特許 5925039 電子顕微鏡観察用染色剤および該染色剤を用いた染色方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5925039

(24)【登録日】2016年4月28日

(45)【発行日】2016年5月25日

(54)【発明の名称】電子顕微鏡観察用染色剤および該染色剤を用いた染色方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/30 20060101AFI20160516BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/30

【請求項の数】3

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2012-99825(P2012-99825)

(22)【出願日】2012年4月25日

(65)【公開番号】特開2012-247411(P2012-247411A)

(43)【公開日】2012年12月13日

【審査請求日】2015年4月8日

(31)【優先権主張番号】特願2011-102777(P2011-102777)

(32)【優先日】2011年5月2日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000006035

【氏名又は名称】三菱レイヨン株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】定金 正洋

(72)【発明者】

【氏名】二宮 航

(72)【発明者】

【氏名】佐野 庸治

(72)【発明者】

【氏名】中井 敏博

(72)【発明者】

【氏名】井出 裕介

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０５−３０６９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−１１８４３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−２８８８８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１４７２３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３７８２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０９−５１２３０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 佐廣浩一，Preyssler型リンタングステートを用いたファージのネガティブ染色:濃度と分子構造の影響，医学生物学電子顕微鏡技術学会誌，２０１２年，Vol.26 No.2，Page.90-91

【文献】 定金正洋，中性溶液中で安定なポリタングステン分子を用いたファージのネガティブ染色，医学生物学電子顕微鏡技術学会誌，２０１１年 ９月，Vol.25 No.2，Page.60

【文献】 CREASER I，Rigid Nonlabile Polyoxometalate Cryptates [ZP5W30O110](15-n)- That Exhibit Unprecedented Selectivity for Certain Lanthanide and Other Multivalent Cations，Inorg Chem，１９９３年，Vol.32 No.9，Page.1573-1578

【文献】 ALIZADEH M H，A heteropolyanion with fivefold molecular symmetry that contains a nonlabile encapsulated sodium ion. The structure and chemistry of [NaP5W30O110]14-，J Am Chem Soc，１９８５年，Vol.107 No.9，Page.2662-2669

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／３０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式Ａ^a+_{[(15-b)+c(6-d)]/a}［Ｚ^b+Ｐ₅Ｗ_(30-c)Ｍ（ｄ）_cＯ₁₁₀］
（式中、Ｐ、ＷおよびＯは、それぞれリン、タングステンおよび酸素を示す。Ａ^a+はａ価のカチオン、Ｚ^b+はｂ価のカチオン、Ｍ（ｄ）はｄ価の元素を示す。０＜ａ、０＜ｂ、０≦ｃ＜３０、０＜ｄ≦６である。）
で表されるリンタングステン酸を含む電子顕微鏡観察用染色剤。

【請求項2】

前記一般式において、Ａ^a+がＨ⁺、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺、Ｃｓ⁺、Ｂｅ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｂａ²⁺、ＮＨ₄⁺、ピリジニウムカチオンおよび第４級アンモニウムカチオンからなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであり、Ｚ^b+がＮａ⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｂｉ³⁺、Ｙ³⁺、Ｌａ³⁺、Ｃｅ³⁺、Ｅｕ³⁺、Ｇｄ³⁺、Ｌｕ³⁺、Ａｍ³⁺、Ｔｈ⁴⁺およびＵ⁴⁺からなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであり、Ｍ（ｄ）がＷ（ＶＩ）、Ｍｏ（ＶＩ）およびＶ（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの元素である請求項１に記載の電子顕微鏡観察用染色剤。

【請求項3】

請求項１または２に記載の電子顕微鏡観察用染色剤を用いる電子顕微鏡観察用試料の染色方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電子顕微鏡観察用試料のネガティブ染色剤および該染色剤を用いた電子顕微鏡観察用試料のネガティブ染色方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ナノレベルからマイクロレベルの微細構造を高精度に観察することへの要求は、有機物、無機物を問わず近年ますます高まっている。さらにこのところ、新型インフルエンザ、ノロウイルスおよび口蹄疫などのウイルスが原因となる流行性の感染症の発生および拡大が問題となっている。これら感染症の蔓延を防止するためには、原因となるウイルスの分類を同定するための微細構造解析を行うことが不可欠である。

【0003】

ウイルスは１０〜２００ナノメートルと小さいため、微細構造解析には走査型および／または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いる必要がある。この中でも、特にＴＥＭを用いることが有効である。しかしながら、有機物であるウイルス上では電子線の散乱が起こりにくいため、重元素などを用いた染色が必須となる。重元素などを用いた染色を行うことで、染色剤部分は電子線が散乱するため暗い像となり、観察対象部分は電子線が透過するため明るい像となる。染色剤が観察対象や観察対象を固定する支持膜と上手く相互作用していれば、観察対象の微細構造を反映した像が得られる。このような染色方法はネガティブ染色方法と呼ばれる。

