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特表2025-505245アルファ６含有ニコチン性アセチルコリン受容体のための発現系及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-21
(54)【発明の名称】アルファ６含有ニコチン性アセチルコリン受容体のための発現系及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20250214BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250214BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250214BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20250214BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12Q1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024547539
(86)(22)【出願日】2023-02-10
(85)【翻訳文提出日】2024-10-08
(86)【国際出願番号】 EP2023053378
(87)【国際公開番号】W WO2023152333
(87)【国際公開日】2023-08-17
(31)【優先権主張番号】63/309,092
(32)【優先日】2022-02-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】397060175
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ブレット，デイビット
(72)【発明者】
【氏名】マッタ，ホセ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ79
4B063QR77
4B063QS36
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
α６含有ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞及びその使用方法が本明細書に開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された組換え細胞であって、ａ）ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする異種核酸と、
ｂ）ＢＡＲＰをコードする異種核酸と、
ｃ）ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸と、
ｄ）ＬＡＭＰ５をコードする異種核酸と、
ｅ）ＣＨＡＴをコードする異種核酸と、
ｆ）ＮＡＣＨＯをコードする異種核酸と、を含む、単離された組換え細胞。
【請求項2】
ｇ）ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする異種核酸と、ｈ）ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットをコードする異種核酸と、を更に含み、
ｎＡＣｈＲの前記α６、β２、及びβ３サブユニットが、α６β２β３ ｎＡＣｈＲを形成する、請求項１に記載の単離された組換え細胞。
【請求項3】
ｎＡＣｈＲの前記α６サブユニットが、前記α６サブユニットの第２の細胞内ループ（ＩＣＬ）の全配列又は部分配列がｎＡＣｈＲのα３サブユニットの第２のＩＣＬの対応する配列によって置き換えられているα６／３キメラであり、前記α６／３キメラ並びにｎＡＣｈＲの前記β２及びβ３サブユニットが、キメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを形成する、請求項１又は２に記載の単離された組換え細胞。
【請求項4】
前記組換え細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項5】
前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された組換え細胞。
【請求項6】
ｎＡＣｈＲの前記α６サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項7】
ｎＡＣｈＲの前記β２サブユニットが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項8】
ｎＡＣｈＲの前記β３サブユニットが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～７のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項9】
前記α６サブユニットの第２のＩＣＬが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記α３サブユニットの第２のＩＣＬが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項10】
前記α６／３キメラが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３～９のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項11】
前記ＢＡＲＰが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項12】
前記ＳＵＬＴ２Ｂ１が、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項13】
前記ＬＡＭＰ５が、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項14】
前記ＣＨＡＴが、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項15】
前記ＮＡＣＨＯが、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞。
【請求項16】
α６含有ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を特定するための方法であって、前記方法が、ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を薬剤と接触させることと、
ｂ）前記単離された組換え細胞の前記α６含有ｎＡＣｈＲの活性を決定することであって、前記薬剤が前記α６含有ｎＡＣｈＲの活性を増強する場合に、前記薬剤が、アゴニスト又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）であると特定され、前記薬剤が、前記単離された組換え細胞が前記薬剤と接触していなかった場合の前記α６含有ｎＡＣｈＲの活性と比較して、前記α６含有ｎＡＣｈＲの活性を減少させる場合に、前記薬剤がアンタゴニストであると特定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項17】
α６β２β３ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を特定するための方法であって、前記方法が、ａ）請求項２～１５のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞を薬剤と接触させることと、
ｂ）前記単離された組換え細胞の前記α６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を決定することであって、前記薬剤が前記α６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を増強する場合に、前記薬剤が、アゴニスト又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）であると特定され、前記薬剤が、前記単離された組換え細胞が前記薬剤と接触していなかった場合の前記α６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性と比較して、前記α６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を減少させる場合に、前記薬剤がアンタゴニストであると特定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項18】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のカルシウム流を決定することを含み、前記薬剤が、前記単離された組換え細胞が前記薬剤と接触していなかった場合の前記カルシウム流と比較して、前記カルシウム流を増強する場合に、前記薬剤がアゴニストであると特定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、前記薬剤が、前記単離された組換え細胞が前記薬剤と接触していなかった場合の前記カルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流と比較して、カルシウム流を増強せず、かつニコチン誘発性カルシウム流を増強する場合に、前記薬剤が、ＰＡＭであると特定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
工程ｂ）が、前記単離された組換え細胞のニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、前記薬剤が、前記単離された組換え細胞が前記薬剤と接触していなかった場合の前記ニコチン誘発性カルシウム流と比較して、前記ニコチン誘発性カルシウム流を減少させる場合に、前記薬剤がアンタゴニストであると特定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記単離された組換え細胞が、前記薬剤と接触する前に、約２５℃～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記薬剤が、小分子又はペプチドである、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
