特許 5719977 油脂成分を産生する方法、高級不飽和脂肪酸の製造方法、及びクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5719977

(24)【登録日】2015年3月27日

(45)【発行日】2015年5月20日

(54)【発明の名称】油脂成分を産生する方法、高級不飽和脂肪酸の製造方法、及びクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/64 20060101AFI20150430BHJP

   C12N 1/12 20060101ALI20150430BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150430BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/64ZNA

   C12N1/12 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2014-550560(P2014-550560)

(86)(22)【出願日】2014年3月17日

(86)【国際出願番号】JP2014057185

【審査請求日】2014年10月14日

(31)【優先権主張番号】特願2013-173417(P2013-173417)

(32)【優先日】2013年8月23日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第６５回日本生物工学会大会の講演要旨集 ６４及び６６頁 平成２５年９月１８日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第６５回日本生物工学会大会の発表ポスター 平成２５年９月１８日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-22266

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504150450

【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(73)【特許権者】

【識別番号】000002886

【氏名又は名称】ＤＩＣ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100094400

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 三義

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(72)【発明者】

【氏名】近藤 昭彦

(72)【発明者】

【氏名】蓮沼 誠久

(72)【発明者】

【氏名】賀 詩欣

(72)【発明者】

【氏名】皆川 純

(72)【発明者】

【氏名】西江 晴男

(72)【発明者】

【氏名】太郎田 博之

(72)【発明者】

【氏名】張 嘉修

【審査官】 櫛引 明佳

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１１−１９６８８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−３１６５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０６０８７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 E. S. SALAMA, et al.，Biomass, lipid content, and fatty acid composition of freshwater Chlamydomonas mexicana and Scenedes，Bioprocess Biosyst. Eng.，２０１３年，vol.36，p.827-833

【文献】 M. SIAUT, et al.，Oil accumulation in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii: characterization, variability be，BMC Biotechnology，２０１１年，vol.11, no.7，<URL: http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1472-6750-11-7.pdf>

【文献】 中西昭仁他，緑藻Chlamydomonas orbicularisを用いた海水塩存在下での油脂高生産条件の開発，日本生物工学会大会講演要旨集，２０１３年 ８月２５日，vol.65，p.64(1P-185)

【文献】 A. NAKANISHI, et al.，Development of lipid productivities under different CO2 conditions of marine microalgae Chlamydomona，Bioresource Technology，２０１４年，vol.152，p.247-252

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

藻類を培養することにより油脂成分を産生する方法において、
クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＳＣ４）ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６６株を、海水塩を含む培地で培養することを特徴とする油脂成分を産生する方法。

【請求項2】

海水塩を含む培地が、２２０ｎｍの波長において硝酸塩含有量を測定した場合、含有量が、１０ｍｇ/Ｌ以下である請求項１に記載の油脂成分を産生する方法。

【請求項3】

培地における海水塩の質量％が、０．５〜５質量％の範囲である請求項１又は２に記載の油脂成分を産生する方法。

【請求項4】

海水塩を含む培地が、海水、濃縮海水、又は人工海水を含むものである請求項１〜３のいずれか一項に記載の油脂成分を産生する方法。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の油脂成分を産生する方法により得られる油脂成分を加水分解することを特徴とする高級不飽和脂肪酸の製造方法。

【請求項6】

高級不飽和脂肪酸が、オレイン酸、又はリノレン酸である、請求項５に記載の高級不飽和脂肪酸の製造方法。

【請求項7】

油脂成分生産能を有するクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＳＣ４）ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６６株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は燃料や化学品原料等として有用な油脂成分の産生方法に関し、特にクラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類を、海水塩を含む培地で培養することを特徴とする油脂成分の産生方法に関する。

【背景技術】

【0002】

光合成生物は、光エネルギーを利用してＣＯ_２を固定する生物の総称であり、特に藻類は、培養条件が良好であれば光合成効率が高い光合成生物の一種である。藻類の工業的培養は半世紀以上にわたって行われており、工業原料、燃料、飼料及びファインケミカルの原料として、並びに健康食品としての需要があり、今後も藻類生産は産業上で重要な位置を占めると考えられる。

