特表 2025-502304 殺虫性タンパク質をスクリーニングするための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-24

(54)【発明の名称】殺虫性タンパク質をスクリーニングするための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20250117BHJP

   C12N 15/32 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20250117BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20250117BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250117BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20250117BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20250117BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20250117BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250117BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20250117BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20250117BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/32

C12N15/113 Z

C12N15/10 220Z

C12N15/10 200Z

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12Q1/04

C12Q1/6869 Z

C12N1/21

C12N15/11 Z

C12N15/10 210Z

C12N1/15

G01N33/53 D

G01N33/543 541A

G01N33/543 597

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024542143

(86)(22)【出願日】2023-01-13

(85)【翻訳文提出日】2024-07-16

(86)【国際出願番号】 US2023060676

(87)【国際公開番号】W WO2023137458

(87)【国際公開日】2023-07-20

(31)【優先権主張番号】63/299,567

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520222106

【氏名又は名称】シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100162422

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 将

(72)【発明者】

【氏名】嘉祥寺谷 幸子

(72)【発明者】

【氏名】浅野 眞一郎

(72)【発明者】

【氏名】山本 貴志

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QS39

4B063QX02

4B065AA15X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD15

4B065CA24

4B065CA48

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA11

4H045DA83

4H045EA06

4H045FA74

4H045GA15

(57)【要約】

提供される方法において有用な組換え核酸、ＤＮＡ構築物、ベクター、融合タンパク質及び胞子と共に殺虫性タンパク質をスクリーニング及び同定するための方法が本明細書で提供される。提供される方法は、天然に存在する合成タンパク質及び操作された合成タンパク質を含む候補殺虫性タンパク質の効果的なハイスループットスクリーニングを可能にする。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合タンパク質をコードする組換え核酸であって、
ａ）胞子外殻ポリペプチドをコードする第１の核酸配列；
ｂ）リンカーをコードする第２の核酸配列；及び
ｃ）推定殺虫性ポリペプチドをコードする第３の核酸配列
を含む、組換え核酸。

【請求項2】

前記胞子外殻ポリペプチドがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌に由来する、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項3】

前記胞子外殻ポリペプチドが、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＧ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＸ、ＣｏｔＹ、又はＣｏｔＺである、請求項１又は２に記載の組換え核酸。

【請求項4】

前記胞子外殻ポリペプチドが、ＣｏｔＣ又はＣｏｔＧである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項5】

前記推定殺虫性ポリペプチドがバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶（Ｂｔ Ｃｒｙ）タンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え核酸配列。

【請求項6】

前記Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質が、野生型タンパク質と比較して少なくとも１つの改変を含む、請求項５に記載の組換え核酸。

【請求項7】

前記改変が、ＤＮＡシャッフリング、ブロックスワップ、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又はそれらの組み合わせの結果である、請求項６に記載の組換え核酸。

【請求項8】

前記Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質改変が、セリンプロテアーゼ消化に対する耐性をもたらす、請求項６又は７に記載の組換え核酸。

【請求項9】

前記推定殺虫性ポリペプチドが、昆虫消化系上皮細胞の細胞表面タンパク質と相互作用する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項10】

前記細胞表面タンパク質が、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体タンパク質、カドヘリンタンパク質、アミノペプチダーゼＮタンパク質又はアルカリホスファターゼタンパク質である、請求項９に記載の組換え核酸。

【請求項11】

前記細胞表面タンパク質がＡＢＣ輸送体タンパク質である、請求項９又は１０に記載の組換え核酸。

【請求項12】

前記ＡＢＣ輸送体タンパク質が、ＰｘＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ３、Ｄｖ－ＡＢＣＢ１、Ｂｍ－ＡＢＣＢ１、Ｓｆ－ＡＢＣＢ１、Ｂｍ－ＡＢＣＡ２、又はＴｃ－ＡＢＣＣ４である、請求項１０又は１１に記載の組換え核酸。

【請求項13】

前記ＡＢＣ輸送体タンパク質が、ＰｘＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２、又はＳｆ－ＡＢＣＣ３である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項14】

前記胞子外殻ポリペプチド及び前記推定殺虫性ポリペプチドが、前記リンカーによって構造的に単離されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項15】

前記リンカーが、少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項16】

前記リンカーが、少なくとも２つのアミノ酸を含むポリペプチドである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項17】

前記リンカーが、構造的に可撓性である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項18】

前記リンカーが、プロテアーゼ消化に耐性である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項19】

前記リンカーが、配列番号２０、２１、又は３８～６１のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換え核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物。

【請求項21】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換え核酸又は請求項２０に記載のＤＮＡ構築物を含むベクター。

【請求項22】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換え核酸、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項２１に記載のベクターによってコードされる融合タンパク質。

【請求項23】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換え核酸、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物、請求項２１に記載のベクター、又は請求項２２に記載の融合タンパク質を含む胞子。

【請求項24】

前記融合タンパク質が前記胞子の表面に提示される、請求項２３に記載の胞子。

【請求項25】

前記胞子が、細菌胞子又は真菌胞子である、請求項２３又は２４に記載の胞子。

【請求項26】

請求項２３～２５のいずれか一項に記載の複数の胞子を含む組成物であって、前記複数の胞子の各々が、異なる推定殺虫性ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む、組成物。

【請求項27】

殺虫性タンパク質を同定する方法であって、
ａ）請求項２２に記載の融合タンパク質又は請求項２３～２５のいずれか一項に記載の胞子を殺虫性タンパク質受容体と接触させること、及び
ｂ）前記融合タンパク質又は胞子と前記殺虫性タンパク質受容体との間の相互作用を検出すること、
を含み、前記相互作用が、前記融合タンパク質又は胞子の推定殺虫性タンパク質が殺虫性タンパク質であることを示す、方法。

【請求項28】

前記殺虫性タンパク質受容体が、精製殺虫性タンパク質受容体タンパク質である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記殺虫性タンパク質受容体が、ＳＭＡ脂質粒子の一部である、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

前記殺虫性タンパク質受容体が、細胞上で発現される、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記細胞が昆虫細胞である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記殺虫性タンパク質受容体がＡＢＣ輸送体タンパク質である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記融合タンパク質又は胞子と前記殺虫性タンパク質受容体との間の前記相互作用を検出することが、免疫磁気分離、フローサイトメトリー、細胞傷害性アッセイ、配列決定、又はそれらの組み合わせを行うことを含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記融合タンパク質又は胞子と前記殺虫性タンパク質受容体タンパク質との間の前記相互作用を検出することが、前記殺虫性タンパク質受容体タンパク質と相互作用する前記融合タンパク質をコードする前記組換え核酸を単離し、配列決定を行って前記殺虫性タンパク質の同一性を決定することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１月１４日に出願された米国仮出願第６３／２９９，５６７号に対する優先権の利益を主張し、その全内容は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。

【0002】

本開示は、植物バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、殺虫性タンパク質を所望の形質についてスクリーニングするための方法に関する。

【0003】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介したＸＭＬファイルとして提出された配列表の参照
本出願には、２０２３年１月１３日に作成された１０９０９８－１３６００６０．ｘｍｌという名称の配列表が添付されており、これはサイズが約１，０３，８４６バイトである。この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書と共に提出され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２４（ａ）（２）～（６）及び（ｂ）に準拠している。

【背景技術】

【0004】

殺虫性タンパク質は、天然に存在するタンパク質及び合成タンパク質を含み得る。候補の殺虫性タンパク質、特にバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）の殺虫性タンパク質は、ＤＮＡシャッフリング、ブロック交換、部位特異的、飽和及びランダム突然変異誘発によって操作（すなわち、人工的に改変）されていてもよい。これらの操作技術は、集合的なグループとしてライブラリーと呼ばれる多数の変異体を生成することが多い。そのようなライブラリーは、所望の形質又は所望の形質についてスクリーニングされ得る。このプロセスは、ハイスループットなタンパク質産生及び多様なタンパク質のスクリーニングを必要とする。そのようなハイスループットスクリーニングは、時間及び費用がかかる。このプロセスは、典型的には、１）タンパク質操作技術を使用して多様な殺虫性タンパク質（すなわち、天然に存在する及び／又は操作されたタンパク質）のライブラリーを作製すること；２）タンパク質産生のために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などの宿主生物においてライブラリー遺伝子をクローニングすること；３）マルチウェルプレート中のライブラリーを含有する宿主生物の形質転換体を個別に採取して、種子培養物を作製すること；４）ライブラリタンパク質をマルチウェルプレートで発現させ、それらを個別に単離すること；５）単離されたタンパク質を純度及び濃度について分析し、使用のためにタンパク質（すなわち、タンパク質濃度を調整することによって）を正規化すること；６）生きている昆虫における単離及び分析されたタンパク質の殺虫活性及び他の形質をアッセイして、所望の形質を有するタンパク質を同定すること；及び７）上記の工程を繰り返して、所望の形質を有するさらなるタンパク質を同定することを含む。

【0005】

現在のスクリーニングプロセスの欠点は、実験スループットが最大で数千のサンプルに制限され、マンパワー及びインフラストラクチャに大きな投資がないことである。律速因子は、プロセスが生昆虫バイオアッセイ及びバイオアッセイに必要な単離タンパク質の量を使用することを含むことである。したがって、上記の従来の方法を超えるスループットの向上は、新しい受容体特異性を見出すことを追求する上で非常に望ましい。

【発明の概要】

【0006】

この概要は、本開示の様々な態様の高レベルの概要であり、本明細書及び添付の図面に記載及び図示されている概念のいくつかを紹介する。この概要は、特許請求される主題の重要な又は本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を決定するために単独で使用されることも意図していない。主題は、明細書全体、任意の又はすべての図及び各請求項の適切な部分を参照することによって理解されるべきである。以下、本開示の実施の形態のいくつかについて説明する。

【0007】

本開示は、昆虫活性毒素タンパク質を同定するために細胞（粒子）選別技術を使用して推定毒素タンパク質及び／又はタンパク質バリアントのライブラリーをスクリーニングする新規方法の本発明者らによる発見に部分的に基づく。いくつかの実施形態では、さらに以下に記載されるように、昆虫活性毒素は、繋ぎ止められたタンパク質の遺伝情報を含有する担体粒子（例えば、胞子）上に個別に繋ぎ止められる（すなわち、タグ付け）。

【0008】

一態様では、融合タンパク質をコードする組換え核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ａ）胞子外殻ポリペプチドをコードする第１の核酸配列；ｂ）リンカーをコードする第２の核酸配列；ｃ）推定殺虫性ポリペプチドをコードする第３の核酸配列を含む。

【0009】

本明細書で提供される組換え核酸のいくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌に由来する。いくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドは、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＧ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＸ、ＣｏｔＹ又はＣｏｔＺである。いくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドは、ＣｏｔＣ又はＣｏｔＧである。

【0010】

本明細書で提供される組換え核酸のいくつかの実施形態では、推定殺虫性ポリペプチドはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶（Ｂｔ Ｃｒｙ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質は、野生型タンパク質と比較して少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＤＮＡシャッフリング、ブロックスワップ、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又はそれらの組み合わせの結果である。いくつかの実施形態では、Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質改変は、セリンプロテアーゼ消化に対する耐性をもたらす。

【0011】

いくつかの実施形態において、推定殺虫性ポリペプチドは、昆虫消化系上皮細胞の細胞表面タンパク質と相互作用する。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体タンパク質、カドヘリンタンパク質、アミノペプチダーゼＮタンパク質、又はアルカリホスファターゼタンパク質である。いくつかの態様では、細胞表面タンパク質はＡＢＣ輸送体タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質は、ＰｘＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ３、Ｄｖ－ＡＢＣＢ１、Ｂｍ－ＡＢＣＢ１、Ｓｆ－ＡＢＣＢ１、Ｂｍ－ＡＢＣＡ２、又はＴｃ－ＡＢＣＣ４である。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質は、ＰｘＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２、又はＳｆ－ＡＢＣＣ３である。

【0012】

本明細書で提供される組換え核酸のいくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチド及び推定殺虫性ポリペプチドは、リンカーによって構造的に単離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２つのアミノ酸を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、構造的に可撓性である。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロテアーゼ消化に耐性である。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２０、２１、又は３８～６１のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0013】

本明細書に記載の組換え核酸のいずれかを含むＤＮＡ構築物も提供される。本明細書に記載の組換え核酸又はＤＮＡ構築物のいずれかを含むベクターも提供される。

【0014】

本明細書に記載の組換え核酸、ＤＮＡ構築物又はベクターのいずれかによってコードされる融合タンパク質も本明細書で提供される。

【0015】

本明細書に記載の組換え核酸、ＤＮＡ構築物、ベクター、又は融合タンパク質のいずれかを含む胞子も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、胞子は融合タンパク質を含み、融合タンパク質は胞子の表面に提示される。いくつかの実施形態において、胞子は、細菌胞子又は真菌胞子である。

【0016】

本明細書に記載の胞子のいずれかを複数含む組成物も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、複数の胞子の各々は、異なる推定殺虫性ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。

【0017】

別の態様では、殺虫性タンパク質を同定する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子のいずれかを殺虫性タンパク質受容体と接触させること、及びｂ）融合タンパク質又は胞子と殺虫性タンパク質受容体との間の相互作用を検出することを含む。いくつかの実施形態において、前記相互作用は、融合タンパク質又は胞子の推定殺虫性タンパク質が殺虫性タンパク質であることを示す。いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体は、精製殺虫性タンパク質受容体タンパク質である。いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体は、ＳＭＡ脂質粒子の一部である。いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体は、細胞上で発現される。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体はＡＢＣ輸送体タンパク質である。

【0018】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質又は胞子と殺虫性タンパク質受容体との間の相互作用を検出することは、免疫磁気分離、フローサイトメトリー、細胞傷害性アッセイ、配列決定、又はそれらの組み合わせを行うことを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質又は胞子と殺虫性タンパク質受容体タンパク質との間の相互作用を検出することは、殺虫性タンパク質受容体タンパク質と相互作用する融合タンパク質をコードする組換え核酸を単離すること、及び殺虫性タンパク質の同一性を決定するために配列決定を行うことをさらに含む。

【0019】

本開示は、以下の図を含む。図面は、組成物及び方法の特定の実施形態及び／又は特徴を例示すること、並びに組成物及び方法の任意の説明を補足することを意図している。図面は、記載された説明がそのようであることを明示的に示さない限り、組成物及び方法の範囲を限定しない。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、本開示の態様による、ｃｏｔＣ又はｃｏｔＧ（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）外殻タンパク質遺伝子）をそれら自体のプロモーターを用いてＰＣＲによって増幅する方法を示す。この方法は、構造的に可撓性のリンカーを有するＣｏｔ－Ｃｒｙ融合タンパク質を形成するために、リンカーを介してｃｏｔ遺伝子をバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙ遺伝子に連結することをもたらす。

【図2】図２は、本開示の態様による、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｔＣ又はｃｏｔＧ遺伝子及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙ１Ａａ遺伝子を有する胞子提示ベクターを構築するための例示的な方法を示す。２つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＳＢ６３４、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のｐＢＣ１６．１と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳとの融合物及びｐＨＹ３００ＰＬＫ、ストレプトコッカス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）のｐＡＭα１と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＡＣＹＣ１７７との融合物を使用した。

【図3】図３は、本開示の態様に従って、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｔＣ又はｃｏｔＧ遺伝子が、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子から得られるリンカー及びターミネーターを用いてバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙ１Ａａ又はｃｒｙ１Ｆａ遺伝子と融合されたことを示す。Ｃｒｙ１タンパク質のＡｒｇ ２７／２８（Ｒ２７／２８）アミノ酸残基をＬｅｕ（Ｌ）に変異させてセリンプロテアーゼ消化を防止した。

【図4】図４は、本開示の態様による、抗Ｃｒｙ１抗体（Ａｂ）を用いてバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子上に提示されるバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ１タンパク質を検出する方法を示す。概略図（上のパネル）に示されるように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光色素で標識された抗体は、結合すると胞子蛍光をもたらす。下のパネルは、抗Ｃｒｙ１抗体に結合すると蛍光になるＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ（Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を提示する胞子）の顕微鏡図である（右下のパネル）。

【図5】図５は、本開示の態様による、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙタンパク質を提示するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子がフローサイトメトリーによって選別され得ることを実証する実現可能性試験を示す。Ｃｒｙタンパク質を提示するそれらの胞子を蛍光抗Ｃｒｙ抗体を用いて（例えば、図４に示すように）蛍光させた。２つの連続的な選別実験を行った：左パネルが最初の選別であり、その箱形領域の胞子を使用して右パネルを得た。

【図6】図６は、本開示の態様による、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＡＢＣＣ２遺伝子を発現するＳｆ９細胞（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株）（上のパネル）（Ｓｆ９：：Ｓｆ－ＡＢＣＣ２）及びＡＢＣＣ２遺伝子を発現しない別の細胞（下のパネル）の顕微鏡図を示す。これらのＳｆ９細胞を、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を提示するＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子と混合し、胞子に結合させた。結合したＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ胞子は、蛍光顕微鏡法によってＡｌｅｘａ標識抗Ｃｒｙ１Ｆａ抗体で輝点として可視化された（右上パネル）。宿主Ｓｆ９細胞はまた、ＧＦＰ遺伝子を発現したので、蛍光顕微鏡法によって可視化された。下のパネルは、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１ＦａがＳｆ－ＡＢＣＣ２タンパク質を発現しないＳｆ９細胞に結合しなかったことを示す陰性対照である。

【図7】図７は、本開示の態様による、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を発現するＳｆ９細胞に対するＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの細胞傷害活性の顕微鏡観察を示す。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１ＦａがＳｆ９細胞に結合した後、胞子上のＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、１時間以内に細胞膜を崩壊させた（上のパネル）。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａは、胞子上に結合したＡｌｅｘａ標識抗Ｃｒｙ抗体を有する輝点として蛍光顕微鏡下で可視であった。より長いインキュベーションにより、Ｓｆ９細胞が完全に崩壊したことが示された（下のパネル）。

【図8】図８は、本開示の態様による、ＳＭＡＬＰ（スチレン－マレイン酸脂質粒子）にＡＢＣ輸送体タンパク質をパッケージングする方法を示す。昆虫細胞膜に発現している輸送体タンパク質をＳＭＡ（スチレンマレイン酸）で抽出した。この図において、「抽出」は、ＳＭＡを用いた昆虫細胞膜からのＡＢＣ輸送体タンパク質の除去、及びＳＭＡＬＰ（スチレン－マレイン酸脂質粒子）における輸送体タンパク質のそれ自身のリン脂質によるパッケージングを指す。

【図9】図９は、本開示の態様による、抗ＦＬＡＧ抗体を使用するＳＭＡＬＰにおけるＳｆ－ＡＢＣＣ２－ＦＬＡＧのアフィニティーカラム精製を示す。本明細書の実施例で使用されるＡＢＣ輸送体タンパク質を、Ｃ末端のＦＬＡＧタグで標識した。ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２－ＦＬＡＧを、１ｍｌ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に充填した２００μｌの抗ＦＬＡＧ抗体固定化アガロースゲルに負荷した。１０％グリセロール（ＴＢＳ－グリセロール）を含むＴＢＳでカラムを洗浄し、１．２ｍｌの溶出緩衝液（ＴＢＳ－１０％グリセロール中０．１ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチド）でＳｆ－ＡＢＣＣ２を溶出した。カラム溶出液を６つの２００μｌ画分に分画し、Ａｌｅｘａ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いたドットブロッティングによって分析した。最初（Ｆｒ．１）を除いて最終的なスピンオフ（Ｆｒ．７）を含むすべての画分（「Ｆｒ」）は強い蛍光シグナルを示し、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２が親和性カラムから首尾よく溶出されたことを確認した。

【図10】図１０は、本開示の態様による、ＬＢ－ｔｅｔ－寒天プレート上で増殖するバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コロニーを示す。これらのコロニーは、Ｓｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４（Ｃｒｙタンパク質が提示されていない）又はＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ胞子由来であり、免疫磁気選別によって選別された。これらの胞子をＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２－ＦＬＡＧに（例えば、図９で精製されたように）結合させ、ＡＢＣＣ２結合胞子のみを捕捉するように設計された抗ＦＬＡＧ抗体固定化磁気ビーズで選別した。選別した胞子をＬＢ－ｔｅｔ－寒天プレート上に播種し、３７℃でインキュベートして１６時間で発芽させ、コロニーを形成した。陰性対照として同一のプロトコルの下で選別されたＳｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４は、わずかなコロニー（左パネル）しか示さず、この胞子試料とＳＭＡＬＰ中のＳｆ－ＡＢＣＣ２との間の結合がほとんどないことを示した。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの選別は、計数するには多すぎるコロニーを生じた（右パネル）。

