特許 5883386 タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、並びに、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5883386

(24)【登録日】2016年2月12日

(45)【発行日】2016年3月15日

(54)【発明の名称】タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、並びに、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160301BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20160301BHJP

   C07K 17/14 20060101ALI20160301BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20160301BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20160301BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12P21/02 C

   C07K17/14

   G01N37/00 102

   G01N33/53 D

【請求項の数】12

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2012-530714(P2012-530714)

(86)(22)【出願日】2011年8月25日

(86)【国際出願番号】JP2011069210

(87)【国際公開番号】WO2012026541

(87)【国際公開日】20120301

【審査請求日】2014年8月12日

(31)【優先権主張番号】特願2010-258302(P2010-258302)

(32)【優先日】2010年11月18日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2010-191060(P2010-191060)

(32)【優先日】2010年8月27日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、ＣＲＥＳＴ事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000004112

【氏名又は名称】株式会社ニコン

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(72)【発明者】

【氏名】一木 隆範

(72)【発明者】

【氏名】ビヤニ マニッシュ

(72)【発明者】

【氏名】塩野 博文

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−２５３２４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０５３５９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０４６５２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Curr. Opin. Biotechnol.，２００８年，vol.19, no.1，pp.4-9

【文献】 Nat. Methods，２００８年，vol.5, no.2，pp.175-177

【文献】 J. Nanosci. Nanotechnol.，２００６年，vol.6, no.8，pp.2237-2264

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １７／００−１７／１４

Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、
（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するように基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、
（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とするタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項2】

前記タンパク質又はペプチドは、固相結合部位としてのアミノ酸配列を含み、前記基板は前記アミノ酸配列に親和性を有する固相結合部位認識部位を有する請求項１に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項3】

前記固相結合部位認識部位は、ニッケルイオン又はコバルトイオンである請求項２に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項4】

前記アミノ酸配列は、ポリヒスチジンである請求項２又は３に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項5】

（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と、ビオチン化ピューロマイシン誘導体と、無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、
（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するようにアビジンで修飾された基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、
（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とするタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項6】

前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物である請求項５に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【化1】

［式中、Ｚは、下記式（２）、（３）、又は（４）で表される基である。］

【化2】

［式中、Ｘ^１及びＸ^２のうち少なくとも一方は、下記式（５）で表される基であり、他方は、蛍光基又は水素原子である。＊は結合部位を表す。］

【化3】

［式中、＊は結合部位を表す。］

【請求項7】

Ｚは、前記式（２）で表される基である請求項６に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項8】

前記無細胞タンパク質合成系は、独立に精製されたタンパク質合成に必要な因子のみからなる請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項9】

前記工程（ａ）において、前記核酸は固相結合部位で修飾されたＤＮＡであり、固相結合部位認識部位で修飾された磁気ビーズにより固定化されたものである請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項10】

前記工程（ａ）において、前記核酸はビオチンで修飾されたＤＮＡであり、ストレプトアビジンで修飾された磁気ビーズにより固定化されたものである請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いることを特徴とするタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。

【請求項12】

請求項１１に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法を用いて、タンパク質アレイ又はペプチドアレイを製造した後、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドの機能性スクリーニングを行い、前記機能性スクリーニングにより特定された、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドを、前記工程（ａ）において対応する微小凹部内の核酸を用いて同定することを特徴とする機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、これらの方法により製造されたアレイ、並びに、該アレイを用いた機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法に関する。本願は、２０１０年８月２７日に、日本に出願された特願２０１０−１９１０６０号、及び２０１０年１１月１８日に、日本に出願された特願２０１０−２５８３０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

近年、基板への分子パターニング方法は、バイオチップやバイオセンサーといった様々な生物学的用途に用いられている。

【0003】

特に、サブマイクロオーダーでの大面積パターニングが可能なマイクロコンタクトプリント法（以下、μＣＰ法）が注目を集めている。μＣＰ法は、ホトリソグラフィックパターニングに必要な強酸や強塩基を必要としないため、タンパク質や他の生体分子のパターニングに適用されている。

【0004】

しかしながら、タンパク質や他の生体分子は、変性や分解を受けやすいものであるため、上記μＣＰ法においても様々な改良が行われてきている（例えば、非特許文献１）。
非特許文献１で提案されている方法は、プリントに用いるシリコンゴムを低温プラズマ処理し、シリコンゴム表面の親水性を増加させたものである。これにより、タンパク質等の生体分子の変性等が抑制される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｊａｍｅｓら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１４巻、第７４１〜７４４頁、１９９８年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、非特許文献１で提案されている方法は、凸版印刷技術を利用したものであり、タンパク質等の生体分子を直接プリンティングする方法であるため、インクとして用いられる該タンパク質は乾燥しやすく、例えば保存安定性の低いタンパク質をプリンティングする方法としては改良の余地がある。