【0003】

藻類の培養過程において、ＣＯ_２を固定化する工程を通じて各種有用な炭素成分が産生されることから、藻類の培養、及び培養による各種炭素成分の産生検討が盛んに行われてきている。
今後、化石燃料の枯渇化が懸念されることから、代替燃料の早期の探索の必要性が高まり、また、需要者の健康志向の向上から、健康維持・向上に好ましい機能性化学品への需要が増加し、益々藻類の産生する有用成分への関心が高まってきている。

【0004】

従来、藻類を用いた、炭素成分の製造方法としては、例えば、燃料や化学品原料等として有用なエタノールの製造として、特許文献１には、海水の塩分濃度で生育して細胞内に澱粉を蓄積し、暗くかつ嫌気性雰囲気に保つことにより細胞内の澱粉よりエタノールを生産するクラミドモナス属に属する微細藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＴ−ＪＥ−ＳＨ−１について記載がある。上記課題を解決する手段として、（１）海水の塩分濃度で生育させて細胞内に澱粉を蓄積し、暗くかつ嫌気性雰囲気に保つことにより、細胞内の澱粉よりエタノールを生産するクラミドモナス属に属する微細藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＴ−ＪＥ−ＳＨ−１、及び（２）クラミドモナス属に属する微細藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＴ−ＪＥ−ＳＨ−１を海水の塩分濃度で培養して細胞内に澱粉を蓄積させた後、培養した藻体を含むスラリーを、ｐＨを６．０〜９．０の範囲に保ちながら暗黒かつ嫌気性雰囲気に保持してエタノールを生成させる方法が記載されている。

【0005】

また、油脂成分の製造方法としては、特許文献２には、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８７）であって、この微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む油脂を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記油脂を抽出したのち、その抽出物を加水分解する方法が記載されている。

【0006】

非特許文献１では、海生藻類を用いた油脂産生と培養時における塩濃度の関係を検討しており、塩濃度が初期濃度で１．５Ｍを超える場合には、藻類の生育が抑制され、０．５〜１．０Ｍの場合には、高い含有率で油脂が生成されることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特許第３８３７５８９号公報

【特許文献2】特許第４０８１７９４号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング，１０１巻、２２３-２２６ページ（２００６年）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ １０１，２２３−２２６（２００６））

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

以上の背景技術では、藻類が有用である炭素成分を産生するものの生産効率が低いものが多く、需要者の要請に十分に答えられるものではなく、生産効率の高い藻類を用いた有用炭素成分の産生方法の提供が待ち望まれていた。
そこで、本発明の課題は、上記背景技術に鑑み、藻類を用いた有用炭素成分の高効率の産生方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決するため、藻類の探索及び該藻類の培養方法について詳細に検討を行い、課題解決に至った。
即ち、本発明では、以下に記載の油脂成分を産生する方法、及び新規微細藻類を提供することにより、上記課題を解決するものである。

【0011】

［１］藻類を培養することにより油脂成分を産生する方法において、
クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＳＣ４）ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６６株を、海水塩を含む培地で培養することを特徴とする油脂成分を産生する方法。
［２］海水塩を含む培地が、２２０ｎｍの波長において硝酸塩含有量を測定した場合、含有量が、１０ｍｇ/Ｌ以下である[１]に記載の油脂成分を産生する方法。
［３］培地における海水塩の質量％が、０．５〜５質量％の範囲である[１]又は［２］に記載の油脂成分を産生する方法。
［４］海水塩を含む培地が、海水、濃縮海水、又は人工海水を含むものである[１]〜[３]のいずれか一つに記載の油脂成分を産生する方法。

【0012】

［５］[１]〜[４]のいずれか一つに記載の油脂成分を産生する方法により得られる油脂成分を加水分解することを特徴とする高級不飽和脂肪酸の製造方法。
［６］高級不飽和脂肪酸が、オレイン酸、又はリノレン酸である、[５]に記載の高級不飽和脂肪酸の製造方法。
［７］油脂成分生産能を有するクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＳＣ４）ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６６株。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、藻類を用いた有用炭素成分を高効率で産生することのできる方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の栄養型細胞（好適生育環境、豊富な栄養条件下で旺盛に増殖する状態の細胞）の顕微鏡写真である。

【図2】近縁クラミドモナス種の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較である。

【図3】近縁クラミドモナス種の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較である。

【図4】近縁クラミドモナス種の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較である。

【図5】ＯＤ_{２２０ｎｍ}と、硝酸塩濃度の関係を示す検量線である。

【図6】窒素十分条件下、及び窒素欠乏条件下で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株（Chlamydomonas sp. JSC4）の脂肪酸の組成分析の結果である。

