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特表2024-546729ヒダントイナーゼをベースとするプロセスを使用するグルホシネートの合成

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】ヒダントイナーゼをベースとするプロセスを使用するグルホシネートの合成

(51)【国際特許分類】

C12P 13/04 20060101AFI20241219BHJP

C07F 9/32 20060101ALI20241219BHJP

C07F 9/6506 20060101ALI20241219BHJP

C12N 9/86 20060101ALI20241219BHJP

C12N 9/14 20060101ALI20241219BHJP

C12N 9/90 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C12P13/04 ZNA

C07F9/32

C07F9/6506

C12N9/86

C12N9/14

C12N9/90

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534279

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-06-27

(86)【国際出願番号】 EP2022085315

(87)【国際公開番号】W WO2023105080

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】21213750.9

(32)【優先日】2021-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508020155

【氏名又は名称】ビーエーエスエフソシエタス・ヨーロピア

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦＳＥ

【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｌ－Ｂｏｓｃｈ－Ｓｔｒａｓｓｅ３８，６７０５６ＬｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎａｍＲｈｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ディートリッヒ，クラウス

(72)【発明者】

【氏名】ブロイアー，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ポット，モリッツステファン

(72)【発明者】

【氏名】ツィマーマン，グンター

(72)【発明者】

【氏名】シーマイヤー，ステファン

【テーマコード（参考）】

4B064

4H050

【Ｆターム（参考）】

4B064AE03

4B064CA21

4B064CB05

4B064CB28

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA12

4H050AA01

4H050AA02

4H050AB84

4H050AC40

4H050BB31

(57)【要約】

本発明は、ヒダントイナーゼ酵素を用いてヒダントインを加水分解してＮ－カルバモイルアミノ酸化合物を形成し、次いで前記Ｎ－カルバモイルアミノ酸化合物のカルバモイル部分を開裂除去するステップを含む、グルホシネートの製造方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（３）

【化1】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩の製造方法であって、以下のステップ：
ａ）式（１）

【化2】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントインをヒダントイナーゼ酵素により加水分解して、式（２）

【化3】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を形成するステップと、
ｂ）式（２）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸のカルバモイル部分を開裂徐去するステップと
を含む方法。

【請求項2】

開裂ステップｂ）が、式（３）

【化4】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩を提供する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

開裂ステップｂ）が、式（３）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩を、ラセミ混合物の形態で、又は式（３ａ）

【化5】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル若しくはその塩のエナンチオマー過剰の形態で、好ましくは、式（３ａ）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩のエナンチオマー過剰の形態で提供し、前記ヒダントイナーゼ酵素はＬ－ヒダントイナーゼ酵素である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記式（１）を有するヒダントインの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に少なくとも７０％が、請求項２に記載の式（３ａ）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩に変換される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記開裂ステップｂ）が、酵素条件下で、好ましくはＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素、より好ましくはＬ－Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素を使用して、或いは前記開裂ステップｂ）が、化学条件下で、好ましくは亜硝酸ナトリウム及び／又は塩化水素を使用して実施される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

式（１）及び（２）中のＲが、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記加水分解ステップａ）が、６～１１、好ましくは６．５～１０、より好ましくは７～９．５、特に７．５～９のｐＨで、及び／又は
２０～５０℃、好ましくは２５～４５℃、より好ましくは３０～４２℃、特に３２～４０℃の温度で実施される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

式（１）及び（２）中のＲが、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらにより好ましくはエチル又はブチル、特にエチルであり、
ｃ）酸性条件下、好ましくは塩酸又は硫酸を使用して脱保護するステップ
をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ヒダントインラセマーゼ酵素及び／又はＮ－カルバモイルアミノ酸ラセマーゼ酵素の添加をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ステップａ）及びステップｂ）が単一容器中で実施され、好ましくは、全ての試薬が実質的に前記反応の開始時に添加されるか、又はステップａ）のための試薬及びステップｂ）のための試薬が異なる時間に前記単一容器に添加される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

加水分解ステップａ）において得られる、式（１ｂ）

【化6】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントインを、好ましくは逆相クロマトグラフィーを使用して分離除去するステップをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ｄ）未反応のＮ－カルバモイル酸をヒダントインにリサイクルするステップ、好ましくは未反応のＮ－カルバモイル酸をヒダントインにリサイクルし、その後、ラセマーゼ酵素を添加するステップ、より好ましくはラセマーゼ酵素の添加によって未反応のＮ－カルバモイル酸をヒダントインにリサイクルするステップであって、前記ラセマーゼ酵素が、Ａ０Ａ６Ｖ７ＡＣＫ５＿ＲＨＩＲＤ（配列番号５）及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｔ６ＫＨＨ４＿９ＲＨＯＢ（配列番号６）及びその変異体からなるＵｎｉｐｒｏｔＩＤによって同定される酵素群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義されるステップをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ヒダントイナーゼ酵素が、Ｏ６９８０９及びその変異体、Ｑ８４６Ｕ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｐ８１００６及びその変異体、Ｑ８４ＦＲ６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ｑ５６Ｓ４９＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ａ１Ｅ３５１＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ｑ２８ＳＡ７及びその変異体、Ｑ４５５１５及びその変異体、Ａ０Ａ３９９ＤＲＱ３＿９ＤＥＩＮ及びその変異体、Ｑ５５ＤＬ０及びその変異体、Ｆ７Ｘ５Ｍ８＿ＳＩＮＭＭ及びその変異体、Ｑ９Ｉ６７６及びその変異体、Ｑ４４１８４及びその変異体、Ｂ５Ｌ３６３及びその変異体、Ｐ４２０８４及びその変異体、Ｐ２５９９５及びその変異体、Ｑ３Ｚ３５４及びその変異体、Ｂ１ＸＥＧ２及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６５＿ＰＡＥＡＵ及びその変異体、Ａ０Ａ１６１ＫＤ３７＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ４ＸＨＲ４＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、Ｅ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ９ＱＴ１７＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ８ＩＶＶ８＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ５ＱＫＥ４＿ＣＬＯＢＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｎ１ＧＢＺ８＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ１７４ＡＤＺ３＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ｕ７Ｖ９Ｑ６＿９ＦＵＳＯ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｊ１ＦＡＩ４＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、ＰＨＹＤＡ＿ＥＣＯＫ１及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｓ８Ｈ５７６＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ４Ｊ４Ｙ８＿９ＥＵＫＡ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＦＳ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＮＪ７＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ２ＡＶ６６＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ４ＲＸＹ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ７ＳＢ７５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１００ＶＲＮ２＿ＰＡＥＡＭ及びその変異体、Ｗ４ＢＤＪ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ５Ｅ０８２＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ５ＺＦＮ３＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＮＭＭ２＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＳＤＶ１＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ１ＰＬＸ０＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ５Ｉ８Ｘ４＿９ＤＥＩＯ及びその変異体、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１４１９５．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１６１４７．１及びその変異体、並びに＊ＡＮＺ１５４８３．１及びその変異体からなるそれらのＵｎｉｐｒｏｔＩＤ又はＮＣＢＩＩＤ（後者はＩＤの先頭に「＊」が示される）によって同定される酵素群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義され、好ましくは、Ｑ４５５１５及びその変異体、Ｑ４４１８４及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ及びその変異体、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、並びにＥ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体からなるそれらのＵｎｉｐｒｏｔＩＤ又はＮＣＢＩＩＤ（後者はＩＤの先頭に「＊」が示される）によって同定される酵素群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素が、Ａ０Ａ０Ｋ９ＹＸ８４＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｅ３ＨＵＬ６＿ＡＣＨＸＡ及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６４及びその変異体、Ａ０Ａ４Ｄ７Ｑ５４８＿ＧＥＯＫＵ及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６４及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｓ９Ｄ９７６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｅ０Ｃ９９６＿９ＢＵＲＫ及びその変異体、Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３（配列番号３）及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴ（配列番号２）及びその変異体からなるそれらのＵｎｉｐｒｏｔＩＤによって同定される酵素群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義され、好ましくは、Ａ０Ａ３Ｅ０Ｃ９９６＿９ＢＵＲＫ及びその変異体、Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ（配列番号４）及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３（配列番号３）及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴ（配列番号２）からなるそれらのＵｎｉｐｒｏｔＩＤによって同定される酵素群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

式（１ｂ）

【化7】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントイン、式（２ａ）

【化8】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩を含む組成物。

【請求項16】

Ｌ－グルホシネート又はその塩の量が、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づいて、少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、特に少なくとも７０重量％である、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

式（２ａ）及び（１ｂ）中のＲが、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである、請求項１５又は１６に記載の組成物。

【請求項18】

好ましくはグルホシネートに耐性を有する植栽された種子又は作物を含む領域において雑草を選択的に防除するための方法であって、
Ｌ－グルホシネート又はその塩を、Ｄ－グルホシネート又はその塩に対して少なくとも５０％、好ましくは７０％を超えるエナンチオマー過剰のエナンチオマー割合で含む組成物の有効量と、組成物の合計量に基づいて０．０１重量％より多く１０重量％未満の式（２）

【化9】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸とを含む組成物の有効量を領域に適用することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒダントイナーゼ酵素を用いてヒダントインを加水分解してＮ－カルバモイルアミノ酸化合物を形成し、次いで前記Ｎ－カルバモイルアミノ酸化合物のカルバモイル部分を開裂除去するステップを含む、グルホシネートの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

除草剤グルホシネートは非選択的な葉面散布型除草剤であり、毒物学的又は環境保護の観点から最も安全な除草剤の１つであると考えられている。現在の商業的なグルホシネートの化学合成法では、Ｌ－グルホシネート及びＤ－グルホシネートのラセミ混合物が得られる（Ｄｕｋｅｅｔａｌ．２０１０Ｔｏｘｉｎｓ２：１９４３－１９６２）。

【化1】

スキーム１．それぞれのアルデヒドを介したヒダントインの合成（式中、Ｒは例えばＨ又はアルキルである）。

【0003】

ヒダントインは、ラセミ体グルホシネートの合成において中間体となり得ることが知られている。それらは、Ｂｕｃｈｅｒｅｒ－Ｂｅｒｇｓ反応によって、それぞれのアルデヒド（スキーム１）から入手することができる。さらなる合成経路は、例えば中国特許第１１１６６２３２５号明細書に記載されている。

【0004】

中国特許第１１３０４５６０４号明細書には、ヒダントインから出発してグルホシネートを合成する方法が開示されている。反応は高圧下、１３０～１８０℃の温度で行う必要がある。したがって、反応条件はかなり過酷である。しかし、工業的規模でオートクレーブ及び／又は１２０℃を超える温度を使用することは、同僚に対する安全上のリスクにもつながる。中国特許第１１１６６２３２５号明細書にもヒダントインを加水分解してグルホシネートを得ることが記載されているが、この反応には強酸又は強塩基と水中での還流条件が必要である。

【0005】

Ｌ－グルホシネート（ホスフィノトリシン又は（Ｓ）－２－アミノ－４－（ヒドロキシ（メチル）ホスホノイル）ブタン酸としても知られる）は、Ｄ－グルホシネートよりも強力であることが知られている（Ｒｕｈｌａｎｄｅｔａｌ．（２００２）Ｅｎｖｉｒｏｎ．ＢｉｏｓａｆｅｔｙＲｅｓ．１：２９－３７）。したがって、より活性の高いＬ－グルホシネートを過剰に製造する方法がさらに注目されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記の背景から、本発明の目的は、グルホシネートの温和な製造方法を提供することであった。

【0007】

さらに、本発明の目的は、グルホシネートの安全な製造方法を提供することである。

【0008】

本発明の目的は、さらに、エナンチオマー過剰のＬ－グルホシネートの温和な製造方法を提供することにある。

【0009】

本発明のさらなる目的は、Ｌ－グルホシネートを含む組成物を提供することである。

【0010】

本発明の目的はさらに、本発明の製造方法に従って得られる組成物を用いて雑草を選択的に防除する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、驚くべきことに、上記の目的の少なくとも１つを、本明細書に記載のヒダントインベースのプロセスによって得ることができることを見出した。さらに、本発明の発明者らによって、特許請求される方法が、除草剤として使用するのに十分な量のグルホシネートを含む組成物を提供することが見出された。

【0012】

したがって、第１の態様において、本発明は、式（３）

【化2】

【化3】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントインをヒダントイナーゼ酵素により加水分解して、式（２）

【化4】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を形成するステップと、
ｂ）式（２）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸のカルバモイル部分を開裂徐去するステップと
を含む方法に関する。

【0013】

以下において、本製造方法、組成物及び雑草を選択的に防除する方法の構成要素の好ましい実施形態をさらに詳細に説明する。それぞれの好ましい実施形態は、それ自体のみならず、他の好ましい実施形態との組合せも好ましいことを理解すべきである。

【0014】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ１において、開裂ステップｂ）は、式（３）

【化5】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩を提供する。

【0015】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ２において、開裂ステップｂ）は、式（３）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩を、ラセミ混合物の形態で、又は式（３ａ）

【化6】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル若しくはその塩のエナンチオマー過剰の形態で、好ましくは、式（３ａ）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩のエナンチオマー過剰の形態で提供し、ヒダントイナーゼ酵素はＬ－ヒダントイナーゼ酵素である。

【0016】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ３において、式（１）を有するヒダントインの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に少なくとも７０％が、式（３ａ）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩に変換される。式（３ａ）は、好ましい実施形態Ａ２で定義される通りである。

【0017】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ４において、開裂ステップｂ）が、酵素条件下で、好ましくはＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素、より好ましくはＬ－Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素を使用して、或いは開裂ステップｂ）が、化学条件下で、好ましくは亜硝酸ナトリウム及び／又は塩化水素を使用して実施される。

【0018】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ４ａにおいて、開裂ステップｂ）は、酵素条件下で、好ましくはＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素、より好ましくはＬ－Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素を使用して、或いは開裂ステップｂ）が、化学条件下で、好ましくは亜硝酸ナトリウム及び／又は塩化水素を使用して実施され、ステップａ）及びｂ）は、ワンポットプロセスで実施される。

【0019】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ５において、式（１）及び（２）中のＲは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである。

【0020】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ６において、加水分解ステップａ）は、６～１１、好ましくは６．５～１０、より好ましくは７～９．５、特に７．５～９のｐＨで、及び／又は２０～５０℃、好ましくは２５～４５℃、より好ましくは３０～４２℃、特に３２～４０℃の温度で実施される。

【0021】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ７において、式（１）及び（２）中のＲは、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらにより好ましくはエチル又はブチル、特にエチルであり、本方法はさらに、
ｃ）酸性条件下、好ましくは塩酸又は硫酸を使用して脱保護するステップ
を含む。

【0022】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ８において、本方法は、ヒダントインラセマーゼ酵素及び／又はＮ－カルバモイルアミノ酸ラセマーゼ酵素の添加をさらに含む。

【0023】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ９において、ステップａ）及びステップｂ）は、単一容器中で実施され、好ましくは、全ての試薬が実質的に反応の開始時に添加されるか、又はステップａ）のための試薬及びステップｂ）のための試薬が異なる時間に単一容器に添加される。

【0024】

第１の態様の好ましい実施形態Ａ１０において、本方法は、加水分解ステップａ）で得られる、式（１ｂ）

【化7】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントインを、好ましくは逆相クロマトグラフィーを使用して分離除去するステップをさらに含む。

【0025】

第２の態様において、本発明は、式（１ｂ）

【化8】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントイン、式（２ａ）

【化9】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩を含む組成物に関する。

【0026】

第２の態様の好ましい実施形態Ｂ１において、Ｌ－グルホシネート又はその塩の量は、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づいて、少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、特に少なくとも７０重量％である。

【0027】

第２の態様の好ましい実施形態Ｂ２において、式（２ａ）及び（１ｂ）中のＲは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである。

【0028】

第３の態様において、本発明は、好ましくはグルホシネートに耐性を有する植栽された種子又は作物を含む領域において雑草を選択的に防除するための方法であって、
Ｌ－グルホシネート又はその塩を、Ｄ－グルホシネート又はその塩に対して少なくとも５０％、好ましくは７０％を超えるエナンチオマー過剰のエナンチオマー割合で含む組成物の有効量と、組成物の合計量に基づいて０．０１重量％より多く１０重量％未満の式（２）

