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特表2024-546916ＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３を標的とする免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】ＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３を標的とする免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241219BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241219BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/02
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61K31/7088
A61P37/04
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535740
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-07-09
(86)【国際出願番号】 EP2022086353
(87)【国際公開番号】W WO2023111266
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】21306822.4
(32)【優先日】2021-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22305477.6
(32)【優先日】2022-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505166225
【氏名又は名称】アブリンクス エン．ヴェー．
(71)【出願人】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】エレーヌ・ボヌヴォ
(72)【発明者】
【氏名】メリッサ・ダラース
(72)【発明者】
【氏名】アンネリース・ルーブルック
(72)【発明者】
【氏名】シュテファニ・スターレンス
(72)【発明者】
【氏名】ダイアン・ファン・フーリック
(72)【発明者】
【氏名】ジュディス・フェルヘルスト
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB27
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB27
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本技術は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している対象を処置するための新規なタイプの薬物を提供することを目的とする。具体的には、本技術は、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、少なくとも１つのＩＳＶＤがＴ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）に結合し、少なくともＩＳＶＤがＣＤ３３に結合し、少なくとも１つのＩＳＶＤがＣＤ１２３に結合することを特徴とするポリペプチドを提供する。本技術はまた、核酸、ベクター及び組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む組成物、又は前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、前記ポリペプチドが少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれからなり、前記ＩＳＶＤの各々が、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていてもよい３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み：及びａａ）第１のＩＳＶＤが、Ｔ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）に特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号１０と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号１４と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤがＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）第３のＩＳＶＤがＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号８と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号１２と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号１６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み、
ＩＳＶＤの順序が、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端まで考慮される互いに対する相対位置を示す、ポリペプチド又は組成物。
【請求項2】
請求項１に記載のポリペプチド又は組成物であって、ａ．前記第１のＩＳＶＤが、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；
ｂ．前記第２のＩＳＶＤが、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；及び
ｃ．前記第３のＩＳＶＤが、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ポリペプチド又は組成物。
【請求項3】
請求項１又は２のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物であって、ａ．前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み；
ｂ．前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；及び
ｃ．前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号４と９０％を超える同一性の配列同一性を含む、ポリペプチド又は組成物。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物であって、ａ．前記第１のＩＳＶＤが、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ．前記第２のＩＳＶＤが、配列番号３のアミノ酸配列を含み；及び
ｃ．前記第３のＩＳＶＤが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド又は組成物。
【請求項5】
前記ポリペプチドが、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含み、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して増大した半減期を有する前記ポリペプチドを提供する、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項6】
前記ポリペプチドに増大した半減期を与える前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質に結合し得る結合単位、Ｆｃ部分及び血清タンパク質に結合し得る低分子タンパク質又はペプチドからなる群から選択される、請求項５に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【請求項7】
前記ポリペプチドに増大した半減期を与える前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）又は血清免疫グロブリン（ＩｇＧなど）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、請求項５又は６に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項8】
増大した半減期を有する前記ポリペプチドを提供する前記結合単位、ヒト血清アルブミンに結合し得る第４のＩＳＶＤである、請求項７に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項9】
請求項８に記載のポリペプチド又は組成物であって、ヒト血清アルブミンに結合する前記第４のＩＳＶＤが、ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含む、ポリペプチド又は組成物。
【請求項10】
ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤが、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項８又は９に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項11】
ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号５と９０％を超える配列同一性を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項12】
ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項13】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１と９０％を超える配列同一性を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項14】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項16】
請求項１５に記載の核酸を含む宿主又は宿主細胞。
【請求項17】
請求項１～１４のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、ａ．適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、請求項１５に記載の核酸を発現させるステップ；場合によりその後に：
ｂ．請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドを単離及び／又は精製するステップ
を少なくとも含む、方法。
【請求項18】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド又は請求項１５に記載の核酸を含む組成物。
【請求項19】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む医薬組成物である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
医薬として使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１８若しくは１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
急性骨髄性白血病ＡＭＬ）の治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１８若しくは１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記ＡＭＬが再発性及び／又は難治性ＡＭＬである、請求項２１に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【請求項23】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的活性量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１８若しくは１９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項24】
前記ＡＭＬが再発性及び／又は難治性ＡＭＬである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するための医薬組成物の調製における、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１８若しくは１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項26】
前記ＡＭＬが再発性及び／又は難治性ＡＭＬである、請求項２５に記載のポリペプチド又は組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１ 本技術の分野
本技術は、ＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３を標的とするポリペプチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含むベクターに関する。本技術はさらに、そのようなポリペプチド、核酸又はベクターを含む組成物に関する。本技術はまた、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している対象を治療する方法に使用するためのそのような組成物に関する。また、本技術は、これらの組成物の製造方法に関する。
本技術は、ＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３を標的とするポリペプチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含むベクターに関する。本技術はさらに、そのようなポリペプチド、核酸又はベクターを含む組成物に関する。本技術はまた、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している対象を治療する方法に使用するためのそのような組成物に関する。また、本技術は、これらの組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２ 技術的背景
今日まで、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療は困難なままである。細胞傷害性Ｔ細胞は、すべての免疫細胞の中で悪性疾患の治療の可能性が最も高いと思われるため、ＡＭＬ治療アプローチは、細胞傷害性Ｔ細胞をＡＭＬ細胞に向けることを目指している。ＣＤ３３及びＣＤ１２３抗原は、ＡＭＬのほとんどの場合の芽球及び白血病幹細胞で過剰発現されることが見出され、したがって、抗体に基づく治療のための適切な腫瘍関連標的抗原として使用された。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ；抗ＣＤ３３抗体薬物コンジュゲート）は、ＡＭＬの治療のために登録された最初の標的化合物であった。最近の治療法は、ＡＭＬ細胞上の腫瘍抗原ＣＤ３３又はＣＤ１２３及び細胞傷害性Ｔ細胞上のＣＤ３の１つを標的とする二重特異性抗体構築物に基づく。
今日まで、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療は困難なままである。細胞傷害性Ｔ細胞は、すべての免疫細胞の中で悪性疾患の治療の可能性が最も高いと思われるため、ＡＭＬ治療アプローチは、細胞傷害性Ｔ細胞をＡＭＬ細胞に向けることを目指している。ＣＤ３３及びＣＤ１２３抗原は、ＡＭＬのほとんどの場合の芽球及び白血病幹細胞で過剰発現されることが見出され、したがって、抗体に基づく治療のための適切な腫瘍関連標的抗原として使用された。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ；抗ＣＤ３３抗体薬物コンジュゲート）は、ＡＭＬの治療のために登録された最初の標的化合物であった。最近の治療法は、ＡＭＬ細胞上の腫瘍抗原ＣＤ３３又はＣＤ１２３及び細胞傷害性Ｔ細胞上のＣＤ３の１つを標的とする二重特異性抗体構築物に基づく。
【0003】
それにより、二重特異性抗体は、ＣＤ３３＋又はＣＤ１２３＋ＡＭＬ細胞に固定することができ、同時にＴ細胞上のＣＤ３に結合することができる。このようにして、Ｔ細胞は腫瘍細胞に近接する。腫瘍細胞上の腫瘍抗原（ＣＤ３３又はＣＤ１２３）への二重特異性抗体の多重結合及びＴ細胞上のＴＣＲ関連ＣＤ３分子への同時結合は、ＴＣＲクラスター形成をもたらす。これは最終的に、ＴＣＲ特異性に関係なく効率的なＴ細胞活性化をもたらす。次いで、ＡＭＬ細胞付近の細胞傷害性Ｔ細胞活性化は、腫瘍細胞の死滅をもたらし得る。現在臨床試験で試験されている二重特異性抗体構築物は、例えば、フロテツズマブ（ＭＧＤ００６；ＣＤ３／ＣＤ１２３ ＤＡＲＴ）、ＡＭＧ３３０又はＡＭＧ６７３（両方ともＣＤ３／ＣＤ３３ ＢｉＴＥ）である。
【0004】
ＡＭＬ患者集団（患者間）及び個々の患者のＡＭＬ芽球集団（患者内）の両方に見られるＣＤ３３及びＣＤ１２３発現の不均一性を考慮すると、ＡＭＬの効果的な治療は複雑である。さらに、単一の腫瘍抗原を標的とすることは、治療的介入によって誘導される選択圧のために腫瘍細胞上のこの抗原の発現を失うリスクをもたらす（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２７（２０），２４０６－２４１０（２０１６）；Ｂｌｏｏｄ．２０１７ Ｊａｎ ５；１２９（１）：１００－１０４）。したがって、単一の標的化療法の限界を克服し、より広い患者範囲を有する新しい治療アプローチが強く必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
３ 本技術の概要
本発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上のＣＤ３３及びＣＤ１２３を二重標的化するポリペプチド（又はＩＳＶＤ構築物）が、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）を標的化することと組み合わされて、ＡＭＬ細胞の効果的な殺傷をもたらすことを見出した。ＣＤ３３／ＣＤ１２３二重発現細胞に対する殺傷活性は、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＡＭＧ ３３０ ＢｉＴＥ又はＣＤ１２３／ＣＤ３ ＭＧＤ００６ ＤＡＲＴなどの単一標的化ベンチマークに匹敵した。しかしながら、本発明のポリペプチドは、ＣＤ３３及びＣＤ１２３単一発現細胞に対して強い殺傷活性を示したが、単一標的化ベンチマークは、それらの特異的標的を発現する細胞に対してのみ活性を示した。さらに、本発明のポリペプチドは、ベンチマークと比較して、類似又はさらに低いレベルの炎症性サイトカインを誘導する。
本発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上のＣＤ３３及びＣＤ１２３を二重標的化するポリペプチド（又はＩＳＶＤ構築物）が、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）を標的化することと組み合わされて、ＡＭＬ細胞の効果的な殺傷をもたらすことを見出した。ＣＤ３３／ＣＤ１２３二重発現細胞に対する殺傷活性は、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＡＭＧ ３３０ ＢｉＴＥ又はＣＤ１２３／ＣＤ３ ＭＧＤ００６ ＤＡＲＴなどの単一標的化ベンチマークに匹敵した。しかしながら、本発明のポリペプチドは、ＣＤ３３及びＣＤ１２３単一発現細胞に対して強い殺傷活性を示したが、単一標的化ベンチマークは、それらの特異的標的を発現する細胞に対してのみ活性を示した。さらに、本発明のポリペプチドは、ベンチマークと比較して、類似又はさらに低いレベルの炎症性サイトカインを誘導する。
【0006】
いくつかの実施形態では、本技術のポリペプチドは効率的に製造され（例えば微生物宿主において）、皮下投与に有利且つ便利な高濃度で低い粘度を示した。さらに、そのようなポリペプチドは、処置される対象における既存の抗体に対する反応性が限られている（すなわち、抗体構築物による第１の処置の前に対象に存在する抗体）。好ましい実施形態では、そのようなポリペプチドは、連続治療が好都合に間隔を空けられるように十分に長い半減期を治療される対象において示す。
【0007】
本技術のポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はこれからなり、ここで、少なくとも１つのＩＳＶＤはＴＣＲαβに特異的に結合し、少なくとも１つのＩＳＶＤはＣＤ３３に特異的に結合し、少なくとも１つのＩＳＶＤはＣＤ１２３に特異的に結合する（例示的なポリペプチドを図１に示す）。好ましくは、ＴＣＲαβに結合する少なくとも１つのＩＳＶＤはヒトＴＣＲαβに特異的に結合し、ＣＤ３３に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤはヒトＣＤ３３に特異的に結合し、ＣＤ１２３に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤはヒトＣＤ１２３に特異的に結合する。
【0008】
ポリペプチドは、好ましくは、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含み、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して、増大した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、血清タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミンなどのヒト血清タンパク質に結合するＩＳＶＤであり得る。
【0009】
本技術のポリペプチドを発現することができる核酸分子、核酸又は核酸を含むベクター、及びポリペプチド、核酸又はベクターを含む組成物も提供される。組成物は、好ましくは医薬組成物である。
【0010】
本技術のポリペプチドをコードする核酸又はベクターを含む宿主又は宿主細胞も提供される。
【0011】
本技術に従うポリペプチドの製造方法であって：
ａ．場合により適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、本技術に従うポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるステップ、次いで、場合により、
ｂ．本技術によるポリペプチドの単離及び／又は精製するステップ
を少なくとも含む方法がさらに提供される。
ａ．場合により適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、本技術に従うポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるステップ、次いで、場合により、
ｂ．本技術によるポリペプチドの単離及び／又は精製するステップ
を少なくとも含む方法がさらに提供される。
【0012】
さらに、本技術は、医薬として使用するための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸若しくはベクターを含む組成物を提供する。好ましくは、ポリペプチド又は組成物は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するためのものであり、好ましくはＡＭＬは再発性及び／又は難治性ＡＭＬである。
【0013】
さらに、ＡＭＬを治療する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に活性な量の本技術によるポリペプチド又は組成物を投与することを含む方法が提供される。ＡＭＬは、好ましくは再発性及び／又は難治性ＡＭＬである。好ましい実施形態では、方法は、１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。
【0014】
ＡＭＬを治療するための医薬組成物の調製における本技術のポリペプチド又は組成物の使用がさらに提供され、ＡＭＬは好ましくは再発性及び／又は難治性ＡＭＬである。
【0015】
特に、本技術は以下の実施形態を提供する：
【0016】
実施形態１．医薬として使用するための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、ポリペプチドが少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれからなり、前記ＩＳＶＤの各々が、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていてもよい３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み：
ａ）第１のＩＳＶＤが、Ｔ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）に特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１４と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤがＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）第３のＩＳＶＤがＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１２と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み、
ＩＳＶＤが、Ｎ末端から始まる順序である、ポリペプチド、又は組成物。
ａ）第１のＩＳＶＤが、Ｔ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）に特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１４と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤがＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）第３のＩＳＶＤがＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１２と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み、
ＩＳＶＤが、Ｎ末端から始まる順序である、ポリペプチド、又は組成物。
【0017】
実施形態２．少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む医薬組成物である、実施形態１に記載の使用のための組成物。
【0018】
実施形態３．実施形態１又は２に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物であって、
ａ）前記第１のＩＳＶＤが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ポリペプチド又は組成物。
ａ）前記第１のＩＳＶＤが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ポリペプチド又は組成物。
【0019】
実施形態４．実施形態１～３のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物であって、
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号４と９０％を超える同一性の配列同一性を有する、ポリペプチド又は組成物。
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号４と９０％を超える同一性の配列同一性を有する、ポリペプチド又は組成物。
【0020】
実施形態５．実施形態１～４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物であって、
ａ）前記第１のＩＳＶＤが配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号３のアミノ酸配列を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド又は組成物。
ａ）前記第１のＩＳＶＤが配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号３のアミノ酸配列を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド又は組成物。
【0021】
実施形態６．前記ポリペプチドが、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含み、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して、増大した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１～５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0022】
実施形態７．増大した半減期をポリペプチドに与える前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質に結合し得る結合単位、Ｆｃ部分及び血清タンパク質に結合し得る低分子タンパク質又はペプチドからなる群から選択される、実施形態６に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0023】