【図7】異なる海水塩濃度で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株のＣＯ_２固定化能分析結果である。

【図8】異なる海水塩濃度で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株のＣＯ_２固定化能分析結果である。

【図9】異なる海水塩濃度で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株のＣＯ_２固定化能分析結果である。

【図10】異なる海水塩濃度で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株のＣＯ_２固定化能分析結果である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

［藻類］
本発明で用いられる藻類は、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類であることに特徴を有する。
クラミドモナスは、緑藻綱クラミドモナス目（もしくはオオヒゲマワリ目）に属する単細胞の鞭毛虫からなる属である。クラミドモナスの多くは淡水産であるが、海水中に生育するものもある。本発明の海生のクラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類とは、海産や汽水産及び海水塩を含む培地で生育可能なクラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類を言う。

【0016】

本発明で用いられるクラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類は、海生のものであれば、特に限定されない。
海水中には栄養源が存在するため、別途培地に栄養源を添加する必要がない。また、純水を用いる必要もない。更に、藻類の培養には糖源を必要としない。本発明の油脂成分を産生する方法は、コスト面においても優れている。
更に、培地中の塩濃度が高いため、培養液のコンタミネーションのおそれがない。本発明は、簡易にクラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類を培養でき、大量培養が可能で、大規模に油脂成分を産生できる点でも優れている。

【0017】

上記課題解決のため、本発明者らは目的とする油脂成分を高効率で産生する藻類の探索を行い、藻類としてクラミドモナス属の藻類が好ましいことを見出した。
更に、クラミドモナス属のなかでも、高効率に油脂成分を産生することから、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株（Chlamydomonas sp. JSC4）が特に好ましいことを見出し、本発明を完成させた。

【0018】

[クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株]
本発明で用いられるクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株（Chlamydomonas sp. JSC4）の分離精製は以下の手順により行った。
即ち、台湾中西部の海岸で採取した汽水試料から、常法により１細胞だけを単離し、無菌化した。これを、以下に組成を示すＨＳＭ寒天培地を用いて、２０℃、８〜１５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓｅｃ、１２時間明期１２時間暗期の光条件で培養し、２週間に１度植え継ぐことで藻株を確立し、形態観察その他よりクラミドモナス属の緑藻と同定して、ＪＳＣ４株と名づけた。

【0019】

【表1】

【0020】

クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の藻類学的性質は以下の通りである。クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の栄養型細胞（好適生育環境、豊富な栄養条件下で旺盛に増殖する状態の細胞）の顕微鏡写真を図１に示す。

【0021】

（形態的性質）
（１）栄養型細胞は、楕円形であり、大きさは、約１０μｍである。栄養型細胞において、細胞長の約等倍の鞭毛を２本有する。栄養型細胞は、運動性を有する。
（２）栄養型細胞は外囲を細胞壁に囲まれ、内部に核、葉緑体が一個存在し、その他、ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が認められる。葉緑体内の基底部にピレノイドを有する。

【0022】

（生殖様式）
（１）内生胞子は栄養細胞内に二〜八個形成され、細胞内に均等に分布する。内生胞子はその細胞内に核、葉緑体を一個有する。
（２）二分裂による増殖も行う。

【0023】

（生理学・生化学性状）
（１）培養液：海産や汽水産及び海水塩を含む培養液中で生育できる。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養生育ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロテノイド類。
（４）同化貯蔵物質：澱粉。
（５）生育温度域：１５℃〜３５℃（至適温度２５℃）。
（６）生育ｐＨ域：ｐＨ６．０〜１０．０（至適ｐＨは７．０）。

【0024】

以上の点から、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株は、形態観察その他よりクラミドモナス属の緑藻と同定した。
クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。図２〜図４は、近縁クラミドモナス種の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列を比較したものである。網掛けは、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の分子マーカー配列である。クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の最近縁種は、Chlamydomonas debaryanaであるが、分子マーカー配列に着目すれば同一種でないことは明らかである。このように、１８Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較の点から、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株を新規の微細藻類株と判断した。
クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株は、２０１４年３月５日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６６として国際寄託されている。