【化10】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸とを領域に適用することを含む方法に関する。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明の例示的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するために重要な定義が示される。

【0030】

本明細書で及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」の単数形は、文脈が特に明確に指示しない限り、それぞれの複数形も包含する。本発明に関連して、「約」及び「およそ」という用語は、対象とする特徴の技術的効果が依然として確保されると当業者が理解することになる精度の幅を指す。この用語は、通常、示された数値から±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％のずれを示す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを理解すべきである。本発明の目的に関する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇｏｆ）」という用語の好ましい実施形態であると見なされる。以下、ある群が少なくともある決まった数の実施形態を含むと定義されている場合、これは、これらの実施形態のみからなる好ましい群も包含することを意味する。さらに、本明細書及び特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」及びこれに類する用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも連続した順番又は時系列順を説明するものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であることと、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示する順序以外の順序で実施することが可能であることとが理解されるべきである。「第１」、「第２」、「第３」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「ｉ」、「ｉｉ」等の用語が方法若しくは使用又はアッセイの工程に関する場合、本出願で別段の指定がない限り、本明細書で前述又は後述するように、この工程間に時間を置かないか、又は時間間隔の一貫性がなく、即ち、この工程は、同時に実施され得るか、又はこのような工程間に数秒間、数分間、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間若しくは更に数年間の時間間隔があり得る。本明細書に記載される特定の方法、手順、試薬等は、変更される可能性があるため、本発明は、それらに限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記載する目的のみに使用され、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者が一般に理解する意味と同義である。

【0031】

本明細書を通じて使用される「重量％」という用語は、「重量パーセント」を表す。

【0032】

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、それぞれの場合において、通常１～２０個の炭素原子、好ましくは１～８個の炭素原子、頻繁には１～６個の炭素原子、より好ましくは１～４個の炭素原子、例えば２又は４個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル基を示す。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、２－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル及びｎ－ヘキシルである。

【0033】

置換パターンに応じて、本発明による化合物は、１個又は複数の立体中心を有し得る。（例えば化学式を介して）明示的に別様に示されない限り、本発明は、好ましくは、本発明による化合物の全ての立体異性体、すなわち、純粋なエナンチオマー、純粋なジアステレオマー、及びラセミ混合物を含むそれらの混合物を包含する。

【0034】

式（３）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩を含む組成物の製造方法、並びに雑草を選択的に防除する方法に関する好ましい実施形態を以下に詳細に説明する。なお、本発明の好ましい実施形態は、単独で又は互いに組み合わせて使用することが好ましいことを理解されたい。

【0035】

上記で示されたように、本発明は、一態様において、式（３）

【化11】

【化12】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントインをヒダントイナーゼ酵素により加水分解して、式（２）

【化13】

【0036】

式（３）

【化14】

を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩は、それぞれのグルホシネート又はそのアルキルエステルの全ての立体異性体、適切な塩を包含することが理解される。さらに、それぞれの双性イオンも式（３）に包含される。適切な塩は、例示的に、塩酸塩、アンモニウム塩、及びイソプロピルアンモニウム塩である。これに関連して、特に式（３）の化合物は２つの立体中心を包含し、ここで１つの立体中心はリン原子に位置し、１つの立体中心はα炭素原子に位置する。特に式（３）の化合物は、リン原子にある立体中心から誘導される全ての立体異性体を包含する。

【0037】

式（１）を有するヒダントインは、任意の適切な製造方法を介して得ることができる。独国特許第３１４２０３６号明細書は例示的にいくつかの合成法を開示している。

【0038】

式（１）を有するヒダントインは、例示的に、ブチル３－シアノ－３－ヒドロキシプロピル（メチル）ホスフィネートなどのアルキル３－シアノ－３－ヒドロキシプロピル（メチル）ホスフィネートから出発して化学的に合成され得、これは、メタノール中濃硫酸で処理され得、次いで、混合物を約４０℃などの約２５℃より高い温度まで加熱され得る。得られた反応混合物は約２５℃まで冷却され、メタノール中のナトリウムメトキシド及び硫酸ナトリウムで処理され得る。粗アルキル３－シアノ－３－ヒドロキシプロピル（メチル）ホスフィネートを、例示的に水中の炭酸二アンモニウムの溶液に添加し、反応混合物を約７０℃の温度まで加熱してもよい。標準的な仕上げ後、所望のアルキルヒダントイン（例えばブチルヒダントイン）を得ることができる。これに関連して、アルキルは、例示的にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、又はオクチルであり得、好ましくはエチル又はブチルである。

【0039】

式（１）を有するヒダントインは、さらに例示的に、グルホシネートアンモニウムの水溶液及びシアン酸カリウムから出発して化学的に合成されてもよい。反応混合物を約５０℃で加熱した後、反応混合物を約２５℃まで冷却し、濃塩化水素を添加する。標準的な仕上げ後、所望のヒダントインを得ることができる。得られたヒダントインを、それぞれのアルキルヒダントイン（例えば、エチルヒダントイン）を提供する例示的なオルト酢酸トリエチルを用いてアルキル化することがさらに可能である。

【0040】

本発明の好ましい実施態様において、加水分解ステップａ）は、６～１１、好ましくは６．５～１０、より好ましくは７～９．５、特に７．５～９のｐＨで実施される。ｐＨは、好ましくは水酸化アルカリ、より好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム、特に水酸化カリウムを使用して調整される。

【0041】

本発明の好ましい実施形態において、加水分解ステップａ）は、２０～５０℃、好ましくは２５～４５℃、より好ましくは３０～４２℃、特に３２～４０℃の温度で実施される。

【0042】

本発明の好ましい実施態様において、加水分解ステップａ）は、水性条件下、好ましくは脱気された水性リン酸緩衝液中、より好ましくは脱気された水性リン酸カリウム緩衝液中で実施される。

【0043】

本発明の好ましい実施態様において、加水分解ステップａ）は、撹拌中、好ましくは５０～１０００ｒｐｍ、より好ましくは１００～８００ｒｐｍ、さらに好ましくは１５０～６００ｒｐｍ、さらに好ましくは１８０～４００ｒｐｍ、特に好ましくは２００～３００ｒｐｍで実施される。

【0044】

任意の適切なヒダントイナーゼ酵素が使用され得る。

【0045】

本方法で使用することができるそのようなヒダントイナーゼ酵素としては、デフルビイモナス・アルバ（Ｄｅｆｌｕｖｉｉｍｏｎａｓａｌｂａ）、ロドコックス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ブレビバシラス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓａｇｒｉ）、パエナルスロバクター・アウレスセンス（Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＳ－２３、バシルス・フォルジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｏｒｄｉｉ）、ジャンナスチア属（Ｊａｎｎａｓｃｈｉａｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓｓｐ．）、ジクチオステリウム・ジスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）、ロビニア・シュードアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バシルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、アエデス・アエギピチ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）、アグロバクテリウム・ファブルム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆａｂｒｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）など、好ましくは、デフルビイモナス・アルバ（Ｄｅｆｌｕｖｉｉｍｏｎａｓａｌｂａ）が挙げられる。

【0046】

適切なヒダントイナーゼ酵素は、環状アミドに作用するＥＣ３．５．２ヒドロラーゼである。

【0047】

さらに、適切なヒダントイナーゼ酵素は、Ｑ８ＲＳＱ２及びその変異体、Ｏ６９８０９及びその変異体、Ｑ８４６Ｕ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｐ８１００６及びその変異体、Ｑ８４ＦＲ６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ｑ５６Ｓ４９＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ａ１Ｅ３５１＿９ＢＡＣ及びその変異体、Ｑ２８ＳＡ７及びその変異体、Ｑ５９６９９及びその変異体、Ｑ４５５１５及びその変異体、Ａ０Ａ３９９ＤＲＱ３＿９ＤＥＩＮ及びその変異体、Ｑ５５ＤＬ０及びその変異体、Ｆ７Ｘ５Ｍ８＿ＳＩＮＭＭ及びその変異体、Ｑ９Ｉ６７６及びその変異体、Ｑ４４１８４及びその変異体、Ｂ５Ｌ３６３及びその変異体、Ｉ１ＭＥＨ３及びその変異体、Ｑ６Ｓ４Ｒ９及びその変異体、Ｑ６５ＬＮ０及びその変異体、Ｑ１７１Ｆ８及びその変異体、Ｑ８Ｕ８Ｚ６及びその変異体、Ｐ４２０８４及びその変異体、Ｑ８８ＮＷ７及びその変異体、Ｐ２５９９５及びその変異体、Ｑ３Ｚ３５４及びその変異体、Ｂ１ＸＥＧ２及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６５＿ＰＡＥＡＵ及びその変異体、Ｑ０１２６２．１及びその変異体、Ａ０Ａ２５０ＤＸＧ４＿ＧＥＯＳＥ及びその変異体、Ａ１ＳＰＮ２及びその変異体、Ｑ９ＷＹＨ０及びその変異体、Ｐ５８３２９及びその変異体、Ａ１ＳＧＴ４及びその変異体、Ｅ３ＪＤ１８及びその変異体、ＨＵＴＩ＿ＢＤＥＢＡ及びその変異体、Ａ０Ａ１６１ＫＤ３７＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ｉ０ＧＬ２７＿ＣＡＬＥＡ及びその変異体、Ａ０Ａ０６８ＷＧＷ０＿ＥＣＨＧＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ４ＸＨＲ４＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｆ５Ｑ０Ａ２＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ０２４ＫＨＳ５＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ０６０ＵＭ６９＿９ＰＲＯＴ及びその変異体、Ａ３ＤＫＳ９＿ＳＴＡＭＦ及びその変異体、Ｗ２ＥＷＴ０＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ１Ｔ９Ｉ４＿ＯＥＳＤＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ａ７ＬＭ６０＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０８７Ｍ７Ｔ５＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ｃ０Ｃ１８０＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ（配列番号１も参照）及びその変異体、Ｒ５ＪＴＰ２＿９ＣＬＯＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０１０ＲＭ８５＿９ＰＥＺＩ及びその変異体、Ｅ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体、Ａ０Ａ０１０ＹＥＨ８＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０３１ＬＶ６９＿９ＣＲＥＮ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ９ＱＴ１７＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、ＡＬＬＢ＿ＢＡＣＶＺ及びその変異体、ＨＵＴＩ＿ＦＬＡＰＪ及びその変異体、Ａ０Ａ０７３Ｊ５Ｊ１＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０３４Ｗ２Ｑ８＿ＢＡＣＤＯ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ８ＩＶＶ８＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ５ＱＫＥ４＿ＣＬＯＢＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０９８Ｂ７Ｘ６＿ＤＥＳＨＡ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ５Ｈ４Ｍ８＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｃ１ＹＤＰ１＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ｑ９８１Ｈ２＿ＲＨＩＬＯ及びその変異体、Ｔ１ＥＥＨ７＿ＨＥＬＲＯ及びその変異体、Ａ０Ａ０６０ＤＴＧ８＿ＡＺＯＢＲ及びその変異体、Ａ０Ａ０１１ＭＧＺ５＿ＭＡＮＨＡ及びその変異体、Ａ０Ａ０６０ＬＹＢ６＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ｓ０Ｆ３Ｌ７＿ＣＨＯＣＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１３３ＶＮＲ０＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ａ０Ａ１３３Ｕ７Ｕ９＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｕ２ＸＤ５２＿ＥＣＯＬＸ及びその変異体、Ｍ１ＹＺＹ６＿ＮＩＴＧ３及びその変異体、Ｔ０Ｎ９Ｘ６＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ｔ０ＬＭＵ２＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｎ１ＧＢＺ８＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、ＨＵＴＩ＿ＡＮＡＳＫ及びその変異体、Ａ０Ａ０３１ＪＵＰ０＿９ＳＰＨＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０６１Ｎ９Ｌ２＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０１７Ｔ４Ｄ２＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１７４ＡＤＺ３＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０２１Ｘ７Ｄ５＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ０２１ＸＡＣ５＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｃ２ＵＩＷ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＮＧＹ１＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ｄ３Ｆ１Ｓ３＿ＣＯＮＷＩ及びその変異体、Ａ０Ａ０２１ＸＧ０６＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ｕ７Ｖ９Ｑ６＿９ＦＵＳＯ及びその変異体、Ｄ６ＸＹ３７＿ＢＡＣＩＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｊ１ＦＡＩ４＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ｂ５Ｙ９Ａ６＿ＣＯＰＰＤ及びその変異体、ＰＨＹＤＡ＿ＥＣＯＫ１及びその変異体、Ａ０Ａ０Ａ９Ｘ９Ｂ７＿ＬＹＧＨＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｓ８Ｈ５７６＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１５１ＡＢＩ４＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ａ０Ａ０６４ＡＦＤ７＿９ＦＵＳＯ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｃ２ＦＣＧ７＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｓ８ＣＩ４８＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ９ＣＺ７４＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ａ３ＹＫＤ１＿９ＥＮＴＲ及びその変異体、Ａ０Ａ０８４Ｒ４Ｔ２＿ＳＴＡＣＨ及びその変異体、Ａ０Ａ０７０Ａ１Ｚ０＿９ＰＲＯＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ４Ｊ４Ｙ８＿９ＥＵＫＡ及びその変異体、Ｒ１ＢＲ７２＿ＥＭＩＨＵ及びその変異体、Ｒ１ＤＤ７２＿ＥＭＩＨＵ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｌ０ＦＩＡ０＿９ＡＳＣＯ及びその変異体、Ｆ７ＤＲＥ９＿ＯＲＮＡＮ及びその変異体、Ａ０ＬＫ７５＿ＳＹＮＦＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ１Ａ９１８＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ｈ２ＹＺ１０＿ＣＩＯＳＡ及びその変異体、Ｉ４ＹＤ９９＿ＷＡＬＭＣ及びその変異体、Ａ０Ａ０７７ＹＹＨ５＿ＴＲＩＴＲ及びその変異体、Ａ０Ａ０７７Ｙ１８９＿９ＳＰＨＩ及びその変異体、Ａ０Ａ０８９Ｋ５Ｐ４＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ７Ｗ２Ｔ１＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ１７４ＮＩＫ６＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＦＳ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＮＪ７＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ２ＡＶ６６＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ４ＲＸＹ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ７ＳＢ７５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０１５ＮＭ９２＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１００ＶＲＮ２＿ＰＡＥＡＭ及びその変異体、Ｗ４ＢＤＪ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１４７Ｋ２Ｇ０＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｗ８ＦＶＭ４＿９ＺＺＺＺ及びその変異体、Ａ０Ａ１４７ＪＸＲ０＿９ＥＵＲＹ及びその変異体、Ｅ８Ｒ８Ｊ７＿ＤＥＳＭ０及びその変異体、Ｄ５Ｕ１１３＿ＴＨＥＡＭ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８Ｔ９Ｊ２＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ｇ３Ｃ９５２＿９ＡＲＣＨ及びその変異体、Ｑ６ＹＮＩ０＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｇ０ＹＩＱ９＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ５ＥＨＱ６＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ５Ｅ０８２＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｃ４ＰＫＤ１＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ｈ８ＧＸ２５＿ＤＥＩＧＩ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ５ＺＦＮ３＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｍ９Ｚ５Ｓ１＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｂ２ＨＮＣ５＿９ＰＳＥＵ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｂ２ＧＮＩ８＿ＳＴＲＮＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＬＢＺ３＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＮＭＭ２＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＳＤＶ１＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ１ＰＬＸ０＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ｉ０ＩＤＣ５＿ＰＨＹＭＦ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ５Ｉ８Ｘ４＿９ＤＥＩＯ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｆ４ＪＥＨ６＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、ＢＡＤ７５７０８．１、＊ＷＰ＿０１４４５３８５９．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１及びその変異体、＊ＣＤＰ５３２０１．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０３５０７８３１４．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０４２８０３７９１．１及びその変異体、＊ＥＱＢ７０５１０．１及びその変異体、＊ＥＱＢ６５９０４．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１２５１４．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１４１９５．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１６１４７．１及びその変異体、＊ＫＧＴ８７２５７．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０４５７５６０９７．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０５６２３９６９４．１及びその変異体、＊ＫＵＯ４１３９５．１及びその変異体、＊ＫＯＶ３４８１８．１及びその変異体、＊ＡＮＺ１５４８３．１及びその変異体、＊ＫＪＹ３２５９５．１及びその変異体、
並びにその混合物からなる群から選択され得、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0048】