【図11】図１１は、本開示の態様による、フローサイトメトリーによるＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａ（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子提示バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｃｒｙ１Ａａタンパク質）の選別を示す。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａ－Ｂｍ－ＡＢＣＣ２複合体を、抗ＦＬＡＧ－ｍｏｕｓｅ－抗体及びＡｌｅｘａ標識抗マウスＩｇＧ－抗体と順次混合することによって蛍光性にした。０．２％ ＳＤＳ（本明細書の実施例８に記載）で処理して、Ｃｒｙ１ＡａとＡＢＣ輸送体タンパク質の間の結合を部分的に切断することによって、細胞サイトメトリー用の蛍光胞子の集団を減少させた。これは、フローサイトメトリーによる胞子分離の実現可能性を実証するためである。顕微鏡観察により、少数の胞子のみが蛍光色素を保持していることが明らかになった。これらの蛍光胞子を、フローサイトメーター、Ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔセルソーター（Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって選別した。セルソーターは、おそらくＢｍ－ＡＢＣＣ２に結合した約１０００個の胞子を蛍光として引き出した。選別された１０００個の蛍光胞子（セルソータ出力に囲まれている）をサンプリングし、ＬＢ－寒天プレートに播種した。ＬＢプレートをＬＢ－ｔｅｔ－寒天プレート上にコピーした。８００個を超える胞子が発芽してテトラサイクリン選択プレート上にコロニーを形成することが見出され、これは、それらがＣｒｙ１Ａａを胞子表面に向けるプラスミドを含有し、テトラサイクリン耐性を付与することを示している。この選別プロセスは、捕捉された胞子が回収され得、Ｃｒｙタンパク質の配列がプラスミドのＤＮＡ配列決定によって推定され得ることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

Ｉ．序論
本開示は、胞子提示技術を使用して推定殺虫性タンパク質のライブラリーをスクリーニングするための効果的でハイスループットな方法の本発明者らによる発見に部分的に基づく。胞子提示技術はこれまで酵素及び抗原を提示するために利用されてきたが（例えば、ワクチン開発のために）、本開示は、受容体結合能についての殺虫性タンパク質のスクリーニングへの胞子提示の最初の応用を提供する。

【0022】

提供される方法において有用な組換え核酸、ＤＮＡ構築物、ベクター、融合タンパク質及び胞子と共に殺虫性タンパク質を同定するための方法が本明細書で提供される。提供される方法は、天然に存在する合成タンパク質及び操作された合成タンパク質を含む候補殺虫性タンパク質の効果的なハイスループットスクリーニングを可能にする。本明細書で詳述するように、提供される方法の実施形態は、微生物胞子（例えば、細菌胞子又は真菌胞子）の表面上に機能的に活性な殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶［Ｂｔ Ｃｒｙ］タンパク質）を提示することを含む。いくつかの実施形態において、胞子表面提示は、（例えば、構造的に可撓性のリンカーによって）候補殺虫性タンパク質に連結された胞子外殻タンパク質を含む融合タンパク質の使用を含む。いくつかの実施形態において、胞子における融合タンパク質の発現時に、融合タンパク質は、胞子表面に移動して、胞子外部に向かって（例えば、溶媒又は媒体に向かって）配置された殺虫性タンパク質を提示する。

【0023】

本明細書の実施例に記載される実験の前に、殺虫性タンパク質（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙ毒素）が胞子表面に機能的に（すなわち、殺虫性タンパク質受容体結合及びその後の殺虫性機能が保存される場合）提示され得るかどうかは知られていなかった。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、殺虫性タンパク質（例えば、Ｃｒｙタンパク質）部分が適切に折り畳まれ得、その受容体結合ドメインが受容体に曝露されるように、推定殺虫性タンパク質を胞子外殻タンパク質に一定の自由度又は完全な自由度で固定するために構造的に可撓性のリンカーを利用する融合タンパク質を含む。

【0024】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、殺虫性タンパク質は、スクリーニング中に胞子に付着したままであり、殺虫性タンパク質をコードする遺伝子を（例えば、以下に詳述するように、胞子提示ベクター中に）含む胞子は、その表面に固定された殺虫性タンパク質の配列タグを有する。スクリーニング中に殺虫性タンパク質の所望のバリアントを保有する胞子が見出された場合、そのバリアントの配列は、胞子中の殺虫性タンパク質遺伝子を配列決定することによって決定することができる。これにより、マルチウェルプレートにおいて個々のクローンを分離する必要がなくなる。本明細書で提供される胞子提示システムはまた、胞子のフローサイトメトリー選別を可能にするという利点を有するが、ファージ提示系で使用される大腸菌ファージは、フローサイトメトリーによって選別することができない。

【0025】

受容体結合活性についてＢｔ Ｃｒｙ変異体をスクリーニングするために関連技術であるファージ提示を使用する最近の試みは成功していないことが証明されている（Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５４：８８８－８９９）。ファージ提示に対する制限は、ファージ粒子が大腸菌で産生されるので、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えばＢｔ Ｃｒｙタンパク質及びその変異型）由来の不均一遺伝子が確実に発現されない可能性があることである。これは、スクリーニングライブラリーが多種多様なタンパク質配列を含む場合に特に問題となる。実際、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ（２０１２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５４：８８８－８９９）は、ファージ提示によって殺虫活性の改善が得られなかったことを見出した。さらに、結果は、ファージ提示Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質の構造が天然タンパク質の構造と同じでない可能性を示している。本明細書で提供される方法及び組成物は、この制限を克服する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主におけるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙ殺虫性タンパク質遺伝子）の均一な発現を可能にする。

【0026】

要約すると、本明細書で提供される方法は、限定するものではないが、以下を含む、他の殺虫性タンパク質スクリーニング技術を超えるいくつかの利点を有する：１）候補殺虫性タンパク質ライブラリー（例えば、免疫磁気分離及びフローサイトメトリーなどの細胞選別技術を使用する）のハイスループットスクリーニング；２）胞子がバチルス種において産生され得るので、ファージ提示と比較して、バチルス種由来の候補殺虫性タンパク質（例えば、Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質）の発現及びスクリーニングに対するより高い耐性；３）候補殺虫性タンパク質に対する受容体の可撓性の増加。

【0027】

ＩＩ．用語
本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、以下に特に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。本明細書で使用される技術への言及は、当業者には明らかであろうそれらの技術の変形及び／又は同等の技術の置換を含む、当技術分野で一般的に理解されている技術を指すことを意図している。以下の用語は、当業者によって十分に理解されていると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために記載されている。

【0028】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体」への言及は、任意選択的に、２つ以上のそのような分子の組み合わせなどを含む。

【0029】

本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指し、例えば±２０％、±１０％、又は±５％は、列挙された値の意図された意味の範囲内にある。

【0030】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語はオープンエンドである。対象の核酸（又はアミノ酸配列）に関連して使用される場合、それは、対象配列をその一部又は全体の配列として含む核酸配列（又はアミノ酸配列）を指す。

【0031】

「複数」という用語は、２つ以上の実体を指す。したがって、「複数の個体」は、少なくとも２つの個体を指す。いくつかの実施形態では、複数という用語は全体の半分以上を指す。例えば、いくつかの実施形態では、「複数の集団」は、その集団のメンバーの半分超を指す。

【0032】

「次世代発見技術」又は「ＮＧＤＴ」という用語は、以下に詳述するように、本開示の特定の実施形態を指すために使用される。

【0033】

「Ｃｒｙ」という用語は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶タンパク質ファミリーのメンバーを指し、そのメンバーは殺虫性であり得る。

【0034】

用語「Ｃｒｙ１Ｆａ」は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ、ツマジロクサヨトウ（Ｆａｌｌ Ａｒｍｙｗｏｒｍ））に対して高い活性を示し、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２に結合することが知られているＣｒｙタンパク質（又は、イタリック体化した場合［ｃｒｙ１Ｆａ］、前記タンパク質をコードする遺伝子）を指す。Ｃｒｙ１Ｆａのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ｃｒｙ１Ｆａのタンパク質コード領域の塩基配列を配列番号２に示す。

【0035】

用語「Ｃｒｙ１Ａａ」は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（Ｂｍ、カイコ（Ｓｉｌｋｗｏｒｍ））及びコナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（Ｐｘ、コナガ（Ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ Ｍｏｔｈ））に対して高い活性を示し、Ｂｍ／Ｐｘ－ＡＢＣＣ２に結合することが知られているＣｒｙタンパク質（又は、イタリック体化した場合［ｃｒｙ１Ａａ］、前記タンパク質をコードする遺伝子）を指す。Ｃｒｙ１Ａａのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ｃｒｙ１Ａａのタンパク質コード領域の塩基配列を配列番号４に示す。

【0036】

「ＡＴＰ結合カセット輸送体」又は「ＡＢＣ輸送体」という用語は、現存するすべての門に代表される輸送系タンパク質の大きなファミリーを指す。「ＡＢＣＣ」という用語は、ＡＢＣ輸送体サブファミリーＣ、２型（ＡＢＣＣ２）タンパク質及び／又は３型（ＡＢＣＣ３）タンパク質（又は、イタリック体化した場合［ＡＢＣＣ］、前記タンパク質をコードする遺伝子）を指す。Ｐｘ－ＡＢＣＣ２のアミノ酸配列を配列番号５に、Ｐｘ－ＡＢＣＣ２のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列を配列番号６に示す。Ｂｍ－ＡＢＣＣ２のアミノ酸配列を配列番号７に、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２のタンパク質コード領域の塩基配列を配列番号８に示す。Ｓｆ－ＡＢＣＣ２のアミノ酸配列を配列番号９に、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２のタンパク質コード領域の塩基配列を配列番号１０に示す。Ｃｒｙ１Ｆａ耐性Ｓｆ株由来のＳｆ－ＡＢＣＣ２変異体（本明細書では「Ｓｆ－ＡＢＣＣ２変異体」と呼ぶ）のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２変異体のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列を配列番号１２に示す。Ｓｆ－ＡＢＣＣ３のアミノ酸配列を配列番号１３に、Ｓｆ－ＡＢＣＣ３のタンパク質コード領域の塩基配列を配列番号１４に示す。同じクラスのＡＢＣ輸送体（例えば、異なる昆虫種のＡＢＣＣ２タンパク質）内のタンパク質配列に違いがあるため、本明細書ではＡＢＣＣは一般に昆虫種の略語、例えばＳｆ（ツマジロクサヨトウ（Ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））、Ｂｍ（カイコ（Ｓｉｌｋｗｏｒｍ）、ボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ））、Ｄｖ（ウェスタンコーンルートワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ＷＣＲ）、ディアブロティカ・バーギフェラ・バーギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ））、Ｔｃ（コクヌストモミ（Ｒｅｄ ｆｌｏｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）、トリボリウム・カスタネウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ））などで言及され、供給源を示す。

【0037】

本明細書で使用される場合、改変なしの「胞子」という用語は、任意の胞子産生微生物の胞子を指す。胞子を生成する微生物の例としては、本明細書で以下に詳述するように、細菌種及び真菌種が挙げられる。特定の供給源からの胞子は、本明細書では属又は種の名称、例えば一般にＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子で示され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質（例えば、胞子の表面上に発現され得る胞子によって発現されるタンパク質）及び／又はベクター（例えば、タンパク質が胞子の表面に提示されると予想されない場合）を含む胞子を提供する。そのような胞子は、「Ｓｐｏｒｅ－［タンパク質名］」（例えば、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ又はＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａ）又は「Ｓｐｏｒｅ－［ベクター名］」（例えば、Ｓｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４又はＳｐｏｒｅ－ｐＨＹ３００ＰＬＫ）として示される。

【0038】

「ＣｏｔＣ」という用語は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子外殻Ｃ型タンパク質（又は、イタリック体化した場合［ｃｏｔＣ］、前記タンパク質をコードする遺伝子）を指す。ＣｏｔＣのアミノ酸配列を配列番号１５に、ｃｏｔＣのヌクレオチド配列（自身のプロモーターを含む）を配列番号１６に示す。

【0039】

「ＣｏｔＧ」という用語は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子外殻Ｇ型タンパク質（又は、イタリック体化した場合［ｃｏｔＧ］、前記タンパク質をコードする遺伝子）を指す。ＣｏｔＧのアミノ酸配列を配列番号１７に、ｃｏｔＧの塩基配列（自身のプロモーターを含む）を配列番号１８に示す。

【0040】

「ｃｒｙ１Ａｃターミネーター」という用語は、そのヌクレオチド配列が配列番号１９に示されている二重ヘアピンＲＮＡ構造を有するＢｔ ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子の翻訳ターミネーターを指す。

【0041】

「Ｃｒｙ１Ａａリーダー配列」及び「Ｃｒｙ１Ｆａリーダー配列」という用語は、成熟Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ｆａタンパク質のＮ末端に結合した短い（約２７アミノ酸）天然アミノ酸配列を指し、これは昆虫腸内のプロテアーゼ消化によって除去され、プロトキシンを成熟毒素に変換する。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、Ｃｏｔタンパク質とＣｒｙタンパク質との間の可撓性のリンカーとして働く。Ｃｒｙ１Ａａリーダー配列を配列番号２０に示し、Ｃｒｙ１Ｆａリーダー配列を配列番号２１に示す。

【0042】

「胞子提示ベクター」という用語は、殺虫性タンパク質が胞子外殻タンパク質遺伝子と共にクローニングされてタンパク質（例えば、１つ以上の胞子の表面上）を発現（又は提示）するプラスミドベクターを指す。本開示では、２つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ｐＢＣ１６．１及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＫＳを含有するｐＳＢ６３４（配列番号２２）、並びにストレプトコッカス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ｐＡＭ－アルファ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＡＣＹＣ１７７を含有するｐＨＹ３００ＰＬＫ（配列番号２３）を例として使用した。

【0043】

「ｔｅｔ」という用語は、抗生物質化合物テトラサイクリンを指す。

【0044】

「ＬＢ」という用語は、ルリアブロスを指す。いくつかの実施形態では、ＬＢは、１Ｌの水中に１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、及び１０ｇのＮａＣｌを含む。本開示において、１／２ ＬＢは２倍希釈ＬＢ（例えば、水で希釈）を意味し、「ＬＢ－Ａｇａｒ」は１．５％寒天で作製した固体ＬＢ培地を指す。

【0045】

「Ｓｆ９」という用語は、親細胞株スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ２１ ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１－ＡＥ（蛹卵巣組織に由来する）のクローン単離昆虫細胞株を指す。

【0046】

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を指す。特定の実施形態では、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態、及びそれらの組み合わせを指す。この用語には、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの一本鎖及び二本鎖形態も含まれるが、これらに限定されない。さらに、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば環状ＤＮＡ鋳型、本明細書に開示される核酸コンカテマーは、天然に存在するヌクレオチド結合及び／又は天然に存在しないヌクレオチド結合によって互いに結合された天然に存在するヌクレオチド及び改変ヌクレオチドのいずれか又は両方を含むことができる。当技術分野の当業者によって容易に理解されるように、核酸分子は、化学的若しくは生化学的に改変され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上の類似体との置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤及び改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。上記の用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分的に二重鎖化された、三重鎖、ヘアピンニングされた、円形及びパッドロックされた立体配座を含む任意のトポロジカルコンフォメーションを含むことが意図される。核酸配列への言及は、特に明記しない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補鎖、その相補配列を包含すると理解されるべきである。ヌクレオチド配列は、溶液中で特異的に（例えば、ワトソン・クリック型塩基対合規則に従って）ハイブリダイズする場合、「相補的」である。この用語はまた、同じポリペプチド配列をコードするコドン最適化された核酸を含む。核酸は、未精製、精製、又は例えばビーズ若しくはカラムマトリックスなどの合成材料に結合され得ることも理解される。

【0047】

別段示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的配列、並びに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。

【0048】

本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈で使用される「同一性」又は「実質的同一性」という用語は、参照配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。或いは、同一性パーセントは、６０％～１００％の任意の整数であり得る。例示的な実施形態は、少なくとも以下：本明細書に記載のプログラム；好ましくは、以下に記載されるような標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用した参照配列と比較して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。当業者は、これらの値を、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整することができることを認識するであろう。

【0049】

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することも、代替パラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0050】

本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常は約５０～約２００、より通常は約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含み、ここで、配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）による局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）による相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）による類似性探索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（例えば、ＢＬＡＳＴ）、又は手動位置合わせ及び目視検査による方法によって行うことができる。

【0051】

特に、パーセント配列同一性及びパーセント配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリ配列中の長さＷの短い単語を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さの単語とアラインメントされたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか又はそれを満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、前出）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、単語ヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチング残差に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残差に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する場合に停止され；累積スコアは、１つ又はそれを超える負スコアの残基アラインメントの蓄積のために０以下になるか；又はいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードサイズ（Ｗ）２８、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワードサイズ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９））。

【0052】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３））。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０^-5未満、最も好ましくは約１０^-20未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。

【0053】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。本明細書で使用される場合、この用語は、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合によって連結されている。

【0054】

本明細書に記載のポリペプチド中のアミノ酸は、２０個の天然アミノ酸、天然アミノ酸のＤ－立体異性体、非天然アミノ酸及び化学改変アミノ酸のいずれかであり得る。非天然アミノ酸（すなわち、タンパク質に天然には見られないもの）も、例えばＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２３（４）：５８１－５８７（２０１３）；Ｘｉｅ ｅｔ ｌａ．“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ”，９（６）：５４８－５４（２００５））及びそこに引用されているすべての参考文献に記載されているように、当技術分野で公知である。β及びγアミノ酸は当技術分野で公知であり、本明細書では非天然アミノ酸としても企図される。

【0055】

本明細書で使用される場合、化学改変アミノ酸は、側鎖が化学改変されているアミノ酸を指す。例えば、側鎖は、シグナル伝達部分、例えばフルオロフォア又は放射性標識を含むように改変することができる。側鎖は、チオール、カルボン酸又はアミノ基などの新しい官能基を含むように改変することもできる。翻訳後改変アミノ酸も化学改変アミノ酸の定義に含まれる。

【0056】

保存的アミノ酸置換も企図される。例として、保存的アミノ酸置換は、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、本明細書で提供されるポリペプチドのいずれかの１つ以上のリジン残基で行うことができる。当技術分野の当業者は、保存的置換が、あるアミノ酸残基を生物学的及び／又は化学的に類似する別のアミノ酸残基で置換することであることを知っているであろう。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）

【0057】

例として、アルギニンからセリンが言及される場合、セリンの保存的置換（例えば、トレオニン）も企図される。例えばリジンをアスパラギンで置換する非保存的置換も企図される。

【0058】

本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素がそれに結合することを可能にする核酸標的にアニーリング（いくつかの実施形態では、核酸標的に特異的にアニーリング）することができ、それによってプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（例えば、ヌクレオチド及び重合のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）の存在下、適切な温度及びｐＨで）に置かれた場合にＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、植物核酸（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる；ＰＣＲ）を増幅するために、１つ又は複数のプライマーが使用される。

【0059】

ＩＩＩ．組換え核酸、構築物、ベクター及び胞子
一態様では、融合タンパク質をコードする組換え核酸であって：ａ）胞子外殻ポリペプチドをコードする第１の核酸配列；ｂ）リンカーをコードする第２の核酸配列；ｃ）推定殺虫性ポリペプチドをコードする第３の核酸配列を含む組換え核酸が本明細書において提供される。

【0060】

Ａ．胞子外殻ポリペプチド
組換え核酸のいくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドは、胞子を産生する任意の微生物由来である。いくつかの実施形態では、微生物は、内生胞子産生細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、以下の属のいずれかの種である：アセトネマ（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アルカリバチルス（Ａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンモニフィラス（Ａｍｍｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネロバクター（Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アネロスポラ（Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒａ）、アノイリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルダネロバクター（Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、カロラマター（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ）、カミニセラ（Ｃａｍｉｎｉｃｅｌｌａ）、セラシバチルス（Ｃｅｒａｓｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジイサリバクター（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｉｓａｌｉｂａｃｔｅｒ）、コネラ（Ｃｏｈｎｅｌｌａ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）（すなわち、コクシエラ・バーネティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ））、デンドロスポロバクター（Ｄｅｎｄｒｏｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、出スルフォトマクラム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、デスルフォスポロムサ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｍｕｓａ）、デスルフォスポロシヌス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ）、デスルフォバーグラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｒｇｕｌａ）、デスルフニスポラ（Ｄｅｓｕｌｆｕｎｉｓｐｏｒａ）、デスルフリスポラ（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｏｒａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲルリア（Ｇｅｌｒｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオスポロバクター（Ｇｅｏｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロナトロヌム（Ｈａｌｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、ヘリオバクテリウム（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリオフィルム（Ｈｅｌｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ラセイエラ（Ｌａｃｅｙｅｌｌａ）、レンチバチルス（Ｌｅｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、リシンバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、マヘラ（Ｍａｈｅｌｌａ）、メタバクテリウム（Ｍｅｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、モオレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、ナトロニエラ（Ｎａｔｒｏｎｉｅｌｌａ）、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、オレニア（Ｏｒｅｎｉａ）、オルニチニバチルス（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、オキサロファガス（Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ）、オキソバクター（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラリオバチルス（Ｐａｒａｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペロスポラ（Ｐｅｌｏｓｐｏｒａ）、ペロトマクルム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、ピスシバチルス（Ｐｉｓｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プラニフィルム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ）、ポンチバチルス（Ｐｏｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロピオニスポラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ）、サリニバチルス（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルスギニバチルス（Ｓａｌｓｕｇｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、セイノネラ（Ｓｅｉｎｏｎｅｌｌａ）、シマズエラ（Ｓｈｉｍａｚｕｅｌｌａ）、スポラセチゲニウム（Ｓｐｏｒａｃｅｔｉｇｅｎｉｕｍ）、スポロナエロバクター（Ｓｐｏｒｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、スポロバクター（Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、スポロバクテリウム（Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロハロバクター（Ｓｐｏｒｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スポロムサ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）、スポロタレア（Ｓｐｏｒｏｔａｌｅａ）、スポロトマクルム（Ｓｐｏｒｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、シントロフォモナス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、シントロフォスポラ（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ）、テヌイバチルス（Ｔｅｎｕｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テピジバクター（Ｔｅｐｉｄｉｂａｃｔｅｒ）、テリバチルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、タラッソバチルス（Ｔｈａｌａｓｓｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモアセトゲニウム（Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ）、サーモアクチノミエス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、サーモアルキルバチルス（Ｔｈｅｒｍｏａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サーモアナエロモナス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｍｏｎａｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモフラビミクロビウム（Ｔｈｅｒｍｏｆｌａｖｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、サーモヴェナブルム（Ｔｈｅｒｍｏｖｅｎａｂｕｌｕｍ）、ツベリバチルス（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バージバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、又はブルカノバチルス（Ｖｕｌｃａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）。