【0007】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、保存安定性の低いタンパク質又はペプチドに与えるダメージを低減し、前記タンパク質又はペプチドを任意の形状にプリントすることができるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、これらの方法により製造されたアレイ、並びに、該アレイを用いた機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、凹版印刷（インタリオプリンティング）技術を応用することにより課題を解決できることを見出した。

【0009】

すなわち本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するように基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記タンパク質又は前記ペプチドは、固相結合部位としてのアミノ酸配列を含み、前記基板は前記アミノ酸配列に親和性を有する固相結合部位認識部位を有することが好ましい。
（３）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記固相結合部位認識部位は、ニッケルイオン又はコバルトイオンであることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記アミノ酸配列は、ポリヒスチジンであることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と、ビオチン化ピューロマイシン誘導体と、無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するようにアビジンで修飾された基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
（６）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物であることが好ましい。

【化1】

［式中、Ｚは、下記式（２）、（３）、又は（４）で表される基である。］

【化2】

［式中、Ｘ^１及びＸ^２のうち少なくとも一方は、下記式（５）で表される基であり、他方は、蛍光基又は水素原子である。＊は結合部位を表す。］

【化3】

［式中、＊は結合部位を表す。］
（７）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、Ｚは、前記式（２）で表される基であることが好ましい。
（８）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記無細胞タンパク質合成系は、独立に精製されたタンパク質合成に必要な因子のみからなることが好ましい。

【0010】

（９）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記工程（ａ）において、前記核酸は固相結合部位で修飾されたＤＮＡであり、固相結合部位認識部位で修飾された磁気ビーズにより固定化されたものであることが好ましい。
（１０）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記工程（ａ）において、前記核酸はビオチンで修飾されたＤＮＡであり、ストレプトアビジンで修飾された磁気ビーズにより固定化されたものであることが好ましい。
（１１）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法は、前記タンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いることを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様における機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、前記タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法を用いて、タンパク質アレイ又はペプチドアレイを製造した後、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドの機能性スクリーニングを行い、前記機能性スクリーニングにより特定された、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドを、前記工程（ａ）において対応する微小凹部内の核酸を用いて同定することを特徴とする。

【発明の効果】

【0011】

本発明のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、保存安定性の低いタンパク質やペプチドにダメージを与えずに、前記タンパク質又は前記ペプチドが任意の形状にプリントされたタンパク質アレイ又はペプチドアレイが得られる。
本発明によれば、前記タンパク質アレイ又は前記ペプチドアレイを高密度化することも可能であり、かかる高密度タンパク質アレイ又は高密度化ペプチドアレイは、膨大な種類のタンパク質又はペプチドが固定化されているだけではなく、１スポット当たりに多分子数のタンパク質又はペプチドが固定化されたものであるため、利用価値が高い。
また、本発明の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、高密度化タンパク質アレイ又はペプチドアレイから所望の機能を有するタンパク質又はペプチドを迅速に同定することができるため、進化分子工学的用途に好適に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図1B】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図1C】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図2A】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図2B】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図2C】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図2D】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図2E】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図3A】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図3B】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図3C】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図4A】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図4B】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図4C】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図4D】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図4E】本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。

【図5】実施例において、磁気ビーズを封入した凹版の顕微鏡像である。

【図6】実施例におけるＧＦＰ−Ｈｉｓタグタンパク質をパターニングしたガラス基板の蛍光顕微鏡像である。

【図7】実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。

【図8】実施例におけるＧＦＰタンパク質をパターニングしたスライドガラスの蛍光画像である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

≪タンパク質又はペプチドのプリンティング方法≫
［第１実施形態］
図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、
（ａ）特定の開口形状を有する複数の微小凹部２からなるマイクロ凹版１において、前記微小凹部２内に、核酸３と無細胞タンパク質合成系９を用意する工程と、
（ｂ）前記微小凹部２中で合成される後記タンパク質又はペプチド７と接触するように基板５を前記マイクロ凹版１と重ね合わせる工程と、
（ｃ）前記微小凹部２内において、前記無細胞タンパク質合成系９を用いて前記核酸３からタンパク質又はペプチド７を合成し、前記タンパク質又はペプチド７を前記基板５上に、前記微小凹部２が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
以下、図２Ａ〜図２Ｅを参照しながら、各工程について説明する。