さらに好ましくは、ヒダントイナーゼ酵素は、Ｏ６９８０９及びその変異体、Ｑ８４６Ｕ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｐ８１００６及びその変異体、Ｑ８４ＦＲ６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ｑ５６Ｓ４９＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ａ１Ｅ３５１＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ｑ２８ＳＡ７及びその変異体、Ｑ４５５１５及びその変異体、Ａ０Ａ３９９ＤＲＱ３＿９ＤＥＩＮ及びその変異体、Ｑ５５ＤＬ０及びその変異体、Ｆ７Ｘ５Ｍ８＿ＳＩＮＭＭ及びその変異体、Ｑ９Ｉ６７６及びその変異体、Ｑ４４１８４及びその変異体、Ｂ５Ｌ３６３及びその変異体、Ｐ４２０８４及びその変異体、Ｐ２５９９５及びその変異体、Ｑ３Ｚ３５４及びその変異体、Ｂ１ＸＥＧ２及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６５＿ＰＡＥＡＵ及びその変異体、Ａ０Ａ１６１ＫＤ３７＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ４ＸＨＲ４＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、Ｅ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ９ＱＴ１７＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ８ＩＶＶ８＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ５ＱＫＥ４＿ＣＬＯＢＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｎ１ＧＢＺ８＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ１７４ＡＤＺ３＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ｕ７Ｖ９Ｑ６＿９ＦＵＳＯ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｊ１ＦＡＩ４＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、ＰＨＹＤＡ＿ＥＣＯＫ１及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｓ８Ｈ５７６＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ４Ｊ４Ｙ８＿９ＥＵＫＡ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＦＳ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＮＪ７＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ２ＡＶ６６＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ４ＲＸＹ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ７ＳＢ７５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１００ＶＲＮ２＿ＰＡＥＡＭ及びその変異体、Ｗ４ＢＤＪ０＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ５Ｅ０８２＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ５ＺＦＮ３＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＮＭＭ２＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ８ＳＤＶ１＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ１ＰＬＸ０＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ５Ｉ８Ｘ４＿９ＤＥＩＯ及びその変異体、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１４１９５．１及びその変異体、＊ＷＰ＿０２３５１６１４７．１及びその変異体、及び＊ＡＮＺ１５４８３．１、並びにその混合物からなる群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0049】

さらに、適切なヒダントイナーゼ酵素は、Ｑ８４６Ｕ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｐ８１００６及びその変異体、Ｑ８４ＦＲ６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ｑ５６Ｓ４９＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ｑ４５５１５及びその変異体、Ａ０Ａ３９９ＤＲＱ３＿９ＤＥＩＮ及びその変異体、Ｑ５５ＤＬ０及びその変異体、Ｆ７Ｘ５Ｍ８＿ＳＩＮＭＭ及びその変異体、Ｑ９Ｉ６７６及びその変異体、Ｑ４４１８４及びその変異体、Ｂ１ＸＥＧ２及びその変異体、Ａ０Ａ１６１ＫＤ３７＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、Ｅ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ９ＱＴ１７＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ５ＱＫＥ４＿ＣＬＯＢＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｎ１ＧＢＺ８＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、ＢＡＤ７５７０８．１及びその変異体、Ａ０Ａ０６４ＡＦＤ７＿９ＦＵＳＯ及びその変異体、並びにその混合物からなる群から選択され得、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0050】

好ましい実施形態において、ヒダントイナーゼ酵素は、Ｑ８４６Ｕ５＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｐ８１００６及びその変異体、Ｑ８４ＦＲ６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ａ０Ａ３９９ＤＲＱ３＿９ＤＥＩＮ及びその変異体、Ｂ１ＸＥＧ２及びその変異体、Ａ０Ａ１６１ＫＤ３７＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、Ｅ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ９ＱＴ１７＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｂ５ＱＫＥ４＿ＣＬＯＢＥ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｎ１ＧＢＺ８＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、ＢＡＤ７５７０８．１及びその変異体、Ａ０Ａ０６４ＡＦＤ７＿９ＦＵＳＯ、並びにその混合物からなる群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0051】

最も好ましくは、ヒダントイナーゼは、Ｑ４５５１５、Ｑ４４１８４及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ及びその変異体、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１及びその変異体、及びＥ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ及びその変異体、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、並びにその混合物からなる群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0052】

上記ヒダントイナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ＵｎｉＰｒｏｔ．ｏｒｇ）又はＮＣＢＩタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）に従ったデータベース識別子の命名法で示されることを理解されたい。ここで、ＮＣＢＩからの配列は、それぞれのデータベース識別子の先頭に「＊」で示される。

【0053】

好ましい実施形態において、ヒダントイナーゼ酵素は、配列番号１を有する。

【0054】

本発明の好ましい実施形態において、ヒダントイナーゼ酵素は、Ｌ－ヒダントイナーゼ酵素である。

【0055】

本発明の好ましい実施形態において、ヒダントイナーゼ酵素は、Ｄ－ヒダントイナーゼ酵素である。

【0056】

本発明の好ましい実施形態において、式（１）及び（２）中のＲは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである。

【0057】

本発明の好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は、式（３）

【化15】

【0058】

本発明の好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は、式（３）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩をラセミ混合物の形態で提供する。

【0059】

本発明の別の好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は、式（３）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩を、式（３ａ）

【化16】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩のエナンチオマー過剰の形態で提供する。好ましくは、式（３ａ）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩のエナンチオマー過剰が形成され、ヒダントイナーゼ酵素はＬ－ヒダントイナーゼ酵素である。

【0060】

本発明の別の好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は、式（３）を有するグルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩を、式（３ｂ）

【化17】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するＤ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩のエナンチオマー過剰の形態で提供する。これに関連して、ヒダントイナーゼ酵素がＤ－ヒダントイナーゼ酵素であることが好ましい。

【0061】

本発明の好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は、酵素条件下で、好ましくはＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素、より好ましくはＬ－Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素を用いて行われる。適切なＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素は、直鎖アミドに作用するＥＣ３．５．１ヒドロラーゼ、ＥＣ３．５．１．８７Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アミノ酸ヒドロラーゼ、３．５．１．７７Ｎ－カルバモイル－Ｄ－アミノ酸ヒドロラーゼ、及びそれらの混合物からなる群から選択される。本方法で使用することができる適切なＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素としては、Ａ０Ａ７Ｙ０Ｔ４Ｎ７＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ｑ８８ＦＱ３＿ＰＳＥＰＫ及びその変異体、Ｑ８８Ｑ８１＿ＰＳＥＰＫ及びその変異体、Ａ０Ａ１２６Ｓ６Ｊ４＿ＰＳＥＰＵ及びその変異体、Ｑ８ＶＵＬ６＿９ＰＳＥＤ及びその変異体、Ｈ９Ｂ８Ｔ５＿９ＰＳＥＤ及びその変異体、Ｑ９ＦＢ０５＿９ＰＳＥＤ及びその変異体、Ｃ０ＺＣＭ８＿ＢＲＥＢＮ及びその変異体、Ｃ０Ｚ７Ｒ５＿ＢＲＥＢ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｋ９ＹＸ８４＿９ＢＡＣＬ及びその変異体、Ｅ３ＨＵＬ６＿ＡＣＨＸＡ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｖ９ＢＳＳ３＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｖ９ＢＳＳ３＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６４及びその変異体、Ａ０Ａ４Ｄ７Ｑ５４８＿ＧＥＯＫＵ及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６４及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｓ９Ｄ９７６＿９ＭＩＣＣ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｉ６ＶＺＺ４＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｌ６ＲＥ９１＿９ＬＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｅ０Ｃ９９６＿９ＢＵＲＫ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｍ７ＢＧＪ４＿ＨＯＲＷＥ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｄ７ＹＱＮ７＿９ＧＡＭＭ及びその変異体、Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ２２３Ｅ４Ｉ５＿９ＢＡＣＩ及びその変異体、Ｍ２ＶＳＥ９＿ＧＡＬＳＵ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｔ０Ｋ６Ｃ０＿９ＧＡＭＭ及びその変異体、Ａ０Ａ４１６ＦＧＥ１＿９ＣＬＯＴ及びその変異体、Ｄ１Ｐ１４３＿９ＧＡＭＭ及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｓ６Ｚ２Ｍ９＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｃ１ＵＳ４９＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｄ３ＶＭＮ７＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｋ８Ｌ５４９＿９ＰＲＯＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｇ０ＭＣ８９＿９ＢＡＣＴ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｍ６ＷＹＳ１＿ＳＥＬＲＵ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｋ２ＢＹＩ３＿ＰＯＰＴＲ及びその変異体、Ａ０Ａ５１０ＤＹＲ５＿９ＣＲＥＮ及びその変異体、Ａ０Ａ５Ｙ３ＸＦＮ７＿ＳＡＬＥＲ及びその変異体、Ａ０Ａ３８１ＩＢ５４＿ＣＬＯＤＩ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｖ３ＩＱＷ６＿９ＦＬＯＲ及びその変異体、並びにその混合物からなる群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。最も好ましくは、Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素は、Ａ０Ａ３Ｅ０Ｃ９９６＿９ＢＵＲＫ及びその変異体、Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ（配列番号４）及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３（配列番号３）及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴ（配列番号２）及びその変異体からなる群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。上記Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ＵｎｉＰｒｏｔ．ｏｒｇ）に従ったデータベース識別子の命名法で示されていることを理解されたい。

【0062】

これに関連して、開裂ステップｂ）は、好ましくは２０～５０℃、好ましくは２５～４５℃、より好ましくは３０～４２℃、特に３２～４０℃の温度で行われる。さらに、反応圧力は好ましくは常圧である。好ましくは、反応圧力は０．９９５～１．０３０ｍｂａｒ、より好ましくは１．００５～１．０２０ｍｂａｒ、特に約１．０１３ｍｂａｒの範囲である。本発明の好ましい実施形態において、開裂ステップｂ）は、５～１０、好ましくは６～９、特に約７のｐＨで行われる。

【0063】

本発明の好ましい実施形態において、開裂ステップｂ）は、撹拌中、好ましくは５０～１０００ｒｐｍ、より好ましくは１００～８００ｒｐｍ、さらにより好ましくは１５０～６００ｒｐｍ、なおより好ましくは１８０～４００ｒｐｍ、特に２００～３００ｒｐｍで行われる。

【0064】

本発明の別の好ましい実施形態において、開裂ステップｂ）は化学的条件下で行われる。「化学的条件」又は「化学的に開裂する」という用語は、酵素条件下で行われない開裂ステップを指すと理解されたい。任意の適切な化学的アプローチが可能である。開裂は、例示的に、亜硝酸ナトリウム及び／又は塩化水素を用いて行うことができる。式（２）

【化18】

（式中、ＲはＨ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸は、例示的に、高温で濃塩化水素によって処理され得る。或いは、上記で定義した式（２）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸は、水性条件下で亜硝酸ナトリウム及び塩化水素で処理されてもよい。これに関連して、開裂ステップｂ）は、好ましくは２５～１２０℃、より好ましくは５０～１１０℃、特に好ましくは６０～１０５℃の温度で行われる。さらに、反応圧力は好ましくは常圧である。好ましくは、反応圧力は０．９９５～１．０３０ｍｂａｒ、より好ましくは１．００５～１．０２０ｍｂａｒ、特に約１．０１３ｍｂａｒの範囲である。本発明の好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は、０～５、好ましくは０～３のｐＨで行われる。反応混合物は、標準的な手順（すなわち、洗浄及び精製）で仕上げを行うことができる。

【0065】

本発明の特に好ましい実施態様において、開裂ステップｂ）は酵素条件下で行われる。

【0066】

本発明の好ましい実施態様において、式（１）及び（２）中のＲは、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらにより好ましくはエチル又はブチル、特にエチルであり、本方法は、
ｃ）酸性条件下で脱保護するステップをさらに含む。これに関連して、任意の適切な酸が可能である。好ましくは、塩酸又は硫酸が使用される。

【0067】

本発明の好ましい実施態様において、この方法は、ヒダントインラセマーゼ酵素の添加をさらに含む。任意の適切なヒダントインラセマーゼ酵素が可能であり得る。適切なヒダントインラセマーゼ酵素は、ＥＣ５．１ラセマーゼ、アミノ酸及び誘導体に作用するＥＣ５．１．１ラセマーゼ、ＥＣ５．１．９９．５ヒダントインラセマーゼ、及びそれらの混合物からなる群から選択される。本方法で使用することができる適切なヒダントインラセマーゼ酵素としては、Ｑ９ＲＹＡ６＿ＤＥＩＲＡ及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６６及びその変異体、Ｑ９Ｆ４６６及びその変異体、Ａ０Ａ７Ｌ５ＢＱＰ９＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ｑ００９２４及びその変異体、Ｆ７Ｘ６Ｘ４＿ＳＩＮＭＭ及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｖ７ＡＣＫ５＿ＲＨＩＲＤ及びその変異体、Ａ０Ａ７Ｙ０ＸＬＨ３＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ５Ｂ８ＸＲ３０＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、Ａ０Ａ５３３ＱＨ７８＿９ＰＲＯＴ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｍ９Ｚ０Ａ０＿９ＣＹＡＮ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ａ０Ａ４Ｔ５＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｆ６Ｃ９Ｐ８＿ＨＡＮＸＲ及びその変異体、Ａ０Ａ４Ｓ０ＮＭ８５＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｖ５Ｉ０８６＿９ＳＰＩＲ及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｐ０ＮＥＹ４＿９ＣＹＡＮ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｋ０ＹＢＹ８＿９ＳＰＨＮ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｈ５ＮＨＮ７＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ３１７ＫＵＺ３＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ４３０ＶＪ３４＿ＴＨＥＳＣ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｊ５ＫＨＡ５＿９ＰＲＯＴ及びその変異体、Ａ０Ａ５３５ＬＩＪ４＿９ＣＨＬＲ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｔ６ＫＨＨ４＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｇ８ＪＳＤ５＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ａ９ＪＲＴ３＿９ＴＨＥＯ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｎ７ＷＢＰ６＿９ＢＵＲＫ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ａ２Ｎ８Ｃ４＿９ＭＹＣＯ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｒ３ＴＢ４３＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ｘ１Ｔ７３３＿９ＺＺＺＺ及びその変異体、Ａ０Ａ６Ｐ１ＳＸ７９＿９ＲＨＯＢ及びその変異体、Ａ０Ａ０Ｑ５ＶＴ２２＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｎ１ＲＫＳ５＿９ＳＰＩＲ及びその変異体、Ａ０Ａ５２９ＸＪＲ５＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ３５８ＴＸＳ４＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｑ９ＵＪＸ６＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ４３４ＷＪＹ９＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ４Ｒ７Ｃ３Ｙ１＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｔ４ＩＲＦ７＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｅ８Ｂ４２７＿９ＰＬＡＮ及びその変異体、Ａ０Ａ５３８Ｄ６７８＿９ＡＣＴＮ及びその変異体、Ａ０Ａ１Ｗ６Ｚ０Ｄ５＿９ＢＯＲＤ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｐ１ＵＫＩ１＿９ＲＨＩＺ及びその変異体、Ｕ２Ｓ１Ｑ０＿９ＦＩＲＭ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｄ５ＩＨＣ５＿ＡＧＲＳＰ及びその変異体、Ａ０Ａ３Ｄ５ＪＥＵ３＿９ＤＥＬＴ及びその変異体、からなる群から選択されるものが含まれ、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。上記ヒダントインラセマーゼ酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ＵｎｉＰｒｏｔ．ｏｒｇ）に従ったデータベース識別子の命名法で示されていることを理解されたい。最も好ましくは、ラセマーゼ酵素は、Ａ０Ａ６Ｖ７ＡＣＫ５＿ＲＨＩＲＤ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｔ６ＫＨＨ４＿９ＲＨＯＢ及びその変異体からなる群から選択され、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0068】