【0061】

いくつかの実施形態において、胞子外殻ポリペプチドは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来する。いくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））胞子外殻（Ｃｏｔ）タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、Ｃｏｔタンパク質は、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＧ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＸ、ＣｏｔＹ又はＣｏｔＺである。いくつかの実施形態では、Ｃｏｔタンパク質は、ＣｏｔＣ又はＣｏｔＧである。

【0062】

本明細書において提供する組換え核酸のいくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドをコードする第１の核酸配列は、配列番号１６又は配列番号１８と少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１５又は配列番号１７と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む胞子外殻ポリペプチドをコードする。

【0063】

本明細書で提供される組換え核酸のいくつかの実施形態では、胞子外殻ポリペプチドは胞子産生真菌に由来する。いくつかの実施形態では、真菌は、以下の門のいずれかに由来する：接合菌門（Ｚｙｇｅｍｙｃｏｔａ）、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）又は卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）。

【0064】

Ｂ．推定殺虫性ポリペプチド
本明細書で提供される組換え核酸は、以下の構造クラスのいずれかの推定殺虫性ポリペプチドをコードすることができる：Ａｐｐ、Ｃｒｙ、Ｃｙｔ、Ｇｐｐ、Ｍｃｆ、Ｍｐｆ、Ｍｐｐ、Ｍｔｘ、Ｐｒａ、Ｐｒｂ、Ｓｐｐ、Ｔｐｐ、Ｖｉｐ、Ｖｐａ、又はＶｐｂ。例えば、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１０７４３８（２０２０）；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０２０．１０７４３８を参照されたい。

【0065】

いくつかの実施形態において、殺虫性ポリペプチドは、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）殺虫性タンパク質（Ｃｒｙタンパク質、栄養性殺虫性タンパク質（ＶＩＰ）、及び前述の殺虫性タンパク質のいずれかの殺虫性キメラが含まれるが、これらに限定されない）である。いくつかの実施形態において、推定殺虫性ポリペプチドは、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶（Ｂｔ Ｃｒｙ）タンパク質である。

【0066】

Ｃｒｙタンパク質の例としては、Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｄ、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ａｆ、Ｃｒｙ１Ａｇ、Ｃｒｙ１Ａｈ、Ｃｒｙ１Ａｉ、Ｃｒｙ１Ａｊ、Ｃｒｙ１Ｂａ、Ｃｒｙ１Ｂｂ、Ｃｒｙ１Ｂｃ、Ｃｒｙ１Ｂｄ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｂｆ、Ｃｒｙ１Ｂｇ、Ｃｒｙ１Ｂｈ、Ｃｒｙ１Ｂｉ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｃｂ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１Ｄｂ、Ｃｒｙ１Ｄｃ、Ｃｒｙ１Ｄｄ、Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｅｂ、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｆｂ、Ｃｒｙ１Ｇａ、Ｃｒｙ１Ｇｂ、Ｃｒｙ１Ｇｃ、Ｃｒｙ１Ｈａ、Ｃｒｙ１Ｈｂ、Ｃｒｙ１Ｈｃ、Ｃｒｙ１Ｉａ、Ｃｒｙ１Ｉｂ、Ｃｒｙ１Ｉｃ、Ｃｒｙ１Ｉｄ、Ｃｒｙ１Ｉｅ、Ｃｒｙ１Ｉｆ、Ｃｒｙ１Ｉｇ、Ｃｒｙ１Ｊａ、Ｃｒｙ１Ｊｂ、Ｃｒｙ１Ｊｃ、Ｃｒｙ１Ｊｄ、Ｃｒｙ１Ｋａ、Ｃｒｙ１Ｌａ、Ｃｒｙ１Ｍａ、Ｃｒｙ１Ｎａ、Ｃｒｙ１Ｎｂ、Ｃｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａｄ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ、Ｃｒｙ２Ａｇ、Ｃｒｙ２Ａｈ、Ｃｒｙ２Ａｉ、Ｃｒｙ２Ａｊ、Ｃｒｙ２Ａｋ、Ｃｒｙ２Ａｌ、Ｃｒｙ２Ｂａ、Ｃｒｙ３Ａａ、Ｃｒｙ３Ｂａ、Ｃｒｙ３Ｂｂ、Ｃｒｙ３Ｃａ、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ、Ｃｒｙ４Ｃａ、Ｃｒｙ４Ｃｂ、Ｃｒｙ４Ｃｃ、Ｃｒｙ５Ａａ、Ｃｒｙ５Ａｂ、Ｃｒｙ５Ａｃ、Ｃｒｙ５Ａｄ、Ｃｒｙ５Ｂａ、Ｃｒｙ５Ｃａ、Ｃｒｙ５Ｄａ、Ｃｒｙ５Ｅａ、Ｃｒｙ６Ａａ、Ｃｒｙ６Ｂａ、Ｃｒｙ７Ａａ、Ｃｒｙ７Ａｂ、Ｃｒｙ７Ａｃ、Ｃｒｙ７Ｂａ、Ｃｒｙ７Ｂｂ、Ｃｒｙ７Ｃａ、Ｃｒｙ７Ｃｂ、Ｃｒｙ７Ｄａ、Ｃｒｙ７Ｅａ、Ｃｒｙ７Ｆａ、Ｃｒｙ７Ｆｂ、Ｃｒｙ７Ｇａ、Ｃｒｙ７Ｇｂ、Ｃｒｙ７Ｇｃ、Ｃｒｙ７Ｇｄ、Ｃｒｙ７Ｈａ、Ｃｒｙ７Ｉａ、Ｃｒｙ７Ｊａ、Ｃｒｙ７Ｋａ、Ｃｒｙ７Ｋｂ、Ｃｒｙ７Ｌａ、Ｃｒｙ８Ａａ、Ｃｒｙ８Ａｂ、Ｃｒｙ８Ａｃ、Ｃｒｙ８Ａｄ、Ｃｒｙ８Ｂａ、Ｃｒｙ８Ｂｂ、Ｃｒｙ８Ｂｃ、Ｃｒｙ８Ｃａ、Ｃｒｙ８Ｄａ、Ｃｒｙ８Ｄｂ、Ｃｒｙ８Ｅａ、Ｃｒｙ８Ｆａ、Ｃｒｙ８Ｇａ、Ｃｒｙ８Ｈａ、Ｃｒｙ８Ｉａ、Ｃｒｙ８Ｉｂ、Ｃｒｙ８Ｊａ、Ｃｒｙ８Ｋａ、Ｃｒｙ８Ｋｂ、Ｃｒｙ８Ｌａ、Ｃｒｙ８Ｍａ、Ｃｒｙ８Ｎａ、Ｃｒｙ８Ｐａ、Ｃｒｙ８Ｑａ、Ｃｒｙ８Ｒａ、Ｃｒｙ８Ｓａ、Ｃｒｙ８Ｔａ、Ｃｒｙ９Ａａ、Ｃｒｙ９Ｂａ、Ｃｒｙ９Ｂｂ、Ｃｒｙ９Ｃａ、Ｃｒｙ９Ｄａ、Ｃｒｙ９Ｄｂ、Ｃｒｙ９Ｄｃ、Ｃｒｙ９Ｅａ、Ｃｒｙ９Ｅｂ、Ｃｒｙ９Ｅｃ、Ｃｒｙ９Ｅｄ、Ｃｒｙ９Ｅｅ、Ｃｒｙ９Ｆａ、Ｃｒｙ９Ｇａ、Ｃｒｙ１０Ａａ、Ｃｒｙ１１Ａａ、Ｃｒｙ１１Ｂａ、Ｃｒｙ１１Ｂｂ、Ｃｒｙ１２Ａａ，Ｃｒｙ１３Ａａ、Ｃｒｙ１４Ａａ、Ｃｒｙ１４Ａｂ、Ｃｒｙ１５Ａａ、Ｃｒｙ１６Ａａ、Ｃｒｙ１７Ａａ、Ｃｒｙ１８Ａａ、Ｃｒｙ１８Ｂａ、Ｃｒｙ１８Ｃａ、Ｃｒｙ１９Ａａ、Ｃｒｙ１９Ｂａ、Ｃｒｙ１９Ｃａ、Ｃｒｙ２０Ａａ、Ｃｒｙ２０Ｂａ、Ｃｒｙ２１Ａａ、Ｃｒｙ２１Ｂａ、Ｃｒｙ２１Ｃａ、Ｃｒｙ２１Ｄａ、Ｃｒｙ２１Ｅａ、Ｃｒｙ２１Ｆａ、Ｃｒｙ２１Ｇａ、Ｃｒｙ２１Ｈａ、Ｃｒｙ２２Ａａ、Ｃｒｙ２２Ａｂ、Ｃｒｙ２２Ｂａ、Ｃｒｙ２２Ｂｂ、Ｃｒｙ２３Ａａ、Ｃｒｙ２４Ａａ、Ｃｒｙ２４Ｂａ、Ｃｒｙ２４Ｃａ、Ｃｒｙ２５Ａａ、Ｃｒｙ２６Ａａ、Ｃｒｙ２７Ａａ、Ｃｒｙ２８Ａａ、Ｃｒｙ２９Ａａ、Ｃｒｙ２９Ｂａ、Ｃｒｙ３０Ａａ、Ｃｒｙ３０Ｂａ、Ｃｒｙ３０Ｃａ、Ｃｒｙ３０Ｄａ、Ｃｒｙ３０Ｄｂ、Ｃｒｙ３０Ｅａ、Ｃｒｙ３０Ｆａ、Ｃｒｙ３０Ｇａ，Ｃｒｙ３１Ａａ、Ｃｒｙ３１Ａｂ、Ｃｒｙ３１Ａｃ、Ｃｒｙ３１Ａｄ、Ｃｒｙ３２Ａａ、Ｃｒｙ３２Ａｂ、Ｃｒｙ３２Ｂａ、Ｃｒｙ３２Ｃａ、Ｃｒｙ３２Ｃｂ、Ｃｒｙ３２Ｄａ、Ｃｒｙ３２Ｅａ、Ｃｒｙ３２Ｅｂ、Ｃｒｙ３２Ｆａ、Ｃｒｙ３２Ｇａ、Ｃｒｙ３２Ｈａ、Ｃｒｙ３２Ｈｂ、Ｃｒｙ３２Ｉａ、Ｃｒｙ３２Ｊａ、Ｃｒｙ３２Ｋａ、Ｃｒｙ３２Ｌａ、Ｃｒｙ３２Ｍａ、Ｃｒｙ３２Ｍｂ、Ｃｒｙ３２Ｎａ、Ｃｒｙ３２Ｏａ、Ｃｒｙ３２Ｐａ、Ｃｒｙ３２Ｑａ、Ｃｒｙ３２Ｒａ、Ｃｒｙ３２Ｓａ、Ｃｒｙ３２Ｔａ、Ｃｒｙ３２Ｕａ、Ｃｒｙ３３Ａａ、Ｃｒｙ３４Ａａ、Ｃｒｙ３４Ａｂ、Ｃｒｙ３４Ａｃ、Ｃｒｙ３４Ｂａ、Ｃｒｙ３５Ａａ、Ｃｒｙ３５Ａｂ、Ｃｒｙ３５Ａｃ、Ｃｒｙ３５Ｂａ、Ｃｒｙ３６Ａａ、Ｃｒｙ３７Ａａ、Ｃｒｙ３８Ａａ、Ｃｒｙ３９Ａａ、Ｃｒｙ４０Ａａ、Ｃｒｙ４０Ｂａ、Ｃｒｙ４０Ｃａ、Ｃｒｙ４０Ｄａ、Ｃｒｙ４１Ａａ、Ｃｒｙ４１Ａｂ、Ｃｒｙ４１Ｂａ、Ｃｒｙ４２Ａａ、Ｃｒｙ４３Ａａ、Ｃｒｙ４３Ｂａ、Ｃｒｙ４３Ｃａ、Ｃｒｙ４３Ｃｂ、Ｃｒｙ４３Ｃｃ、Ｃｒｙ４４Ａａ、Ｃｒｙ４５Ａａ、Ｃｒｙ４６Ａａ Ｃｒｙ４６Ａｂ、Ｃｒｙ４７Ａａ、Ｃｒｙ４８Ａａ、Ｃｒｙ４８Ａｂ、Ｃｒｙ４９Ａａ、Ｃｒｙ４９Ａｂ、Ｃｒｙ５０Ａａ、Ｃｒｙ５０Ｂａ、Ｃｒｙ５１Ａａ、Ｃｒｙ５２Ａａ、Ｃｒｙ５２Ｂａ、Ｃｒｙ５３Ａａ、Ｃｒｙ５３Ａｂ、Ｃｒｙ５４Ａａ、Ｃｒｙ５４Ａｂ、Ｃｒｙ５４Ｂａ、Ｃｒｙ５５Ａａ、Ｃｒｙ５６Ａａ、Ｃｒｙ５７Ａａ、Ｃｒｙ５７Ａｂ、Ｃｒｙ５８Ａａ、Ｃｒｙ５９Ａａ、Ｃｒｙ５９Ｂａ、Ｃｒｙ６０Ａａ、Ｃｒｙ６０Ｂａ、Ｃｒｙ６１Ａａ、Ｃｒｙ６２Ａａ、Ｃｒｙ６３Ａａ、Ｃｒｙ６４Ａａ、Ｃｒｙ６５Ａａ、Ｃｒｙ６６Ａａ、Ｃｒｙ６７Ａａ、Ｃｒｙ６８Ａａ、Ｃｒｙ６９Ａａ、Ｃｒｙ６９Ａｂ、Ｃｒｙ７０Ａａ、Ｃｒｙ７０Ｂａ、Ｃｒｙ７０Ｂｂ、Ｃｒｙ７１Ａａ、Ｃｒｙ７２Ａａ、Ｃｒｙ７３Ａａ、又は前述の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなＣｒｙタンパク質のリスト及び関連情報は、例えば、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＰＰＲＣ）（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，Ｎ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｃ．，Ｐａｎｎｅｅｒｓｅｌｖａｍ，Ｓ．，Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．，Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｏｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｃ．（２０２０）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ、ｂｐｐｒｃ．ｏｒｇ）に見ることができる。配列は、ＢＰＰＲＣ及びＮＣＢＩデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて入手可能である。

【0067】

Ｖｉｐ３クラスのメンバー及びそれらのそれぞれのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、米国特許又は特許公開番号の非限定的な例は、Ｖｉｐ３Ａａ１（ＡＡＣ３７０３６）、Ｖｉｐ３Ａａ２（ＡＡＣ３７０３７）、Ｖｉｐ３Ａａ３（米国特許第６，１３７，０３３号明細書参照）、Ｖｉｐ３Ａａ４（ＡＡＲ８１０７９）、Ｖｉｐ３Ａａ５（ＡＡＲ８１０８０）、Ｖｉｐ３Ａａ６（ＡＡＲ８１０８１）、Ｖｉｐ３Ａａ７（ＡＡＫ９５３２６）、Ｖｉｐ３Ａａ８（ＡＡＫ９７４８１）、Ｖｉｐ３Ａａ９（ＣＡＡ７６６６５）、Ｖｉｐ３Ａａ１０（ＡＡＮ６０７３８）、Ｖｉｐ３Ａａ１１（ＡＡＲ３６８５９）、Ｖｉｐ３Ａａ１２（ＡＡＭ２２４５６）、Ｖｉｐ３Ａａ１３（ＡＡＬ６９５４２）、Ｖｉｐ３Ａａ１４（ＡＡＱ１２３４０）、Ｖｉｐ３Ａａ１５（ＡＡＰ５１１３１）、Ｖｉｐ３Ａａ１６（ＡＡＷ６５１３２）、Ｖｉｐ３Ａａ１７（米国特許第６，６０３，０６３号明細書参照）、Ｖｉｐ３Ａａ１８（ＡＡＸ４９３９５）、Ｖｉｐ３Ａａ１９（ＤＱ２４１６７４）、Ｖｉｐ３Ａａ１９（ＤＱ５３９８８７）、Ｖｉｐ３Ａａ２０（ＤＱ５３９８８８）、Ｖｉｐ３Ａａ２１（ＡＢＤ８４４１０）、Ｖｉｐ３Ａａ２２（ＡＡＹ４１４２７）、Ｖｉｐ３Ａａ２３（ＡＡＹ４１４２８）、Ｖｉｐ３Ａａ２４（ＢＩ８８０９１３）、Ｖｉｐ３Ａａ２５（ＥＦ６０８５０１）、Ｖｉｐ３Ａａ２６（ＥＵ２９４４９６）、Ｖｉｐ３Ａａ２７（ＥＵ３３２１６７）、Ｖｉｐ３Ａａ２８（ＦＪ４９４８１７）、Ｖｉｐ３Ａａ２９（ＦＪ６２６６７４）、Ｖｉｐ３Ａａ３０（ＦＪ６２６６７５）、Ｖｉｐ３Ａａ３１（ＦＪ６２６６７６）、Ｖｉｐ３Ａａ３２（ＦＪ６２６６７７）、Ｖｉｐ３Ａａ３３（ＧＵ０７３１２８）、Ｖｉｐ３Ａａ３４（ＧＵ０７３１２９）、Ｖｉｐ３Ａａ３５（ＧＵ７３３９２１）、Ｖｉｐ３Ａａ３６（ＧＵ９５１５１０）、Ｖｉｐ３Ａａ３７（ＨＭ１３２０４１）、Ｖｉｐ３Ａａ３８（ＨＭ１１７６３２）、Ｖｉｐ３Ａａ３９（ＨＭ１１７６３１）、Ｖｉｐ３Ａａ４０（ＨＭ１３２０４２）、Ｖｉｐ３Ａａ４１（ＨＭ１３２０４３）、Ｖｉｐ３Ａａ４２（ＨＱ５８７０４８）、Ｖｉｐ３Ａａ４３（ＨＱ５９４５３４）、Ｖｉｐ３Ａａ４４（ＨＱ６５０１６３）、Ｖｉｐ３Ａｂ１（ＡＡＲ４０２８４）、Ｖｉｐ３Ａｂ２（ＡＡＹ８８２４７）、Ｖｉｐ３Ａｃ１（米国特許出願公開第２００４０１２８７１６号明細書参照）、Ｖｉｐ３Ａｄ１（米国特許出願公開第２００４０１２８７１６号明細書参照）、Ｖｉｐ３Ａｄ２（ＣＡＩ４３２７６）、Ｖｉｐ３Ａｅ１（ＣＡＩ４３２７７）、Ｖｉｐ３Ａｆ１（米国特許第７，３７８，４９３号明細書参照）、Ｖｉｐ３Ａｆ２（ＡＤＮ０８７５３）、Ｖｉｐ３Ａｆ３（ＨＭ１１７６３４）、Ｖｉｐ３Ａｇ１（ＡＤＮ０８７５８）、Ｖｉｐ３Ａｇ２（ＦＪ５５６８０３）、Ｖｉｐ３Ａｇ３（ＨＭ１１７６３３）、Ｖｉｐ３Ａｇ４（ＨＱ４１４２３７）、Ｖｉｐ３Ａｇ５（ＨＱ５４２１９３）、Ｖｉｐ３Ａｈ１（ＤＱ８３２３２３）、Ｖｉｐ３Ｂａ１（ＡＡＶ７０６５３）、Ｖｉｐ３Ｂａ２（ＨＭ１１７６３５）、Ｖｉｐ３Ｂｂ１（米国特許第７，３７８，４９３号明細書参照）、Ｖｉｐ３Ｂｂ２（ＡＢ０３０５２０）及びＶｉｐ３Ｂｂ３（ＡＤＩ４８１２０）である。

【0068】

いくつかの実施形態において、殺虫性ポリペプチドは、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質以外のタンパク質であり得る。例えば、殺虫性ポリペプチドは、α－アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、コレステロール酸化酵素、パタチン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ウレアーゼ、α－アミラーゼ阻害剤、細孔形成タンパク質、キチナーゼ、レクチン、操作された抗体又は抗体断片、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）殺虫性タンパク質、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）属（例えば、Ｘ．ネマトフィラ（Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）又はＸ．ボヴィエニイ（Ｘ．ｂｏｖｉｅｎｉｉ））殺虫性タンパク質、フォトルハブデュス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属（例えば、Ｐ．ルミネセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）又はＰ．アシモビオティカ（Ｐ．ａｓｙｍｏｂｉｏｔｉｃａ）殺虫性タンパク質、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｂ．ラテロスポラス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓ））殺虫性タンパク質、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｌ．スフェアリクス（ｓｐｈｅａｒｉｃｕｓ））殺虫性タンパク質、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、Ｃ．スブツガエ（Ｃ．ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）又はＣ．ピスシナエ（Ｃ．ｐｉｓｃｉｎａｅ））殺虫性タンパク質、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属（例えば、Ｙ．エントモファガ（Ｙ．ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ））殺虫性タンパク質、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｐ．プロピラエア（Ｐ．ｐｒｏｐｙｌａｅａ））殺虫性タンパク質、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えば、Ｃ．ビフェルメンタンス（Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））殺虫性タンパク質、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えばＰ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））及びリグニンであり得る。他の実施形態において、殺虫性ポリペプチドは、フォトルハブデュス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）又はエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）由来の殺虫性毒素複合体（Ｔｃ）由来の少なくとも１つの殺虫性タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、殺虫性ポリペプチドは、フォトルハブデュス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属などの殺虫性細菌由来のＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼであり得る。いくつかの実施形態において、殺虫性ポリペプチドは、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）由来のＶＩＰ１及び／又はＶＩＰ２などのＶＩＰタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、殺虫性ポリペプチドは、殺虫性細菌由来の二成分毒素、例えば、Ｂ．ラテロスポラス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓ）由来のＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａ、又はＬ．スファエリクス（Ｌ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来のＢｉｎＡ及びＢｉｎＢであり得る。いくつかの実施形態では、殺虫性ポリペプチドは、操作されたバージョンであり得、又は前述の殺虫性ポリペプチドのいずれかのハイブリッド若しくはキメラであってもよい。