【0014】

工程（ａ）は、特定の開口形状を有する微小凹部１２からなるマイクロ凹版１１において、前記微小凹部１２内に、核酸と無細胞タンパク質合成系１９を用意する工程である。

【0015】

前記マイクロ凹版１１は、複数の微小凹部１２からなることが好ましい。本実施形態においては、個々に壁を有する微小凹部１２からなるマイクロ凹版１１を用いるため、基板１５へのタンパク質又はペプチド１７のプリントの際に、各スポット間のリーク等の心配が無く、微細な形状のパターン印刷が可能となり、後記する工程（ｃ）において、前記微小凹部１２の有する特定の開口形状がそのまま基板１５上にプリントされ、スポット形状に反映される。
よって、該形状により、高密度化タンパク質アレイ１８の製造が可能となる。更に、基板１５上のスポット形状は、前記微小凹部１２の開口形状に依存するため、本実施形態においては、任意の形状にて基板１５上のスポット形状を決めることができる。
また、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化するＤＮＡの分子数には制限があるのに対し、本実施形態においては、マイクロ凹版１１上に多分子数のＤＮＡを添加することができるため、後記する無細胞タンパク質合成系を用いることにより、多分子数のタンパク質を合成することができ、１スポット当たり多分子数のタンパク質を固定化したタンパク質アレイを作製することができる。また、本実施形態では、微小凹部１２からなるマイクロ凹版１１を用いるため、転写段階と翻訳段階とを１度に行うことができ、効率的である。

【0016】

マイクロ凹版１１の表面及び微小凹部１２内壁を、ＤＮＡ等生体分子の非特異吸着防止用ブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）で好適にコーティングすることができる。かかるブロッキング剤をコーティングすることで、基板表面や微小反応槽の内壁への生体分子の非特異吸着を抑制することができる。

【0017】

マイクロ凹版１１に用いられる基板材料は、透明なガラス又はポリマー材であることが好ましく、リークを抑える目的からは、ポリジメチルシロキサンなどのエラストマー材料であることがより好ましい。なお、マイクロ凹版１１に用いられる基板材料にエラストマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が凹版と基板１５との間に挟まれた時に生じる凹版全体の基板との密着性に及ぼす悪影響がエラストマーの局所的な変形により回避される利点がある。

【0018】

工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意される核酸は、プリンティングに用いられるタンパク質又はペプチドをコードするものであれば特に限定されないが、ＤＮＡ又はｍＲＮＡが好ましく、取り扱い安さの観点からＤＮＡであることが好ましい。
該ＤＮＡは、マイクロ凹版１１において、該ＤＮＡの位置情報が特定されている必要性の観点から固定化されていることが好ましい。
固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、ＤＮＡをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。この場合、アビジンを固相に固定化し、ビオチンをＤＮＡに結合させたものが好ましい。

【0019】

前記固相は、後にＤＮＡを回収する観点から、ビーズであることが好ましく、短時間でマイクロ凹版１１中の各微小凹部１２に配列させることが可能であるという観点から磁気ビーズであることがより好ましい。
また、ビーズを用いる場合には、基板上にＤＮＡを固定する場合より多分子数のＤＮＡを固定することができる。かかるＤＮＡの分子数は、無細胞タンパク質合成系を用いて合成されるタンパク質の分子数に反映されるため、本実施形態によれば、ＤＮＡマイクロアレイからタンパク質アレイを作製する方法よりも１スポット当たりに多分子数のタンパク質を固定することができる。

【0020】

本実施形態において、固相として磁気ビーズを用いる場合には、マイクロ凹版１１に用いられる基板材料下に、磁性体板が配設されていることが好ましい。
かかる構造のマイクロ凹版１１を用いることにより、微小凹部１２内に磁気ビーズ１４を容易にかつ確実に配置することができる。具体的には、該基板材料の下部に磁石を配置し、該基板材料上にＤＮＡ１３を固定した磁気ビーズ１４を分散させた分散液を滴下する。磁気ビーズ１４及び磁性体薄膜による磁力の作用により、微小凹部１２内へ磁気ビーズが誘引されることにより配置されやすくなる。さらに磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで磁気ビーズ１４が分散し、微小凹部１２内への充填率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００〜１００００ガウスである。
また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズ１４は安定した配置を保持し続けることが可能となる。

【0021】

かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができ、本実施形態においては残留磁化の大きな磁性材料を用いることが好ましい。

【0022】

磁気ビーズ１４の微小凹部１２への充填率は微小凹部１２の直径に依存し、微小凹部１２の直径が磁気ビーズ１４の直径よりも若干広い方が充填率が高く、好ましくは微小凹部１２の径は磁気ビーズの直径の１〜２倍である。また、１個の微小凹部１２に１個の磁気ビーズ１４を充填する上で、微小凹部１２の深さは、好ましくは磁気ビーズ１４の直径の１〜２倍である。

【0023】

微小凹部１２は、親水化されていることが好ましく、該微小凹部１２を酸素プラズマ照射などにより親水化処理することにより、微小凹部１２内部への磁気ビーズを分散させた液の充填が容易になり、充填率が向上する。