本発明の好ましい実施態様において、本方法は、Ｎ－カルバモイルアミノ酸ラセマーゼ酵素の添加をさらに含む。任意の適切なＮ－カルバモイルアミノ酸ラセマーゼ酵素が可能であり得る。

【0069】

本発明の好ましい実施態様において、本方法は、ヒダントインラセマーゼ酵素及びＮ－カルバモイルアミノ酸ラセマーゼ酵素の添加をさらに含む。

【0070】

本発明の好ましい実施態様において、ステップａ）及びステップｂ）は単一容器中で実施され、ここでステップｂ）は酵素条件下で実施される。これに関連して、全ての試薬は好ましくは実質的に反応の開始時に添加される。或いは、ステップａ）のための試薬とステップｂ）のための試薬は、好ましくは異なる時間に単一容器に添加される。

【0071】

本発明の好ましい実施態様において、本方法は、加水分解ステップａ）において得られる、式（１ｂ）

【化19】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントインを分離除去するステップをさらに含む。式（１ｂ）を有するヒダントインの分離は、好ましくは逆相クロマトグラフィーを用いて達成される。或いは、分離は、イオン交換、抽出、塩形成、結晶化及び濾過を用いて達成され得る。

【0072】

式（１ｂ）を有するヒダントインを化学的にラセミ化し、加水分解ステップａ）で再利用してもよい。式（１ｂ）を有するヒダントインをラセミ化するためには、適切な塩基で、好ましくはｐＨ８以上、より好ましくは８～１４、さらに好ましくは８．５～１２、特に８．５～１０で処理することができる。好ましくは、ラセミ化は水性条件下で行われる。

【0073】

或いは、式（１ｂ）を有するヒダントインは、ヒダントインラセマーゼ酵素で処理されてもよい。

【0074】

本発明の好ましい実施態様において、式（１）を有するヒダントインの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％が、式（３ａ）

【化20】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、より好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、さらに好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである）を有するＬ－グルホシネート、そのアルキルエステル又はその塩に変換される。

【0075】

本発明の好ましい実施態様において、式（１）を有するヒダントインの４０～９９％、好ましくは５０～９８％、より好ましくは６０～９７％、さらに好ましくは７０～９６％、特に８０～９５％が、式（３ａ）

【化21】

【0076】

本発明の別の好ましい実施態様では、式（１）を有するヒダントインの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、特に少なくとも８０％が、式（３ｂ）

【化22】

【0077】

本発明の別の好ましい実施態様では、式（１）を有するヒダントインの４０～９９％、好ましくは５０～９８％、より好ましくは６０～９６％、さらに好ましくは７０～９５％、特に８０～９０％が、式（３ｂ）

【化23】

【0078】

Ｌ－グルホシネートのエナンチオマー過剰が好ましい。

【0079】

本発明の好ましい実施態様において、本方法は、ヒダントイナーゼ酵素、ヒダントインラセマーゼ酵素、及びＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素の添加を含み、全ての反応ステップが単一容器中で行われ（「ワンポット」条件としても知られる）、好ましくは、全ての試薬が実質的に反応の開始時に添加されるか、又は試薬が異なる時間に単一容器に添加される。

【0080】

本発明の別の好ましい実施態様において、本方法は、ヒダントイナーゼ酵素、ヒダントインラセマーゼ酵素、及びＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素の添加を含み、全ての反応ステップが単一容器中で行われ（「ワンポット」条件としても知られる）、好ましくは、全ての試薬が実質的に反応の開始時に添加されるか、又は試薬が異なる時間に単一容器に添加される。

【0081】

本発明のさらに別の好ましい実施態様において、本方法は、ヒダントイナーゼ酵素、及びＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素の添加を含み、全ての反応ステップが単一容器中で行われ（「ワンポット」条件としても知られる）、好ましくは、全ての試薬が実質的に反応の開始時に添加されるか、又は試薬が異なる時間に単一容器に添加される。これに関連して、反応混合物のｐＨが８以上であることが好ましい。

【0082】

適用される酵素は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法で適用されてよい。

【0083】

本発明の好ましい実施態様において、適用される酵素は、清澄化細胞溶解物、全細胞、又は固定化酵素として適用される。

【0084】

或いは、Ｌ－グルホシネート以外の成分の一部又は全部をバイオトランスフォーメーション混合物から除去し、その混合物を任意選択的に濃縮し、次いでその混合物を雑草の予防又は防除のために直接（及び／又は種々のアジュバントを添加して）使用することができる。バイオトランスフォーメーション混合物は、いくつかの実施態様において、雑草の予防又は防除のために直接（及び／又は種々のアジュバントの添加して）使用することができる。

【0085】

Ｌ－グルホシネートをさらに精製するステップを追加することもできる。このようなさらなる精製及び単離方法には、イオン交換、抽出、塩形成、結晶化、及び濾過が含まれ、それぞれを複数回又は適切な組み合わせで使用することができる。酵素は、担持されている場合は単純な濾過によって、溶液中で遊離している場合は限外濾過、セライト、セルロース又は炭素のような吸収剤の使用、又は当業者に知られている様々な技術による変性によって除去することができる。

【0086】

イオン交換プロセスは、この目的のために選択された樹脂への溶質の選択的吸着によって分離をもたらす。生成物及び不純物は吸着前に単一溶液に溶解していなければならないため、単離の前に蒸発又は蒸留による精製生成物の流れの濃縮が通常必要となる。精製のためのイオン交換の使用例は、Ｓｃｈｕｌｔｚｅｔａｌ．によって、及び欧州特許第０２４９１８８（Ａ２）号明細書に記載されている。

【0087】

精製は、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸などを含む適切な酸の添加によるＬ－グルホシネートの不溶性塩の形成によって達成されてもよい。同様に、不溶性塩を形成するために適切な塩基を添加することによって精製されてもよい。有用な塩基としては、アルカリ金属の水酸化物、炭酸塩、硫酸塩及びリン酸塩、又はアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、硫酸塩及びリン酸塩が挙げられる。アンモニア、ヒドロキシルアミン、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、２－ピコリン、３－ピコリン、４－ピコリン、２，４－ルチジン、２，６－ルチジン、モルホリン、Ｎ－メチルモルホリン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク－７－エン、及びジメチルエタノールアミンを含む、窒素を含む他の塩基を使用してもよい。収率を最大化し、所望の塩の純度を最適化するために、混合物を濃縮するか、又は溶媒（又はその両方）を添加することが有利な場合がある。この目的に適した溶媒には、所望の塩の溶解度が非常に低いものが含まれる（このような溶媒はしばしば「抗溶媒」と呼ばれる）。Ｌ－グルホシネートの塩は、当業者に公知の標準的な方法により、製剤化に適した形態のグルホシネートに変換することができる。或いは、Ｌ－グルホシネートを双性イオンとして単離することもできる。

【0088】

米国特許第９，２５５，１１５Ｂ２号明細書には、Ｌ－グルホシネートの塩酸塩を、水酸化ナトリウム又はナトリウムメトキシドなどの塩基を用いて双性イオン型に変換し、次いで水性アルコール溶媒から結晶化して、比較的高純度のＬ－グルホシネートを得る方法が記載されている。この方法は、吸湿性のない結晶性Ｌ－グルホシネートを製造できるため、長期間湿気にさらされても非晶質Ｌ－グルホシネートと比較して高い純度を維持できるという利点がある。

【0089】

Ｌ－グルホシネートの他の塩は当技術分野で知られている。米国特許第５，７６７，３０９号明細書及び米国特許第５，８６９，６６８号明細書は、ラセミ体のグルホシネートとジアステレオマー塩を形成するためにキラルアルカロイド塩基を使用することを教示している。Ｌ－グルホシネートの塩はＤ－グルホシネートの対応する塩よりもはるかに多量に溶液から沈殿するので、精製が達成される。したがって、この方法は、所望により、高エナンチオマー過剰のＬ－グルホシネートを得るために本発明と共に使用され得る。

【0090】

任意選択的に、精製は、最初に１種又は複数種の不純物を結晶化させ、濾過により不純物を除去し、次に、上記されたように塩を形成することにより、得られた濾液からＬ－グルホシネートをさらに精製することにより達成され得る。これは、未反応のアミン供与体を部分的又は完全に単離し、その後の反応に使用することができる場合に有利である。同様に、部分的又は完全に単離された式（２）を有する未反応のＮ－カルバモイルアミノ酸は、その後の反応に使用するために再利用されてもよい。

【0091】

生成物を精製するために抽出を使用してもよい。独国特許第３９２０５７０Ｃ２号明細書は、硫酸によって溶液のｐＨを３．７～４．２に調整することにより、過剰のグルタミン酸（アミン供与体として使用）を沈殿させるプロセスを記載している。グルタミン酸を濾過した後、濾液のｐＨを１～２まで下げ、そこで他の不純物を溶媒に抽出する。抽出及び濃縮後、水溶液にアンモニアを添加してｐＨを５～７にし、硫酸アンモニウムを析出させる。硫酸アンモニウムを濾過により除去し、得られた濾液を濃縮してＬ－グルホシネートのアンモニウム塩を得る。

【0092】

Ｌ－グルホシネート又はその塩の単離は、例えば、製剤化又は使用の場所に固形物を出荷する目的で望ましい場合がある。単離の典型的な工業的方法、例えば、濾過、遠心分離などが使用されてよい。単離された製品は、しばしば水分、揮発性不純物及び溶媒（存在する場合）の除去を必要とし、この目的のために典型的な工業用乾燥装置を使用することができる。このような装置の例としては、オーブン、回転ドラム乾燥機、撹拌乾燥機などが挙げられる。場合によっては、スプレードライヤーを使用するのが有利な場合もある。

【0093】

精製後に固形物製品を製造する必要はない。これは、Ｌ－グルホシネートの製剤化をＬ－グルホシネートの製造に使用される場所と同一の場所で行う場合に有利となり得る。Ｌ－グルホシネート及びその塩の多くは水に溶けやすく、水は製品製剤化に便利な液体である。例えば、アミン供与体を濾過により単離し、得られた濾液を蒸留により濃縮する。濾液のｐＨを望ましい値に調整し、得られた溶液をそのまま、又は製剤成分とブレンドして使用することができる。別の例では、Ｌ－グルホシネート又はその塩の１種のスラリーを上記のように調製し、濾過により単離することができる。固形物は、水、又はＬ－グルホシネートの溶液を得るために適切な溶媒を添加することにより、フィルター上で直接溶解され得る。

【0094】

本発明のさらに好ましい実施態様において、この方法は、Ｎ－カルバモイルアミノ酸をヒダントインにリサイクルするステップをさらに含む。上記の通り、式（２）を有する未反応のＮ－カルバモイルアミノ酸は、後続の反応での使用のためにリサイクルされるために部分的又は完全に単離することができる。これらの反応の１つは、再度のグルホシネート調製ステップであり得る。したがって、好ましくは、未反応のＮ－カルバモイルアミノ酸は、再びヒダントインにリサイクルされる。Ｎ－カルバモイルアミノ酸をヒダントインにリサイクルする１つの好ましい方法ステップは、Ｎ－カルバモイルアミノ酸を水溶液中の酸で処理することである。好ましくは、この酸はＨＣｌである。さらに、Ｎ－カルバモイルアミノ酸をヒダントインに戻すリサイクルは、７未満のｐＨ値でヒダントイナーゼを使用しても可能である。

【0095】

好ましくは、リサイクルのさらなるステップは、ステップａ）にリサイクルする前にヒダントインをラセミ化するステップを含む。より好ましくは、ヒダントインをラセミ化するステップは、ラセマーゼ酵素を添加することを含む。最も好ましくは、ラセマーゼ酵素は、Ａ０Ａ６Ｖ７ＡＣＫ５＿ＲＨＩＲＤ及びその変異体、Ａ０Ａ２Ｔ６ＫＨＨ４＿９ＲＨＯＢ及びその変異体からなるそれらのＵｎｉｐｒｏｔＩＤによって同定される酵素の群から選択される。ここでは、変異体は、それぞれのポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。

【0096】

上記のように、本発明はさらに、第２の態様において、式（１ｂ）

【化24】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するヒダントイン、式（２ａ）

【化25】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩を含む組成物に関する。

【0097】

適切な塩は、塩酸塩、アンモニウム塩、及びイソプロピルアンモニウム塩である。さらに、Ｌ－グルホシネートのそれぞれの双性イオンも包含されることを理解されたい。

【0098】

本発明の好ましい実施態様において、Ｌ－グルホシネート又はその塩の量は、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、少なくとも２０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、より好ましくは少なくとも４０重量％、さらにより好ましくは少なくとも５０重量％、なおより好ましくは少なくとも６０重量％、特に少なくとも７０重量％又は少なくとも８０重量％である。

【0099】

本発明の好ましい実施態様において、Ｌ－グルホシネート又はその塩の量は、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、２０～９９重量％、好ましくは３０～９８重量％、より好ましくは４０～９６重量％、さらにより好ましくは５０～９５重量％、なおより好ましくは６０～９４重量％、特に好ましくは少なくとも７０～９０重量％又は少なくとも８０～９０重量％である。

【0100】

組成物は、式（２ａ）

【化26】

を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、最大４０重量％、好ましくは最大２０重量％、より好ましくは最大１０重量％、さらにより好ましくは最大５重量％、なおより好ましくは最大４重量％、特に最大２重量％の量で含むことができる。組成物は、式（２ａ）

【化27】

を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、０．００１～４０重量％、好ましくは０．００５～２０重量％、より好ましくは０．０１～１０重量％、さらにより好ましくは０．０５～５重量％、なおより好ましくは０．１～４重量％、特に０．５～２重量％の量で含むことができる。

【0101】

組成物は、式（２ｂ）

【化28】

を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を、好ましくは、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、式（２ｂ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、好ましくは最大４０重量％、好ましくは最大２０重量％、より好ましくは最大１０重量％、さらにより好ましくは最大５重量％、なおより好ましくは最大４重量％、特に最大２重量％の量でさらに含むことができる。組成物は、式（２ｂ）

【化29】

を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、式（２ｂ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、０．００１～４０重量％、好ましくは０．００５～２０重量％、より好ましくは０．０１～１０重量％、さらにより好ましくは０．０５～５重量％、なおより好ましくは０．１～４重量％、特に０．５～２重量％の量で含むことができる。

【0102】

組成物は、式（１ｂ）

【化30】

を有するヒダントインを、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、最大３０重量％、好ましくは最大２０重量％、より好ましくは最大１０重量％、さらにより好ましくは最大５重量％、なおより好ましくは最大２．５重量％、特に最大１重量％の量で含むことができる。組成物は、式（１ｂ）

【化31】

を有するヒダントインを、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、０．００１～３０重量％、好ましくは０．００５～２０重量％、より好ましくは０．０１～１０重量％、さらにより好ましくは０．０５～５重量％、なおより好ましくは０．１～２．５重量％、特に０．５～１重量％の量で含むことができる。

【0103】

組成物は、式（１ａ）

【化32】

を有するヒダントインを、好ましくは、式（１ａ）を有するヒダントイン、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、好ましくは最大３０重量％、好ましくは最大２０重量％、より好ましくは最大１０重量％、さらにより好ましくは最大５重量％、なおより好ましくは最大２．５重量％、特に最大１重量％の量でさらに含むことができる。組成物は、式（１ａ）

【化33】

を有するヒダントインを、式（１ａ）を有するヒダントイン、式（１ｂ）を有するヒダントイン、式（２ａ）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、及びＬ－グルホシネート又はその塩の合計量に基づき、０．００１～３０重量％、好ましくは０．００５～２０重量％、より好ましくは０．０１～１０重量％、さらに好ましくは０．０５～５重量％、なおより好ましくは０．１～２．５重量％、特に０．５～１重量％の量でさらに含むことができる。