【0069】

他の非限定的な例の殺虫性ポリペプチドとしては、ＤＩＧ－６５７（米国特許出願公開第２０１５３６６２１１号明細書参照）；ＰｔＩＰ－９６（米国特許出願公開第２０１７２３３４４０号明細書参照）；ＰＩＰ－７２（米国特許出願公開第２０１６３６６８９１号明細書参照）；ＰＩＰ－８３（米国特許出願公開第２０１６３４７７９９号明細書参照）；ＰＩＰ－５０（米国特許出願公開第２０１７１６６９２１号明細書参照）；ＩＰＤ７３（米国特許出願公開第２０１９１１９３３４号明細書参照）；ＩＰＤ０９０（米国特許出願公開第２０１９１３６２５８号明細書参照）；ＩＰＤ８０（米国特許出願公開第２０１９２５６５６３号明細書参照）；ＩＰＤ０７８、ＩＰＤ０８４、ＩＰＤ０８６、ＩＰＤ０８７、ＩＰＤ０８９（米国特許出願公開第２０２００５５９０６号明細書参照）；ＩＰＤ０９３（国際公開第２０１８１１１５５１号パンフレット参照）；ＩＰＤ０５９（国際公開第２０１８２３２０７２号パンフレット参照）；ＩＰＤ１１３（国際公開第２０１９１７８０４２号パンフレット参照）；ＩＰＤ１２１（国際公開第２０１８２０８８８２号パンフレット参照）；ＩＰＤ１１０（国際公開第２０１９１７８０３８号パンフレット参照）；ＩＰＤ１０３（国際公開第２０１９１２５７１７号パンフレット参照）；ＩＰＤ０９２；ＩＰＤ０９５；ＩＰＤ０９７；ＩＰＤ０９９；ＩＰＤ１００、ＩＰＤ１０５；ＩＰＤ１０６；ＩＰＤ１０７；ＩＰＤ１１１；ＩＰＤ１１２（国際公開第２０２００５５８８５号パンフレット参照）；ＩＰＤ１０２（国際公開第２０２００７６９５８号パンフレット参照）Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７（米国特許出願公開第２０２０－０３２２８９号明細書参照）；ＴＩＣ１０７（米国特許第８０４９０７１号明細書参照）；Ｃｒｙ２Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５（米国特許第１０５８４３９１号明細書参照）；Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１（米国特許第１０４０７６８８号明細書参照）；ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７３、ＴＩＣ６７５７（米国特許出願公開第２０１７０５８２９４号明細書参照）；ＴＩＣ３６６８、ＴＩＣ３６６９、ＴＩＣ３６７０、ＴＩＣ４０７６、ＴＩＣ４０７８、ＴＩＣ４２６０、ＴＩＣ４３４６、ＴＩＣ４８２６、ＴＩＣ４８６１、ＴＩＣ４８６２、ＴＩＣ４８６３、ＴＩＣ－３６６８（米国特許出願公開第２０１６３１９３０２号明細書参照）；ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９（米国特許出願公開第２０１８２９１３９５号明細書参照）；ＴＩＣ７９４１（米国特許出願公開第２０２０２２９４４５号明細書参照）ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６８、ＴＩＣ８６９、及びＴＩＣ１１００（国際公開第２０１６０６１３９１号パンフレット参照）、ＴＩＣ２１６０（国際公開第２０１６０６１３９２号パンフレット参照）、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、ＡＸＭＩ－００１、ＡＸＭＩ－００２、ＡＸＭＩ－０３０、ＡＸＭＩ－０３５、及びＡＸＭＩ－０４５（米国特許出願公開第２０１３０１１７８８４号明細書参照）、ＡＸＭＩ－５２、ＡＸＭＩ－５８、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００（米国特許出願公開第２０１－０３１０５４３号明細書参照）、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３、ＡＸＭＩ－００５（米国特許出願公開第２０１３０１０４２５９号明細書参照）、ＡＸＭＩ－１３４（米国特許出願公開第２０１３０１６７２６４号明細書参照）、ＡＸＭＩ－１５０（米国特許出願公開第２０１００１６０２３１号明細書参照）、ＡＸＭＩ－１８４（米国特許出願公開第２０１００００４１７６号明細書参照）、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９（米国特許出願公開第２０１１－００３００９６号明細書参照）、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０（米国特許出願公開第２０１４０２４５４９１号明細書参照）、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ、ＡＸＭＩ－２２５ｚ（米国特許出願公開第２０１４０１９６１７５号明細書参照）、ＡＸＭＩ－２３８（米国特許出願公開第２０１４００３３３６３号明細書参照）、ＡＸＭＩ－２７０（米国特許出願公開第２０１４０２２３５９８号明細書参照）、ＡＸＭＩ－３４５（米国特許出願公開第２０１４０３７３１９５号明細書参照）、ＡＸＭＩ－３３５（国際公開第２０１３１３４５２３号パンフレット参照）、ＤＩＧ－３（米国特許出願公開第２０１３０２１９５７０号明細書参照）、ＤＩＧ－５（米国特許出願公開第２０１００３１７５６９号明細書参照）、ＤＩＧ－１１（米国特許出願公開第２０１００３１９０９３号明細書参照）、ＡｆＩＰ－１Ａ（米国特許出願公開第２０１４００３３３６１号明細書参照）、ＡｆＩＰ－１Ｂ（米国特許出願公開第２０１４００３３３６１号明細書参照）、ＰＩＰ－１ＡＰＩＰ－１Ｂ（米国特許出願公開第２０１４０００７２９２号明細書参照）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許出願公開第２０１４０００７２９２号明細書参照）、ＡＥＣＦＧ－５９２７４０（米国特許出願公開第２０１４０００７２９２号明細書参照）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許出願公開第２０１４０００７２９２号明細書参照）、ＤＩＧ－６５７（国際公開第２０１５１９５５９４号明細書参照）、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許出願公開第２０１４０００７２９２号明細書参照）、ＧＳ－１３５（米国特許出願公開第２０１２０２３３７２６号明細書参照）、ＧＳ１５３（米国特許出願公開第２０１２０１９２３１０号明細書参照）、ＧＳ１５４（米国特許出願公開第２０１２０１９２３１０号明細書参照）、ＧＳ１５５（米国特許出願公開第２０１２０１９２３１０号明細書参照）、ＤＩＧ－９１１及びＤＩＧ－１８０（米国特許出願公開第２０１５０２６４９４０号明細書参照）；などが挙げられる。

【0070】

いくつかの実施形態において、推定殺虫性ポリペプチドは、野生型タンパク質（すなわち、それが由来するタンパク質）に対して少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＤＮＡシャッフリング、ブロックスワップ、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又はそれらの組み合わせの結果である（例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ａｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ｔｈ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｒｉｍ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｉｍｐａｃｔ：１１８－１２３，米国特許第８，５３０，４１１号明細書，Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｔｏｘｉｎｓ １１（３）：１６２及び米国特許出願公開第２０２１０１４７４９２号明細書に記載の通りである）。いくつかの実施形態では、改変は、野生型タンパク質と比較した１つ又は複数のヌクレオチドの欠失である。いくつかの実施形態において、改変は、野生型タンパク質に対する１つ又は複数のヌクレオチドの挿入である。いくつかの実施形態において、改変は、野生型タンパク質の５’末端及び／又は３’末端からの１つ又は複数のヌクレオチドの短縮、すなわち欠失である。いくつかの実施形態において、推定殺虫性ポリペプチドは、Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質に由来し、野生型タンパク質に対する改変は、セリンプロテアーゼ消化に対する耐性をもたらす（すなわち、セリンプロテアーゼ活性の阻害）。いくつかの実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害は、Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質（例えば、Ｐａｒｄｏ－Ｌｏｐｅｚ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ３０（３）：５８９－５９５を参照のこと）の殺虫活性を増強する。

【0071】

本明細書で提供される組換え核酸のいくつかの実施形態では、推定殺虫性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２又は配列番号４と少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号１又は配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む推定殺虫性ポリペプチドをコードする。

【0072】

Ｃｒｙタンパク質の１つのファミリーは、３ドメインＣｒｙファミリーとして公知であり、活性毒素タンパク質中に３つのドメインを有するタンパク質を含む。ドメインＩ、ドメインＩＩ、及びドメインＩＩＩと呼ばれるこれらのドメインは、例えば、Ｂｒａｖｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｔｏｘｉｃｏｎ ４９（４）：４２３－４３５及びＰａｌｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｔｏｘｉｎｓ ６（１２）：３２９６－３３２５に記載されている。そのようなＣｒｙタンパク質は、一般に毒性に必要とされないさらなるドメインＩＶ－ＶＩＩを含むプロトキシンとして発現され得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される推定殺虫性ポリペプチドは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩを含む。いくつかの実施形態において、推定殺虫性ポリペプチドは、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、並びにドメインＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩのうちの少なくとも１つを含む。

【0073】

Ｃ．殺虫性タンパク質受容体
いくつかの実施形態において、本開示の推定殺虫性ポリペプチドは、有害生物細胞（例えば、昆虫細胞）の細胞表面タンパク質と相互作用することができる。推定殺虫性タンパク質によって標的化され得る有害生物は、以下に列挙されるもののいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、有害生物細胞は上皮細胞である。一部の実施形態では、有害生物細胞は有害生物消化系の一部である。本開示の細胞表面タンパク質は、殺虫性タンパク質の任意の既知の受容体又は任意の潜在的な受容体を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、上記の推定殺虫性タンパク質のいずれかに対する受容体である。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は公知のＢｔ Ｃｒｙタンパク質受容体である。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体タンパク質、カドヘリンタンパク質、アミノペプチダーゼＮタンパク質、又はアルカリホスファターゼタンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、例えばＶＰＡＣ１及び／又はＶＰＡＣ２などのＶＩＰ受容体である。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、スカベンジャー受容体（例えば、ＳＲ－Ｃ）である（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８５（１６）：ｅ００５７９－１９参照）。

【0074】

いくつかの実施形態において、推定殺虫性ポリペプチドはＡＢＣ輸送体タンパク質と相互作用する。最近、ＡＢＣ輸送体はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）殺虫性タンパク質の受容体として同定された（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｔｏｘｉｎｓ １１：１２４及びＥｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：８５６９－８５７７）。例えば、Ｃｒｙ１Ｆａと呼ばれるＢｔ殺虫性毒素（Ｂｔ Ｃｒｙ殺虫性毒素）は、その受容体としてハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ハスモンヨトウ（Ｆａｌｌ Ａｒｍｙｗｏｒｍ））のＡＢＣＣ２を利用して虫を死滅させる。Ｃｒｙ１Ａａ毒素は、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９，Ｔｏｘｉｎｓ １１：１２４）によって記載されるように、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、ＥＣＬ１及びＥＣＬ４の６つの細胞外ループ（ＥＣＬ）のうちの２つに結合する。Ｃｒｙ１Ｆａは、構造的類似性に基づいて、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２のＥＣＬ１及びＥＣＬ４にも結合すると予想される（図８）。いくつかの実施形態では、図８に示すように、ＡＢＣ輸送体タンパク質は２つの膜貫通αヘリックスバンドルを有し、各バンドルは６つのヘリックスからなる。いくつかの実施形態において、２つのバンドルの間には、第１のＡＴＰアーゼ（ヌクレオチド結合）ドメインが存在する。いくつかの実施形態において、第２のαヘリックスバンドルの最後のαヘリックスのＣ’末端に結合している第２のＡＴＰアーゼドメインが存在する。いくつかの実施形態では、両方のＡＴＰアーゼドメインが細胞質（すなわち、細胞内側）にある（図８）。いくつかの実施形態では、第２のＡＴＰアーゼを含まないＡＢＣ輸送体タンパク質は、αヘリックス束及びＥＣＬの（すなわち、両方のＡＴＰアーゼドメインを有するＡＢＣ輸送体タンパク質と比較して）同じ立体配座を保持する。いくつかの実施形態において、第１のＡＴＰアーゼドメイン（すなわち、上記の２つのアルファ－ヘリックス束の間のＡＴＰアーゼドメイン）は、ＥＣＬ１及びＥＣＬ４の確認を補助するために必要である。いくつかの態様において、ＡＢＣ輸送体タンパク質は第２のＡＴＰアーゼドメインを含まない。

【0075】

いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体は、ＡＢＣＡ、ＡＢＣＢ、ＡＢＣＣ、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＣＧ、及びＡＢＣＨを含むＡＢＣ輸送体サブファミリーのいずれかからのタンパク質を含み得る。ＡＢＣ輸送体タンパク質は、以下に列挙する有害生物のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質は、ＰｘＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ３、Ｄｖ－ＡＢＣＢ１、Ｂｍ－ＡＢＣＢ１、Ｓｆ－ＡＢＣＢ１、Ｂｍ－ＡＢＣＡ２、又はＴｃ－ＡＢＣＣ４である。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質は、ＰｘＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２、又はＳｆ－ＡＢＣＣ３である。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質はＡＢＣ輸送体機能を保持する。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質はＡＢＣ輸送体機能を保持していない（例えば、上記のように、第２のＡＴＰアーゼドメインを有しないＡＢＣ輸送体）。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質は、配列番号５、７、９、１１、又は１３のいずれかと少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質は、配列番号６、８、１０、１２、又は１４のいずれかと少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

【0076】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、１つ以上の殺虫剤に耐性であることが知られている有害生物由来であり得る。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、１つ以上の目的の殺虫性タンパク質との相互作用が低下していることが知られている変異細胞表面タンパク質である。例えば、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＣｒｙ１Ｆａ耐性コロニーは、Ｃｒｙ１Ｆａが結合できなかったそのＡＢＣＣ２に突然変異を有することが見出された（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：１０８７７）。これらの報告は、殺虫性タンパク質を、新しい受容体又は既存の受容体の変異体に結合させて耐性を克服するように操作することができることを示している。例えば、Ｃｒｙ１Ｆａ耐性Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＡＢＣＣ２の変異体に結合する新しい操作されたタンパク質は、耐性を克服することができる可能性がある。同様に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＡＢＣＣ３に結合する操作されたタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｆａ耐性Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に対して活性であり得る。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、殺虫性タンパク質受容体の変異型を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、Ｃｒｙ１Ｆａ耐性Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＡＢＣＣ２の変異体を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｆ ＡＢＣＣ２変異体は、配列番号１１と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｆ ＡＢＣＣ２変異体は、配列番号１２と少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

【0077】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、それが由来する野生型タンパク質に対して１つ又は複数の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＤＮＡシャッフリング、ブロックスワップ、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又はそれらの組み合わせの結果である（例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ａｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ｔｈ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｒｉｍ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｉｍｐａｃｔ：１１８－１２３，米国特許第８，５３０，４１１号明細書，Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｔｏｘｉｎｓ １１：１６２及び米国特許出願公開第２０２１０１４７４９２号明細書に記載の通りである）。いくつかの実施形態では、改変は、野生型タンパク質と比較した１つ又は複数のヌクレオチドの欠失である。いくつかの実施形態において、改変は、野生型タンパク質に対する１つ又は複数のヌクレオチドの挿入である。いくつかの実施形態において、改変は、野生型タンパク質の５’末端及び／又は３’末端からの１つ又は複数のヌクレオチドの短縮、すなわち欠失である。

【0078】

Ｄ．標的有害生物
本明細書で提供される殺虫性タンパク質は、鱗翅目有害生物、鞘翅目有害生物、半翅目有害生物、双翅目有害生物、リガス（Ｌｙｇｕｓ）属有害生物及び線虫有害生物を含む様々な標的有害生物に対して活性を有することができる。

【0079】

いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質は、鱗翅目有害生物の以下の非限定的な例の１つ以上に対して活性を有することができる：スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属、例えば、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓ．リトラリス（Ｓ．ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）（エジプトヨトウ（Ｅｇｙｐｔｉａｎ ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆｗｏｒｍ））、Ｓ．オルニソガリ（Ｓ．ｏｒｎｉｔｈｏｇａｌｌｉ）（イエローストライドアーミーワーム（ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓ．プラエフィカ（Ｓ．ｐｒａｅｆｉｃａ）（西洋イエローストライドアーミーワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓ．エリダニア（Ｓ．ｅｒｉｄａｎｉａ）（南アーミーワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、Ｓ．リツラ（Ｓ．ｌｉｔｕｒａ）（ハスモンヨトウ（Ｃｏｍｍｏｎ ｃｕｔｗｏｒｍ／Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｌｅａｆｗｏｒｍ））及び／又はＳ．エキシグア（Ｓ．ｅｘｉｇｕａ）（ビートアーミーワーム（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；オストリニア（Ｏｓｔｒｉｎｉａ）属、例えばＯ．ヌビリアリス（Ｏ．ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）（ヨーロッパコーンボーラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））及び／又はＯ．フルナカリス（Ｏ．ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ）（アジアンコーンボーラー（Ａｓｉａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））；コナガ属（Ｐｌｕｔｅｌｌａ）属、例えばＰ．キシロステラ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ））；アグロティス（Ａｇｒｏｔｉｓ）属、例えば、Ａ．イプシロン（Ａ．ｉｐｓｉｌｏｎ）（黒色ヨトウムシ（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ））、Ａ．セゲツム（Ａ． ｓｅｇｅｔｕｍ）（普通ヨトウムシ（ｃｏｍｍｏｎ ｃｕｔｗｏｒｍ））、Ａ．グレーディアリア（Ａ．ｇｌａｄｉａｒｉａ）（粘土状ヨトウムシ（ｃｌａｙｂａｃｋｅｄ ｃｕｔｗｏｒｍ））、及び／又はＡ．オルトゴニア（Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）（淡色西洋ヨトウムシ）；スタリアコスタ（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ）属、例えばＳ．アルビコスタ（Ｓ．ａｌｂｉｃｏｓｔａ）（西洋マメヨトウムシ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｅａｎ ｃｕｔｗｏｒｍ））；ヘリコベルパ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ）属、例えばＨ．ジー（Ｈ．ｚｅａ）（コーンイヤーワーム（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ））、Ｈ．プンクチゲラ（Ｈ．ｐｕｎｃｔｉｇｅｒａ）（ネイティブブドワーム（ｎａｔｉｖｅ ｂｕｄｗｏｒｍ））及び／又はＨ．アルミゲラ（Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａ）（コットンボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；ヘリオチス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）属、例えばＨ．ビレセンス（Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（タバコブドワーム（ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ））；ディアトレア（Ｄｉａｔｒａｅａ）属、例えばＤ．グランディオセラ（Ｄ．ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）（南西コーンボーラー（ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））及び／又はＤ．サッカラリス（Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）（サトウキビボーラー（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）；トリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）属、例えばＴ．ニ（Ｔ．ｎｉ）（キャベツルーパー（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ））；セサミア（Ｓｅｓａｍｉａ）属、例えばＳ．ノナゴリド（Ｓ．ｎｏｎａｇｒｏｉｄｅｓ）（地中海コーンボーラー（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ））、Ｓ．インフェレンス（Ｓ．ｉｎｆｅｒｅｎｓ）（ピンクステムボーラー（Ｐｉｎｋ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ））及び／又はＳ．カラミスティス（Ｓ．ｃａｌａｍｉｓｔｉｓ）（ピンクステムボーラー（ｐｉｎｋ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ））；ペクチノフォラ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ）属、例えばＰ．ゴシピエラ（Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）（ピンクボールワーム（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；コヒリス（Ｃｏｃｈｙｌｉｓ）属、例えばＣ．ホスペス（Ｃ．ｈｏｓｐｅｓ）（シマヒマワリガ（ｂａｎｄｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ））；マンデュカ（Ｍａｎｄｕｃａ）属、例えば、Ｍ．セクスタ（Ｍ．ｓｅｘｔａ）（タバコホーンワーム（ｔｏｂａｃｃｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ））及び／又はＭ．クインクエマクラタ（Ｍ．ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ）（トマトホーンワーム（ｔｏｍａｔｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ））；エラスモパルプス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ）属、例えばＥ．リグノセルス（Ｅ．ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）（小コーンストークボーラー（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ））；シュードプルジア（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ）属、例えばＰ．インクルーデンス（Ｐ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）（ダイズルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ））；アンチカルジア（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ）属、Ａ．ジェムマタリス（Ａ．ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）（ベルベットビーンキャタピラ（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；プラチペナ（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ）属、例えば、Ｐ．スカブラ（Ｐ．ｓｃａｂｒａ）（ミドリクローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ））；モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ）属、例えばＰ．ブラシカエ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（モンシロチョウ（ｃａｂｂａｇｅ ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ））；パパイペマ（Ｐａｐａｉｐｅｍａ）属、例えばＰ．ネブリス（Ｐ．ｎｅｂｒｉｓ）（ストークボーラー（ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ））；シュードアレチア（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ）属、例えばＰ．ユニパンクタ（Ｐ．ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（コモンアームワーム（ｃｏｍｍｏｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；ペリドロマ（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ）属、例えばＰ．ソーシア（Ｐ．ｓａｕｓｉａ）（マダラカットワーム（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ ｃｕｔｗｏｒｍ））；キーフェリア（Ｋｅｉｆｅｒｉａ）属、例えば、Ｋ．リコペルシセラ（Ｋ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ）（トマトピンワーム（Ｔｏｍａｔｏ ｐｉｎｗｏｒｍ））；アルトゲイア（Ａｒｔｏｇｅｉａ）属、例えば、Ａ．ラパエ（Ａ．ｒａｐａｅ）（青虫（ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｃａｂｂａｇｅｗｏｒｍ））；フトリマイア（Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ）属、例えばＰ．オペルクレラ（Ｐ．ｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ）（ジャガイモガ幼虫）；クリソデイキス（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ）属、例えばＣ．インクルーデンス（Ｃ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）（ダイズルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ））；フェルチア（Ｆｅｌｔｉａ）属、例えばＦ．ドュセンス（Ｆ．ｄｕｃｅｎｓ）（ディンジーカットワーム（ｄｉｎｇｙ ｃｕｔｗｏｒｍ））；チロ（ｃｈｉｌｏ）属、例えばＣ．サプレッサリス（Ｃ．ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）（シマステムボーラー（ｓｔｒｉｐｅｄ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ））、クナフハロクロシス（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ）属、例えばＣ．メディナリス（Ｃ．ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）（イネリーフフォルダー（ｒｉｃｅ ｌｅａｆｆｏｌｄｅｒ））、コノゲテス（Ｃｏｎｏｇｅｔｈｅｓ）属、例えばＣ．パンクチフェラリス（Ｃ．ｐｕｎｃｔｉｆｅｒａｌｉｓ）（イエローピーチモース（Ｙｅｌｌｏｗ ｐｅａｃｈ ｍｏｔｈ））、ミシムナ（Ｍｙｔｈｉｍｎａ）属、例えばＭ．セパラタ（Ｍ．ｓｅｐａｒａｔａ）（オリエンタルアーミーワーム（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、アテチス（Ａｔｅｔｉｓ）属、例えばＡ．レピゴン（Ａ．ｌｅｐｉｇｏｎｅ）（２スポットアーミーワーム（Ｔｗｏ－ｓｐｏｔｔｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ））、又はこれらの任意の組み合わせ。