【0004】

これまでに、ネガティブ染色方法に用いられるネガティブ染色剤は数多く提案されている。ネガティブ染色剤としては、例えば、酢酸ウラニル（特許文献１、非特許文献１および非特許文献３〜５）、クエン酸鉛（特許文献１および非特許文献１）、酢酸鉛および硝酸鉛（非特許文献１）、リンタングステン酸（特許文献２、３および非特許文献１、２）、モリブデン酸アンモニウム・４水和物（非特許文献１、２）、タングステン酸アンモニウム・５水和物（非特許文献３）、塩化ハフニウム（非特許文献４）、塩化ジルコニウム（非特許文献４）および白金ブルー（非特許文献５）などが提案されている。さらに、粘度や浸透性能の制御を目的として、染色剤溶液への添加剤の添加についても提案されている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００７−３０９８７２号公報

【特許文献2】特開平５−３０６９７９号公報

【特許文献3】特開平２−１１８４３１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】医生電顕技術誌（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．）、第２１巻（第１号）、ｐ９３−９８、２００７年

【非特許文献2】医生電顕技術誌（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．）、第２１巻（第１号）、ｐ１−６、２００７年

【非特許文献3】医生電顕技術誌（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．）、第２４巻（第２号）、ｐ５９−６０、２０１０年

【非特許文献4】医生電顕技術誌（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．）、第２０巻（第１号）、ｐ６９−７０、２００６年

【非特許文献5】医生電顕技術誌（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．）、第２１巻（第１号）、ｐ９０−９２、２００７年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、最も汎用されている酢酸ウラニル（酢酸ウラン）は、良好な染色性を示すものの、放射性物質であるウラン（劣化ウラン）が使用されており、兵器への転用が可能であることから使用制限や管理などが強化されつつあるため、安全性が高く簡便に使用可能な代替染色剤の開発が望まれている。また、鉛塩類、モリブデン酸アンモニウム、タングステン酸アンモニウム、塩化ハフニウム、塩化ジルコニウムおよび白金ブルーは、安全性の面では優れているが酢酸ウラニルに比べてコントラストが弱く染色能力が劣り、観察対象の性質や調製条件などの点でも適正に使用できる範囲が狭い。

【0008】

一方、特許文献２、３および非特許文献１、２に開示されているリンタングステン酸は、酢酸ウラニルに次いで汎用なネガティブ染色剤であり、ケギン（Ｋｅｇｇｉｎ）型と呼ばれるリン酸とタングステン酸との縮合により合成されるヘテロポリ酸（ポリオキソメタレート）である。現在、市販試薬として容易に入手できるリンタングステン酸は、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸のみであり、ネガティブ染色剤において単にリンタングステン酸あるいはＰＴＡ（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ Ａｃｉｄ）と表記される場合には、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸を意味する。さらに、本願発明者は、ネガティブ染色剤として市販されているリンタングステン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｕｓｔａｔｅ ａｃｉｄ ＥＭ、ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）をＦＴ−ＩＲおよび³¹Ｐ−ＮＭＲを用いて分析したところ、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸に特有なスペクトルを示すことを確認している。

【0009】

図１にＫｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸アニオンの一次構造を示す。Ｈ₃ＰＷ₁₂Ｏ₄₀で表されるＫｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸は、水溶液中での安定性が非常に低く、ｐＨ＜１の領域でしか構造を保てない課題がある。例えば、ウイルス、菌および細胞などの試料の観察はほぼ中性領域で行われるため、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸の安定ｐＨ領域以外では、Ｋｅｇｇｉｎ型構造の分解が懸念される。また、前記分解が生じた場合、ウイルスの表面蛋白質や支持膜との相互作用も大きく変化する可能性がある。

【0010】

したがって、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸を染色剤に用いる場合には、種々の分解生成物に由来する観察試料の均質性の低下が生じ、染色性が低下する。また、これを改善するためにＫｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸溶液に酢酸などを添加する場合にも、染色剤溶液の調製が煩雑になり、好適条件の決定が難しい。このような背景から、染色が簡便で、染色性が十分に高く、使用可能範囲が広い代替染色剤の開発が望まれている。

【0011】

本発明の目的は、適用範囲が広く高い染色性を示し、取り扱いが容易で安全性の高い電子顕微鏡観察用染色剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、一般式Ａ^a+_{[(15-b)+c(6-d)]/a}［Ｚ^b+Ｐ₅Ｗ_(30-c)Ｍ（ｄ）_cＯ₁₁₀］（式中、Ｐ、ＷおよびＯは、それぞれリン、タングステンおよび酸素を示す。Ａ^a+はａ価のカチオン、Ｚ^b+はｂ価のカチオン、Ｍ（ｄ）はｄ価の元素を示す。０＜ａ、０＜ｂ、０≦ｃ＜３０、０＜ｄ≦６である。）で表されるリンタングステン酸を含む。

【0013】

本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤を用いる。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、適用範囲が広く高い染色性を示し、取り扱いが容易で安全性の高い電子顕微鏡観察用染色剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸アニオンの一次構造を示す模式図である。

【図2】Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸アニオンの一次構造を示す（ａ）側面図、（ｂ）上面図である。