実施形態８．増大した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に結合し得る結合単位からなる群から選択される、実施形態６～７のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0024】
実施形態９．増大した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位が、ヒト血清アルブミンに結合し得るＩＳＶＤである、実施形態８に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0025】
実施形態１０．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含む、実施形態９に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含む、実施形態９に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0026】
実施形態１１．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態９～１０のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0027】
実施形態１２．ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態９～１１のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0028】
実施形態１３．ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤが、配列番号５のアミノ酸配列を有する、実施形態９～１２のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0029】
実施形態１４．ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0030】
実施形態１５．ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0031】
実施形態１６．ＡＭＬの治療に使用するための、請求項１～１５のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0032】
実施形態１７．ＡＭＬが再発性及び／又は難治性ＡＭＬである、請求項１６に記載の使用のためのポリペプチド又は組成物。
【0033】
実施形態１８．少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか、又はこれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤのそれぞれが、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていてもよい３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み：
ａ）第１のＩＳＶＤが、Ｔ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）に特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１４と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤがＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）第３のＩＳＶＤがＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１２と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み、
ＩＳＶＤが、Ｎ末端から始まる順序である、ポリペプチド。
ａ）第１のＩＳＶＤが、Ｔ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）に特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１４と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤがＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）第３のＩＳＶＤがＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｖｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１２と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｘ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１６と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含み、
ＩＳＶＤが、Ｎ末端から始まる順序である、ポリペプチド。
【0034】
実施形態１９．実施形態１８に記載のポリペプチドであって：
ａ）前記第１のＩＳＶＤが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ポリペプチド。
ａ）前記第１のＩＳＶＤが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ポリペプチド。
【0035】
実施形態２０．実施形態１８又は１９のいずれかに記載のポリペプチドであって：
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号４と９０％を超える同一性の配列同一性を有する、ポリペプチド。
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号２と９０％を超える配列同一性を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号３と９０％を超える配列同一性を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号４と９０％を超える同一性の配列同一性を有する、ポリペプチド。
【0036】
実施形態２１．実施形態１８～２０のいずれか１つに記載のポリペプチドであって：
ａ）前記第１のＩＳＶＤが配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号３のアミノ酸配列を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
ａ）前記第１のＩＳＶＤが配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤが、配列番号３のアミノ酸配列を有し；及び
ｃ）前記第３のＩＳＶＤが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【0037】
実施形態２２．前記ポリペプチドが、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含み、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して、増大した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0038】
実施形態２３．増大した半減期をポリペプチドに与える前記一つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質に結合し得る結合単位、Ｆｃ部分及び血清タンパク質に結合し得る小さなタンパク質又はペプチドからなる群から選択される、実施形態２２に記載のポリペプチド。
【0039】
実施形態２４．増大した半減期をポリペプチドに与える前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に結合し得る結合単位からなる群から選択される、実施形態２２～２３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0040】
実施形態２５．増大した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位が、ヒト血清アルブミンに結合し得るＩＳＶＤである、実施形態２４に記載のポリペプチド。
【0041】
実施形態２６．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含む、実施形態２５に記載のポリペプチド。
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３を含む、実施形態２５に記載のポリペプチド。
【0042】
実施形態２７．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、実施形態２５～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0043】
実施形態２８．ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤのアミノ酸配列が、配列番号５と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0044】
実施形態２９．ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤが、配列番号５のアミノ酸配列を有する、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0045】
実施形態３０．ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１と９０％を超える配列同一性を有する、実施形態１８～２９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0046】
実施形態３１．配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる、実施形態１８～２９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0047】
実施形態３２．実施形態１８～３１のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【0048】
実施形態３３．実施形態３２に記載の核酸を含む宿主又は宿主細胞。
【0049】
実施形態３４．実施形態１８～３１のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造するための方法であって：
ａ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、実施形態３２に記載の核酸を発現させ；場合によりその後に：
ｂ）実施形態１８～３１のいずれか１つに記載のポリペプチドを単離及び／又は精製するステップを少なくとも含む、方法。
ａ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、実施形態３２に記載の核酸を発現させ；場合によりその後に：
ｂ）実施形態１８～３１のいずれか１つに記載のポリペプチドを単離及び／又は精製するステップを少なくとも含む、方法。
【0050】
実施形態３５．実施形態１８～３１のいずれか１つに記載の少なくとも１つのポリペプチド又は実施形態３２に記載の核酸を含む組成物。
【0051】
実施形態３６少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む医薬組成物である、実施形態３５に記載の組成物。
【0052】
実施形態３７．ＡＭＬを治療する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的活性量の請求項１８～３１のいずれか１つに記載のポリペプチド又は請求項３５～３６のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む方法。
【0053】
実施形態３８．前記ＡＭＬが再発性及び／又は難治性ＡＭＬである、請求項３７に記載の方法。
【0054】
実施形態３９．ＡＭＬを治療するための医薬組成物の調製における、請求項１８～３１のいずれか１つに記載のポリペプチド又は請求項３５～３６のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【0055】
実施形態４０．ＡＭＬが再発性及び／又は難治性ＡＭＬである、請求項３９に記載のポリペプチド又は組成物の使用。
【0056】
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1】リンカーを介して連結された一価構成要素／ＩＳＶＤ ＴＣＲαβ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＡｌｂをＮ末端からＣ末端に示す、本発明による多重特異性ＩＳＶＤ構築物の概略図。
【図2】ＢＢ（右）に結合する一価ＣＤ３３（左）及びＣＤ１２３の、ヒト（上）又はカニクイザル（下）トランスフェクトＣＤ３３、それぞれＣＤ１２３細胞への結合。
【図3】Ａ０２５００１５６２（ＴＣＲ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物、配列番号１）のヒトＣＤ３３及び／又はヒトＣＤ１２３発現細胞ヘの結合。
【図4】Ａ０２５００１５６２、ＴＣＲ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物、配列番号１（黒い四角）及び参照ＴＣＲ（灰色の点）の臨床グレードＨＳＡの非存在下（点線の曲線）又は存在下（完全な曲線）における初代Ｔ細胞に対する競合アッセイにおける用量依存的阻害。
【図5】５０μＭ ＨＳＡの存在下でのインピーダンスベースアッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）において１５対１のエフェクター対標的比を使用した、対応する種のＣＤ３３（左）又はＣＤ１２３（右）トランスフェクト細胞の用量依存性のヒト（上）又はカニクイザル（下）Ｔ細胞媒介性殺傷。
【図6】１０：１のエフェクター対標的比を使用したフローサイトメトリーベースのアッセイにおける用量依存性のヒト（左）又はカニクイザル（右）Ｔ細胞媒介ＭＯＬＭ－１３細胞殺傷。％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３陽性標的細胞を、ＩＳＶＤの濃度に対してプロットする。
【図7】インピーダンスベースアッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）において１５対１のエフェクター対標的比を使用した用量依存性ヒトＴ細胞媒介性細胞殺傷。３２～３５時間のインキュベーション後の細胞指数（ＣＩ）を、ＩＳＶＤの濃度に対してプロットする。
【図8】Ａ０２５００１５６２（ＴＣＲ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物、配列番号：１）のｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージングによるＭｏｌｍ１３－ｌｕｃ ＡＭＬ腫瘍成長の阻害。
【図9】Ａ０２５００１５６２（ＴＣＲ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物、配列番号１）のｅｘ ｖｉｖｏ生物発光イメージングによるＭｏｌｍ１３－ｌｕｃ ＡＭＬ腫瘍成長の阻害。
【図10】ＭＯＬＭ－１３細胞におけるＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性対照と比較した、本発明によるＩＳＶＤの用量依存性のヒトＴ細胞媒介性殺傷。
【図11】ＫＧ－１ａ細胞におけるＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性対照と比較した、本発明によるＩＳＶＤの用量依存性のヒトＴ細胞媒介性殺傷。
【図12】Ｕ－９３７細胞におけるＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性対照と比較した、本発明によるＩＳＶＤの用量依存性のヒトＴ細胞媒介性殺傷。
【図13】ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性対照並びに陰性対照（非標的化ＴＣＥ）と比較した本発明によるＩＳＶＤの用量依存性の単球枯渇。
【図14】異なるサイトカインのパネルを使用した、健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣにおける、ＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性対照並びに陰性対照（非標的化ＴＣＥ）と比較した、本発明によるＩＳＶＤの用量依存性のサイトカイン放出。Ａ．ＩＬ－６。Ｂ．ＩＦＮγ。Ｃ．ＴＮＦα。Ｄ．ＩＬ－２。
【図15】すべての試験患者におけるＣＤ３３及びＣＤ１２３陽性対照に対する本発明によるＩＳＶＤのＡＭＬ芽球殺傷。
【図16】ＡＭＬ試料あたりのＣＤ３３又はＣＤ１２３陽性細胞のパーセンテージを示す散布図。
【図17】ＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性対照並びに陰性対照と比較した、本発明によるＩＳＶＤに対する広範囲の疾患サブタイプを有するＡＭＬ患者由来の原発性芽球の細胞生存率。Ａ．患者番号３。Ｂ．患者番号４。Ｃ．患者番号５。
【図18】本発明によるＩＳＶＤで処置したカニクイザルの末梢血中で経時的に測定した総ＣＤ１２３＋Ｔ細胞（Ａ）、単球ＣＤ３３＋細胞（Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｃ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ）の個々の絶対細胞数。動物Ｍ１及びＭ２には０．０４μｇ／ｋｇを投与し、Ｍ３及びＭ４には０．４μｇ／ｋｇの本発明によるＩＳＶＤの溶液の単回１時間連続静脈内注入を投与した。
【発明を実施するための形態】
【0058】
５ 本技術の詳細な説明
本技術は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するための新規なタイプの薬物を提供することを目的とする。
本技術は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するための新規なタイプの薬物を提供することを目的とする。
【0059】
本発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上のＣＤ３３及びＣＤ１２３を二重標的化するポリペプチド（又はＩＳＶＤ構築物）が、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体αβ（ＴＣＲαβ）を標的化することと組み合わされて、ＡＭＬ細胞の効果的な殺傷をもたらすことを見出した。殺傷活性は、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＡＭＧ ３３０ ＢｉＴＥ又はＣＤ１２３／ＣＤ３ ＭＧＤ００６ ＤＡＲＴなどの単一標的化ベンチマークに匹敵するか、又はそれよりもさらに高かった。患者内及び患者間試料におけるＡＭＬ細胞上のＣＤ３３及びＣＤ１２３発現の高い不均一性のために、本発明のポリペプチドは、単一標的化ベンチマークと比較してより広い患者範囲を提供する。
【0060】
いくつかの実施形態では、本技術のポリペプチドは効率的に製造され（例えば微生物宿主において）、皮下投与に有利且つ便利な高濃度で低い粘度を示した。さらに、そのようなポリペプチドは、処置される対象における既存の抗体に対する反応性が限られている（すなわち、抗体構築物による第１の処置の前に対象に存在する抗体）。好ましい実施形態では、そのようなポリペプチドは、連続治療が好都合に間隔を空けられるように十分に長い半減期を治療される対象において示す。
【0061】
ポリペプチドは、少なくとも二重特異性であるが、例えば、三重特異性、四重特異性又は五重特異性であってもよい。さらに、ポリペプチドは少なくとも四価であるが、例えば五価又は六価などであってもよい。
【0062】
「二重特異性」、「三重特異性」、「四特異性」又は「五特異性」という用語はすべて「多重特異性」という用語に該当し、それぞれ２、３、４又は５つの異なる標的分子への結合を指す。「二価」、「三価」、「４価」、「５価」又は「６価」という用語はすべて「多価」という用語に該当し、それぞれ２、３、４又は５つの結合単位（ＩＳＶＤなど）の存在を示す。例えば、ポリペプチドは、４つのＩＳＶＤを含むか又は４つのＩＳＶＤからなるポリペプチドなどの四特異性四価であり得、１つのＩＳＶＤはヒトＴＣＲαβに結合し、１つのＩＳＶＤはヒトＣＤ３３に結合し、１つのＩＳＶＤはＣＤ１２３に結合し、１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミン（例えば、配列番号１に示されるＩＳＶＤ構築物）に結合する。例えば、２つのＩＳＶＤが同じ標的上の２つの異なるエピトープに結合する場合、例えば、２つのＩＳＶＤがＴＣＲαβに結合する場合、ポリペプチドは同時に二重特異性であり得る。「バイパラトピック」という用語は、同じ標的分子の２つの異なる部分（例えば、エピトープ）への結合を指す。
【0063】
用語「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などは、本明細書中で使用されるとき、ＩＳＶＤの互いに対する相対的な位置を示すにすぎず、ここで、ナンバリングは、本発明のポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって、「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりもＮ末端に近く、一方、「第２のＩＳＶＤ」は、「第３のＩＳＶＤ」よりもＮ末端に近い。したがって、ＩＳＶＤ配置は、Ｃ末端から考えると逆である。ナンバリングは絶対的なものではなく、少なくとも３つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すにすぎないため、ＴＣＲαβ、ＣＤ３３若しくはＣＤ１２３に結合するさらなるＩＳＶＤ、又は別の標的に結合するＩＳＶＤなどの他の結合単位／構成要素がポリペプチド中に存在し得ることは排除されない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、「（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期延長」の節を参照されたい）、ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに結合する別のＩＳＶＤをさらに含むことができ、このＩＳＶＤは、少なくとも３つのＩＳＶＤのＣ末端に位置する第４のＩＳＶＤであり得る。さらに、ＩＳＶＤなどの他の結合単位／構成要素をその間に配置することができる可能性を排除するものではない。例えば、ポリペプチドは、例えば、「第２のＩＳＶＤ」と「第３のＩＳＶＤ」との間に位置することさえできる別のＩＳＶＤをさらに含むことができる。
【0064】
上記に照らして、本発明は、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むか又はそれからなるポリペプチドであって、少なくとも１つのＩＳＶＤがＴＣＲαβに特異的に結合し、少なくとも１つのＩＳＶＤがＣＤ３３に特異的に結合し、少なくとも１つのＩＳＶＤがＣＤ１２３に特異的に結合するポリペプチドを提供する。
【0065】
ポリペプチドの成分、好ましくはＩＳＶＤは、１つ以上の適切なリンカー、例えばペプチドリンカーによって互いに連結されていてもよい。
【0066】
２つ以上の（ポリ）ペプチドを結合するためのリンカーの使用は、当業界でよく知られている。例示的なペプチドリンカーを表Ａ－５に示す。よく使用されるクラスのペプチドリンカーは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」又は「ＧＳ」リンカーとして知られている。これらは、本質的にグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基からなるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号７７）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを有し、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７又はそれ以上であり得る）などのペプチドモチーフの１つ以上の反復を含む。そのようなＧＳリンカーのいくつかのしばしば使用される例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号８０）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）及び３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔ １５；６５（１０）；１３５７－１３６９及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）；３２５－３３０を参照されたい。本発明のポリペプチドでは、ポリペプチドの成分を互いに連結するための９ＧＳリンカーの使用が好ましい。
【0067】
好ましい実施形態では、ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤは、ポリペプチドのＮ末端に位置する。本発明者らは、驚くべきことに、そのような構成がポリペプチドの製造収率を増加させ得ることを見出した。
【0068】
また、好ましい実施形態において、ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤは、ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤのＣ末端側に位置する。
【0069】
さらにより好ましい実施形態では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤは、ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤに対してＣ末端に配置され、それ自体は、ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤに対してＣ末端に配置される。
【0070】
したがって、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から出発する順序で、以下を含むか、又は以下からなることが好ましい：ＴＣＲαβに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、ＣＤ３３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、及びＣＤ１２３に特異的に結合する第３のＩＳＶＤ、並びに本明細書中で定義されるような増大した半減期を有するポリペプチドを提供する任意の結合単位。増大した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位は、好ましくはＩＳＶＤである。
【0071】
ポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端から出発する順序で、以下を含むか、又は以下からなることがさらにより好ましい：ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー及びヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ。より具体的には、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から出発する順序で、以下を含むか、又は以下からなる：ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤ、９ＧＳリンカー、ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤ、９ＧＳリンカー、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤ、２０ＧＳリンカー、及びヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ。
【0072】
ポリペプチドのそのような構成は、製造収率の増加、良好なＣＭＣ特性、並びに免疫応答の調節に関して最適化された機能性及びより強い効力を提供することができる。
【0073】