【0080】

いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質は、鞘翅目害虫に対する活性を有することができる。実施形態では、開示されるタンパク質は、ディアボロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属に対する活性を有する。ディアボロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）は、一般に「トウモロコシ根虫」又は「キュウリビートル」と呼ばれる鞘翅目のビートルの属である。例示的なディアボロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種としては、限定されないが、ディアボロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（北コーンルートワーム（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））、Ｄ．バーギフェラ・バーギフェラ（Ｄ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（西コーンルートワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ）（南コーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））、Ｄ．バルテアータ（Ｄ．ｂａｌｔｅａｔａ）（シマキュウリビートル（ｂａｎｄｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｂｅｅｔｌｅ））、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ（Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）（西スポットキュウリビートル（ｗｅｓｔｅｒｎ ｓｐｏｔｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｂｅｅｔｌｅ））、Ｄ．シグニフィカータ（Ｄ．ｓｉｇｎｉｆｉｃａｔａ）（３－スポットリーフビートル（３－ｓｐｏｔｔｅｄ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ））、Ｄ．スペシオーサ（Ｄ．ｓｐｅｃｉｏｓａ）（クリサンセマムビートル（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｂｅｅｔｌｅ））、Ｄ．バーギフェラ・ゼアエ（Ｄ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシココーンルートワーム（Ｍｅｘｉｃａｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ））、Ｄ．ベニエンシス（Ｄ．ｂｅｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｄ．クリスタータ（Ｄ．ｃｒｉｓｔａｔａ）、Ｄ．クルヴィプルスタラータ（Ｄ．ｃｕｒｖｉｐｌｕｓｔａｌａｔａ）、Ｄ．ディシミリス（Ｄ．ｄｉｓｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｄ．エレガンツラ（Ｄ．ｅｌｅｇａｎｔｕｌａ）、Ｄ．エモルシタンス（Ｄ．ｅｍｏｒｓｉｔａｎｓ）、Ｄ．グラミネア（Ｄ．ｇｒａｍｉｎｅａ）、Ｄ．ヒスパンロエ（Ｄ．ｈｉｓｐａｎｌｏｅ）、Ｄ．レムニスカータ（Ｄ．ｌｅｍｎｉｓｃａｔａ）、Ｄ．リンスレイ（Ｄ．ｌｉｎｓｌｅｙｉ）、Ｄ．ミレリ（Ｄ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、Ｄ．ヌムムラリス（Ｄ．ｎｕｍｍｕｌａｒｉｓ）、Ｄ．オククルサル（Ｄ．ｏｃｃｌｕｓａｌ）、Ｄ．ポルレセア（Ｄ．ｐｏｒｒｅｃｅａ）、Ｄ．スクテラータ（Ｄ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔａ）、Ｄ．チビアリス（Ｄ．ｔｉｂｉａｌｉｓ）、Ｄ．トリファスシアタ（Ｄ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）及びＤ．ビリドゥラ（Ｄ．ｖｉｒｉｄｕｌａ）；及びそれらの任意の組み合わせを含む。本発明による鞘翅目害虫の他の非限定的な例としては、レプチノタルサ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ）属、例えばＬ．デセムリネータ（Ｌ．ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）（コロラドジャガイモビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａｔｏ ｂｅｅｔｌｅ））；クリソメラ（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａ）属、例えばＣ．スクリプタ（Ｃ．ｓｃｒｉｐｔａ）（コットンウッドリーフビートル（Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ））；ヒポセネムス（Ｈｙｐｏｔｈｅｎｅｍｕｓ）属、例えばＨ．ハンペイ（Ｈ．ｈａｍｐｅｉ）（コーヒーベリーボーラー（ｃｏｆｆｅｅ ｂｅｒｒｙ ｂｏｒｅｒ））；シトフィルス（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）属、例えばＳ．ジーマイス（Ｓ．ｚｅａｍａｉｓ）（トウモロコシゾウムシ（ｍａｉｚｅ ｗｅｅｖｉｌ））；エピトリピクス（Ｅｐｉｔｒｉｘ）属、例えばＥ．ヒルティペンニス（Ｅ．ｈｉｒｔｉｐｅｎｎｉｓ）（タバコノミハムシ（ｔｏｂａｃｃｏ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））、Ｅ．ククメリス（Ｅ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）（ジャガイモノミハムシ）；フィロトレタ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ）属、例えば、Ｐ．クルシフェラエ（Ｐ．ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（アブラナノミハムシ（ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））、及びＰ．プシラ（Ｐ．ｐｕｓｉｌｌａ）（西洋黒ノミハムシ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌａｃｋ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；アンソノムス（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ）属、例えばＡ．オイゲニイ（Ａ．ｅｕｇｅｎｉｉ）（コショウゾウムシ（ｐｅｐｐｅｒ ｗｅｅｖｉｌ））；ヘミクレピダス（Ｈｅｍｉｃｒｅｐｉｄｕｓ）属、例えばＨ．メムノニウス（Ｈ．ｍｅｍｎｏｎｉｕｓ）（コメツキムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍ））；メラノツス（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ）属、例えばＭ．コムニス（Ｍ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（コメツキムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍ））；セウトルフィカス（Ｃｅｕｔｏｒｈｙｃｈｕｓ）属、例えばＣ．アシミリス（Ｃ．ａｓｓｉｍｉｌｉｓ）（キャベツ鞘ゾウムシ（ｃａｂｂａｇｅ ｓｅｅｄｐｏｄ ｗｅｅｖｉｌ））；フィロトレタ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ）属、例えばＰ．クルシフェラエ（Ｐ．ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（アブラナノミハムシ（ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；アエオルス（Ａｅｏｌｕｓ）属、例えばＡ．メルリルルス（Ａ．ｍｅｌｌｉｌｌｕｓ）（コメツキムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍ））；アエオルス（Ａｅｏｌｕｓ）属、例えば、Ａ．マンクス（Ａ．ｍａｎｃｕｓ）（コムギコメツキムシ（ｗｈｅａｔ ｗｉｒｅｗｏｒｍ））；ホリストノツス（Ｈｏｒｉｓｔｏｎｏｔｕｓ）属、例えば、Ｈ．ウフレリイ（Ｈ．ｕｈｌｅｒｉｉ）（スナコメツキムシ（ｓａｎｄ ｗｉｒｅｗｏｒｍ））；スフェノホルス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ）属、例えば、Ｓ．マイディス（Ｓ．ｍａｉｄｉｓ）（トウモロコシビルバグ（ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ））、Ｓ．ゼアエ（Ｓ．ｚｅａｅ）（チモシービルバグ（ｔｉｍｏｔｈｙ ｂｉｌｌｂｕｇ））、Ｓ．パルブルス（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）（ブルーグラスビルバグ（ｂｌｕｅｇｒａｓｓ ｂｉｌｌｂｕｇ））、及びＳ．カロスス（Ｓ．ｃａｌｌｏｓｕｓ）（南コーンビルバグ（（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｉｌｌｂｕｇ）））；フィロファガ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ）属（白色グラブ（Ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂｓ））；チャエトクネマ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ）属、例えば、Ｃ．プルリカリア（Ｃ．ｐｕｌｉｃａｒｉａ）（コーンノミハムシ（ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ））；ポピリア（Ｐｏｐｉｌｌｉａ）属、例えばＰ．ジャポニカ（Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）（マメコガネ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ））；エピラクナ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ）属、例えばＥ．バリベスティス（Ｅ．ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）（メキシコマメビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ））；セロトマ（Ｃｅｒｏｔｏｍａ）属、例えばＣ．トリフルケート（Ｃ．ｔｒｉｆｕｒｃａｔｅ）（マメリーフビートル）；エピカッタ（Ｅｐｉｃａｕｔａ）属、例えばＥ．ペスチフェラ（Ｅ．ｐｅｓｔｉｆｅｒａ）及びＥ．レムニスカータ（Ｅ．ｌｅｍｎｉｓｃａｔａ）（ブリスタービートル（Ｂｌｉｓｔｅｒ ｂｅｅｔｌｅ））；及び上記の任意の組み合わせが挙げられる。

【0081】

開示される殺虫性タンパク質は、半翅目、双翅目、リグス（Ｌｙｇｕｓ）属、及び／又は他の、例えば直翅目又は総翅目の穿孔性及び吸汁性昆虫に対して活性であり得る。双翅目の昆虫としては、それに限定されるものではないが、リリオミザ（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ）属、例えば、Ｌ．トリフォリ（Ｌ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）（ハモグリバエ（ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））及びＬ．サティバエ（Ｌ．ｓａｔｉｖａｅ）（植物ハモグリバエ（（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；スクロビパルプラ（Ｓｃｒｏｂｉｐａｌｐｕｌａ）属、例えばＳ．アブソルータ（Ｓ．ａｂｓｏｌｕｔａ）（トマトハモグリバエ（ｔｏｍａｔｏ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；デリア（Ｄｅｌｉａ）属、例えばＤ．プラツラ（Ｄ．ｐｌａｔｕｒａ）（シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ））、Ｄ．ブラシカエ（Ｄ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（キャベツマゴット（ｃａｂｂａｇｅ ｍａｇｇｏｔ））及びＤ．ラジクム（Ｄ．ｒａｄｉｃｕｍ）（キャベツネバエ（ｃａｂｂａｇｅ ｒｏｏｔ ｆｌｙ））；プシリア（Ｐｓｉｌｉａ）属、例えばＰ．ロザエ（Ｐ．ｒｏｓａｅ）（ニンジンラストバエ（ｃａｒｒｏｔ ｒｕｓｔ ｆｌｙ））；テタノプス（Ｔｅｔａｎｏｐｓ）属、例えば、Ｔ．ミオパエフォルミス（Ｔ．ｍｙｏｐａｅｆｏｒｍｉｓ）（サトウダイコン根マゴット（ｓｕｇａｒｂｅｅｔ ｒｏｏｔ ｍａｇｇｏｔ））；及び上記の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、現在知られている又は後に特定される双翅目昆虫が挙げられる。直翅目の昆虫としては、それに限定されるものではないが、例えば、メラノプラス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ）属、例えば、Ｍ．ディファレンシャリスバッタ（Ｍ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）、Ｍ．フェムルブルム（Ｍ．ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）（アカアシトビバッタ（Ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ））、Ｍ．ビビタツス（Ｍ．ｂｉｖｉｔｔａｔｕ）（２ストライプバッタ（Ｔｗｏｓｔｒｉｐｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ））及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、現在知られている又は後に特定される直翅目昆虫が挙げられる。総翅目の昆虫としては、それに限定されるものではないが、フランクリニエラ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ）属、例えばＦ．オシデンタリス（Ｆ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（西洋フラワーアザミウマ（ｗｅｓｔｅｒｎ ｆｌｏｗｅｒ ｔｈｒｉｐｓ））及びＦ．フスカ（Ｆ．ｆｕｓｃａ）（タバコアザミウマ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐｓ））；及びスリップス（Ｔｈｒｉｐｓ）属、例えばＴ．タバシ（Ｔ．ｔａｂａｃｉ）（タマネギアザミウマ（ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐｓ））、Ｔ．パルミ（Ｔ．ｐａｌｍｉ）（メロンアザミウマ（ｍｅｌｏｎ ｔｈｒｉｐｓ））；及び上記の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、現在知られている又は後に特定される総翅目昆虫が挙げられる。

【0082】

開示される殺虫性タンパク質は、線虫に対して活性であり得る。本明細書で使用される「線虫」という用語は、動物界、線虫門に分類される現在知られている又は後に特定される任意の生物を包含し、それには、限定するものではないが、双器綱（例えば、エノプルス目（Ｅｎｏｐｌｉｄａ）、イソライミダ目（Ｉｓｏｌａｉｍｉｄａ）、モンキダ目（Ｍｏｎｏｎｃｈｉｄａ）、ドリルアミダ目（Ｄｏｒｙｌａｉｍｉｄａ）、トリコケファリダ目（Ｔｒｉｃｈｏｃｅｐｈａｌｉｄａ）、メリメチダ目（Ｍｅｒｍｉｔｈｉｄａ）、ムスピケア目（Ｍｕｓｐｉｃｅｉｄａ）、アレオライミダ目（Ａｒａｅｏｌａｉｍｉｄａ）、クロマドリダ目（Ｃｈｒｏｍａｄｏｒｉｄａ）、デスモスコレシダ目（Ｄｅｓｍｏｓｃｏｌｅｃｉｄａ）、デスモドリダ目（Ｄｅｓｍｏｄｏｒｉｄａ）及びモンヒステリダ目（Ｍｏｎｈｙｓｔｅｒｉｄａ）を含む）及び／又は線虫綱（例えば、ラブディタ目（Ｒｈａｂｄｉｔａ）、円虫目（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａ）、回虫目（Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ）、旋尾線虫目（Ｓｐｉｒｕｒｉｄａ）、カマラヌス目（Ｃａｍａｌｌａｎｉｄａ）、ジプロガステリダ目（Ｄｉｐｌｏｇａｓｔｅｒｉｄａ）、チレンクス目（Ｔｙｌｅｎｃｈｉｄａ）及びアフェレンキダ目（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｉｄａ）を含む）内の線虫が含まれる。線虫としては、それらに限定されないが、ネコブ線虫、シスト線虫及び／又は病変線虫などの寄生線虫が挙げられる。本発明による線虫の例示的な属としては、これらに限定されないが、メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）（ネコブセンチュウ（ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）（シスト線虫（ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）（シスト線虫（ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ラドホルス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）（包埋線虫（ｂｕｒｒｏｗｉｎｇ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ロチレンクルス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）（腎形線虫（ｒｅｎｉｆｏｒｍ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、プラチレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）（病変線虫（ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、アフェレンコイデス（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）（葉線虫（ｆｏｌｉａｒ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ヘリコチレンクス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）（らせん線虫（ｓｐｉｒａｌ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ホプラライムス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ）（ランス線虫（ｌａｎｃｅ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、パラトリコドーラス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ）（副根線虫（ｓｔｕｂｂｙ－ｒｏｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ロンギドルス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ）、ナコブス（偽根結節線虫（ｆａｌｓｅ ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、スバンギナ（Ｓｕｂａｎｇｕｉｎａ）、ベロンライムス（Ｂｅｌｏｎｌａｉｍｕｓ）（刺線虫）、クリコネメラ、クリコネモイド（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）（環線虫（ｓｔｉｎｇ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、ディチレンクス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）、ドリコドーラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｄｏｒｕｓ）、ヘミクリコネモイド（Ｈｅｍｉｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、ヘミシクロホラ（Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ）、ヒルシュマニエラ（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ）、ヒプソペリン（Ｈｙｐｓｏｐｅｒｉｎｅ）、マクロポストニア（Ｍａｃｒｏｐｏｓｔｈｏｎｉａ）、メリニウス（Ｍｅｌｉｎｉｕｓ）、パンクトデラ（Ｐｕｎｃｔｏｄｅｒａ）、キニスルキウス（Ｑｕｉｎｉｓｕｌｃｉｕｓ）、スクテロネマ（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ）、キフィネマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）（ダッガー線虫（ｄａｇｇｅｒ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、チレンコルヒンクス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）（スタント線虫（ｓｔｕｎｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））、チレンチルス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）、バーサフェレンチルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ）（丸ワーム）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。本開示による例示的な植物寄生性線虫としては、これらに限定されるものではないが、ベロノラミムス・グラシリス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ベロノラミムス・ロンギカウダツス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ）、ブルサフェレンクス・キシロフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）（マツ木材線虫（ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、クリコネモイデス・オルナータ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ ｏｒｎａｔａ）、ジチレンクス・デストラクター（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（ジャガイモ腐敗線虫（ｐｏｔａｔｏ ｒｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ジチレンクス・ジプサチ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）（茎及び球根線虫（ｓｔｅｍ ａｎｄ ｂｕｌｂ ｎｅｍａｔｏｄｅ）、グロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）（ジャガイモシスト線虫）、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（ゴールデン線虫（ｇｏｌｄｅｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシスト線虫（ｓｏｙｂｅａｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ヘテロデラ・スキャクティ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）（サトウダイコンシスト線虫（ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））；ヘテロデラ・ゼアエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｚｅａｅ）（コーンシスト線虫（ｃｏｒｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ）（穀物シスト線虫）、ヘテロデラ・カロタエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｃａｒｏｔａｅ）、ヘテロデラ・トリフォリ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、ホプロライムス・コロンブス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｃｏｌｕｍｂｕｓ）、ホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｇａｌｅａｔｕｓ）、ホプロライムス・マグニスチルス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｍａｇｎｉｓｔｙｌｕｓ）、ロンギドルス・ブレビアンヌラツス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｂｒｅｖｉａｎｎｕｌａｔｕｓ）、メロイドギネ・アレナリア（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、メロイドギネ・キトウッディ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ）、メロイドギネ・ハプラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）、メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、メロイドギネ・ジャバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、メソクリコネマ・ゼノプラックス（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｏｎｅｍａ ｘｅｎｏｐｌａｘ）、ナコブス・アベランス（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、ナコブス・ドルサリス（Ｎａｃｃｏｂｕｓ ｄｏｒｓａｌｉｓ）、パラトリコドルス・クリスティエイ（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｃｈｒｉｓｔｉｅｉ）、パラトリコドルス・マイナー（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｍｉｎｏｒ）、プラチレンクス・ブラキュルス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）、プラチレンクス・クレナトゥス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｒｅｎａｔｕｓ）、プラチレンクス・ヘキシンシスス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｈｅｘｉｎｃｉｓｕｓ）、プラチレンクス・ネグレクトゥス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ）、プラチレンクス・ペネトランス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、プラチレンクス・プロジェクトゥス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｒｏｊｅｃｔｕｓ）、プラチレンクス・スクリブネリ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｃｒｉｂｎｅｒｉ）、プラチレンクス・テヌイカウダトゥス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｔｅｎｕｉｃａｕｄａｔｕｓ）、プラチレンクス・スロネイ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｔｈｏｒｎｅｉ）、プラチレンクス・ゼアエ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｚｅａｅ）、プンクトデラ・チャコエンシス（Ｐｕｎｃｔｏｄｅｒａ ｃｈａｃｃｏｅｎｓｉｓ）、キニスルシウス・アクトゥス（Ｑｕｉｎｉｓｕｌｃｉｕｓ ａｃｕｔｕｓ）、ラドフォルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、ロチレンクルス・レニホルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、チレンコルヒンクス・ドゥビウス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｄｕｂｉｕｓ）、チレンクルス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）（柑橘線虫（ｃｉｔｒｕｓ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、シフェネマ・アメリカヌム（Ｓｉｐｈｉｎｅｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、Ｘ．メディテラネウム（Ｘ．Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｕｍ）、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0083】