【0025】

[培地]
本発明では、クラミドモナス属に属する藻類を培養するにあたり培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、クラミドモナス属に属する藻類が生育する条件であれば制限はないが、海水塩を含む培地が、海水、濃縮海水、又は人工海水を含むものが油脂産生能を向上させることから、特に好ましい。
例えば、このような培地として、特に改変Ｂｏｌｄ ３Ｎ培地を好ましく用いることができる。
その他用いることのできる培地として、改変Ｂａｓａｌ培地、改変Ｂｒｉｓｔｏｌ培地、ＢＧ−１１培地、改変ＨＳＭ（Ｈｉｇｈ Ｓａｌｔ ｍｅｄｉｕｍ）培地などを挙げることができるが、高効率で油脂成分を産生できることから、改変Ｂｏｌｄ ３Ｎ培地が特に好ましい。

【0026】

本発明に用いられる培養の特徴として、窒素含有量が低い条件下での培養が挙げられる。
窒素含有量が低い条件下での培養は、増殖に伴う窒素消費による窒素欠乏状態下における培養であっても、藻体を窒素含有量が低い培地に移植させる等による培養であってもよい。
本発明において、培地中に含まれる窒素含有量は、培地中に含まれる硝酸塩の含有量を２２０ｎｍの波長で測定することにより評価することができる。
培地中に含まれる窒素含有量は、この方法に限定されるものではなく、 例えばイオンセンサーや発色試薬による吸光度測定などで、硝酸塩やアン モニウム塩の含有量を測定することにより評価することもできる。
測定法は、１９９９年にＣｏｌｌｏｓらによって報告された方法を改変して行った（文献：ジャーナル オブ アプライド ファイコロジー，１１巻、１７９−１８４ページ（１９９９年）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １１， Ｐ１７９−１８４ （１９９９））。
詳細な測定法は、下記実施例に記載する。

【0027】

本発明で使用された改変Ｂｏｌｄ ３Ｎ培地の組成を以下に記す。

【0028】

【表2】

【0029】

[海水塩]
本発明では、培地中の海水塩の濃度（培地全体に占める質量％）が、油脂成分の産生能に大きく影響を及ぼすことを見出した。よって、上記培地に最適濃度の海水塩を添加することで、油脂成分の産生効率を向上させることができる。
本発明で使用が可能な海水塩は、公知慣用の海水塩を挙げることができる。本発明で用いられる海水塩は、海水を蒸発乾固させて得られたものであっても、海水や海水の濃縮液を用いてもよいが、培地中に含まれる濃度を調整するためには、海水の固形分である海水塩を用いる方がより好ましい。

【0030】

また、人工海水も用いることができる。本発明で用いられる人工海水は、海水の組成を模して人工的に調整された粉末や濃縮液のことであり、海水を必要とする生物の飼育や培養において、入手性、再現性、廉価性などの理由から天然海水の代用となるものである。市販の人工海水を用いることができるが、市販の人工海水は塩化ナトリウムを主成分として、様々な無機塩類やｐＨ調整剤などが含まれており、用途により水道水や蒸留水で希釈することによって海水に近い成分となるものである。
その他、上記の海水塩等でなくても、本発明の目的に適う培地として使用が可能な塩を調整して用いることができる。

【0031】

本発明では、上記海水塩濃度が、油脂産生効率に大きく影響することを見出した。
藻類の油脂産生能（ｍｇ/Ｌ/ｄａｙ）で評価すると、好ましい海水塩濃度として、０．５〜５質量％を挙げることができ、中でも２．０〜５．０質量％の範囲が、目的とする油脂成分の含有量も高いことから、特に好ましい。
なお、藻類の大量培養を想定した場合には、海水を用いることに利便性があるが、塩化ナトリウムを用いても、油脂産生に対して同様の効果を有し、好ましく用いることができる。

【0032】

[培養方法]
本発明において、クラミドモナス属に属する藻類の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。
培養においては、本発明では前記培地を用いることができる。
本発明に用いる培養方法としては、静置培養法を用いることも可能であるが、藻類の藻体生産性と油脂成分の生産性を考えると、振盪培養法又は深部通気撹拌培養法による培養が好ましい。振盪培養は、往復振盪であっても、回転振盪であってもよい。培養温度としては、通常１５〜４０℃で藻体産生を行なうことが可能である。
上述のように海洋性微細藻類を、本発明の培養方法で培養すると、安定した増殖を示すばかりでなく、油脂成分の割合が高度に高いクラミドモナス藻類が得られる。
また、光条件は、光合成可能な条件下であれば特に制限はないが、連続光とすることが好ましい。

