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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-04
(54)【発明の名称】ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20250128BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250128BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20250128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250128BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20250128BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C07K16/40
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P37/02
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534160
(86)(22)【出願日】2022-12-08
(85)【翻訳文提出日】2024-06-19
(86)【国際出願番号】 EP2022084898
(87)【国際公開番号】W WO2023104938
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】21213573.5
(32)【優先日】2021-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514099673
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ブランシ， アリ
(72)【発明者】
【氏名】カーピー グティエレス チルロス， アレハンドロ
(72)【発明者】
【氏名】フライモサー－グルントショーバー， アン
(72)【発明者】
【氏名】ホーファー， ケルスティン
(72)【発明者】
【氏名】ホーファー， トーマス
(72)【発明者】
【氏名】キューンル， トミー
(72)【発明者】
【氏名】メスナー， エッケハルト
(72)【発明者】
【氏名】ノイマン， クリスティアーヌ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化するための、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体に関する。さらに、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、抗体を産生する方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体であって、ここで該抗体は、（ａ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン；並びに
（ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメイン
を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体。
【請求項2】
第１の抗原結合ドメインのＶＨが、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ／又は第１の抗原結合ドメインのＶＬが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体であって、ここで該抗体は、（ａ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１３のＶＬ配列を含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン；並びに
（ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメイン
を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体。
【請求項4】
第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び／又は、存在する場合、第３の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
第１及び第２の抗原結合ドメインが、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
第１及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているかのいずれかである、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、該抗体が、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているかのいずれであり、且つ、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
ＦｃドメインがＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項５～１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項13】
Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項５～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項14】
Ｆｃが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項５～１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項15】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項５～１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項16】
第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項17】
第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３若しくは配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び／又は配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項19】
請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項20】
（ａ）抗体の発現に適した条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、（ｂ）抗体を回収する工程とを含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を産生する方法。
【請求項21】
請求項２０に記載の方法によって産生される、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体。
【請求項22】
請求項１～１７又は２１のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項23】
医薬としての使用のための、請求項１～１７若しくは２１のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項24】
疾患の治療における使用のための、請求項１～１７若しくは２１のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項25】
疾患が、がん又は自己免疫疾患である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項26】
医薬の製造における、請求項１～１７若しくは２１のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項27】
疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１～１７若しくは２１のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項28】
疾患が、がん又は自己免疫疾患である、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
個体における疾患を治療する方法であって、請求項１～１７若しくは２１のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２２に記載の医薬組成物の有効量を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項30】
疾患が、がんである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
上記に記載されるとおりの発明。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化するための、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体に関する。さらに、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、抗体を産生する方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ３（分化抗原群３）は、４つのサブユニット、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖から構成されるタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体及びζ鎖と会合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。
【0003】
ＣＤ３は、創薬標的として広く研究されている。ＣＤ３を標的とするモノクローナル抗体は、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患又は移植拒絶反応の治療における免疫抑制療法として使用されてきた。ＣＤ３抗体ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）は、１９８５年にヒトでの臨床使用が認可された最初のモノクローナル抗体であった。
【0004】
ＣＤ３抗体のより最近の応用は、一方ではＣＤ３に結合し、他方ではＰＬＡＰなどの標的細胞抗原に結合する二重特異性抗体の形態である。ＰＬＡＰ（胎盤アルカリホスファターゼ）は、グリコシルホスファチジルイノシトールによって細胞膜に固定された二量体酵素であり、胎盤では高度に発現しているが、健常組織では発現が限られているか、あるいは発現していない。ＰＬＡＰの異所性発現は、卵巣、精巣、肺、及び消化管のがんと関連していることが判明しており（Ｆｉｓｈｍａｎ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３６（１９７６）４２５６－４２６１）、ＣＤ３二重特異性抗体を使用した腫瘍標的免疫療法の興味深い標的となっている。ＰＬＡＰに対するバインダーは、例えば国際公開第２０１９／２４０９３４号に記載されている。
【0005】
そのような抗体が両方の標的に同時に結合することで、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化とそれに続く標的細胞の溶解が引き起こされる。ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する二重特異性抗体は、例えば国際公開第２０２１／１５４５３４号に記載されている。
【0006】
治療目的のために抗体が満たさなければならない重要な要件は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（薬物の貯蔵のため）及びｉｎ ｖｉｖｏ（患者への投与後）の両方での十分な安定性である。
【0007】
アスパラギンの脱アミド化などの修飾は、組換え抗体の典型的な分解であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏの安定性とｉｎ ｖｉｖｏの生物学的機能の両方に影響を与える可能性がある。
【0008】
抗体、特にＴ細胞の活性化のための二重特異性抗体の多大な治療可能性を考慮すると、最適化された特性を持つ多重特異性抗体を含むＣＤ３抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、ＣＤ３に結合し、例えばアスパラギン脱アミド化による分解に耐性があり、したがって治療目的に必要とされる場合に特に安定な抗体、特に多重特異性（例えば二重特異性）抗体を提供する。また、この抗体は優れた熱安定性と結合親和性を備えている。提供される（多重特異性）抗体は、優れた有効性と生産性を、低い毒性と好ましい薬物動態特性とさらに組み合わせている。
【0010】
明細書に示すように、多重特異性抗体を含む、本発明によって提供されるＣＤ３に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性と比較して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３に対する約９０％以上の結合活性を保持する。本明細書でさらに示すように、本発明によって提供されるＣＤ３に結合する多重特異性抗体を含む抗体は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定されるように５５℃以上の凝集温度を有し、ＳＰＲによって決定されるようにヒト及びカニクイザルＣＤ３への一価の結合のＫＤ値はピコモル範囲である。
【0011】
一態様では、本発明は、ＣＤ３及び胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）に結合する抗体を提供し、ここで該抗体は、（ａ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン；並びに（ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ／又は第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0012】
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供し、ここで該抗体は、（ａ）配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１３のＶＬ配列を含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン；並びに（ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む。
【0013】
一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び／又は、存在する場合、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
【0014】
一態様では、抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
【0015】
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である。
【0016】
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
【0017】
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0018】
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている。
【0019】
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているかのいずれかである。
【0020】
一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、本抗体は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているかのいずれであり、且つ、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
【0021】
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【0022】
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３若しくは配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び／又は配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【0023】
特定の態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び／又は配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【0024】
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４８のＬＣＤＲ１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び／又は配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【0025】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド、及び本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。
【0026】
別の態様では、（ａ）抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、（ｂ）抗体を回収する工程とを含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって産生される、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を包含する。
【0027】
本発明は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【0028】
本発明には、本発明の抗体及び医薬組成物の使用方法も包含される。一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明による抗体又は医薬組成物を提供する。一態様では、疾患の治療における使用のための、本発明による抗体又は医薬組成物が提供される。また、医薬の製造における本発明による抗体又は医薬組成物の使用、疾患の治療のための医薬の製造における本発明による抗体又は医薬組成物の使用も提供される。本発明はまた、本発明による抗体又は医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法を提供する。特定の態様では、疾患はがんである。他の態様では、疾患は、自己免疫疾患である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A-F】本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構造である。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ構成要素を有する（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。黒丸：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいて任意選択で導入された反対電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的に、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む場合がある。
【図1G-N】本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構造である。（Ｇ、Ｋ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ構成要素を有する（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂと別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ構成要素とを有する（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。黒丸：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいて任意選択で導入された反対電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的に、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む場合がある。
【図1O-V】本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構造である。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図。黒丸：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいて任意選択で導入された反対電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的に、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む場合がある。
【図1W-Z】本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構造である。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図。黒丸：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいて任意選択で導入された反対電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的に、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む場合がある。
【図2】（Ａ）実施例で使用されるＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）分子の概略図。試験したＴＣＢ抗体分子は全て、電荷修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、標的細胞抗原バインダーにおける電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」として製造された。（Ｂ－Ｅ）ＴＣＢのアセンブリのための構成要素：ＣＨ１及びＣＬに電荷修飾を有する抗ＴＹＲＰ１ Ｆａｂ分子の軽鎖（Ｂ）、抗ＣＤ３クロスオーバーＦａｂ分子の軽鎖（Ｃ）、Ｆｃ領域にノブ及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｄ）、Ｆｃ領域にホール及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｅ）。
【図3】実施例３で使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）設定の概略図。Ｃ１センサーチップに結合させた抗ＰＧ抗体。その表面にヒト及びカニクイザルのＣＤ３（Ｆｃ領域に融合）を通過させ、ＴＣＢ内での抗ＣＤ３抗体とＣＤ３との相互作用を分析する。
【図4A-B】異なるＣＤ３バインダーを含むＴＣＢによる腫瘍細胞の死滅及びＴ細胞の活性化。Ｐ０３５．０９３、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔ ＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢで処理したときの健常ドナーのＰＢＭＣによる黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ）及び４８時間後（Ｂ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとして、ＰＢＭＣ内のＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ４ ＣＤ２５（Ｃ）、ＣＤ４ ＣＤ６９（Ｄ）、ＣＤ８ ＣＤ２５（Ｅ）、ＣＤ８ ＣＤ６９（Ｆ）。
【図4C-F】異なるＣＤ３バインダーを含むＴＣＢによる腫瘍細胞の死滅及びＴ細胞の活性化。Ｐ０３５．０９３、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔ ＣＤ３バインダーを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢで処理したときの健常ドナーのＰＢＭＣによる黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ）及び４８時間後（Ｂ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとして、ＰＢＭＣ内のＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御をフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ４ ＣＤ２５（Ｃ）、ＣＤ４ ＣＤ６９（Ｄ）、ＣＤ８ ＣＤ２５（Ｅ）、ＣＤ８ ＣＤ６９（Ｆ）。
【図5】（Ａ）実施例６で生成された一価ＩｇＧ分子の概略図。この一価ＩｇＧ分子は、ＣＤ３バインダーにＶＨ／ＶＬ交換を有するヒトＩｇＧ１として製造された。（Ｂ－Ｅ）一価ＩｇＧのアセンブリのための構成要素：抗ＣＤ３クロスオーバーＦａｂ分子の軽鎖（Ｂ）、Ｆｃ領域にノブ及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｃ）、Ｆｃ領域にホール及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｄ）。
【図6A-F】最適化された抗ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３を含むＰＬＡＰＴＣＢを、標的細胞として操作されたＣＨＯ－Ｋ１プールを用いたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞の活性化は、処理後６時間後の発光を測定することにより決定された。各パネルは以下のように異なる標的細胞株を表している：（Ａ）標的細胞なし、（Ｂ）ＣＨＯ－Ｋ１親、（Ｃ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＡＬＰＰ、（Ｄ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＡＬＰＧ、（Ｅ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＡＬＰＩ、（Ｆ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＡＬＰＬ。
【図6G-I】最適化された抗ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３を含むＰＬＡＰＴＣＢを、標的細胞として操作されたＣＨＯ－Ｋ１プールを用いたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞の活性化は、処理後６時間後の発光を測定することにより決定された。各パネルは以下のように異なる標的細胞株を表している：（Ｇ）ＣＨＯ－Ｋ１マウスＡＬＰＧ、（Ｈ）ＣＨＯ－Ｋ１マウスＡＬＰＩ、（Ｉ）ＬｏＶｏ。
【図7】最適化された抗ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３を含むＰＬＡＰ ＴＣＢを、標的細胞として操作されたＣＨＯ－Ｋ１プールを用いたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイで試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞の活性化は、処理後６時間後の発光を測定することにより決定された。各パネルは以下のように異なる標的細胞株を表している：（Ａ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＡＬＰＰ、（Ｂ）ＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＡＬＰＰ。
【図8】健常ドナーからのＰＢＭＣによる結腸直腸腺癌細胞株ＬｏＶｏの腫瘍細胞死滅を、ＰＬＡＰ ＴＣＢで処理した場合に評価した。腫瘍細胞死滅は、標的細胞の非存在下（Ａ、Ｂ）又は存在下（Ｃ、Ｄ）で、４８時間後（Ａ、Ｃ）及び７２時間後（Ｂ、Ｄ）にＣｙｔｏｔｏｘＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞死を定量化することによって測定した。
【図9】ＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ、Ｃ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ、Ｄ）におけるＣＤ２５の上方制御を、ＰＬＡＰ ＴＣＢで処理した健常ドナーからのＰＢＭＣについて、標的細胞としてＬｏＶｏ細胞株の存在下（Ｃ、Ｄ）又は非存在下（Ａ、Ｂ）で分析した。７２時間後にフローサイトメトリーにより分析を行った。
【発明を実施するための形態】
【0030】
Ｉ．定義
以下で別途定義されない限り、用語は当技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
以下で別途定義されない限り、用語は当技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
【0031】
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関して「第１」、「第２」又は「第３」という語は、各タイプの部分が２つ以上ある場合に区別する便宜のために使用される。これらの用語の使用は、明示的に述べられていない限り、部分の特定の順序又は向きを付与することを意図していない。
【0032】
「抗ＣＤ３抗体」及び「ＣＤ３に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＤ３を標的とする診断剤及び／又は治療薬として有用であるように、十分な親和性でＣＤ３に結合することができる抗体を指す。一態様では、抗ＣＤ３抗体の無関係の非ＣＤ３タンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、抗体のＣＤ３への結合の約１０％未満である。特定の態様では、ＣＤ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ又は≦１００ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。抗体は、例えばＳＰＲによって測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、ＣＤ３に「特異的に結合する」と言われる。特定の態様では、抗ＣＤ３抗体は、異なる種由来のＣＤ３の間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。
【0033】
同様に、「抗ＰＬＡＰ抗体」及び「ＰＬＡＰに結合する抗体」という用語は、抗体がＰＬＡＰを標的とする診断剤及び／又は治療薬として有用であるように、十分な親和性でＰＬＡＰに結合することができる抗体を指す。一態様では、抗ＰＬＡＰ抗体の無関係の非ＰＬＡＰタンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、抗体のＰＬＡＰへの結合の約１０％未満である。特定の態様では、ＰＬＡＰに結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ又は≦１００ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。抗体は、例えばＳＰＲによって測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、ＰＬＡＰに「特異的に結合する」と言われる。特定の態様では、抗ＰＬＡＰ抗体は、異なる種由来のＰＬＡＰの間で保存されたＰＬＡＰのエピトープに結合する。
【0034】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【0035】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
【0036】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体を指す。
【0037】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で通常存在しているバリアント、例えば天然に生じる変異を含んでいるか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に生じるような、可能性のあるバリアント抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、そのような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【0038】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）法又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）法によって決定して、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価方法のレビューについては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。いくつかの態様では、本発明により提供される抗体は、単離された抗体である。
【0039】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【0040】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。そのような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0041】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特定の態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えばマウス、ラット又はウサギに由来する。特定の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片も、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
【0042】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に結合し、それに相補的である領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されてもよい。好ましい態様では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0043】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は通常、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体由来のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照。可変領域配列に関して本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって規定された番号付けシステムを指す。
【0044】
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載される、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０頁を参照）はカッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３頁を参照）は重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用される。Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステムは、本明細書では、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け」と称することによってさらに明確化されている。
【0045】
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であり、抗原結合特異性を決定する抗体可変ドメインの各領域、例えば「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を指す。通常、抗体は、６つのＣＤＲ；ＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、及びＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む。本明細書の例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部位（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部位（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