好ましくは、本技術のポリペプチドは、ヒト血清中の既存の抗体による結合の減少を示す。この目的のために、一実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ、好ましくは各ＩＳＶＤにおいて、アミノ酸位置１１にバリン（Ｖ）を含み、アミノ酸位置８９にロイシン（Ｌ）を含む（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端ＩＳＶＤのＣ末端に１～５個の（好ましくは天然に存在する）アミノ酸の伸長、例えば単一のアラニン（Ａ）伸長を含む。ＩＳＶＤのＣ末端は、通常、ＶＴＶＳＳ（配列番号９３）である。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤに（Ｋａｂａｔのナンバリングに従って）１１０位にリジン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）を含む。別の実施形態では、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤの（Ｋａｂａｔのナンバリングに従って）１１２位にリジン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）を含む。これらの実施形態では、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号９４）、ＶＱＶＳＳ（配列番号９５）、ＶＴＶＫＳ（配列番号９６）、ＶＴＶＱＳ（配列番号９７）、ＶＫＶＫＳ（配列番号９８）、ＶＫＶＱＳ（配列番号９９）、ＶＱＶＫＳ（配列番号１００）又はＶＱＶＱＳ（配列番号１０１）であり、単一アラニンの付加後、ポリペプチドのＣ末端は、例えば配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１０２）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１０３）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号１０４）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号１０５）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号１０６）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号１０７）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号１０８）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号１０９）又はＶＱＶＱＳＡ（配列番号１１０）、好ましくはＶＴＶＳＳＡ（配列番号１０２）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤのアミノ酸１１位にバリン（Ｖ）及びアミノ酸８９位にロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含み、少なくとも１つのＩＳＶＤの１１０位にリジン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）を含んでいてもよく、（ポリペプチドのＣ末端が、例えば配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１０２）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１０３）又はＶＱＶＳＳＡ（配列番号１０４）、好ましくはＶＴＶＳＳＡ（配列番号１０２）を含むように）Ｃ末端ＩＳＶＤのＣ末端に１個のアラニン（Ａ）伸長などの１～５個（好ましくは天然に存在する）アミノ酸の伸長を含む。この点に関するさらなる情報については、例えば、国際公開第２０１２／１７５７４１号パンフレット及び国際公開第２０１５／１７３３２５号パンフレットを参照されたい。
【0074】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１と９０％超、例えば９５％超又は９９％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなり、４つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ以下のセクション「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期延長」に記載の項目ＡからＤ（又はＫａｂａｔ定義を使用する場合はＡ’からＤ’）で定義される通りであり、特に：
・ ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；及び
・ ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有するか、
又は、Ｋａｂａｔ定義を使用する場合：
・ ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号 ３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；及び
・ ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号 ４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。
・ ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；及び
・ ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有するか、
又は、Ｋａｂａｔ定義を使用する場合：
・ ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号 ３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；
・ ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する；及び
・ ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号 ４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。
【0075】
特に、ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる。最も好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0076】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、ヒトＴＣＲαβ、ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３に対して、少なくとも半分の結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を用いて測定される。
【0077】
５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
「単一可変ドメイン」と互換的に使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）という用語は、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一の免疫グロブリンドメインによって形成される免疫グロブリン分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを「従来の」免疫グロブリン（例えば、モノクローナル抗体）又はそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ）と区別しており、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的に、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合部位に寄与しており、すなわち合計６のＣＤＲが抗原結合部位の形成に関わる。
「単一可変ドメイン」と互換的に使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）という用語は、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一の免疫グロブリンドメインによって形成される免疫グロブリン分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを「従来の」免疫グロブリン（例えば、モノクローナル抗体）又はそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ）と区別しており、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的に、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合部位に寄与しており、すなわち合計６のＣＤＲが抗原結合部位の形成に関わる。
【0078】
上述の定義に鑑み、従来の４鎖抗体（例えば、当業界で知られているＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＥ分子）の、又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ等のＦｖ断片、若しくはｓｃＦｖ断片、又はこのような従来の４鎖抗体から導き出された二重特異性抗体（すべて当業界で知られている）は通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとはみなされず、それは、これらのケースでは、抗原のそれぞれのエピトープへの結合が通常、１つの（単一）免疫グロブリンドメインによってではなく、軽鎖及び重鎖可変ドメイン等の（関連する）免疫グロブリンドメインのペアによって、すなわちそれぞれの抗原のエピトープに共同で結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬペアによって起こるからである。
【0079】
それに対して、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の免疫グロブリン可変ドメインとペアにならずに、抗原のエピトープに特異的に結合できる。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一ＶＨ、単一ＶＨＨ又は単一ＶＬドメインにより形成される。
【0080】
そのため、単一可変ドメインは、それが単一の抗原結合単位（すなわち、基本的に単一可変ドメインからなり、単一抗原結合ドメインが機能的抗原結合単位を形成するために他の可変ドメインと相互作用する必要がない機能的抗原結合単位）を形成できる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ－配列）若しくは適当なその断片、或いは重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ－配列若しくはＶＨＨ配列）又は適当なその断片であり得る。
【0081】
免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は例えば、重鎖ＩＳＶＤ、例えばラクダ化ＶＨ又はヒト化ＶＨＨを含むＶＨ，ＶＨＨとすることができる。好ましくは、これはラクダ化ＶＨ又はヒト化ＶＨＨを含むＶＨＨである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体から、又は重鎖抗体から得ることができる。
【0082】
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又はｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）（本明細書で定義されるように、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤを含むが、これに限定されない）；他の単一可変ドメイン、又はそれらのいずれか１つの任意の適切な断片であってもよい。
【0083】
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化ＶＨＨ若しくはラクダ化ＶＨ又はその適切な断片を含むＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤであり得る。［注：ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）、ＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳ（登録商標）及びＮＡＮＯＣＬＯＮＥ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である］
【0084】
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶＨＨ抗原断片、及びＶＨＨ抗体としても知られ、もともと、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を持たない抗体」；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３））の抗原結合免疫グロブリン可変ドメインとして説明されていた。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と呼ばれる）から、及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するために選択されている。ＶＨＨのさらなる説明については、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説論文（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２，２００１の総説）、並びに一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願を参照されたい：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット及び国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Ｕｎｉｌｅｖｅｒの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．及びＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット。カナダ国家研究会議（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）による国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；抗体協会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）による国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット。
【0085】
典型的には、免疫グロブリンの作製は、実験動物の免疫化、ハイブリドーマを作製するための免疫グロブリン産生細胞の融合、及び所望の特異性についてのスクリーニングを含む。或いは、免疫グロブリンは、ナイーブ又は合成ライブラリーのスクリーニングによって、例えばファージディスプレイによって作製することができる。
【0086】
ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤなどの免疫グロブリン配列の作製は、国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９３及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００１（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２，２００１）に広く記載されている。これらの方法においてラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄｓ）はターゲット抗原で免疫化され、前記ターゲット抗原に対する免疫反応が引き起こされる。前記免疫化から得られたＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤのレパートリーを、標的抗原に結合するＩＳＶＤについてさらにスクリーニングする。
【0087】
これらの例では、抗体の生成には免疫化及び／又はスクリーニングのために精製された抗原が必要である。抗原は天然由来のものから、又は組換え産生の過程で精製し得る。
【0088】
免疫グロブリン配列のための免疫化及び／又はスクリーニングは、このような光源のペプチド断片を使って行うことができる。
【0089】
本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト及びラクダ科の免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列を使用し得る。本発明はまた、完全ヒト配列、ヒト化配列又はキメラ配列を含む。例えば、本発明は、ラクダ免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、又はラクダ化ドメイン抗体、例えばＷａｒｄ ｅｔ ａｌ（例えば国際公開第９４／０４６７８号パンフレット及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．，３３９：２８５－２９０，１９９４及びＰｒｏｔ．９：５３１－５３７，１９９６）によって記載されるラクダ化ｄＡｂを含む。さらに、本発明はまた、融合された免疫グロブリン配列を使用し、例えば、多価及び／又は多重特異性構築物の形成（１つ以上のＶＨＨドメインを含有する多価及び多重特異性ポリペプチド及びそれらの調製については、Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６．１０．７３４６～７３５０、２００１、並びに例えば国際公開第９６／３４１０３号パンフレット及び国際公開第９９／２３２２１号パンフレットを参照）、並びに本発明の免疫グロブリン配列から誘導可能なタグ又は他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む免疫グロブリン配列を使用する。
【0090】
「ヒト化ＶＨＨ」は、天然に発生するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」された、すなわち前記天然に発生するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中（及び特にフレームワーク配列中）の１つ以上のアミノ酸残基を人間の従来の４鎖抗体からのＶＨドメイン内の対応する位置において生じるアミノ酸残基の１つ以上（例えば、前述の通り）と置換されたアミノ酸配列を含む。これ自体は公知の方法で行うことができ、これは、例えば、本明細書のさらなる説明及び従来技術（例えば、国際公開第２００８／０２００７９号パンフレット）に基づいて当業者には明らかであろう。再び、このようなヒト化ＶＨＨはそれ自体知られているいずれの伝統的な方法でも取得でき、それゆえ開始材料として天然に発生するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使って取得されたポリペプチドには厳格に限定されないことに留意すべきである。
【0091】
「ラクダ化ＶＨ」は、天然に発生するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち従来の４鎖抗体からの天然に発生するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置において生じるアミノ酸残基の１つ以上と置換されているアミノ酸配列を含む。これ自体は公知の方法で行うことができ、これは、例えば、本明細書のさらなる説明及び従来技術（例えば、国際公開第２００８／０２００７９号パンフレット）に基づいて当業者には明らかであろう。このような「ラクダ化」置換は、好ましくは本明細書において定義されているように、ＶＨ－ＶＬ界面及び／又はいわゆるラクダ科動物（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）ホールマーク残基を形成する、及び／又はそこに存在するアミノ酸の位置に挿入される（例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットと、前述のＤａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４及び１９９６）参照）。好ましくは、ラクダ化ＶＨを生成又は設計するための開始材料又は開始点として使用されるＶＨ配列は、哺乳動物由来のＶＨ配列、例えば人間由来のＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。しかしながら、このようなラクダ化ＶＨは、それ自体知られているいずれの適当な方法でも取得でき、それゆえ開始材料として天然に発生するＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドには厳格に限定されないことに留意すべきである。
【0092】
１つ以上の免疫グロブリン配列を互いに及び／又は他のアミノ酸配列に（例えばジスルフィド架橋を介して）連結して、本発明においても有用であり得るペプチド構築物（例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ構築物「ダイアボディ」及び他の多重特異性構築物）を提供し得ることに留意すべきである。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎによる総説、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６－３６））を参照されたい。一般に、ポリペプチドが対象への（例えば、予防、治療及び／又は診断目的のための）投与を意図する場合、ポリペプチドは好ましくは前記対象に天然には存在しない免疫グロブリン配列を含む。
【0093】
免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の好ましい構造は、４つのフレームワーク領域（「ＦＲｓ」）からなると考えることができ、これらは、当業界及び本明細書において、それぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）、「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）、「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）、「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）と呼ばれ、これらのフレームワーク領域は３つの「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）により中断され、これらは当業界及び本明細書において、それぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）、「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）、及び「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）と呼ばれる。
【0094】
国際公開第０８／０２００７９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の５８頁及び５９頁の段落ｑ）にさらに記載されるように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、ＶＨドメインの、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって与えられる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００の記事におけるラクダ科動物（Ｃａｍｅｌｉｄｓ）からのＶＨＨドメインに適用された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１－２）：１８５～１９５；例えば、この資料の図２を参照のこと）一般的なナンバリングに従ってナンバリングすることができる。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当技術分野で周知であるように、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変動し得、Ｋａｂａｔナンバリング（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングに従う１つ以上の位置が実際の配列に占有されていなくてもよく、又は実際の配列がＫａｂａｔナンバリングによって許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含み得る）によって示されるアミノ酸残基の総数に対応し得ないことに留意すべきである。これは、一般に、Ｋａｂａｔによるナンバリングは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応してもしなくてもよいことを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は通常、１１０～１２０の範囲、多くの場合、１１２～１１５であろう。しかしながら、これより短い、及び長い配列もまた、本明細書に記載の目的のために適当であり得ることに留意すべきである。
【0095】
本出願では、特に指示しない限り、ＣＤＲ配列は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（Ｅｄｓ．２０１０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ ２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐｐ．３３－５１）によって記載されるＡｂＭナンバリングによって決定された。この方法によれば、ＦＲ１は１～２５位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は２６～３５位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は３６～４９位のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は５０～５８位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は５９～９４位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。
【0096】
ＣＤＲ領域の決定は、異なる方法に従って行うこともできる。ＫａｂａｔによるＣＤＲ決定では、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は１～３０位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は３１～３５位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は３６～４９位のアミノ酸を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は５０～６５位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は６６～９４位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。
【0097】
このような免疫グロブリン配列において、フレームワーク領域はいずれの適当なフレームワーク領配列であってもよく、適当なフレームワーク配列の例は、当業者にとっては、例えば標準的ハンドブック及び本明細書に記載のさらなる開示及び先行技術に基づき、明らかであろう。
【0098】
フレームワーク配列は、好ましくは免疫グロブリンフレームワーク配列又は免疫グロブリンフレームワーク配列から（例えば、ヒト化又はラクダ化によって）導き出されたフレームワーク配列（の適当な組合せ）である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ－配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ－配列又はＶＨＨ配列）から導き出されるフレームワーク配列であり得る。１つの特定の好ましい態様において、フレームワーク配列は、ＶＨＨ－配列から導き出されたフレームワーク配列（その中では前記フレームワーク配列は場合により部分的又は完全にヒト化されている）か、又はラクダ化された（本明細書中で定義）従来のＶＨ配列のいずれかである。
【0099】
特に、本発明で使用されるＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、ＩＳＶＤ配列がヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨを含むＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）免疫グロブリン可変ドメインであるように、１つ以上のホールマーク残基（本明細書で定義される）を含み得る。そのようなフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）のいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書のさらなる開示から明らかになるであろう。
【0100】