Ｅ．リンカー
本明細書で提供される組換え核酸のいくつかの実施形態では、核酸配列はリンカーをコードする。いくつかの実施形態において、リンカーは、胞子外殻ポリペプチドを推定殺虫性ポリペプチドに連結する。いくつかの実施形態において、胞子外殻ポリペプチド及び推定殺虫性ポリペプチドは、リンカーによって構造的に単離される。本明細書に記載される融合タンパク質中で「構造的に単離された」ポリペプチドは、それらの適切な形態に折り畳まれ、したがって機能性を維持することができる。例えば、胞子外殻ポリペプチドから構造的に単離された殺虫性ポリペプチドは、その適切な形状に折り畳まれ、１）標的タンパク質（例えば、昆虫細胞表面タンパク質受容体）に結合する能力及び２）その殺虫活性を維持することができる。同様に、推定殺虫性タンパク質から構造的に単離された胞子外殻ポリペプチドは、その適切な形状に折り畳まれ、融合タンパク質を胞子の外殻に配置する能力を維持することができる。本明細書中に記載されるリンカーの重要な特徴は、推定殺虫性ポリペプチドを、それが発現される胞子に付着させ続ける能力である。本開示のリンカーは、組換え核酸によってコードされる融合タンパク質において所望の効果（例えば、構造的分離）をもたらすように最適化することができる。リンカー設計の局面及び考察は、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２７（１０）：３２５－３３０に記載されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロテアーゼ消化に耐性である。いくつかの実施形態において、リンカーのプロテアーゼ消化耐性は、胞子外殻ポリペプチドに連結された推定殺虫性ポリペプチドを保持する（すなわち、推定殺虫性タンパク質を、それが発現される胞子の表面に付着させたままにする）。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロテアーゼが豊富な環境（例えば、胞子形成及び／又は溶解したバチルス培養培地）でのプロテアーゼ消化に耐性である。

【0084】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２つのアミノ酸を含むポリペプチドである。リンカー配列は、融合タンパク質のポリペプチドが採用することができる配向の範囲を増加させることができる。ペプチドリンカーは、例えば、１～１００又はそれを超えるアミノ酸長（例えば、１ａａ、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、１０ａａ、１５ａａ、２０ａａ、２５ａａ、３０ａａ、３５ａａ、４０ａａ、４５ａａ、５０ａａ、５５ａａ、６０ａａ、６５ａａ、７０ａａ、７５ａａ、８０ａａ、８５ａａ、９０ａａ、９５ａａ、１００ａａ以上）であり得る。長さに応じて、リンカー配列は、らせん、β鎖、コイル／屈曲、及びターンなどの二次構造において様々な立体配座を有し得る。いくつかの例では、リンカー配列は、拡張された立体配座を有し、隣接するタンパク質ドメインと相互作用しない独立したドメインとして機能することができる。リンカー配列は、構造的に可撓性又は構造的に剛直であり得る。可撓性リンカーは、ポリペプチドドメイン間のある程度の移動又は相互作用を提供し、一般に、Ｇｌｙ及びＳｅｒなどの小さいアミノ酸又は極性アミノ酸が豊富である。剛性リンカーを使用して、ドメイン間の一定の距離を維持し、それらの独立した機能を維持するのを助けることができる。

【0085】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え核酸は、表１の任意のリンカー又はＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２７（１０）：３２５－３３０に記載されている任意のリンカーと少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有するリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２０、２１、又は３８～６１のいずれかと少なくとも６０％の同一性（例えば、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、親水性タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質）由来の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３８）の１つ又は複数のリピートと、それに続くアラニン残基及びセリン残基とを含む。ＧＧＧＧＳのリピート数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｂｔ Ｃｒｙタンパク質リーダー配列（例えば、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列）を含む。

【0086】

【表1】

【0087】

【表2】

【0088】

【表3】

【0089】

Ｆ．ＤＮＡ構築物及びベクター
本明細書に記載の組換え核酸のいずれかに作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物も本明細書で提供される。核酸は、この核酸が別の核酸配列と機能的関連性に置かれる場合、「作動可能に連結されて」いる。多数のプロモーターが、本明細書中に記載される構築物において使用され得る。プロモーターは、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与する、転写開始の上流及び／又は下流に位置する領域又は配列である。プロモーターは、真核生物プロモーター又は原核生物プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、胞子外殻ポリペプチド遺伝子に対する内因性プロモーターである（すなわち、プロモーターは、その天然のゲノム状況において遺伝子の発現を駆動する）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組換え核酸によってコードされる特定の胞子外殻ポリペプチド遺伝子に対する内因性プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは内因性ＣｏｔＣ又はＣｏｔＧプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＸ、ＣｏｔＹ又はＣｏｔＺプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種においてシグマＫ因子制御下にある。

【0090】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、胞子形成特異的プロモーターである。胞子の合成及び構造に関与する遺伝子が同定及びクローニングされ、そのような遺伝子からのプロモーター配列が単離され、特徴付けられている。当技術分野の当業者は、これらのプロモーター及び調節配列の中から選択することによって、胞子又は栄養細胞における目的のポリペプチドの発現の物理的位置、並びに胞子及び／又は栄養細胞のライフサイクルにおける発現のタイミングを制御することが可能であることを理解するであろう。例えば、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｃ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２３：１２９Ｓ－１３４Ｓ（１９９８）を参照されたく、これは、ルシフェラーゼ及びβ－ガラクトシダーゼなどのモデルタンパク質が、これらのタンパク質をコードする核酸配列を胞子形成特異的プロモーターに作動可能に連結することによって、胞子形成プロセス中に内生胞子に指向され得ることを実証している。Ｈｉｌｌらは、これらのモデル酵素が効果的に保存され、それらの活性を保持することをさらに実証している。米国特許出願公開第２００３０１６５５３８号明細書も参照されたい。

【0091】

本明細書で提供される組換え核酸は、目的の宿主細胞又は生物における発現のための発現カセットに含めることができる。カセットは、融合タンパク質の発現を可能にする本明細書で提供される組換え核酸に作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含むことができる。カセットは、生物に同時形質転換される少なくとも１つの追加の遺伝子又は遺伝要素をさらに含むことができる。さらなる遺伝子又はエレメントが含まれる場合、構成要素は作動可能に連結される。或いは、追加の遺伝子又は要素は、複数の発現カセット上に提供することができる。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位及び／又は組換え部位を備える。発現カセットは、転写の５’から３’方向に：目的の細胞又は生物において機能する転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本明細書に開示される組換え核酸、並びに転写及び翻訳終結領域（すなわち、終端領域）を含み得る。本明細書に記載のプロモーターは、宿主細胞におけるコード配列の発現を指示又は駆動することができる。調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域及び翻訳終結領域）は、宿主細胞又は互いに対して内因性又は異種性であり得る。本明細書で使用される場合、配列に関して「異種性」とは、外来種に由来する配列、又は同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座においてその天然の形態から実質的に改変されている配列である。

【0092】

さらなる調節シグナルとしては、転写開始開始部位、オペレーター、アクチベーター、エンハンサー、他の調節エレメント、リボソーム結合部位、開始コドン、終結シグナルなどが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。

【0093】

発現カセットはまた、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子には、いくつか例を挙げると、ハイグロマイシン耐性、アンピシリン耐性、ゲンタマイシン耐性、ネオマイシン耐性を付与するものなどの抗生物質耐性を付与する遺伝子が含まれる。さらなる選択マーカーは公知であり、任意のものを使用することができる。

【0094】

発現カセットを調製する際に、ＤＮＡ配列を適切な向きで、必要に応じて適切な読み枠で提供するように、様々なＤＮＡ断片を操作することができる。この目的のために、アダプター又はリンカーを使用してＤＮＡ断片を結合することができ、又は便利な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するために他の操作が関与し得る。この目的のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば転移及びトランスバージョンが関与し得る。

【0095】

本明細書に記載の組換え核酸又は発現カセットを含むベクターを、本明細書中にさらに提供する。ベクターは、挿入された核酸の転写を指示及び調節する必要な機能的要素を有することが企図される。これらの機能的エレメントとしては、プロモーター、プロモーターの上流又は下流の領域、例えばプロモーターの転写活性を調節し得るエンハンサー、複製起点、プロモーターに隣接するインサートのクローニングを容易にするための適切な制限部位、ベクター又はインサートを含むベクターを含む細胞を選択するのに役立ち得る抗生物質耐性遺伝子若しくは他のマーカー、ＲＮＡスプライスジャンクション、転写終結領域、又は挿入された遺伝子若しくはハイブリッド遺伝子の発現を容易にするのに役立ち得る任意の他の領域が挙げられるが、これらに限定されない（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^th ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２０１２を参照されたい）。ベクターは、例えば、プラスミドであり得る。

【0096】

本明細書に記載の組換え核酸、ＤＮＡ構築物、又はベクターを含む宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は細菌細胞又は真菌細胞である。宿主細胞は、例えば、上記の細菌又は真菌種のいずれかに由来する細胞を含む、任意の胞子産生微生物細胞であり得る。宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ）、ｅｘ ｖｉｖｏ（エクスビボ）、又はｉｎ ｖｉｖｏ（インビボ）宿主細胞であり得る。本明細書に記載の宿主細胞のいずれかの集団も提供される。本明細書に記載の１つ又は複数の宿主細胞を含む細胞培養物も提供される。細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌株）起源の細胞を含む多くの細胞の培養及び産生のための方法は、当技術分野で利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：３－８１２、並びにＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３^rd Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，ＮＹ及びそこに引用されている参考文献；Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９）Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４^th Ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；及びＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６－１０２４を参照されたい。

【0097】

本明細書で使用される場合、核酸を細胞に導入する文脈における「導入する」という語句は、細胞の外側から細胞の内側への核酸配列の転座を指す。エレクトロポレーション、ナノ粒子送達、ウイルス送達、ナノワイヤ又はナノチューブとの接触、受容体媒介内在化、細胞透過性ペプチドを介した移行、リポソーム媒介移行、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクタミン、リン酸カルシウム、又は核酸を原核細胞宿主又は真核細胞宿主に導入するための現在知られている若しくは将来同定される任意の方法を含むがこれらに限定されない、そのような移行の様々な方法が企図される。標的化されたヌクレアーゼシステム（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はｍｅｇａＴＡＬ（ＭＴ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．１（２０２０））を使用して、核酸、例えば本明細書に記載の組換えタンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することもできる。

【0098】

Ｇ．融合タンパク質
本明細書に記載の組換え核酸、ＤＮＡ構築物又はベクターのいずれかによってコードされる融合タンパク質も本明細書で提供される。

【0099】

本明細書に記載のポリペプチド又はタンパク質のいずれも、検出可能な部分、例えば蛍光タンパク質又はその断片をさらに含むことができる。蛍光タンパク質の例には、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、例えばＶｅｎｕｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、並びにこれらのタンパク質の誘導体、例えば変異体誘導体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｕｄａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ”，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０（３）：１１０３－１１６３（２０１０）；及びＳｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ７９：９３－１１７（２０１７）を参照されたい。

【0100】

本明細書に記載されるポリペプチド又はタンパク質のいずれも、タンパク質単離に有用なドメイン又は配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、いくつか例を挙げると、親和性タグ、例えばＦＬＡＧタグ（配列番号２４）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２６））、ポリヒスチジンタグ（例えば、８ＸＨｉｓタグ（配列番号２７））、アルブミン結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、ＡＵ１エピトープ、ＡＵ５エピトープ、ビオチン－カルボキシ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）を含む。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、タンパク質単離に有用である。Ｋｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔａｇｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７３：Ｕｎｉｔ－９．９（２０１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又はタンパク質は、タンパク質単離に有用なシグナル配列を含む。例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．“Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｏｓｔ”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９７：３８１１－３８２６（２０１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又はタンパク質は、プロテアーゼ認識部位を含む。そのようなプロテアーゼ認識部位は、とりわけ、タンパク質単離後のシグナルペプチド又は親和性精製タグの除去を可能にするために有用であり得る。

【0101】

Ｈ．胞子
本明細書に記載の組換え核酸、ＤＮＡ構築物、ベクター、又は融合タンパク質のいずれかを含む微生物胞子も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、胞子の成分として発現される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、胞子の表面に提示される。

【0102】

いくつかの実施形態において、胞子は、細菌胞子又は真菌胞子である。いくつかの実施形態では、胞子は、本開示のセクションＡに列挙された胞子産生微生物のいずれかに由来する。いくつかの実施形態では、胞子は、その胞子中に殺虫性タンパク質を産生することが知られていないバチルス種に由来する。

【0103】

胞子の混合物を含む組成物であって、混合物中の胞子の少なくとも２つが異なる推定殺虫性ポリペプチドを含む組成物も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数の胞子を含み、複数の胞子は、異なる推定殺虫性ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む胞子を含む。例えば、混合物又は複数の胞子は、第１の推定殺虫性ポリペプチドをコードする第１の組換え核酸を含む胞子と、第２の推定殺虫性ポリペプチドをコードする第２の組換え核酸を含む胞子とを含み得る。混合物又は複数の胞子は、広範囲の推定殺虫性ポリペプチドをコードする胞子を含み得る。いくつかの実施形態において、混合物又は複数の胞子は、１０×１０＾８個までの異なる推定殺虫性ポリペプチド（例えば、最大１０×１０＾７個、最大１０×１０＾６個、又は最大１０×１０＾５個）を含む胞子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数の胞子を含み、複数の胞子の各々は、異なる推定殺虫性ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。

【0104】

ＩＶ．殺虫性タンパク質及び殺虫性タンパク質受容体を同定する方法
別の態様では、殺虫性タンパク質をスクリーニング及び同定する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、細菌又は真菌胞子（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の胞子）上に殺虫性タンパク質ライブラリーを提示すること、及び１つ以上の受容体タンパク質に対してスクリーニングすることを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記の融合タンパク質又は上記の融合タンパク質を含む胞子を上記の殺虫性タンパク質受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体タンパク質はＡＢＣ輸送体タンパク質である。いくつかの実施形態において、本方法は、融合タンパク質又は胞子と殺虫性タンパク質受容体との間の相互作用を検出することを含む。いくつかの実施形態において、そのような相互作用は、融合タンパク質又は胞子の推定殺虫性タンパク質が殺虫性タンパク質であることを示す。

【0105】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質又は胞子を精製殺虫性タンパク質受容体タンパク質と接触させる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質又は胞子を、殺虫性タンパク質受容体タンパク質を含む粗抽出物と接触させる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質又は胞子を、関連する生物学的環境を模倣する環境において殺虫性タンパク質受容体と接触させる。例えば、シミュレートされる環境は、昆虫の中腸環境であり得る。環境は、緩衝溶液などの中性又はアルカリ性ｐＨ（すなわち、７．０以上のｐＨレベル）環境であり得る。いくつかの実施形態において、ｐＨは、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を使用して７．５ｐＨに維持される。いくつかの実施形態において、ｐＨは、８．０ ｐＨ～１１．０ ｐＨに維持される。例えば、ｐＨを最大１１．０ ｐＨ（例えば、１１ｐＨ、１０．５ｐＨ、１０ｐＨ、９．５ｐＨ、９ｐＨ、８．５ｐＨ、又は８ｐＨ）に維持することができる。適切なアルカリ性緩衝液（例えば、８．２以上のｐＫ_a値を有する緩衝液）は当技術分野で公知であり、それらに限定されないが、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ、塩化コラミン、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、及びＡＭＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＰＳ緩衝液又はＣＡＢＳ緩衝液を使用してｐＨを約１０ｐＨに維持する。

【0106】

いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体は膜タンパク質である。特異的な産生及び／又は単離方法を使用して、膜タンパク質を（すなわち、膜タンパク質の構造及び／又は機能を維持するために）精製することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、コポリマーの一部として精製される。例えば、いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体は、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）の一部として（例えば、本明細書の実施例７に記載の方法によって）精製される。いくつかの実施形態において、受容体タンパク質は、特定のＳを有するＳＭＡコポリマーの一部としてＳ；Ｍ比（すなわち、コポリマー中のスチレン対無水マレイン酸の比）として精製される。この比は、当業者による実験によって決定され得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＣ輸送体タンパク質の精製のためのＳ：Ｍ比は２：１～３：１（例えば、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、又は３：１）である。ＳＭＡＬＰにおいて殺虫性タンパク質受容体タンパク質（例えば、ＡＢＣ輸送体タンパク質）を調製することにより、受容体タンパク質の構造及び機能を保存することができる。Ｃｒｙ結合アッセイにおけるＳＭＡＬＰ－ＡＢＣ輸送体タンパク質の使用は以前に記載されていない。以前は、Ｃｒｙ結合アッセイのためにＡＢＣ輸送体を精製するために、ＤＤＭなどの界面活性剤が使用されてきた。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ＡＢＣ輸送体の構造及び機能は、ＡＢＣ輸送体の構造を支持する昆虫リン脂質を置換又は除去する界面活性剤によって悪影響を受ける可能性がある。

【0107】

本開示の殺虫性タンパク質受容体タンパク質は、任意の適切な細胞（例えば、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞など）において発現され得る、及び／又は任意の適切な細胞から精製され得る。いくつかの実施形態では、受容体タンパク質は昆虫細胞で発現される。いくつかの態様では、受容体タンパク質はバキュロウイルス発現ベクターから発現される。バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で産生された組換えタンパク質は、翻訳後改変を受ける。適切なベクターは当業者に公知である。本明細書における受容体タンパク質の発現に有用な昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、カイコ蛹細胞、又は当業者に公知の他の昆虫細胞株が含まれる。本明細書における受容体タンパク質の発現に有用であり得る他の細胞には、Ｅｘｐｉ２９３細胞及びＨＥＫ２９３細胞が含まれる。Ｗｉｌｌｃｏｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２１７：７２－８１及びＮｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０２０（１０）：１５８３０を参照されたい。

【0108】

いくつかの態様において、受容体タンパク質は原核細胞において発現され、原核細胞から精製される。受容体タンパク質の発現及び精製に有用な、当業者に公知の多数の大腸菌発現ベクターが存在する。使用に適した他の微生物宿主には、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セナティア（Ｓｅｎａｔｉａ）、及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主において、典型的には宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。さらに、プロモーターは、受容体タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている。例示的な周知のプロモーターとしては、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、及びファージラムダ由来のプロモーター系が挙げられる。さらに、酵母発現を使用することができ、例えば、受容体タンパク質はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって発現させることができる。

【0109】

哺乳動物細胞はまた、タンパク質の発現及び精製を可能にする。哺乳動物細胞における活性タンパク質の発現に有用なベクターは当技術分野で公知であり、ハイグロマイシン耐性、ジェネテシン若しくはＧ４１８耐性、又は選択マーカーとしての使用に適した他の遺伝子若しくは表現型、又は遺伝子増幅のためのメトトレキサート耐性を付与する遺伝子を含むことができる。インタクトなタンパク質を分泌することができるいくつかの適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、又は任意の他の初代細胞株若しくは形質転換細胞株が含まれる。他の適切な宿主細胞株には、ＣＯＳ－７細胞、骨髄腫細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞などが含まれる。これらの細胞の発現ベクターには、複製起点、プロモーター、エンハンサー、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要な情報処理部位などの発現制御配列が含まれ得る。

【0110】

本明細書に記載のタンパク質の発現のための発現ベクターはまた、テトラサイクリン誘導性プロモーター又はグルココルチコイド誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターの制御下で本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸を含み得る。核酸はまた、特定の細胞、組織又は器官における核酸の発現を促進するために組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。多くの例が当技術分野で周知である、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、及び他の調節可能なプロモーターなどの任意の調節可能なプロモーターも企図される。さらに、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ誘導性系、並びにＦｌｐリコンビナーゼ誘導性プロモーター系も使用することができ、これらは両方とも当技術分野で公知である。

【0111】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、融合タンパク質又は胞子を、細胞（すなわち、精製タンパク質又は細胞溶解物中に存在するタンパク質ではなく）の表面上の殺虫性タンパク質受容体と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞は、昆虫細胞である（例えば、セクションＤ：上記標的有害生物に列挙されている昆虫のいずれかに由来する）。いくつかの実施形態では、細胞は細胞培養物の一部である。いくつかの実施形態では、細胞は生きている昆虫に存在する。

【0112】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質又は胞子と殺虫性タンパク質受容体との間の相互作用を検出することは、免疫磁気分離、フローサイトメトリー、細胞傷害性アッセイ、配列決定又はそれらの組み合わせを行うことを含む。いくつかの実施形態において、殺虫性タンパク質受容体タンパク質（例えば、ＦＬＡＧエピトープ）上のエピトープは、殺虫性タンパク質受容体を（例えば、免疫磁気分離を介して）精製するためにエピトープに対する抗体と共に使用される。融合タンパク質又は胞子が受容体と相互作用した場合、それは受容体タンパク質と共に精製される。いくつかの実施形態では、受容体タンパク質と相互作用する胞子は、フローサイトメトリーによって同定することができる。いくつかの実施形態では、受容体タンパク質と相互作用する胞子は、細胞傷害性アッセイによって（例えば、本明細書の実施例５に記載されるように）同定することができる。

【0113】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、推定殺虫性ポリペプチドが胞子に（例えば、胞子外殻ポリペプチドへの融合を介して）つながれるため、結合した胞子（すなわち、受容体タンパク質と相互作用した胞子）が選別された後に推定殺虫性ポリペプチドを同定することができる。この態様は、ハイスループットスクリーニングを可能にし、本明細書中の方法を、推定殺虫性タンパク質を宿主微生物において（例えば、各ウェルが異なる推定殺虫性タンパク質を発現する宿主細胞を有する９６ウェルプレートにおいて）個々に産生させ、受容体タンパク質に対して別々に試験しなければならなかった以前の昆虫活性毒素スクリーニング方法と区別する。