【0046】
別途指示がない限り、ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上掲のＣｈｏｔｈｉａ、上掲のＭｃＣａｌｌｕｍ、又は任意の他の科学的に認められた命名システムに従い決定することもできることを理解するであろう。
【0047】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１ドメイン、ＦＲ２ドメイン、ＦＲ３ドメイン及びＦＲ４ドメインの４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）で次の順序で表示される：ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４。
【0048】
別途指示がない限り、ＣＤＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされている。
【0049】
本明細書の目的において「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【0050】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。
【0051】
本明細書における「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分類することできる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【0052】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分け得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【0053】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）とからなるタンパク質を指す。
【0054】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」ともいう）とは、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１から構成されるペプチド鎖（Ｎ末端からＣ末端の方向にＶＬ－ＣＨ１）と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬから構成されるペプチド鎖（Ｎ末端からＣ末端の方向にＶＨ－ＣＬ）とを含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
【0055】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち重鎖可変ドメイン及び定常ドメインから構成される重鎖（ＮからＣ末端の方向にＶＨ－ＣＨ１）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインから構成される軽鎖（ＮからＣ末端の方向にＶＬ－ＣＬ）とを含むＦａｂ分子を意味する。
【0056】
本明細書の「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びている。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受ける可能性がある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって宿主細胞によって産生される抗体は、完全長重鎖を含み得るか、又は完全長重鎖の切断されたバリアントを含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。Ｆｃ領域（又は本明細書で定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、他に示されない限り、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドなしで示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で特定されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で特定されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書で特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記も参照）で説明されているようなＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」）は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
【0057】
「融合した」とは、構成成分（例えばＦａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）がペプチド結合によって、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
【0058】
「多重特異性」という用語は、抗体が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。多重特異性抗体は、例えば、二重特異性抗体であり得る。典型的には、二重特異性抗体は２つの抗原結合部位を含み、それぞれの抗原結合部位は異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の態様では、多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【0059】
本明細書で使用される用語「価」は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、その抗原に特異的な１つの（且つ１つを超えない）抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。
【0060】
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【0061】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合ドメインが結合し、抗原結合ドメイン－抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞表面に、ウイルス感染した細胞表面に、他の疾患細胞表面に、免疫細胞表面に、血清中に遊離状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に見出すことができる。好ましい態様では、抗原はヒトタンパク質である。
【0062】
「ＣＤ３」は、特に断らない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」の、未処理のＣＤ３、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列を配列番号６３（シグナルペプチドなし）に示す。（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｐ０７７６６（バージョン２０９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１も参照されたい。別の態様では、ＣＤ３は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εである。カニクイザルＣＤ３εのアミノ酸配列を配列番号６４（シグナルペプチドなし）に示す。ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１も参照されたい。特定の態様では、本発明の抗体は、異なる種、特にヒト及びカニクイザルＣＤ３由来のＣＤ３抗原の間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体はヒトＣＤ３に結合する。
【0063】
本明細書で使用される「標的細胞抗原」とは、標的細胞、例えばがん細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。好ましくは、標的細胞抗原はＣＤ３ではなく、且つ／又はＣＤ３とは異なる細胞上に発現する。本発明によれば、標的細胞抗原はＰＬＡＰ、特にヒトＰＬＡＰである。
【0064】
「ＰＬＡＰ」は胎盤アルカリホスファターゼ（酵素委員会（ＥＣ）番号３．１．３．１）を表す。ヒトＰＬＡＰは、ＡＬＰＰ遺伝子によってコードされる５３５アミノ酸のグリコシル化タンパク質である（したがって、「ＡＬＰＰ」と呼ばれることもる）。４つの異なるヒトアルカリホスファターゼが存在する：（１）胎盤型ＡＬＰ（ＰＬＡＰ、ＡＬＰＰ遺伝子）及び（２）生殖細胞型ＡＬＰ（ＰＬＡＰ様、ＡＬＰＧ遺伝子）。これらは９８％の相同性を有する；（３）腸型ＡＬＰ（ＡＬＰＩ遺伝子）及び（４）非特異的組織ＡＬＰ又は肝臓／骨／腎臓ＡＬＰ（ＡＬＰＬ遺伝子）。これらはＰＬＡＰとそれぞれ８８％及び５６％の相同性を有する（Ｍｏｓｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（１９９２）２４８６－２４９２；Ｈａｒｒｉｓ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １８６（１９９０）１３３－１５０）。本明細書で使用される場合、「ＰＬＡＰ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＰＬＡＰを指す。この用語は、「完全長」の、未処理のＰＬＡＰ、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＰＬＡＰを包含する。この用語は、ＰＬＡＰの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様では、ＰＬＡＰはヒトＰＬＡＰである。ヒトタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｐ０５１８７（エントリーバージョン２２４）を参照。ヒトＰＬＡＰのアミノ酸配列も配列番号７３（シグナルペプチドなし）に示す。カニクイザルＰＬＡＰのアミノ酸配列を配列番号７４（シグナルペプチドを含む）に示す。特定の態様では、本発明の抗体は、異なる種のＰＬＡＰ抗原（特にヒト及びカニクイザルＰＬＡＰ）の間で保存されているＰＬＡＰのエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体はヒトＰＬＡＰに結合する。
【0065】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0066】
「親和性成熟」抗体とは、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ以上の改変を有する抗体を指し、そのような改変を有しない親抗体と比較して、そのような改変は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
【0067】
「結合の低下」、例えばＦｃ受容体への結合の低下は、例えばＳＰＲによって測定される、それぞれの相互作用に対する親和性の低下を指す。明確にするために、この用語には、親和性をゼロ（又は分析方法の検出限界未満）に減少させること、すなわち相互作用の完全な消失も含まれる。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
【0068】
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【0069】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低下させるか又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される、会合を促進する修飾は、好ましくは、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）のそれぞれに対して行われる別個の修飾を含み、これらの修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電的に有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これは、サブユニットのそれぞれに融合されたさらなる構成要素（例えば、抗原結合ドメイン）が同じではないという意味で、同一ではない可能性がある。いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【0070】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【0071】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【0072】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体で覆われた標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低下」という用語は、上で定義したＡＤＣＣの機構により、標的細胞を取り囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生産、精製、製剤化及び保存方法（これらは当業者には既知である）を用いて、同じタイプの宿主細胞によって生産された同じ抗体であるが操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。例えば、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換をそのＦｃドメインに含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメインにおいてこのアミノ酸置換を伴わない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照）。
【0073】
本明細書で使用される場合、「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作すること（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらの手法の組み合わせを含む。
【0074】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴（例えば、Ｆｃ受容体への結合の低下又は別のペプチドとの会合の増加）を有することを条件として、置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達することができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び挿入が含まれる。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変化させるためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０種類の標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を改変する方法も有用であり得ることが考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用され得る。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示され得る。
【0075】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列アライメントを行うための適切なパラメーターを決定し得る。あるいは、同一性パーセント値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、利用者向け文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録され、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
【0076】
別途指示がない限り、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムをＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスと共に使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５（１９８８）２４４４－２４４８），Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６（１９９６）２２７－２５８）及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６（１９９７）２４－３６）により作成され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ又はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公開されて利用可能である。代替的に、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダ中に与えられる。
【0077】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基から構成されている。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、前記塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’に向かって表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は線状又は環状であり得る。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及び／又は例えば宿主若しくは患者におけるｉｎ ｖｉｖｏにおいて、本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡを化学修飾して、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を向上させ、ｍＲＮＡを対象に注入してｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成できるようにすることができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又はＥＰ２１０１８２３号Ｂ１を参照）。
【0078】
「単離された」核酸分子は、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子には、核酸分子を通常含有する細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、この核酸分子は染色体外に存在するか、又はその本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在する。
【0079】
「抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、これには単一のベクター又別々のベクター中のそのようなポリヌクレオチド分子が含まれ、宿主細胞中の１つ又は複数の箇所にそのようなポリヌクレオチド分子が存在している。
【0080】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では、「発現ベクター」と呼ばれる。
【0081】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。一態様では、本発明の宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞はヒト体内の細胞ではない。
【0082】
「医薬組成物」又は「医薬製剤」という用語は、中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、該組成物が投与されるであろう対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
【0083】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって非毒性である、有効成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、バッファー、添加物、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0084】
本明細書で使用される場合、「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（及びその文法上の変化形、「治療する」（ｔｒｅａｔ）又は「治療すること」（ｔｒｅａｔｉｎｇ））は、治療される対象における疾患の自然経過を変えるための臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の経過中に実施することができる。治療の望ましい効果には、限定するものではないが、疾患の発生又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度を遅らせること、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【0085】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【0086】
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
【0087】
「添付文書」という用語は、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【0088】
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供する。抗体は、例えば、有効性と安全性、薬物動態、及び生産性に関して、治療への応用に有利な他の特性と相まって、優れた安定性を示す。本発明の抗体は、例えば、がん又は自己免疫疾患などの疾患の治療に有用である。
本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供する。抗体は、例えば、有効性と安全性、薬物動態、及び生産性に関して、治療への応用に有利な他の特性と相まって、優れた安定性を示す。本発明の抗体は、例えば、がん又は自己免疫疾患などの疾患の治療に有用である。
【0089】
Ａ．抗ＣＤ３／ＰＬＡＰ抗体
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供する。一態様では、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する単離された抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに特異的に結合する抗体を提供する。特定の態様では、抗ＣＤ３抗ＰＬＡＰ抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性に対して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３に対する約９０％を超える結合活性を保持している。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供する。一態様では、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する単離された抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに特異的に結合する抗体を提供する。特定の態様では、抗ＣＤ３抗ＰＬＡＰ抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性に対して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３に対する約９０％を超える結合活性を保持している。
【0090】
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、ここで該抗体は、（ａ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
【0091】
一態様では、抗体はヒト化抗体である。一態様では、第１の抗原結合ドメインはヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
【0092】
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【0093】
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９の重鎖可変領域配列の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＣＤ３に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号９のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0094】
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３の軽鎖可変領域配列の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＣＤ３に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１３のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【0095】
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは配列番号９のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合ドメインのＶＬは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【0096】
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供し、ここで該抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
【0097】
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供し、ここで該抗体は、配列番号９のＶＨ配列と、配列番号１３のＶＬ配列とを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
【0098】
別の態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供し、ここで該抗体は、配列番号９のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１３のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
【0099】
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【0100】
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号９のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号９のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号９のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号９のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
【0101】
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１３のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１３のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１３のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１３のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
【0102】
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供し、ここで該抗体は、上で提供される態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列と、上で提供される態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列とを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
【0103】
一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む。一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号７０及び７１（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号７２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、抗体は、配列番号７０又は配列番号７１のアミノ酸配列、特に配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一態様では、抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載のＦｃドメインにアミノ酸変異を含み得る。
【0104】
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７０又は配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、特に配列番号７０のアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書で「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含んでもよく、且つ／又はクロスオーバーＦａｂ分子の場合、１つ又は複数（特に２つ）のＮ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでもよい。いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
【0105】
一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【0106】
一態様では、抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である。一態様では、抗体は、完全長抗体である。
【0107】
別の態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片であり、特にＦａｂ分子である。別の態様では、抗体断片は、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である。
【0108】
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。好ましい態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である（すなわち、第１の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子である）。
【0109】
さらなる態様では、上記態様のうちのいずれかによる抗体は、以下のセクションＩＩ．Ａ．１．～８．に記載される特徴のうちのいずれかを単独で、又は組み合わせて、組み込んでもよい。
【0110】
好ましい態様では、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、より具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットからなり、Ｆｃドメインバリアントに関連して本明細書の以下に記載される特徴のうちのいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい（セクションＩＩ．Ａ．８．）。
【0111】
本発明によれば、抗体は、ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む（すなわち、抗体は、本明細書の以下（セクションＩＩ．Ａ．７．）でさらに説明するように、多重特異性抗体である）。
【0112】
１．抗体断片
特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。
特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。
【0113】
一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２分子、特に本明細書に記載のＦａｂ分子である。「Ｆａｂ’分子」は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での残基の付加によってＦａｂ分子とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（１つ又は複数）が遊離チオール基を持つＦａｂ’分子である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ分子）とＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２分子が得られる。
【0114】
別の態様では、抗体断片は、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載がある。
【0115】
さらなる態様では、抗体断片は一本鎖Ｆａｂ分子である。「一本鎖Ｆａｂ分子」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーから成るポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向へ以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合によって安定化されている。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される可能性がある（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）。
【0116】
別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結することも、その逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照。
【0117】
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。
【0118】
抗体断片は、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質消化及び組換え宿主細胞（例えば大腸菌）による組換え産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
【0119】
２．ヒト化抗体
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、親となる非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意でヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、親となる非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意でヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
【0120】
ヒト化抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説されており、さらに、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植法を記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイド付き選択」手法を記載）で説明されている。
【0121】
ヒト化に使用できるヒトフレームワーク領域には、以下が含まれるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）参照。）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）参照；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）参照。）；及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）参照。）。
【0122】
３．グリコシル化バリアント
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
【0123】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合するオリゴ糖を改変してもよい。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、通常、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作成するために行われ得る。
【0124】