【0104】

本発明の好ましい実施態様において、式（２ａ）及び（１ｂ）中のＲは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルである。これに関連して、式（２ｂ）及び（１ａ）中のＲもまた、好ましくはＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＨ又はＣ_２～Ｃ_４アルキル、より好ましくはエチル又はブチル、特にエチルであると理解される。

【0105】

本発明の１つの好ましい実施態様において、本明細書に記載される組成物は、除草組成物として直接使用され得るか、又は製剤化された除草製品の成分として使用され得る。

【0106】

本明細書に記載の組成物は、雑草の予防又は防除のために作物植物の圃場に適用するのに有用である。組成物は、圃場に散布するための液体として製剤化されてよい。グルホシネート、好ましくはＬ－グルホシネートは、有効量で組成物中に提供される。本明細書で使用される場合、有効量とは、１ヘクタール当たり約１０グラムの有効成分から約１，５００グラムの有効成分、例えば約５０グラム～約４００グラム又は約１００グラム～約３５０グラムを意味する。いくつかの実施形態において、有効成分はＬ－グルホシネートである。例えば、組成物中のＬ－グルホシネートの量は、１ヘクタール当たり約１０グラム、約５０グラム、約１００グラム、約１５０グラム、約２００グラム、約２５０グラム、約３００グラム、約３５０グラム、約４００グラム、約５００グラム、約５５０グラム、約６００グラム、約６５０グラム、約７００グラム、約７５０グラム、約８００グラム、約８５０グラム、約９００グラム、約９５０グラム、約１，０００グラム、約１，０５０グラム、約１，１００グラム、約１，１５０グラム、約１，２００グラム、約１，２５０グラム、約１，３００グラム、約１，３５０グラム、約１，４００グラム、約１，４５０グラム、又は約１，５００グラムのＬ－グルホシネートであることが可能である。

【0107】

本明細書に記載の除草組成物（植物に施用する前に希釈を必要とする濃縮物を含む）は、Ｌ－グルホシネート（すなわち、有効成分）、任意選択的に式（１ｂ）

【化34】

を有するいくらかの残留ヒダントイン、及び／又は式（２ａ）

【化35】

を有するＮ－カルバモイルアミノ酸、並びに液体又は固体の形態の１種若しくは複数種のアジュバント成分を含有する。

【0108】

組成物は、有効成分を１種若しくは複数種のアジュバント、例えば希釈剤、伸長剤、担体、界面活性剤、有機溶媒、保湿剤、又はコンディショニング剤と混合することにより調製され、微細粒子状固体、ペレット、溶液、分散液、又は乳濁液の形態の組成物が提供される。このように、有効成分は、アジュバント、例えば、微細固体、有機由来の液体、水、湿潤剤、分散剤、乳化剤、又はこれらの任意の適切な組み合わせと共に使用することができる。経済性及び利便性の観点から、水が好ましい希釈剤である。しかしながら、全ての化合物が加水分解に耐性を有するわけではなく、場合によっては、当業者には理解されるように、非水性溶媒媒体の使用が指示されることもある。

【0109】

任意選択的に、１種又は複数種の追加成分を組成物に添加して、製剤化された除草組成物を製造することができる。このような製剤化組成物は、Ｌ－グルホシネート、担体（例えば、希釈剤及び／又は溶媒）、及び他の成分を含むことができる。製剤化された組成物は、有効量のＬ－グルホシネートを含む。

【0110】

希釈剤もまた、製剤化された組成物に含まれることが可能である。適切な希釈剤としては、水及び他の水性成分が挙げられる。任意選択的に、希釈剤は、包装又は使用の準備が整った組成物を製造するのに必要な量で存在する。

【0111】

本明細書に記載の除草組成物、特に液体及び可溶性粉末は、さらなるアジュバント成分として、所与の組成物を水中又は油中に容易に分散可能にするのに十分な量の１種若しくは複数種の表面活性剤を含有することができる。表面活性剤の組成物への組込みは、その効力を大いに高める。本明細書で使用される表面活性剤には、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、及び乳化剤が含まれる。アニオン性剤、カチオン性剤及び非イオン性剤も等しく使用できる。

【0112】

適切な湿潤剤としては、アルキルベンゼン及びアルキルナフタレンスルホネート、硫酸化脂肪アルコール、アミン又は酸アミド、イソチオネートナトリウムの長鎖酸エステル、スルホコハク酸ナトリウムのエステル、硫酸化又はスルホン化脂肪酸エステル石油ソルホネート、スルホン化植物油、第二級アセチレングリコール、アルキルフェノール（特にイソオクチルフェノール及びノニルフェノール）のポリオキシエチレン誘導体、及びヘキシトール無水物のモノ高級脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ソルビタンなど）が挙げられる。例示的な分散剤としては、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、リグニンスルホン酸ナトリウム、高分子アルキルナフタレンスルホネート、ナフタレンスルホン酸ナトリウム、ポリメチレンビスナフタレンスルホネート、及びＮ－メチル－Ｎ－（長鎖酸）ラウリン酸ナトリウムが挙げられる。

【0113】

水分散性粉末組成物は、１種若しくは複数種の有効成分、不活性固体エクステンダー、及び１種若しくは複数種の湿潤剤及び分散剤を含有して製造することができる。不活性固体エクステンダーは、通常、鉱物由来、例えば、天然クレイ、珪藻土、及びシリカなどに由来する合成鉱物である。このようなエクステンダーの例としては、カオリナイト、アタパルジャイトクレイ、及び合成ケイ酸マグネシウムが挙げられる。本明細書に記載の水分散性粉末は、任意選択的に、約５～約９５重量部の有効成分（例えば、約１５～約３０重量部の有効成分）、約０．２５～約２５重量部の湿潤剤、約０．２５～約２５重量部の分散剤、及び約４．５～約９４．５重量部の不活性固体エクステンダーを含有することができる。全ての部は組成物全体の重量による。必要に応じて、約０．１～約２．０重量部の固体不活性エクステンダーを、腐食防止剤又は消泡剤又はその両方で置き換えることができる。

【0114】

水性懸濁液は、溶解によって、又は分散剤の存在下で水不溶性有効成分の水性スラリーを混合し粉砕して、非常に微細な粒子の濃縮スラリーを得ることによって調製することができる。得られた濃縮水性懸濁液は、その極めて小さい粒径が非常によって特徴づけられ、したがって、希釈して噴霧すると、非常に均一な被覆が得られる。

【0115】

乳化性油は通常、水不混和性又は部分的に水不混和性の溶媒に、表面活性剤とともに有効成分を溶解したものである。本明細書に記載される有効成分に適した溶媒には、炭化水素及び水非混和性のエーテル、エステル、又はケトンが含まれる。乳化性油組成物は、一般に、約５～９５部の有効成分、約１～５０部の表面活性剤、及び約４～９４部の溶媒を含有し、全ての部は乳化性油の全重量に基づく重量部である。

【0116】

本明細書に記載の組成物は、他の添加剤、例えば、アジュバントとして、又は上記のアジュバントのいずれかと組み合わせて使用される肥料、植物毒性剤及び植物成長調節剤、殺虫剤などを含有することもできる。また、本明細書に記載の組成物は、他の材料、例えば肥料、他の植物毒性剤などと混合し、一度に施用することもできる。

【0117】

本明細書に記載の製剤タイプの各々、例えば液体製剤及び固体製剤において、有効成分の濃度は同一である。

【0118】

本除草組成物を他の除草剤と組み合わせて使用できることが認識される。本発明の除草性組成物は、より多種多様な望ましくない植生を防除するために、１種又は複数種の他の除草剤と併用して適用されることが多い。他の除草剤と併用する場合、本発明の化合物を他の除草剤と製剤化し、他の除草剤とタンク混合し、又は他の除草剤と順次適用することができる。本発明の化合物と併用できる除草剤としては、以下のものが挙げられる：アミド系除草剤、例えばアリドクロル、ベフルブタミド、ベンザドックス、ベンジプラム、ブロモブチド、カフェンストロール、ＣＤＥＡ、クロルチアミド、シプラゾール、ジメテナミド、ジメテナミド－Ｐ、ジフェナミド、エプロナズ、エトニプロミド、フェントラザミド、フルポキサム、ホメサフェン、ハロサフェン、イソカルバミド、イソキサベン、ナプロパミド、ナプタラム、ペトキサミド、プロピザミド、キノナミド及びテブタム；アニリド系除草剤、例えばクロラノクリル、シサニリド、クロメプロップ、シプロミド、ジフルフェニカン、エトベンザニド、フェナスラム、フルフェナセット、フルフェニカン、メフェナセット、メフルイジド、メタミホップ、モナリド、ナプロアニリド、ペンタノクロル、ピコリナフェン及びプロパニル；アリールアラニン系除草剤、例えばベンゾイルプロップ、フランプロップ及びフランプロップ－Ｍ；クロロアセトアニリド系除草剤、例えばアセトクロル、アラクロル、ブタクロル、ブテナクロル、デラクロル、ジエタチル、ジメタクロル、メタザクロル、メトラクロル、Ｓ－メトラクロル、プレチラクロル、プロパクロル、プロピソクロル、プリナクロル、ターブクロル、テニルクロル及びキシラクロル；スルホンアニリド系除草剤、例えばベンゾフルオル、パーフルイドン、ピリミスルファン及びプロフルアゾール；スルホンアミド系除草剤、例えばアスラム、カルバスラム、フェナスラム及びオリザリン；抗生物質系除草剤、例えばビラナホス；安息香酸系除草剤、例えばクロランベン、ジカンバ、２，３，６－ＴＢＡ及びトリカンバ；ピリミジニルオキシ安息香酸系除草剤、例えばビスピリバック及びピリミノバック；ピリミジニルチオ安息香酸系除草剤、例えばピリチオバック；フタル酸系除草剤、例えばクロルタール；ピコリン酸系除草剤、例えばアミノピラリド、クロピラリド及びピクロラム；キノリンカルボン酸系除草剤、例えばキンクロラック及びキンメラック；ヒ素系除草剤、例えばカコジル酸、ＣＭＡ、ＤＳＭＡ、ヘキサフルレート、ＭＡＡ、ＭＡＭＡ、ＭＳＭＡ、亜ヒ酸カリウム及び亜ヒ酸ナトリウム；ベンゾイルシクロヘキサンジオン系除草剤、例えばメソトリオン、スルコトリオン、テフリルトリオン及びテンボトリオン；ベンゾフラニルアルキルスルホネート系除草剤、例えばベンフレセート及びエトフメセート；カルバメート系除草剤、例えばアスラム、カルボキサゾールクロルプロカルブ、ジクロルメート、フェナスラム、カルブチレート及びテルブカルブ；カルバニレート系除草剤、例えばバルバン、ＢＣＰＣ、カルバスラム、カルベタミド、ＣＥＰＣ、クロルブファム、クロルプロファム、ＣＰＰＣ、デスメジファム、フェニソファム、フェンメジファム、フェンメジファム－エチル、プロファム及びスウェップ；シクロヘキセンオキシム系除草剤、例えばアロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、プロホキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム及びトラルコキシジム；シクロプロピルイソキサゾール系除草剤、例えばイソキサクロルトール及びイソキサフルトール；ジカルボキシイミド系除草剤、例えばベンツフェンジゾン、シニドン－エチル、フルメジン、フルミクロラック、フルミオキサジン及びフルミプロピン；ジニトロアニリン系除草剤、例えばベンフルラリン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、フルクロラリン、イソプロパリン、メタルプロパリン、ニトラリン、オリザリン、ペンジメタリン、プロジアミン、プロフルラリン及びトリフルラリン；ジニトロフェノール系除草剤、例えばジノフェネート、ジノプロップ、ジノサム、ジノセブ、ジノテルブ、ＤＮＯＣ、エチノフェン及びメジノテルブ；ジフェニルエーテル系除草剤、例えばエトキシフェン；ニトロフェニルエーテル系除草剤、例えばアシフルオルフェン、アクロニフェン、ビフェノックス、クロメトキシフェン、クロミトロフェン、エトニプロミド、フルオロジフェン、フルオログリコフェン、フルオロニトロフェン、ホメサフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、ラクトフェン、ニトロフェン、ニトロフルオルフェン及びオキシフルオルフェン；ジチオカルバメート系除草剤、例えばダゾメット及びメタム；ハロゲン化脂肪族除草剤、例えばアロラック、クロロポン、ダラポン、フルプロパネート、ヘキサクロロアセトン、ヨードメタン、臭化メチル、モノクロロ酢酸、ＳＭＡ及びＴＣＡ；イミダゾリノン系除草剤、例えばイマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン及びイマゼタピル；無機除草剤、例えばスルファミン酸アンモニウム、ホウ砂、塩素酸カルシウム、硫酸銅、硫酸第一鉄、アジ化カリウム、シアン酸カリウム、アジ化ナトリウム、塩素酸ナトリウム及び硫酸；ニトリル系除草剤、例えばブロモボニル、ブロモキシニル、クロロキシニル、ジクロロベニル、ヨードボニル、イオキシニル及びピラクロニル；有機リン系除草剤、例えばアミプロホス－メチル、アニロホス、ベンスリド、ビラナホス、ブタミホス、２，４－ＤＥＰ、ＤＭＰＡ、ＥＢＥＰ、ホサミン、グリホサート及びピペロホス；フェノキシ系除草剤、例えばブロモフェノキシム、クロメプロップ、２，４－ＤＥＢ、２，４－ＤＥＰ、ジフェノペンテン、ジスル、エルボン、エトニプロミド、フェンテラコール及びトリホプシム；フェノキシ酢酸系除草剤、例えば４－ＣＰＡ、２，４－Ｄ、３，４－ＤＡ、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＡ－チオエチル及び２，４，５－Ｔ；フェノキシ酪酸系除草剤、例えば４－ＣＰＢ、２，４－ＤＢ、３，４－ＤＢ、ＭＣＰＢ及び２，４，５－ＴＢ；フェノキシプロピオン酸系除草剤、例えばクロプロップ、４－ＣＰＰ、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ－Ｐ、３，４－ＤＰ、フェノプロップ、メコプロップ及びメコプロップ－Ｐ；アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤、例えばクロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、シハロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ－Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ－Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ－Ｐ、イソキサピリホップ、メタミホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ－Ｐ及びトリホップ；フェニレンジアミン系除草剤、例えばジニトラミン及びプロジアミン；ピラゾリル系除草剤、例えばベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトル、ピラゾキシフェン、ピロキサスルホン及びトプラメゾン；ピラゾリルフェニル系除草剤、例えばフルアゾレート及びピラフルフェン；ピリダジン系除草剤、例えばクレダジン、ピリダホル及びピリデート；ピリダジノン系除草剤、例えばブロムピラゾン、クロリダゾン、ジミダゾン、フルフェンピル、メトフルラゾン、ノルフルラゾン、オキサピラゾン及びパイダノン；ピリジン系除草剤、例えばアミノピラリド、クリオジネート、クロピラリド、ジチオピル、フルロキシピル、ハロキシジン、ピクロラム、ピコリナフェン、ピリクロル、チアゾピル及びトリクロピル；ピリミジンジアミン系除草剤、例えばイプリミダム及びチオクロリム；第四級アンモニウム系除草剤、例えばシペルコート、ジエタムコート、ジフェンゾコート、ジクワット、モルファムコート及びパラコート；チオカルバメート系除草剤、例えばブチレート、シクロエート、ジアレート、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、エチオレート、イソポリネート、メチオベンカルブ、モリネート、オルベンカルブ、ペブレート、プロスルホカルブ、ピリブチカルブ、スルファレート、チオベンカルブ、チオカルバジル、トリアレート及びベモレート；チオカルボネート系除草剤、例えばジメキサノ、ＥＸＤ及びプロキサン；チオウレア系除草剤、例えばメチウロン；トリアジン系除草剤、例えばジプロペトリン、トリアジフラム及びトリヒドロキシトリアジン；クロロトリアジン系除草剤、例えばアトラジン、クロラジン、シアナジン、シプラジン、エグリナジン、イパジン、メソプラジン、プロシアジン、プログリナジン、プロパジン、セブチルアジン、シマジン、ターブチラジン及びトリエタジン；メトキシトリアジン系除草剤、例えばアトラトン、メトメトン、プロメトン、セクブメトン、シメトン及びテルブメトン；メチルチオトリアジン系除草剤、例えばアメトリン、アジプロトリン、シアナトリン、デスメトリン、ジメタメトリン、メトプロトリン、プロメトリン、シメトリン及びテルブトリン；トリアジノン系除草剤、例えばアメトリジオン、アミブジン、ヘキサジノン、イソメチオジン、メタミトロン及びメトリブジン；トリアゾール系除草剤、例えばアミトロール、カフェンストロール、エプロナズ及びフルポキサム；トリアゾロン系除草剤、例えばアミカルバゾン、ベンカルバゾン、カルフェントラゾン、フルカルバゾン、プロポキシカルバゾン、スルフェントラゾン及びチエンカルバゾン－メチル；トリアゾロピリミジン系除草剤、例えばクロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノクススラム及びピロクススラム；ウラシル系除草剤、例えばブタフェナシル、ブロマシル、フルプロパシル、イソシル、レナシル及びターバシル；３－フェニルウラシル；ウレア系除草剤、例えばベンズチアズロン、クミルロン、シクロン、ジクロラルウレア、ジフルフェンゾピル、イソノルロン、イソウロン、メタベンズチアズロン、モニソウロン及びノルロン；フェニルウレア系除草剤、例えばアニスロン、ブツロン、クロルブロムロン、クロレツロン、クロロトルロン、クロロクスロン、ダイムロン、ジフェノクスロン、ジメフロン、ジウロン、フェヌロン、フルオメツロン、フルオチウロン、イソプロツロン、リヌロン、メチウロン、メチルジムロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトクスロン、モノリヌロン、モヌロン、ネブロン、パラフルロン、フェノベンズロン、シデュロン、テトラフルロン及びチジアズロン；ピリミジニルスルホニルウレア系除草剤、例えばアミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、シクロスルファムロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルセトスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、メソスルフロン、ニコスルフロン、オルトスルファムロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン及びトリフロキシスルフロン；トリアジニルスルホニルウレア系除草剤、例えばクロルスルフロン、シノスルフロン、エタメツスルフロン、ヨードスルフロン、メツスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルスルフロン及びトリトスルフロン；チアジアゾリルウレア系除草剤、例えばブチウロン、エチジムロン、テブチウロン、チアザフルロン及びチジアズロン；並びに
未分類除草剤、例えばアクロレイン、アリルアルコール、アミノシクロピラクロル、アザフェニジン、ベナゾリン、ベンタゾン、ベンゾビシクロン、ブチダゾール、カルシウムシアナミド、カンベンジクロル、クロルフェナク、クロルフェンプロップ、クロルフルラゾール、クロルフレノール、シンメチリン、クロマゾン、ＣＰＭＦ、クレゾール、オルトジクロロベンゼン、ジメピペレート、エンドタール、フルオロミジン、フルリドン、フルロクロリドン、フルルタモン、フルチアセット、インダノファン、メタゾール、メチルイソチオシアネート、ニピラクロフェン、ＯＣＨ、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサジクロメホン、ペンタクロロフェノール、ペントキサゾン、酢酸フェニル水銀、ピノキサデン、プロスルファリン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、キノクラミン、ロデタニル、スルグリカピン、チジアジミン、トリジフェン、トリメツロン、トリプロピンダン及びトリタック。本発明の除草組成物は、さらに、グリホサート又は２，４－Ｄと併用して、グリホサート耐性又は２，４－Ｄ耐性の作物に使用することができる。一般に、本発明の組成物を、処理される作物に対して選択的であり、採用される適用速度でこれらの組成物によって防除される雑草のスペクトルを補完する除草剤と組み合わせて使用することが好ましい。本発明の組成物及び他の補完的除草剤を、組み合わせ製剤として、又はタンクミックスとして、同時に適用することがさらに一般に好ましい。