ここでも、免疫グロブリン配列について本明細書中に一般的に記載されるように、前述のいずれかの適切な断片（又は断片の組み合わせ）、例えば、１つ以上のＣＤＲ配列を含み、適切には１つ以上のフレームワーク配列に隣接し、且つ／又は１つ以上のフレームワーク配列を介して連結される断片（例えば、これらのＣＤＲ及びフレームワーク配列と同じ順序で、断片が由来するフルサイズの免疫グロブリン配列に存在してもよい）を使用することも可能である。
【0101】
しかしながら、本発明は、ＩＳＶＤ配列（又はそれを発現するために使用されるヌクレオチド配列）の起源に関して限定されず、ＩＳＶＤ配列又はヌクレオチド配列が生成又は取得される（或いは生成又は取得されてきた）方法に関しても限定されないことに留意されたい。それゆえ、ＩＳＶＤ配列は天然に発生する配列（いずれかの適当な種から）でも、合成若しくは半合成配列でもよい。特定の、ただし非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は天然に発生する配列（いずれかの適当な種から）又は、合成若しくは半合成配列であり、これには「ヒト化」（本明細書中で定義）免疫グロブリン配列（例えば部分的又は完全にヒト化されたマウス又はウサギ免疫グロブリン配列、及び特に部分的又は完全にヒト化されたＶＨＨ配列）、「ラクダ化」（本明細書中で定義）免疫グロブリン配列のほか、親和性成熟（例えば、合成、ランダム、又は天然に発生する免疫グロブリン配列から開始）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列から導き出された断片の結合、オーバラッププライマを使用したＰＣＲアセンブリ、及びこれらと同様の、当業者の間でよく知られている免疫グロブリン配列エンジニアリング技術等の手法により得られた免疫グロブリン配列、又は前述のいずれかのあらゆる適当な組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0102】
同様に、ヌクレオチド配列は天然に発生するヌクレオチド配列又は合成若しくは半合成配列であり得、例えば、ＰＣＲにより適当な天然に発生する鋳型から単離された配列（例えば、細胞から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ）、ライブラリ（及び特に表現ライブラリ）から単離されたヌクレオチド配列、天然に発生するヌクレオチド配列への（ミスマッチＰＣＲ等の、それ自体知られた適当ないずれかの技術を用いた）変異導入により調製されたヌクレオチド配列、オーバラッププライマを使ってＰＣＲにより調製されたヌクレオチド配列、又はそれ自体知られたＤＮＡ合成技術を使って調製されたヌクレオチド配列であり得る。
【0103】
上述のように、ＩＳＶＤは、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標） ＶＨＨ又はその適切な断片であり得る。ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤの一般的な説明については、以下のさらなる説明、及び本明細書で引用される先行技術を参照されたい。しかしながら、この点に関して、この説明及び従来技術は、いわゆる「ＶＨ３クラス」（すなわち、ＶＨ３クラスのヒト生殖系列配列（ＤＰ－４７、ＤＰ－５１又はＤＰ－２９など）に対して高度の配列相同性を有するＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ）のＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤを主に説明していることに留意されたい。しかしながら、本発明は、その最も広い意味で、一般に、任意のタイプのＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤを使用することができ、例えば、国際公開第２００７／１１８６７０号パンフレットに記載されているように、例えば、いわゆる「ＶＨ４クラス」（すなわち、ＤＰ－７８などのＶＨ４クラスのヒト生殖系列配列に対して高度の配列相同性を有するＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ）に属するＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤも使用することに留意されたい。
【0104】
一般に、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ（特に、（部分的に）ヒト化されたＶＨＨ配列及びラクダ化されたＶＨ配列を含むＶＨＨ配列）は、１つ以上のフレームワーク配列（本明細書に記載の通り）の中の１つ以上の「ホールマーク残基」（同じく本明細書にさらに記載の通り）の存在により特徴付けることができる。それゆえ、一般に、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤは下記の（一般的）構造を有する免疫グロブリン配列として定義できる：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、ホールマーク残基の１つ以上は本明細書中でさらに定義される通りである。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、ホールマーク残基の１つ以上は本明細書中でさらに定義される通りである。
【0105】
具体的に、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤは下記の（一般的）構造を有する免疫グロブリン配列とすることができ：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は本明細書中でさらに定義される通りである。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は本明細書中でさらに定義される通りである。
【0106】
より具体的には、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤは下記の（一般的）構造を有する免疫グロブリン配列とすることができ：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、
Ｋａｂａｔナンバリングによる１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、１０８位におけるアミノ酸残基の１つ以上は、下の表１に記されるホールマーク残基から選択される。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、
Ｋａｂａｔナンバリングによる１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、１０８位におけるアミノ酸残基の１つ以上は、下の表１に記されるホールマーク残基から選択される。
【0107】
【表1】
【0108】
【表2】
【0109】
本技術は、とりわけ、ＴＣＲαβ、ＣＤ３３又はＣＤ１２３に特異的に結合することができるＩＳＶＤを使用する。本技術の文脈において、特定の標的分子「結合」は、抗体及びそれらのそれぞれの抗原の文脈において理解されるような当技術分野における通常の意味を有する。
【0110】
本技術のポリペプチドは、ＴＣＲαβに特異的に結合する１つ以上のＩＳＶＤ、ＣＤ３３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶＤ、及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶＤを含み得る。
【0111】
本技術において使用されるＩＳＶＤは、ポリペプチドがＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３に特異的に結合することができるように、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むか又はそれからなる本技術のポリペプチドの一部を形成する。それにより、ポリペプチドは、ＣＤ３３＋ＣＤ１２３＋白血病幹細胞（ＬＳＣ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球上に固定することができ、同時に細胞傷害性Ｔ細胞上のＴＣＲαβに結合することができる。このようにして、ポリペプチドは、Ｔ細胞をＬＳＣ及びＡＭＬ芽球に近接させる。腫瘍細胞上の腫瘍抗原（ＣＤ３３及びＣＤ１２３）へのポリペプチドの複数の結合及び単一Ｔ細胞上のＴＣＲ分子への同時結合は、ＴＣＲクラスター形成及び最終的にはＴ細胞活性化をもたらす。ＬＳＣ及びＡＭＬ芽球に近接したＴ細胞の活性化は、ＡＭＬ患者において効率的な腫瘍細胞の死滅をもたらし、結果として治療効果をもたらし得る。
【0112】
したがって、本技術のポリペプチドにおいて使用される少なくとも３つのＩＳＶＤの標的分子は、ＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３である。例は、哺乳動物のＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＴＣＲαβである。ヒトＴＣＲαβ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション）、ヒトＣＤ３３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション）及びヒトＣＤ１２３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション）が好ましいが、他の種由来のバージョン、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル（本明細書中では「ｃｙｎｏ」とも称する）、又はラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄｓ）、例えばラマ若しくはアルパカ由来のＴＣＲαβ、ＣＤ３３及びＣＤ１２３も本技術に適している。
【0113】
本技術で使用できるＴＣＲαβ、ＣＤ１２３及びＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤの具体例は、下記Ａ～Ｃに記載の通りである：
Ａ．ヒトＴＣＲαβに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１４と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
Ａ．ヒトＴＣＲαβに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１４と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0114】
ヒトＴＣＲαβに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ａで定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２のＴＣＲαβ－ＶＨＨについて示される１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、ＴＣＲαβ－ＶＨＨ（配列番号２、表Ａ－１及びＡ－２参照）の完全アミノ酸配列を有するＩＳＶＤである。
【0115】
また、好ましい実施形態では、ヒトＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％超、例えば９５％超又は９９％超の配列同一性を有していてもよく、任意でＣＤＲは前項目Ａで定義された通りである。特に、ＴＣＲαβに特異的に結合するＩＳＶＤは、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【0116】
ＴＣＲαβに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記項目Ａ）に対して少なくとも１つのＣＤＲに２つ又は１つのアミノ酸差を有する場合、ＩＳＶＤは、好ましくは、ＴＣＲαβ－ＶＨＨ（配列番号２）と同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される、ヒトＴＣＲαβに対する結合親和性の少なくとも半分、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有する。
【0117】
Ｂ．ヒトＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0118】
ヒトＣＤ３３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ｂで定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２のＣＤ３３－ＶＨＨについて示されるような１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、ＣＤ３３－ＶＨＨ（配列番号３、表Ａ－１及びＡ－２参照）の完全アミノ酸配列を有するＩＳＶＤである。
【0119】
また、好ましい実施形態では、ヒトＣＤ３３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％超、例えば９５％超又は９９％超の配列同一性を有し得、場合によりＣＤＲは前の項目Ｂで定義された通りである。特に、ＣＤ３３に結合するＩＳＶＤは、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【0120】
ＣＤ３３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列に対して少なくとも１つのＣＤＲに２個又は１個のアミノ酸差を有する場合（上記項目Ｂ）、ＩＳＶＤは、好ましくは、構築物ＣＤ３３－ＶＨＨ（配列番号３）と同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される、ヒトＣＤ３３に対する結合親和性の少なくとも半分、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有する。
【0121】
Ｃ．ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１２と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１６と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１２と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１６と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＩＳＶＤ。
【0122】
ヒトＣＤ１２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ｃで定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２のＣＤ１２３－ＶＨＨについて示されるような１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、ＣＤ１２３－ＶＨＨ（配列番号４、表Ａ－１及びＡ－２参照）の完全アミノ酸配列を有するＩＳＶＤである。
【0123】
また、好ましい実施形態では、ヒトＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％超、例えば９５％超又は９９％超の配列同一性を有し得、場合によりＣＤＲは前の項目Ｃで定義された通りである。特に、ＣＤ１２３に結合するＩＳＶＤは、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【0124】
ＣＤ１２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列に対して少なくとも１つのＣＤＲに２つ又は１つのアミノ酸差を有する場合（上記項目Ｃ）、ＩＳＶＤは、好ましくは、ＣＤ１２３－ＶＨＨ（配列番号４）と同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される、ヒトＣＤ１２３に対する結合親和性の少なくとも半分、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有する。
【0125】
好ましくは、上記項目Ａ～Ｃの下で定義されるＩＳＶＤの各々は、本発明のポリペプチドに含まれる。上記項目Ａ～Ｃで定義されたＩＳＶＤの各々を含む本発明のそのようなポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドとしてのヒトＴＣＲαβ、ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３に対する結合親和性の少なくとも半分、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
【0126】
上記項目Ａ～Ｃで言及される配列番号は、ＡｂＭの定義によるＣＤＲの定義に基づいている（表Ａ－２参照）。Ｋａｂａｔの定義（表Ａ－２．１を参照）による同じＣＤＲを定義する配列番号は、上記項目Ａ～Ｃにおいて同様に使用することができることに留意されたい。
【0127】
したがって、ＡｂＭの定義を使用して上記のような本発明において使用することができるＴＣＲαβ、ＣＤ３３又はＣＤ１２３に特異的に結合する特定のＩＳＶＤはまた、下記の項目Ａ’～Ｃ’に示されるようなＫａｂａｔの定義を使用して記載することができる：
Ａ’．ヒトＴＣＲαβに特異的に結合し、
ｉ．配列番号３４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３４と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３８と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４２と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
Ａ’．ヒトＴＣＲαβに特異的に結合し、
ｉ．配列番号３４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３４と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３８と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４２と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0128】
ヒトＴＣＲαβに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ａ’で定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１のＴＣＲαβ－ＶＨＨについて示される１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、ＴＣＲαβ－ＶＨＨ（配列番号２、表Ａ－１及びＡ－２．１参照）の完全アミノ酸配列を有するＩＳＶＤである。
【0129】
Ｂ’．ヒトＣＤ３３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３５と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３９と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４３と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号３５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３５と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号３９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３９と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４３と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0130】
ヒトＣＤ３３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ｂで定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１のＣＤ３３－ＶＨＨについて示される１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、ＣＤ３３－ＶＨＨ（配列番号３、表Ａ－１及びＡ－２．１参照）の完全アミノ酸配列を有するＩＳＶＤである。
【0131】
Ｃ’．ヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３６と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４０と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４４と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号３６のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３６と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４０と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４４と２若しくは１つのアミノ酸差を有するＣＤＲ３、
好ましくは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0132】
ヒトＣＤ１２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ｃで定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１のＣＤ１２３－ＶＨＨについて示される１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、ＣＤ１２３－ＶＨＨ（配列番号４、表Ａ－１及びＡ－２．１参照）の完全アミノ酸配列を有するＩＳＶＤである。
【0133】
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」の百分率は、［第１のアミノ酸配列における、第２のアミノ酸配列の対応する位置のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数］で除し、［１００％］を乗じることによって計算することができ、ここで、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換又は付加は、第１のアミノ酸配列と比較して、単一のアミノ酸残基における（すなわち、単一の位置における）差異と見なされる。
【0134】
通常、上に概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最も多数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１」のアミノ酸配列と見なし、他のアミノ酸配列を「第２」のアミノ酸配列と見なす。
【0135】
本明細書で使用される「アミノ酸差異」は、参照配列に対する単一のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を指し、好ましくは置換である。
【0136】
アミノ酸置換は、好ましくは保存的置換である。そのような保存的置換は、好ましくは、以下の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基によって置換される置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；（ｂ）極性、負に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；（ｃ）極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；及び（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【0137】
特に好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙ又はＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａ又はＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；及び／又はＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕ。
【0138】
５．２ 特異性
「特異性」、「特異的に結合する」又は「特異的結合」という用語は、ＩＳＶＤなどの特定の結合単位が十分に高い親和性で結合することができる同じ生物由来の抗原などの異なる標的分子の数を指す（以下を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、本明細書では「選択性」、「選択的に結合する」又は「選択的結合」と互換的に使用される。ＩＳＶＤなどの結合単位は、好ましくはそれらの指定された標的に特異的に結合する。
「特異性」、「特異的に結合する」又は「特異的結合」という用語は、ＩＳＶＤなどの特定の結合単位が十分に高い親和性で結合することができる同じ生物由来の抗原などの異なる標的分子の数を指す（以下を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、本明細書では「選択性」、「選択的に結合する」又は「選択的結合」と互換的に使用される。ＩＳＶＤなどの結合単位は、好ましくはそれらの指定された標的に特異的に結合する。
【0139】
結合単位の特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は、分子相互作用の強度又は安定性を示す。親和性は、一般に、ｍｏｌ／ｌ（又はＭ）の単位を含むＫＤ又は解離定数によって与えられる。親和性は、会合定数ＫＡとして表すこともでき、ＫＡは、１／ＫＤに等しく、（ｍｏｌ／ｌ）－１（又はＭ－１）の単位を有する。
【0140】
親和性は、標的分子上の部分と結合部位との間の結合強度の尺度である。ＫＤの値が小さいほど、標的分子と標的化部分との間の結合強度が強くなる。
【0141】
典型的には、本技術で使用される結合単位（ＩＳＶＤなど）は、１０－５～１０－１２ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０－７～１０－１２ｍｏｌ／ｌ以下、より好ましくは１０－８～１０－１２ｍｏｌ／ｌ（すなわち、会合定数（ＫＡ）が１０５～１０１２ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは１０７～１０１２ｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは１０８～１０１２ｌ／ｍｏｌ）の解離定数（ＫＤ）でそれらの標的に結合する。
【0142】
１０－４ｍｏｌ／ｌを超える任意のＫＤ値（又は１０４ｌ／ｍｏｌ未満の任意のＫＡ値）は、一般に非特異的結合を示すと考えられる。
【0143】
特異的であると考えられる、抗原への免疫グロブリン配列の結合などの生物学的相互作用のＫＤは、典型的には１０－５ｍｏｌ／ｌ（１００００ｎＭ又は１０μＭ）～１０－１２ｍｏｌ／ｌ（０．００１ｎＭ又は１ｐＭ）以下の範囲である。
【0144】
したがって、特異的／選択的結合は、－同じ測定方法、例えばＳＰＲを使用して－結合単位（又はそれを含むポリペプチド）が、１０－５～１０－１２ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値でＴＣＲαβ、ＣＤ３３及び／又はＣＤ１２３に結合し、１０－４ｍｏｌ／ｌを超えるＫＤ値で関連する標的に結合することを意味し得る。
【0145】
したがって、本技術のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較して、ヒトＴＣＲαβ、ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３に対して、少なくとも半分の結合親和性、より好ましくは少なくとも同じ結合親和性を有し、ここで、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を用いて測定される。
【0146】
特定の種からの特定の標的への特異的結合は、結合単位が異なる種からの類似の標的にも特異的に結合することができることを排除しない。例えば、ヒトＴＣＲαβへの特異的結合は、結合単位（又はそれを含むポリペプチド）がカニクイザル由来のＴＣＲαβにも特異的に結合できることを排除するものではない。同様に、例えば、ヒトＣＤ３３又はＣＤ１２３への特異的結合は、結合単位（又はそれを含むポリペプチド）がカニクイザル（「ｃｙｎｏ」）由来のＣＤ３３又はＣＤ１２３にも特異的に結合することができることを排除しない。
【0147】
指定された標的への結合単位の特異的結合は、例えばスキャッチャード解析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ、並びに当技術分野でそれ自体公知のそれらの様々なバリアントを含む、それ自体公知の任意の適切な方法；並びに本明細書で言及される他の技術で決定することができる。
【0148】