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。そのような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、天然抗体又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加した抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％又はさらには約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）。ただし、抗体のわずかな配列の変化により、Ａｓｎ２９７は、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち２９４位と３００位の間に位置することもある。Ｆｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
【0125】
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照）が挙げられる。
【0126】
さらなる態様では、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアント、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、抗体バリアントが提供される。そのような抗体バリアントは、上に記載されたように、フコシル化の減少及び／又はＡＤＣＣ機能の改善を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
【0127】
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、国際公開第１９９８／５８９６４号及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【0128】
４．システイン操作抗体バリアント
特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えばＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位にコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、米国特許第８，３０，９３０号、米国特許第７，８５５，２７５号、米国特許第９，０００，１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているように生成され得る。
特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えばＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位にコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、米国特許第８，３０，９３０号、米国特許第７，８５５，２７５号、米国特許第９，０００，１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているように生成され得る。
【0129】
５．抗体誘導体
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、限定するものではないが、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどの考慮事項に基づいて決定され得る。
特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、限定するものではないが、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどの考慮事項に基づいて決定され得る。
【0130】
６．イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はこれらの断片）又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療薬剤とコンジュゲートした本明細書における抗ＣＤ３／ＰＬＡＰ抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はこれらの断片）又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療薬剤とコンジュゲートした本明細書における抗ＣＤ３／ＰＬＡＰ抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
【0131】
一態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が上述の治療剤の１つ又は複数にコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、１つ又は複数の治療剤に連結される。治療剤及び治療薬及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概説は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
【0132】
別の態様では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質（ｄｉａｎｔｈｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むがこれらに限定されない酵素的に活性な毒素又はこれらの断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
【0133】
別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本発明の抗体を含む。放射性コンジュゲートの生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートは、検出用に使用される場合、シンチグラフィ検査のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えばＩ２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含み得る。
【0134】
抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６－ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を促進する「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【0135】
本明細書における免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販（例：米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から）されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明確に意図している。
【0136】
７．多重特異性抗体
本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質、又は同じタンパク質上の２つの異なるエピトープ）に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。本発明によれば、結合特異性のうちの１つはＣＤ３に対するものであり、もう１つはＰＬＡＰに対するものである。
本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質、又は同じタンパク質上の２つの異なるエピトープ）に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。本発明によれば、結合特異性のうちの１つはＣＤ３に対するものであり、もう１つはＰＬＡＰに対するものである。
【0137】
多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る。多重特異性抗体を作製するための手法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２種以上の抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているような三重特異性抗体の調製によっても作製され得る。
【0138】
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。多重特異性抗体又はその抗原結合断片はまた、ＣＤ３及び別の異なる抗原、又はＣＤ３の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
【0139】
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性を有する１つ又は複数の結合アームにドメイン交差を含む非対称形態（いわゆる「クロスマブ（“ＣｒｏｓｓＭａｂ”）」技術）で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号参照）又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１，及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０）も参照）を交換することによっても提供され得る。非対称Ｆａｂアームは、ドメイン界面に荷電又は非荷電アミノ酸変異を導入して正しいＦａｂ対合を誘導することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
【0140】
多重特異性抗体のさらなる様々な分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
【0141】
多特異性抗体の特定のタイプは、標的細胞、例えばがん細胞上の表面抗原と、標的細胞を死滅させるためにＴ細胞を再標的化するための、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変成分、例えばＣＤ３に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に、結合特異性の一方がＣＤ３に対するものであり、他方が標的細胞抗原としてのＰＬＡＰに対するものである二重特異性抗体である。
【0142】
この目的のために有用であり得る二重特異性抗体フォーマットの例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ））分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号及び同第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、安定化付加のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、並びに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に概説）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
【0143】
本発明の抗体の好ましい態様を以下に記載する。
【0144】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のように、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含み、ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する抗体を提供する。
【0145】
本発明の好ましい態様によれば、抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である（すなわち、それぞれが可変ドメイン及び定常ドメインを含む重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメインである）。一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び／又は、存在する場合、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。一態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトのものである。好ましい態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。さらに別の態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
【0146】
好ましくは、抗原結合ドメインの少なくとも１つはクロスオーバーＦａｂ分子である。そのような修飾は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を減少させ、それにより組換え産生における本発明の（多重特異性）抗体の収率及び純度を向上させる。本発明の（多重特異性）抗体に有用な好ましいクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬ、ＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換を用いても、（多重特異性）抗体の調製は、誤対合した重鎖と軽鎖の間のいわゆるベンス・ジョーンズ型相互作用により、ある種の副産物を含むことがある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照）。異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させることにより所望の（多特異性）抗体の純度及び収率を向上させるために、反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を、ＣＤ３に結合するＦａｂ分子、又はＰＬＡＰに結合するＦａｂ分子（１つ又は複数）のいずれかのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入することができる。これについては後述する。電荷修飾は、（多重特異性）抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（１つ又は複数）（例えば図１Ａ～Ｃ、Ｇ～Ｊに示すような）又は多重特異性抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（１つ又は複数）（例えば図１Ｄ～Ｆ、Ｋ～Ｎに示すような）のいずれかにおいて行われる（但し、両方で行われることはない）。好ましい態様では、電荷修飾は、（多重特異性）抗体（好ましい態様ではＰＬＡＰに結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子内で行われる。
【0147】
本発明による好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３及びＰＬＡＰに同時に結合することができる。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３とＰＬＡＰに同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらにより好ましい態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特にＰＬＡＰ発現標的細胞の溶解をもたらす。一態様では、そのような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一態様では、ＰＬＡＰへの同時結合を伴わない（多重特異性）抗体のＣＤ３への結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
【0148】
一態様では、（多重特異性）抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に再指向することができる。好ましい態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性とは無関係である。
【0149】
好ましくは、本発明の態様のいずれかによるＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0150】
ａ）第１の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様では、ＣＤ３はヒトＣＤ３（配列番号６３）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号６４）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。いくつかの態様では、ＣＤ３は、ＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
本発明の（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様では、ＣＤ３はヒトＣＤ３（配列番号６３）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号６４）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。いくつかの態様では、ＣＤ３は、ＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
【0151】
好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３への一価の結合を提供する。
【0152】
一態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
【0153】
好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。そのような態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。多重特異性抗体に含まれる、ＰＬＡＰに結合する１つより多い抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子が存在する態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0154】
代替的な態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。そのような態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメイン（１つ又は複数）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。（多重特異性）抗体に含まれる、ＣＤ３に結合する１つより多い抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子が存在する態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメインは、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0155】
好ましい態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である（すなわち、そのような態様によると、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。そのような態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
【0156】
一態様では、ＣＤ３に結合する１つを超えない抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体に存在する（すなわち、この抗体はＣＤ３に対する一価の結合を提供する）。
【0157】
ｂ）第２の（及び第３の）抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＰＬＡＰに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメイン）、特にＦａｂ分子を含む。第２の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位、例えばＰＬＡＰを発現する特定のタイプの腫瘍細胞に指向させることができる。
本発明の（多重特異性）抗体は、ＰＬＡＰに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメイン）、特にＦａｂ分子を含む。第２の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位、例えばＰＬＡＰを発現する特定のタイプの腫瘍細胞に指向させることができる。
【0158】
一態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
【0159】
特定の態様では、（多重特異性）抗体は、ＰＬＡＰに結合する２つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。好ましい態様では、これらの抗原結合ドメインは全て同一であり、すなわち、同じ分子フォーマット（例えば、従来の又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、且つ、（存在する場合）本明細書に記載されるＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＰＬＡＰに結合する２つを超えない抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。
【0160】
好ましい態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメイン（１つ又は複数）は、従来のＦａｂ分子である。そのような態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメイン（１つ又は複数）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。
【0161】
代替的な態様では、ＰＬＡＰに結合する抗原結合ドメイン（１つ又は複数）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。そのような態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメイン（１つ又は複数）は、従来のＦａｂ分子である。
【0162】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号７０及び７１（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号７２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、配列番号７０又は配列番号７１のアミノ酸配列、特に配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書で「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含んでもよく、且つ／又はクロスオーバーＦａｂ分子の場合、１つ又は複数（特に２つ）のＮ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでもよい。いくつかの態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
【0163】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0164】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、ヒト化抗体（由来）である。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
【0165】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【0166】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４７のうちの１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９８パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＰＬＡＰに結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列において、合計１から１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、又は配列番号４７のアミノ酸配列を、その配列の翻訳後修飾も含め、含む。
【0167】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９８パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＰＬＡＰに結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号５１のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
【0168】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列を含み、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
【0169】
さらなる態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７の配列を含むＶＨと、配列番号５１の配列を含むＶＬとを含む。
【0170】
さらなる態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨ配列と、配列番号５１のＶＬ配列とを含む。
【0171】
別の態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号５１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
【0172】
さらなる態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号５１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【0173】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、それぞれ、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、それぞれ、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、それぞれ、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するフレームワークとを含む。
【0174】
一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
【0175】
ｃ）電荷修飾
本発明の（多重特異性）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は、２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、複数）の結合アームにＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの多重特異性抗体の製造の際に生じ得る、軽鎖と一致しない重鎖との誤対合（ベンス・ジョーンズ型の副産物）を減らすのに特に有効なアミノ酸置換を含み得る（参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照されたい）。望ましくない副産物、特に、１つの結合アームにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型の副産物に対する望ましい（多重特異性）抗体の比率は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。
本発明の（多重特異性）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は、２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、複数）の結合アームにＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの多重特異性抗体の製造の際に生じ得る、軽鎖と一致しない重鎖との誤対合（ベンス・ジョーンズ型の副産物）を減らすのに特に有効なアミノ酸置換を含み得る（参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照されたい）。望ましくない副産物、特に、１つの結合アームにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型の副産物に対する望ましい（多重特異性）抗体の比率は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。
【0176】
したがって、（多重特異性）抗体の第１及び第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインがいずれもＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインのうちの１つ（特に第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられるいくつかの態様では、
ｉ）第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｉ）第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸若しくは２１３位のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0177】
（多重特異性）抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられていない（すなわち交換されていない）。
【0178】
より具体的な態様では、
ｉ）第２の（存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定数ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定数ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定数ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定数ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｉ）第２の（存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定数ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定数ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定数ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定数ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0179】
そのような態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0180】
さらなる態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0181】
好ましい態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0182】
より好ましい態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0183】
さらにより好ましい態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0184】
好ましい態様では、上記の態様によるアミノ酸置換が、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１に行われる場合、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
【0185】
代替的に、上記の態様によるアミノ酸置換は、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。好ましいそのような態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
【0186】
したがって、一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0187】
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0188】
さらに別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0189】
一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0190】
別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0191】
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、
（ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインであって、
第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインと、を含む。
（ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインであって、
第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（好ましい態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン、及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインと、を含む。
【0192】
ｄ）多重特異性抗体フォーマット
本発明による（多重特異性）抗体は、様々な構造を有することができる。例示的な構造を図１に示す。
本発明による（多重特異性）抗体は、様々な構造を有することができる。例示的な構造を図１に示す。
【0193】
好ましい態様では、（多重特異性）抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。そのような態様では、第１、第２、第３などの抗原結合ドメインは、本明細書ではそれぞれ第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ぶことができる。
【0194】
一態様では、（多重特異性）抗体の第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている。好ましい態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子である。そのような態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。別のそのような態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。（ｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている態様では、追加的に、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合され得る。
【0195】
第２の抗原、例えば、標的細胞抗原、例えばＰＬＡＰに特異的に結合することができる単一の抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ分子）を有する（多重特異性）抗体（例えば、図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示されている）は、高親和性抗原結合ドメインの結合後に第２の抗原の内部移行が予測される場合に有用である。そのような場合、第２の抗原に特異的な１つより多い抗原結合ドメインの存在は、第２の抗原の内部移行を促進し、それによってその利用可能性を低下させ得る。
【0196】
しかし他の場合には、例えば標的部位への標的化を最適化するため又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、第２の抗原、例えばＰＬＡＰなどの標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ分子など）を含む（多重特異性）抗体（例えば図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ，１Ｍ又は１Ｎに示されているものを参照されたい）を有することが有利であろう。
【0197】
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメインを含む。
【0198】
一態様では、第３の抗原結合ドメインは、ＰＬＡＰに結合する。一態様では、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
【0199】
一態様では、第３の抗原ドメインは第２の抗原結合ドメインと同一である。
【0200】