【0024】

本実施形態において、微小凹部１２内に核酸を用意する際には、ＤＮＡライブラリーなど複数種類のＤＮＡの混合物をＤＮＡ増幅試薬と混合し、混合物を適当なバッファーなどで希釈して、微小凹部１２に分注してもよい。また、ＤＮＡライブラリーとしては、進化分子工学的用途に好適に用いられるものとして、遺伝子変異が導入された変異ＤＮＡライブラリーを用いてもよい。ここで、各微小凹部１２に確率的にＤＮＡが１分子になるように希釈して分注を行うことが好ましい。ＤＮＡと増幅試薬と希釈との前後は特に限定するものではなく、分注後、ＤＮＡが増幅するのに適するように、マイクロ凹版１１の条件を設定し、反応を行わせると、微小凹部１２毎に異なる種類のＤＮＡが増幅される。
ここで、ＤＮＡを増幅する場合、ＰＣＲ反応を利用することが好ましく、該反応のために必要な反応溶液な市販のものを使用することができる。また、微小凹部１２内のＤＮＡをビーズに固定する場合、ＤＮＡにビオチンが取り込まれるように増幅反応を行わせ、アビジンでコートしてビーズを用いれば、アビジン−ビオチン結合を介して、ＤＮＡは容易にビーズ上に固定化することができる。ＤＮＡにビオチンを取り込ませる方法としては、例えば、ビオチン標識したＰＣＲプライマーを用いる方法などを利用することができる。

【0025】

工程（ｂ）は、前記微小凹部１２中で合成される後記タンパク質又はペプチド１７と接触するように基板１５を前記マイクロ凹版１１と重ね合わせる工程である。
前記工程（ｂ）は、版の凹んだ部分にインクをいれ、上から紙などを押し当てる凹版印刷（インタリオプリンティング）技術を利用したものである。前記工程（ｂ）は、マイクロ凹版１１上の凹部である微小凹部１２に反応溶液を滴下し、上から基板１５を前記マイクロ凹版１１と重ね合わせ、ハンドプレス器等を用いて、押し当てる工程であり、後記工程（ｃ）において、基板１５上にタンパク質又はペプチド１７がプリントされる。よって、微小凹部１２の有する特定の開口形状がそのまま基板１５でのスポットの形状に反映されることになるため、本実施形態によれば、基板に任意のサイズ及び形状のタンパク質又はペプチドを印刷することができる。従って、該形状が微細であれば、転写されるスポットの形状も微細なものとなる。かかる微細な形状により、高密度化したタンパク質アレイ又はペプチドアレイの作製が可能となる。

【0026】

更に、後記工程（ｃ）により、配列上に固定化された核酸の位置情報を変更することなく、該核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、該タンパク質又は該ペプチドを基板上にプリントすることができる。

【0027】

前記微小凹部１２が有する前記開口形状は任意であるが、少なくとも１つのビーズを充填可能な形状であることが好ましい。例えば、前記微小凹部１２が有する前記開口形状は、円形状、四角状、六角状、ライン状、などであってもよい。

【0028】

前記工程（ｂ）において用いられる基板１５としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。
本実施形態においては、マイクロ凹版１１と重ね合わせる基板１５の表面は必ずしも平坦である必要はなく、例えば、タンパク質又はペプチド１７を固定する表面積を増やすために凹凸を加工してもよい。ただし、基板１５とマイクロ凹版１１を重ね合わせた際に、マイクロ凹版１１上の全ての微小凹部１２内の試薬等の漏れがなく封じられるように、マイクロ凹版１１が接触する部分の基板表面は平坦である必要がある。

【0029】

工程（ｃ）は、前記微小凹部１２内において、前記無細胞タンパク質合成系１９を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチド１７を合成し、前記タンパク質又はペプチド１７を前記基板１５上に、前記微小凹部１２が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程である。

【0030】

無細胞タンパク質合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。かかる翻訳効率の観点から、本実施形態においては、無細胞タンパク質合成系として、再構成型無細胞タンパク質合成系を用いることが好ましい。
このような系を用いることにより、前記微小凹部１２内においてタンパク質又はペプチド１７が製造される。

【0031】

合成されるタンパク質は、分解や変性により失活しやすいため、基板へのプリントの際にはできるだけ安定な状態で該タンパク質を維持する必要がある。本実施形態においては、微小凹部１２内で合成したタンパク質１７を、そのまま基板１５にプリントするため、タンパク質の失活を極力抑えたアレイ１８を作製することができる。