【図3】本発明に係る染色方法の一例を示す模式図である。

【図4】（ａ）マイクロピペットを用いてグリッドに染色剤溶液を滴下する操作の概略図、（ｂ）ろ紙で余分な溶液を吸い取る際の、グリッドとろ紙との位置関係を示す概略図である。

【図5】（ａ）実施例１、（ｂ）比較例１、（ｃ）比較例４の各種染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図6】（ａ）実施例２、（ｂ）比較例２、（ｃ）比較例５の各種染色剤により染色したＴ７ファージのＴＥＭ像である。

【図7】（ａ）実施例３、（ｂ）比較例３、（ｃ）比較例６の各種染色剤により染色したλファージのＴＥＭ像である。

【図8】（ａ）実施例４、（ｂ）実施例５の各種濃度の染色剤溶液を用いて染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図9】実施例６の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図10】実施例７の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図11】実施例８の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図12】実施例９の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図13】実施例１０の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図14】実施例１１の染色剤により染色したＴ７ファージのＴＥＭ像である。

【図15】実施例１２の染色剤により染色したλファージのＴＥＭ像である。

【図16】実施例１３の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【図17】実施例１４の染色剤により染色したＴ４ファージのＴＥＭ像である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

［電子顕微鏡観察用染色剤］
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤に含まれる、一般式Ａ^a+_{[(15-b)+c(6-d)]/a}［Ｚ^b+Ｐ₅Ｗ_(30-c)Ｍ（ｄ）_cＯ₁₁₀］で表されるリンタングステン酸は、Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型と呼ばれるリンタングステン酸である。Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸は、Ｋｅｇｇｉｎ型とは異なる形でリン酸とタングステン酸とが縮合したヘテロポリ酸の一種である。Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸アニオンの一次構造を図２に示す。

【0017】

Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸は、１９３３年にその一次構造が決定され、染色剤の他、触媒、導電材料およびナノ材料などとして広く研究されてきた。一方、Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸は１９７０年に初めて合成され、その一次構造が決定されたのは１９８５年である。Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸は、Ｋｅｇｇｉｎ型のそれよりも研究の歴史が浅く、合成も難しいとされていた。本願発明者はＰｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の調製方法、物性および特徴を鋭意研究しており、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸よりも、重元素であるタングステンを一次構造中に多く有するＰｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の方が、電子顕微鏡観察用染色剤としてより良好な性能を示すと考えた。また、電子顕微鏡観察用染色剤としてＰｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸は、ｐＨ＜１２の広いｐＨ範囲で安定に存在するため、ネガティブ染色剤としてＫｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸と比較して良好な染色性能を示すことができる。さらに、Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸は、アニオンおよびカチオンの構成元素（Ａ^a+、Ｚ^b+およびＭ（ｄ））を種々変えることができるため、分子設計・物性制御の幅が広く、適用可能な検体の範囲も広い。

【0018】

前記一般式において、Ｐ、ＷおよびＯは、それぞれリン、タングステンおよび酸素を示す。Ａ^a+はａ価のカチオン、Ｚ^b+はｂ価のカチオン、Ｍ（ｄ）はｄ価の元素を示す。０＜ａ、０＜ｂ、０≦ｃ＜３０、０＜ｄ≦６である。なお、前記一般式で表されるリンタングステン酸には、前記一般式の水和物も含まれる。リンタングステン酸が水和物の場合、水和物の水和水量（ｎＨ₂Ｏ）は特に限定されず、０≦ｎであることができる。水和物の水和水量は、その乾燥状態や保管状態などにより変化する。仮に水和物の水和水量が異なったとしても、電子顕微鏡観察用染色剤としての性能は同じである。そのため、前記一般式では、水和水の記載は省略している。

【0019】

前記一般式において、Ａ^a+としては０＜ａであれば特に制限されない。ａは、０＜ａ≦３とすることもでき、０＜ａ≦２とすることもできる。Ａ^a+としては、第１族元素のカチオン、第２族元素のカチオン、ＮＨ₄⁺、ピリジニウムカチオンおよび第４級アンモニウムカチオンからなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであることが好ましい。Ａ^a+としては、Ｈ⁺、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺、Ｃｓ⁺、Ｂｅ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｂａ²⁺、ＮＨ₄⁺、ピリジニウムカチオンおよび第４級アンモニウムカチオンからなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであることがより好ましい。

【0020】

前記ピリジニウムカチオンはＣ₅Ｈ₅Ｎ⁺Ｒで表され、前記第４級アンモニウムカチオンはＲ₄Ｎ⁺で表される。ピリジニウムカチオンおよび４級アンモニウムカチオンは、Ｃ₁からＣ₂₁までの種々の炭化水素基（Ｒ）で窒素原子がアルキル化されたピリジンおよびアルキルアンモニウムのカチオンである。Ｒとしては特に限定されないが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ドデシル基、セチル基などが挙げられる。第４級アンモニウムカチオンにおいては、複数のＲは同じでも異なっていてもよい。また、Ｒは官能基を有していても差し支えない。なお、Ａ^a+が複数の種類のカチオンを含む場合、ａの値は各カチオンの価数に各モル比を乗じた値の和とする。例えば、Ａ^a+がＫ⁺と、Ｃａ²⁺とをモル比０．５：０．５で含む場合、ａの値は１×０．５＋２×０．５＝１．５となる。