解離定数は、当業者には明らかなように、実際の解離定数又は見かけの解離定数であり得る。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えば、以下に述べる技術を含む。この点で、１０－４ｍｏｌ／ｌ又は１０－３ｍｏｌ／ｌ（例えば、１０－２ｍｏｌ／ｌ）を超える解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかであろう。場合により、当業者には明らかであるように、（実際の又は見かけの）解離定数は、（実際の又は見かけの）会合定数（ＫＡ）に基づいて、関係［ＫＤ＝１／ＫＡ］によって計算し得る。
【0149】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術（例えば、Ｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１５５１－１５５９を参照されたい）。本明細書で使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの生物特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、一方の分子はバイオセンサーチップ上に固定化され、他方の分子はフロー条件下で固定化された分子上を通過して、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、したがってＫＤ（又はＫＡ）値をもたらす。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して実行することができる。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３，Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６）、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５－１３１）、及び Ｊｏｈｎｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８－２７７）を参照されたい。
【0150】
生体分子相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．２００８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９－２１７を参照されたい）。本明細書で使用される「バイオレイヤー干渉法」又は「ＢＬＩ」という用語は、２つの表面から反射された光の干渉パターンを分析する無標識光学技術を指す。内部参照層（参照ビーム）と、バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質の層（信号ビーム）とを含む。バイオセンサーの先端に結合した分子の数の変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される干渉パターンのシフトを引き起こし、その大きさは、バイオセンサーの先端表面に結合した分子の数の直接的な尺度である。相互作用はリアルタイムで測定することができるので、会合速度及び解離速度並びに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＵＳＡの一部門であるＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行うことができる。
【0151】
或いは、親和性は、速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）（例えば、Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．２００４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２８：３５－４３を参照のこと）で、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ，Ｂｏｉｓｅ，ＵＳＡ）を使用して測定することができる。本明細書で使用される「ＫｉｎＥｘＡ」という用語は、未修飾分子の真の平衡結合親和性及び速度論を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡溶液を、抗原（又は抗体）でプレコートしたビーズが入ったカラムに通し、遊離抗体（又は抗原）を被覆分子に結合させる。このように捕捉された抗体（又は抗原）の検出は、抗体（又は抗原）に結合する蛍光標識タンパク質を用いて達成される。
【0152】
ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）免疫アッセイシステムは、自動化された生物分析及び迅速な試料ターンアラウンドのためのプラットフォームを提供する（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５：１７６５－７４）。
【0153】
５．３（Ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期の延長
ポリペプチドは、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含んでいてもよく、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して、増大した（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期を有するポリペプチドを提供する。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長は、例えば、ポリペプチドが、投与後にヒト対象などの哺乳動物において増大した半減期を有することを意味する。半減期は、例えばｔ１／２ベータとして表すことができる。
ポリペプチドは、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含んでいてもよく、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して、増大した（ｉｎ ｖｉｖｏ）半減期を有するポリペプチドを提供する。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長は、例えば、ポリペプチドが、投与後にヒト対象などの哺乳動物において増大した半減期を有することを意味する。半減期は、例えばｔ１／２ベータとして表すことができる。
【0154】
基、残基、部分又は結合単位の種類は一般に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質に結合することができる小タンパク質又はペプチドからなる群から選択され得る。
【0155】
より具体的には、ポリペプチドに増大した半減期を提供する前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン又はＩｇＧなどの血清免疫グロブリンに結合することができる結合単位からなる群から選択することができ、好ましくはヒト血清アルブミンに結合することができる結合単位である。結合単位は、好ましくはＩＳＶＤである。
【0156】
例えば、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレットは、血清アルブミンに結合する（特にヒト血清アルブミンに結合する）ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤを記載しており、これは、前記タンパク質の半減期を増加させるために、他のタンパク質（所望の標的に結合する１つ以上の他のＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤなど）に連結することができる。
【0157】
国際出願である国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットには、（ヒト）血清アルブミンに対するいくつかのＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤが記載されている。これらのＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤには、Ａｌｂ－１（国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットの配列番号５２）と呼ばれるＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ、及びＡｌｂ－８（国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットの配列番号６２）などのそのヒト化バリアントが含まれる。ここでも、これらを使用して、治療用タンパク質及びポリペプチド並びに他の治療用実体又は部分の半減期を延長することができる。
【0158】
さらに、国際公開第２０１２／１７５４００号パンフレットには、Ａｌｂ－２３と呼ばれるＡｌｂ－１のさらに改良されたバージョンが記載されている。
【0159】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、国際公開第２０１２／１７５４００号パンフレットの７～９頁に示されるように、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０及びＡｌｂ－２３、好ましくはＡｌｂ－８又はＡｌｂ－２３又はそのバリアント、並びに国際公開第２０１２／１７５７４１号パンフレット、国際公開第２０１５／１７３３２５号パンフレット、国際公開第２０１７／０８０８５０号パンフレット、国際公開第２０１７／０８５１７２号パンフレット、国際公開第２０１８／１０４４４４号パンフレット、国際公開第２０１８／１３４２３５号パンフレット、国際公開第２０１８／１３４２３４号パンフレットに記載されるアルブミン結合剤から選択される血清アルブミン結合部分を含む。いくつかの好ましい血清アルブミン結合剤も表Ａ－４に示す。本技術のポリペプチドの特に好ましいさらなる成分は、項目Ｃに記載の通りである。
【0160】
Ｃ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３；
好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号９と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号１３と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号１７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３；
好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0161】
ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ｃで定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２の構築物ＡＬＢ２３００２について示される１つ以上の（好ましくはすべての）フレームワーク領域を有し、最も好ましくは、構築物ＡＬＢ２３００２の完全アミノ酸配列を含むＩＳＶＤである（配列番号５、表Ａ－１及びＡ－２参照）。
【0162】
項目Ｃは、以下のようにＫａｂａｔの定義を使用して説明することもできる。
【0163】
Ｃ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号３７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号４１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号４５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３；
好ましくは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、又は配列番号３７と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、又は配列番号４１と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、又は配列番号４５と２若しくは１個のアミノ酸差を有するＣＤＲ３；
好ましくは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＩＳＶＤ。
【0164】
ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤの好ましい例は、（前の項目Ｃ’で定義されたＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１の構築物ＡＬＢ２３００２について示される１つ以上、好ましくはすべてのフレームワーク領域を有し、最も好ましくは、構築物ＡＬＢ２３００２の完全アミノ酸配列を含むＩＳＶＤである（配列番号５、表Ａ－１及びＡ－２．１参照）。
【0165】
また好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％超、例えば９５％超又は９９％超の配列同一性を有し得、場合によりＣＤＲは前の項目Ｃで定義された通りである。特に、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【0166】
ヒト血清アルブミンに対するそのようなＩＳＶＤ結合が、対応する参照ＣＤＲ配列（上記項目Ｃ） 比較して少なくとも１つのＣＤＲに２つ又は１つのアミノ酸差を有する場合、ＩＳＶＤは、配列番号５に示される構築物ＡＬＢ２３００２と少なくとも半分の結合親和性、好ましくは少なくとも同じ結合親和性をヒト血清アルブミンに対して有し、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。
【0167】
好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンへのそのようなＩＳＶＤ結合がＣ末端位置を有する場合、それはＣ末端アラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ）伸長を示し、好ましくは配列番号６４、６５、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４及び７５から選択される（以下の表Ａ－４参照）。ヒト血清アルブミンへのＩＳＶＤ結合が、Ｃ末端位置（すなわち、本技術のポリペプチドのＣ末端ＩＳＶＤではない）以外の位置を含み、配列番号５、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６及び配列番号６８から選択される場合（下記の表Ａ－４を参照のこと）。
【0168】
５．４ 核酸分子
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。
【0169】
「核酸分子」（「核酸」と互換的に使用される）は、リン酸骨格を介して互いに連結されてヌクレオチド配列を形成するヌクレオチドモノマーの鎖である。核酸は、例えばポリペプチドの発現及び／又は産生のために、宿主細胞又は宿主生物を形質転換／トランスフェクトするために使用され得る。産生目的に適した宿主又は宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物の細胞若しくは細胞株又は任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物であり得る。本技術のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主又は宿主細胞も本技術に包含される。
【0170】
核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのハイブリッドであり得、ＰＮＡのような（例えば、化学的に）修飾ヌクレオチドも含み得る。これは一本鎖又は二本鎖であり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本技術のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡであり得る。
【0171】
本技術の核酸は、それ自体公知の方法で調製又は取得することができ、及び／又は適切な天然源から単離することができる。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列変異を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供するために、部位特異的突然変異誘発に供することができる。また、当業者には明らかなように、核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば標的化部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列及び例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸も適切な方法で一緒に連結することができる。
【0172】
核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、例えば、限定されないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的突然変異誘発；２つ以上の天然に存在する配列及び／又は合成配列（又はその２つ以上の部分）を組み合わせること、切断型発現産物の発現をもたらす突然変異の導入；１つ以上の制限部位（例えば、適切な制限酵素を使用して容易に消化及び／又は連結することができるカセット及び／又は領域を作製するために）の導入、及び／又は１つ以上の「不一致」プライマーを使用したＰＣＲ反応による突然変異の導入を含み得る。
【0173】
５．５ ベクター
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を細胞に運ぶのに適したビヒクルである。ベクターは、プラスミド若しくはｍＲＮＡなどの裸の核酸、又はリポソーム若しくはウイルスベクターなどのより大きな構造に組み込まれた核酸を含む。
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を細胞に運ぶのに適したビヒクルである。ベクターは、プラスミド若しくはｍＲＮＡなどの裸の核酸、又はリポソーム若しくはウイルスベクターなどのより大きな構造に組み込まれた核酸を含む。
【0174】
ベクターは、一般に、１つ以上の調節エレメント（例えば、１つ又はそれを超える適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）に場合により連結される少なくとも１つの核酸を含む。ベクターは、好ましくは発現ベクター、すなわち、コードされたポリペプチド又は構築物を適切な条件下で、例えばベクターが（例えば、ヒト）細胞に導入された場合に発現させるのに適したベクターである。ＤＮＡベースのベクターの場合、これは通常、転写（例えばプロモーター及びポリＡシグナル）及び翻訳（例えば、コザック配列）のためのエレメントの存在を含む。
【0175】
好ましくは、ベクターにおいて、前記少なくとも１つの核酸及び前記調節エレメントは、互いに「作動可能に連結される」であり、これは、一般に、それらが互いに機能的関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写及び／又は発現を開始又は他の方法で制御／調節することができる場合、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられる（ここで、前記コード配列は、前記プロモーター「の管理下」であると理解されるべきである）。一般に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結されている場合、それらは同じ向きにあり、通常は同じ読み枠にもある。それらは通常、本質的に連続しているが、これもまた必要ではない場合がある。
【0176】
好ましくは、ベクターの任意の調節エレメントは、それらが意図される宿主細胞又は宿主生物においてそれらの意図される生物学的機能を提供することができるようなものである。
【0177】
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、意図された宿主細胞又は宿主生物において「操作可能」でなければならず、これは、例えば、前記プロモーターが、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列、例えばコード配列の転写及び／又は発現を開始又は他の方法で制御／調節することができなければならないことを意味する。
【0178】
５．６ 組成物
本技術はまた、本技術の少なくとも１つのポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、又はそのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物を提供する。組成物は医薬組成物であり得る。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含んでいてもよく、１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含んでいてもよい。
本技術はまた、本技術の少なくとも１つのポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、又はそのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物を提供する。組成物は医薬組成物であり得る。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含んでいてもよく、１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含んでいてもよい。
【0179】
５．７ 宿主生物
本技術はまた、本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸、及び／又は本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞又は宿主生物に関する。
本技術はまた、本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸、及び／又は本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞又は宿主生物に関する。
【0180】
適切な宿主細胞又は宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物の細胞若しくは細胞株又は任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物である。具体的としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が挙げられる。最も好ましい宿主はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【0181】
５．８ ポリペプチドの方法及び使用
本技術は、本技術のポリペプチドの製造方法も提供する。この方法は、宿主細胞又は宿主生物をポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合により１つ以上の単離及び／又は精製ステップが続くことを含み得る。具体的には、本方法は：
ａ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合によりその後に：
ｂ）ポリペプチドを単離及び／又は精製することを含み得る。
本技術は、本技術のポリペプチドの製造方法も提供する。この方法は、宿主細胞又は宿主生物をポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合により１つ以上の単離及び／又は精製ステップが続くことを含み得る。具体的には、本方法は：
ａ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の適切な発現系において、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合によりその後に：
ｂ）ポリペプチドを単離及び／又は精製することを含み得る。
【0182】
産生目的に適した宿主細胞又は宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物の細胞又は細胞株、又は任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物であり得る。具体的としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が挙げられる。最も好ましい宿主はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【0183】
本技術のポリペプチド、記載の核酸分子若しくはベクター、又は本技術のポリペプチド、核酸分子若しくはベクターを含む組成物、好ましくはポリペプチド又はそれらを含む組成物は、医薬として有用である。
【0184】
したがって、本技術は、医薬として使用するための、本技術のポリペプチド、記載の核酸分子若しくはベクター、又は本技術のポリペプチド、核酸分子若しくはベクターを含む組成物を提供する。
【0185】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、好ましくは再発性及び／又は難治性ＡＭＬの（予防的又は治療的）治療に使用するための、本技術のポリペプチド、記載される核酸分子若しくはベクター、又は本技術のポリペプチド、核酸分子若しくはベクターを含む組成物も提供される。
【0186】
ＡＭＬを処置する（予防的及び／又は治療的）方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に活性な量の本技術のポリペプチド、記載される核酸分子若しくはベクター、又は本技術のポリペプチド、核酸分子若しくはベクターを含む組成物を投与することを含む方法がさらに提供される。
【0187】
本技術のポリペプチド、記載の核酸分子若しくはベクター、又は本技術のポリペプチド、核酸分子若しくはベクターを含む組成物の、好ましくはＡＭＬを治療するための医薬組成物の調製における使用がさらに提供される。
【0188】
ＡＭＬは、再発性及び／又は難治性ＡＭＬであり得る。
【0189】
本技術の文脈で言及される「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物であり得る。哺乳動物の中でも、ヒトと非ヒト哺乳動物とを区別することができる。非ヒト動物は、例えばコンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、又はブタの動物）、又は一般に研究目的及び／又は抗体を産生するために使用される動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、又はラクダ科動物、例えばラマ若しくはアルパカ）であり得る。
【0190】
予防及び／又は治療目的の文脈において、対象は任意の動物、より具体的には任意の哺乳動物であり得るが、好ましくはヒト対象である。
【0191】
物質（ポリペプチド、核酸分子及びベクターを含む）又は組成物は、任意の適切な投与経路によって、例えば経腸（経口又は直腸など）又は非経口（例えば、皮膚上、舌下、頬側、鼻、関節内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、又は経粘膜）投与によって対象に投与され得る。筋肉内、皮下又は皮内などの非経口投与が好ましい。最も好ましいのは皮下投与である。
【0192】
意図する治療結果を提供するために、有効量のポリペプチド、記載の核酸分子若しくはベクター、又はポリペプチド、核酸分子若しくはベクターを含む組成物を対象に投与することができる。
【0193】
１種以上の用量を投与することができる。２種以上の用量を投与する場合、ポリペプチド、組成物、核酸分子又はベクターの効果を最大化するために、用量を適切な間隔で投与することができる。
【0194】
【表3】
【0195】
【表4】
【0196】
【表5】
【0197】
【表6】
【0198】
【表7】
【0199】
【表8】
【0200】
【表9】
【実施例】
【0201】
６ 実施例
６．１ 実施例１：多重特異性ＩＳＶＤ構築物の生成
多重特異性ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤタンパク質をＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現させた。酵母発現ベクターは、ＡＯＸ１プロモーター及びターミネーター、ゼオシンに対する耐性遺伝子及び出芽酵母α接合因子シグナルペプチドに対するコード情報を含む。ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ一価構成要素（ＢＢ）をＧＳリンカーと組み合わせ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニング（Ｅｎｇｌｅｒ Ｃ、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ Ｓ．Ｇｏｌｄｅｎ ＧａｔｅクローニングＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１１６：１１９－３１））によって発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、１つ以上のベクターに含まれるＧＳリンカーと共に、ＰＣＲ増幅一価ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ構成要素をクローニングするための２つのＢｐｉＩ制限部位を含む。これらのエレメントはすべて、ＢｐｉＩ部位に隣接している。クローニングカセットの各位置に固有のヌクレオチドオーバーハングを使用することにより、所定の順序でシームレスなライゲーションが可能になる。サンガー配列確認後、大腸菌ＴＯＰ１０由来のプラスミドＤＮＡを線状化し、エレクトロポレーションによって社内で調製した高コンピテントＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０（ＡＴＣＣ ７６２７３）に形質転換した。