いくつかの態様では、第３及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと同一である。したがって、これらの態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（すなわち、従来型又はクロスオーバー）を有する。さらに、これらの態様では、第３の抗原結合ドメインは、もしあれば、第２の抗原結合ドメインと同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書において「電荷修飾」と記載されるアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインのそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。あるいは、前記アミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン（好ましい態様ではこれもＦａｂ分子である）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われ得るが、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
【0201】
第２の抗原結合ドメインと同様に、第３の抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。しかし、第２及び第３の抗原結合ドメインがクロスオーバーＦａｂ分子である（且つ第１の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である）態様も企図されている。ゆえに、好ましい態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。他の態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0202】
第３の抗原結合ドメインが存在する場合、好ましい態様では、第１の抗原結合ドメインはＣＤ３に結合し、第２及び第３の抗原結合ドメインは、ＰＬＡＰに結合する。
【0203】
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、安定した会合が可能である。
【0204】
本発明による（多重特異性）抗体は、異なる構造を有することができ、すなわち、第１の、第２の（及び任意選択的に第３の）抗原結合ドメインは、異なる方法で互いに、及びＦｃドメインに融合され得る。構成要素は、直接、又は好ましくは１つ若しくは複数の適切なペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
【0205】
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され得るか、又はＦｃドメインのもう一方のサブユニットのＮ末端に融合され得る。好ましいそのような態様では、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様では、第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0206】
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｇ及び１Ｋに模式的に示されている（これらの例における第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【0207】
別の態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合されている。具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ａ及び１Ｄに模式的に示されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。好ましい態様では、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。特定の態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【0208】
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され得るか、又は（上に記載したように）Ｆｃドメインのもう一方のサブユニットのＮ末端に融合され得る。好ましいそのような態様では、前記第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様では、前記第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0209】
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｈ及び１Ｌに模式的に示されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【0210】
いくつかの態様では、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。好ましいそのような態様では、前記第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様では、前記第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0211】
好ましいそのような態様では、第１及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子、第２のＦａｂ分子、及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｂ及び１Ｅ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）並びに図１Ｊ及び１Ｎ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。好ましい態様では、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。特定の態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【0212】
別のそのような態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子、第２のＦａｂ分子、及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｃ及び１Ｆ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）並びに図１Ｉ及び１Ｍ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。好ましい態様では、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。特定の態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
【0213】
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインの各サブユニットのＮ末端に融合されている（多重特異性）抗体の構造では、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは本質的に免疫グロブリン分子を形成する。好ましい態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより好ましい態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さらに好ましい態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一態様では、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
【0214】
本発明の（多重特異性）抗体のいくつかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は互いに融合され、任意選択的にペプチドリンカーを介して融合されている。第１及び第２のＦａｂ分子の構造に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合され得るか、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合され得る。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、一致しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに減らし、また、本発明の（多重特異性）抗体のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を減少させる。
【0215】
抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ又は（Ｇ４Ｓ）ｎＧ５ペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長、一態様では５～１００個のアミノ酸長、さらなる態様では１０～５０個のアミノ酸長を有する。一態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン、且つ（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝１、２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２、３、４又は５）であり、一態様では、ｘ＝４且つｎ＝２、又は３であり、さらなる態様では、ｘ＝４、ｎ＝１、且つｍ＝５である。一態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。別の態様では、前記ペプチドリンカーはＧ４ＳＧ５である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を連結するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６６及び６７）を含む。別の適切な当該リンカーは、配列（Ｄ）－Ｇ４ＳＧ５（配列番号６８及び６９）を含む。特定の態様では、リンカーは配列番号６７の配列を含む。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特にＦａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合している場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合され得る。
【0216】
特定の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。特定の態様では、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。
【0217】
特定の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。特定の態様では、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。
【0218】
いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の態様では、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。これらの態様のいくつかにおいて、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第１のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。これらの態様の他の態様では、（多重特異性）抗体は、必要に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＬ（２）－ＣＬ（２））、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドがカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。特定の態様では、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。
【0219】
いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の態様では、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。これらの態様のいくつかにおいて、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する第１のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。その他のこれらの態様では、（多重特異性）抗体は、必要に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＬ（２））、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドがカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。特定の態様では、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって、共有結合的に連結している。
【0220】
特定の態様では、（多重特異性）抗体はＦｃドメインを含まない。好ましいそのような態様では、前記第２及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の、可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いに置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様では、前記第２及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインはそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
【0221】
そのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｏ及び１Ｓに模式的に示されている（これらの例では、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
【0222】
別のそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｐ及び１Ｔに模式的に示されている（これらの例では、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
【0223】
いくつかの態様では、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。特定のそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子、第２のＦａｂ分子、及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｑ及び１Ｕ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｘ及び１Ｚ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。
【0224】
いくつかの態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。特定のそのような態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子、第２のＦａｂ分子、及び第３のＦａｂ分子並びに場合により１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合されている。そのような構造は、図１Ｒ及び１Ｖ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｗ及び１Ｙ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。
【0225】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。
【0226】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。
【0227】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。
【0228】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。
【0229】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
【0230】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
【0231】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
【0232】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
【0233】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
【0234】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
【0235】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
【0236】
特定の態様では、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重可変領域と共有し、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが次に、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの態様では、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
【0237】
一態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0238】
好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0239】
好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0240】
本発明による（多重特異性）抗体の異なる構造の全てにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換（「電荷修飾」）は、存在する場合、第２及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン又は第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインのいずれかにおけるものであってもよい。好ましくは、これらは第２及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるものである。本発明の概念によると、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子においては行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子においては行われない。アミノ酸置換は、好ましくは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ１が互いによって置き換えらえているＦａｂ分子を含む（多重特異性）抗体において行われる。
【0241】
本発明による（多重特異性）抗体の好ましい態様では、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第２の（及び、存在する場合、第３の）Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による（多重特異性）抗体の他の態様では、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。いくつかの態様では、第２の（及び、存在する場合、第３の）抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ、並びに第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
【0242】
一態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0243】
好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１及びｂ）の第３の抗原結合ドメインにおいて、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１及びｂ）の第３の抗原結合ドメインにおいて、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0244】
別の態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0245】
上記の態様のいずれかによれば、（多重特異性）抗体の構成要素（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接又は様々なリンカー、特に、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で知られている、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合され得る。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ又は（Ｇ４Ｓ）ｎＧ５ペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１から１０、典型的には２から４の整数である。
【0246】
好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、（ｉ）配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、（ｉ）配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0247】
好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、該第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、該第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0248】
さらに好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、（ｉ）配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインがそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、（ｉ）配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３４のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号３７のＨＣＤＲ２、及び配列番号３８のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、配列番号４１のＨＣＤＲ２、及び配列番号４２のＨＣＤＲ３、又は（ｖ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、及び配列番号４６のＨＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに配列番号４８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号４９のＬＣＤＲ２、及び配列番号５０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0249】
さらに好ましい態様では、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、該第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、該第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＰＬＡＰに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、該第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３又は配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
【0250】
本発明のこれらの態様による一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基に置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基に置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基に置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基に置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0251】
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基に置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0252】
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）に置き換えられ、２３５位のロイシン残基がアラニン残基に置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基で置き換えられる（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0253】
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0254】
具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。
【0255】
一態様では、本発明は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
【0256】
別の特定の態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。
【0257】
一態様では、本発明は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
【0258】
特に具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。
【0259】
一態様では、本発明は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
【0260】
別の特定の態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。
【0261】
一態様では、本発明は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号５９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
【0262】
別の特定の態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む。
【0263】
一態様では、本発明は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）を含む、ＣＤ３及びＰＬＡＰに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
【0264】
８．Ｆｃドメインバリアント
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
【0265】
（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、１つ以下のＦｃドメインを含む。
【0266】
一態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。さらなる好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。より好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号６５に示されている。
【0267】
ａ）ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合させることができる異なる抗原結合ドメインを含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。このように、組換え産生における（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善するためには、（多重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
本発明による（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合させることができる異なる抗原結合ドメインを含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。このように、組換え産生における（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善するためには、（多重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【0268】
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間でタンパク質間相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。
【0269】
ヘテロ二量体化を強制するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインを修飾するためのいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分説明されている。典型的には、そのような全ての手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインとＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは両方とも相補的に設計され、それにより、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを構成する重鎖）は、それ自体でホモ二量体化できなくなるが、（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間にホモ二量体が形成されないように）相補的に操作された他のＣＨ３ドメインと強制的にヘテロ二量体化される。重鎖ヘテロ二量体化の改善のためのこれらの異なる手法は、（多重特異性）抗体における重鎖－軽鎖修飾（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨとＶＬの交換／置換や、ＣＨ１／ＣＬ境界面における反対の電荷を持つ荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた、重／軽鎖の誤対合やベンス・ジョーンズ型の副産物を減らす異なる選択肢として企図されたものである。
【0270】
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。
【0271】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般に、この方法は、突起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの界面に導入し、対応する空洞「ホール」）を第２のポリペプチドの界面に導入し、これによって、突起が空洞内に位置付けられ、それによりヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げることを伴う。突起は、最初のポリペプチドの界面にある小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えることによって構築される。突起に対して同一又は同様のサイズの代償空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。
【0272】
したがって、好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に収容可能な突起が第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を収容可能な空洞が第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成される。
【0273】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
【0274】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
【0275】
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作製することができる。
【0276】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0277】
またさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋が生成し、二量体をさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
【0278】
好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0279】
好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、（任意選択的に、ＰＬＡＰに結合する第２の抗原結合ドメイン及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの（「ノブ」修飾を含む）第１のサブユニットに融合されている。理論に縛られることを望むものではないが、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインをＦｃドメインのノブ含有サブユニットに融合させると、ＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成が（さらに）最小限に抑えられる（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。
【0280】
ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮されており、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９，国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
【0281】
一態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づいている。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、並びにＦｃドメインのＣＨ３ドメインのもう一方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。
【0282】
別の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0283】
別の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0284】
一態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（特にＬ３６８Ｅ）から選択されるアミノ酸変異をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0285】
一態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２にさらなるアミノ酸変異を含み、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択される。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）をさらに含む。
【0286】
一態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量体化手法が、例えば３６８及び４０９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに基づく番号付け）からなる群から選択される位置でのアミノ酸修飾を用いて代替的に使用される。
【0287】
一態様では、上述のノブ・イントゥ・ホール技術も使用する国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0288】
一態様では、（多重特異性）抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
【0289】
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの接触面における１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。そのような一態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より具体的にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７のアミノ酸置換を含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換をさらに含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換をさらに、又は代替的に含む（全ての番号付けはＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる）。