（ｉ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離された組換え細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含む、キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２２年２月１１日に出願された米国仮出願第６３／３０９，０９２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年２月１１日に出願された米国仮出願第６３／３０９，０９２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本発明は、α６含有ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor、ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞及びその使用方法に関する。
本発明は、α６含有ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor、ｎＡＣｈＲ）の発現のための単離された組換え細胞及びその使用方法に関する。
【0003】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ＳＴ．２６形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。当該ＳＴ．２６コピーは、２０２３年１月２６日に作成され、名称はＪＡＢ７１３７ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ＸＭＬであり、そのサイズは１６，１０８バイトである。
本出願は、ＳＴ．２６形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。当該ＳＴ．２６コピーは、２０２３年１月２６日に作成され、名称はＪＡＢ７１３７ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ＸＭＬであり、そのサイズは１６，１０８バイトである。
【背景技術】
【0004】
大うつ病は、絶望感及び快感消失を含む衰弱性の症状を特徴とする。腹側被蓋野から側坐核へのドーパミン系（中脳辺縁系ドーパミン系）と、報酬に関連し、快楽的であり、動機付けられた行動とを結びつける強力な証拠が存在する。現時点で、ドーパミンニューロンを特異的に標的とする治療的介入は利用可能ではない。
【0005】
アセチルコリン（Acetylcholine、ＡＣｈ）は、ドーパミンニューロンの調節において主要な役割を果たす。ＡＣｈは、２つの主要な受容体であるイオン向性ニコチン性アセチルコリン受容体（ionotropic nicotinic、ｎＡＣｈＲ）及び代謝調節型ムスカリン性アセチルコリン受容体（metabotropic muscarinic、ｍＡＣｈＲ）に結合する。ｎＡＣｈＲは、ドーパミンニューロンを脱分極させ、カルシウムを細胞に流入させる非選択性カチオンチャネルである。この脱分極は、バースト発火（＞２０Ｈｚ）と呼ばれる高周波数での活動電位の発生をもたらす。上述の行動に関して中脳辺縁系ドーパミン系の生理学的役割をコードするのは、ドーパミンニューロンのこのバースト発火である。したがって、ｎＡＣｈＲを調節することは、気分障害に対する治療的介入をもたらし得る。
【0006】
ｎＡＣｈＲは、それぞれが大きな細胞外Ｎ末端ドメイン（N-terminal domain、ＮＴＤ）、大きな第２の細胞内ループ（intracellular loop、ＩＣＬ）を含む細胞内及び細胞外ループによって接続された４つの膜貫通αヘリックス（ＴＭ１～ＴＭ４）からなる膜貫通ドメイン（transmembrane domain、ＴＭＤ）並びに短い細胞外Ｃ末端からなる５つのサブユニットから組み立てられた膜結合複合体である。したがって、五量体ｎＡＣｈＲ複合体は、オルソステリック部位を含有する細胞外ドメイン、イオンチャネルを含有する膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインといった３つの構造的エンティティを含み、３つのエンティティは、それぞれ、５つのサブユニットのＮＴＤ、ＴＭＤ、及びＩＣＬから組み立てられる。
【0007】
ｎＡＣｈＲサブユニットα６（ＣＨＲＮＡ６、アクセッション番号：ＮＭ＿００４１９８）を含有するｎＡＣｈＲは、ドーパミンニューロンにおいて選択的に発現され、気分障害を治療するための中脳辺縁系ドーパミン系の調節のための治療標的を与える。しかしながら、薬物開発の努力は、そのようなスクリーニングに典型的に使用される組換え系においてα６含有ｎＡＣｈＲを発現することができないことによって妨げられてきた。
【0008】
α６含有ｎＡＣｈＲを強く発現し、薬物開発に使用することができる組換え細胞株を開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本明細書では、単離された組換え細胞であって、ａ）ｎＡＣｈＲのα６サブユニットをコードする異種核酸と、ｂ）ＢＡＲＰをコードする異種核酸と、ｃ）ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸と、ｄ）ＬＡＭＰ５をコードする異種核酸と、ｅ）ＣＨＡＴをコードする異種核酸と、ｆ）ＮＡＣＨＯをコードする異種核酸と、を含む、単離された組換え細胞が提供される。
【0010】
単離された組換え細胞の一実施形態では、単離された組換え細胞は、ｇ）ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする異種核酸と、ｈ）ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットをコードする異種核酸と、を更に含み、ｎＡＣｈＲのα６、β２、及びβ３サブユニットが、α６β２β３ ｎＡＣｈＲを形成する。
【0011】
単離された組換え細胞の更なる実施形態では、ｎＡＣｈＲのα６サブユニットは、α６サブユニットの第２の細胞内ループ（intracellular loop、ＩＣＬ）の全配列又は部分配列がｎＡＣｈＲのα３サブユニットの第２のＩＣＬの対応する配列によって置き換えられているα６／３キメラであり、α６／３キメラ並びにｎＡＣｈＲのβ２及びβ３サブユニットが、キメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを形成する。
【0012】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。
【0013】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（human embryonic kidney 293T、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎臓（baby hamster kidney、ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される。
【0014】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ｎＡＣｈＲのα６サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0015】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0016】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0017】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットは、α６サブユニットの第２のＩＣＬは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、α３サブユニットの第２のＩＣＬは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0018】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、α６／３キメラは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0019】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ＢＡＲＰは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0020】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ＳＵＬＴ２Ｂ１は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0021】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ＬＡＭＰ５は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0022】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ＣＨＡＴは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0023】
単離された組換え細胞のなお更なる実施形態では、ＮＡＣＨＯは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0024】