６．１ 実施例１：多重特異性ＩＳＶＤ構築物の生成
多重特異性ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤタンパク質をＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現させた。酵母発現ベクターは、ＡＯＸ１プロモーター及びターミネーター、ゼオシンに対する耐性遺伝子及び出芽酵母α接合因子シグナルペプチドに対するコード情報を含む。ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ一価構成要素（ＢＢ）をＧＳリンカーと組み合わせ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニング（Ｅｎｇｌｅｒ Ｃ、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ Ｓ．Ｇｏｌｄｅｎ ＧａｔｅクローニングＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１１６：１１９－３１））によって発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、１つ以上のベクターに含まれるＧＳリンカーと共に、ＰＣＲ増幅一価ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ構成要素をクローニングするための２つのＢｐｉＩ制限部位を含む。これらのエレメントはすべて、ＢｐｉＩ部位に隣接している。クローニングカセットの各位置に固有のヌクレオチドオーバーハングを使用することにより、所定の順序でシームレスなライゲーションが可能になる。サンガー配列確認後、大腸菌ＴＯＰ１０由来のプラスミドＤＮＡを線状化し、エレクトロポレーションによって社内で調製した高コンピテントＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０（ＡＴＣＣ ７６２７３）に形質転換した。
【0202】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２）（ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤタンパク質発現ベクター含有）を、「５０５２」自己誘導培地を含有するバッフル付き振盪フラスコ中で３７℃で２時間、続いて３０℃（２５０ｒｐｍ）で２９時間増殖させた。細胞を遠心分離（２０分、４５００ｒｐｍ、４℃）によってペレット化し、上清を捨て、ペレットを－２０℃で一晩凍結した。次いで、凍結細胞ペレットを元の培養体積の１／１２．５でＤＰＢＳに溶解し、穏やかに回転させながら４℃で１時間インキュベートして、細胞の外膜を破壊した。細胞を再度ペレット化し（２０分、８５００ｒｐｍ、４℃）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤタンパク質を含有する上清を回収し、濾過して直ちに精製を進めた。
【0203】
ＦＬＡＧ３Ｈｉｓ６タグ付きＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤタンパク質を、イミダゾール（前者）又は酸性溶出（後者）を用いたＮｉＩＤＡ／ＮＴＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）樹脂上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、引き続いて脱塩ステップ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂を含むＰＤカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及び必要に応じて分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＤ－ＰＢＳ中で精製した。この目的のために、ロボットステーション又はＡＫＴＡ精製システムを使用した。
【0204】
タグレスＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤタンパク質又はＡＬＢ構成要素を含有する構築物を、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３（ＪＳＲ）又はＭａｂＣａｐｔｕｒｅＡ（Ｐｏｒｏｓ）樹脂上で精製し、続いて脱塩ステップ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂を含むＰＤカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行い、必要に応じて、分取ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＤ－ＰＢＳ中で行った。Ｎ－オクチル－β－ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ；Ａｌｐｈａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号Ｊ６７３９０）処理は、低ＬＰＳレベルが必要とされる場合は常に精製／ゲル濾過クロマトグラフィー中に実施した。ＯＤ２８０／ＯＤ３４０測定によって濃度を決定した。品質管理はＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析によって行った。
【0205】
６．２ 実施例２：ＴＣＲαβ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３及び血清アルブミンに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合親和性
配列番号１に示されるようなＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を作製した。
配列番号１に示されるようなＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を作製した。
【0206】
６．２．１ ヒト及びカニクイザルのＣＤ３３及びＣＤ１２３タンパク質に対する親和性決定
組換えｈｕＣＤ３３Ｌ－Ｆｃ、ｃｙＣＤ３３Ｌ－Ｆｃ（捕捉設定による）又はｈｕＣＤ１２３（捕捉設定による）タンパク質に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）の、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイによって３７℃で測定した。
組換えｈｕＣＤ３３Ｌ－Ｆｃ、ｃｙＣＤ３３Ｌ－Ｆｃ（捕捉設定による）又はｈｕＣＤ１２３（捕捉設定による）タンパク質に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）の、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイによって３７℃で測定した。
【0207】
ＣＤ３３に対する結合親和性を測定するための設定
抗ｈｕＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）化学を使用して、アミンカップリングを介してＧＬＨ（長マトリクス、高容量）センサーチップに固定化した。次に、ｈｕＣＤ３３Ｌ－Ｆｃ及びｃｙＣＤ３３Ｌ－Ｆｃを捕捉した（会合：１２０秒、２５μＬ／分）。配列番号１に示される精製されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を異なる濃度（０．４ｎＭ～６２５ｎＭ）で１２０秒間注入し、解離を９００秒間追跡した。
抗ｈｕＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）化学を使用して、アミンカップリングを介してＧＬＨ（長マトリクス、高容量）センサーチップに固定化した。次に、ｈｕＣＤ３３Ｌ－Ｆｃ及びｃｙＣＤ３３Ｌ－Ｆｃを捕捉した（会合：１２０秒、２５μＬ／分）。配列番号１に示される精製されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を異なる濃度（０．４ｎＭ～６２５ｎＭ）で１２０秒間注入し、解離を９００秒間追跡した。
【0208】
ＣＤ１２３に対する結合親和性を測定するための設定
抗ｈｕＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）化学を使用して、アミンカップリングを介してＧＬＨ（長マトリクス、高容量）センサーチップに固定化した。次に、ｈｕＣＤ１２３－Ｆｃ及びｃｙＣＤ１２３－Ｆｃを捕捉した（会合：１２０秒、２５μＬ／分）。配列番号１に示される精製されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を異なる濃度（１．２ｎＭ～３００ｎＭ）で１２０秒間注入し、解離を４５μｌ／分で９００秒間追跡した。
抗ｈｕＩｇＧ（Ｆｃ）を、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）化学を使用して、アミンカップリングを介してＧＬＨ（長マトリクス、高容量）センサーチップに固定化した。次に、ｈｕＣＤ１２３－Ｆｃ及びｃｙＣＤ１２３－Ｆｃを捕捉した（会合：１２０秒、２５μＬ／分）。配列番号１に示される精製されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を異なる濃度（１．２ｎＭ～３００ｎＭ）で１２０秒間注入し、解離を４５μｌ／分で９００秒間追跡した。
【0209】
基準分析物レーン及びブランク緩衝液注入を差し引くことによってデータを二重参照した。親和定数（ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアを使用してラングミュア１：１相互作用モデルを適用して計算した。
【0210】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３３並びにヒト及びカニクイザルＣＤ１２３に対する配列番号１に記載のＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の親和性測定の結果を、以下の表２及び表３に要約する。
【0211】
【表10】
【0212】
カニクイザルＣＤ３３（ＫＤ＝６．９ｎＭ）に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の反応性は、ヒトＣＤ３３（ＫＤ＝７．６ｎＭ）に匹敵した。
【0213】
【表11】
【0214】
カニクイザルＣＤ１２３（ＫＤ＝２ｎＭ）に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の反応性は、ヒトＣＤ１２３（ＫＤ＝０．５９ｎＭ）より３．３倍低かった。
【0215】
結果（表２及び表３）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物がヒト／カニクイザルＣＤ３３及びヒト／カニクイザルＣＤ１２３に高親和性で結合することを実証している。
【0216】
６．２．２ ヒト及びカニクイザルＴＣＲαβタンパク質に対する親和性決定
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）の、組換えｈｕＴＣＲ（２ＸＮ９）－ジッパー、ｃｙＴＣＲ（ＡＥＡ４１８６５）－ジッパー（被覆設定による）に対する会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に基づくＳＰＲベースアッセイによって３７℃で評価した。
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）の、組換えｈｕＴＣＲ（２ＸＮ９）－ジッパー、ｃｙＴＣＲ（ＡＥＡ４１８６５）－ジッパー（被覆設定による）に対する会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に基づくＳＰＲベースアッセイによって３７℃で評価した。
【0217】
ＴＣＲαβに対する結合親和性を測定するための設定
ｈｕＴＣＲ（２ＸＮ９）－ジッパー、ｃｙＴＣＲ（ＡＥＡ４１８６５）－ジッパータンパク質をＧＬＣ（短マトリクス、通常容量）センサーチップでコーティングした。配列番号１に示される精製されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を異なる濃度（０．４ｎＭ～６２５ｎＭ）で１２０秒間注入し、解離を９００秒間追跡した。
ｈｕＴＣＲ（２ＸＮ９）－ジッパー、ｃｙＴＣＲ（ＡＥＡ４１８６５）－ジッパータンパク質をＧＬＣ（短マトリクス、通常容量）センサーチップでコーティングした。配列番号１に示される精製されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物を異なる濃度（０．４ｎＭ～６２５ｎＭ）で１２０秒間注入し、解離を９００秒間追跡した。
【0218】
基準分析物レーン及びブランク緩衝液注入を差し引くことによってデータを二重参照した。親和定数（ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアを使用してラングミュア１：１相互作用モデルを適用して計算した。
【0219】
ヒト及びカニクイザルＴＣＲαβに対する配列番号１に示されるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の親和性測定の結果を以下の表４に要約する。参照として、ＡＬＢ２３００２（配列番号５）に連結されたＴＣＲαβ構成要素（配列番号２）のみからなるＩＳＶＤを採用した。
【0220】
【表12】
【0221】
カニクイザルＴＣＲαβ（ＫＤ＝６．７ｎＭ）に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の反応性は、ヒトＴＣＲαβ（ＫＤ＝２１ｎＭ）よりも３倍高かった。
【0222】
結果（表４）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物がヒト／カニクイザルＴＣＲαβに高親和性で結合することを実証している。
【0223】
６．２．３ ヒト、マウス及びカニクイザル血清アルブミンに対する親和性決定
Ｃ末端ＡＬＢ２３００２半減期延長を介したヒト、カニクイザル及びマウス血清アルブミンへの組換え体に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）の、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）として表される結合親和性（被覆設定による）を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に基づくＳＰＲベースアッセイによって３７℃で評価した。
Ｃ末端ＡＬＢ２３００２半減期延長を介したヒト、カニクイザル及びマウス血清アルブミンへの組換え体に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）の、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）として表される結合親和性（被覆設定による）を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に基づくＳＰＲベースアッセイによって３７℃で評価した。
【0224】
結合親和性血清アルブミンを測定するための設定
ＥＤＣ及びＮＨＳ化学（使用したランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ７．４）を使用して、アミンカップリングを使用するアミンカップリングを使用して、ヒト、カニクイザル及びマウス血清アルブミンをＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップに固定化した。アルブミンをｐＨ４．５酢酸緩衝液中２．５μｇ／ｍＬ（ＨＳＡ及びＭＳＡ）及び５μｇ／ｍＬ（ＣＳＡ）の２つの濃度で固定化し、ＣＳＡについては最大２２０ＲＵ、ＭＳＡについては１５０ＲＵ及びＨＳＡについては１１０ＲＵの固定化レベルをもたらした。精製した多価ＶＨＨを異なる濃度（４．３ｎＭ～４１６ｎＭ）で２分間（流速４５μＬ／分）注入し、解離を９００秒間追跡した。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５を１００μＬ／分で４７秒間注入することからなった。
ＥＤＣ及びＮＨＳ化学（使用したランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋、ｐＨ７．４）を使用して、アミンカップリングを使用するアミンカップリングを使用して、ヒト、カニクイザル及びマウス血清アルブミンをＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップに固定化した。アルブミンをｐＨ４．５酢酸緩衝液中２．５μｇ／ｍＬ（ＨＳＡ及びＭＳＡ）及び５μｇ／ｍＬ（ＣＳＡ）の２つの濃度で固定化し、ＣＳＡについては最大２２０ＲＵ、ＭＳＡについては１５０ＲＵ及びＨＳＡについては１１０ＲＵの固定化レベルをもたらした。精製した多価ＶＨＨを異なる濃度（４．３ｎＭ～４１６ｎＭ）で２分間（流速４５μＬ／分）注入し、解離を９００秒間追跡した。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５を１００μＬ／分で４７秒間注入することからなった。
【0225】
参照リガンドレーン及び緩衝液注入を差し引くことによって、データを二重参照した。ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１．０（バージョン３．１．０．６）ソフトウェアモデルを使用して、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルでのフィッティングによって処理曲線を評価し、親和定数（ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）を計算した。
【0226】
ヒト、マウス及びカニクイザル血清アルブミンに対する配列番号１に示されるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の親和性測定の結果を、以下の表５に要約する。
【0227】
【表13】
【0228】
ＣＳＡに対する交差反応性が確認された。さらに、動態パラメータは報告されなかったが、ＭＳＡに対する親和性は、半減期延長を得て血清アルブミンの半減期を採用するのに十分良好であった。
【0229】
結果（表５）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物がヒト／マウス／カニクイザルＴＣＲαβに高親和性で結合することを実証している。
【0230】
６．３ 実施例３：膜結合ＣＤ３３及び／又はＣＤ１２３に対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物結合親和性
標的細胞株上のＣＤ３３／ＣＤ１２３に対する結合親和性を測定するための設定
ＣＤ３３及び／又はＣＤ１２３を発現する標的細胞株に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性を、フローサイトメトリーを使用して評価した。ＣＤ１２３を発現する標的細胞株は、国際公開第２０１８／０９１６０６Ａ１号パンフレットに詳細に記載されている。
標的細胞株上のＣＤ３３／ＣＤ１２３に対する結合親和性を測定するための設定
ＣＤ３３及び／又はＣＤ１２３を発現する標的細胞株に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性を、フローサイトメトリーを使用して評価した。ＣＤ１２３を発現する標的細胞株は、国際公開第２０１８／０９１６０６Ａ１号パンフレットに詳細に記載されている。
【0231】
トランスフェクトされたＣＤ３３細胞を以下のように作製した。Ｆｌｐ－Ｉｎ（Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介インテグレーションによって安定な哺乳動物発現細胞株を生成するためのＦｌｐ－Ｉｎ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ６０１００１、Ｋ６０１００２））部位特異的組換え技術を使用して、ＣＤ３３の組換え過剰発現を有する安定なＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ７５８－０７）細胞株を作製した。これにより、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＦｌｐリコンビナーゼ（ｐＯＧ４４）によって、ＦＲＴ（Ｆｌｐ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）部位の特定のゲノム位置でＤＮＡ組込みが起こる。Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）宿主細胞株及び発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ５）は両方ともこのＦＲＴ部位を含有し、それによって単一の相同ＤＮＡ組換えを可能にする。ヒトＣＤ３３の配列はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１７６３に由来し、カニクイザルＣＤ１２３の配列はＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＰ＿００５５９０１３８に由来した。
【0232】
簡単に記載すると、細胞を集め、Ｖ底９６ウェルプレートに移し（５×１０４細胞／ウェル）、３０μＭの臨床グレードのＨＳＡ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、２１６０－６７９）の存在下、１００μＬの最終容量で、ＦＡＣＳバッファー（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４）及び０．０５％アジ化ナトリウム（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、１９０３８年）を含むＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０））中、４℃で３０分間、ＴＣＲαβ－ＣＤ１２３－ＣＤ３３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の段階希釈物と共にインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＦＬＡＧ３Ｈｉｓ６タグ付きＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＴＣＲ多重特異性ＩＳＶＤ構築物の検出のために４℃で３０分間、１μｇ／ｍＬマウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ１８０４）と共に、又はＡＬＢ ＢＢによるＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤの検出のために３μｇ／ｍＬ ｍＡｂ抗ＶＨＨ抗体（ＡＢＨ００７７）（ＡＰＳ＋インハウス、Ａ－０００６－００＿ＡＢＨ００７７＿ＳＦ＿ＡＢ１８９１）と共にインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、最終体積１００μＬで、５μｇ／ｍＬのアロフィコシアニン（ＡＰＣ） ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５－１３６－０７１）と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、シグマＰ４１７０）を補充した５０μＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生細胞と死細胞とを区別した。染色後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて細胞を取得し、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分析した。最初に、細胞を破片と区別するために、ＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて、全イベントの８０％超を表すＰ１集団を選択した。この集団（Ｐ１）から、ＰＩ陽性（死）細胞を除外し、ＰＩ陰性細胞のＡＰＣ蛍光強度の中央値を評価した。
【0233】
初代Ｔ細胞に対する結合親和性を測定するための設定
初代Ｔ細胞に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性を、ＦＬＡＧ３Ｈｉｓ６タグ付き一価ＴＣＲ ＩＳＶＤをリガンドとして使用する競合設定においてフローサイトメトリーを使用して評価した。
初代Ｔ細胞に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性を、ＦＬＡＧ３Ｈｉｓ６タグ付き一価ＴＣＲ ＩＳＶＤをリガンドとして使用する競合設定においてフローサイトメトリーを使用して評価した。
【0234】
簡単に説明すると、ヒト初代Ｔ細胞又はカニクイザル初代Ｔ細胞を解凍し、Ｖ底９６ウェルプレート（１００μＬ中７．５×１０４細胞／ウェル）に移し、３０μＭ臨床グレードＨＳＡ ＣＳＬベーリング、２１６０～６７９の存在下、ＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳ（シグマ、Ｆ７５２４）及び０．０５％アジ化ナトリウム（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、１９０３８）を含むＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０））中、ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の段階希釈物及び固定濃度のリガンドと共に４℃で３０分間、最終容量１００μＬでインキュベートした。アッセイで使用したリガンドの濃度は、その結合ＥＣ５０未満であった。４℃で９０分間のインキュベーション期間の後、リガンド結合のレベルをフローサイトメトリーによって決定した。そこで、細胞を３回洗浄し、１μｇ／ｍｌマウスモノクローナルＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ１８０４）と共に４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄し、最終体積１００μＬで５μｇ／ｍｌのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５－１３６－０７１）と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ４１７０）を補充したＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生細胞と死細胞とを区別した。染色後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて細胞を取得し、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分析した。最初に、細胞を破片と区別するために、ＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて、全イベントの８０％超を表すＰ１集団を選択した。この集団（Ｐ１）から、ＰＩ陽性（死）細胞を除外し、ＰＩ陰性細胞のＡＰＣ蛍光強度の中央値を評価した。
【0235】
ヒト－カニクイザル交差反応性は、上記のようにフローサイトメトリーを使用して、ヒト若しくはカニクイザルＣＤ３３トランスフェクト細胞株又はヒト若しくはカニクイザルＣＤ１２３トランスフェクト細胞株への一価ＣＤ３３構成要素（配列番号３）及び一価ＣＤ１２３構成要素（配列番号４）の結合を試験することによって評価した。結果を図２にグラフで表す。異なる実験のＥＣ５０値を表６（ＣＤ３３トランスフェクト標的細胞）及び表７（ＣＤ１２３トランスフェクト標的細胞）に要約する。
【0236】
【表14】
【0237】
【表15】
【0238】
ヒト及びカニクイザルの膜標的への一価ＣＤ３３及びＣＤ１２３ビルディングブロックの結合が確認された。ヒトとカニクイザルとの間のＥＣ５０の差は、ＣＤ３３への結合については２倍未満の減少であり、ＣＤ１２３細胞への結合については３倍の減少であった（表７）。
【0239】
結論として、組換えヒト及びカニクイザルＣＤ３３及びＣＤ１２３タンパク質に対する結合親和性に加えて、ヒト及びカニクイザル細胞発現ＣＤ３３及びＣＤ１２３に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の用量依存的結合も確認された（ｎ＝１）。
【0240】
ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＴＣＲ多重特異性ＩＳＶＤ構築物及び参照ＴＣＲ－ＩＳＶＤ構築物（ＡＬＢ２３００２に連結されたＴＣＲαβ構成要素（配列番号２）のみからなる（配列番号５））のヒトＴ細胞及びカニクイザルＴ細胞への結合を、上記のようにフローサイトメトリーを使用して競合設定で評価した（図３）。