【0119】

上記の通り、本発明はさらに第３の態様において、好ましくは植栽された種子の作物又はグルホシネートに耐性を有する作物を含む領域において雑草を選択的に防除するための方法であって：
Ｌ－グルホシネート又はその塩を、Ｄ－グルホシネート又はその塩に対して少なくとも５０％、好ましくは７０％を超えるエナンチオマー過剰のエナンチオマー割合で含む組成物の有効量と、組成物の合計量に基づいて０．０１重量％より多く１０重量％未満の式（２）

【化36】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキルである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸とを含む組成物の有効量を領域に適用することを含む方法に関する。

【0120】

本発明の好ましい実施態様において、組成物は、Ｄ－グルホシネート又はその塩に対して５０～９９％のエナンチオマー割合、好ましくは６０～９８％のエナンチオマー割合、より好ましくは７０～９５％のエナンチオマー割合、特に８０～９０％のエナンチオマー割合でＬ－グルホシネート又はその塩を含む。

【0121】

本発明の好ましい実施態様において、組成物は、組成物の全量に基づき、０．０２～８重量％、好ましくは０．０３～５重量％、より好ましくは０．０５～３重量％、特に０．１～２重量％の式（２）

【化37】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_８アルキル、好ましくはＨである）を有するＮ－カルバモイルアミノ酸を含む。

【0122】

組成物は、上記でより詳細に記載したものと同一アジュバント及び／又は他の除草剤を含んでもよいことを理解されたい。

【0123】

本明細書に記載の組成物は、雑草の予防又は防除のために作物植物の圃場に適用するのに有用である。組成物は、圃場に散布するための液体として製剤化されてよい。Ｌ－グルホシネートは、有効量で組成物中に提供される。本明細書で使用される場合、有効量とは、１ヘクタール当たり約１０グラムの有効成分から約１，５００グラムの有効成分、例えば約５０グラム～約４００グラム又は約１００グラム～約３５０グラムを意味する。いくつかの実施形態において、有効成分はＬ－グルホシネートである。例えば、組成物中のＬ－グルホシネートの量は、１ヘクタール当たり約１０グラム、約５０グラム、約１００グラム、約１５０グラム、約２００グラム、約２５０グラム、約３００グラム、約３５０グラム、約４００グラム、約５００グラム、約５５０グラム、約６００グラム、約６５０グラム、約７００グラム、約７５０グラム、約８００グラム、約８５０グラム、約９００グラム、約９５０グラム、約１，０００グラム、約１，０５０グラム、約１，１００グラム、約１，１５０グラム、約１，２００グラム、約１，２５０グラム、約１，３００グラム、約１，３５０グラム、約１，４００グラム、約１，４５０グラム、又は約１，５００グラムのＬ－グルホシネートであることが可能である。

【0124】

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。

【実施例】

【0125】

材料及び方法
酵素の調製
ａ）酵素遺伝子のクローニング（ＥＸ１）
それぞれの酵素のアミノ酸配列を公開データベースから同定した（ＵｎｉＰｒｏｔ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ；ＮＣＢＩタンパク質データベース，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ＮＣＢＩからの配列は、それぞれのデータベース識別子の先頭に「＊」で示す）。それぞれのＤＮＡ配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．）の標準的なコドン使用法を用いて導き出した。このＤＮＡ配列を合成し（ＢｉｏＣａｔＧｍｂＨ）、プラスミドｐＤＨＥ１９．２中にクローニングした（Ｒｅｓｓ－Ｌｏｅｓｃｈｋｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．，独国特許第１９８４８１２９号明細書，１９９８，（ＢＡＳＦＡＧ））。得られたプラスミドを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１０株、ｐＡｇｒｏ、ｐＨＳＧ５７５（Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１０（Ｋｅｓｓｅｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ、国際公開第２００４０５０８７７Ａ１号パンフレット，２００４，（ＢＡＳＦＡＧ））：ｐＨＳＧ５７５（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８７，６１，６３）及びｐＡｇｒｏ４（ｐＢＢ５４１ｉｎＴｏｍｏｙａｓｕ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１，４０，３９７）によって形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１のｒｈａＡ－誘導体のコンピテントセルを形質転換した（Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｔ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９８９，８６，２１７２）。

【0126】

ｂ）酵素の組換え生産（ＥＸ２）
シェイクフラスコ中での生体触媒の調製
酵素の組換えプラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１０を用い、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した２ｍｌのＬＢ培地（Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｇ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９５１，６２，２９３）に接種し、得られた予備培養液を３７℃、２５０ｒｐｍの撹拌下で５時間培養した。この予備培養液１ｍｌを使用し、５００ｍｌバッフル付きエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ中で１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１ｍＭＭｎＣｌ２、０．１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド及び０．５ｇ／ｌラムノースを添加した１００ｍｌのＬＢ培地に接種した。培養は３７℃で１８時間、振とう培養した。その後、８℃で１０分間、３２２０ｘｇで遠心分離し、バイオマスを回収した。上清を捨て、細胞ペレットを８ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（濃度１００ｍＭ及びｐＨ８．２、１ｍＭＭｎＣｌ２添加）に懸濁した。この細胞懸濁液は、全細胞バイオトランスフォーメーションが行われた場合には、合成のためにそれ以上調製することなく使用された。清澄化細胞溶解物を代わりに使用する場合、５ｍｌの細胞懸濁液を、溶解マトリックスＢ（φ０．１ｍｍの石英ビーズ０．７ｍｌ、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含む５本の反応チューブに分配し、チューブを氷上で冷やし、その後ホモジナイザー（ＰｅｑｌａｂＰｒｅｃｅｌｌｙｓ２４、ＶＷＲ）において３０秒サイクルで２回、細胞を破砕した。サイクルの間にサンプルは氷上で冷却した。得られた無細胞溶解物は、２０８１７ｘｇ、１０分間、８℃で遠心分離することにより清澄化した。上清を単離し、同一バッチからのフラクションを組み合わせた（＝清澄化細胞溶解物）。

【0127】

発酵全細胞生体触媒生産
プラスミドｐＡｇｒｏ４及びｐＨＳＧ５７５を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１０を、目的のタンパク質をコードするｐＤＨＥプラスミドで形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天培地で培養した。

【0128】

予備培養培地：
ＥｃｏＫ１２溶液
超純水１．０ｋｇ
クエン酸一水和物４０．０ｇ
硫酸亜鉛七水和物１１．０ｇ
硫酸二アンモニウム鉄六水和物８．６ｇ
硫酸マンガン一水和物３．０ｇ
硫酸銅五水和物０．８ｇ
硫酸コバルト七水和物０．０９ｇ

【0129】

ポアサイズ０．２μｍのフィルターを用いた濾過により滅菌した。

【0130】

パート１
超純水１．０ｋｇ
クエン酸一水和物３．４ｇ
硫酸マグネシウム七水和物２．４ｇ
塩化カルシウム二水和物０．１ｇ
ＥｃｏＫ１２溶液２０ｇ
水酸化ナトリウム水溶液２５％ｐＨを６．６に調整するために使用。

【0131】

パート２
超純水５００ｇ
リン酸二水素カリウム２６．６ｇ
リン酸水素二アンモニウム８．０ｇ
水酸化ナトリウム水溶液２５％ｐＨを６．４に調整するために使用。

【0132】

パート３
超純水５００ｇ
グリセロール９９％３６．０ｇ
グルコン酸ナトリウム２４．０ｇ
リン酸２０％ｐＨを６．６に調整するために使用。

【0133】

全３パートを１２１℃で３０分間滅菌した。

【0134】

ビタミン溶液
超純水１００ｇ
塩酸チアミン１．０ｇ
ビタミンＢ_１２０．５ｇ

【0135】

ポアサイズ０．２μｍのフィルターを用いた濾過により滅菌した。
最終的な予備培養培地を作製するために、パート１、２及び３を組み合わせ、２．０ｍｌのビタミン溶液を添加する。さらに、培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した。数個の形質転換体をＬＢ寒天培地プレートから掻き出し、これを使用して１ｌのバッフル付きエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに１００ｇの予備培養培地を２回接種した。これらの予備培養液を３７℃及び１５０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００が１２に達した時点で、予備培養液をそのまま使用し、本培養に接種した。

【0136】

本培養培地：
パート４
超純水９．６ｋｇ
クエン酸一水和物２１．１ｇ
リン酸二水素カリウム１７３．６ｇ
リン酸水素二アンモニウム５２．８ｇ
硫酸マンニウム七水和物１５．１ｇ
塩化カルシウム二水和物０．７ｇ
ＥｃｏＫ１２溶液１２３ｇ
水酸化ナトリウム溶液２５％ｐＨを６．４に調整するために使用
プルリオールＰ２０００１ｍｌ

【0137】

パート４を１２５℃で４５分間滅菌した。

【0138】

パート５
超純水３００ｇ
塩酸チアミン１５１ｍｇ
ビタミンＢ１２３０．２ｍｇ
アンピシリンナトリウム塩１０００ｍｇ
塩酸スペクチノマイシン５００ｍｇ
クロラムフェニコール２００ｍｇ

【0139】

パート５は、ポアサイズ０．１μｍのフィルターユニットを用いた滅菌ろ過により滅菌した。

【0140】

グリセロール溶液
超純水８０４ｇ
クエン酸一水和物２９．１ｇ
硫酸ナトリウム５８．１ｇ
硫酸二アンモニウム鉄六水和物４．５ｇ
グリセリン９９％３３７０ｇ

【0141】

チアミン溶液
超純水４０ｇ
チアミン塩酸塩５５ｍｇ

【0142】

消泡溶液
プルリオールＰ２０００３５０ｇ

【0143】

塩基溶液
アンモニア水２５％１５００ｍｌ

【0144】

誘導質溶液
超純水１５０ｇ
ラムノース一水和物１００ｇ
ＩＰＴＧ２３８ｍｇ

【0145】

グリセロール及び消泡溶液は１２１℃で３０分間滅菌した。チアミン及び誘導質溶液は、ポアサイズ０．２μｍのフィルターを用いた濾過により滅菌した。

【0146】

パート４及び５を滅菌した発酵容器（Ｔｅｃｈｆｏｒｓ，ＩｎｆｏｒｓＨＴ）中で組み合わせ、予備培養液を接種した。発酵容器を温度３７℃、圧力０．２ｂａｒ、ｐＨ６．６に保持した。撹拌機の速度（通常５００ｒｐｍ）及び通気速度（通常６ｌ／分）を調整することで、ｐＯ２レベルを２０～４０％に保持した。消泡溶液を必要に応じて添加した。グリセロール溶液及びチアミン溶液を組み合わせて、供給溶液を得た。接種後、供給溶液を１０ｇ／時間の速度で投与した。７時間後、飼料溶液の投与を「ストップ・アンド・シー」モードに切り替えた。ここでは、ｐＯ２レベルが上昇すると１０ｇ／時間の速度で供給が活性化された。１４時間後又は３３０ｇの供給溶液消費後、供給速度を８０～１００ｇ／時間まで上昇した。遺伝子発現は、８０ｍｍｏｌ／ｌ／時間の酸素移動速度で、又は誘導質溶液の添加によりＯＤ６００が１２になった時点で誘導された。誘導から３６時間後、温度を１５℃まで低下させることにより発酵を停止した。冷却した発酵ブロスを発酵槽から排出し、４７００ｒｐｍ及び１０℃で遠心分離して細胞をペレット化した。得られた上清を捨て、細胞を３８５０ｇの５０ｍＭリン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞懸濁液を凍結乾燥する前に－８０℃で凍結した。その際、凍結乾燥機を－５０℃及び０．２５ｍｂａｒの圧力に保持した。凍結乾燥無細胞抽出物は４℃で保存した。