更に、α６含有ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を特定するための方法であって、本方法が、ａ）上で提供される単離された組換え細胞を薬剤と接触させることと、ｂ）単離された組換え細胞のα６含有ｎＡＣｈＲの活性を決定することであって、薬剤がα６含有ｎＡＣｈＲの活性を増強する場合に、薬剤が、アゴニスト又は正のアロステリック調節因子（positive allosteric modulator、ＰＡＭ）であると特定され、薬剤が、単離された組換え細胞が薬剤と接触していなかった場合のα６含有ｎＡＣｈＲの活性と比較して、α６含有ｎＡＣｈＲの活性を減少させる場合に、薬剤がアンタゴニストであると特定される、決定することと、を含む、方法が本明細書で提供される。
【0025】
なお更に、α６β２β３ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を特定するための方法であって、本方法が、ａ）上で提供される単離された組換え細胞を薬剤と接触させることと、ｂ）単離された組換え細胞のα６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を決定することであって、薬剤がα６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を増強する場合に、薬剤が、アゴニスト又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）であると特定され、薬剤が、単離された組換え細胞が薬剤と接触していなかった場合のα６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性と比較して、α６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を減少させる場合に、薬剤がアンタゴニストであると特定される、決定することと、を含む、方法が本明細書で提供される。
【0026】
上の方法の一実施形態では、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のカルシウム流（calcium flux）を決定することを含み、薬剤が、単離された組換え細胞が薬剤と接触していなかった場合のカルシウム流と比較して、カルシウム流を増強する場合に、薬剤がアゴニストであると特定される。
【0027】
上の方法の更なる実施形態では、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流（nicotine-evoked calcium flux）を決定することを含み、薬剤が、単離された組換え細胞が薬剤と接触していなかった場合のカルシウム流及びニコチン誘発性カルシウム流と比較して、カルシウム流を増強せず、かつニコチン誘発性カルシウム流を増強する場合に、薬剤が、ＰＡＭであると特定される。
【0028】
上の方法のなお更なる実施形態では、工程ｂ）は、単離された組換え細胞のニコチン誘発性カルシウム流を決定することを含み、薬剤が、単離された組換え細胞が薬剤と接触していなかった場合のニコチン誘発性カルシウム流と比較して、ニコチン誘発性カルシウム流を減少させる場合に、薬剤がアンタゴニストであると特定される。
【0029】
上で提供される方法のなお更なる実施形態では、単離された組換え細胞は、薬剤と接触する前に、約２５℃～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる。
【0030】
上で提供される方法のなお更なる実施形態では、薬剤は、小分子又はペプチドである。
【0031】
なお更に、（ｉ）上で提供される単離された組換え細胞と、（ｉｉ）使用説明書と、を含むキットが本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1A】シャペロンタンパク質の異なる組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共発現され、試験前に３０℃でインキュベートされた場合のα６β２β３ ｎＡＣｈＲの機能的発現を示すグラフである。
【図1B】シャペロンタンパク質の異なる組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共発現され、試験前に３７℃でインキュベートされた場合のα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲの機能的発現を示すグラフである。
【図1C】シャペロンタンパク質の異なる組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共発現され、試験前に３０℃でインキュベートされた場合のα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲの機能的発現を示すグラフである。
【図2A】様々な濃度でのＤＨｂＥ（α６含有ｎＡＣｈＲの既知のアンタゴニスト）との第１のインキュベーション及びニコチンとの第２のインキュベーションの後のα６／３β２β３を発現する組換え細胞のＦＬＩＰＲシグナルのプロットである。
【図2B】様々な濃度でのＭＬＡ（α６含有ｎＡＣｈＲの既知のアンタゴニスト）との第１のインキュベーション及びニコチンとの第２のインキュベーションの後のα６／３β２β３を発現する組換え細胞のＦＬＩＰＲシグナルのプロットである。
【図2C】様々な濃度でのメカミラミン（α６含有ｎＡＣｈＲの既知のアンタゴニスト）との第１のインキュベーション及びニコチンとの第２のインキュベーションの後のα６／３β２β３を発現する組換え細胞のＦＬＩＰＲシグナルのプロットである。
【図2D】様々な濃度でのαコノトキシンＭＩＩ（α６含有ｎＡＣｈＲの既知のアンタゴニスト）との第１のインキュベーション及びニコチンとの第２のインキュベーションの後のα６／３β２β３を発現する組換え細胞のＦＬＩＰＲシグナルのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0033】
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて、各種刊行物、論文及び特許が引用又は記載され、これらの参照文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の前後関係を与えるためのものである。このような考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0034】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。
【0035】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」及び「ｔｈｅ（その）」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意しなければならない。
【0036】
別途記載されない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、通常、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【0037】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0038】
本明細書で使用される場合、「含む（comprises）、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」という用語、又はこれらの任意の他の変形は、述べられている要素又は要素群を含むことが意図されるが、これら以外の他の要素又は要素群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に固有である他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって満たされる。
【0039】
本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は（and/or）」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される場合、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
【0040】
本明細書で使用される場合、「からなる（consists of）」という用語、又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された要素又は要素群を包含するが、追加の要素又は要素群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されないことを示す。
【0041】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる（consists essentially of）」という用語、又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択的に、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群を包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２ １１１．０３．を参照されたい。
【0042】
好ましい本発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【0043】
２つ若しくは３つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ若しくは３つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0044】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
【0045】