【0114】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質又は胞子と殺虫性タンパク質受容体との間の相互作用を検出することは、殺虫性タンパク質受容体タンパク質と相互作用する融合タンパク質をコードする組換え核酸を単離すること、及び殺虫性タンパク質の同一性を決定するために配列決定を行うことをさらに含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、以下のステップを（例えば、本明細書の実施例で実証されているように）含むが、番号が付けられているが、特定のステップは、列挙されたものとは異なる順序で及び／又は同時に実行することができる。
１．多様化した殺虫性タンパク質のライブラリーは、様々なタンパク質操作技術を使用し、天然に存在する殺虫性タンパク質を単離することによって作製される；
２．ステップ１のライブラリーを胞子提示ベクターにクローニングして、胞子の表面にタンパク質を提示させる；
３．所望の受容体（例えば、耐性を克服するためのＣｒｙ１Ｆａ耐性Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）コロニー由来のＡＢＣＣ２変異体）のタンパク質サンプルは、受容体発現系（例えば、バキュロウイルス発現系を用いたＳｆ９などの昆虫細胞株又はカイコなどの生きている昆虫）において産生される；
４．受容体タンパク質は、その天然のタンパク質構造が次のステップのために保存及び精製されるように、細胞膜から抽出される；
５．ステップ２から産生された胞子は、免疫磁気分離及びフローサイトメトリーなどの細胞選別技術を使用して、ステップ４で産生された受容体への結合能についてスクリーニングされる；
６．上記のステップ１～５を、１つ以上の殺虫性タンパク質が得られるまで繰り返す。

【0116】

いくつかの実施形態では、特定の殺虫性タンパク質受容体に結合することができる殺虫性タンパク質を同定する方法であって、受容体が昆虫細胞の表面に発現され、（ａ）推定殺虫性タンパク質の受容体結合部分が溶媒に曝露され、昆虫細胞受容体タンパク質に結合することができるような配向で宿主微生物中にクローニングされた胞子提示ベクターからの微生物内生胞子の表面に推定殺虫性タンパク質のライブラリーを提示すること；（ｂ）天然受容体タンパク質構造を保持し、推定殺虫性タンパク質に結合することができる形態の殺虫性タンパク質受容体タンパク質（すなわち、毒素受容体）を単離し、調製すること；（ｃ）細胞（粒子）選別技術（例えば、フローサイトメトリー又は磁気的選別）を用いて、（ｂ）で調製した昆虫細胞膜タンパク質に対する推定殺虫性タンパク質の結合能に基づいて、推定殺虫性胞子を選別すること；（ｄ）場合により、受容体タンパク質に結合する胞子に繋がれた推定殺虫性タンパク質の遺伝子配列を決定すること；及び必要に応じて、（ｅ）毒素受容体がクローン化され発現されるＳｆ９及びＨＥＫ２９３などの培養細胞を使用して、（ｃ）で選別された胞子に対する毒素タンパク質の細胞傷害性を決定することを含む、方法が本明細書において提供される。

【0117】

特定の殺虫性タンパク質に対する殺虫性タンパク質受容体を同定する方法も本明細書で企図される。いくつかの実施形態において、既知又は推定殺虫性ポリペプチドを含む融合タンパク質又は胞子を（例えば、本明細書に記載されるように）受容体タンパク質のライブラリーと接触させることができる。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、公知の受容体又は操作された合成受容体（例えば、ＤＮＡシャッフリング、ブロックスワップ、部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又はそれらの組み合わせによって産生される）を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質又は胞子間の相互作用は、上記のように（例えば、免疫磁気分離における融合タンパク質上のエピトープを使用して）検出される。いくつかの実施形態において、そのような相互作用は、受容体タンパク質が融合タンパク質又は胞子の殺虫性ポリペプチドに対する受容体であることを示す。

【0118】

Ｖ．有害生物防除方法
本明細書では、有害生物防除のための生物学的薬剤として本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子を使用する方法も企図される。本明細書で使用される場合、「有害生物防除」は、植物に対する有害生物の悪影響の低減を指す。有害生物又は植物有害生物は、植物又は植物製品を直接又は間接的に損傷するか、植物又は植物製品に損傷を与えるか、植物又は植物製品に疾患を引き起こす植物、動物又は病原体の種、株又は生物型である。本開示の文脈において、「有害生物」は害虫である。いくつかの実施形態において、有害生物は、上記のセクションＩＩＩ．Ｄに列挙された有害生物のいずれかである。いくつかの実施形態において、有害生物防除は、殺生物活性によって（すなわち、有害生物を死滅させることによって）達成される。害虫に関して、殺生物性活性は殺虫活性と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、有害生物防除は、植物に対する有害生物の影響を低減することによって達成される。

【0119】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子を含む組成物は、植物、植物種子又は植物繁殖材料（例えば、種子、葉、茎、根、又は任意の他の植物組織）に施用される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の胞子を産生する細菌を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、当技術分野で公知の他の殺虫剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、当技術分野で従来使用されている追加の補助成分、例えば賦形剤、安定剤、担体、分散剤、肥料、栄養素、成長添加剤、安定剤、「徐放性」助剤、着色剤、及び適切な場合は表面活性物質（界面活性剤）を含む。適切な補助成分には、作物保護製品に従来使用されている全ての物質が含まれる。

【0120】

いくつかの態様において、組成物は１つ又は複数の賦形剤を含む。１つ以上の賦形剤は、１種又は複数の安定剤、１種又は複数の添加剤、１種又は複数の担体、１種又は複数の分散剤、１種又は複数の肥料、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。一例では、１つ以上の賦形剤はアセトンを含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の安定剤及び／又は他の添加剤を含む。安定剤及び／又は添加剤としては、浸透剤、接着剤、固化防止剤、染料、分散剤、湿潤剤、乳化剤、消泡剤、抗菌剤、不凍液、顔料、着色剤、緩衝剤及び担体が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、界面活性剤及び／又はアジュバントをさらに含んでもよい。

【0122】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、１つ以上の担体をさらに含み得る。担体の例としては、固体担体、スポンジ、織物及び合成材料が挙げられるが、これらに限定されない。合成材料は、多孔質合成材料であってもよい。追加の担体としては、ワックス、リノリン、パラフィン、デキストロース顆粒、スクロース顆粒及びマルトース－デキストロース顆粒などの有機担体を挙げることができる。或いは、担体は、天然粘土、カオリン、パイロフィライト、ベントナイト、アルミナ、モンモリロナイト、珪藻土、チョーク、珪藻土、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウム、硫黄、石灰、小麦粉又はタルクなどの無機担体であり得る。組成物は、担体に吸着され得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の分散剤を含む。分散剤は、負に帯電したアニオン分散剤であってもよい。分散剤は、非イオン性分散剤であってもよい。

【0124】

いくつかの実施形態では、組成物は、肥料、栄養素、又は他の成長添加剤を含む。肥料は化学肥料であってもよい。肥料は有機肥料であってもよい。肥料は無機肥料であってもよい。肥料は、粒状又は粉末状の肥料であってもよい。肥料は液体肥料であってもよい。肥料は、徐放性肥料であってもよい。

【0125】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される有害生物防除方法は、有害生物防除有効量の本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子（又は本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子を含む組成物）で植物、植物種子又は植物繁殖材料を処理することを含む。本明細書で使用する「有害生物防除有効量」とは、標的有害生物を死滅させ、防除し、若しくは感染させ、標的有害生物の成長若しくは繁殖を遅延させ、標的有害生物の集団を減少させ、及び／又は標的有害生物によって引き起こされる植物への損傷を減少させることができる融合タンパク質、胞子又は組成物の量を指す。所与の融合タンパク質、胞子、又は組成物の有害生物防除有効量は、植物種、植物、植物種子、又は植物繁殖物質の表面積、担体の種類、他の有効成分の有無、製剤化の方法、送達経路、使用される特定の融合タンパク質又は胞子、融合タンパク質又は胞子の供給源（すなわち、融合タンパク質又は胞子を産生する胞子産生微生物）、標的有害生物種、及び植物への有害生物感染又は損傷の重症度を含むがこれらに限定されない要因に応じて変化する。

【0126】

本明細書で提供される有害生物防除方法は、意図された目的及び一般的な状況に応じて、当業者に知られている任意の適切な方法で、すなわち本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子を含む組成物の噴霧、湿潤、注射、霧化、散布、ブラッシング、種子粉衣、散布又は注入によって行うことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、植物、植物種子又は植物繁殖材料に直接適用される。いくつかの実施形態では、組成物は、植物、植物種子又は植物繁殖材料に（例えば、前記組成物を灌漑用水、植物生息地、土壌、植物成長容器などに添加することによって）間接的に適用される。胞子形成細菌及び真菌の場合、植物繁殖材料（例えば種子処理）に対する施用量は、約１×１０⁴～１×１０¹²（又はそれ以上）個の胞子／種子の範囲であり得る。さらなる実施形態では、胞子濃度は、約１×１０⁶個～約１×１０¹¹個の胞子／種子、１×１０⁶個～約１×１０¹⁰個の胞子／種子、１×１０⁶個～約１×１０⁹個の胞子／種子、１×１０⁶個～約１×１０⁸個の胞子／種子、又は１×１０⁶個～約１×１０⁷個の胞子／種子の範囲であり得る。さらなる実施形態では、胞子濃度は、約１×１０⁷個～約１×１０¹¹個の胞子／種子、１×１０⁷個～約１×１０¹⁰個の胞子／種子、１×１０⁷個～約１×１０⁹個の胞子／種子又は１×１０⁷個～約１×１０⁸個の胞子／種子の範囲であり得る。さらなる実施形態において、胞子濃度は、約１×１０⁷個の胞子／種子であり得る。

【0127】

繁殖材料は、植物繁殖のために繁殖材料を使用する前に組成物で処理することができ、例えば、種子は播種前にドレッシングされる。有効成分はまた、穀粒を液体組成物に浸漬することによって、又は穀粒を固体組成物でコーティングすることによって、種子穀粒に適用されてもよい（コーティング）。本明細書で提供される方法で使用することができる本明細書に記載の融合タンパク質又は胞子を含む組成物の製剤の例としては、限定されないが、溶液、顆粒、ペレット、ビーズ、粉剤、噴霧可能な粉末、乳剤、コーティングされた顆粒及び懸濁濃縮物が挙げられる。

【実施例】

【0128】

以下の実施例は、説明のために提供されるが、特許請求される発明を限定するものではない。

【0129】

実施例１．胞子提示ベクターにおけるＢｔ ｃｒｙ１Ａａ及びｃｒｙ１Ｆａ遺伝子のクローニング
Ｂｔ Ｃｒｙ殺虫性タンパク質をバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子の表面に提示した。提示されたＣｒｙタンパク質をＡＢＣ輸送体受容体に結合することができるようにするために、Ｃｒｙタンパク質自身のリーダー配列を含む構造的に可撓性のリンカーを胞子外殻（ＣｏｔＣ／Ｇ）とＣｒｙタンパク質との間に挿入した。

【0130】

リーダー配列を含むｃｒｙ１Ａａ（配列番号４）及びｃｒｙ１Ｆａ（配列番号２）遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により合成された。Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ｆａをセリンプロテアーゼに対して耐性にするために、合成したｃｒｙ１Ａａ又はｃｒｙ１Ｆａ遺伝子にＲ２８Ｌ又はＲ２７Ｌ変異を含めた。表２のプライマー１Ｆ（配列番号２８及び２９）及びプライマー２Ｒ（配列番号３０及び３１）を用いて、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＳＷ１２１４のゲノムＤＮＡ調製物から、プロモーター（５’上流領域）を含むｃｏｔＣ（配列番号１６）及びｃｏｔＧ（配列番号１８）遺伝子を増幅した。これらのプライマーを、ｃｏｔＣ及びｃｏｔＧをＬ１をコードするヌクレオチド（短：ＧＧＧＧＧＳＡＳ［配列番号５４］）及びＬ２（長：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳ［配列番号５５］）リンカーペプチドに図１に示すスキームで連結するように設計した。

【0131】

図１に示すように、２段階増幅を行い、プロモーター－ｃｏｔＣ／Ｇ－リンカー（Ｌ１又はＬ２）を得た。プライマー３Ｒ Ｌ１（配列番号３２）による第１の増幅はリンカーの一部を付加し、プライマー３Ｒ Ｌ２（配列番号３３）による第２の増幅（表２）は、完全なリンカー配列及びＮｃｏＩ部位に対するものであった。第２の増幅の産物をｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ）にクローニングした。

【0132】

表２のプライマー４Ｆ（配列番号３４）及びプライマー５Ｒ（配列番号３５）を用いて合成ｃｒｙ１Ａａ遺伝子からｃｒｙ１Ａａ遺伝子を増幅し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を付加した。タンパク質コード配列の５’末端にＮｃｏＩ部位及び３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙにクローニングした。これらの制限酵素部位を使用して、ｃｒｙ１Ｆａなどの他のｃｒｙ遺伝子をクローニングした。これらの２つのｐＧＥＭ－Ｔクローン、一方はｃｏｔＣ／Ｇ－Ｌ１／Ｌ２遺伝子を含むものをＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化し、他方はｃｒｙ１Ａａを含むものをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化した。これら２つのＤＮＡ断片、ＸｈｏＩ－ｃｏｔＣ／Ｇ－リンカー－Ｎｃｏ１及びＮｃｏＩ－ｃｒｙ１Ａａ－ＢａｍＨＩを、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＳＢ６３４（配列番号２２）中で三方向ライゲーションによってクローニングした。このｐＳＢ６３４プラスミドはＳａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：１９５－２００）によって記載されている。また、合成ｃｒｙ１Ａｃターミネーター及びＸｈｏＩ部位をクローニングしたｐＨＹ３００ＰＬＫ（配列番号２３）に、ｃｏｔ－ｃｒｙ断片をクローニングした。クローニングスキームを図２に示す。

【0133】

ｐＨＹ３００ＰＬＫはそのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にＸｈｏＩ部位を有さないため、表２に示すように、リンカーＦ及びリンカーＲのオリゴヌクレオチド（配列番号３６及び３７）からなる小さなＤＮＡ片をクローニングすることによって、ＭＣＳのＸｂａＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にＸｈｏＩ部位を挿入した。

【0134】

最終的な胞子提示プラスミドを図３に示す。本図において、「シャトルベクター」は、ｐＳＢ６３４又はｐＨＹ３００ＰＬＫを意味する。他のｃｒｙ遺伝子をクローニングするために、ｃｏｔＣ／Ｇ－Ｌ１／２－ｃｒｙ１Ａａを有するｐＳＢ６３４及びｐＨＹ３００ＰＬＫの最終構築物中のｃｒｙ１Ａａ遺伝子を消化し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を利用してｃｒｙ１Ｆａなどの新しい遺伝子をクローニングした。

【0135】

【表4】

【0136】

実施例２．Ｓｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａ及びＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの調製
Ｃｒｙタンパク質を表面に発現する枯草菌胞子を単離する方法を確立した。栄養細胞の汚染を防ぐために、完全且つ同期的な胞子形成のために、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物を１／２ ＬＢ寒天プレートの表面上で増殖させた。

【0137】

図３に示すように、ｃｏｔ－ｃｒｙ遺伝子をｐＳＢ６３４及びｐＨＹ３００ＰＬＫにクローニングした後、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＳＷ１２１４（宿主株）をエレクトロポレーションによってこれらのプラスミド構築物で形質転換した。エレクトロコンピテントバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の調製及びエレクトロポレーションは、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎのプロトコルに従って行い、そこからｐＨＹ３００ＰＬＫ及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株を購入した。形質転換されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を１／２ ＬＢ－ｔｅｔ寒天プレート上に広げてコンフルエントな増殖をさせ、３７℃でインキュベートした。完全な胞子形成後、プレートあたり１ｍｌのＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ７．５）で胞子を収集し、１５ｍｌ遠心管に移した。チューブにＴＢＳを１４ｍｌまで充填し、胞子を懸濁した。胞子を１４，０００ｘｇで３０分間遠心分離して沈殿物を保存した。沈殿物中の胞子は、気泡を形成することなく１４ｍｌのＴＢＳに穏やかだが完全に懸濁し、同じ速度及び時間で再び遠心分離した。懸濁及び遠心分離のこの手順は「洗浄」と呼ばれ、この用語は同じ又は同様の手順を意味する他の実施例で使用される。最終沈殿物を１ｍｌのＴＢＳに懸濁し、長期保存が必要な場合は－２０℃で凍結状態を維持した。この胞子懸濁液を顕微鏡下で試験し、胞子数を決定した。ｐＳＢ６３４にはｃｏｔ－ｃｒｙ遺伝子をクローニングしなかったことを除いて、Ｓｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４の調製に差異なかった。１／２ ＬＢのみ（ｔｅｔなし）プレートを使用したことを除いて、同じ方法で枯草菌ＩＳＷ１２１４の野生型胞子を調製した。

【0138】

実施例３．胞子表面におけるＣｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ｆａの発現の確認
Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子の表面におけるＢｔ Ｃｒｙタンパク質の発現を、顕微鏡観察及び蛍光抗Ｃｒｙ抗体を用いたフローサイトメトリーによって確認した。Ｂ．Ｃｒｙタンパク質を発現するサブチリス胞子をフローサイトメトリーによって選別することができた。

【0139】

可溶性、無胞子Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：１９５－２００）によって記載されているように、これらの遺伝子をｐＳＢ６３４においてｃｒｙ１Ｃａプロモーターでクローニングすることによって作製し、Ｃｒｙタンパク質を、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４３２：４６－６０）らによって報告された方法に従って精製した。これらの精製Ｃｒｙタンパク質を使用して、Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ｆａに対する抗体をモルモットにおいて作製し、標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（「Ａｌｅｘａ」）で標識した。ＴＢＳ中の数μｌの１０⁹個の胞子／ｍｌ Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａ／Ｃｒｙ１Ｆａ懸濁液を等体積の抗血清と混合し、２５℃で１時間インキュベートした。次いで、実施例２に記載したように遠心分離によってＴＢＳ中で胞子を洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。図４の上部パネルに示されるモデルは、バチルス胞子上のＣｒｙタンパク質が蛍光抗体によってどのように検出されたかを示す。このモデルは、胞子表面に１つのＣｒｙタンパク質分子のみを示すが、複数の分子が存在すると考えられる。蛍光顕微鏡法（図４、底部）は、すべてではないにしてもほとんどの胞子が蛍光性であることを示し、Ｃｒｙタンパク質が発現され、胞子表面に局在していることを確認した。

【0140】

胞子表面上のＣｒｙ１Ｆａの局在化を、Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＯｎ－ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔマイクロチップ細胞選別機を用いてフローサイトメトリーによって確認した。この実験では、Ａｌｅｘａ標識抗Ｃｒｙ１Ｆａ抗体を結合させた１０％ Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａを、抗体を含まないＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａと混合した。図５（左パネル）に示すように、選別機は９．１７％の蛍光胞子を小さなピークとして分離した。残りの９０．８％の胞子（主要ピーク）は蛍光性ではなかった。これらの９．１７％の蛍光胞子を再吸収し（図５、右パネル）、それらの純度が７４．５％であることが明らかになった。胞子数スケールが２つのグラフ間で異なることに留意されたい。結果は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子が実際にＣｒｙタンパク質を発現しているという顕微鏡観察を確認した。また、フローサイトメトリーによりバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子を分取できることが確認された。

【0141】

実施例４．ＡＢＣ輸送体を発現するＳｆ９細胞とＣｒｙタンパク質を提示するバチルス胞子との間の結合
枯草菌胞子の表面に提示されたＢｔ Ｃｒｙタンパク質は、Ｓｆ９昆虫細胞の表面に機能的に発現されたそれぞれの受容体に結合することができた。