【0032】

前記工程（ｃ）において、無細胞タンパク質合成系１９に用いられる核酸がＤＮＡ１３である場合には、無細胞タンパク質転写系を用いて前記ＤＮＡ１３からｍＲＮＡ１６を合成する工程が含まれる。前記ｍＲＮＡ１６は、スクリーニングすべきタンパク質をコードする固定化されたＤＮＡ１３から、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
転写反応及び後述する翻訳反応を最適な状態で行わせるために、マイクロ凹版１１の温度、微小凹部１２内のｐＨ条件などを制御する他の装置などを組み合わせて、実施してもよい。
また、簡便であることから、転写翻訳がカップルした系を用いてもよい。

【0033】

工程（ｃ）において、前記タンパク質又はペプチド１７の合成に続いて、前記タンパク質又はペプチドの基板１５への固定化が行われる。具体的には、工程（ａ）において、マイクロ凹版１１上の微小凹部１２に、必要な試薬や材料（核酸）を添加した後に、工程（ｂ）において、基板１５を用いて上からマイクロ凹版１１に封をし、密閉状態にする。工程（ｃ）において、試薬を混ぜた先から、ＤＮＡ１３→ｍＲＮＡ１６→タンパク質１７の一連の転写／翻訳反応が進行し、さらに翻訳されたタンパク質１７の有するタグが前記基板１５に結合する。

【0034】

本実施形態において、タンパク質又はペプチドを基板に固定するため、前記タンパク質又は前記ペプチドは、固相結合部位としてのアミノ酸配列を含み、前記基板は前記アミノ酸配列に親和性を有する固相結合部位認識部位を有することが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジン／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジン／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、使い勝手の良さからポリヒスチジン／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオンの組合せが最も好ましい。
ポリヒスチジンとしては、ヘキサマー以上のものが好ましく用いられる。タンパク質又はペプチド中にポリヒスチジンを含ませるためには、ＰＣＲ等で予めｃＤＮＡの末端に該ポリヒスチジンをコードする塩基配列を付加しておくことが好ましい。
また、上記の固相結合部位認識部位は、該基板上において、所定ピッチの円形状や四角状のパターン、所定ピッチのラインパターン、又はそれらの組み合わせパターン、などの所定パターンに基づいて形成されていてもよい。この場合、上述のタンパク質又はペプチドは、基板にパターンニングされた固相結合部位認識部位のパターンに応じて、任意のサイズ及び形状で印刷される。

【0035】

次に、重ね合わせた前記基板１５を前記マイクロ凹版１１から剥がす（工程ｄ）。前記基板１５でのスポットの形状は、前記微小凹部１２の有する特定の開口形状がそのまま反映されたものである。さらに、前記基板１５上のスポットは、対応するマイクロ凹版１１上に固定化されたＤＮＡ１３の位置情報を変更することなくプリントされたものである。

【0036】

このようにしてタンパク質又はペプチド１７が固定化された基板１５をＰＢＳ等で洗浄して、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ１８が製造される（工程ｅ）。

【0037】

［第２実施形態］
図３Ａ〜図３Ｃに示されるように、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、
（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部２からなるマイクロ凹版１において、前記微小凹部２内に、核酸３と、ビオチン化ピューロマイシン誘導体１０と、無細胞タンパク質合成系９を用意する工程と、
（ｂ）前記微小凹部２中で合成される後記タンパク質又はペプチド７と接触するようにアビジンで修飾された基板５を前記マイクロ凹版１と重ね合わせる工程と、
（ｃ）前記微小凹部２内において、前記無細胞タンパク質合成系９を用いて前記核酸３からタンパク質又はペプチド７を合成し、前記タンパク質又はペプチド７を前記基板５上に、前記微小凹部２が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
以下、図４Ａ〜図４Ｅを参照しながら、各工程について説明する。図４Ａ〜図４Ｅにおいて、図２Ａ〜図２Ｅのタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。

【0038】

工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意される核酸としては、固相に固定化されたＤＮＡが好ましい。固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましく、アビジンを固相に固定化し、ビオチンをＤＮＡに結合させた方法がより好ましい。

【0039】

工程（ｂ）において用いられる基板１５はアビジンで修飾されており、後記工程（ｃ）において、ビオチン化された合成タンパク質又はペプチド１７を固定することができる。ここで、基板１５の修飾に用いられるアビジンとしては、使い勝手の良さからストレプトアビジンが好ましい。

【0040】

本実施形態において、ビオチン化ピューロマイシン誘導体１０とは、ピューロマイシンとビオチン化されたヌクレオチドの複合体である。ピューロマイシンは、３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造が類似している化合物であり、翻訳系においてタンパク質の合成がされた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する性質を有する。そのため、本実施形態においては、タンパク質又はペプチド合成の際、工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意されたビオチン化ピューロマイシン誘導体１０が、合成されたタンパク質又はペプチド１７のＣ末端に結合する。