【0241】
ＤＲＣの例示的な例を図４に示す。ＩＳＶＤ構築物を複数の健常ドナーＴ細胞で試験した。グローバルＩＣ５０を表８に示す。
【0242】
【表16】
【0243】
要約すると、カニクイザル初代Ｔ細胞に対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の交差反応性が確認された。初代カニクイザルＴ細胞のＥＣ５０（＝７２９ｎＭ）は、ヒト初代Ｔ細胞のＥＣ５０（＝２１８Ｍ）よりも約３倍高かった。
【0244】
６．４ 実施例４：多重特異性ＩＳＶＤ構築物誘導Ｔ細胞媒介性標的細胞殺傷
６．４．１ インピーダンスに基づく細胞傷害性アッセイ
ＩＳＶＤ構築物を、ヒト又はカニクイザルの初代エフェクターＴ細胞及び接着性標的細胞を使用したインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイにおけるリダイレクトされたＴ細胞媒介性殺傷について（例えば、国際公開第２０１８０９１６０６Ａ１号パンフレットに記載されているように）特徴付けた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、電極表面への標的細胞の接着によって誘導されるインピーダンスの変化を測定した。Ｔ細胞は非接着性であり、したがってインピーダンス測定値に影響を及ぼさない。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ＲＴＣＡ ＭＰ機器は、電気インピーダンスの変化を定量化し、細胞によって覆われる組織培養ウェルの総面積に正比例する細胞指数と呼ばれる無次元パラメータとして表示する。アッセイ培地（標的細胞増殖培地（選択抗生物質なし）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号１５１４０）中９６ Ｅプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；０５ ２３２ ３６８ ００１）の各ウェルに、５０μＬの４倍濃度ＨＳＡ溶液を添加した（いくつかのアッセイでは、２００μＭを使用して５０μＭの最終濃度を有し、他のアッセイでは、１２０μＭを使用して３０μＭの最終濃度を有した）。外側ウェルを使用せず、２００μＬの培地又はＤ－ＰＢＳで満たした。９６ ＥプレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ステーション（３７℃インキュベータ内、５％ＣＯ２）に置き、細胞の非存在下で、アッセイ培地のバックグラウンドインピーダンスを測定するために単一の測定を行った。続いて、アッセイ培地中の５０μＬの標的細胞（２×１０４細胞／ウェル）を９６ Ｅプレートに播種し、アッセイ培地中の５０μＬの連続希釈ＩＳＶＤ構築物溶液（４Ｘ濃度）を添加した。（最終体積＝２００μＬ）。室温で３０分後、アッセイ培地中の初代Ｔ細胞（３×１０５細胞／ウェル）５０μＬをウェルあたり添加して、１５：１のエフェクター対標的比を達成した。プレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ステーションに置き、インピーダンスを１５分ごとに４日間測定した。データは、結果に示される固定時点で分析した。
６．４．１ インピーダンスに基づく細胞傷害性アッセイ
ＩＳＶＤ構築物を、ヒト又はカニクイザルの初代エフェクターＴ細胞及び接着性標的細胞を使用したインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイにおけるリダイレクトされたＴ細胞媒介性殺傷について（例えば、国際公開第２０１８０９１６０６Ａ１号パンフレットに記載されているように）特徴付けた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、電極表面への標的細胞の接着によって誘導されるインピーダンスの変化を測定した。Ｔ細胞は非接着性であり、したがってインピーダンス測定値に影響を及ぼさない。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ＲＴＣＡ ＭＰ機器は、電気インピーダンスの変化を定量化し、細胞によって覆われる組織培養ウェルの総面積に正比例する細胞指数と呼ばれる無次元パラメータとして表示する。アッセイ培地（標的細胞増殖培地（選択抗生物質なし）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号１５１４０）中９６ Ｅプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；０５ ２３２ ３６８ ００１）の各ウェルに、５０μＬの４倍濃度ＨＳＡ溶液を添加した（いくつかのアッセイでは、２００μＭを使用して５０μＭの最終濃度を有し、他のアッセイでは、１２０μＭを使用して３０μＭの最終濃度を有した）。外側ウェルを使用せず、２００μＬの培地又はＤ－ＰＢＳで満たした。９６ ＥプレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ステーション（３７℃インキュベータ内、５％ＣＯ２）に置き、細胞の非存在下で、アッセイ培地のバックグラウンドインピーダンスを測定するために単一の測定を行った。続いて、アッセイ培地中の５０μＬの標的細胞（２×１０４細胞／ウェル）を９６ Ｅプレートに播種し、アッセイ培地中の５０μＬの連続希釈ＩＳＶＤ構築物溶液（４Ｘ濃度）を添加した。（最終体積＝２００μＬ）。室温で３０分後、アッセイ培地中の初代Ｔ細胞（３×１０５細胞／ウェル）５０μＬをウェルあたり添加して、１５：１のエフェクター対標的比を達成した。プレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ステーションに置き、インピーダンスを１５分ごとに４日間測定した。データは、結果に示される固定時点で分析した。
【0245】
６．４．２ フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイ
ＩＳＶＤ構築物を、エフェクター細胞及び非接着性標的細胞としてヒト初代Ｔ細胞又はカニクイザル初代Ｔ細胞を使用するフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイにおいて、リダイレクトされたＴ細胞媒介性殺傷について特徴付けた。ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ）を製造者の説明書に従って使用して、標的細胞を４μＭ ＰＫＨ２６膜色素で標識した。エフェクター細胞（２．５×１０５細胞／ウェル）及びＰＫＨ標識標的細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を、標的細胞株（１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０）及び５０μＭ ＡｌブレックスＨＳＡ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、２１６０－６７９）を含む標的増殖培地）のアッセイ培地中、９６ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、＃６５１ １８０）（エフェクター対標的比１０：１）中で共インキュベートした。濃度依存性細胞溶解の分析のために、標的アッセイ培地中のＩＳＶＤ構築物の段階希釈物を細胞に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４）及び０．０５％アジ化ナトリウム（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、１９０３８）を含むＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０））で洗浄した。その後、細胞を、５ｎＭのＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３ヨウ化物（６４２?６６１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ３６０５）が補充された１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生細胞と死細胞とを区別した。細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分析した。試料あたり、７０μＬの総試料体積を取得した。ＰＫＨ２６陽性細胞にゲーティングを設定し、この集団内でＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３陽性細胞を決定した。比溶解パーセント＝（（％ＴＯ－ＰＲＯ－３＋構築物なし－％ＴＯ－ＰＲＯ－３＋構築物あり）／％ＴＯ－ＰＲＯ－３＋構築物なし） ×１００。
ＩＳＶＤ構築物を、エフェクター細胞及び非接着性標的細胞としてヒト初代Ｔ細胞又はカニクイザル初代Ｔ細胞を使用するフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイにおいて、リダイレクトされたＴ細胞媒介性殺傷について特徴付けた。ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ）を製造者の説明書に従って使用して、標的細胞を４μＭ ＰＫＨ２６膜色素で標識した。エフェクター細胞（２．５×１０５細胞／ウェル）及びＰＫＨ標識標的細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を、標的細胞株（１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０）及び５０μＭ ＡｌブレックスＨＳＡ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、２１６０－６７９）を含む標的増殖培地）のアッセイ培地中、９６ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、＃６５１ １８０）（エフェクター対標的比１０：１）中で共インキュベートした。濃度依存性細胞溶解の分析のために、標的アッセイ培地中のＩＳＶＤ構築物の段階希釈物を細胞に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４）及び０．０５％アジ化ナトリウム（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、１９０３８）を含むＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０））で洗浄した。その後、細胞を、５ｎＭのＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３ヨウ化物（６４２?６６１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ３６０５）が補充された１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生細胞と死細胞とを区別した。細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分析した。試料あたり、７０μＬの総試料体積を取得した。ＰＫＨ２６陽性細胞にゲーティングを設定し、この集団内でＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３陽性細胞を決定した。比溶解パーセント＝（（％ＴＯ－ＰＲＯ－３＋構築物なし－％ＴＯ－ＰＲＯ－３＋構築物あり）／％ＴＯ－ＰＲＯ－３＋構築物なし） ×１００。
【0246】
ＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＴＣＲに対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の機能的交差反応性分析を、ヒト又はカニクイザルの初代Ｔ細胞及び接着性ヒト又はカニクイザルのトランスフェクトＣＤ３３又はＣＤ１２３細胞を使用したインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）で決定した。
【0247】
ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤを上記のようにＨＳＡで完全に飽和させるために、６．４．１及び６．４．２で上記したように、すべてのアッセイを過剰量のＨＳＡの存在下で実行した。参照ＴＣＲ－ＩＳＶＤを陰性対照として使用した。結果を図５及び６並びに表９に示す。
【0248】
６．４．３ 結果
ヒト初代Ｔ細胞とカニクイザル初代Ｔ細胞とを比較したアッセイ結果を図５及び図７にグラフで示す。ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３トランスフェクト細胞のヒトＴ細胞媒介性細胞殺傷の評価を、異なるヒトドナー由来のＴ細胞を使用して行い、これにより、グローバルＩＣ５０値を計算することができた（表９）。ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３トランスフェクト細胞のカニクイザルＴ細胞媒介殺傷の評価を、１匹のカニクイザル由来のＴ細胞を使用して行った。ＩＣ５０値を表１０に要約する。
ヒト初代Ｔ細胞とカニクイザル初代Ｔ細胞とを比較したアッセイ結果を図５及び図７にグラフで示す。ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３トランスフェクト細胞のヒトＴ細胞媒介性細胞殺傷の評価を、異なるヒトドナー由来のＴ細胞を使用して行い、これにより、グローバルＩＣ５０値を計算することができた（表９）。ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ１２３トランスフェクト細胞のカニクイザルＴ細胞媒介殺傷の評価を、１匹のカニクイザル由来のＴ細胞を使用して行った。ＩＣ５０値を表１０に要約する。
【0249】
【表17】
【0250】
ヒト標的発現細胞に対するグローバルＩＣ５０は、ＣＤ３３及びＣＤ１２３についてそれぞれ５、４．１０－１１Ｍ及び２、５．１０－１１Ｍであった。
【0251】
【表18】
【0252】
ＴＣＲに対するＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３ ＩＳＶＤ構築物のヒトカニクイザル交差反応性を確認するために、上記のように５０μＭ ＨＳＡの存在下でＣＤ３３、ＣＤ１２３二重発現ヒトＭＯＬＭ－１３標的細胞株と組み合わせてヒト又は初代Ｔ細胞のいずれかを使用して、フローサイトメトリーに基づくＴ細胞媒介ＭＯＬＭ－１３細胞殺傷でＩＳＶＤ構築物を評価した。これらの結果のグラフ図を図６に示す。異なるドナーを使用したヒトＴ細胞媒介殺傷アッセイにおいて試験されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３ ＩＳＶＤ構築物のさらなるデータが利用可能であり、これにより、グローバルＥＣ５０値を計算することができた（表１１）。カニクイザルＴ細胞媒介性殺傷アッセイのＥＣ５０値を表１２に示す。
【0253】
【表19】
【0254】
【表20】
【0255】
結論として、ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３ ＩＳＶＤ構築物は、ヒト及びカニクイザルヒト標的細胞媒介性殺傷アッセイの両方において機能的であった。ＣＤ３３／ＣＤ１２３二重陽性ＡＭＬ細胞株に対する記載されたＩＳＶＤのグローバルな殺傷効力は、１、８．１０－１１Ｍであった。
【0256】
６．５ 実施例５：Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスに移植したＣＤ１２３＋Ｍｏｌｍ－１３－ｌｕｃ播種性ＡＭＬモデルにおけるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の前臨床
６．５．１ 材料及び方法
細胞株及びヒト材料
ＣＤ１２３ Ｍｏｌｍ－１３を発現するヒトＡＭＬ由来細胞株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｍｏｌｍ－１３細胞をＲＰＭＩ１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（ウシ胎児血清２０％で完成）中で培養して増殖させた（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）。細胞を、非複製レンチウイルスによって保有されるルシフェラーゼベクター（ＳＶ４０－ＰＧＬ４－Ｐｕｒｏ）に感染させた。ポリクローナルＭｏｌｍ－１３－ｌｕｃを、２μｇ／ｍｌピューロマイシンを使用して選択した。
６．５．１ 材料及び方法
細胞株及びヒト材料
ＣＤ１２３ Ｍｏｌｍ－１３を発現するヒトＡＭＬ由来細胞株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｍｏｌｍ－１３細胞をＲＰＭＩ１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（ウシ胎児血清２０％で完成）中で培養して増殖させた（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）。細胞を、非複製レンチウイルスによって保有されるルシフェラーゼベクター（ＳＶ４０－ＰＧＬ４－Ｐｕｒｏ）に感染させた。ポリクローナルＭｏｌｍ－１３－ｌｕｃを、２μｇ／ｍｌピューロマイシンを使用して選択した。
【0257】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのヒトＴ細胞の精製及び増幅
健常なドナー由来の新鮮なヒト末梢血は、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ，Ｉｌｅ－ｄｅ－Ｆｒａｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅより供給された。
健常なドナー由来の新鮮なヒト末梢血は、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ，Ｉｌｅ－ｄｅ－Ｆｒａｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅより供給された。
【0258】
新鮮なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ブレーキなしで室温にて４０分間、２００ ｇでのＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって単離した。ペレットを洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって完了した最終体積５０ｍｌに再懸濁した。総生存ＰＢＭＣ数をＶｉ－ＣＥＬＬカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって決定した。ペレットをａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に回収した。製造業者の指示に従って、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びａｕｔｏＭＡＣＳを使用してＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。精製されたＴ細胞を、ＣＤ３及びＣＤ２８の同時刺激に基づくＴ Ｃｅｌｌ ＴＲＡＮＳＡＣＴマトリクス活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１４日間にわたって活性化及び拡大培養した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ手順によれば、活性化プロトコルは、２０ ０００ ＩＵの可溶性ＩＬ－２及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中のＴＲＡＮＳＡＣＴマトリクスの存在下でＴ細胞を２週間培養することを伴った。増殖の１４日目に、Ｔ細胞を回収し、５×１０７細胞／ｍｌの最終濃度でＰＢＳに再懸濁し、１０７個の細胞を各動物に腹腔内（ＩＰ）注射によって投与した。動物注射前のＴ細胞生存率は８５％超であると試験されている。
【0259】
ｉｎ ｖｉｖｏ特性評価
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験は、Ｓａｎｏｆｉ倫理委員会によって承認され、現地及び機関の法律、ＡＡＡＬＡＣ認定施設における倫理及びガイダンスに従って実施された。
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験は、Ｓａｎｏｆｉ倫理委員会によって承認され、現地及び機関の法律、ＡＡＡＬＡＣ認定施設における倫理及びガイダンスに従って実施された。
【0260】
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）抗腫瘍活性を、非照射ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ） マウスにおけるＭｏｌｍ１３－ｌｕｃ ＡＭＬ生着後に評価した（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｒｍａｉｎ－Ｎｕｅｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）。６～８週齢の雌動物に、０日目にマウス１匹当たり１０６個／０．２ｍｌのＭｏｌｍ－１３－ｌｕｃ細胞を静脈内（ＩＶ）移植した。同じ動物に、マウス１匹あたり１０７個／０．２ｍｌのヒトＴ細胞を１日目に腹腔内移植した。
【0261】
動物を、全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）シグナル均一性及び３日目の長骨シグナルセグメント化によって評価した腫瘍骨髄生着に基づいて群間に分配した。マウスを、１２、１．２、０．１２及び０．０１２ｎｍｏｌ／ｋｇ Ｑ２ＤのＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（配列番号１）により、４日目から１２日目まで、又はＣＤ３３若しくはＣＤ１２３結合ＩＳＶＤを有さない参照（Ａｌｂ－ＩＳＶＤ（配列番号５）に連結されたＴＣＲαβ－ＩＳＶＤ（配列番号２））により、１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ ＱＤ（４～１３日目）又はＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照１．３ｎｍｏｌ／ｋｇ ＱＤ（４～１３日目）でＩＶ処理した、表１３を参照のこと。縦方向ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行って、播種性腫瘍成長をモニタリングした。マウスを１４日目に屠殺し、肝臓、脾臓、卵巣及び腹部脂肪などの深部軟組織における衝撃評価のためにＢＬＩ下で剖検した。
【0262】
【表21】
【0263】
データ収集及び有効性基準
動物の体重を３日目からアッセイ終了までモニタリングして、治療の影響を追跡した。３日間連続して２０％の体重減少若しくは１５％の体重減少又は１０％以上の薬物死をもたらす投与量を、過剰に毒性のある投与量と考えた。動物の体重は腫瘍重量を含んでいた。
動物の体重を３日目からアッセイ終了までモニタリングして、治療の影響を追跡した。３日間連続して２０％の体重減少若しくは１５％の体重減少又は１０％以上の薬物死をもたらす投与量を、過剰に毒性のある投与量と考えた。動物の体重は腫瘍重量を含んでいた。
【0264】
腫瘍成長を、画像の５分前にケタミン（登録商標）／キシラジン（登録商標）（１２０ｍｇ／ｋｇ；６ｍｇ／ｋｇ ＩＭ、５ｍｌ／ｋｇ）で麻酔した動物の画像処理の１５分前に、甲虫ルシフェリンカリウム塩１６０ｍｇ／ｋｇ Ｉｐ注射を使用して、腫瘍注射後３、７、１０、及び１４日目にｉｎ ｖｉｖｏでルシフェラーゼ活性測定を介してＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．５．２取得ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と共にＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳイメージャ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用するｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩによって評価した。腫瘍成長は、生物発光シグナル曲線（光子／秒で表される）に基づいた。
【0265】
腫瘍移植後７、１０及び１４日目にＢＬＩシグナル測定によって、全身及び後肢の長骨において腫瘍成長を追跡した。主要有効性エンドポイントは、治療群と対照群との間のベースラインからの腫瘍シグナル変化の変化の比（Ｔ／Ｃ）、部分退縮（ＰＲ）及び完全退縮（ＣＲ）である。
【0266】
生物発光シグナル曲線（Ｐｈｏｔ／秒で表される）に基づく腫瘍増殖を各処置群の各動物について経時的に描画し、全身体（線形スケール）及び骨セグメント化シグナル（Ｌｏｇスケール）の両方について中央曲線±ＭＡＤとして表した。各処置（Ｔ）及び対照（Ｃ）についての腫瘍生物発光シグナルの変化は、各動物及び各日について、指定された観察日の腫瘍シグナルから最初の処置日（病期分類日）の腫瘍シグナルを差し引くことによって計算される。中央値Ｔを処置群について計算し、中央値Ｃを対照群について計算する。次いで、比Ｔ／Ｃが計算され、パーセンテージとして表される。
ｄＴ／ｄＣ＝［（Ｔ終了中央値－Ｔ日中央値３）／（Ｃ終了中央値－Ｃ日中央値３）］×１００
ｄＴ／ｄＣ＝［（Ｔ終了中央値－Ｔ日中央値３）／（Ｃ終了中央値－Ｃ日中央値３）］×１００
【0267】
用量は、ｄＴ／ｄＣが４２％未満である場合に治療活性であり、ｄＴ／ｄＣが１０％未満である場合に非常に活性であると考えられる。ｄＴ／ｄＣが０未満である場合、用量は高活性であると考えられ、退縮のパーセンテージは日付を記録される。
【0268】
腫瘍退縮率は、処置の１日目のシグナルと比較した、特定の観察日の処置群における腫瘍シグナル減少の％として定義される。
【0269】
各動物について、特定の時点で退縮％を計算する。ｉｐ注射ミスによるルシフェリン動態変動に起因するシグナル変動のリスクを考慮して、各動物について少なくとも２つの連続する時点で観察される場合、真の退縮を考慮する。
【数1】
【0270】
部分退縮（ＰＲ）：２つの連続した時点で治療開始時に腫瘍シグナルが腫瘍シグナルを下回って減少する場合、退縮は部分的であると定義され、１つは開始シグナルの５０％未満である。完全退縮（ＣＲ）：腫瘍シグナルが開始シグナルの８０％未満に低下した場合、退縮を完全と定義する。
【0271】
生物統計学的分析
経時的な生物発光シグナル曲線に基づく腫瘍成長を、各処置群の各動物について測定した。長手方向のｉｎｖｉｖｏ ＢＬＩデータのために、分散型（ＡＮＯＶＡ型）の２つのノンパラメトリック二元解析、続いて多重度についてボンフェローニ－ホルム（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ－Ｈｏｌｍ）調整による２つのコントラスト解析を、毎日繰り返し測定して行った：ｐ＞０．０５：ＮＳ，０．０５＜ｐ＞０．０１：＊，ｐ＜０．０１：＊＊。最終ｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩデータのために、ランク変換された生物発光シグナル上の因子群を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを行った。中央値±絶対偏差の中央値を有する記述統計を群及び測定日によって提供した：ｐ＞０．０５：ＮＳ，０．０５＜ｐ＞０．０１：＊，ｐ＜０．０１：＊＊。
経時的な生物発光シグナル曲線に基づく腫瘍成長を、各処置群の各動物について測定した。長手方向のｉｎｖｉｖｏ ＢＬＩデータのために、分散型（ＡＮＯＶＡ型）の２つのノンパラメトリック二元解析、続いて多重度についてボンフェローニ－ホルム（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ－Ｈｏｌｍ）調整による２つのコントラスト解析を、毎日繰り返し測定して行った：ｐ＞０．０５：ＮＳ，０．０５＜ｐ＞０．０１：＊，ｐ＜０．０１：＊＊。最終ｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩデータのために、ランク変換された生物発光シグナル上の因子群を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを行った。中央値±絶対偏差の中央値を有する記述統計を群及び測定日によって提供した：ｐ＞０．０５：ＮＳ，０．０５＜ｐ＞０．０１：＊，ｐ＜０．０１：＊＊。
【0272】
６．５．２ 結果
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＭｏｌｍ－１３－ｌｕｃ ＡＭＬ異種移植モデルにおいて抗白血病効果を誘導する（図８Ａ）。
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＭｏｌｍ－１３－ｌｕｃ ＡＭＬ異種移植モデルにおいて抗白血病効果を誘導する（図８Ａ）。
【0273】
ヒトエフェクターＴ細胞（Ｔ細胞／腫瘍比Ｒ＝１０）の存在下で、Ｍｏｌｍ－１３－ｌｕｃ異種移植モデルにおいて２日ごとに静脈内投与されたＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、すべての用量において十分に忍容性であった。有害事象又は体重の変化の証拠は治療下で観察されなかった。ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、試験したすべての用量で、同じ活性（０，０１２；０，１２；１２及び１２ｎｍｏｌ／ｋｇでそれぞれ２％（ｐ＜０．０００１）、対２％（ｐ＜０．０００１）、２％（ｐ＜０．０００１）及び３％（ｐ＜０．０００１）のｄＴ／ｄＣ）で全身の腫瘍増殖を阻害した（図８Ａ、８Ｂ）。