【0021】

前記一般式において、Ｚ^b+としては０＜ｂであれば特に制限されない。ｂは、０＜ｂ≦６とすることもでき、０＜ｂ≦４とすることもできる。Ｚ^b+としては、第１族元素のカチオン、第２族元素のカチオン、第３族元素のカチオン、第１５族元素のカチオン、ランタノイド元素のカチオンおよびアクチノイド元素のカチオンからなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであることが好ましい。Ｚ^b+としては、Ｎａ⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｂｉ³⁺、Ｙ³⁺、Ｌａ³⁺、Ｃｅ³⁺、Ｅｕ³⁺、Ｇｄ³⁺、Ｌｕ³⁺、Ａｍ³⁺、Ｔｈ⁴⁺およびＵ⁴⁺からなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであることがより好ましい。なお、ネガティブ染色の原理からは、Ａ^a+およびＺ^b+により重い元素を導入すれば、より鮮明な像が得られる。

【0022】

前記一般式において、Ｍ（ｄ）としては０＜ｄ≦６であれば特に制限されない。ｄは２≦ｄ≦６とすることもでき、３≦ｄ≦６とすることもできる。Ｍ（ｄ）としては、ｄ価の第５族元素およびｄ価の第６族元素の少なくとも一方であることが好ましい。Ｍ（ｄ）としては、Ｗ（ＶＩ）、Ｍｏ（ＶＩ）およびＶ（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの元素であることがより好ましい。ｃは０≦ｃ＜３０であるが、０≦ｃ≦５とすることができ、合成の困難さや構造安定性の観点から、ｃは０、１または２が好ましい。

【0023】

なお、ｃ＝０の場合、前記一般式にはＭ（ｄ）は含まれないが、この場合前記一般式は、Ａ^a+_(15-b)/a［Ｚ^b+Ｐ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］（式中、Ｐ、ＷおよびＯは、それぞれリン、タングステンおよび酸素を示す。Ａ^a+はａ価のカチオン、Ｚ^b+はｂ価のカチオンを示す。０＜ａ、０＜ｂである。）で表される。

【0024】

前記一般式で表されるリンタングステン酸は、例えばＭ．Ｔ．Ｐｏｐｅら，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，１５７３−１５７８、またはＹ．Ｊｅａｎｎｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８５，１０７，２６６２−２６６９に開示されている方法により製造することができる。

【0025】

例えば、Ｋ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・ｎＨ₂Ｏの製造方法としては、タングステン酸ナトリウム・２水和物（Ｎａ₂ＷＯ₄・２Ｈ₂Ｏ）を水に溶解し、８５質量％リン酸（Ｈ₃ＰＯ₄）を加え、圧力容器中、１２０℃において一晩水熱合成を行う。室温まで冷却後、水および塩化カリウム（ＫＣｌ）を添加し、析出した固体をろ過し、酢酸カリウムおよびメタノールで洗浄する。得られた固体を熱水に溶解して室温まで放冷し、再結晶を行うことで得ることができる。再結晶を繰り返すと収率は低下するものの、純度を向上させることができる。

【0026】

［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン中の、Ｎａ⁺のＺ^b+への交換は、［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン水溶液に交換するＺ^b+を含有する溶液を添加して、圧力容器中、１４０〜１８０℃において一晩水熱合成を行う。その後、ＫＣｌを添加し、ろ別し、洗浄および乾燥を行うことで、Ｎａ⁺のＺ^b+への交換を行うことができる。

【0027】

［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン中の、Ｗ（ＶＩ）のＭ（ｄ）への置換は、ｐＨを調整した［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン水溶液にＭ（ｄ）を含有する溶液を添加する。その後、ＫＣｌを添加し、ろ別し、洗浄および乾燥を行うことで、Ｗ（ＶＩ）のＭ（ｄ）への置換を行うことができる。

【0028】

カチオンＡ^a+を交換する方法としては、陽イオン交換樹脂を用いる方法が有用である。各種カチオン型交換樹脂に、［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン水溶液を処理することで、カチオンＡ^a+を交換することが可能である。また、プロトン型交換樹脂で処理してプロトン型Ｈ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］とした後、各種カチオンでプロトンを部分中和することも可能である。

【0029】

Ａ^a+、Ｚ^b+およびＭ（ｄ）の交換および置換に用いる原料は特に制限されず、交換および置換したいカチオンまたは元素の硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩および塩化物などを用いることができる。これらは一種のみを用いてもよく、二種以上を併用してもよい。

【0030】

合成した前記一般式で表されるリンタングステン酸は、ＦＴ−ＩＲ、ＩＣＰ発光分析や原子吸光などの元素分析、Ｘ線回折、³¹Ｐ−ＮＭＲ、¹⁸³Ｗ−ＮＭＲ等により構造と組成を確認することができる。

【0031】

［電子顕微鏡観察用試料の染色方法］
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、電子顕微鏡観察用試料の染色に用いることができる。本発明に係る方法によれば、電子顕微鏡観察用試料をより簡便に染色することができる。