【0041】

本実施形態において、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体は、前記一般式（１）で表される化合物であることが好ましい。前記一般式（１）において、Ｚは、前記式（２）、（３）、又は（４）で表される基である。
即ち、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体としては、デオキシシチジルピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンがビオチン化された誘導体がより好ましい。
更に、前記一般式（１）において、Ｚは、前記式（２）で表される基であることが好ましく、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体としては、下記式（６）で表されるビオチン化デオキシシチジルピューロマイシン誘導体であることが特に好ましい。

【0042】

【化4】

［式中、Ｘ^１及びＸ^２のうち少なくとも一方は、下記式（５）で表される基であり、他方は、蛍光基又は水素原子である。］

【0043】

【化5】

［式中、＊は結合部位を表す。］

【0044】

前記式（２）〜（４）、（６）中、Ｘ^１及びＸ^２のうち少なくとも一方は、前記式（５）で表される基（ビオチン）である。具体的には、Ｘ^１又はＸ^２のみがビオチンであってもよく、Ｘ^１及びＸ^２の両方がビオチンであってもよい。ピューロマイシン誘導体がビオチンを有することにより、工程（ｃ）においてタンパク質又はペプチド１７が合成される際、そのＣ末端にビオチンが付加される。従って、本実施形態においては、鋳型として用いるｃＤＮＡの末端にヘキサヒスチジンや他のペプチド・タンパク質タグをコードする塩基配列を付加しておく必要がない。
また、工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意される核酸として、変異ＤＮＡライブラリーを用いる場合には、該変異ＤＮＡライブラリー中に、コード領域中に終止コドンが導入されたＤＮＡが存在する場合がある。このようなＤＮＡを鋳型としてタンパク質を合成する場合、ＤＮＡの３’末端側に予めポリヒスチジンをコードする塩基配列を付加する方法では、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを付加することができない。一方、本実施形態においては、このようなトランケート型のタンパク質にもビオチンを付加することができる。従って、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、進化分子工学的手法に好適に用いられる。

【0045】

前記式（１）中、Ｘ^１又はＸ^２がビオチンでない場合、Ｘ^１又はＸ^２は、蛍光基又は水素原子である。蛍光基としては、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ 、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ 、Ｃｙ ｄｙｅ、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ、ＨｉＬｙｔｅ（商標名）Ｆｌｕｏｒ等、タンパク質又はペプチドの蛍光標識に汎用される蛍光色素が挙げられる。ビオチン化ピューロマイシン誘導体１０が蛍光基を有することにより、作製したタンパク質アレイ又はペプチドアレイ中に固定されたタンパク質又はペプチドの量を、蛍光強度を測定することにより確認することができる。

【0046】

微小凹部１２に添加された反応溶液総量におけるビオチン化ピューロマイシン誘導体１０の濃度としては、１μＭ〜１００μＭが好ましく、１０μＭ〜５０μＭがより好ましい。１μＭ以上の場合、タンパク質のビオチン化の効率が低くなりすぎず、１００μＭ以下の場合、タンパク質の発現量が低くなりすぎない。

【0047】

合成されるタンパク質は、分解や変性により失活しやすいため、基板へのプリントの際にはできるだけ安定な状態で該タンパク質を維持する必要がある。本実施形態においては、微小凹部１２内で合成したタンパク質１７を、そのまま基板１５にプリントするため、タンパク質の失活を極力抑えたアレイ１８’を作製することができる。

【0048】

≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイ≫
本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いて製造された本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、任意のスポット形状を有するものであり、スポットの高密度化にも対応し得るものである。また、該タンパク質アレイ又はペプチドアレイは、使用時に、随時、前記マイクロ凹版から製造されるものであるため、アレイ上のタンパク質やペプチドの変性等を抑制することができる。

【0049】

≪機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法≫
本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、上述したタンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、前記機能性スクリーニングにより特定された、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドを、前記工程（ａ）において対応する微小凹部内の核酸を用いて同定する方法である。

【0050】

前記機能性スクリーニング方法は、タンパク質又はペプチドの有する所望の機能に依存するものであるが、タンパク質又はペプチドの活性を測定する場合、例えば以下の工程が挙げられる。
先ず、工程（ａ）におけるマイクロ凹版と同様に、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ上に固定化されているスポットの位置に対応するようなマイクロ凹版を用意する。
次いで、マイクロ凹版の微小凹部内にタンパク質又はペプチドの活性を測定するために必要な溶液を予め充填し、タンパク質アレイ又はペプチドアレイとマイクロ凹版を重ね合わせて反応させる。
これらの工程により、アレイ上のタンパク質又はペプチドの活性を測定することができる。

