はそれらの組み合わせ）を有する抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）抗体の存在下で評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように行い、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）を使用して、非特異的結合の可能性を評価した。抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）については、非特異的抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化を検出することができなかった。

【0311】

特異的な抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化を、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）の存在下で検出することができた。評価されたＥＣ_５０は、全てのヒト化抗Ｐ３２９Ｇバリアント間で同等であり、元のバインダーのＥＣ_５０と異なることはなかった。

【0312】

興味深いことに、ＶＨＶＬコンフォメーションのｓｃＦｖバインダーを含む抗原結合受容体は、元の非ヒト化バインダー及びＶＬＶＨコンフォメーションのヒト化バインダーと比較して、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の強い活性化をもたらす。より高いプラトー（例えば図３Ｆ参照）は、発現レベルの向上及び／又は抗原結合受容体による細胞表面への輸送の向上により、より強い活性化がもたらされたためと考えられる。さらに、このコンフォメーションはＰ３２９Ｇ変異への結合に影響を与え得る。

【0313】

Ｔ細胞のトニックシグナル伝達又は非特異的な活性化をもたらす抗原結合ドメインクラスター化のリスクを調べるため、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施したが、使用する初期抗体濃度を上げ、段階希釈は１００ｎＭのＧＡ１０１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１で開始し、さらに標的細胞を播種しなかった。

【0314】

図３Ｃに描かれているように、試験した全てのヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントで活性化は検出されず、標的細胞の非存在下で検出可能な受容体クラスター化又は非特異的活性化を示している。

【0315】

実施例５
異なるレベルの抗原を発現する標的細胞に対するＴ細胞活性化によって評価される、異なるヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体バリアントの感受性
さらに、ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の感受性及び選択性を特徴づけるために、上記のようにＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。

【0316】

異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアント抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞を、高（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中程度（Ｓｋｏｖ３）、低（ＨＴ２９）ＦｏｌＲ１陽性標的細胞を識別する能力について評価した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞株において、抗Ｐ３２９Ｇ結合体の様々なバリアントをｓｃＦｖ抗原認識足場として、ＦｏｌＲ１に対して高親和性（１６Ｄ５）（図４Ａ、Ｄ、Ｇ）、中程度親和性（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）（図４Ｂ、Ｅ、Ｈ）又は低親和性（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）（図４Ｃ、Ｆ、Ｉ）を呈する抗体と組み合わせて使用した。高発現標的細胞であるＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１は、高親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ａ）、中程度親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｂ）及び低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｃ）と組み合わせて、用量依存的活性化を示した。中程度発現標的細胞であるＳｋｏｖ３は、高親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ｄ）、中程度親和性抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｅ）、低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｆ）と組み合わせて、用量依存的活性化を示した。低発現標的細胞であるＨＴ２９については、異なる親和性バインダー抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ｇ）、抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｈ）又は低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｉ）と組み合わせて、シグナルは全く検出されなかった。さらに、興味深いことに、ＶＨＶＬフォーマットの抗原結合受容体は、元の非ヒト化バインダー及びＶＬＶＨフォーマットのヒト化バインダーと比較して強いＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の活性化をもたらす。ヒト化バリアントＶＨ３ＶＬ１ ｓｃＦｖバインダーは、全ての構築物の中で最も高いシグナル強度をもたらす（図４Ａ－Ｆ）。

【0317】

さらに、抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図５）又は抗ＨＥＲ２ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図６）のいずれかと組み合わせて使用したＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１^＋及びＨＥＲ２^＋）細胞について、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。いずれも、ＶＬＶＨ配向よりもＶＨＶＬ配向の方が優れているという知見を確かめるものである。ヒト化バリアントＶＨ３ＶＬ１が、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の最も強い活性化をもたらす。

【0318】

実施例６
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞におけるさらなる抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
ジスルフィドヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体をＪｕｒｋａｔ（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ＃ＣＳ１７６５０１）細胞にウイルス形質導入した。抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体発現をフローサイトメトリーによって評価した。ジスルフィド安定化ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体を使用するＪｕｒｋａｔ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、９６ウェル平底プレートに５０．０００細胞／ウェルで播種した。異なる濃度（１：１０の６００ｎＭ～０ｎＭ段階希釈）のＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む抗体で暗所及び冷蔵庫内（４～８℃）で４５分間染色した後、試料をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、１０％の０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８及び０．５ｇ／Ｌ ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、試料を２．５μｇ／ｍＬのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的及びＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ断片抗体で、冷蔵庫内の暗所で３０分間染色し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＢＤ）で分析した。さらに、抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体には細胞内ＧＦＰレポーターが含まれていた（図１Ｃを参照）。ＣＡＲ発現をＧＦＰシグナルに対して正規化した。