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときにマッチするか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（high scoring sequence pair、ＨＳＰ）を特定することを伴う。上記のＴは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
【0046】
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ又は２つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝３、期待値（Ｅ）＝１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい）。
【0047】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
【0048】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２の核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【0049】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ又は２つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。
【0050】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」という用語は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲートを包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
【0051】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0052】
単離された組換え細胞及び組換え細胞を作製する方法
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的には、細胞内で特定のシャペロンタンパク質とα６含有ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）（例えばα６β２β３ ｎＡＣｈＲ）とを同時発現させることにより、α６含有ｎＡＣｈＲを高度に発現する細胞が生成され、細胞を薬物開発に有用なものにするという予想外の知見に基づく。ｎＡＣｈＲのα６サブユニットを発現する組換え細胞及びｎＡＣｈＲのα６サブユニットの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、α６サブユニットは、その第２のＩＣＬが、ｎＡＣｈＲのα３サブユニットの第２のＩＣＬの対応する配列によって部分的又は完全に置き換えられていてもよく、これはα６／３キメラタンパク質と呼ばれてもよい。α６β２β３ ｎＡＣｈＲを発現する組換え細胞、及びα６β２β３ ｎＡＣｈＲの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法も、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、α６サブユニットは、上述のα６／３キメラタンパク質であってもよく、組換え細胞は、α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを発現する。
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的には、細胞内で特定のシャペロンタンパク質とα６含有ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）（例えばα６β２β３ ｎＡＣｈＲ）とを同時発現させることにより、α６含有ｎＡＣｈＲを高度に発現する細胞が生成され、細胞を薬物開発に有用なものにするという予想外の知見に基づく。ｎＡＣｈＲのα６サブユニットを発現する組換え細胞及びｎＡＣｈＲのα６サブユニットの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、α６サブユニットは、その第２のＩＣＬが、ｎＡＣｈＲのα３サブユニットの第２のＩＣＬの対応する配列によって部分的又は完全に置き換えられていてもよく、これはα６／３キメラタンパク質と呼ばれてもよい。α６β２β３ ｎＡＣｈＲを発現する組換え細胞、及びα６β２β３ ｎＡＣｈＲの発現のための単離された組換え細胞を作製する方法も、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、α６サブユニットは、上述のα６／３キメラタンパク質であってもよく、組換え細胞は、α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを発現する。
【0053】
本明細書で使用される場合、「α６β２β３ニコチン性アセチルコリン受容体」、「α６β２β３ ｎＡＣｈＲ」、「アルファ６ベータ２ベータ３ニコチン性アセチルコリン受容体」、及び「アルファ６ベータ２ベータ３ ｎＡＣｈＲ」という用語は、互換的に使用され、コリン作動性受容体のタンパク質ファミリーのメンバーであるα６β２β３ニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質、好ましくはヒトα６β２β３ ｎＡＣｈＲを指す。
【0054】
α６β２β３ ｎＡＣｈＲは、α６、β２及びβ３サブユニットから構成されるリガンド開口型イオンチャネルである。α６サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＡ６（ＮＭ＿００４１９８）によってコードされ、β２サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＢ２（ＮＭ＿０００７４８）によってコードされ、β３サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＢ３（ＮＭ＿０００７４９）によってコードされる。一緒に発現されると、サブユニットは、一緒に集合してα６β２β３ ｎＡＣｈＲを形成する。
【0055】
本発明によれば、α６β２β３ ｎＡＣｈＲという用語はまた、α６サブユニットの第２のＩＣＬが、ｎＡＣｈＲのα３サブユニットの第２のＩＣＬの対応するアミノ酸配列によって部分的又は完全に置き換えられている、キメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを包含する。一実施形態では、α６サブユニットの第２のＩＣＬの一部分は、ｎＡＣｈＲのα３サブユニットの第２のＩＣＬのアミノ酸配列によって置き換えられている。α３サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＡ３（ＮＭ＿０００７４３）によってコードされる。
【0056】
「組換え細胞」とは、細胞がタンパク質を異種性に発現している、１つ以上の個々の細胞、及び組換え細胞株を指す。本明細書中で使用される場合、細胞におけるタンパク質の「異種発現」とは、外因性核酸、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする外因性核酸を細胞に導入することによって、タンパク質を発現するように細胞を改変することを指す。「異種核酸」は、細胞内に導入される、細胞にとって外因性の核酸を指す。いくつかの実施形態では、異種核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、異種核酸は、ＲＮＡである。細胞におけるタンパク質の異種発現は、種々の方法を使用して達成されることができる。例えば、タンパク質の発現を駆動することができるプロモータ（例えば、構成的プロモータ）をコードする核酸に作動可能に連結されているタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを細胞内に導入してもよい。
【0057】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、全ての天然に存在する、転写後及び翻訳後修飾も更に包含する。
【0058】
一般的な態様では、本発明は、薬物開発に有用であるα６含有ｎＡＣｈＲ（例えば、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ、上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）を発現する細胞を作製又は生成する方法に関する。一実施形態では、本方法は、細胞に、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（キメラα６／３サブユニットを含む）をコードする核酸、β固定及びβ調節タンパク質（β-anchoring and -regulatory protein、ＢＡＲＰ、アクセッション番号：ＮＭ＿１５２７６９）をコードする核酸、スルホトランスフェラーゼファミリー２Ｂメンバー１（Sulfotransferase Family 2B Member 1、ＳＵＬＴ２Ｂ１、アクセッション番号：ＮＭ＿１７７９７３）をコードする核酸、リソソーム関連膜タンパク質５（lysosomal-associated membrane protein 5、ＬＡＭＰ５、アクセッション番号：ＮＭ＿０１２２６１）をコードする核酸、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（Choline O-Acetyltransferase、ＣＨＡＴ、アクセッション番号：ＮＭ＿０２０９８４）をコードする核酸、及び膜貫通タンパク質３５（transmembrane protein 35、ＴＭＥＭ３５、ＮＡＣＨＯとしても知られる、アクセッション番号：ＮＭ＿０２１６３７）をコードする核酸を導入することを含む。ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（キメラα６／３サブユニットを含む）及びシャペロンタンパク質（すなわち、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＣＨＡＴ、及びＮＡＣＨＯ）をコードする核酸は、発現ベクター中（例えば、単一の発現ベクター中又は別々の発現ベクター中）に存在し得る。いくつかの実施形態では、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（キメラα６／３サブユニットを含む）及びシャペロンタンパク質（すなわち、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＣＨＡＴ、及びＮＡＣＨＯ）をコードする核酸は、それぞれのタンパク質の発現を駆動することができるプロモータに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモータは、構成的プロモータである。