【0290】
さらなる態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化手法が代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0291】
さらに別の態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。
【0292】
一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0293】
ｂ）Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織血液分布比に寄与する長い血清半減期を含む、好ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、それは同時に、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（多重特異性）抗体の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、これは、（多重特異性）抗体のＴ細胞活性化特性及び長い半減期と組み合わせて、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰な活性化や重篤な副作用を生じさせる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性のために、（多重特異性）抗体の効力を低下させることさえある。
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織血液分布比に寄与する長い血清半減期を含む、好ましい薬物動態特性を付与する。しかしながら、それは同時に、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（多重特異性）抗体の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、これは、（多重特異性）抗体のＴ細胞活性化特性及び長い半減期と組み合わせて、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰な活性化や重篤な副作用を生じさせる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性のために、（多重特異性）抗体の効力を低下させることさえある。
【0294】
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。１つのそのような態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して５０％未満、特に２０％未満、さらに詳細には１０％未満、最も詳細には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して５０％未満、特に２０％未満、さらに詳細には１０％未満、最も詳細には５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。好ましい態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）の約７０％超、特に約８０％超、さらに詳細には約９０％超の、ＦｃＲｎに対する結合親和性を示す場合に達成される。
【0295】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能が非操作型Ｆｃドメインと比較して低下するように操作される。好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を低下させる。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１低下させる。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる、１つより多いアミノ酸変異が存在する態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又はさらには少なくとも５０分の１低下させ得る。一態様では、操作型Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体は、非操作型Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体と比較して２０％未満、特に１０％未満、さらに詳細には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈する。好ましい態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が低下する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性（具体的には、Ｃ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、非操作型のＦｃドメイン（又は前記非操作型のＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体）のＦｃＲｎ対する結合親和性の約７０％超を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の（多重特異性）抗体は、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。特定の態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低下、標的結合抗体との架橋の低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。一態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。一態様では、ＡＤＣＣの低下は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【0296】
一態様では、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのような態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位、Ｌ２３４位、及びＬ２３５位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸置換を含む。より好ましい態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（ＫａｂａｔＥＵインデックス番号付け）、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基で置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。
【0297】
そのような態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。
【0298】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を示す。したがって、いくつかの態様では、本発明の（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。別の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。好ましい態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号（参照により全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【0299】
好ましい態様では、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａと、Ｌ２３５Ａと、任意選択でＰ３２９Ｇとを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐと、Ｌ２３５Ｅと、任意選択でＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）とを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
【0300】
特定の態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は排除されている。そのような態様の１つでは、ＦｃドメインはＮ２９７位のアミノ酸変異、特にアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）に置き換えたアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0301】
本明細書上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を伴うＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体には、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸位置２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が含まれる。
【0302】
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。
【0303】
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。あるいはまた、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のＦｃ受容体に対する結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞など、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価することができる。
【0304】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法で測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいはまた、非放射性アッセイを使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、あるいは追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。
【0305】
いくつかの態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、具体的にはＣ１ｑに対する結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低下したエフェクター機能を有するように設計されているいくつかの態様では、前述のエフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイが、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体がＣ１ｑに結合でき、ゆえにＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行され得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。
【0306】
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で知られている方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
【0307】
Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。前記単離されたポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドであり得る。
本発明はさらに、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。前記単離されたポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドであり得る。
【0308】
本発明の（多重特異性）抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は共発現される複数の（例えば２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段により会合し、機能的抗体を形成することができる。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖を含む抗体の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの１つと、任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含む抗体の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含む抗体の部分からの別個のポリヌクレオチドによってコード化できる。共発現されると、Ｆｃドメインサブユニットは会合して、Ｆｃドメインを形成する。
【0309】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【0310】
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【0311】
Ｃ．組換え法
本発明の抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生の場合、例えば上述したように、抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る。一態様では、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。ここで使用される「コード領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中（例えば単一のベクター上）に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中（例えば別々の（異なる）ベクター上）に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊な要素又はモチーフが含まれる。作動可能な会合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の制御配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに関連付けられたプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子生成物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作動可能に会合」している。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合していると思われる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作動可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写調節領域が本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制調節域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の染色体組み込み要素等の他の特徴を含み得る。
本発明の抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生の場合、例えば上述したように、抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る。一態様では、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。ここで使用される「コード領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中（例えば単一のベクター上）に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中（例えば別々の（異なる）ベクター上）に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊な要素又はモチーフが含まれる。作動可能な会合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の制御配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに関連付けられたプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子生成物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作動可能に会合」している。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合していると思われる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作動可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写調節領域が本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制調節域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の染色体組み込み要素等の他の特徴を含み得る。
【0312】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と関連し得る。例えば、抗体の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸の上流に置かれていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生成することを承知している。特定の態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド、又はそれと作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する、その配列の機能的誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【0313】
後の精製を容易にするため又は抗体を標識するのに役立てるために使用可能な短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードする抗体（断片）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。
【0314】
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチド（すなわち単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターには、ポリヌクレオチド及びベクターのそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗体の複製及び発現補助に適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターで適宜トランスフェクション又は形質導入し、大量のベクター含有細胞を増殖させて大規模な発酵槽に播種し、臨床応用に十分な量の抗体を得ることができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの様々な真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌中で生成され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、昆虫細胞と組み合わせて使用し得、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用し得る。植物細胞培養物も、宿主として利用し得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に記載される２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３，２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載される）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ．２５５－２６８（２００３）を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞はヒト体内の細胞ではない。
【0315】
これら系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当技術分野で既知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれか一方を含むポリペプチドを発現する細胞を、もう一方の抗体鎖も発現するように操作して、発現産物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗体であるようにしてもよい。
【0316】
一態様では、本発明による抗体を製造する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択で、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から該抗体を回収することとを含む。
【0317】
本発明の（多重特異性）抗体の構成要素は、互いに遺伝的に融合することができる。（多重特異性）抗体は、その構成要素が互いに直接的に又はリンカー配列を介して間接的に融合されているように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。（多重特異性）抗体の異なる構成要素間のリンカー配列の例を本明細書で提供する。融合の個々の構成成分を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を必要に応じて含めることもできる。
【0318】
本明細書で記載するように調製される抗体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野で既知の技術によって精製され得る。特定のタンパク質を精製するのに使用される実際の条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性などの要因に依拠し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載されているように抗体を単離することができる。抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
【0319】
Ｄ．アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴づけすることができる。
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴づけすることができる。
【0320】
１．結合アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な器具類と、組換え発現によって得ることができる受容体又は標的タンパク質とを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。あるいはまた、異なる受容体又は標的抗原への抗体の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。ＣＤ３への結合活性を測定するための特定の例証的及び例示的な態様を以下に記載する。
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な器具類と、組換え発現によって得ることができる受容体又は標的タンパク質とを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。あるいはまた、異なる受容体又は標的抗原への抗体の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。ＣＤ３への結合活性を測定するための特定の例証的及び例示的な態様を以下に記載する。
【0321】
一態様では、ＣＤ３への結合活性は、以下のようにＳＰＲによって決定される：
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行される。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリング化学を使用して、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でシリーズ Ｓ センサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化されている。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を使用する。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）を５μｌ／分の流量で約６０秒間注入する。使用されるＣＤ３抗原は、ノブ・イントゥ・ホール修飾及びＣ末端Ａｖｉタグを有するヒトＦｃドメインに融合されたＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンエクトドメインのヘテロ二量体である（配列番号２４及び２５を参照）。ＣＤ３抗原を１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入し、解離を５μｌ／分の流量で約１２０秒間モニターする。チップ表面は、１０ｍＭグリシン ｐＨ２．１をそれぞれ約６０秒間２回連続して注入することによって再生される。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正される。評価のために、注入終了から５秒後に結合応答が取得される。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を抗Ｆａｂ応答（固定化抗Ｆａｂ抗体上のＣＤ３抗体の捕捉時に得られるシグナル（ＲＵ））で割る。異なる処理後の抗体のＣＤ３に対する結合活性に対する、ある処理後の抗体のＣＤ３に対する結合活性（相対活性濃度（ＲＡＣ）ともいう）は、ある処理後の抗体試料の結合活性を、別の処理後の対応する抗体試料の結合活性に参照することによって計算される。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行される。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリング化学を使用して、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でシリーズ Ｓ センサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化されている。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を使用する。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）を５μｌ／分の流量で約６０秒間注入する。使用されるＣＤ３抗原は、ノブ・イントゥ・ホール修飾及びＣ末端Ａｖｉタグを有するヒトＦｃドメインに融合されたＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンエクトドメインのヘテロ二量体である（配列番号２４及び２５を参照）。ＣＤ３抗原を１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入し、解離を５μｌ／分の流量で約１２０秒間モニターする。チップ表面は、１０ｍＭグリシン ｐＨ２．１をそれぞれ約６０秒間２回連続して注入することによって再生される。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正される。評価のために、注入終了から５秒後に結合応答が取得される。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を抗Ｆａｂ応答（固定化抗Ｆａｂ抗体上のＣＤ３抗体の捕捉時に得られるシグナル（ＲＵ））で割る。異なる処理後の抗体のＣＤ３に対する結合活性に対する、ある処理後の抗体のＣＤ３に対する結合活性（相対活性濃度（ＲＡＣ）ともいう）は、ある処理後の抗体試料の結合活性を、別の処理後の対応する抗体試料の結合活性に参照することによって計算される。
【0322】
２．活性アッセイ
本発明の（多重特異性）抗体の生物学的活性は、実施例に記載されている様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、がん細胞などの標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれ得る。
本発明の（多重特異性）抗体の生物学的活性は、実施例に記載されている様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、がん細胞などの標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれ得る。
【0323】
Ｅ．組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗体のいずれかを含む医薬組成物、例えば、下記の治療方法のいずれかに使用するための医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、例えば以下に記載するような、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗体のいずれかを含む医薬組成物、例えば、下記の治療方法のいずれかに使用するための医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、例えば以下に記載するような、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【0324】
さらに、本発明の抗体をｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態で産生する方法が提供され、該方法は、（ａ）本発明による抗体を得ること、及び（ｂ）抗体を少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに製剤化することを含み、これにより、抗体の調製物がｉｎ ｖｉｖｏ投与用に製剤化される。
【0325】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散された有効量の抗体を含む。「薬学的に許容される」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。抗体及び任意選択的に追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に示されているように、本開示に照らして当業者には公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与について、製剤は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって要求される無菌状態、発熱性、一般的な安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されよう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、香味剤、染料など、当業者には知られているような材料及びそれらの組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，１２８９－１３２９頁を参照）。従来の担体が有効成分と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【0326】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。
【0327】
非経口組成物には、注射による投与、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗体は、水溶液、特にハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合するバッファー中で製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有していてもよい。あるいはまた、抗体は、使用前に、適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分とともに、適切な溶媒中に必要な量の本発明の抗体を組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの混入は、最小限安全なレベル、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保たれるべきであることが理解されよう。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなど）；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類その他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例：Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁液は、好適な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
【0328】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示される。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の態様では、注射可能な組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えばアルミニウムモノステアレート、ゼラチン又はこれらの組み合わせ）の組成物における使用によってもたらすことができる。
【0329】
前述の組成物に加えて、抗体はデポー製剤として製剤化することもできる。そのような徐放性調製物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、抗体は、適切なポリマー材料又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化され得る。
【0330】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥工程により製造することができる。医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、添加物又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の方法で製剤化することができる。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。
【0331】
抗体は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は有機酸で形成されるもの、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、又はマンデル酸等の有機酸が含まれる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
【0332】
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗体のいずれも、治療方法において使用することができる。本発明の抗体は、例えばがん又は自己免疫疾患の治療における免疫療法剤として使用することができる。
本明細書で提供される抗体のいずれも、治療方法において使用することができる。本発明の抗体は、例えばがん又は自己免疫疾患の治療における免疫療法剤として使用することができる。
【0333】
治療法で使用するために、本発明の抗体は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に知られている他の因子が含まれる。
【0334】