【0147】

凍結乾燥無細胞抽出物の製造
超純水中に凍結乾燥細胞を１００ｇ／ｌで懸濁した。細胞懸濁液を氷上で冷却した後、８００ｂａｒに設定した圧力ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰｌｕｓ２０００、ＧＥＡ）に３回通過させて細胞を破砕した。３回通過の圧力は、通常１０００～１４００ｂａｒであった。得られた混合物から、１０℃で１００００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって残骸を取り除いた。得られたペレットを廃棄し、上清中のタンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイで分析した。上清は－８０℃で凍結し、その後－５０℃及び０．２５ｍｂａｒの圧力で凍結乾燥した。

【0148】

出発物質及び中間生成物の調製
ｃ）５－（［２－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］エチル）イミダゾリジン－２，４－ジオンの化学合成（Ｅｘ３）

【化38】

メタノール（４００ｍＬ）中の［２－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］－１－シアノ－エチル］アセテート（１００ｇ、純度９０％、Ｃａｓ１６７００４－７８－６）の撹拌溶液に濃硫酸（１ｇ）を添加し、反応混合物を４０℃まで加熱し、この温度で１５時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却した後、メタノール中のナトリウムメトキシド（３０％、３．５２ｇ）を添加し、続いて硫酸ナトリウム（２ｇ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下濃縮した（８４．５ｇ）。

【0149】

粗製の３－シアノ－３－ヒドロキシプロピル（メチル）ホスフィン酸ブチル（８４．５ｇ、３６６ｍｍｏｌ）に、水（２９０ｍＬ）中の炭酸二アンモニウム（７０．４ｇ、７３２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を７０℃まで４時間加熱し、次いで減圧下で蒸発乾固した。残渣を温イソプロパノール（７０℃）中に懸濁し、得られた懸濁液を濾過し、濾過ケーキをイソプロパノール（２×１０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、シリカを通して濾過した（１．５Ｌジクロロメタン／メタノール９：１で溶出）。濾液を減圧下で濃縮して生成物５５．５ｇを得、得られた固体をイソプロパノール／ジイソプロピルエーテルから再結晶した（収率３４％）。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，酸化重水素）δ ４．４２－４．３７（ｍ，１Ｈ），４．０８－４．００（ｍ，２Ｈ），２．１９－１．７７（ｍ，４Ｈ），１．７０－１．６４（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，３Ｈ），１．４６－１．３４（ｍ，２Ｈ），０．９２（ｔｄ，Ｊ＝７．４，０．８Ｈｚ，３Ｈ）。

【0150】

ｄ）ラセミ体グルホシネートから５－（［２－［エトキシ（メチル）ホスホリル］エチル）イミダゾリジン－２，４－ジオンの化学合成（Ｅｘ４）

【化39】

グルホシネートアンモニウム（水中５０％、５０ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の真空（２００ｍバール）下での撹拌溶液に、水（５０ｍｌ）中のシアン酸カリウム（１７ｇ、２０２ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で４０分間かけて添加した。反応混合物を真空（２００ｍｂａｒ）下、５０℃でさらに１．５時間撹拌し、その後室温まで冷却した。室温及び周囲圧力でさらに１４時間撹拌した後、濃ＨＣＬ（１２５ｍＬ、３６％）を添加し、反応混合物を３０分間還流まで加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を５０℃の水（５０ｍＬ）に溶解し、濾過した。濾液をイオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ－５０ＷＸ８２００－４００（Ｈ）、５００ｍＬ）に供し、水（１Ｌ）で溶出し、生成物を実質的に定量的収率で得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，酸化重水素）δ ４．４１－４．３６（ｍ，１Ｈ），２．１５－１．７０（ｍ，４Ｈ），１．５２（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，３Ｈ）。

【0151】

【化40】

酢酸（５０ｍＬ）及びオルト酢酸トリエチル（７５ｍＬ、４０９ｍｍｏｌ）の混合物に、室温で２－（２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イル）エチル－メチル－ホスフィン酸（１０ｇ、４８．５ｍｍｏｌ、上記のように合成）を添加した。反応混合物を還流（１１０℃、加熱浴温度）まで１５分間加熱した。次いで、反応物を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール９：１）で精製し、２－（２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イル）エチル（メチル）ホスフィン酸エチル（４．８ｇ、４２％）を得た。
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，酸化重水素）δ ４．４１－４．３６（ｍ，１Ｈ），４．１３－４．０３（ｍ，２Ｈ），２．１９－１．７４（ｍ，４Ｈ），１．６０（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，３Ｈ），１．３５－１．２８（ｍ，３Ｈ）。

【0152】

ｅ）グルホシネートからＮ－カルバモイルアミノ酸の化学合成（Ｅｘ５）

【化41】

真空下（２００ｍｂａｒ）ラセミ体グルホシネートアンモニウムの撹拌溶液（水中５０％、３９．６ｇ、９９．９ｍｍｏｌ）に、水（３０ｍｌ）中シアン酸カリウム（１１．８ｇ、１４５ｍｍｏｌ）溶液を５０℃で３０分間かけて添加した。反応混合物を真空（２００ｍｂａｒ）下、５０℃でさらに１時間撹拌し、その後室温まで冷却した。反応混合物をイオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ－５０ＷＸ８２００－４００（Ｈ）、２２０ｍＬ）に供し、生成物を水（１Ｌ）で溶出した。溶出した生成物を減圧下濃縮し、カルバモイル酸生成物（７．９ｇ）を得た。残りのカルバモイル酸をカリウム塩としてカラムから再分離した。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，酸化重水素）δ ４．３１－４．２５（ｍ，１Ｈ），２．１９－１．８１（ｍ，４Ｈ），１．５２（ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ，３Ｈ）。Ｄ－及びＬ－エナンチオマーを、市販のＤ－及びＬ－グルホシネートから類似の方法で合成した。Ｌ－エナンチオマーの比回転［α］＝＋２７．５°（ｃ＝１Ｈ_２Ｏ、カリウム塩として測定）。ＳｕｐｅｌｃｏＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃＴ２を使用したＨＰＬＣ－ＭＳの保持時間（溶離液４０％アセトニトリル中水、０．１％ギ酸）。温度：２０℃、流速０．８ｍＬ／分。Ｌ－カルバモイルアミノ酸の保持時間（７．４分）；Ｄ－カルバモイルアミノ酸の保持時間（９．２分）。

【0153】

ｆ）Ｎ－カルバモイルアミノ酸から５－（［２－［エトキシ（メチル）ホスホリル］エチル）イミダゾリジン－２，４－ジオンの化学合成（Ｅｘ６）

【化42】

（２Ｒ）－４－［エトキシ（メチル）ホスホリル］－２－ウレイド－ブタン酸（すなわち、Ｅｘ１１又はＥｘ１２を介して合成）（１６４ｍｇ）を、ＨＣｌ水溶液（５％、３ｍＬ）に溶解した。反応混合物を４０℃で４８時間振とうした。ＮＭＲによって、Ｎ－カルバモイルアミノ酸からＤ－ヒダントインへの完全な変換が示された。Ｄ－ヒダントインは、実施例１４（酵素）に従って、又はｐＨ８．５で水性アンモニアによって処理することにより（実施例１５に記載されるものと類似の様式で）、容易にラセミ化することができる。

【0154】

化学的カルバモイル開裂ステップを用いる反応
ｇ）ブチル保護Ｎ－カルバモイルアミノ酸の酵素合成（ＥＸ７）

【化43】

５－（［２－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］エチル）イミダゾリジン－２，４－ジオン（７．８ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）の脱気リン酸カリウム緩衝液（６０ｍＬ、０．４９６Ｍ、ｐＨ８．０）中溶液にＫＯＨ（水中３Ｍ、３９０μＬ）を添加し、ｐＨを８．０まで調整した。この混合物にリン酸カリウム緩衝液（２２３ｍＬ、０．１００Ｍ、ｐＨ８．０）及びヒダントイナーゼ酵素（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ、配列番号１、清澄化細胞溶解物、１６．５ｍＬ、総タンパク質濃度８．１ｍｇ／ｍＬ）及びＭｎＣｌ_２溶液（水中１Ｍ、２４０μＬ）を添加した。反応混合物を３７℃で２４時間撹拌した（２５０ｒｐｍ）。粗製物質を濾過して細胞溶解物を除去し、濾過ケーキを水（６０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、ＴＨＦ／湿式ＭｅＯＨ中に再溶解し、シリカで濾過した（溶離液は純粋なメタノール）。次に、粗製物を逆相クロマトグラフィー（水／アセトニトリル９９：１～９５：５勾配）で精製し、４－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］－２－ウレイド－ブタン酸（２．０５ｇ、２５％）を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，酸化重水素）δ ４．１１－４．０７（ｍ，１Ｈ），４．０６－４．００（ｍ，２Ｈ），２．０９－１．８０（ｍ，４Ｈ），１．７１－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，３Ｈ），１．４６－１．３４（ｍ，２Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）。

【0155】

ｈ）Ｎ－カルバモイルアミノ酸からのグルホシネートの化学合成（Ｅｘ８）

【化44】

ヒダントイナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ、配列番号１、ｃｆ．Ｅｘ３）を用いて合成した４－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］－２－ウレイド－ブタン酸（１００ｍｇ）をＨＣｌ水溶液（３．５Ｍ、１０ｍＬ）中に溶解し、撹拌した反応混合物を０℃まで冷却した。水（２ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（２６ｍｇ）の溶液を添加し、反応混合物を室温まで加温した。反応混合物を室温でさらに２時間撹拌した。次に、水中濃ＨＣｌ（３６％、７．５ｍＬ）を添加し、反応混合物を１００℃まで加熱し、この温度で一晩撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、塩化メチレン（２×１０ｍＬ）で２回抽出した。水相を減圧下で濃縮し、グルホシネートの塩酸塩を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，酸化重水素）δ ３．８４－３．７８（ｍ，１Ｈ），２．１７－２．００（ｍ，２Ｈ），１．７４－１．５４（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，３Ｈ）。

【0156】

酵素的カルバモイル開裂ステップを用いたグルホシネートへの再反応
ｉ）Ｎ－カルバモイルアミノ酸からのグルホシネートの酵素的２－ｐｏｔ合成（Ｅｘ９、配列番号２）

【化45】

２－（カルバモイルアミノ）－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］ブタン酸（０．６ｇ、２．５ｍｍｏｌ、Ｅｘ５に従って製造）の脱気した水性リン酸カリウム緩衝液（５．４ｍＬ、０．４９６Ｍ、ｐＨ８．０）中溶液にＫＯＨ（水中３Ｍ）を添加し、ｐＨを８．０まで調整した。反応混合物（６．１ｍｌ）にリン酸カリウム緩衝液（１９．２ｍＬ、０．１００Ｍ、ｐＨ８．０）及びＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴ、配列番号２、清澄化細胞溶解物、１．５ｍＬ、総タンパク質濃度１２．９ｍｇ／ｍＬ、シェイクフラスコで生産されたタンパク質）及びＭｎＣｌ_２溶液（水中１Ｍ、２０μＬ）を添加した。反応混合物を３７℃で２４時間撹拌した（２５０ｒｐｍ）。ＮＭＲ及びＨＰＬＣ分析によって、グルホシネートへの変換率が３１％であることが示された。グルホシネートのエナンチオマー比をキラルＨＰＬＣによって分析した。キラルＨＰＬＣ：＞９９％－Ｌ－グルホシネート／＜１％Ｄ－グルホシネート；分析法：ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘからのＣｈｉｒｅｘ（Ｄ）－Ｐｅｎｃｉｌｌａｍｉｎｅ２５０×４．６ｍｍカラム；アイソクラティック溶出１０ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）；２４５ｎｍでＵＶ検出）。

【0157】

ｊ）Ｎ－カルバモイルアミノ酸からのグルホシネートの酵素的２－ｐｏｔ合成（Ｅｘ１０、配列番号３）

【化46】

並行して、別のＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素を用いて、同一条件でＥｘ９の反応を行い（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３、配列番号３、清澄化細胞溶解物、１．５ｍＬ、１０．２ｍｇ／ｍＬ総タンパク質濃度、シェイクフラスコで生産されたタンパク質）、Ｌ－グルホシネートも得た（変換率２１％、キラルＨＰＬＣ：＞９９％－Ｌ－グルホシネート／＜１％Ｄ－グルホシネート）。

【0158】

ｋ）ヒダントインのエチルエステルからのエチル－グルホシネートの酵素的１－ｐｏｔ合成（Ｅｘ１１、配列番号１＋４）

【化47】

水（２０ｍＬ）中の５－［２－［エトキシ（メチル）ホスホリル］エチル］イミダゾリジン－２，４－ジオン（５．６ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液にアンモニア（水中２５％）を添加して、ｐＨを８．５まで調整した。この混合物にＭｎＣｌ_２溶液（水中２Ｍ、１ｍＬ）及びヒダントイナーゼ酵素（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ、配列番号１、清澄化細胞溶解物、７．５ｍＬ、総タンパク質濃度３３ｍｇ／ｍＬ）及びＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素（Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ、配列番号４、清澄化細胞溶解物、２．８ｍＬ、総タンパク質濃度４４．８ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応混合物を３７℃で７２時間撹拌した。７２時間の反応時間中、ｐＨをアンモニア（水中２５％）で８．５に保持した。総反応時間７時間、２７時間、３０時間及び４９時間後、Ｎ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素（Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ、配列番号４、２．８ｍＬ、清澄化細胞溶解物）を添加した。ＮＭＲによって、２４時間後に３６％、７２時間後に４３％のＬ－グルホシネートのエチルエステルへの変換が示された（キラルＨＰＬＣによるエナンチオマー比Ｌ＞９９％、Ｄ＞１％）。反応終了後、粗反応混合物を８０℃まで３０分間加熱し、濾過して細胞溶解物を除去した。Ｌ－グルホシネートエチルエステル及びＮ－カルバモイルアミノ酸のエチルエステルの混合物をＤｏｗｅｘ－５０ＷＸ８２００－４００（Ｈ）で分離した。Ｎ－カルバモイルアミノ酸を水で溶出し、Ｌ－グルホシネートのエチルエステルをアンモニア（水中０．５Ｍ）で溶出して、Ｌ－グルホシネートエチルエステルを得た。或いは、結晶化によりＬ－グルホシネートエチルエステルを分離することもできた。残りのカルバモイルアミノ酸は、Ｅｘ６を介してリサイクルすることができる。Ｌ－グルホシネート及びＤ－グルホシネートのエチルエステルの濃度は、ＳｕｐｅｌｃｏＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃＴ２を用いたＨＰＬＣ－ＭＳによって決定した（溶離液２５％アセトニトリル中水、０．１％ギ酸）。温度：２０℃、流速１．０ｍＬ／分。グルホシネートのエチルエステルの保持時間：Ｌ－構成ジアステレオ異性体（７．６＋７．８分）；Ｄ－構成（８．５及び１１．５分）。

【0159】

ｌ）ヒダントインのエチルエステルからのエチル－グルホシネートの酵素的１－ｐｏｔ合成（Ｅｘ１２、配列番号１＋３）

【化48】

【0160】

ｍ）Ｎ－カルバモイルアミノ酸の酵素合成（Ｅｘ１３、配列番号１）

【化49】

２－（２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イル）エチル－メチル－ホスフィン酸（２５ｇ）を加熱しながらアンモニア水溶液（５３ｍＬ、１０Ｍ）中に溶解した。反応物を３７℃まで冷却し、次いでアンモニアを使用してｐＨを８．７まで調整した。ＭｎＣｌ_２溶液（水中２Ｍ、２．５ｍＬ）及びヒダントイナーゼ酵素（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ、配列番号１、凍結乾燥無細胞抽出物、１．２８ｇ）を添加し、アンモニア水溶液を用いてｐＨを８．７に調整した。反応混合物を３７℃で７２時間撹拌し、１０Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを８．７に連続的に調整した。２４時間後、ＨＰＬＣは９５％のヒダントインからカルバモイル酸への変換を示した。ＨＰＬＣ条件：ヒダントインからカルバモイル酸への変換率は、ＬｕｎａＣ８１５０×３．０ｍｍカラムを用いたＨＰＬＣ－ＭＳで測定した（水＋０．１％ギ酸）。温度：４０℃、流速０．５ｍＬ／分。保持時間：ヒダントイン３．４分、Ｎ－カルバモイルアミノ酸２．５分。