【0032】

本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤を用いて染色し、電子顕微鏡観察を行う観察対象としては、特に制限されず、例えば細胞、ウイルス、ファージ（細菌に感染するウイルスの総称）、たんぱく質、低分子酵素、核、ミトコンドリア、リポソーム、グリコーゲン、脂肪滴、膜系、菌体、細菌鞭毛およびグラム陰性菌などが挙げられる。

【0033】

観察対象を定着させる支持膜としては、特に制限されず、コロジオン膜、フォルムバール膜およびカーボン膜などが挙げられ、必要に応じて蒸着処理や親水化処理を施したものであってもよい。

【0034】

本発明に係る染色剤に含まれるリンタングステン酸はＰｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸であるため、染色剤溶液の調製においては、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸やモリブデン酸アンモニウム等を用いる場合とは異なり、アルカリを用いたｐＨ調整や酢酸などの添加は不要である。このため、本発明に係る染色剤を用いた染色剤溶液の調製は、非常に簡便に行うことができる。

【0035】

染色剤溶液に含まれる溶媒としては、水、アルコールなどが挙げられる。

【0036】

染色剤溶液中の前記一般式で表されるリンタングステン酸の濃度は、０．１質量％以上が好ましく、０．２質量％以上がより好ましく、０．３質量％以上がさらに好ましい。また、前記濃度は１．９質量％以下が好ましく、１．５質量％以下がより好ましく、１．０質量％以下がさらに好ましい。前記濃度を前記範囲とすることで、分散性、浸透圧、表面張力、支持膜や試料表面との相互作用などをバランスよく制御でき、高コントラストで微細構造の電子顕微鏡観察が可能となる。

【0037】

本発明に係る染色方法の一例を図３に示す。支持膜である透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用コロジオン膜に親水化処理を施し、観察対象であるウイルスを接触させ、定着させる。定着させたウイルスに、本発明に係る染色剤を溶解させた染色剤溶液を滴下して接触させる。その後、余分な溶液をろ紙で吸い取ることで取り除き、定置乾燥を行う。観察対象の支持膜への接触時間、染色剤溶液の観察対象への接触時間および定置乾燥の乾燥時間は特に限定されず、電子顕微鏡観察の結果を考慮しながら、観察対象に応じて適宜決定することができる。

【0038】

その後、得られた観察用試料について電子顕微鏡観察を行う。この時、重金属元素を含む染色剤部分については、電子線は透過せずに散乱する。このため、観察される像は、ウイルス部分は明るい像となり、染色剤部分は暗い像となる。使用する電子顕微鏡には制限はなく、透過型電子顕微鏡であれば差し支えない。観察される像の綺麗さは、観測対象像の鮮明性（高コントラスト、高解像度）、染色剤のひび割れの有無、バックグラウンドの均一性などの基準により判断することができる。

【実施例】

【0039】

以下、本発明において、実施例および比較例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

【0040】

［実施例１］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ４
（Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の合成）
Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸として、既報（Ｙ．Ｊｅａｎｎｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８５，１０７，２６６２−２６６９）に従い、カリウムとナトリウムの混合塩であるＫ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成し、単離した。

【0041】

具体的な合成方法としては、タングステン酸ナトリウム・２水和物（Ｎａ₂ＷＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、和光純薬製）３３ｇを純水３０ｍｌに溶解し、８５質量％リン酸（８５質量％Ｈ₃ＰＯ₄、和光純薬製）２６．５ｍｌを添加した。この溶液を、テフロン（登録商標）内筒型密閉容器（ＴＡＦ−ＳＲ型、内容積１００ｍｌ、耐圧硝子工業製）に入れて密閉後、１２０℃の水熱条件下で一晩静置した。容器を室温まで放冷して容器を開放し、純水１５ｍｌをゆっくりと添加、引き続いて塩化カリウム（和光純薬製）１０ｇを添加した。生じた沈澱は、吸引ろ過によりろ別し、２ｍｏｌ／ｌの酢酸カリウム（和光純薬製）水溶液およびメタノール（和光純薬製）で洗浄した。吸引条件下で乾燥後、得られた黄白色固体を熱水３０ｍｌに溶解し、静置して室温まで放冷し、再結晶した。吸引ろ過して得られた白色固体について、同様な方法で再結晶を２回繰返し、白色結晶を得た。