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための本発明の抗体が提供される。特定の態様では、治療法における使用のための本発明の抗体が提供される。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、個体に有効量の抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための抗体を提供する。特定の態様では、疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがん、特にＰＬＡＰ発現がんである。特定の態様では、がんは卵巣のがん、肺のがん、又は消化管のがん（例えば胃、結腸、膵臓、又は食道のがん）である。さらに特定の態様では、がんは、卵巣がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん及び食道がんからなる群から選択されるがんである。特定の態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤、又は治療される疾患が自己免疫疾患の場合は免疫抑制剤）の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特にがん細胞の溶解を誘導する際に使用するための本発明の抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に有効量の抗体を投与することを含む、個体において、標的細胞、特にがん細胞の溶解を誘導する方法における使用のための本発明の抗体を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【0335】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の態様では、疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがん、特にＰＬＡＰ発現がんである。特定の態様では、がんは卵巣のがん、肺のがん、又は消化管のがん（例えば胃、結腸、膵臓、又は食道のがん）である。さらに特定の態様では、がんは、卵巣がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん及び食道がんからなる群から選択されるがんである。一態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤、又は治療される疾患が自己免疫疾患の場合は免疫抑制剤）の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、医薬は、標的細胞、特にがん細胞の溶解を誘導するためのものである。なおさらなる態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に有効量の医薬を投与することを含む、個体において、標的細胞、特にがん細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【0336】
さらなる態様では、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本方法は、そのような疾患を有する個体に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、本発明の抗体を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。特定の態様では、疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがん、特にＰＬＡＰ発現がんである。特定の態様では、がんは卵巣のがん、肺のがん、又は消化管のがん（例えば胃、結腸、膵臓、又は食道のがん）である。さらに特定の態様では、がんは、卵巣がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん及び食道がんからなる群から選択されるがんである。特定の態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤、又は治療される疾患が自己免疫疾患の場合は免疫抑制剤）の有効量を個体に投与することをさらに含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【0337】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特にＰＬＡＰ発現細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で標的細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。さらなる態様では、個体において標的細胞、特にＰＬＡＰ発現細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。そのような一態様では、本方法は、標的細胞の溶解を誘導するために有効量の本発明の抗体を個体に投与することを含む。一態様では、「個体」はヒトである。
【0338】
当業者であれば、多くの場合、抗体は治癒をもたらすものではなく、部分的な利益しかもたらさない可能性があることを容易に認識できる。いくつかの態様では、何らかの利益をもたらす生理学的変化も、治療上有益であると考えられる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化をもたらす抗体の量は「有効量」とみなされる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【0339】
いくつかの態様では、本発明の抗体の有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
【0340】
疾患の予防又は治療の場合、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で又は１種以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び抗体に対する反応、並びに主治医の裁量に依存するであろう。投与を担当する医師は、いずれにせよ、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象に対する適切な用量を決定するであろう。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが企図される。
【0341】
抗体は、患者に一度に又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の個別投与によるか、持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ－１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が上記患者への投与のための初期候補用量となり得る。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投薬量は、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量は、１回の投与につき、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上、及びその中で導出可能な任意の範囲も含む。本明細書に列挙される数字から導き出される範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重～約５００ミリグラム／ｋｇ体重などの範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を患者に投与することができる。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初のより高い負荷用量、続いて１回又は複数回のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投薬レジメンが有用な場合もある。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【0342】
本発明の抗体は、通常、意図した目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するために使用するために、本発明の抗体又はその医薬組成物は、有効量で投与又は適用される。
【0343】
全身投与の場合、有効用量は、細胞培養アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。次いで、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて用量を策定してもよい。そのような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
【0344】
また、初期投薬量を、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当技術分野で周知の技術を使用して概算することができる。
【0345】
投薬量及び投与間隔は、治療効果を維持するのに十分な本抗体の血漿濃度が得られるように個別に調節することができる。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
【0346】
本発明の抗体の有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療上の利益を提供する。抗体の毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物で、標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す抗体が好ましい。一態様では、本発明による抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した投薬量の範囲を製剤化するために使用できる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、種々の要因、例えば、用いられる剤形、利用される投与経路、対象の状態等に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点から個々の医師により選択され得る（例えば、その全体が参考により本明細書に援用される、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１のＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５を参照されたい）。
【0347】
本発明の抗体で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などのために投与を終了、中断又は調整する方法と時期を知っているであろう。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合、治療をより高いレベルに調整することも知っている（毒性を除いて）。対象となる障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度、及び投与経路等によって変わる。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価することができる。さらに、用量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変化するであろう。
【0348】
本発明の抗体は、治療において、１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。「治療剤」という用語は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の疾患に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する活性成分を含み得る。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。他の態様では、追加の治療剤は免疫抑制剤である。特定の態様では、追加の治療剤は、コルチコステロイド、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、メトトレキセート、アザチオプリン、シクロホスファミド、カルシニューリン阻害剤、ベリムマブ、リツキシマブ及びオビヌツズマブの群から選択される１つ又は複数である。
【0349】
そのような他の薬剤は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。抗体は、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投薬量の約１～９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【0350】
上記のそのような併用療法には、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれる）及び個別の投与が含まれ、この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行うことができる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【0351】
Ｇ．製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物をそれ自体で、又は状態を治療し、予防し、且つ／若しくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えていてもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物をそれ自体で、又は状態を治療し、予防し、且つ／若しくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えていてもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
【0352】
Ｈ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の態様では、本明細書において提供される抗体のいずれもが、生物学的試料中の、その標的（例えばＣＤ３又はＰＬＡＰ）の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される場合、「検出する」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の態様では、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
特定の態様では、本明細書において提供される抗体のいずれもが、生物学的試料中の、その標的（例えばＣＤ３又はＰＬＡＰ）の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される場合、「検出する」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の態様では、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
【0353】
一態様では、診断又は検出の方法における使用のための、本発明による抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＣＤ３及びＰＬＡＰの存在を検出する方法が提供される。特定の態様では、本方法は、本発明の抗体のＣＤ３又はＰＬＡＰへの結合を許容する条件下で、生物学的試料を本発明の抗体と接触させることと、該抗体とＣＤ３又はＰＬＡＰとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することとを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。一態様では、本発明の抗体は、ＣＤ３又はＰＬＡＰに結合する抗体を用いた治療に適格な対象を選択するために使用され、例えば、ＣＤ３又はＰＬＡＰは、患者の選択のためのバイオマーカーとなる。
【0354】
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、がん、特にＰＬＡＰ発現がんが含まれる。
【0355】
特定の態様では、抗体が標識されている、本発明による抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分（蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、放射性標識など）、並びに、例えば酵素反応や分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼやキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼを、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカルなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素と結合したものなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0356】
ＩＩＩ．配列
【実施例】
【0357】
ＩＶ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明が与えられると、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明が与えられると、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
【0358】
実施例１ － 最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の調製
最適化された抗ＣＤ３抗体「Ｐ０３５．０９３」は、既述の（例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３１７１２号参照）ＣＤ３バインダー（ここでは「ＣＤ３ｏｒｉｇ」ともいう）から得られたライブラリーを用いたファージディスプレイ選択操作（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃａｍｐａｉｇｎ）により生成したものであり、それぞれ配列番号７、１３のＶＨとＶＬを含む。これらのライブラリーでは、重鎖のＣＤＲ３領域にある位置Ｎ９７とＮ１００（Ｋａｂａｔ番号付け）は、サイレンシングされたか又は除去された。図２Ａに示すように、例示的な標的細胞抗原結合部分（配列番号１４及び１５）として抗ＴＹＲＰ１抗体を使用して、Ｐ０３５．０９３をＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）フォーマットに変換した。ＣＤ３バインダーとしてＣＤ３ｏｒｉｇ又はさらに以前に記載されたＣＤ３バインダー（「ＣＤ３ｏｐｔ」、例えば国際公開第２０２０／１２７６１９号を参照）を含む対応する分子も調製した。
最適化された抗ＣＤ３抗体「Ｐ０３５．０９３」は、既述の（例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３１７１２号参照）ＣＤ３バインダー（ここでは「ＣＤ３ｏｒｉｇ」ともいう）から得られたライブラリーを用いたファージディスプレイ選択操作（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃａｍｐａｉｇｎ）により生成したものであり、それぞれ配列番号７、１３のＶＨとＶＬを含む。これらのライブラリーでは、重鎖のＣＤＲ３領域にある位置Ｎ９７とＮ１００（Ｋａｂａｔ番号付け）は、サイレンシングされたか又は除去された。図２Ａに示すように、例示的な標的細胞抗原結合部分（配列番号１４及び１５）として抗ＴＹＲＰ１抗体を使用して、Ｐ０３５．０９３をＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）フォーマットに変換した。ＣＤ３バインダーとしてＣＤ３ｏｒｉｇ又はさらに以前に記載されたＣＤ３バインダー（「ＣＤ３ｏｐｔ」、例えば国際公開第２０２０／１２７６１９号を参照）を含む対応する分子も調製した。
【0359】
図２Ｂ～Ｅに示すように、重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0360】
試験された抗ＣＤ３抗体の配列は、表１に示す配列番号に示されている。
【0361】
表１．本実施例で使用した最適化抗ＣＤ３抗体（Ｐ０３５．０９３）及び比較抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３ｏｒｉｇ、ＣＤ３ｏｐｔ）の配列。
【0362】
軽鎖の対応する重鎖との正確な対合をさらに改善するために、ＴＹＲＰ１結合Ｆａｂ分子のヒトＣＬ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）及びヒトＣＨ１（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）に変異が導入された。
【0363】
重鎖の正確な対合（ヘテロ二量体分子の形成）のために、各抗体重鎖の定常領域にノブ・イントゥ・ホール変異を導入した（それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ）。
【0364】
さらに、抗体重鎖の定常領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を導入し、Ｆｃγ受容体との結合を無効にした。
【0365】
調製したＴＣＢ分子の完全な配列は、配列番号１６、１９、２０及び２１（Ｐ０３５．０９３）、配列番号１８、１９、２０及び２１（ＣＤ３ｏｐｔ）、配列番号１７、１９、２０及び２１（ＣＤ３ｏｒｉｇ）に示される。
【0366】
ＴＣＢは、Ｅｖｉｔｒｉａ社（スイス）により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。製造のために、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を使用した。これらの細胞は、１：１：２：１（「ベクターノブ重鎖」：「ベクターホール重鎖」：「ベクターＴＹＲＰ－１軽鎖」：「ベクターＣＤ３軽鎖」）の対応する発現ベクターでトランスフェクトされた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により、上清を回収した。
【0367】
Ｅｖｉｔｒｉａ社での調製に代わるものとして、ＴＣＢ分子を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションにより、自家で調製した。細胞を遠心分離し、予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃１０７４３０２９）により培地を置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃２３９６６－１）を加え、その溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、補充物（総容積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を付加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充物（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を加えた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により、７日後に細胞上清を回収した。
【0368】
タンパク質は、標準的な方法によって、回収した上清から精製した。簡単に説明すると、Ｆｃ含有タンパク質を、濾過した細胞培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（平衡化バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を、遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５、＃ＵＦＣ９０３０９６）によって濃縮し、凝集タンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーによって単量体タンパク質から分離した。
【0369】
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含量の測定は、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）をランニングバッファーで平衡化して（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド、ｐＨ６．７又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．２）使用して、２５℃でのＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行われた。
【0370】
調製したＴＣＢ分子の生化学的及び生物物理学的解析の結果を表２に示す。
【0371】
全てのＴＣＢ分子を良好な品質で生産することができた。
【0372】
表２．ＴＣＢフォーマットの抗ＣＤ３抗体の生化学的及び生物物理学的解析。
【0373】
実施例２ － 最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の熱安定性の測定
実施例１で調製した抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）の熱安定性を、Ｏｐｔｉｍ２装置（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社、英国）を使用して、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、及び温度傾斜を適用することによる温度依存性固有タンパク質蛍光のモニタリングにより、モニターした。
実施例１で調製した抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）の熱安定性を、Ｏｐｔｉｍ２装置（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社、英国）を使用して、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、及び温度傾斜を適用することによる温度依存性固有タンパク質蛍光のモニタリングにより、モニターした。
【0374】
タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの１０μｇの濾過したタンパク質試料をＯｐｔｉｍ２に２回かけた。温度を０．１℃／分で２５℃から８５℃まで上昇させ、３５０ｎｍ／３３０ｎｍでの蛍光強度と２６６ｎｍでの散乱強度の比を収集した。
【0375】
結果を表３に示す。実施例１で製造された最適化されたＣＤ３バインダーの凝集温度（Ｔａｇｇ）及び観察された温度誘導アンフォールディング転移の中点（Ｔｍ）は、既述のＣＤ３バインダーＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔよりも高い。
【0376】
表３．動的光散乱及び温度依存性固有タンパク質蛍光の変化により測定した、ＴＣＢフォーマットの抗ＣＤ３抗体の熱安定性。
【0377】
実施例３ － 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の機能特性評価
全ての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。
全ての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。
【0378】
親和性測定では、抗Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）に特異的に結合する抗体；「抗ＰＧ抗体」－参照により本明細書に援用される国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照）を固定化したＣ１センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面で、ＴＣＢ分子を捕捉した。実験設定を図３に模式的に示す。捕捉ＩｇＧを、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、約４００レゾナンスユニット（ＲＵ）の直接固定化によりセンサーチップ表面にカップリングした。
【0379】
ＣＤ３との相互作用を分析するために、ＴＣＢ分子を８０秒間、２５ｎＭで、１０μｌ／分の流量で捕捉した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３εストーク－Ｆｃ（ノブ）－Ａｖｉ／ＣＤ３δストーク－Ｆｃ（ホール）（ＣＤ３ε／δ、配列番号２４及び２５（ヒト）並びに配列番号２６及び２７（カニクイザル）参照）を０．１２２～１２５ｎＭの濃度で、３０μｌ／分の流量で、３００秒間フローセルを通過させた。解離は８００秒間モニターされた。
【0380】
バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。ここでは、抗原を、ＴＣＢ分子の代わりにＨＢＳ－ＥＰが注入された表面であって抗ＰＧ抗体が固定化された表面上を飛行させた。
【0381】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて反応速度定数を導出し、数値積分によって反応速度式を１：１ラングミュア結合に当てはめた。相互作用の半減期（ｔ１／２）を、式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを用いて計算した。
【0382】
表４には、既述のバインダーであるＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔと比較した、最適化された抗ＣＤ３抗体の結合の全ての反応速度パラメーターが列挙されている。最適化された抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３（ＴＣＢフォーマット）は、高いｐＭ範囲のＫＤ値でＣＤ３ε／δに結合し、ここでＫＤ値はヒトＣＤ３ε／δで４１０ｐＭ、カニクイザルＣＤ３ε／δで２１０ｐＭである。ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔと比較して、最適化抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε／δへの結合の親和性は、ＳＰＲによって同一条件下で測定した場合、最大１０倍まで増加する。
【0383】
ヒトＣＤ３α／δへの一価結合の半減期は、抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３の場合７．５５分で、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔの結合半減期よりも最大４倍長い。
【0384】
表４．抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）のヒトＣＤ３ε／δ及びカニクイザルＣＤ３ε／δに対する親和性
【0385】
実施例４ － ストレス後の最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による特性評価
脱アミド化部位の除去とその抗体の安定性への影響を評価するため、抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）を３７℃、ｐＨ７．４及び４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュべートし、さらにそれらのヒトＣＤ３ε／δへの結合能をＳＰＲで分析した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を基準として使用した。参照試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析して戻した。
脱アミド化部位の除去とその抗体の安定性への影響を評価するため、抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）を３７℃、ｐＨ７．４及び４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュべートし、さらにそれらのヒトＣＤ３ε／δへの結合能をＳＰＲで分析した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を基準として使用した。参照試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析して戻した。
【0386】
全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）をランニング及び希釈バッファーとして用いて実施された。ビオチン化ヒトＣＤ３ε／δ（実施例３、配列番号２４及び２５参照）及びビオチン化抗ｈｕＩｇＧ（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃７１０３２６２１００）を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２９１０４９９２）上に固定化し、少なくとも１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の表面密度を得た。濃度２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を５μｌ／分の流量で３０秒間注入し、解離を１２０秒間モニターした。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を６０秒間注入することによって表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を減算し、ブランク対照フローセルから得られた応答を減算することによって補正した。評価のために、注入終了５秒後の結合応答を取得した。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を、抗ｈｕＩｇＧ応答（固定化された抗ｈｕＩｇＧ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉時に得られるシグナル（ＲＵ））で割った。相対結合活性は、各温度ストレスをかけた試料と、それに対応するストレスをかけていない試料を参照することにより算出した。
【0387】
表５に示すように、実施例１で調製した抗ＣＤ３抗体（及びＣＤ３ｏｐｔ）は、ＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、ストレス時のＣＤ３α／δへの結合の改善を示している。
【0388】
表５．ｐＨ６／４０℃又はｐＨ７．４／３７℃で２週間インキュベートした後の抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢフォーマット）のヒトＣＤ３ε／δに対する結合活性。
【0389】
実施例５ － 最適化抗ＣＤ３（多重特異性）抗体による原発性黒色腫細胞の腫瘍細胞死滅
（ＴＹＲＰ１標的）ＴＣＢフォーマットの最適化抗ＣＤ３抗体を、ヒト黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３（チューリッヒ大学の皮膚科細胞バンクから入手した原発性黒色腫細胞株）と共インキュベートした新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣを用いて、腫瘍細胞死滅アッセイで試験した。腫瘍細胞の溶解を、２４時間後と４８時間後にアポトーシス細胞又はネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化により決定した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化は、４８時間後の両方の細胞サブセットでのＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御によって分析された。
（ＴＹＲＰ１標的）ＴＣＢフォーマットの最適化抗ＣＤ３抗体を、ヒト黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３（チューリッヒ大学の皮膚科細胞バンクから入手した原発性黒色腫細胞株）と共インキュベートした新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣを用いて、腫瘍細胞死滅アッセイで試験した。腫瘍細胞の溶解を、２４時間後と４８時間後にアポトーシス細胞又はネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化により決定した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化は、４８時間後の両方の細胞サブセットでのＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御によって分析された。
【0390】
簡単に言えば、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して３００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた新鮮な血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）に積層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣを含む中間層（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）より上の血漿を捨て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、続いて５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。結果として得られたＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ＃Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に３７℃、５％ＣＯ２で、さらなる使用まで細胞インキュベーター内に保存した（２４時間以内）。死滅アッセイのために、抗体を指示された濃度で三重に添加した。ＰＢＭＣを、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１０：１で標的細胞に添加した。標的細胞死滅は、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間のインキュベーション後、アポトーシス／壊死細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨを定量することによって評価した（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１６４４７９３００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、標的細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とインキュベートすることで達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物を含まずにエフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【0391】