【0161】

ｎ）ｐＨ７．０のラセマーゼを用いたヒダントイン（エチルエステル）のラセミ化（Ｅｘ１４、ラセマーゼＡ０Ａ６Ｖ７ＡＣＫ５＿ＲＨＩＲＤ、配列番号５）

【化50】

（５Ｒ）－５－［２－［エトキシ（メチル）ホスホリル］エチル］イミダゾリジン－２，４－ジオン（３７．５ｍｇ、Ｄ－構成ヒダントインとＬ－構成ヒダントインとの比率９５／５）を水（７５μＬ）中に溶解し、アンモニア（水中１０Ｍ）を用いてｐＨを７．０まで調整した。この混合物にヒダントインラセマーゼ（配列番号５；Ａ０Ａ６Ｖ７ＡＣＫ５＿ＲＨＩＲＤ、２０．２ｍｇ／ｍｌ、１５０μＬ、清澄化細胞溶解物）を添加し、続いて１．６μＬのＭｎＣｌ_２（水中２Ｍ）を添加した。反応混合物を３７℃で２４時間振とうした。総反応時間４時間後、Ｄ／Ｌ－ヒダントイン比は９５／５から５３／４７に変化した。２０時間後、ヒダントインのラセミ化はほぼ完了した（比率５１／４９）。Ｌ及びＤ－ヒダントインの濃度は、ＳｕｐｅｌｃｏＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃＴ２を用いたＨＰＬＣ－ＭＳによって決定した（溶離液２５％アセトニトリル中水、０．１％ギ酸）。温度：２０℃、流速０．８ｍＬ／分。グルホシネートのエチルエステルの保持時間：Ｄ－構成ジアステレオ異性体（５．８＋６．１分）；Ｌ－構成（７．２及び１０．５分）。

【0162】

ｏ）ｐＨ８．５におけるヒダントインのラセミ化（Ｅｘ１５）

【化51】

２－［（４Ｓ）－２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イル］エチル－メチル－ホスフィン酸（２０６ｍｇ、エナンチオマー比Ｌ：Ｄ９２：８、キラルＨＰＬＣによって測定）を９００μＬの水に溶解し、５０μＬのアンモニア（水中１０Ｍ）を用いてｐＨを８．５まで調整した。反応混合物に１０μＬの２ＭＭｎＣｌ_２溶液を添加し、続いて３０μＬの水を添加した。反応混合物を３７℃で２４時間振とうした。総反応時間３時間後、エナンチオマー比はＬ：Ｄ５３：４７であり、総反応時間２４時間後、それは５０：５０であった。これは、ヒダントインがアンモニア水中の濃塩基性条件下で容易にラセミ化することを示している。Ｌ及びＤ－ヒダントインの濃度は、ＳｕｐｅｌｃｏＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃＴ２を用いたＨＰＬＣ－ＭＳによって決定した（溶離液４０％アセトニトリル中水、０．１％ギ酸）。温度：２０℃、流速０．８ｍＬ／分。Ｌ－ヒダントイン（１１．３分）；Ｄ－ヒダントイン（６．６分）の保持時間。

【0163】

ｐ）ｐＨ７．８でのラセマーゼを用いたヒダントインのラセミ化（Ｅｘ１６、ラセマーゼＡ０Ａ２Ｔ６ＫＨＨ４＿９ＲＨＯＢ、配列番号６）

【化52】

２－［（４Ｓ）－２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イル］エチル－メチル－ホスフィン酸（２０６ｍｇ、エナンチオマー比Ｌ：Ｄ９２：８、キラルＨＰＬＣによって測定）を５００μＬの水中に溶解し、アンモニア（水中１０Ｍ）を用いてｐＨを７．８に調整した。この混合物にヒダントインラセマーゼ（Ａ０Ａ２Ｔ６ＫＨＨ４＿９ＲＨＯＢ、配列番号６、１００μＬ、無細胞抽出物、総タンパク質濃度２６．１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて１０μＬのＭｎＣｌ_２（水中２Ｍ）を添加した。反応液を１ｍＬに調整し、アンモニア（水中１０Ｍ）でｐＨを７．８に調整した。反応混合物を３７℃で２４時間振とうした。総反応時間２時間後、エナンチオマー比はＬ：Ｄ５０：５０であった。

【0164】

ｑ）新規生体触媒の酵素スクリーニング（Ｅｘ１７）
プラスミドｐＡｇｒｏ４及びｐＨＳＧ５７５を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１０を、目的のタンパク質をコードするｐＤＨＥプラスミドで形質転換した。得られた単一クローンを用いて、１ｍＭＭｎＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した予備培養培地（発酵全細胞生体触媒生産、ＥＸ２参照）１ｍｌを、４８ウェル花型マイクロタイタープレート（ｍ２ｐｌａｂｓ）のウェルに接種した。培養は３７℃、１０００ｒｐｍで一晩行った。本培養のために、予備培養培地（発酵全細胞生体触媒生産、ＥＸ２を参照）に、１ｍＭＭｎＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１ｍＭＩＰＴＧ、及び１％ラムノースを添加した。得られた培地１ｍｌを４８ウェル花型マイクロタイタープレート（ｍ２ｐｌａｂｓ）のウェルに分注し、１０μｌの予備培養液を接種した。本培養を３７℃、１０００ｒｐｍで一晩培養した。その後、３７５０ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。全細胞を用いたスクリーニングでは、細胞ペレットを５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．４、１ｍＭＭｎＣｌ２添加）に懸濁した。清澄化細胞溶解物を用いる場合は、細胞ペレットを、１ｍＭＭｎＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．３ｍｇ／ｍｌ硫酸ポリミキシンｂ、０．０１ｍｇ／ｍｌＤＮアーゼ、０．０１ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼを添加した５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．４）中に懸濁し、懸濁液を室温、１０００ｒｐｍで１時間培養した。得られた細胞溶解物を３７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することにより、残骸を除去した。５０μｌの清澄化細胞溶解物又は全細胞懸濁液を、ｐＨ８．４で１００ｍＭＨＥＰＥＳ中１０ｍＭの関連基質及び１ｍＭＭｎＣｌ２を含有する２００μｌの反応に用いた。反応を３７℃で一晩行った後、最終濃度５％でＴＦＡによってクエンチした。沈殿物を遠心分離によって除去し、質量分析検出器と組み合わせたＨＰＬＣを用いて上清を定量分析した。ＨＰＬＣ－ＭＳはＬｕｎａＣ８１５０×３．０ｍｍカラムを使用（水＋０．１％ギ酸）。温度：４０℃、流速０．５ｍＬ／分をＮ－カルバモイル酸、ヒダントイン及びグルホシネート自体の検出に関しては使用したが、一方、ブチルエステルを含む分子はＫｉｎｅｔｅｘＣ１８１００×２．１ｍｍカラム（流速０．５ｍＬ／分、２０％水中アセトニトリル、０．１％ギ酸）で分離した。

【0165】

１）全細胞を用い、基質として１０ｍＭのラセミ体５－（［２－［エトキシ（メチル）ホスホリル］エチル］イミダゾリジン－２，４－ジオン（グルホシネートヒダントイン、合成Ｅｘ３）又は５－（［２－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］エチル］イミダゾリジン－２，４－ジオン（グルホシネートヒダントインのブチルエステル、合成ＥＸ４）を用いてヒダントイナーゼをスクリーニングした。ヒダントイナーゼからのそれぞれのＮ－カルバモイルアミノ酸の生成をモニターした。ヒダントイナーゼＱ４５５１５、Ｑ４４１８４、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１，及びＥ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳは、＞０．１％の２－（カルバモイルアミノ）－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］ブタン酸（グルホシネートのＮ－カルバモイル酸）収率を示した。ヒダントイナーゼＯ６９８０９、Ｑ８４６Ｕ５＿９ＢＡＣＬ、Ｐ８１００６、Ｑ８４ＦＲ６＿９ＭＩＣＣ、Ｑ５６Ｓ４９＿９ＢＡＣＩ、Ａ１Ｅ３５１＿９ＢＡＣＩ、Ｑ２８ＳＡ７、Ｑ４５５１５、Ａ０Ａ３９９ＤＲＱ３＿９ＤＥＩＮ、Ｑ５５ＤＬ０、Ｆ７Ｘ５Ｍ８＿ＳＩＮＭＭ、Ｑ９Ｉ６７６、Ｑ４４１８４、Ｂ５Ｌ３６３、Ｐ４２０８４、Ｐ２５９９５、Ｑ３Ｚ３５４、Ｂ１ＸＥＧ２、Ｑ９Ｆ４６５＿ＰＡＥＡＵ、Ａ０Ａ１６１ＫＤ３７＿９ＣＨＬＲ、Ａ０Ａ１Ｊ４ＸＨＲ４＿９ＢＡＣＴ、Ａ０Ａ１Ｃ４ＱＩＹ５＿９ＡＣＴＮ、Ａ０Ａ０Ｋ２ＵＭＰ４＿ＬＥＰＳＭ、Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ、Ｅ１Ｒ８Ｃ９＿ＳＥＤＳＳ、Ａ０Ａ１Ｆ９ＱＴ１７＿９ＢＡＣＴ、Ａ０Ａ０Ｄ８ＩＶＶ８＿９ＦＩＲＭ、Ａ０Ａ０Ｂ５ＱＫＥ４＿ＣＬＯＢＥ、Ａ０Ａ０Ｎ１ＧＢＺ８＿９ＡＣＴＮ、Ａ０Ａ１７４ＡＤＺ３＿９ＦＩＲＭ、Ｕ７Ｖ９Ｑ６＿９ＦＵＳＯ、Ａ０Ａ０Ｊ１ＦＡＩ４＿９ＦＩＲＭ、ＰＨＹＤＡ＿ＥＣＯＫ１、Ａ０Ａ０Ｓ８Ｈ５７６＿９ＢＡＣＴ、Ａ０Ａ１Ｊ４Ｊ４Ｙ８＿９ＥＵＫＡ、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＦＳ５＿９ＢＡＣＬ、Ａ０Ａ０Ｄ５ＮＮＪ７＿９ＢＡＣＬ、Ａ０Ａ１Ｈ２ＡＶ６６＿９ＢＡＣＬ、Ａ０Ａ０Ｑ４ＲＸＹ０＿９ＢＡＣＬ、Ａ０Ａ０Ｑ７ＳＢ７５＿９ＢＡＣＬ、Ａ０Ａ１００ＶＲＮ２＿ＰＡＥＡＭ、Ｗ４ＢＤＪ０＿９ＢＡＣＬ、Ａ０Ａ１Ｊ５Ｅ０８２＿９ＤＥＬＴ、Ａ０Ａ１Ｈ５ＺＦＮ３＿９ＢＡＣＴ、Ａ０Ａ１Ｆ８ＮＭＭ２＿９ＣＨＬＲ、Ａ０Ａ１Ｆ８ＳＤＶ１＿９ＣＨＬＲ、Ａ０Ａ１Ｈ１ＰＬＸ０＿９ＢＡＣＴ、Ａ０Ａ０Ｑ５Ｉ８Ｘ４＿９ＤＥＩＯ、＊ＷＰ＿０４６１７０５１９．１、＊ＷＰ＿０２３５１４１９５．１、＊ＷＰ＿０２３５１６１４７．１及び＊ＡＮＺ１５４８３．１は、＞０．１％の４－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］－２－ウレイドブタン酸（グルホシネート－ブチルエステルのＮ－カルバモイル酸）収率を示した。

【0166】

２）清浄化細胞溶解物及び基質として１０ｍＭ２－（カルバモイルアミノ）－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］ブタン酸（グルホシネートのＮ－カルバモイル酸）又は４－［ブトキシ（メチル）ホスホリル］－２－ウレイド－ブタン酸（グルホシネート－ブチルエステルのＮ－カルバモイル酸）を用いてカルバモイラーゼをスクリーニングした。グルホシネート又はグルホシネートのブチルエステルの生成をモニターした。カルバモイラーゼＡ０Ａ３Ｅ０Ｃ９９６＿９ＢＵＲＫ、Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ、Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３及びＡ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴは＞０．１％のグルホシネート収率を示した。カルバモイラーゼＡ０Ａ０Ｋ９ＹＸ８４＿９ＢＡＣＬ、Ｅ３ＨＵＬ６＿ＡＣＨＸＡ、Ｑ９Ｆ４６４、Ａ０Ａ４Ｄ７Ｑ５４８＿ＧＥＯＫＵ、Ｑ９Ｆ４６４、Ａ０Ａ２Ｓ９Ｄ９７６＿９ＭＩＣＣ、Ａ０Ａ３Ｅ０Ｃ９９６＿９ＢＵＲＫ、Ａ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ、Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３及びＡ０Ａ１Ｙ４ＧＣ６２＿９ＢＡＣＴは、＞０．１％のグルホシネートのブチルエステル収率を示した。

【0167】

ｒ）小スケールでの酵素的カスケード反応（ＥＸ１８）

【化53】

凍結乾燥した無細胞抽出物をｐＨ８．４の１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。７５ｍＭＭｎＣｌ_２及び１００ｍＭラセミ体５－［２－［エトキシ（メチル）ホスホリル］エチル］イミダゾリジン－２，４－ジオンを含むｐＨ８．４の１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液中で４００μｌスケールで反応をセットアップした。反応は、ヒダントイナーゼＱ４４１８４（配列番号７）及びカルバモイラーゼＡ０Ａ５３５Ｙ１Ｈ２＿９ＣＨＬＲ（配列番号４）を、それぞれ最終濃度１９ｍｇ／ｍｌ及び７．３ｍｇ／ｍｌで添加することによって開始した。その後、反応物を３７℃で２４時間培養した後、９５℃で５分間加熱して停止させた。沈殿物を遠心分離によって除去し、１００倍に希釈し、質量分析検出器と組み合わせたキラルＨＰＬＣを用いて上清を定量分析した。グルホシネートのエチルエステルの反応収率は２２．３％であり、エナンチオマー比はＬ＞９９％、Ｄ＞１％であった。

【0168】

ｓ）Ｎ－カルバモイルアミノ酸からのグルホシネートの酵素的１－ｐｏｔ合成（Ｅｘ１９、配列番号１＋３）

【化54】

３０ｍＬアンモニア（２Ｍ）水溶液中の２－（２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イル）エチル－メチル－ホスフィン酸（７．３ｇ）にアンモニア（水中２５％）を添加してｐＨを８．０に調整した。この混合物にＭｎＣｌ_２溶液（水中２Ｍ、１ｍＬ）、ヒダントイナーゼ酵素（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ１５９Ｚ５３１＿９ＲＨＯＢ、配列番号１、凍結乾燥清澄化細胞溶解物、１．２ｇ）及びＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３、清澄化細胞溶解物、２．８ｍＬ、総タンパク質濃度４４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応混合物を３７℃で４４時間撹拌した。総反応時間４時間後にＮ－カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ酵素（Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３、２．８ｍＬ）を添加し、総反応時間２３時間後に再度添加した（Ａ０Ａ６Ｐ２ＩＳＬ４＿ＢＵＲＬ３、１１．２ｍＬ）。４４時間後、ＮＭＲで測定したところ、ヒダントインの８３％がＮ－カルバモイルアミノ酸に、１０％がグルホシネートに変換していた。キラルＨＰＬＣ分析によって、Ｌ－グルホシネート：Ｄ－グルホシネート９２：８のエナンチオマー比が示された。Ｌ－グルホシネートとＤ－グルホシネートとの比率は、ＳｕｐｅｌｃｏＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃＴ２を用いたＨＰＬＣ－ＭＳによって決定した（溶離液４０％アセトニトリル中水、０．１％ギ酸）。温度：２０℃、流速０．８ｍＬ／分。Ｌ－グルホシネートの保持時間（６．８分）：Ｄ－グルホシネートの保持時間（７．４分）。残りのカルバモイルアミノ酸はＥｘ６を介してリサイクルできる。

【0169】

配列番号１（デフルビイモナス・アルバ（Ｄｅｆｌｕｖｉｉｍｏｎａｓａｌｂａ）由来）

【化55】