【0042】

また、合成した化合物がＫ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・３７Ｈ₂Ｏであることは、ＦＴ−ＩＲ（ＰＡＲＡＧＯＮ １０００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）、元素分析（ＩＣＰ発光分析：ＩＲＩＳ−ＡＰ、Ｊａｒｒｅｌｌ Ａｓｈ Ｊａｐａｎ製、原子吸光：ＡＡｎａｌｙｓｔ ８００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）、³¹Ｐ−ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍ ５００、Ｖａｒｉａｎ製）および¹⁸³Ｗ−ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍ ５００、Ｖａｒｉａｎ製）により確認した。ＦＴ−ＩＲスペクトルにおいては、７８９、９１２、９３７、１０１８、１０８３および１１６４ｃｍ^-1に［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオンに特徴的な振動が観測された。元素分析においては、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：６．０３（５．６５）、Ｎａ：０．４８（０．６７）、Ｐ：１．５１（１．７９）、Ｗ：６３．７（６３．８）であった。³¹Ｐ−ＮＭＲ（共鳴周波数：２０２．３３３ＭＨｚ、溶媒：重水）においては、８５質量％Ｈ₃ＰＯ₄を外部標準とし、Ｈ₃ＰＯ₄のＰ由来のシグナルを０ｐｐｍとした場合の化学シフト値として、−９．４ｐｐｍに［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン由来のシグナルが確認された。¹⁸³Ｗ−ＮＭＲ（共鳴周波数：２０．８２５ＭＨｚ、溶媒：重水）においては、飽和Ｎａ₂ＷＯ₄重水溶液を外部標準とし、Ｎａ₂ＷＯ₄のＷ由来のシグナルを０ｐｐｍとした場合の化学シフト値として、−２０７．９、−２０９．９、−２７５．０および−２８７．４ｐｐｍに［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン由来のシグナルが、積分比２：２：１：１で確認された。なお、¹⁸³Ｗ−ＮＭＲの前処理として、Ｋ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を重水中でＬｉ⁺型陽イオン交換樹脂とともに攪拌してカチオン交換を施した。この操作により、サンプルの重水への溶解度が向上し、より良好なスペクトルを得ることができる。このとき、カチオンの相違は、¹⁸³Ｗ−ＮＭＲでのケミカルシフト値に影響を与えないことを確認している。

【0043】

（観察対象）
細菌に感染するウイルスであるＴ４ファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、Ｔ４（ＮＢＲＣ２０００４））を二重寒天培養法により３７℃で２４時間培養し、精製したものを用いた。

【0044】

（染色剤溶液）
Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸を蒸留水に溶かし、濃度を０．５質量％とした溶液を用いた。

【0045】

（染色方法）
染色は以下の手順で行った。前記ファージの濃度を約１０¹¹ＰＦＵ／ｍｌ（ＰＦＵ：Ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）に調整したファージ溶液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）５μｌを、カーボン蒸着および親水化処理を施したコロジオン膜張りＣｕグリッド（日新ＥＭ社製、製品番号：６５１１、２００メッシュ）上にマイクロピペット３を用いて図４（ａ）に示すように滴下し、グリッドと３分間接触させた後、余分な溶液を５Ｃのろ紙で吸い取った。その後、試料に前記染色剤溶液５μｌを、マイクロピペットを用いて図４（ａ）に示すように滴下し、３分間接触させた後、余分な溶液を５Ｃのろ紙により吸い取った。なお、ろ紙で余分な溶液を吸い取る際には、図４（ｂ）に示すようにグリッド２とろ紙４との角度を３０度に保った。その後、室温にて１時間定置乾燥させて観察用試料を得た。

【0046】

（電子顕微鏡観察）
前記観察用試料について電子顕微鏡観察を行った。電子顕微鏡観察は、広島大学自然科学研究支援開発センター遺伝子実験部門所有の透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２００ＥＸ、日本電子製、加速電圧８０ｋＶ）を用いて行った。結果を図５（ａ）に示す。

【0047】

［実施例２］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ７
ファージとして、Ｔ７ファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、Ｔ７（ＮＢＲＣ２０００７））を用いたこと以外は、実施例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図６（ａ）に示す。

【0048】

［実施例３］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／λ
ファージとして、λファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、λ（ＮＢＲＣ２００１６））を用いたこと以外は、実施例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図７（ａ）に示す。

【0049】

［比較例１］ 酢酸ウラニル／Ｔ４
染色剤溶液として、酢酸ウラニルを蒸留水に溶かし、濃度を３質量％とした溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図５（ｂ）に示す。

【0050】

［比較例２］ 酢酸ウラニル／Ｔ７
ファージとして、Ｔ７ファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、Ｔ７（ＮＢＲＣ２０００７））を用いたこと以外は、比較例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図６（ｂ）に示す。

【0051】

［比較例３］ 酢酸ウラニル／λ
ファージとして、λファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、λ（ＮＢＲＣ２００１６））を用いたこと以外は、比較例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図７（ｂ）に示す。

【0052】

［比較例４］ Ｋｅｇｇｉｎ／Ｔ４
染色剤溶液として、Ｋｅｇｇｉｎ型リンタングステン酸（ＴＡＡＢ社製）を蒸留水に溶かして濃度を０．５質量％とした後、ＫＯＨ水溶液によりｐＨを６に調整した溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図５（ｃ）に示す。

【0053】

［比較例５］ Ｋｅｇｇｉｎ／Ｔ７
ファージとして、Ｔ７ファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、Ｔ７（ＮＢＲＣ２０００７））を用いたこと以外は、比較例４と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図６（ｃ）に示す。

【0054】

［比較例６］ Ｋｅｇｇｉｎ／λ
ファージとして、λファージ（ＮＢＲＣ；ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入、λ（ＮＢＲＣ２００１６））を用いたこと以外は、比較例４と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図７（ｃ）に示す。