【0059】
別の態様では、本方法は、細胞に、α６β２β３ ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のキメラα６／３サブユニットを含む）をコードする核酸、α６β２β３ ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする核酸、α６β２β３ ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットをコードする核酸、ＢＡＲＰをコードする核酸、ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸、ＬＡＭＰ５をコードする核酸、ＣＨＡＴをコードする核酸、ＮＡＣＨＯをコードする核酸を導入することを含み、本方法によって生成された細胞は、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＣＨＡＴ、及びＮＡＣＨＯをコードする核酸を含まない同じ細胞と比較して、増加したレベルでα６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３ ｎＡＣｈＲを含む）を発現する。
【0060】
別の態様では、本発明は、ｎＡＣｈＲのα６（上述のキメラα６／３を含む）、β２、及びβ３サブユニット、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＣＨＡＴ、及びＮＡＣＨＯを発現するように遺伝子修飾された細胞であって、遺伝子修飾された細胞が、同じ（又は実質的に同じ）条件下での非修飾細胞における同じタンパク質の発現と比較して、増加したレベルでこれらのタンパク質を発現する、遺伝子修飾された細胞に関する。
【0061】
別の態様では、本発明は、ＢＡＲＰをコードする核酸配列を含む発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸配列を含む発現ベクター、ＬＡＭＰ５をコードする核酸配列を含む発現ベクター、ＣＨＡＴをコードする核酸配列を含む発現ベクター、及びＮＡＣＨＯをコードする核酸配列を含む発現ベクターからなる群から選択される少なくとも１つの発現ベクターを含む、単離された組換え細胞に関する。
【0062】
更なる態様では、本発明は、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のｎＡＣｈＲのキメラα６／３サブユニットを含む）をコードする異種核酸、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする異種核酸、ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットをコードする異種核酸、ＢＡＲＰをコードする異種核酸、ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする異種核酸、ＬＡＭＰ５をコードする異種核酸、ＣＨＡＴをコードする異種核酸、及びＮＡＣＨＯをコードする異種核酸を含む、単離された組換え細胞であって、α６（α６／３を含む）、β２、及びβ３サブユニットが、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（又はキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲ）を形成する、単離された組換え細胞に関する。一実施形態では、異種核酸は、発現ベクターの形態で組換え細胞に導入される。一実施形態では、本明細書に管理される単離された組換え細胞は、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のα６／３サブユニットをコードする核酸を含む）をコードする核酸を含む発現ベクター、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクター、ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクター、ＢＡＲＰをコードする核酸を含む発現ベクター、ＳＵＬＴ２Ｂ１をコードする核酸を含む発現ベクター、ＬＡＭＰ５をコードする核酸を含む発現ベクター、ＣＨＡＴをコードする核酸を含む発現ベクター、及びＮＡＣＨＯをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【0063】
本明細書に記載される実施形態の任意の１つでは、ｎＡＣｈＲのα６（α６／３を含む）、β２、及びβ３サブユニット、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＣＨＡＴ、及びＮＡＣＨＯのうちのいずれか１つ以上をコードする核酸は、単一の発現ベクター中にあってもよく、別々の発現ベクター中にあってもよい。
【0064】
一実施形態では、ｎＡＣｈＲのα６サブユニットは、配列番号１（ＮＭ＿００４１９８．２／ＮＰ＿００４１８９）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0065】
【化1】
【0066】
一実施形態では、α６サブユニットの第２のＩＣＬは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0067】
【化2】
【0068】
一実施形態では、ｎＡＣｈＲのα３サブユニットは、配列番号３（ＮＭ＿０００７４３．５／ＮＰ＿０００７３４．２）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0069】
【化3】
【0070】
一実施形態では、α３サブユニットの第２のＩＣＬは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0071】
【化4】
【0072】
一実施形態では、例示的なキメラα６／３は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５５、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0073】
【化5】
【0074】
一実施形態では、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットは、配列番号６（ＮＭ＿０００７４８．３／ＮＰ＿０００７３９．１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0075】
【化6】
【0076】
一実施形態では、ｎＡＣｈＲのβ３サブユニットは、配列番号７（ＮＭ＿０００７４９．５／ＮＰ＿０００７４０．１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0077】
【化7】
【0078】
一実施形態では、ＢＡＲＰは、配列番号８（ＸＭ＿０１７０２６５５５．１／ＸＰ＿０１６８８２０４４．１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＢＡＲＰは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のキメラα６／３サブユニットを含む）の発現を増強する特性を含む、タンパク質シャペル特性を有する。
【0079】
【化8】
【0080】
一実施形態では、ＳＵＬＴ２Ｂ１は、配列番号９（ＮＭ＿１７７９７３．２／ＮＰ＿８１４４４４．１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＳＵＬＴ２Ｂ１は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のキメラα６／３サブユニットを含む）の発現を増強する特性を含む、タンパク質シャペル特性を有する。
【0081】
【化9】
【0082】
一実施形態では、ＬＡＭＰ５は、配列番号１０（ＮＭ＿０１２２６１．４／ＮＰ＿０３６３９３．１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＬＡＭＰ５は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のキメラα６／３サブユニットを含む）の発現を増強する特性を含む、タンパク質シャペル特性を有する。
【0083】
【化10】
【0084】
一実施形態では、ＣＨＡＴは、配列番号１１（ＮＭ＿０２０９８４．４／ＮＰ＿０６６２６４．４）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＣＨＡＴは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のキメラα６／３サブユニットを含む）の発現を増強する特性を含む、タンパク質シャペル特性を有する。
【0085】
【化11】
【0086】
一実施形態では、ＮＡＣＨＯは、配列番号１２（ＮＭ＿０２１６３７．３／ＮＰ＿０６７６５０．１）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、ＮＡＣＨＯは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｎＡＣｈＲのα６サブユニット（上述のキメラα６／３サブユニットを含む）の発現を増強する特性を含む、タンパク質シャペル特性を有する。