【0319】

ヒト化バージョンＶＨ３ＶＬ１及びＶＬ１ＶＨ３と比較して、ジスルフィド安定化Ｐ３２９Ｇバインダーは、細胞表面上で同等のＣＡＲ標識を示している（図７）。

【0320】

実施例７
ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞におけるさらなる抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ ＣＡＲ構築物の発現を検証するために、１．５ｘ１０６個のＨＥＫ２９３－Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、８～２４時間の接着期間後、２μｍのＣＡＲコードプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μＬ）を含むＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、２４７６５）／塩化ナトリウム（Ｂａｘｔｅｒ、Ａ６Ｅ１３０７）混合物でトランスフェクトした。４８時間の培養期間後、ＨＥＫ２９３Ｔ培養上清を捨て、フローサイトメトリーを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣＡＲ発現を解析した。そのため、１ウェル当たり３＊１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに移し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した（５分間、３００ｇ）。一次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＷＴ ＩｇＧ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＰＧ ＩｇＧをＦＡＣＳバッファーで希釈し、１：５０希釈作業溶液を得た。その抗体溶液にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を懸濁し、４℃で３０分間染色した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄（５分、３００ｇ）後、３％Ｆｉｘａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．：２８９０８）を使用して細胞を２０分間固定した。その後、細胞をフローサイトメトリーで分析し、ＧＦＰとＡＰＣ標識について調べた。ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ ＣＡＲはいずれもＨＥＫ２３９ Ｔ細胞で発現及び検出された（図９）。

【0321】

実施例８
Ｔ細胞におけるさらなる抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
レンチウイルス導入によりＣＡＲ Ｔ細胞を調製し、フローサイトメトリーによりＣＡＲの発現を確認した。ＣＡＲ検出のために、適切な量の形質導入Ｔ細胞をＦＡＣＳバッファーで１回、３００×ｇ、５分間洗浄した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能死細胞及びビオチン－ＳＰ（ロングスペーサー）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０６６－００６）を含むＦＡＣＳバッファーを加え、細胞を４℃で３０～４５分間染色した。その後、細胞を２回洗浄し、それぞれの抗体を加え：ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ＣＤ３（ＢＤ、５６０８３５）、ＢＵＶ８０５－ＣＤ８（ＢＤ、７４９３６６）、ＡＰＣストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５２０７）、４℃で３０～４５分間染色した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、再懸濁した後、フローサイトメトリーで評価した。データはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を用いて分析された。Ｔ細胞集団に類似したＣＤ３^＋細胞をゲーティングした後、ＣＡＲ Ｔ陽性細胞の％は、ＨｕＲ９６８４Ｍでは２７％、ＨｕＲ９６８Ｂでは１８％と検出された（図１０Ｂ）。

【0322】

実施例９
ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体とＰ３２９Ｇ変異を含むＡ６ ＩｇＧによって誘導される特異的Ｔ細胞死滅
ＨｕＲ９６８Ｂ又はＨｕＲ９６８４Ｍ ＣＡＲを発現するＴ細胞を血液ドナー（ＰＣＨ２０２０１１００００４）から調製し、標的細胞としてＤＡＮ－Ｇ１８．２を使用し、標的細胞表面のクローディン１８．２と結合するＡ６ ＰＧ ＩｇＧ又はＷＴ Ａ６（ＶＨ／ＶＬ配列番号１３６／１３７及びＦｃにおけるＰ３２９Ｇ変異、例えば配列番号５５）を使用した死滅アッセイで比較した。標的細胞とエフェクター細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ ＰＧ ＩｇＧ又はＷＴ ＩｇＧのいずれかとともにＥ：Ｔ＝１：２の比率で播種した。標的細胞の死滅を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して６０時間測定した（図１１Ａ及びＢ）。

【0323】

Ｐ３２９Ｇ及びＷＴ Ａ６抗体の存在下でも、非形質導入ＵＮＴ細胞は死滅効果を生じなかった。ＨｕＲ９６８Ｂ及びＨｕＲ９６８４Ｍ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＰＧ ＩｇＧとともにインキュベートすると、強力な腫瘍細胞溶解を誘導した（図１１Ａ）。ＰＧ変異を欠く対照ＷＴ ＩｇＧとともにインキュベートした場合、細胞死滅は観察されなかった（図１１Ｂ）。

【0324】

実施例１０
ＨｕＲ９６８Ｂ抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体とＰ３２９Ｇ変異を含むＡ６及びＺｍａｂ ＩｇＧによって誘導される特異的Ｔ細胞死滅
ＨｕＲ９６８Ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、両方ともクローディン１８．２を標的とするＡ６ ＰＧ ＩｇＧとＺｍａｂ ＰＧ ＩｇＧ（ＶＨ／ＶＬ 配列番号１３６／１３７又は１３８／１３９、及びＦｃにおけるＰ３２９Ｇ変異、例えば配列番号５５）の異なる抗体濃度の存在下で２４時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は１：１であった。アッセイは９６ウェル丸底プレートにおいて行い、２４時間後に各ウェルの上清はＬＤＨ放出について観察され、製造元の提案に従って細胞傷害性を算出した（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ１７８０）。どちらのＰＧ ＩｇＧも、高レベルのクローディン１８．２を発現するＤＡＮ－Ｇ１８．２標的細胞の強力な標的細胞溶解を示している（図１２）。

【図1A-B】

【図1C-D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】