【0033】

培養終了後、粗油脂を得る方法としての培養液からの藻体の回収は、一般的な方法である遠心分離法や、濾紙及びガラスフィルターによる濾過法等により行なうことが可能である。このようにして回収した藻体は、そのままか、あるいは、凍結乾燥法、熱風乾燥法などにより乾燥藻体とすることができる。得られた藻体又はその乾燥藻体から、油脂成分を抽出することが可能である。

【0034】

本発明では、通常炭酸ガスを供給して行うことが好ましい。
炭酸ガスの供給法として、公知慣用の方法で行うことができ、例えば、培養液中に通気することにより、好適に炭酸ガスの供給を行うことができる。

【0035】

本発明で産生される油脂成分は、トリグリセリドであることに特徴を有する。
トリグリセリドは、グリセリンのアシル体であり、アルキルエステル化することにより、バイオディーゼル燃料としての利用が期待されている。
本発明においてトリグリセリドとして挙げられる化合物としては、グリセリンと脂肪酸とのエステル体であり、脂肪酸としては炭素数１０〜３０の高級飽和或いは不飽和脂肪酸である。

【0036】

また、本発明は、バイオディーゼル燃料として有用な高級不飽和脂肪酸の製造方法も提供する。
即ち、本発明の方法において得られる油脂成分を加水分解することにより、燃焼効率の高い高級不飽和脂肪酸を製造することができる。
燃焼効率の高い高級不飽和脂肪酸として、オレイン酸、又はリノレン酸を挙げることができ、燃焼効率が特に高いことから特にオレイン酸が好ましい。
上記高級不飽和脂肪酸を産生するための最適海水塩濃度の検討の結果、０．５〜５質量％が好ましく、特に好ましくは２．０〜５質量％の範囲を挙げることができる。

【0037】

[油脂の抽出方法]
藻体から油脂成分を抽出する方法としては、通常の油脂の抽出方法を用いることができ、特に、Ｆｏｌｃｈ法やＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に代表されるクロロホルム／メタノール系等の有機溶媒による一般的な抽出方法を用いることが可能であるが、これらに限らない。

【実施例】

【0038】

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0039】

（培養液中の藻濃度の測定）
フォトバイオリアクターからの液体試料を、予め精密に秤量した０．４５μｍ孔径のフィルターでろ過し、これを恒量になるまで凍結乾燥して精密に秤量した。ろ過前後のフィルター質量の差を、ろ過した液体試料量で割り、藻濃度を決定した。

【0040】

（培養液中の窒素含有量の測定）
フォトバイオリアクターからの液体試料を、０．２２μｍ孔径のフィルターでろ過し、蒸留水で２０倍に希釈した。硝酸塩含有量はＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を用いて、２２０ｎｍ（ＯＤ_２２０）の波長における光学濃度によって決定した。
即ち、ＯＤ_２２０における値を、図５に示すＯＤ_２２０と硝酸塩含有量の検量線を用いて、硝酸塩濃度を換算した。

【0041】

（藻体中の油脂成分の分析）
凍結乾燥した藻体１５ｍｇを、直径０．５ｍｍのガラスビーズ０．５ｇが入ったマイクロバイアルに取り、これに１ｍＬの０．５Ｍ濃度ＫＯＨ溶液を加えて、ビーズビーター式ホモジナイザーで４０分破砕処理した。処理液を７ｍＬの０．５Ｍ濃度ＫＯＨ溶液で共洗いしながら５０ｍＬ容耐熱ガラスビンに移して密栓し、ウオーターバス中で１００℃１５分間処理した。室温まで冷却後、８ｍＬの０．７Ｍ濃度ＨＣｌメタノール溶液と１０ｍＬの１４％（ｖ／ｖ）３フッ化ホウ素メタノール溶液（シグマ・アルドリッチ社）を加えて、再度ウオーターバス中で１００℃１５分間処理した。室温まで冷却後、４ｍＬの飽和食塩水と３ｍＬのｎ−へキサンを加えて、ボルテックスミキサーで５分間撹拌した。撹拌した液を５０ｍＬ容プラスチック遠沈管に移して７，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清１００μＬをエッペンドルフチューブに取り、８９０μＬのｎ−へキサンと１０μＬの内部標準物質（ペンタデカン酸メチル、シグマ社）を加えた後、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清をＧＣＭＳ分析装置で分析した。