【0087】
【化12】
【0088】
本明細書で開示される組換え細胞を調製するために、（例えば、ＤＮＡベクターを介した）ＤＮＡ形質移入及びＲＮＡ形質導入などの、異種核酸を細胞に導入するための任意の適切な手段を本明細書で使用することができる。一実施形態では、組換え細胞を生成するために細胞に導入される異種核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターを使用することによって調製される。用語「ベクター」は、連結されたもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を意味する。ベクターの代表的な一例であるプラスミドは、環状二本鎖ＤＮＡループを指し、追加のＤＮＡセグメントがこれに挿入され得る。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができるウイルスベクターである。発現ベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を指向することができるベクターである。本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態のタンパク質配列をコードする核酸を含む。したがって、発現ベクターは、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列（例えば、プロモータ）を含むことができる。発現ベクターに関して使用される場合、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）調節配列に連結されることを意味することが意図される。発現ベクターの設計は、ベクターの意図される用途のみならず、形質転換される宿主細胞の選択及び望ましいタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得るということを、当業者は理解するであろう。
【0089】
本開示を考慮して、プラスミド、コスミド、ファージベクター又はウイルスベクターなどの、当業者に知られている任意のベクターを使用することができる。一実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において知られており、本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った発現ベクターを生成することができる。
【0090】
本開示を考慮して、当業者に知られている任意の細胞を、ｎＡＣｈＲのα６（キメラα６／３を含む）、β２、β３サブユニット、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＣＨＡＴ、及びＮＡＣＨＯの組換え発現のために使用することができる。一実施形態では、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞及びＣｏｓ７細胞から選択されてもよい。
【0091】
α６β２β３ ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子を特定する方法
α６含有ｎＡＣｈＲ（例えば、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ、上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）のアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）を特定する方法が、本明細書で更に提供される。ＰＡＭは、活性部位以外のタンパク質表面上の部位で結合し、したがって、タンパク質結合部位の立体構造を変化させる化合物である。
α６含有ｎＡＣｈＲ（例えば、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ、上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）のアゴニスト、アンタゴニスト、又は正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）を特定する方法が、本明細書で更に提供される。ＰＡＭは、活性部位以外のタンパク質表面上の部位で結合し、したがって、タンパク質結合部位の立体構造を変化させる化合物である。
【0092】
一実施形態では、本方法は、本明細書に開示される単離された組換え細胞を、組換え細胞が成長する条件下で培養することと、組換え細胞を薬剤と接触させることと、薬剤が、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）のアゴニスト、アンタゴニスト、又はＰＡＭであるかどうかを決定することと、を含み、アゴニスト又はＰＡＭは、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）の活性を増強し、アンタゴニストは、薬剤と接触しなかった組換え細胞におけるα６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）の活性と比較して、α６β２β３ ｎＡＣｈＲの活性を減少させる。本明細書で使用される場合、アゴニストは、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）の機能を増強する働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、受容体を直接的に活性化させることなく、リガンドに対するα６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）の応答の効果を増強する分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「増強する」、「増強された」、「増加する」、又は「増加された」という用語は、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）活性に関して使用されるときに、アゴニスト又はＰＡＭが投与されていない細胞において観察された対応するシグナル伝達と比較して、受容体を介したシグナル伝達が増加していることを指す。本明細書で使用される場合、アンタゴニストは、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）の機能を遮断させ、減少させ、又は減衰させる働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。特定の実施形態では、薬剤は、小分子又はペプチドである。
【0093】
一実施形態では、ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）媒介性カルシウム流のアゴニストを特定する。このアッセイでは、組換え細胞は、カルシウム感受性色素（Ｃａ５など）と共にインキュベートされ、試験化合物に曝露され、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによってカルシウム流が画像化される。
【0094】
一実施形態では、ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、ニコチン誘発性α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）媒介性カルシウム流のアゴニストを特定する。このアッセイでは、組換え細胞は、カルシウム感受性色素（Ｃａ５など）と共にインキュベートされる。二重添加プロトコルを使用して、組換え細胞は、第１の期間中に試験化合物に曝露され、第２の期間中にニコチンに（例えば、ＥＣ８０（２３６ｎＭ）で）曝露される。その後、カルシウム流は、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化される。
【0095】
一実施形態では、ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、ニコチン誘発性α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）媒介性カルシウム流を正に調節又は強化する化合物を特定する。このアッセイでは、組換え細胞は、カルシウム感受性色素（Ｃａ５など）と共にインキュベートされる。二重添加プロトコルを使用して、組換え細胞は、第１の期間中に試験化合物に曝露され、第２の期間中にニコチンに（例えば、ＥＣ８０（２３６ｎＭ）で）曝露される。その後、カルシウム流は、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡによって画像化される。試験化合物が、ニコチン誘発性α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）媒介性カルシウム流を増強するが、（上述のように決定される）アゴニストとしてカルシウム流を増強しない場合、その試験化合物は、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）の正のアロステリック調節因子（ＰＡＭ）又は強化因子と呼ばれる。
【0096】
好ましい実施形態では、細胞は、ＦＬＩＰＲアッセイ、又はα６β２β３ ｎＡＣｈＲ（上述のキメラα６／３β２β３ ｎＡＣｈＲを含む）活性を測定するための他のアッセイの前に、約２５～３５℃で約２０～５０時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、細胞は、アッセイの前に、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃又は約３５℃で、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間又は約５０時間インキュベートされる。
【0097】
発現系及びキット