ＴＣＢによって媒介される標的細胞のＴ細胞死滅によるＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価された。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（＃３００５１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（＃３４４７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（＃３０２６３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＣＤ６９ ＰＥ（＃３１０９０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の表面染色は、供給者の表示に従って行った。細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定バッファー（ＢＤ ＃５５４６５５）を使用して４℃で１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。試料はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析された。
【0392】
抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３を含むＴＣＢで処理すると、親バインダーＣＤ３ｏｒｉｇ又はバインダーＣＤ３ｏｐｔを含むＴＣＢと比較して、最も高い腫瘍細胞死滅とＴ細胞活性化をもたらした（図４）。
【0393】
実施例６ － 一価ＩｇＧフォーマットの最適化抗ＣＤ３抗体の調製
最適化された抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３及び抗体ＣＤ３ｏｒｉｇを、図５Ａに示すように、ＣＤ３結合部分に交差ＶＨ及びＶＬドメインを有する一価ヒトＩｇＧ１フォーマットに変換した。
最適化された抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３及び抗体ＣＤ３ｏｒｉｇを、図５Ａに示すように、ＣＤ３結合部分に交差ＶＨ及びＶＬドメインを有する一価ヒトＩｇＧ１フォーマットに変換した。
【0394】
図５Ｂ～Ｄに示すように、重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0395】
重鎖の正確な対合（ヘテロ二量体分子の形成）のために、各抗体重鎖の定常領域にノブ・イントゥ・ホール変異を導入した（それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ）。
【0396】
さらに、抗体重鎖の定常領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を導入し、Ｆｃγ受容体との結合を無効にした。
【0397】
調製した一価ＩｇＧ分子の完全な配列は、配列番号１６、２２及び２３（Ｐ０３５．０９３）、配列番号１７、２２及び２３（ＣＤ３ｏｒｉｇ）、配列番号１８、２２及び２３（ＣＤ３ｏｐｔ）に示されている。
【0398】
一価ＩｇＧ分子は、Ｅｖｉｔｒｉａ社（スイス）で調製され、実施例１のＴＣＢ分子について記載したように精製され、分析された。これらの細胞のトランスフェクションのために、対応する発現ベクターを１：１：１の比率（「ベクターノブ重鎖」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖」）で用いた。
【0399】
調製した一価ＩｇＧ分子の生化学的及び生物物理学的解析の結果を表６に示す。
【0400】
一価ＩｇＧ分子を両方とも良好な品質で生産することができた。
【0401】
表６．一価ＩｇＧフォーマットの抗ＣＤ３抗体の生化学的及び生物物理学的解析
【0402】
実施例７ － 最適化抗ＣＤ３抗体の熱安定性の測定
（実施例６で調製した）一価ＩｇＧフォーマットの抗ＣＤ３抗体の熱安定性を、実施例２に記載されるように、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、及び温度依存性固有タンパク質蛍光のモニタリングにより、モニターした。
（実施例６で調製した）一価ＩｇＧフォーマットの抗ＣＤ３抗体の熱安定性を、実施例２に記載されるように、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、及び温度依存性固有タンパク質蛍光のモニタリングにより、モニターした。
【0403】
結果を表７に示す。一価ＩｇＧフォーマットの最適化ＣＤ３バインダーの凝集温度（Ｔａｇｇ）と観察された温度誘導アンフォールディング転移の中点（Ｔｍ）は、既述のＣＤ３バインダーＣＤ３ｏｒｉｇよりも高い。
【0404】
表７．動的光散乱及び温度依存性固有タンパク質蛍光の変化により測定した、一価ＩｇＧフォーマットの抗ＣＤ３抗体の熱安定性。
【0405】
実施例８ － 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による最適化抗ＣＤ３抗体の機能特性評価
ＳＰＲ実験は、実施例６で調製した一価ＩｇＧ分子を用いて、実施例３に記載のとおりに実施された。
ＳＰＲ実験は、実施例６で調製した一価ＩｇＧ分子を用いて、実施例３に記載のとおりに実施された。
【0406】
ＣＤ３との相互作用を分析するために、一価ＩｇＧ分子を２４０秒間、５０ｎＭで、５μｌ／分の流量で捕捉した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３εストーク－Ｆｃ（ノブ）－Ａｖｉ／ＣＤ３δストーク－Ｆｃ（ホール）を０．０６１～２５０ｎＭの濃度で、３０μｌ／分の流量で、３００秒間フローセルを通過させた。解離は８００秒間モニターされた。
【0407】
表８には、前述のバインダーＣＤ３ｏｒｉｇと比較した、最適化された抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３の結合の全ての反応速度パラメーターが列挙されている。最適化された抗ＣＤ３抗体（一価ＩｇＧフォーマット）は、高いｐＭ範囲のＫＤ値でＣＤ３ε／δに結合し、ここでＫＤ値はヒトＣＤ３ε／δで４５０ｐＭ、カニクイザルＣＤ３ε／δで２２０ｐＭである。ＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、最適化抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε／δへの結合の親和性は、ＳＰＲによって同一条件下で測定した場合、最大１０倍増加する。
【0408】
ヒトＣＤ３ε／δに対する一価結合の半減期は、抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３３．０７８の場合８．６９分で、ＣＤ３ｏｒｉｇの結合半減期の２倍以上長い。
【0409】
表８．抗ＣＤ３抗体（一価ＩｇＧフォーマット）のヒトＣＤ３ε／δ及びカニクイザルＣＤ３ε／δに対する親和性３回の測定から得られたデータ。
【0410】
実施例９ － ストレス後の最適化抗ＣＤ３抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による特性評価
この実験は、実施例６で調製した一価ＩｇＧ分子を用いて、実施例４に記載のとおりに実施された。
この実験は、実施例６で調製した一価ＩｇＧ分子を用いて、実施例４に記載のとおりに実施された。
【0411】
表９に示すように、最適化された抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、ストレスによるＣＤ３α／δへの結合の改善を示している。
【0412】
表９．ｐＨ６／４０℃又はｐＨ７．４／３７℃で２週間インキュベートした後の（一価ＩｇＧフォーマットの）抗ＣＤ３抗体のヒトＣＤ３ε／δに対する結合活性。
【0413】
実施例１０ － 抗ＰＬＡＰ Ｔ細胞二重特異性抗体（ＰＬＡＰ ＴＣＢ）として最適化された抗ＣＤ３抗体の調製
抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３を、標的細胞抗原結合部分として５つの異なる抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ１～Ｈ５（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより提供）を使用し（配列番号２８～３１、４８～５１（Ｈ１）、配列番号３２～３５、４８～５１（Ｈ２）、配列番号３６～３９、４８～５１（Ｈ３）、配列番号４０～４３、配列番号４８～５１（Ｈ４）、配列番号４４～５１（Ｈ５））、実施例１に記載され、図２Ａに示されているフォーマットで、さらなるＴＣＢに変換した。
抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３を、標的細胞抗原結合部分として５つの異なる抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ１～Ｈ５（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより提供）を使用し（配列番号２８～３１、４８～５１（Ｈ１）、配列番号３２～３５、４８～５１（Ｈ２）、配列番号３６～３９、４８～５１（Ｈ３）、配列番号４０～４３、配列番号４８～５１（Ｈ４）、配列番号４４～５１（Ｈ５））、実施例１に記載され、図２Ａに示されているフォーマットで、さらなるＴＣＢに変換した。
【0414】
調製されたＴＣＢ分子の完全な配列は、配列番号１６、５２、５３及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ１ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）、配列番号１６、５４、５５及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ２ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）、配列番号１６、５２、５３及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ１ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）、配列番号１６、５６、５７及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ３ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）、配列番号１６、５８、５９及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ４ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）、並びに配列番号１６、６０、６１及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ５ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）に示されている。
【0415】
ＴＣＢは、ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。細胞を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）カタログ番号Ａ１４３５１０１）で細胞密度２．５ｘ１０６細胞／ｍｌまで増殖させ、生命力は＞９５％であった。
【0416】
発現ベクター（ＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１ｍｇ ＤＮＡ／１Ｌ細胞培養物）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）カタログ番号３１９８５０７０、５０ｍＬ／１Ｌ細胞培養物）中で混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）カタログ番号Ａ１４５２４、２．７ｍＬ／１Ｌ細胞培養物）を加え、溶液を室温で２０分間インキュベートした。細胞培養物をベクター／ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３溶液（１００ｍＬ／１Ｌ細胞培養物）と混合し、８％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で３７℃で７日間インキュベートした。トランスフェクションの１８～２３時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（商標）カタログ番号Ａ１４５２４、５ｍＬ／１Ｌ細胞培養物）及びエンハンサー２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）カタログ番号Ａ１４５２４、５０ｍＬ／１Ｌ細胞培養物）を加えた。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、以下に示す標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
【0417】
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に説明すると、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ａｔｏｌｌ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、平衡化バッファー：ＰＢＳ、ｐＨ７．４；溶出バッファー：１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を、遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５，Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によって濃縮し、凝集タンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中でサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体タンパク質から分離した。さらに、イオン交換クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ ＸＳ カラム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、平衡化バッファー：４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５；溶出バッファー：１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）による精製を、ＰＬＡＰ（Ｈ１）、ＰＬＡＰ（Ｈ２）及びＰＬＡＰ（Ｈ５）ＴＣＢを用いて行い、タンパク質を２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０にバッファー交換した。
【0418】
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４，１９９５，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含有量の決定は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ高分解能ＳＥＣカラム、２５０Å、５μｍ、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２で平衡化）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。
【0419】
表１０．ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の生化学的及び生物物理学的分析。
【0420】
実施例１１ － 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の疎水性決定
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）の疎水性は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して決定した。このために、試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。測定は、ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳ、１１μｌフローセル、オートサンプラー温度１０℃）において、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０μｍ、７．５ｘ７５ｍｍ）カラムを４０℃、移動相Ａ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５Ｍ ＮＨ４ＳＯ４、ｐＨ７）及び移動相Ｂ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）を使用し、流量０．８ｍｌ／分、勾配：溶離液Ｂ ０％／０～２分、１３％／３～５分、１００％／５７～６２分、０％／６３～６５分で実行された。試料量は１回の注入につき２０μｇ、試料量は１０μｌで、２１４ｎｍ、２２０ｎｍ、及び２８０ｎｍの吸光度を検出した。分子の相対的な保持時間を決定するため、保持時間の異なる２つの参照分子（ＲＥＦｌｏｗ及びＲＥＦｈｉｇｈ、２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６中に１ｍｇ／ｍｌ、２０μｇ量）の１：１比で構成されるＨＩＣ標準混合物を使用した。分子の相対保持時間（ＲＴ）は次のように定義される：
相対ＲＴ［分］＝（主ピーク試料ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）／（ＲＥＦｈｉｇｈ ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）
結果を表１１に示す。０．３５より小さい相対保持時間は、疎水性が許容される抗体様タンパク質の特徴である。したがって、ＰＬＡＰ Ｈ１ ＴＣＢ、ＰＬＡＰ Ｈ３ ＴＣＢ、ＰＬＡＰ Ｈ４ ＴＣＢ及びＰＬＡＰ Ｈ５ ＴＣＢの疎水性は許容範囲内であるが、ＰＬＡＰ Ｈ２ ＴＣＢは疎水性基準を超えることがわかった。
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）の疎水性は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して決定した。このために、試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。測定は、ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳ、１１μｌフローセル、オートサンプラー温度１０℃）において、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０μｍ、７．５ｘ７５ｍｍ）カラムを４０℃、移動相Ａ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５Ｍ ＮＨ４ＳＯ４、ｐＨ７）及び移動相Ｂ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）を使用し、流量０．８ｍｌ／分、勾配：溶離液Ｂ ０％／０～２分、１３％／３～５分、１００％／５７～６２分、０％／６３～６５分で実行された。試料量は１回の注入につき２０μｇ、試料量は１０μｌで、２１４ｎｍ、２２０ｎｍ、及び２８０ｎｍの吸光度を検出した。分子の相対的な保持時間を決定するため、保持時間の異なる２つの参照分子（ＲＥＦｌｏｗ及びＲＥＦｈｉｇｈ、２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６中に１ｍｇ／ｍｌ、２０μｇ量）の１：１比で構成されるＨＩＣ標準混合物を使用した。分子の相対保持時間（ＲＴ）は次のように定義される：
相対ＲＴ［分］＝（主ピーク試料ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）／（ＲＥＦｈｉｇｈ ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）
結果を表１１に示す。０．３５より小さい相対保持時間は、疎水性が許容される抗体様タンパク質の特徴である。したがって、ＰＬＡＰ Ｈ１ ＴＣＢ、ＰＬＡＰ Ｈ３ ＴＣＢ、ＰＬＡＰ Ｈ４ ＴＣＢ及びＰＬＡＰ Ｈ５ ＴＣＢの疎水性は許容範囲内であるが、ＰＬＡＰ Ｈ２ ＴＣＢは疎水性基準を超えることがわかった。
【0421】
表１１．疎水性相互作用クロマトグラフィーによって決定されたＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の相対保持時間。
【0422】
実施例１２ － ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の熱安定性の決定
ＰＬＡＰ－ＴＣＢ（実施例１０で調製）の熱安定性は、ＵＮＣＬＥ装置（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用して温度勾配を適用することによる静的光散乱（ＳＬＳ）によってモニターした。測定のために、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの各試料（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）１０μｇを二重にＵＮＣＬＥに適用した。温度を０．１℃／分で３０℃から９０℃まで上昇させ、２６６ｎｍでの散乱強度を収集した。
ＰＬＡＰ－ＴＣＢ（実施例１０で調製）の熱安定性は、ＵＮＣＬＥ装置（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用して温度勾配を適用することによる静的光散乱（ＳＬＳ）によってモニターした。測定のために、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの各試料（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）１０μｇを二重にＵＮＣＬＥに適用した。温度を０．１℃／分で３０℃から９０℃まで上昇させ、２６６ｎｍでの散乱強度を収集した。
【0423】
結果を表１２に示す。凝集温度（Ｔａｇｇ）が６４℃より高いタンパク質は、熱的に安定していると考えられる。結果として、全てのＰＬＡＰ ＴＣＢ分子はこの基準を満たしている。
【0424】
表１２．静的光散乱によって測定されたＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の熱安定性。
【0425】
実施例１３ － ストレス後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の特性評価
抗体の安定性を評価するために、ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）を３７℃、ｐＨ７．４及び４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに分析し、単量体、高分子種（凝集体、二量体、不純物など）及び低分子種（分解生成物、不純物など）の相対的な含有量を決定した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を参照として使用した。参照試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析して戻した。
抗体の安定性を評価するために、ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）を３７℃、ｐＨ７．４及び４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに分析し、単量体、高分子種（凝集体、二量体、不純物など）及び低分子種（分解生成物、不純物など）の相対的な含有量を決定した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を参照として使用した。参照試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析して戻した。
【0426】
分析のために、５つのＰＬＡＰ ＴＣＢ分子を移動相（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２）で５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。測定は、ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２μｍ、４．６ｘ３００ｍｍ）カラムを使用したＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳ、２．５μｌフローセル、オートサンプラー温度１０℃）で、２５℃、流量０．３ｍｌ／分、定組成勾配で１８分間行った。試料量は１回の注入につき５０μｇ、試料量は１０μｌであり、２８０ｎｍの吸光度を検出した。
【0427】
結果を表１３に示す。５つのＰＬＡＰ ＴＣＢ分子は全て９５％を超える単量体含有量を示しており、分子の純度は高い。非ストレス試料（「非ストレス」）の主ピーク含有量とストレス試料（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中４０℃で２週間（「ストレスＡ」）又は１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中３７℃で２週間（「ストレスＢ」））の主ピーク含有量との差は「デルタ」値と定義され、安定性の指標として機能する。これらのデルタ値は１．０～３．４％の範囲にあり、これは２つの異なるストレス条件下で分子が安定していることを示している。全体として、ＳＥＣによる分析で、５つのＰＬＡＰ ＴＣＢの純度と安定性が確認された。
【0428】
表１３．ＳＥＣ分析の結果。非ストレス条件（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、－８０℃で２週間）と、ストレスＡ（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、４０℃で２週間）とストレスＢ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で２週間）の２つのストレス条件におけるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の分析ＳＥＣデータ。高分子量種（ＨＭＷ）、低分子量種（ＬＭＷ）。デルタ値の計算：デルタ＝Ｒｅｌ．面積［％］（主ピーク、非ストレス）－Ｒｅｌ．面積［％］（主ピーク、ストレスＡ又はＢ）。＊非ストレス試料の主ピーク含有量がストレス試料より小さいため、決定できなかった。
【0429】
実施例１４ － ストレス後の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の特性評価
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）の安定性をさらに評価するために、試料に実施例１３に記載のようにストレスをかけ、ヒトＣＤ３ε／δに対する結合能力についてＳＰＲによってさらに分析した。
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）の安定性をさらに評価するために、試料に実施例１３に記載のようにストレスをかけ、ヒトＣＤ３ε／δに対する結合能力についてＳＰＲによってさらに分析した。
【0430】
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）をランニング及び希釈バッファーとして用いて実施された。抗ＰＧ抗体（実施例３を参照）を、アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１０００５０を使用）によって、ＣＭ５チップ（センサーチップＣＭ５、Ｃｙｔｉｖａ ＃２９１０４９８８）上に、＞６０００ＲＵの密度で固定化した。ＨＢＳ－Ｐ＋中のＴＣＢ分子試料の１０ｎＭ溶液を、流量１０μｌ／分で３０秒間捕捉した。次いで、ヒトＣＤ３ε／δ（実施例３、配列番号２４及び２５を参照）の３００ｎＭ溶液を、１０μｌ／分の流量で、１５０秒の会合時間及び１２０秒の解離時間にわたって注入した。表面の再生に続いて、２０ｍＭ ＮａＯＨ溶液を用いた３５秒の再生工程が続いた。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ及びＥｘｃｅｌソフトウェアで分析された。相対活性濃度（ＲＡＣ）の計算には、結合報告点（ＢＲＰ）を使用した（ＢＲＰはＳＰＲにおける標準的な読み出し点であり、抗原と抗体間の相互作用の最大応答（単位／値）である）。
【0431】
この結果から、最適化されたＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３のＰＬＡＰ ＴＣＢ分子における安定性が確認された。
【0432】
表１４．非ストレス条件（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、－８０℃で２週間）と、ストレスＡ（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、４０℃で２週間）とストレスＢ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で２週間）の２つのストレス条件におけるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子のＳＰＲデータ。
【0433】
実施例１５ － ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の機能活性
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）の機能活性を、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞アッセイで試験した。
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）の機能活性を、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞アッセイで試験した。
【0434】
ＣＨＯ－Ｋ１ ＡＬＰＰ、ＡＬＰＧ、ＡＬＰＬ又はＡＬＰＩ細胞株の生成
ＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）、ＡＬＰＧ（ＡＬＰＰＬ２）、ＡＬＰＬ、又はＡＬＰＩを安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を生成するために、同時トランスフェクションされた２つのプラスミドからなるトランスポゾンベクターシステムをトランスフェクションに使用した：目的の遺伝子が２つの逆方向／直接反復ＩＲ／ＤＲに隣接しているトランスポゾンベクターと、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼＳＢ１００ｘをコードするベクター。ＣＨＯ－Ｋ１細胞に、ヒトＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）、ＡＬＰＰＬ２、ＡＬＰＩ又はＡＬＰＬ、並びにマウスＡＬＰＩ、ＡＬＰＰＬ２又はカニクイザルＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）をコードするピューロマイシン耐性遺伝子保有トランスポゾンベクターを、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，＃１１６６８－０１９）を用いてトランスフェクトした。ピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１１１３８－０３）を用いた抗生物質選択段階を経て、トランスフェクトされた細胞集団を濃縮した後、ヒト、カニクイザル、又はマウスのＡＬＰＰ若しくはホモログを安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞をセルソーティングによって単離した。そこで、ピューロマイシンで選択された細胞プールをヒツジ抗ＡＬＰＰ／ＡＬＰＩ抗体（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ５９０５）又はマウス抗ＡＬＰＬ抗体クローンＢ４－７８（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＭＡＢ１４４８）で染色し、続いて、それぞれＲ－ＰＥをコンジュゲートさせた二次抗マウス抗体又は抗ヒツジ抗体で染色した。選別された細胞プールを、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＰＡＮ ＃Ｐ０４－８０１００）、１０％ＦＣＳ（ＰＡＮ ＃Ｐ３０－２００６）、及び１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＃Ａ１１１３８－０３）を添加したＤＭＥＭ Ｆ１２（ＰＡＮ ＃Ｐ０４－４１４５０）において増殖させ、５ｘ１０６個の細胞アリコートをクライオパン（ＰＡＮ ＃Ｐ０７－９２５００）で凍結した。生成されたＣＨＯ－Ｋ１細胞株は、以下のタンパク質を発現する：ヒトＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０５１８７）、ヒトＡＬＰＬＬ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ１０６９６）、ヒトＡＬＰＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０５１８６）、ヒトＡＬＰＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０９９２３）、マウスＡＬＰＬＬ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ２４８２３）、マウスＡＬＰＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０９２４２）又はカニクイザルＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）（配列番号７４）。
ＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）、ＡＬＰＧ（ＡＬＰＰＬ２）、ＡＬＰＬ、又はＡＬＰＩを安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を生成するために、同時トランスフェクションされた２つのプラスミドからなるトランスポゾンベクターシステムをトランスフェクションに使用した：目的の遺伝子が２つの逆方向／直接反復ＩＲ／ＤＲに隣接しているトランスポゾンベクターと、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼＳＢ１００ｘをコードするベクター。ＣＨＯ－Ｋ１細胞に、ヒトＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）、ＡＬＰＰＬ２、ＡＬＰＩ又はＡＬＰＬ、並びにマウスＡＬＰＩ、ＡＬＰＰＬ２又はカニクイザルＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）をコードするピューロマイシン耐性遺伝子保有トランスポゾンベクターを、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，＃１１６６８－０１９）を用いてトランスフェクトした。ピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１１１３８－０３）を用いた抗生物質選択段階を経て、トランスフェクトされた細胞集団を濃縮した後、ヒト、カニクイザル、又はマウスのＡＬＰＰ若しくはホモログを安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞をセルソーティングによって単離した。そこで、ピューロマイシンで選択された細胞プールをヒツジ抗ＡＬＰＰ／ＡＬＰＩ抗体（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ５９０５）又はマウス抗ＡＬＰＬ抗体クローンＢ４－７８（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＭＡＢ１４４８）で染色し、続いて、それぞれＲ－ＰＥをコンジュゲートさせた二次抗マウス抗体又は抗ヒツジ抗体で染色した。選別された細胞プールを、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＰＡＮ ＃Ｐ０４－８０１００）、１０％ＦＣＳ（ＰＡＮ ＃Ｐ３０－２００６）、及び１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＃Ａ１１１３８－０３）を添加したＤＭＥＭ Ｆ１２（ＰＡＮ ＃Ｐ０４－４１４５０）において増殖させ、５ｘ１０６個の細胞アリコートをクライオパン（ＰＡＮ ＃Ｐ０７－９２５００）で凍結した。生成されたＣＨＯ－Ｋ１細胞株は、以下のタンパク質を発現する：ヒトＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０５１８７）、ヒトＡＬＰＬＬ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ１０６９６）、ヒトＡＬＰＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０５１８６）、ヒトＡＬＰＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０９９２３）、マウスＡＬＰＬＬ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ２４８２３）、マウスＡＬＰＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション ＃Ｐ０９２４２）又はカニクイザルＰＬＡＰ（ＡＬＰＰ）（配列番号７４）。