【0042】

ＧＣＭＳ分析装置（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０Ｐｌｕｓ、島津製作所）には、ＤＢ−２３キャピラリーカラム（０．２５ｍｍφ×６０ｍ、０．１５μｍ膜厚、アジレント・テクノロジー社）を装着し、ヘリウムガスを毎分２．３ｍＬ流した。インジェクター、イオン源及びインターフェース温度は、それぞれ２３０、２３０及び２５０℃に設定し、カラム温度は、試料注入後１分間は５０℃で保持後に毎分２５℃で１７５℃まで昇温し、さらに毎分４℃で２３０℃まで昇温後５分間保持した。上記上清１μＬを注入して、スプリット比５：１でカラム分離して、脂肪酸メチルエステルの各成分を５０〜５００ｍ／ｚのフルスキャンモードで検出し、内部標準の添加量を基に定量して、これを油脂量とした。

【0043】

（ＣＯ_２固定化能の分析）
バイオマスの濃度（ｇ／Ｌ）の時間経過プロファイルを用いて、乾燥藻体重量当たりの時間プロットに対する増殖率を計算した。
バイオマス生産速度（Ｐ_{ｂｉｏｍａｓｓ}；ｍｇ／Ｌ／ｄ）は、以下の式で求められる。

【0044】

【数1】

【0045】

式中、ΔＸは、培養時間Δｔ（ｄ）におけるバイオマスの濃度（ｍｇ／Ｌ）の変化量を示す。
更に、ＣＯ_２固定化速度（Ｐ_ＣＯ２；ｍｇ／Ｌ／ｄ）は、以下の式で求められる。

【0046】

【数2】

【0047】

藻類のバイオマスの典型的な分子式として、ＣＯ_０．４８Ｈ_１．８３Ｎ_０．１１Ｐ_０．０１を用いた。
ＣＯ_２固定化率（％）は、以下の式で求められる。

【0048】

【数3】

【0049】

式中、Ｃ_{ＣＯ２，ｉｎｆｌｕｅｎｔ}及びＣ_{ＣＯ２，ｅｆｆｌｕｅｎｔ}は、それぞれＣＯ_２の流入濃度及び流出濃度を示す。

【0050】

（実施例１）
（培地の比較）
表３に組成を示した改変Ｂａｓａｌ培地、改変Ｂｒｉｓｔｏｌ培地、ＢＧ−１１培地、改変Ｂｏｌｄ ３Ｎ培地、改変ＨＳＭ（Ｈｉｇｈ Ｓａｌｔ ｍｅｄｉｕｍ）培地を各１リッター調製し、それぞれ容量１リッターのフォトバイオリアクターに仕込んでオートクレーブ滅菌した。各々のフォトバイオリアクターに、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株（Chlamydomonas sp. JSC4）を藻濃度が約１００ｍｇ／Ｌとなるよう接種し、室温、２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓｅｃの強度の蛍光灯光を２４時間連続照射、２％炭酸ガス含有空気を毎分５０ｍＬ通気、スターラーで２００ｒｐｍ撹拌、の条件で５．７日間培養した。
各培養液の油脂成分を分析した結果を、表４に示した。藻体中の油脂含量、培養液当りの油脂生産速度とも、改変Ｂｏｌｄ ３Ｎ培地が最も高かった。

【0051】

【表3】

【0052】

【表4】

【0053】

（実施例２）
（海水塩の添加効果）
表３に組成を示した改変Ｂｏｌｄ ３Ｎ培地のＳｅａ Ｓａｌｔ添加量を、０．５％、２％、３．５％、及び５％（ｗ／ｖ）とした培地を各1リッター調製し、それぞれ容量１リッターのフォトバイオリアクターに仕込んでオートクレーブ滅菌した。各々のフォトバイオリアクターに、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株（Chlamydomonas sp. JSC4）を藻濃度が約１００ｍｇ／Ｌとなるよう接種し、室温、２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓｅｃの強度の蛍光灯光を２４時間連続照射、２％炭酸ガス含有空気を毎分５０ｍＬ通気、スターラーで２００ｒｐｍ撹拌、の条件で１０日間培養した。