【0051】

本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法により製造されたタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、対応するマイクロ凹版上に固定化された核酸の位置情報を変更することなく基板上にプリントされたものである。よって、該タンパク質アレイ又は該ペプチドアレイを用いて、前記機能性スクリーニングにより特定されたスポットに対応するマイクロ凹版上の微小凹部内のＤＮＡを回収し、その塩基配列を解析することにより、特定の機能を有するタンパク質等、及び該タンパク質等をコードするＤＮＡを同定することができる。

【0052】

本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法によれば、高密度化タンパク質アレイ又はペプチドアレイから所望の機能を有するタンパク質又はペプチドを迅速に同定することができるため、進化分子工学的用途に好適に用いられる。

【0053】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0054】

（ｃＤＮＡ結合磁気ビーズの作製）
直径約４０μｍのストレプトアビジン修飾されたビーズ３０μｌ（約３０００個)を１．５ ｍｌチューブに取り、磁石を用いてビーズをチューブの底に引き寄せ、上清を取り除いた。１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＮａＣｌ，及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いて、二回洗浄した後、ビオチン修飾されたＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−ＨｉｓタグｃＤＮＡ５０μｌ［４０ｐｍｏｌ]と２×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，及び０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を５０μｌを加え、６０分間転倒混和した。磁石を用いてビーズをチューブの底に引き寄せ、上清を取り除いた後、ＰＢＳもしくはＴＮＴ（商標名）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ(Ｐｒｏｍｅｇａ)１０μｌに懸濁した。

【0055】

（ｃＤＮＡ結合磁気ビーズの凹版への導入）
上記により作製したｃＤＮＡ結合磁気ビーズ懸濁液１０μｌを１００×１００個のマイクロウェル(直径８０μｍ、 深さ４５μｍ)がアレイ状に並んだシリカガラス製の鋳型(３０ｍｍ×３０ｍｍ，ｔ＝０．５)の凹部に導入した。
ｃＤＮＡ結合磁気ビーズがマイクロウェルモールドの中に導入されているかどうか、倒立顕微鏡を用いて観察した。結果を図５に示す。

【0056】

図５中、凹版の各々の凹部に１つずつｃＤＮＡ結合磁気ビーズが導入されている。このように、効率よく磁気ビーズがマイクロウェルモールド中に導入されていることが確認された。

【0057】

（ガラス基板を用いたＧＦＰ−Ｈｉｓタグタンパク質のパターニング）
ｃＤＮＡ結合磁気ビーズがマイクロウェルモールドの中に導入された凹版上に、転写・翻訳を同時に起こさせる無細胞タンパク質合成系溶液（ＴＮＴ（商標名） Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ））を滴下した後、Ｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｌｉｒｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｉ−ＮＴＡ)で修飾されたガラス基板を密着させ、約１時間保持した。
その後、Ｎｉ−ＮＴＡ基板を凹版から剥がし、ＰＢＳバッファーで洗浄し、基板上にＧＦＰ−Ｈｉｓタグタンパク質がパターニングされているかどうかを、蛍光顕微鏡（Ｅｘ：４８８ｎｍ ，Ｅｍ：５１５ｎｍ)にて確認した。結果を図６に示す。

【0058】

図６に示されるように、ガラス基板上にＧＦＰ由来の蛍光スポットがアレイ状に並んでいることが観察された。このことから、ＧＦＰ−ＨｉｓタグｃＤＮＡ結合磁気ビーズが導入された凹版に対応して、ＧＦＰ−Ｈｉｓタグタンパク質がＮｉ−ＮＴＡで修飾されたガラス基板上にパターニングされていることが確認された。

【0059】

以上の結果から、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、マイクロウェルモールドといった微小構造体の中でタンパク質又はペプチドの合成を行い、合成されたタンパク質又はペプチドを微細なパターン形状で基板表面に固定化することができる。従って、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、基板に任意のサイズ及び形状のタンパク質を印刷することができる。

【0060】

（蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体の合成）
前記式（６）で表される化合物であって、Ｘ^１がＣｙ５、Ｘ^２が前記式（５）で表されるビオチンである化合物（以下、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体）を標準的なホスホラミダイト法により合成した。また、対照として、Ｘ^１がＣｙ５、Ｘ^２が水素原子である化合物（以下、蛍光標識ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体）も作製した。

【0061】

（無細胞転写／翻訳系を用いたタンパク質合成及びビオチン化）
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）ｃＤＮＡが挿入されたｐＥＴ２１ａ−ｄ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素を用いて直線化した。
次いで、この直線化したベクターを鋳型として、ベクター由来のＴ７プロモーターを含むＧＦＰｃＤＮＡをＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて増幅した。増幅された断片（ＰＣＲ産物）をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、無細胞転写／翻訳系の鋳型として用いた。
次いで、無細胞転写／翻訳系として、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（商標名）ｃｌａｓｓｉｃ ＩＩ（バイオコゥマー社製）を用い、タンパク質を合成した。詳細には、５μｌ（０．１μｇ／μｌ）のＰＣＲ産物をＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（商標名）ｃｌａｓｓｉｃ ＩＩのライセート（転写／翻訳系混合物）３５μｌと混ぜた後、２μｌの蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体（最終濃度：２〜４０μＭ）が前もって加えられている３８４ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに８μｌずつ加えた。反応は、３７℃１時間の条件で行い、プレートを氷上に置いて反応を停止した。反応産物を、１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０）を用いて解析した。結果を図７に示す。