単離された組換え細胞を含む発現系及びキットが、本明細書において更に提供される。発現系及びキットは、使用説明書を更に含んでもよい。
単離された組換え細胞を含む発現系及びキットが、本明細書において更に提供される。発現系及びキットは、使用説明書を更に含んでもよい。
【実施例】
【0098】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【0099】
材料
【0100】
【表1】
【0101】
細胞株
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｒ７９００７）
ベクター構築物
・ｐｃＤＮＡ３．１－α６／３（α６／３キメラ、α６：１－３３８；４６５－５０５、α３：３３９－４６４）
・ｐＣＭＶ６－ＸＬ５－β２
・ｐｃＤＮＡ３．１－β３
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＢＡＲＰ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＮＡＣＨＯ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＵＬＴ２Ｂ１
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＡＭＰ５
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＨＡＴ
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｒ７９００７）
ベクター構築物
・ｐｃＤＮＡ３．１－α６／３（α６／３キメラ、α６：１－３３８；４６５－５０５、α３：３３９－４６４）
・ｐＣＭＶ６－ＸＬ５－β２
・ｐｃＤＮＡ３．１－β３
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＢＡＲＰ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＮＡＣＨＯ
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＵＬＴ２Ｂ１
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＡＭＰ５
・ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＨＡＴ
【0102】
培養培地
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地
・ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地
【0103】
形質移入試薬
・ＦｅｃｔｏＰＲＯ ＤＮＡ形質移入試薬
・ＦｅｃｔｏＰＲＯ ＤＮＡ形質移入試薬
【0104】
播種培地
・ＤＭＥＭ＋Ｌ－グルタミン＋ピルビン酸ナトリウム
・１０％ＦＢＳ
・１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
・ＤＭＥＭ＋Ｌ－グルタミン＋ピルビン酸ナトリウム
・１０％ＦＢＳ
・１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
【0105】
化合物希釈／Ｃａ５緩衝液
・１ｍＭのＭｇ２＋及び２ｍＭのＣａ２＋が補充されたＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液（５００ｍＬ）
・１ｍＭのＭｇ２＋及び２ｍＭのＣａ２＋が補充されたＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水溶液（５００ｍＬ）
【0106】
カルシウム５（Ｃａ５）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
・カルシウム色素をハンクス緩衝塩溶液中に２５倍濃度で希釈した。色素を、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で１倍に希釈した。
・カルシウム色素をハンクス緩衝塩溶液中に２５倍濃度で希釈した。色素を、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で１倍に希釈した。
【0107】
方法及び手順
１日目細胞調製
・細胞を遠心分離し、新鮮な予め加温された培地中に再懸濁することによって、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製する。形質移入の日に細胞密度を再調整する必要はない。
１日目細胞調製
・細胞を遠心分離し、新鮮な予め加温された培地中に再懸濁することによって、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製する。形質移入の日に細胞密度を再調整する必要はない。
【0108】
２日目形質移入
・以下のプロトコルは、例として１００ｍＬの形質移入を使用する。９０ｍＬの細胞を振盪しながら、１０ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地中で以下の形質移入混合物を調製する。
・ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）試薬を５秒間ボルテックス撹拌した後、７５μＬのＦｅｃｔｏＰＲＯ（全培養培地１ｍＬ当たり０．７５ｕＬの試薬）を空の５０ｍＬチューブに添加する。
・第２の５０ｍＬチューブで、５０μｇのＤＮＡ（全培養培地１ｍＬ当たり０．５μｇの総ＤＮＡ、全てのプラスミド１：１）をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地で最終体積１０ｍＬになるまで希釈する。穏やかにボルテックス撹拌する。
・希釈したＤＮＡを純粋なＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）試薬に全て一度に移す。溶液を直ちにホモジナイズし、室温で１０分間インキュベートする。
・１０ｍＬのＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）／ＤＮＡ形質移入混合物を細胞に移し、培養物をホモジナイズする。
・以下のプロトコルは、例として１００ｍＬの形質移入を使用する。９０ｍＬの細胞を振盪しながら、１０ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地中で以下の形質移入混合物を調製する。
・ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）試薬を５秒間ボルテックス撹拌した後、７５μＬのＦｅｃｔｏＰＲＯ（全培養培地１ｍＬ当たり０．７５ｕＬの試薬）を空の５０ｍＬチューブに添加する。
・第２の５０ｍＬチューブで、５０μｇのＤＮＡ（全培養培地１ｍＬ当たり０．５μｇの総ＤＮＡ、全てのプラスミド１：１）をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地で最終体積１０ｍＬになるまで希釈する。穏やかにボルテックス撹拌する。
・希釈したＤＮＡを純粋なＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）試薬に全て一度に移す。溶液を直ちにホモジナイズし、室温で１０分間インキュベートする。
・１０ｍＬのＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）／ＤＮＡ形質移入混合物を細胞に移し、培養物をホモジナイズする。
【0109】
３日目細胞を播種する
・細胞を３００×Ｇで５分間かけて沈降させ、上清を吸引し、１０ｍＬの播種培地に再懸濁する。
・５０μＬに２５，０００細胞／ウェルを播種する（５×１０５細胞／ｍＬ）。
・加湿雰囲気中、プレートを５％ＣＯ２、３０℃で２４時間インキュベートする。
・細胞を３００×Ｇで５分間かけて沈降させ、上清を吸引し、１０ｍＬの播種培地に再懸濁する。
・５０μＬに２５，０００細胞／ウェルを播種する（５×１０５細胞／ｍＬ）。
・加湿雰囲気中、プレートを５％ＣＯ２、３０℃で２４時間インキュベートする。
【0110】
４日目ＦＬＰＲアッセイ
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに２５μＬを残す。
・２５μＬの２倍のＣａ５色素を各ウェルに添加する。
・室温で１時間インキュベートする。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに２５μＬを残す。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに２５μＬを残す。
・２５μＬの２倍のＣａ５色素を各ウェルに添加する。
・室温で１時間インキュベートする。
・化合物希釈緩衝液を使用してプレート洗浄機でプレートを洗浄し（４回洗浄×１００μＬ／洗浄）、各ウェルに２５μＬを残す。
【0111】
アンタゴニスト
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。第１の添加プレート－２倍のアンタゴニスト（２５μＬの試験化合物）。第２の添加プレート－１倍のアンタゴニスト、３倍のアゴニスト（２５μＬのニコチンＥＣ８０）ＥＣ８０ニコチン２３６ｎＭ（２５μＬ、３倍＝７０８ｎＭ）。アンタゴニストの対照ウェルは、カラム２３及び２４にあった。陽性対照ウェルは、第１の添加においてＩＣ１００ ＤＨＢｅ（２５μＬ、３倍＝３０μＭ）を受け、陰性対照は、緩衝液（２５μＬ）を受けた。対照ウェルへの第２の添加は、ＩＣ１００ ＤＨＢｅ（１０μＭ）及びＥＣ８０ニコチン２３６ｎＭ（２５μＬ、３倍＝７０８ｎＭ）であった。