【0274】
すべての標的病変の最長直径（ＬＤ）の合計は、ベースライン合計ＬＤであった。ベースライン合計ＬＤを、客観的な腫瘍応答を特徴付けるための参照として使用した。
【0275】
長骨では、０．０１２ｎｍｏｌ／ｋｇで３／８完全奏効（ＣＲ；全病変の消失）及び１／８部分奏効（ＰＲ；ベースライン合計ＬＤを参照として、標的病変のＬＤの合計の少なくとも３０％の減少）が観察された。
【0276】
３／８ＣＲ及び１／８ＰＲが０．１２ｎｍｏｌ／ｋｇで観察され、４／８ＣＲ及び３／８ＰＲが１．２ｎｍｏｌ／ｋｇで観察され、３／７ＣＲ及び３／７ＰＲが１２ｎｍｏｌ／ｋｇで観察された（図８Ｃ）。参照ＴＣＲ－ＩＳＶＤ構築物は、１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ（８０％のｄＴ／ｄＣ）でＭｏｌｍ１３－ｌｕｃ腫瘍成長に対して全体的に不活性であった。ＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照１、３ｎｍｏｌ／ｋｇは、長骨における４／８ ＣＲを伴って、腫瘍増殖をｄＴ／ｄＣ ８％で阻害した（ＮＳをＡ０２５００１５６２（ＴＣＲ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物、配列番号１） 処置）（図８Ａ、８Ｂ）。
【0277】
最終ｅｘ ｖｉｖｏ生物発光イメージングに基づいて、ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、肝臓（ｐ＜０．０００１）、脾臓（ｐ＜０．０００１）及び卵巣（ｐ＜０．０００１）において腫瘍成長を有意に阻害したが、すべての試験された用量で腹部脂肪においては阻害せず、参照ＩＳＶＤ ＴＣＲ－ＨＬＥがすべての組織において不活性であり、ＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照は、肝臓（ｐ＜０．０００１）及び脾臓（ｐ＜０．０００１）において腫瘍負荷を有意に阻害したが、卵巣（ＮＳ）又は腹部脂肪組織においては阻害しなかった。（図９）
【0278】
６．６ 実施例６：Ｔ細胞媒介ヒト標的細胞殺傷
６．６．１ 材料及び方法
ＩＳＶＤ構築物を、エフェクター細胞及び非接着性標的細胞としてヒト初代Ｔ細胞を使用するフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイにおいて、リダイレクトされたＴ細胞媒介性殺傷について特徴付けた。ＣＤ１２３及び／又はＣＤ３３陽性標的細胞（ＭＯＬＭ－１３、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５５４、Ｕ－９３７、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１５９３．２、及びＫＧ－１ａ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４６．１（商標））を、ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ）を製造者の説明書に従って使用して、４μＭ ＰＫＨ－２６膜色素で標識した。エフェクター細胞（２．５×１０５細胞／ウェル）及びＰＫＨ標識標的細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を、標的細胞株のアッセイ培地（抗生物質を含まない標的増殖培地）中の９６ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、＃６５１ １８０）（エフェクター対標的比１０：１）中で共インキュベートした。濃度依存性細胞溶解の分析のために、標的アッセイ培地中の化合物の段階希釈液を細胞に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａの１０％ＦＢＳ及びＭｅｒｃｋの０．０５％アジ化ナトリウムを含むＧｉｂｃｏのＤ－ＰＢＳ）で洗浄した。その後、細胞を、５ｎＭ ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３ヨウ化物（６４２?６６１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ３６０５）が補充されたＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生細胞と死細胞とを区別した。細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。試料あたり、８０μＬの総試料体積を取得した。ＰＫＨ２６陽性細胞にゲーティングを設定し、この集団内でＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３陽性細胞を決定した。比溶解パーセント＝（（％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３＋ＩＳＶＤなし－％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３＋ＩＳＶＤあり）／（％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３＋ＩＳＶＤなし））×１００。
６．６．１ 材料及び方法
ＩＳＶＤ構築物を、エフェクター細胞及び非接着性標的細胞としてヒト初代Ｔ細胞を使用するフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイにおいて、リダイレクトされたＴ細胞媒介性殺傷について特徴付けた。ＣＤ１２３及び／又はＣＤ３３陽性標的細胞（ＭＯＬＭ－１３、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５５４、Ｕ－９３７、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１５９３．２、及びＫＧ－１ａ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４６．１（商標））を、ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ）を製造者の説明書に従って使用して、４μＭ ＰＫＨ－２６膜色素で標識した。エフェクター細胞（２．５×１０５細胞／ウェル）及びＰＫＨ標識標的細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を、標的細胞株のアッセイ培地（抗生物質を含まない標的増殖培地）中の９６ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、＃６５１ １８０）（エフェクター対標的比１０：１）中で共インキュベートした。濃度依存性細胞溶解の分析のために、標的アッセイ培地中の化合物の段階希釈液を細胞に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａの１０％ＦＢＳ及びＭｅｒｃｋの０．０５％アジ化ナトリウムを含むＧｉｂｃｏのＤ－ＰＢＳ）で洗浄した。その後、細胞を、５ｎＭ ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３ヨウ化物（６４２?６６１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ３６０５）が補充されたＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、生細胞と死細胞とを区別した。細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。試料あたり、８０μＬの総試料体積を取得した。ＰＫＨ２６陽性細胞にゲーティングを設定し、この集団内でＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３陽性細胞を決定した。比溶解パーセント＝（（％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３＋ＩＳＶＤなし－％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３＋ＩＳＶＤあり）／（％ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３＋ＩＳＶＤなし））×１００。
【0279】
本発明による多重特異性ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３ ＩＳＶＤ構築物を、ＣＤ３３結合ＩＳＶＤ又はＣＤ１２３結合ＩＳＶＤのいずれかが無関係なＩＳＶＤ ＩＲＲ（ＣＤ３３に結合せず、ＣＤ１２３に結合しない；表２３）並びにＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照及びＣＤ３３／ＣＤ３陽性対照によって置き換えられた対応する構築物と比較した。結果を図１０、図１１及び図１２に示す。
【0280】
６．６．２ 結果
図１０に見られるように、ＭＯＬＭ－１３細胞では、試験したすべての化合物が腫瘍細胞殺傷を誘発したが、これは、ＭＯＬＭ－１３細胞がＣＤ１２３及びＣＤ３３の両方が陽性であるので予想される。ＩＳＶＤ構築物のうち、二重標的化フォーマット（ＣＤ３３／ＣＤ１２３ ＴＣＥ）が最も強力な腫瘍細胞殺傷を有した。
図１０に見られるように、ＭＯＬＭ－１３細胞では、試験したすべての化合物が腫瘍細胞殺傷を誘発したが、これは、ＭＯＬＭ－１３細胞がＣＤ１２３及びＣＤ３３の両方が陽性であるので予想される。ＩＳＶＤ構築物のうち、二重標的化フォーマット（ＣＤ３３／ＣＤ１２３ ＴＣＥ）が最も強力な腫瘍細胞殺傷を有した。
【0281】
【0282】
【表22】
【0283】
【表23】
【0284】
ＴＣＲ－ＣＤ１２３単一標的化ＩＳＶＤは、ＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照についても観察されたように、ＣＤ１２３－Ｕ－９３７細胞の殺傷をほとんど誘導しなかった。同様に、ＣＤ３３単一標的化ＩＳＶＤは、ＣＤ３３／ＣＤ３陽性対照についても観察されたように、ＣＤ３３－／＋ＫＧ－１ａ細胞の低レベルの殺傷のみを誘導した。他方、二重標的化ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３ ＩＳＶＤ（構築物Ａ）は、ＣＤ３３－細胞株及びＣＤ１２３－細胞株の両方で強力な腫瘍細胞殺傷を示し、したがって二重標的化アプローチの利点を例証した。
【0285】
６．７ 実施例７：サイトカイン放出アッセイ
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）はＴ細胞エンゲージャーの既知の副作用であるため、本発明によるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物のサイトカイン放出プロファイルを自己健常ドナーＰＢＭＣアッセイで決定した。並行して、ヒトＰＢＭＣ内の単球の自己枯渇を評価した。本発明によるＩＳＶＤの官能性を２つのツール分子と比較した：ＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照及びＣＤ３３／ＣＤ３陽性対照。非標的Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）ＩＳＶＤを陰性対照として使用した。
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）はＴ細胞エンゲージャーの既知の副作用であるため、本発明によるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物のサイトカイン放出プロファイルを自己健常ドナーＰＢＭＣアッセイで決定した。並行して、ヒトＰＢＭＣ内の単球の自己枯渇を評価した。本発明によるＩＳＶＤの官能性を２つのツール分子と比較した：ＣＤ１２３／ＣＤ３陽性対照及びＣＤ３３／ＣＤ３陽性対照。非標的Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）ＩＳＶＤを陰性対照として使用した。
【0286】
６．７．１ 材料及び方法
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）溶液を含むＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブを使用して全血から単離された合計２０００００個のＰＢＭＣ（培養培地中２×１０６細胞／ｍＬで１００μＬ）を９６ウェルＶ底クリアウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルプレート；６５１：１８０）に移した。
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）溶液を含むＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブを使用して全血から単離された合計２０００００個のＰＢＭＣ（培養培地中２×１０６細胞／ｍＬで１００μＬ）を９６ウェルＶ底クリアウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルプレート；６５１：１８０）に移した。
【0287】
次に、試験対象化合物の段階希釈液５０μＬ又は空ウェル用の培養培地５０μＬをウェルに添加した。
【0288】
処置ＰＢＭＣを含む培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。一晩（２０時間）のインキュベーション後、ＰＢＭＣを３００ｇで２分間遠心分離した。上清を回収し、新しい９６ウェル貯蔵プレートに移し、サイトカイン測定のために－２０°Ｃで凍結した。細胞ペレットを１００μＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。
【0289】
その後、ＰＢＭＣを３００ｇで２分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、細胞を３０μＬの希釈Ｆｃブロック（ＦＡＣＳ緩衝液中１／２００）（ＢＤ，５６４２２０）に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。
【0290】
次に、３０μＬの（２Ｘ）抗体染色混合物（ＣＤ１２３、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１４抗体）をＰＢＭＣ懸濁液に添加し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。
【0291】
次いで、細胞懸濁液を２回洗浄し、５０μＬの希釈したＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３ヨウ化物に再懸濁した。プレートをＭＡＣＳＱｕａｎｔＸで読み取った。読み取ったのは、フローサイトメトリーによる各サブセットの生細胞数の検出であった。単球をＳＳＣ％ＣＤ１４＋によって定量した（図１３）。
【0292】
ヒトＰＢＭＣの一晩のインキュベーションからの凍結上清を使用して、Ｂｉｏ－ｒａｄからのマルチプレックスビーズアッセイを使用して、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＴＮＦαを含む一連のサイトカインを測定した。アッセイは、製造業者のガイドラインに従って実施した。Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭＡＰ ３Ｄシステムを使用して、反応からのデータを取得した（図１４）。
【0293】
６．７．２ 結果
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、すべてのドナーにおいてサイトカイン産生に関連する単球の枯渇を誘導した。非標的化ＴＣＥは、殺傷もサイトカイン放出も示さなかった（図１３参照）。図１３に示されるデータは、１名のドナーからのデータであり、これは、ＰＢＭＣを提供した６名すべてのドナーのデータを表す。
ＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物は、すべてのドナーにおいてサイトカイン産生に関連する単球の枯渇を誘導した。非標的化ＴＣＥは、殺傷もサイトカイン放出も示さなかった（図１３参照）。図１３に示されるデータは、１名のドナーからのデータであり、これは、ＰＢＭＣを提供した６名すべてのドナーのデータを表す。
【0294】
さらに、本発明によるＩＳＶＤ構築物によって誘導されるサイトカインの効力及び最高レベルの両方は、ＣＤ１２３／ＣＤ３対照化合物と比較して実質的に低かった。ＣＤ３３／ＣＤ３対照と比較して、本発明によるＩＳＶＤ構築物によって誘導されたＩＬ－６及びＴＮＦα産生は同等であった。ＩＬ－２及びＩＦＮγのレベルはＣＤ３３／ＣＤ３対照よりも高かったが、レベルは依然として許容可能であった。
【0295】
これに基づいて、本発明によるＩＳＶＤ構築物は、他のＣＤ１２３又はＣＤ３３標的化化合物よりもＣＲＳを誘導するリスクが高くなく、ヒトにおける使用に安全であるべきであると結論付けることができる。
【0296】
６．８ 実施例８：ｅｘ ｖｉｖｏ初代ＡＭＬ細胞死滅アッセイ
６．８．１ 材料及び方法
ＣＤ３３／ＣＤ３陽性対照によって媒介されるＡＭＬ芽球の溶解を以下のように試験した：原発診断又は再発を有する患者からのＡＭＬ試料を、他の細胞を添加せずにｅｘ ｖｉｖｏ共培養系で使用した。したがって、Ｅ：Ｔ比は、原発性ＡＭＬ試料内の残存Ｔ細胞の数によって決定した。ＡＭＬ患者からの全血試料は、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ（Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ，ＡＰ－ＨＭ）又はＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅの公共病院又は中央研究所によって提供された。
６．８．１ 材料及び方法
ＣＤ３３／ＣＤ３陽性対照によって媒介されるＡＭＬ芽球の溶解を以下のように試験した：原発診断又は再発を有する患者からのＡＭＬ試料を、他の細胞を添加せずにｅｘ ｖｉｖｏ共培養系で使用した。したがって、Ｅ：Ｔ比は、原発性ＡＭＬ試料内の残存Ｔ細胞の数によって決定した。ＡＭＬ患者からの全血試料は、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ（Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ，ＡＰ－ＨＭ）又はＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅの公共病院又は中央研究所によって提供された。
【0297】
最初に、１ｍＬの全血試料を５０ｍＬチューブごとに分配し、４０ｍＬの（１×）赤血球溶解緩衝液を添加し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ペレットをＰＢＳ（Ｅｕｒｏｂｉｏ ＣＳ１ＰＢＳ０１－０１）で洗浄し、１ｍＬの培養培地（（ＲＰＭＩ（Ｅｕｒｏｂｉｏ カタログ番号ＣＭ１ＲＰＭ００－０１）ＦＣＳ １０％（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｆ２４４２－５００ｍｌ １７Ｌ４８４）、非必須アミノ酸１％（Ｅｕｒｏｂｉｏ カタログ番号ＣＳＴＡＡＮ００）、グルタミン１％（Ｅｕｒｏｂｉｏ カタログ番号ＣＳＴＧＬＵ００）ピルビン酸ナトリウム１％（Ｅｕｒｏｂｉｏ カタログ番号ＣＳＴＶＡＴ００）、ペニシリン／ストレプトマイシン、（Ｅｕｒｏｂｉｏ カタログ番号ＣＡＢＰＥＳ０１））に再懸濁した。
【0298】
次に、３００μＬのＡＭＬ芽球細胞を、１ｍＬ（２×）の飽和濃度の本発明によるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物（ＣＤ３３／ＣＤ１２３ ＴＣＥ）、陽性対照（ＣＤ３３／ＣＤ３又はＣＤ１２３／ＣＤ３）又は陰性対照（非標的化ＴＣＥ）の存在下で、６ウェルプレート中のウェルあたり７００μＬの培養培地に添加し、５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。４日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。
【0299】
次に、Ｚｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ生存マーカー（ＰＢＳで１／１００希釈）を細胞ペレットに添加し、暗所で室温で５分間インキュベートした。
【0300】
次いで、細胞を洗浄し、抗体カクテル（ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１４、ＣＤ１２３、ＣＤ１１抗体）で染色し、氷上で１０分間インキュベートした。
【0301】
次に、細胞を洗浄し、１．５ｍＬのＰＢＳ＋２％パラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定した。３０分間のインキュベーション後、パラホルムアルデヒドを９ｍＬの希釈剤で希釈した。データをＣｙｔｏｆｌｅｘサイトメーターで分析した。結果を図１５～図１７に示す。
【0302】
６．８．２ 結果
ＡＭＬ試料あたりのＣＤ３３又はＣＤ１２３陽性細胞のパーセンテージを図１６に示す。見られるように、すべての患者はＣＤ３３及びＣＤ１２３陽性細胞の両方の数が多かった。さらに、ＡＭＬ患者は広範囲の疾患サブタイプを有していた。したがって、ＡＭＬ試料はこのアッセイでの使用に適していた。
ＡＭＬ試料あたりのＣＤ３３又はＣＤ１２３陽性細胞のパーセンテージを図１６に示す。見られるように、すべての患者はＣＤ３３及びＣＤ１２３陽性細胞の両方の数が多かった。さらに、ＡＭＬ患者は広範囲の疾患サブタイプを有していた。したがって、ＡＭＬ試料はこのアッセイでの使用に適していた。
【0303】
図１５には、すべてのＡＭＬ患者試料におけるＡＭＬ芽球細胞殺傷が示されている。各ドットは、本発明によるＩＳＶＤ又は陰性対照（非標的化ＴＣＥ）に対して正規化された陽性対照の１つでの処置後に生存している芽球数を表す。数人の別々の患者の結果が図１７で強調されている。
【0304】
見られるように、本発明によるＩＳＶＤで処理した芽球細胞の細胞生存率は、平均して、陽性対照と比較して最も低かった。すべての患者からの細胞は明確な応答を示したが、応答は患者によって異なっていた。これは、本発明によるＩＳＶＤがＣＤ１２３及びＣＤ３３陽性腫瘍細胞の殺細胞を標的化することができることを示す。
【0305】
６．９ 実施例９：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）試験
本発明によるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）及び非臨床安全性プロファイルをカニクイザルにおける研究で評価した。
本発明によるＴＣＲαβ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物の薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）及び非臨床安全性プロファイルをカニクイザルにおける研究で評価した。
【0306】
６．９．１ 材料及び方法
本発明によるＩＳＶＤ構築物を、単回用量の１時間連続静脈内（ＩＶ）注入とそれに続く２１日間の観察期間として合計４匹の雄カニクイザルに投与した。ＩＳＶＤの全身曝露及び潜在的毒性を決定し、ＰＤエンドポイント（免疫細胞評価）を評価した。研究設計を表２５に示す。
本発明によるＩＳＶＤ構築物を、単回用量の１時間連続静脈内（ＩＶ）注入とそれに続く２１日間の観察期間として合計４匹の雄カニクイザルに投与した。ＩＳＶＤの全身曝露及び潜在的毒性を決定し、ＰＤエンドポイント（免疫細胞評価）を評価した。研究設計を表２５に示す。
【0307】
【表24】
【0308】
６．９．２ 安全性
カニクイザルへのＩＳＶＤ構築物の単回１時間連続ＩＶ注入は十分に忍容された。試験の経過中に死亡及び治療関連臨床徴候は発生しなかった。処置に関連する体重変化及び体温変化は観察されなかった。
カニクイザルへのＩＳＶＤ構築物の単回１時間連続ＩＶ注入は十分に忍容された。試験の経過中に死亡及び治療関連臨床徴候は発生しなかった。処置に関連する体重変化及び体温変化は観察されなかった。
【0309】
サイトカイン評価は、０．０４μｇ／ｋｇでの単回投与として投与されたＩＳＶＤ構築物に関連するＩＬ－６の非常に最小の増加（注入開始の２時間及び／又は６時間後に発生し、２４時間以内にベースラインに戻るピーク）のみを示した。０．０４μｇ／ｋｇでは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－８及びＴＮＦ－αレベルの変化は観察されなかった。ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの非常に最小から最小への増加（注入開始２時間及び／又は６時間後に発生し、２４時間以内にベースラインに戻るピーク）は、０．４μｇ／ｋｇで単回投与として投与されたＩＳＶＤ構築物と関連していた。本発明によるＴＣＲ－ＣＤ３３－ＣＤ１２３多重特異性ＩＳＶＤ構築物に関連する変化は、０．４μｇ／ｋｇのサルのＩＬ－１β及びＩＬ－８レベルでは観察されなかった。
【0310】
したがって、本発明によるＩＳＶＤ構築物は、このＮＨＰモデルにおいて十分に許容されたと結論付けることができる。
【0311】
６．９．３ 薬物動態
ＩＳＶＤ構築物の１時間の注入後、血清レベルを、サルにおいて０．０４μｇ／ｋｇで３日まで、０．４μｇ／ｋｇで７日まで定量することができた。全体として、約０．０７Ｌ／日／ｋｇのクリアランスが、０．０４μｇ／ｋｇ及び０．４μｇ／ｋｇの用量レベルでのＩＶ注入後に観察された。最終排出半減期は、１日に近いと推定されている。０．０４μｇ／ｋｇから０．４μｇ／ｋｇまで、ＩＳＶＤ構築物曝露（ＡＵＣ）は、用量比例によって予想されるよりもわずかに減少した増加を示し、用量の１０倍の増加に対して、曝露は７．７倍増加したが、これはおそらく、１匹のサル（Ｍ３）で観察された曝露が低かったためである。ＰＫパラメータを表２６に報告する。
ＩＳＶＤ構築物の１時間の注入後、血清レベルを、サルにおいて０．０４μｇ／ｋｇで３日まで、０．４μｇ／ｋｇで７日まで定量することができた。全体として、約０．０７Ｌ／日／ｋｇのクリアランスが、０．０４μｇ／ｋｇ及び０．４μｇ／ｋｇの用量レベルでのＩＶ注入後に観察された。最終排出半減期は、１日に近いと推定されている。０．０４μｇ／ｋｇから０．４μｇ／ｋｇまで、ＩＳＶＤ構築物曝露（ＡＵＣ）は、用量比例によって予想されるよりもわずかに減少した増加を示し、用量の１０倍の増加に対して、曝露は７．７倍増加したが、これはおそらく、１匹のサル（Ｍ３）で観察された曝露が低かったためである。ＰＫパラメータを表２６に報告する。
【0312】
【表25】
【0313】
６．９．４ 薬力学
０．０４及び０．４μｇ／ｋｇでのカニクイザルへのＩＳＶＤ構築物の単回用量ＩＶ注入は、両方の用量レベルでＣＤ１２３＋細胞集団及びＣＤ３３＋単球の変化を誘導した。これらの変化は以下からなっていた：
－ 注入開始の６時間後から開始して、すべての動物について観察された総ＣＤ１２３＋細胞数の総減少この減少は、試験全体を通してすべての動物について維持された。
－ 注入開始の６時間後から開始して（及び０．０４μｇ／ｋｇのＩＳＶＤ構築物を受けている動物Ｍ１については１日目まで）、すべての動物について観察された単球ＣＤ３３＋細胞数の総減少。動物Ｍ３については、１日目に完全な回復が観察された。
０．０４及び０．４μｇ／ｋｇでのカニクイザルへのＩＳＶＤ構築物の単回用量ＩＶ注入は、両方の用量レベルでＣＤ１２３＋細胞集団及びＣＤ３３＋単球の変化を誘導した。これらの変化は以下からなっていた：
－ 注入開始の６時間後から開始して、すべての動物について観察された総ＣＤ１２３＋細胞数の総減少この減少は、試験全体を通してすべての動物について維持された。
－ 注入開始の６時間後から開始して（及び０．０４μｇ／ｋｇのＩＳＶＤ構築物を受けている動物Ｍ１については１日目まで）、すべての動物について観察された単球ＣＤ３３＋細胞数の総減少。動物Ｍ３については、１日目に完全な回復が観察された。
【0314】
また、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞数の総減少が注入開始の６時間後からすべての動物について観察された。ＣＤ８＋細胞については、完全な回復が３日目に観察され、動物Ｍ４についてはリバウンド効果があった。ＣＤ４＋細胞については、動物Ｍ４については３日目に完全な回復が観察された。
【0315】
細胞数を図１８に可視化した。
【0316】
７ 産業上の利用可能性
本明細書に記載のポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクター及び組成物は、例えば急性骨髄性白血病に罹患している対象の治療に使用され得る。
本明細書に記載のポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクター及び組成物は、例えば急性骨髄性白血病に罹患している対象の治療に使用され得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B-8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A-14C】
【図14D】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B-17C】
【図18A-18C】
【図18D】
【配列表】
【国際調査報告】