【0062】

図７中、レーン１は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体及び蛍光標識ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体未添加のＧＦＰ発現サンプル、レーン２は蛍光標識ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、レーン３は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を２μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、レーン４は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、レーン５は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を４０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、矢印は目的タンパク質であるＧＦＰを示す。上段及び下段の電気泳動結果は、同一のゲルを異なるイメージング法を用いて解析したものである。上段（ＧｒｅｅｎＳｃａｎ）は、ＧＦＰによる蛍光イメージを取得した結果であり、下段は、Ｃｙ５による蛍光イメージを取得した結果である。
上段のレーン３〜５において、ＧＦＰの発現が確認された。また、下段のレーン３〜５において、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を取り込んだビオチン化ＧＦＰの発現が確認された。
更に、上段のレーン４及びレーン５において、ＧＦＰ由来の蛍光強度はレーン４の方が強く検出された。その一方、下段のレーン４及びレーン５においては、Ｃｙ５蛍光強度はレーン５の方が強く検出された。これらのことから、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を４０μＭ添加したサンプルは、ビオチン化効率が特に高いことが確認された。

【0063】

（スライドガラスを用いたビオチン化ＧＦＰタンパク質のパターニング）
ビオチンコートされたスライドガラス（ＭｉｃｒｏＳｕｒｆａｃｅ社製、商品名：Ｂｉｏ−０２）上に、２０μｇのストレプトアビジンと１０％グリセロールを含有したＰＢＳ（ｐＨ７．５）を滴下し、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラスを作製した。次いで、（無細胞転写／翻訳系を用いたタンパク質合成及びビオチン化）で述べた方法により、３８４ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにＧＦＰタンパク質合成反応液を加え、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラスを密着させ、加湿チャンバー中で約３０分、室温で保持した。
その後、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラスを３８４ウェルマイクロタイタープレート凹版から剥がし、ＰＢＳ １ｘ ｗａｓｈバッファー（１００ｍＭ Ｐｈｏｓｐａｔｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で１５秒間、３回洗浄した。更に、水を用いてリンスし、風乾した。スライドガラス上にＧＦＰタンパク質がパターニングされているかどうかを、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ）を用いてＧＦＰ由来の蛍光を確認した。結果を図８に示す。

【0064】

図８中、左上のスポットは蛍光標識ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、右上のスポットは蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を２μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、左下のスポットは蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、右下のスポットは蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体を４０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプルを示す。左上のスポットにおいて蛍光が観察されない一方、その他のスポットにおいては、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体の用量依存にスポットの蛍光強度が強まっていることが確認された。
このことから、ビオチン化ピューロマイシン−ヌクレオチド複合体をタンパク質合成系に加えることにより、タンパク質がビオチン化され、基板上に容易にパターニングされることが確認された。

【0065】

以上の結果から、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、マイクロウェルモールドといった微小構造体の中でビオチン化タンパク質又はビオチン化ペプチドの合成を行い、合成されたビオチン化タンパク質又はビオチン化ペプチドを微細なパターン形状でアビジン修飾された基板表面に固定化することができる。従って、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、基板に任意のサイズ及び形状のタンパク質を簡便にかつ効率よく印刷することができる。

【0066】

更に、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、上記の様に本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いて、簡便でかつ効率よく製造されるものであるため、近年遺伝子レベルで診断が行われている生活習慣病やガンなどに関連する遺伝子や、病原細菌やウイルスの遺伝子の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）解析に柔軟に対応することができる。そして、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイによれば、かかる一塩基多型診断をタンパク質レベルで迅速にかつ詳細に行うことができる。

【産業上の利用可能性】

【0067】

本発明は、生活習慣病やガンなどに関連する遺伝子や、病原細菌やウイルスの遺伝子の一塩基多型解析の分野において利用が可能である。

【符号の説明】

【0068】

１、１１…マイクロ凹版、２、１２…微小凹部、３…核酸、４、１４…磁気ビーズ、５、１５…基板、１０…ビオチン化ピューロマイシン誘導体、１３…ＤＮＡ、１６…ｍＲＮＡ、７、１７…タンパク質又はペプチド、９、１９…無細胞タンパク質合成系、１８、１８’…タンパク質アレイ又はペプチドアレイ。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】