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。第１の添加プレート－２倍のアンタゴニスト（２５μＬの試験化合物）。第２の添加プレート－１倍のアンタゴニスト、３倍のアゴニスト（２５μＬのニコチンＥＣ８０）ＥＣ８０ニコチン２３６ｎＭ（２５μＬ、３倍＝７０８ｎＭ）。アンタゴニストの対照ウェルは、カラム２３及び２４にあった。陽性対照ウェルは、第１の添加においてＩＣ１００ ＤＨＢｅ（２５μＬ、３倍＝３０μＭ）を受け、陰性対照は、緩衝液（２５μＬ）を受けた。対照ウェルへの第２の添加は、ＩＣ１００ ＤＨＢｅ（１０μＭ）及びＥＣ８０ニコチン２３６ｎＭ（２５μＬ、３倍＝７０８ｎＭ）であった。
【0112】
アゴニスト
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。２倍のアゴニスト（２５μＬ）の単一添加プレート。アゴニストの対照ウェルは、カラム２３及び２４にある。陽性対照ウェルは、ＥＣ１００ニコチン（２５μＬ、２倍＝２μＭ）を受けた。陰性対照ウェルは、緩衝液＋ビヒクル（２５μＬ）を受けた。
・化合物添加のためにプレートをＦＬＩＰＲに移す。２倍のアゴニスト（２５μＬ）の単一添加プレート。アゴニストの対照ウェルは、カラム２３及び２４にある。陽性対照ウェルは、ＥＣ１００ニコチン（２５μＬ、２倍＝２μＭ）を受けた。陰性対照ウェルは、緩衝液＋ビヒクル（２５μＬ）を受けた。
【0113】
α６β２β３ ｎＡＣｈＲの機能的発現
ｎＡＣｈＲのヒトα６、β２、及びβ３サブユニットをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡの特定の組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共形質移入し、３７℃で一晩、続いて３０℃で２４～４８時間インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（１０μＭ）で刺激した。形質移入されたニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１Ａにグラフで示す。示されるように、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴによる共形質移入（「＋ＣＨＡＴ」として示される）は、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、及びＮＡＣＨＯによる共形質移入（「－ＣＨＡＴ」として示される）と比較して、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強する。
ｎＡＣｈＲのヒトα６、β２、及びβ３サブユニットをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡの特定の組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共形質移入し、３７℃で一晩、続いて３０℃で２４～４８時間インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（１０μＭ）で刺激した。形質移入されたニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１Ａにグラフで示す。示されるように、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴによる共形質移入（「＋ＣＨＡＴ」として示される）は、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、及びＮＡＣＨＯによる共形質移入（「－ＣＨＡＴ」として示される）と比較して、α６β２β３ ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強する。
【0114】
α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲの機能的発現
キメラα６／３並びにｎＡＣｈＲのヒトβ２及びβ３サブユニットをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡの特定の組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共形質移入し、３７℃で一晩インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（１０μＭ）で刺激した。形質移入されたニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１Ｂにグラフで示す。示されるように、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴによる共形質移入（「＋ＣＨＡＴ」として示される）は、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、及びＮＡＣＨＯによる共形質移入（「－ＣＨＡＴ」として示される）と比較して、α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強する。
キメラα６／３並びにｎＡＣｈＲのヒトβ２及びβ３サブユニットをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡの特定の組み合わせ（ＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ又はＢＡＲＰ＋ＳＵＬＴ２Ｂ１＋ＬＡＭＰ５＋ＮＡＣＨＯ＋ＣＨＡＴ）と共形質移入し、３７℃で一晩インキュベートした。形質移入された細胞をＣａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＥｍａｘニコチン（１０μＭ）で刺激した。形質移入されたニコチン誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１Ｂにグラフで示す。示されるように、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴによる共形質移入（「＋ＣＨＡＴ」として示される）は、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、及びＮＡＣＨＯによる共形質移入（「－ＣＨＡＴ」として示される）と比較して、α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強する。
【0115】
別個に、Ｃａ５色素とのインキュベーション及びニコチンによる刺激の前に、形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３０℃で２４～４８時間インキュベートした。形質移入されたニコチン（１０μＭ）誘発性Ｃａ２＋シグナルを図１Ｃにグラフで示す。ここで再び、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴによる共形質移入（「＋ＣＨＡＴ」として示される）は、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、及びＮＡＣＨＯによる共形質移入（「－ＣＨＡＴ」として示される）と比較して、α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を増強する。加えて、３０℃でインキュベートした形質移入細胞は、３７℃でインキュベートしたものよりもはるかに高いｎＡＣｈＲ機能（すなわち、ニコチン誘発性カルシウム流）を示し、これにより、α６含有ｎＡＣｈＲの調節因子についてのより強固なスクリーニングを可能にする。
【0116】
α６／３β２β３ ｎＡＣｈＲのニコチン誘発性活性に対するアンタゴニストの濃度応答曲線
上述のように、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴをコードする核酸と共に、ｎＡＣｈＲのα６／３、β２、及びβ３サブユニットをコードする核酸により形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３０℃で２４～４８時間インキュベートした。次いで、形質移入された細胞を、Ｃａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、その後、２回の添加プロトコル（第１の添加：種々の濃度のアンタゴニスト（すなわち、ＤＨｂＥ、ＭＬＡ、メカミラミン、又はα－コノトキシンＭＩＩ）を用いて３分間、第２の添加：ニコチン（ＥＣ８０、２３６ｎｍ）を用いて３．５分間）を使用して刺激した。次いで、ニコチン誘発性カルシウム流を、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡイメージャを使用して測定し、最終ＦＬＩＰＲシグナルを平均化し、プロットした（図２Ａ～２Ｄ）。示されるように、試験されたアンタゴニストの各々は、用量依存様式でニコチン誘発性カルシウム流を減少させる。
上述のように、ＢＡＲＰ、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＬＡＭＰ５、ＮＡＣＨＯ、及びＣＨＡＴをコードする核酸と共に、ｎＡＣｈＲのα６／３、β２、及びβ３サブユニットをコードする核酸により形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３０℃で２４～４８時間インキュベートした。次いで、形質移入された細胞を、Ｃａ５色素と共に室温で１時間インキュベートし、その後、２回の添加プロトコル（第１の添加：種々の濃度のアンタゴニスト（すなわち、ＤＨｂＥ、ＭＬＡ、メカミラミン、又はα－コノトキシンＭＩＩ）を用いて３分間、第２の添加：ニコチン（ＥＣ８０、２３６ｎｍ）を用いて３．５分間）を使用して刺激した。次いで、ニコチン誘発性カルシウム流を、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡイメージャを使用して測定し、最終ＦＬＩＰＲシグナルを平均化し、プロットした（図２Ａ～２Ｄ）。示されるように、試験されたアンタゴニストの各々は、用量依存様式でニコチン誘発性カルシウム流を減少させる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【配列表】
【国際調査報告】