【0055】

［実施例４］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ濃度０．３質量％／Ｔ４
染色剤溶液中のＰｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の濃度を０．３質量％としたこと以外は、実施例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図８（ａ）に示す。

【0056】

［実施例５］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ濃度２．０質量％／Ｔ４
染色剤溶液中のＰｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の濃度を２．０質量％としたこと以外は、実施例１と同様にして観察用試料を作製し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図８（ｂ）に示す。

【0057】

［実施例６］ Ｃａ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ４
（Ｃａ²⁺交換Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の合成）
実施例１と同様な方法で調製したＫ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・１５Ｈ₂Ｏを純水に溶解し、１．２当量の塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂、和光純薬製）を加え、既報（Ｍ．Ｔ．Ｐｏｐｅら，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，１５７３−１５７８）に従って１６０℃で２日間反応させることにより、Ｋ₁₃［ＣａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成し、単離した。元素分析（Ｍｉｋｒｏａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅｓ Ｌａｂｏｒ Ｐａｓｃｈｅｒ社により分析、所在地：Ａｎ ｄｅｒ Ｐｕｌｖｅｒｍｕｈｌｅ １，Ｄ−５３４２４，Ｒｅｍａｇｅｎ−Ｂｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：５．７８（５．９４）、Ｃａ：０．４８（０．４６）、Ｐ：１．８４（１．８４）、Ｗ：６５．４（６５．４）、Ｈ：０．５９（０．６０）が得られ、本化合物がＫ₁₃［ＣａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・２５Ｈ₂Ｏであることを確認した。また、実施例１と同様な方法で³¹Ｐ−ＮＭＲを測定し、−９．０および−１１．１ｐｐｍに［ＣａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^13-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0058】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
染色剤としてＫ₁₃［ＣａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を用いたこと以外は、実施例１と同様な方法で行った。結果を図９に示す。

【0059】

［実施例７］ Ｙ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ４
（Ｙ³⁺交換Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の合成）
塩化カルシウムの代わりに１．２当量の硝酸イットリウム・６水和物（Ｙ（ＮＯ₃）₃・６Ｈ₂Ｏ、アルドリッチ製）を用いたこと以外は、実施例６と同様にして、Ｋ₁₂［ＹＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成し、単離した。実施例６と同様な方法で元素分析と³¹Ｐ−ＮＭＲを測定した。元素分析により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：５．７８（５．７４）、Ｙ：１．０５（１．０４）、Ｐ：１．８４（１．８４）、Ｗ：６５．４（６５．４）、Ｈ：０．５９（０．５５）が得られ、本化合物がＫ₁₂［ＹＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・２５Ｈ₂Ｏであることを確認した。³¹Ｐ−ＮＭＲにおいて、−１０．１ｐｐｍに［ＹＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^12-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0060】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
染色剤としてＫ₁₂［ＹＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を用いたこと以外は、実施例６と同様な方法で行った。結果を図１０に示す。

【0061】

［実施例８］ Ｃｅ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ４
（Ｃｅ³⁺交換Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の合成）
溶媒として０．１ｍｏｌ／ｌの硝酸（ＨＮＯ₃）水溶液を用いたこと、塩化カルシウムの代わりに３当量の硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（（ＮＨ₄）₂［Ｃｅ（ＮＯ₃）₆］、和光純薬製）を用いたことおよび反応温度を１８０℃としたこと以外は、実施例６と同様にして、Ｋ₁₂［ＣｅＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成し、単離した。実施例６と同様な方法で元素分析と³¹Ｐ−ＮＭＲを測定した。元素分析により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：５．７４（５．７８）、Ｃｅ：１．６５（１．６３）、Ｐ：１．８３（１．８１）、Ｗ：６５．０（６４．７）、Ｈ：０．５９（０．６０）が得られ、得られた化合物がＫ₁₂［ＣｅＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・２５Ｈ₂Ｏであることを確認した。³¹Ｐ−ＮＭＲにおいて、−１５．９ｐｐｍに［ＣｅＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^12-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0062】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
染色剤としてＫ₁₂［ＣｅＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を用いたこと以外は、実施例６と同様な方法で行った。結果を図１１に示す。

【0063】

［実施例９］ Ｅｕ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ４
（Ｅｕ³⁺交換Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の合成）
塩化カルシウムの代わりに１．２当量の硝酸ユウロピウム（ＩＩＩ）・６水和物（Ｅｕ（ＮＯ₃）₃・６Ｈ₂Ｏ、和光純薬製）を用いたこと以外は、実施例６と同様にして、Ｋ₁₂［ＥｕＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成し、単離した。実施例６と同様な方法で元素分析と³¹Ｐ−ＮＭＲを測定した。元素分析により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：５．７４（５．８０）、Ｅｕ：１．７９（１．８１）、Ｐ：１．８２（１．８２）、Ｗ：６４．９（６４．８）、Ｈ：０．５９（０．５３）が得られ、本化合物がＫ₁₂［ＥｕＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・２５Ｈ₂Ｏであることを確認した。³¹Ｐ−ＮＭＲにおいて、０．６ｐｐｍに［ＥｕＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^12-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0064】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
染色剤としてＫ₁₂［ＥｕＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を用いたこと以外は、実施例６と同様な方法で行った。結果を図１２に示す。