【0435】
標的細胞として操作されたＣＨＯ細胞を使用したＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞株は、ＮＦＡＴプロモーターを有するＣＤ３発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）。ＴＣＢが腫瘍標的とＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上で発現）に同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性なホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。発光シグナル（ルシフェラーゼ基質の添加により得られる）の強度は、ＣＤ３の活性化とシグナル伝達の強度に比例する。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞株は、ＮＦＡＴプロモーターを有するＣＤ３発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）。ＴＣＢが腫瘍標的とＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上で発現）に同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性なホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。発光シグナル（ルシフェラーゼ基質の添加により得られる）の強度は、ＣＤ３の活性化とシグナル伝達の強度に比例する。
【0436】
アッセイのために、ＣＨＯ細胞のプールは、本明細書で上述したように、ヒトＡＬＰＰ、ＡＬＰＧ、ＡＬＰＩ、ＡＬＰＬ、マウスＡＬＰＧ、ＡＬＰＩ、及びカニクイザルＡＬＰＰを発現するように操作されている。ＬｏＶｏ、ＣＨＯプール及び親ＣＨＯ細胞をカウントし、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて生存率をチェックした。３５０×ｇで５分間の遠心分離により、所望の量の標的細胞を回収した。細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）からなるアッセイ培地に再懸濁し、０．０３ｘ１０６細胞／ウェルを白色平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にプレーティングした。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を収集し、カウントし、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生存率を評価した。細胞を０．０９ｘ１０６細胞／ウェルでプレーティングし、最終的なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比３：１を得た。ＴＣＢの段階希釈をアッセイ培地で調製した。ＴＣＢ滴定を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えた。最終アッセイ容量は９０μｌであった。
【0437】
６時間のインキュベーション時間後、９０μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ６１２０）を加え、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０４マルチモードプレートリーダーを使用して読み取りを直ちに行い、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。
【0438】
図６に示すように、最適化された抗ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３を含むＰＬＡＰ ＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞に対して同様の機能活性を示した。試験したＴＣＢは、表１５に示すＥＣ５０値で濃度依存的にＣＤ３活性化を誘導したが、同じＣＤ３バインダーを有する非標的対照ＴＣＢ（ＤＰ４７）はＴ細胞活性化を誘導しなかった。ＰＬＡＰバインダーＨ１からＨ５は全て、ヒトＡＬＰＰ又はＡＬＰＧを操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下でＣＤ３の活性化を誘導したが、ヒトＡＬＰＩ、ＡＬＰＬ又はマウスＡＬＰＧ、ＡＬＰＩの存在下では誘導しなかった。これらのＴＣＢはまた、ＬｏＶｏ大腸腺癌細胞株の存在下でＪｕｒｋａｔレポーターの活性化を誘導した。
【0439】
表１５．レポーターアッセイで測定したＥＣ５０値。
【0440】
図７に示すように、最適化された抗ＣＤ３バインダーＰ０３５．０９３を含むＰＬＡＰ ＴＣＢは、ヒト又はカニクイザルＡＬＰＰを発現する標的細胞と共インキュベートした場合、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞に対して同様の機能活性を示した。ＴＣＢは濃度依存的にＣＤ３活性化を誘導し、そのＥＣ５０値を表１６に示した。ＰＬＡＰバインダーＨ１、Ｈ３、及びＨ５は全て、ヒト及びカニクイザルＡＬＰＰを操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下でＣＤ３の活性化を誘導し、カニクイザルＡＬＰＰに対する交差反応性を確認した。
【0441】
表１６．カニクイザルの交差反応性を示すためにレポーターアッセイで測定されたＥＣ５０値。
【0442】
実施例１６ － ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子によって誘導される腫瘍細胞の死滅
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）を、新鮮な単離ヒトＰＢＭＣを用い、ヒト上皮細胞株ＬｏＶｏと共インキュベートした腫瘍細胞死滅アッセイで試験した。腫瘍細胞の溶解は、４８時間後と７２時間後にアポトーシス細胞又はネクローシス細胞によって細胞上清中に放出された、細胞内プロテアーゼ活性の細胞外活性を定量することによって決定された。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化をフローサイトメトリーで分析し、７２時間後の両サブセットの活性化マーカーの上方制御を評価した。
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１０で調製）を、新鮮な単離ヒトＰＢＭＣを用い、ヒト上皮細胞株ＬｏＶｏと共インキュベートした腫瘍細胞死滅アッセイで試験した。腫瘍細胞の溶解は、４８時間後と７２時間後にアポトーシス細胞又はネクローシス細胞によって細胞上清中に放出された、細胞内プロテアーゼ活性の細胞外活性を定量することによって決定された。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化をフローサイトメトリーで分析し、７２時間後の両サブセットの活性化マーカーの上方制御を評価した。
【0443】
標的細胞（ＬｏＶｏ）をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離し、ＰＢＳで１回洗浄し、増殖培地（１０％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ））中に０．３ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。１００μｌのこの細胞懸濁液（３００００細胞を含有）を、９６ウェルのＵ底プレートに播種した。
【0444】
健常ドナーの血液からＰＢＭＣを単離し、生存率を確認した。抗体をアッセイ用培地で表示濃度に希釈し、１ウェルあたり５０μｌを標的細胞に添加した。対照ウェルに、アッセイ培地を添加した。単離したＰＢＭＣを６ｍｉｏ細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、１ウェルあたり５０μｌを添加し、３０００００細胞／ウェルとした（Ｅ：Ｔ １０：１）。自然死細胞プロテアーゼ放出の測定には、陰性対照としてＰＢＭＣと標的細胞のみを共インキュベートした。標的細胞の非存在下でＰＢＭＣとＴＣＢを含む対照ウェルを使用して、ＴＣＢの特異性を試験した。
【0445】
アッセイは、インキュベーター内で３７℃で合計７２時間インキュベートされた。死細胞プロテアーゼ活性の測定は、アッセイ開始から４８時間及び７２時間後に実施された。このために、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ９２９１）を測定前に室温に調整した。分析のために、ウェルあたり３０μｌの上清を９６ウェル平底プレートに移した。続いて、３０μｌの発光ペプチド基質を各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０４機器を使用して発光を測定した。
【0446】
その後、ＰＢＭＣを回収し、ＣＤ２５とＣＤ６９の活性化の上方制御を測定して分析した。詳細には、プレートを６００ｘｇで３分間遠心分離し、上清を除去し、細胞をウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄した。プレートを再び６００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去した。続いて、ＣＤ４ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＰＥ（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ６９ ＦＩＴＣ（クローンＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む抗体ミックスをウェルあたり５０μｌ、細胞に加えた。細胞を冷蔵庫内で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり１％ＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁させた。測定前に細胞を洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。分析はＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａ３装置を使用して行った。
【0447】
抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３５．０９３を含むＰＬＡＰ ＴＣＢによる処理は、図８及び試験した２人の健康なドナーのうちの１人からの代表的なＥＣ５０値を示す表１７に示すように、強力なＬｏＶｏ腫瘍細胞死滅をもたらした。抗ＣＤ３抗体クローンＰ０３５．０９３を含むＴＣＢでＰＢＭＣを処理し、ＬｏＶｏ標的細胞の存在下で共インキュベートすると、Ｔ細胞の活性化が観察される。図９に示すように、試験したＴＣＢは、腫瘍標的細胞の非存在下でＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞上の有意なＣＤ２５上方制御を誘導しなかった。この結果は、試験したＣＤ３バインダーは、例えば腫瘍細胞との結合を介した架橋に依存してＴ細胞活性化を誘導し、一価フォーマットではＴ細胞活性化を誘導することができないことを示すものである。これと一致して、標的細胞存在下でのＴ細胞の活性化マーカーの発現増加が、ＣＤ２５のフローサイトメトリー分析で観察された（図９）。ＣＤ６９の発現も同様の結果を示したが、シグナルはかなり弱く、これはおそらく分析の時点が遅く、このマーカーが初期の活性化マーカーであり、遅い時点では下方制御されるためであると考えられる（データは示さず）。
【0448】
表１７．Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅アッセイで測定されたＥＣ５０値。
【0449】
実施例１７ － さらなる抗ＰＬＡＰ Ｔ細胞二重特異性抗体（ＰＬＡＰ ＴＣＢ）の調製
実施例１０で調製したＰＬＡＰ ＴＣＢ（抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３及び抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ１～Ｈ５を含む）に加えて、さらなるＰＬＡＰ ＴＣＢを、（ｉ）抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ３（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供；配列番号３６～３９、４８～５１）及び抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔ（上記の実施例１、表１の配列を参照））、又は（ｉｉ）抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ２又はＨ４（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供；それぞれ配列番号３２～３５、４８～５１又は配列番号４０～４３、４８～５１）及び抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｏｒｉｇを使用して調製した。
実施例１０で調製したＰＬＡＰ ＴＣＢ（抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３及び抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ１～Ｈ５を含む）に加えて、さらなるＰＬＡＰ ＴＣＢを、（ｉ）抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ３（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供；配列番号３６～３９、４８～５１）及び抗ＣＤ３抗体Ｐ０３５．０９３、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔ（上記の実施例１、表１の配列を参照））、又は（ｉｉ）抗ＰＬＡＰ抗体Ｈ２又はＨ４（ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供；それぞれ配列番号３２～３５、４８～５１又は配列番号４０～４３、４８～５１）及び抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｏｒｉｇを使用して調製した。
【0450】
調製されたＴＣＢ分子の完全な配列は、配列番号１６、５６、５７及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ３ ＣＤ３ Ｐ０３５．０９３）、配列番号１７、５６、５７及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ３ ＣＤ３ｏｒｉｇ）、配列番号１８、７５、５７及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ３ ＣＤ３ｏｐｔ）、配列番号１７、５４、５５及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ２ ＣＤ３ｏｒｉｇ）、並びに配列番号１８、５８、５９及び６２（ＰＬＡＰ Ｈ４ ＣＤ３ｏｒｉｇ）に示されており、それらのフォーマットは実施例１に記述され、図２Ａに示されているとおりである。
【0451】
ＴＣＢは、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の発現ベクターを用いて、Ｐｒｏｔｅｒｏｓ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓによって調製された。Ｅｘｐｉ２９３細胞に、１：１：２：１（「ベクターノブ重鎖」：「ベクターホール重鎖」：「ベクターＰＬＡＰ軽鎖」：「ベクターＣＤ３軽鎖」）の比でプラスミドを一時的にトランスフェクトした。上清を遠心分離とその後の濾過によって回収した。タンパク質を、回収した上清から、アフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ．ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、平衡化バッファー：ＰＢＳ、ｐＨ７．４；溶出バッファー：５０ｍＭ酢酸、ｐＨ３．２）、イオン交換クロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ＸＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、平衡化バッファー：４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５；溶出バッファー：１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００プレップグレード、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）によって精製した。
【0452】
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４，１９９５，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算された質量吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含有量の決定は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ高分解能ＳＥＣカラム、２５０Å、５μｍ、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．０で平衡化）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。
【0453】
表１８．ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の生化学的及び生物物理学的分析。
【0454】
実施例１８ － ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の熱安定性の決定
実施例１７で生成したＰＬＡＰ ＴＣＢの熱安定性を、ＵＮＣＬＥ装置（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用して温度勾配を適用することによる静的光散乱（ＳＬＳ）によってモニターした。測定のために、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの各試料（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）１０μｇを二重にＵＮＣＬＥに適用した。温度を０．１℃／分で３０℃から９０℃まで上昇させ、２６６ｎｍでの散乱強度を収集した。
実施例１７で生成したＰＬＡＰ ＴＣＢの熱安定性を、ＵＮＣＬＥ装置（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用して温度勾配を適用することによる静的光散乱（ＳＬＳ）によってモニターした。測定のために、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの各試料（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）１０μｇを二重にＵＮＣＬＥに適用した。温度を０．１℃／分で３０℃から９０℃まで上昇させ、２６６ｎｍでの散乱強度を収集した。
【0455】
結果を表１９に示す。凝集温度（Ｔａｇｇ）が６４℃より高いタンパク質は、熱的に安定していると考えられる。全てのＰＬＡＰ ＴＣＢ分子はこの基準を満たしている。ＰＬＡＰ－Ｈ３－Ｐ０３５．０９３－ＴＣＢ構築物は最も高い熱安定性を示した。
【0456】
表１９．静的光散乱（ＳＬＳ）によって測定された異なるＰＬＡＰ ＴＣＢの熱安定性。
【0457】
実施例１９ － 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の疎水性決定
実施例１７で生成したＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の疎水性を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して決定した。このために、試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。測定は、ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、７．５ｘ７５ｍｍ）カラムを４０℃、移動相Ａ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５Ｍ ＮＨ４ＳＯ４、ｐＨ７）及び移動相Ｂ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で実行され、２８０ｎｍの吸光度を検出した。分子の相対的な保持時間（ｒｅｌ．ＲＴ）を決定するため、保持時間の異なる２つの参照分子（ＲＥＦｌｏｗ及びＲＥＦｈｉｇｈ）の１：１比で構成されるＨＩＣ標準混合物を使用した。分子の相対保持時間は次のように定義される：
ｒｅｌ．ＲＴ［分］＝（主ピーク（試料）ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）／（ＲＥＦｈｉｇｈ ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）
主ピーク（試料）ＲＴ：分析分子の主ピークの保持時間、ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ：保持時間が短い参照分子の保持時間、ＲＥＦｈｉｇｈ ＲＴ：保持時間が長い参照分子の保持時間。
実施例１７で生成したＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の疎水性を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して決定した。このために、試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。測定は、ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、７．５ｘ７５ｍｍ）カラムを４０℃、移動相Ａ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５Ｍ ＮＨ４ＳＯ４、ｐＨ７）及び移動相Ｂ（２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で実行され、２８０ｎｍの吸光度を検出した。分子の相対的な保持時間（ｒｅｌ．ＲＴ）を決定するため、保持時間の異なる２つの参照分子（ＲＥＦｌｏｗ及びＲＥＦｈｉｇｈ）の１：１比で構成されるＨＩＣ標準混合物を使用した。分子の相対保持時間は次のように定義される：
ｒｅｌ．ＲＴ［分］＝（主ピーク（試料）ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）／（ＲＥＦｈｉｇｈ ＲＴ［分］－ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ［分］）
主ピーク（試料）ＲＴ：分析分子の主ピークの保持時間、ＲＥＦｌｏｗ ＲＴ：保持時間が短い参照分子の保持時間、ＲＥＦｈｉｇｈ ＲＴ：保持時間が長い参照分子の保持時間。
【0458】
結果を表２０に示す。０．３５分より短い相対保持時間は、疎水性が許容される抗体様タンパク質の特徴である。したがって、ＰＬＡＰ－Ｈ３－ＣＤ３ｏｒｉｇ－ＴＣＢ、ＰＬＡＰ－Ｈ４－ＣＤ３ｏｒｉｇ－ＴＣＢ及びＰＬＡＰ－Ｈ３－Ｐ０３５．０９３－ＴＣＢの疎水性は許容範囲内であったが、ＰＬＡＰ－Ｈ３－ＣＤ３ｏｐｔ－ＴＣＢ及びＰＬＡＰ－Ｈ２－ＣＤ３ｏｒｉｇ－ＴＣＢは疎水性基準を超えるがわかった。
【0459】
表２０．疎水性相互作用クロマトグラフィーによって決定された異なるＰＬＡＰ ＴＣＢの相対保持時間。
【0460】
実施例２０ － ストレス後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の特性評価
安定性を評価するために、実施例１７で生成したＰＬＡＰ ＴＣＢ分子を３７℃、ｐＨ７．４又は４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに分析し、単量体、高分子種（凝集体、二量体、不純物など）及び低分子種（分解生成物、不純物など）の相対的な含有量を決定した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を参照として使用した。参照試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１０．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析して戻した。
安定性を評価するために、実施例１７で生成したＰＬＡＰ ＴＣＢ分子を３７℃、ｐＨ７．４又は４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに分析し、単量体、高分子種（凝集体、二量体、不純物など）及び低分子種（分解生成物、不純物など）の相対的な含有量を決定した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を参照として使用した。参照試料及び４０℃でストレスを与えた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に、３７℃でストレスを与えた試料は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に、全て濃度１０．０ｍｇ／ｍｌで存在させた。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析して戻した。
【0461】
分析のために、５つのＰＬＡＰ ＴＣＢ分子を移動相（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２）で５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。測定は、ＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２μｍ、４．６ｘ３００ｍｍ）カラムを使用したＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、２５℃、流量０．３ｍｌ／分、定組成勾配で１８分間行った。試料量は１回の注入につき５０μｇで、２８０ｎｍの吸光度を検出した。
【0462】
結果を表２１に示す。５つのＰＬＡＰ ＴＣＢ分子は全て９５％を超える単量体（主ピーク）含有量を示しており、分子の純度は高い。非ストレス試料（「非ストレス」）の主ピーク含有量とストレス試料（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中４０℃で２週間（「ストレスＡ」）又は１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中３７℃で２週間（「ストレスＢ」））の主ピーク含有量との差は「デルタ」値と定義され、安定性の指標として機能する。これらのデルタ値は１．５～３．３パーセントの範囲にあり、これは２つの異なるストレス条件下で分子が安定していることを示している。全体として、ＳＥＣによる分析で、ＰＬＡＰ ＴＣＢの純度と安定性が確認された。
【0463】
表２１．非ストレス条件（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中、－８０℃で２週間）と、ストレスＡ（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中、４０℃で２週間）とストレスＢ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で２週間）の２つのストレス条件における異なるＰＬＡＰ ＴＣＢのＳＥＣデータ。高分子量種（ＨＭＷ）、低分子量種（ＬＭＷ）。デルタ値の計算：デルタ＝Ｒｅｌ．面積［％］（主ピーク、非ストレス）－Ｒｅｌ．面積［％］（主ピーク、ストレスＡ又はＢ）。
【0464】
実施例２１ － ストレス後の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による ＰＬＡＰ ＴＣＢ 分子の特性評価（ＲＡＣアッセイ）
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１７で調製）の安定性をさらに評価するために、試料に実施例２０に記載のようにストレスをかけ、ヒトＣＤ３ε／δに対する結合能力についてＳＰＲによってさらに分析した。
ＰＬＡＰ ＴＣＢ分子（実施例１７で調製）の安定性をさらに評価するために、試料に実施例２０に記載のようにストレスをかけ、ヒトＣＤ３ε／δに対する結合能力についてＳＰＲによってさらに分析した。
【0465】
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行された。固定化には、ＨＢＳ－Ｎ ｐＨ７．４をランニングバッファーとして使用した（Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１００６７０）。抗ＰＧ抗体（実施例３を参照）を、アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１０００５０を使用）によって、ＣＭ３チップ（Ｃｙｔｉｖａ ＃２９１０４９９０）上に、＞６０００ＲＵの密度で固定化した。抗ＰＧ抗体ストック溶液を、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１００３５１）中で２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。固定化後、分析を２５℃で、ランニングバッファー及び希釈バッファーとしてＰＢＳ－Ｐ＋（Ｃｙｔｉｖａ ＃２８９９５０８４）を使用して行った。ＰＢＳ－Ｐ＋中のＴＣＢ分子試料の５ｎＭ溶液を、流量５μｌ／分で３０秒間捕捉した。次いで、ヒトＰＬＡＰの１００ｎＭ溶液を、８μｌ／分の流量で９０秒の会合時間及び３０秒の解離時間にわたって注入した。その後、ヒトＣＤ３ε／δ（実施例３、配列番号２４及び２５を参照）の２００ｎＭ溶液を、８μｌ／分の流量で、９０秒の会合時間及び３０秒の解離時間にわたって注入した。表面の再生に続いて、１０ｍＭ ＮａＯＨ溶液を用いた６０秒の再生工程が２回行われた。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ及びＥｘｃｅｌソフトウェアで分析された。相対活性濃度（ＲＡＣ）の計算には、結合報告点（ＢＲＰ）を使用した。ＲＡＣを計算するために、標的濃度と抗体濃度は、非ストレス試料（－８０℃）を１００％比較として参照した。タンパク質濃度の正規化には、抗ＰＧ抗体捕捉（ＲＡＣ値）を参照した。
【0466】
ＣＤ３結合安定性の結果を表２２に、ＰＬＡＰ結合安定性の結果を表２３に示す。Ｐ０３５．０９３ ＣＤ３バインダーを含むＴＣＢ分子は最も高い結合安定性を示し、ＣＤ３バインダーＣＤ３ｏｐｔを含む分子がそれに続く。ＣＤ３ｏｒｉｇを含むＴＣＢ分子は、最も低い結合安定性を示す（表２２）。ＰＬＡＰの結合安定性は全ての分子で同じ範囲にある（表２３）。
【0467】
表２２．ＲＡＣアッセイによるストレス後のＣＤ３結合データ。非ストレス条件（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中、－８０℃で２週間）と、ストレスＡ（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中、４０℃で２週間）とストレスＢ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で２週間）の２つのストレス条件におけるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子のＲＡＣデータ。
【0468】
表２３．ＲＡＣアッセイによるストレス後のＰＬＡＰ結合データ。非ストレス条件（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中、－８０℃で２週間）と、ストレスＡ（２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６．０、１４０ｍＭ中、４０℃で２週間）とストレスＢ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で２週間）の２つのストレス条件におけるＰＬＡＰ ＴＣＢのＲＡＣデータ。
【0469】
実施例２２ － 単一サイクル反応速度アッセイ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の結合反応速度の特性評価
実施例１７で生成されたＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の結合反応速度は、単一サイクル反応速度（ＳＳＫ）アッセイによって特徴づけられた。このアッセイでは、再びＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した。固定化は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－Ｎ ｐＨ７．４（Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１００６７０）を用いて２５℃で行った。抗ＰＧ抗体（実施例３を参照）を、アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１０００５０を使用）によって、ＣＭ３チップ（Ｃｙｔｉｖａ ＃２９１０４９９０）上に、＞５０００ＲＵの密度で固定化した。抗ＰＧ抗体ストック溶液を、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１００３５１）中で２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。固定化後、分析は２５℃で行い、ＰＢＳ－Ｐ＋（Ｃｙｔｉｖａ ＃２８９９５０８４）をランニングバッファー及び希釈バッファーとして使用した。ＰＢＳ－Ｐ＋中のＴＣＢ分子試料の３ｎＭ溶液を、ＣＭ３センサーチップ上で抗ＰＧ抗体で捕捉した。
実施例１７で生成されたＰＬＡＰ ＴＣＢ分子の結合反応速度は、単一サイクル反応速度（ＳＳＫ）アッセイによって特徴づけられた。このアッセイでは、再びＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した。固定化は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－Ｎ ｐＨ７．４（Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１００６７０）を用いて２５℃で行った。抗ＰＧ抗体（実施例３を参照）を、アミンカップリング（アミンカップリングキット、Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１０００５０を使用）によって、ＣＭ３チップ（Ｃｙｔｉｖａ ＃２９１０４９９０）上に、＞５０００ＲＵの密度で固定化した。抗ＰＧ抗体ストック溶液を、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（Ｃｙｔｉｖａ ＃ＢＲ１００３５１）中で２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。固定化後、分析は２５℃で行い、ＰＢＳ－Ｐ＋（Ｃｙｔｉｖａ ＃２８９９５０８４）をランニングバッファー及び希釈バッファーとして使用した。ＰＢＳ－Ｐ＋中のＴＣＢ分子試料の３ｎＭ溶液を、ＣＭ３センサーチップ上で抗ＰＧ抗体で捕捉した。
【0470】
試料分析の測定サイクルは、表２４と表２５に示すように、３つの異なる工程からなる。導出された反応速度定数及び対応する親和性値（平衡解離定数ＫＤ）は、ＣＤ３バインダーについては表２６に、ＰＬＡＰバインダーについては表２７にまとめられている。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ及びＥｘｃｅｌソフトウェアで分析された。
【0471】
ＣＤ３バインダーの反応速度論の結果を表２６に示し、ＰＬＡＰバインダーの反応速度論の結果を表２７に示す。Ｐ０３５．０９３ ＣＤ３バインダーは、ＣＤ３バインダーＣＤ３ｏｐｔ及びＣＤ３ｏｒｉｇと比較してＣＤ３標的に対して最も高い親和性を示し（表２６を参照）、ＰＬＡＰ Ｈ３バインダーは、ＰＬＡＰバインダーＨ２及びＨ４と比較してＰＬＡＰ標的に対して最も高い親和性を示す（表２７を参照）。
【0472】
表２４．ヒトＣＤ３に結合する試料の測定サイクル。
第３工程では、５倍希釈系列（０．７８１ｎＭ－３．１３ｎＭ－１．５ｎＭ－５０．０ｎＭ－２００ｎＭ）から１濃度ずつ注入した。全サイクルをブランク（０ｎＭ）でも繰り返した。
【0473】
表２５．ヒトＰＬＡＰに結合する試料の測定サイクル。
第３工程では、５倍希釈系列（０．１９５ｎＭ－０．７８１ｎＭ－３．１２ｎＭ－１２．５ｎＭ－５０．０ｎＭ）から１濃度ずつ注入した。全サイクルをブランク（０ｎＭ）でも繰り返した。
【0474】
表２６．ＣＤ３結合反応速度。ヒトＣＤ３相互作用の２５℃における反応速度定数と平衡解離定数。
【0475】
表２７．ＰＬＡＰ結合反応速度。ヒトＰＬＡＰ相互作用の２５℃における反応速度定数と平衡解離定数。
【0476】
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例としてある程度詳細に説明されているが、説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【図1A-F】
【図1G-N】
【図1O-V】
【図1W-Z】
【図2】
【図3】
【図4A-B】
【図4C-F】
【図5】
【図6A-F】
【図6G-I】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】