【0142】

Ｓｆ９細胞でＡＢＣ輸送体タンパク質を発現させるために、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２（配列番号８）、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２（配列番号１０）、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２変異体（配列番号１２）及びＳｆ－ＡＢＣＣ３（配列番号１４）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって合成した。これらの配列番号に示すように、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加して標識した。これらの遺伝子を、それらの公開されたプロトコルに従って、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（商標）バキュロウイルス発現系にクローニングした。簡潔には、輸送体遺伝子を、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターを利用してｐＦａｓｔＢａｃ（商標）にクローニングした。マーカーとして機能するＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子もまた、ＮｈｅＩ部位とＳｐｈＩ部位との間で同じベクターにクローニングした。ＧＦＰ遺伝子をｐＥＧＦＰ－１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）から増幅した。ｐＦａｓｔＢａｃ発現プラスミドをＤＨ１０Ｂａｃ（商標）細胞に形質転換した後、ｐＦａｓｔＢａｃベクター上のｍｉｎｉ－Ｔｎ７エレメントとバクミド上のｍｉｎｉ－ａｔｔＴｎ７標的部位との間で転位が起こり、組換えバクミドが生成した。転位反応が完了した後、高分子量の組換えバクミドＤＮＡを単離し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＳｆ９細胞にバクミドＤＮＡをトランスフェクトし、組換えバキュロウイルスを作製した。７２時間後、細胞を覆う培地を回収し、５００ｘｇで５分間の遠心分離によって清澄化した。上清をウイルス溶液として使用した。Ｎａｋａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｙ ８７（２）：４５－５１）は、ＦＬＡＧタグ（配列番号６）を有するＰｘ－ＡＢＣＣ２をバキュロウイルスにクローニングし、ウイルスを提供した。この輸送体タンパク質を発現するＳｆ９細胞を、他の輸送体遺伝子と同じ方法で作製し、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａの細胞傷害性を試験するために使用した。Ｓｆ９細胞を、２６℃で１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＧｒａｃｅの補足昆虫培地で維持した。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ結合及び細胞生存率アッセイのために、８０％超の集密度を有するＳｆ９細胞をウイルス懸濁液に感染させた。感染したＳｆ９細胞を２６℃で７２時間インキュベートした。Ｓｐｏｒｅ－ＣｒｙがＡＢＣ輸送体を発現するＳｆ９細胞に結合するかどうかを調べるために、ＰＢＳ（８．１ｍＭリン酸二ナトリウム－１．５ｍＭリン酸一カリウム緩衝液、ｐＨ ７．４、２．７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁したＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙを昆虫培地中でＳｆ９細胞懸濁液と混合し、顕微鏡下で観察した。Ｓｆ９細胞表面に見られる粒子がＣｒｙタンパク質を発現する胞子であることを確認するために、Ａｌｅｘａ標識抗Ｃｒｙ抗体を胞子に添加し、蛍光顕微鏡で観察した。図６は、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を発現するＳｆ９に結合したＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの一例である。結合した胞子は、明視野顕微鏡（図６、左上パネル）によって細胞上の灰色のスポットとして、蛍光顕微鏡（図６、右上パネル）によって白色のスポットとして見られた。Ａｌｅｘａ標識抗Ｃｒｙ１Ｆａ抗体は、Ｓｆ９細胞表面に結合した胞子上のＣｒｙ１Ｆａに結合した。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの結合は、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を含まないＳｆ９細胞（図６、左下及び右下パネル）又はＳｆ－ＡＢＣＣ２変異体を発現するＳｆ９細胞では観察されなかった。Ｓｆ９細胞は蛍光顕微鏡下で可視であり、これはＥＧＦＰがｃｒｙ遺伝子と共クローニングされたためである。

【0143】

実施例５．Ｃｒｙタンパク質を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子の細胞毒性
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子の表面に提示されたＢｔ Ｃｒｙタンパク質は、細胞がＣｒｙタンパク質の受容体を発現している場合にのみ、Ｓｆ９昆虫細胞に対して毒性であった。

【0144】

細胞をＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａと混合した後、混合物を２６℃で６０分間インキュベートした。図７に示すように、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を発現するＳｆ９細胞は膨潤し（図７、左上及び右上パネル）、次いで完全に破壊された（図７、左下及び右下パネル）。図７の右下のパネルは、細胞壁が完全に崩壊したことを示す、細胞から漏出したＧＦＰを示す。

【0145】

Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの細胞傷害性は、ＡＢＣ輸送体を発現していないＳｆ９細胞及びＳｆ－ＡＢＣＣ２変異体を発現しているＳｆ９細胞では見られなかった。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１ＡａとＳｆ９発現Ｂｍ－ＡＢＣＣ２の組み合わせでも同様の観察が見られた。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙの細胞毒性アッセイを以下のように要約する：Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａは、Ｐｘ－ＡＢＣＣ２、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ３に対して細胞毒性であり；Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｃｒｙ１Ｆａ耐性Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）コロニー由来のＳｆ－ＡＢＣＣ２変異体に対して細胞傷害性であったが、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２変異体に対しては細胞傷害性でなかった。

【0146】

実施例６．カイコ（Ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｐｕｐａｅ）におけるＡＢＣ輸送体タンパク質の産生
Ｂｔ Ｃｒｙ殺虫性タンパク質の受容体を、バキュロウイルス発現系を利用してカイコ蛹において発現させて、大量の受容体タンパク質を産生した。

【0147】

合成されたＢｍ－ＡＢＣＣ２、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２及びＳｆ－ＡＢＣＣ３遺伝子は、Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）に送られ、ＰｒｏＣｕｂｅ（商標）技術を利用してタンパク質を産生した。ＳｙｓｍｅｘのＰｒｏＣｕｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙについては、ウェブサイト（Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＰｒｏＣｕｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｃｕｂｅ．ｓｙｓｍｅｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇ／ｐ／ｅ＿ｓｉｌｋｗｏｒｍ＿ｏｕｔｌｉｎｅ／）で説明されている。手短に言えば、ＡＢＣ輸送体遺伝子をバキュロウイルス発現系にクローニングしてウイルスを作製した。組換えバキュロウイルスをＢ．ｍｏｒｉ（Ｂ．モリ）（カイコ（ｓｉｌｋｗｏｒｍ））細胞内で増殖させ、１０匹のカイコ蛹に注射した。プロテアーゼ阻害剤カクテルとメラニン化阻害剤を含むＴＢＳ中で、ウイルス感染カイコ蛹を超音波処理によりホモジナイズした。超音波処理によって生成された細胞膜断片を、以下のように分画遠心分離によって収集した。均質化された蛹組織を１，０００ｘｇで遠心分離して、大きなサイズの物質を除去した。沈殿物をさらに超音波処理し、さらに２回遠心分離した。低速遠心分離の上清を合わせ、１００，０００ｘｇで１時間遠心分離して沈殿を回収した。次いで、沈殿を１０ｍｌのＴＢＳに懸濁し、１０個の１ｍｌアリコート（１蛹あたり１ｍｌ）に分割し、－８０℃で凍結したままにした。「膜断片」と呼ばれるこの試料を使用して、ＡＢＣ輸送体タンパク質を抽出及び精製した。

【0148】

実施例７．ＡＢＣ輸送体タンパク質の抽出及び精製
カイコ蛹細胞膜で産生されたＡＢＣ輸送体を抽出し、ＳＭＡＬＰ（Ｓｔｙｒｅｎｅ Ｍａｌｅｃｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）にパッケージングし、輸送体タンパク質の第２のＡＴＰアーゼのＣ末端に結合したＦＬＡＧタグを利用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。抗ＦＬＡＧ抗体に結合したＦＬＡＧタグは、タグが溶媒に曝露されていることを意味する。結果は、ＳＭＡＬＰにおけるＡＢＣ輸送体タンパク質の予想される構造を支持する。

【0149】

ＡＢＣ輸送体タンパク質をＳＭＡ（スチレンマレイン酸）で抽出した。本実施例において、「ＳＭＡで可溶化した」又は「ＳＭＡで抽出した」とは、図８に示すように、昆虫細胞膜からＡＢＣ輸送体タンパク質を抽出し、ＳＭＡＬＰ（Ｓｔｙｒｅｎｅ Ｍａｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ）にパッケージングしたものを意味する。すぐに使用可能な粉末ＳＭＡ試薬を、Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍｏｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、５％でＴＢＳに溶解した。３つの異なるＳ：Ｍ比のＳＭＡ試薬を使用してＳｆ－ＡＢＣＣ２を抽出した。Ｓ：Ｍ比は、ＳＭＡコポリマー中のスチレン（Ｓ）対無水マレイン酸（Ｍ）比である。例えば、Ｓ：Ｍ＝３：１は、ｎ＝３、ｍ＝１であるコポリマー［スチレン］_n－［無水マレイン酸］_mを意味する。実施例６で調製した膜断片懸濁液を等体積のＴＢＳ中５％ ＳＭＡと混合し、２５℃で２時間インキュベートした。混合物を１００，０００ｘｇで３０分間４℃で遠心分離した。上清及び沈殿をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ＦＬＡＧ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析して、上清中のＳｆ－ＡＢＣＣ２を確認した。Ｓ：Ｍ比２．３：１及び３：１を有するＳＭＡのみがＳｆ－ＡＢＣＣ２を抽出し、Ｓ：Ｍ＝１．４：１を有するＳＭＡではＳｆ－ＡＢＣＣ２は抽出されなかった。ＳＭＡは、図８に示されるように、細胞のリン脂質二重層を有する小膜断片として細胞膜からＡＢＣ輸送体を打ち抜くと考えられる。この断片はＳＭＡＬＰである。このモデル（図８、右パネル）では、Ｃｒｙタンパク質のドメインＩＩループ領域に結合するＥＣＬ（細胞外ループ）、及び第２のＡＴＰアーゼに結合したＦＬＡＧタグと共に輸送体のＡＴＰアーゼ領域（ヌクレオチド結合領域）が、Ｃｒｙタンパク質と抗ＦＬＡＧ抗体の両方への結合を可能にする溶媒に曝露される。本発明で使用されるすべてのＡＢＣ輸送体は、第２のＡＴＰアーゼのＣ末端にＦＬＡＧタグが付加されている。

【0150】

ＳＭＡＬＰのサイズは、Ｓ：Ｍ比によって決定され、ＡＢＣ輸送体タンパク質を有する脂質粒子を含有するのに十分な大きさでなければならない。Ｓ：Ｍ比１．４：１のＳＭＡは、ＡＢＣ輸送体には不適切なサイズの脂質粒子を生成すると考えられる。Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を含有するＳＭＡＬＰを、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡから入手した抗ＦＬＡＧ抗体固定化アガロースゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。１ｍｌの細胞膜断片試料の１つのアリコートを２つの５００μｌのアリコートに分割した。１つの５００ｕｌアリコートでは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、約１５０μｇのＡＢＣ輸送体タンパク質を含有すると推定された。アフィニティークロマトグラフィーのために、１つの５００μｌアリコートを５００μｌの５％ ＳＭＡと混合し、インキュベートし、遠心分離して、約１ｍｌのＳＭＡ抽出Ｓｆ－ＡＢＣＣ２（すなわち、ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２）を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、輸送体タンパク質の約５０％が抽出されたことを示した。ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を、１ｍｌ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に充填した２００μｌの抗ＦＬＡＧ抗体固定化アガロースゲルにロードした。１０％グリセロール（ＴＢＳ－グリセロール）を含有するＴＢＳでカラムを洗浄し、ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２を１．２ｍｌの溶出緩衝液（１０％グリセロールを含むＴＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチド）で溶出した。カラム溶出液を６つの２００μｌ画分に分画し、図９に示すようにドットブロッティングによって分析した。図９において、すべての２００μｌ画分（最初（Ｆｒ．１）以外の最後のスピンオフ（Ｆｒ．７）を含む「Ｆｒ．」）、は強い蛍光シグナルを示し、Ｓｆ－ＡＢＣＣ２が親和性カラムから首尾よく溶出したことを確認した。

【0151】

Ｆｒ．１を除くすべての画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入、５０ｋＤａカットオフ）で３００ｕｌまで濃縮した。次いで、濃縮したカラム溶出液を２ｍｌのＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）中で脱塩して、ＦＬＡＧペプチドを除去した。ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２と呼ばれるこの親和性精製ＡＢＣ輸送体が約３００μｌあった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、１５０ｋＤａ付近に一つのバンドが示された。これを６つの５０μｌアリコートに分割し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。抗ＦＬＡＧ－抗体アフィニティークロマトグラフィーによるＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２の精製の成功は、ＦＬＡＧタグが溶媒に曝露されていることを示す。これは、図８に示すＳＭＡＬＰモデルを支持する。ＡＢＣＣ２の細胞外ループ（ＥＣＬ）も溶媒に曝露され、Ｃｒｙタンパク質に結合することができることは、ＳＭＡＬＰモデルに基づいている可能性が高い。

【0152】

実施例８．Ｃｒｙタンパク質とその特異的受容体との間の相互作用に基づくＣｒｙタンパク質を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子の選別
Ｃｒｙタンパク質を発現し、その受容体が特異的に結合したバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子を、受容体に結合したＦＬＡＧタグ及び磁気ビーズに固定化された抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫磁気分離によって単離した。また、受容体に結合した胞子は、フローサイトメトリーによって選別できることが実証された。

【0153】

胞子選別実験は、免疫磁気分離及びフローサイトメトリーによって行った。選別の目的は、胞子上のＣｒｙタンパク質と特定のＡＢＣ輸送体タンパク質との間の親和性を利用して、Ｃｒｙタンパク質を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子を引き出すことである。胞子選別の実現可能性を実証するために、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１ＦａをＳｆ－ＡＢＣＣ２で選別し、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１ＡａをＢｍ－ＡＢＣＣ２で選別した。ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２が結合したＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａを用いて免疫磁気分離を行った。以下のようにして、抗ＦＬＡＧ抗体固定化磁気ビーズを用いて、輸送体に結合した胞子を取り出した。１００μｌのＴＢＳに懸濁した約１０⁶個のＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの胞子を実施例７からの５０μｌの親和性精製ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２と混合し、２５℃で２時間インキュベートし、１４，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって１．５ｍｌのＴＢＳで２回洗浄した。洗浄した胞子を１００μｌのＴＢＳに懸濁し、５μｌの抗ＦＬＡＧ抗体固定化磁気ビーズ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａのカタログ番号Ｍ８８２３）と混合した。磁気ビーズ上に結合した胞子を磁石上に保持し、ＴＢＳで５回洗浄した。洗浄した胞子を１００μｌのＴＢＳに懸濁した。ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２に結合したＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａを、１０ｍＭ ＴＢＳ中の１．５ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチドを含む抗ＦＬＡＧ抗体固定化磁気ビーズから分離した。この最終胞子懸濁液をＬＢ－ｔｅｔプレートにプレーティングした。Ｃｒｙタンパク質が発現していないＳｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４を用いて、全く同じ実験を行った。結果を図１０に示す。

【0154】

図１０に示すように、磁気ビーズは、Ｃｒｙタンパク質が発現していないＳｐｏｒｅ－ｐＳＢ６３４の１０⁶個の胞子から９個の胞子（コロニー）しか引き出さなかった（図１０左パネル）。胞子の数は、非特異的結合のバックグラウンドレベルとして予想されるよりもはるかに少なかった。一方、ビーズは、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ出発試料において多数の胞子（すなわち、多すぎる数のコンフルエントな成長）を捕捉した（図１０、右パネル）。

【0155】

磁気分離がＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａを選択的に単離できるかどうかを調べるために、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａと野生型胞子との混合物を用いて同様の実験を行った。混合物－１において、１０⁶個（約１０％）のＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ胞子及び１０⁷個の野生型胞子が存在した。混合物－２は、２×１０³個（０．１％）のＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ及び２×１０⁶個の野生型胞子からなっていた。混合物－３は、２×１０³個（０．０１％）のＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ及び２×１０⁷個の野生型胞子を含有した。混合物－４は、２×１０³個（０．００１％）のＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａ及び２×１０⁸個の野生型胞子を有していた。これらの試料は、ｔｅｔ耐性Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａとｔｅｔ感受性野生型胞子との間で胞子を分離するためのものであったため、選別された胞子はｔｅｔ選択によって同定することができた。免疫磁気ビーズで分離した胞子を最初にＬＢプレート（ｔｅｔなし）に蒔き、次いでＬＢ－ｔｅｔプレートに移した。混合物－１は３５９個の胞子（コロニー）を生成し、混合物－２は１８０個の胞子（コロニー）を生成し、混合物－３は１５００個の胞子（コロニー）を生成し、混合物－４は１７００個の胞子（コロニー）をＬＢ－ｔｅｔプレート上に生成した。混合物－３及び４中の０．０１％及び０．００１％のＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａの回収率を高めるために、５μｌの代わりに５０μｌの抗ＦＬＡＧ抗体固定磁気ビーズを使用した。磁気ビーズによって捕捉されたこれらの胞子の数は、分離が選択的であることを示した。混合物－１由来の胞子の７０％、混合物（Ｍｉｔｕｒｅ）－２由来の胞子の６１％、混合物－３由来の胞子の６０％及び混合物－４由来の胞子の７０％がテトラサイクリン耐性Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａであることが明らかになった。これは、ＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２がＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ｆａに選択的に結合したことを強く示し、図８に示すＳＭＡＬＰ－ＡＢＣ輸送体モデルを確認した。

【0156】

受容体親和性に基づくＣｒｙタンパク質を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子の選別をフローサイトメーターによって行った。この場合、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００に可溶化したＢｍ－ＡＢＣＣ２と共に使用し、続いてＳＭＡＬＰ－Ｓｆ－ＡＢＣＣ２と同様に親和性精製を行った。ＰＢＳに懸濁したＳｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａを、単純に混合し、２５℃で２時間インキュベートすることによって、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有するＰＢＳ中の５μｌのＢｍ－ＡＢＣＣ２（約０．３ｍｇ／ｍｌ）で標識した。未結合Ｂｍ－ＡＢＣＣを、０．２％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）で胞子を洗浄することによって除去した。次いで、Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａ－Ｂｍ－ＡＢＣＣ２複合体を抗ＦＬＡＧ－マウス－抗体及びＡｌｅｘａ標識抗マウスＩｇＧ－抗体と順次混合して蛍光性にした。胞子複合体を、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有するＰＢＳ中で洗浄し、蛍光顕微鏡法によって観察した。観察の結果、蛍光色素を保持している胞子はごく少数であったため、Ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔ セルソーター（Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてフローサイトメーターで選別した。セルソーターは、おそらくＢｍ－ＡＢＣＣ２に結合した約１０００個の胞子を蛍光として引き出した。洗浄溶液中の０．２％ ＳＤＳの使用は、Ｂｍ－ＡＢＣＣ２を多くの胞子から引き離したが、セルソーターが少数の残存する蛍光胞子を選別できるかどうかを調べるために意図的に行われた。図１１に示すように、１０００個の蛍光胞子を分離し、ＬＢプレートにプレーティングした。ＬＢプレートをＬＢ－ｔｅｔプレート上にコピーした。８００個を超える胞子が出芽して、ｔｅｔ選択プレート上にコロニーを形成することが見出された。これらのコロニーの一部を採取し、それらの胞子中のプラスミドがＰＣＲ及びシーケンシングによってｃｒｙ１Ａａ遺伝子であることを確認した（実施例９）。Ｓｐｏｒｅ－Ｃｒｙ１Ａａを用いたこの実験により、Ｃｒｙタンパク質を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）胞子を、受容体親和性に基づいてフローサイトメトリーによって選別することができることが確認された。

【0157】

実施例９．選別された胞子におけるｃｒｙ遺伝子の同定
胞子表面に提示されたＣｒｙタンパク質を同定するために、フローサイトメトリーによって選別された胞子中のプラスミドを単離し、配列決定した。

【0158】

フローサイトメトリーによって選別された胞子中のｃｒｙ遺伝子を同定するために、図１０に示すＬＢ－ｔｅｔプレート上の約１０個のコロニーを採取し、細胞密度がＯＤ_600nm＝０．２～０．３に達するまでシェーカー中３７℃で数時間、１ｍｌのＬＢ－ｔｅｔブロス中で増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９，Ｔｏｘｉｎｓ １１：１６２）によって記載された方法に従ってそれらのコロニーからプラスミドを単離した。Ｈｏｕらのこのプラスミド単離方法は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のためのものであるが、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）でうまく機能した。単離されたプラスミドを配列決定して、胞子中のｃｒｙ遺伝子を決定した。

【0159】

本開示で論じられているすべての特許、特許公報、特許出願、雑誌記事、書籍、技術参考文献などは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0160】

本開示の図及び説明は、本開示の明確な理解に関連する要素を示すために簡略化されていることを理解されたい。図面は例示を目的として提示されており、構造図として提示されていないことを理解されたい。省略された詳細及び修正又は代替の実施形態は、当業者の理解の範囲内である。

【0161】

本開示の特定の態様では、要素若しくは構造を提供するために、又は所与の１つ若しくは複数の機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素に置き換えることができ、複数の構成要素を単一の構成要素に置き換えることができることが理解されよう。そのような置換が本開示の特定の実施形態を実施するように機能しない場合を除いて、そのような置換は本開示の範囲内であると考えられる。

【0162】

本明細書に提示される例は、本開示の潜在的且つ具体的な実施態様を例示することを意図している。例は、主に当技術分野の当業者のための本開示の例示を目的としていることが理解されよう。本開示の趣旨から逸脱することなく、これらの図又は本明細書に記載された動作には変形例があり得る。例えば、特定の場合には、方法ステップ又は動作を異なる順序で実行又は実行することができ、或いは動作を追加、削除又は変更することができる。

【0163】

値の範囲が提供される場合、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、下限の単位の最小部分まで、その範囲の上限と下限との間の各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値又は記載されていない介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値との間の任意のより狭い範囲が包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれてもよく、又は除外されてもよく、いずれかの、いずれの、又は両方の限界がより小さい範囲に含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本技術に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外した範囲も含まれる。

【0164】

前述の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載されている。しかしながら、本開示に記載された本発明は、これらの特定の詳細の１つ又は複数なしで実施され得ることは当技術分野の当業者には明らかであろう。他の例では、当技術分野の当業者に周知の、周知の特徴及び手順は、本発明を不明瞭にすることを避けるために記載されていない。本開示の実施形態は、例示を目的として説明されており、限定を目的とするものではない。本発明は主に特定の実施形態を参照して説明されているが、他の実施形態が本開示を読むと当技術分野の当業者に明らかになることも想定され、そのような実施形態が本発明の方法の範囲内に含まれることが意図される。したがって、本開示は、上述又は図面に示された実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び変更を行うことができる。

【0165】

【表5】

【0166】

【表6】

【0167】

【表7】

【0168】

【表8】

【0169】

【表9】

【0170】

【表10】

【0171】

【表11】

【0172】

【表12】

【0173】

【表13】

【0174】

【表14】

【0175】

【表15】

【0176】

【表16】

【0177】

【表17】

【0178】

【表18】

【0179】

【表19】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】