【0054】

いずれも、藻体の増殖とともに培養液中の硝酸塩含有量は低下し、１．９ないし２．７日間で１０ｍｇ／Ｌ以下になった。その後藻体中の油脂含量と油脂生産速度は、著しく増加した。特に海水塩の添加量が２％、３．５％、及び５％添加した場合、藻体中の油脂含量は５０％以上の高含量に達し、最大の油脂生産速度は１４０ｍｇ／Ｌ／ｄ以上と非常に高かった。

【0055】

【表5】

【0056】

（実施例３）
（窒素欠乏条件下での培養がバイオディーゼルの品質にもたらす効果）
バイオディーゼルの品質は、飽和脂肪酸に対する不飽和脂肪酸の割合で評価される。バイオディーゼル中の飽和脂肪酸含量は、高温下での酸化抑制に影響する。その一方、不飽和脂肪酸含量は、低温下での流動性に影響する。バイオディーゼル中の飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸が等量であることが、バイオディーゼルに、低温下及び高温下における良好な特性を付与するために重要である。脂肪酸のプロファイルは、培地中の栄養分、外気温、及び光強度から生じる環境ストレスに影響する。これらのストレスのうち、窒素欠乏条件は、藻類の脂肪代謝に影響する最も重要な因子である。
窒素十分条件下、及び窒素欠乏条件下で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株（Chlamydomonas sp. JSC4）の脂肪酸の組成を図６に示す。図６において、対照として、大豆油由来の脂肪酸の組成と比較している。クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株の培養条件は、実施例２と同様である。
図６に示すように、窒素欠乏条件下では、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株における脂肪の蓄積は、オレイン酸（Ｃ１８：１）が増加傾向にあり、リノレン酸（Ｃ１８：３）が減少傾向にあることが確認された。バイオディーゼルの特性によると、オレイン酸を高い割合で含有することにより、より良い酸化安定性と低い外気温下における適切な目詰まり点（ＣＦＰＰ）を備える。更に、欧州バイオ燃料規格（ＥＮ１４２１４）に基づくと、リノレン酸（Ｃ１８：３）の含有量は、最大１２％（ｍ／ｍ）に限定されている。よって、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株により生産される油脂は、バイオ燃料を製造するために適切な品質を有していることが確認された。
更に、図６に示すように、大豆油由来の脂肪酸の組成と比較して、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株は、高い飽和脂肪酸含有量と低い多価不飽和脂肪酸（ｎ≧２）含有量示した。一般的に油脂における飽和脂肪酸の高含有は、バイオ燃料に優れた流動性と密度をもたらす。一方、多価不飽和脂肪酸の低含有は、低い外気温下での酸化安定性の増加のみならず、適切な目詰まり点の付与をもたらす。よって、油脂において適切な脂肪酸のプロファイルを有するという観点から、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株は、バイオ燃料の製造に適切な株であることが確認された。

【0057】

（実施例４）
（海水塩と窒素源の制御が、クラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株のＣＯ_２固定にもたらす効果）
異なる海水塩濃度で培養したクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株のＣＯ_２固定化能を一定時間ごとに調べた。結果を図７〜図１０に示す。図７〜図１０に示すように、異なる海水塩濃度におけるＣＯ_２固定化率とＣＯ_２固定速度は、時間経過全般にわたり同様の傾向を示した。即ち、培養２−３日後に最高値に達した後、徐々に減少するベル型のカーブを示した。
図７〜図１０において、ＣＯ_２固定化率及びＣＯ_２固定速度の最大値は、海水塩の添加量が２％の条件下で得られ、それぞれ５４．９％及び１３１９．０ｍｇ／Ｌ／ｄであった。この優れたＣＯ_２固定能からクラミドモナス・スピーシーズＪＳＣ４株が、工業ガスを用いたＣＯ_２固定への実用的応用に対応しうる株であることが確認された。

【0058】

以上で説明した各実施態様における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。また、本発明は各実施態様によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

【産業上の利用可能性】

【0059】

本発明によれば、藻類を用いた有用炭素成分を高効率で産生できる。

【要約】

藻類を培養することにより油脂成分を産生する方法において、海生のクラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類を、海水塩を含む培地で培養することを特徴とする油脂成分を産生する方法。

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]