【0065】

［実施例１０］ Ｂｉ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ４
（Ｂｉ³⁺交換Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸の合成）
溶媒として０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ水溶液を用いたこと、塩化カルシウムの代わりに２当量の塩化ビスマス（ＩＩＩ）（ＢｉＣｌ₃、和光純薬製）を用いたこと以外は、実施例６と同様にして、Ｋ₁₂［ＢｉＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成し、単離した。実施例６と同様な方法で元素分析と³¹Ｐ−ＮＭＲを測定した。元素分析により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：５．７０（５．７３）、Ｂｉ：２．４４（２．４１）、Ｐ：１．８１（１．８０）、Ｗ：６４．５（６４．６）、Ｈ：０．５８（０．５４）が得られ、本化合物がＫ₁₂［ＢｉＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・２５Ｈ₂Ｏであることを確認した。³¹Ｐ−ＮＭＲにおいて、−８．２ｐｐｍに［ＢｉＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^12-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0066】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
染色剤としてＫ₁₂［ＢｉＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を用いたこと以外は、実施例６と同様な方法で行った。結果を図１３に示す。

【0067】

［実施例１１］ Ｅｕ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／Ｔ７
（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
実施例９の染色剤を用いたこと以外は、実施例２と同様な方法で行った。結果を図１４に示す。

【0068】

［実施例１２］ Ｅｕ−Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ／λ
（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
実施例３の観察対象を用いたこと以外は、実施例１１と同様な方法で行った。結果を図１５に示す。

【0069】

［実施例１３］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ−ＮＨ₄塩／Ｔ４
（Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸ＮＨ₄塩の合成）
実施例１記載の既報に従って合成したＫ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を原料とし、Ｈ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を経由して（ＮＨ₄）₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成した。具体的には、２０ｇのＫ_12.5Ｎａ_1.5［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・１５Ｈ₂Ｏを３００ｍｌの純水に溶解し、５０ｇのＤｏｗｅｘ５０Ｗ×８（プロトン型陽イオン交換樹脂、和光純薬製）をつめたカラム（カラム内径：約１５ｍｍ）にこの溶液を流通させることでＨ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］へ変換した。得られた溶液をロータリーエバポレーター（３２ｍｂａｒ、４５℃）を用いて濃縮、乾燥し、固体を得た。実施例６と同様な方法で元素分析と³¹Ｐ−ＮＭＲを測定し、実施例１と同様な方法で¹⁸³Ｗ−ＮＭＲを測定した。元素分析により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：＜０．０００２（０．００）、Ｎａ：０．２６（０．２８）、Ｐ：１．７２（１．８８）、Ｗ：６７．０２（６６．７７）、Ｈ：１．１０（１．２４）が得られ、本化合物がＨ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・４４Ｈ₂Ｏであることを確認した。³¹Ｐ−ＮＭＲにより、−９．４ｐｐｍに［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン由来のシグナルが確認された。¹⁸³Ｗ−ＮＭＲにより、−２０７．８、−２０９．７、−２７５．９および−２８８．３ｐｐｍに［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0070】

０．７７２ｇのＨ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・４４Ｈ₂Ｏと１０ｍｌの純水を、冷却管を取り付けた２００ｍｌ二口フラスコに入れ、９５℃に加熱したオイルバス中に３０分間保持した。その溶液に０．１２ｇの炭酸水素アンモニウム（ＮＨ₄ＨＣＯ₃、和光純薬製）を５５ｍｌの純水に溶解した溶液を、滴下ロートを用いて３０分かけて滴下した。滴下終了後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーター（３２ｍｂａｒ、４５℃）を用いて、３時間濃縮乾燥した。実施例１と同様な方法でＦＴ−ＩＲと³¹Ｐ−ＮＭＲを測定した。ＦＴ−ＩＲスペクトルにおいては、７８４、９１２、９３５、９８４、１０１８、１０７９および１１６４ｃｍ^-1に［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオンに特徴的な振動が、１４０１ｃｍ^-1にＮＨ₄⁺カチオンに特徴的な振動が観測された。³¹Ｐ−ＮＭＲにより、−９．４ｐｐｍに［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0071】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
（ＮＨ₄）₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を染色剤として用いたこと以外は、実施例１と同様な方法で行った。結果を図１６に示す。

【0072】

［実施例１４］ Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ−Ｋ塩／Ｔ４
（Ｐｒｅｙｓｓｌｅｒ型リンタングステン酸Ｋ塩の合成）
実施例１記載の既報に従い、Ｋ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を合成した。具体的には、タングステン酸ナトリウム・２水和物（Ｎａ₂ＷＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、和光純薬製）９９ｇを純水９０ｍｌに溶解し、８５質量％リン酸（８５質量％Ｈ₃ＰＯ₄、和光純薬製）７９．５ｍｌを添加した。この溶液を、テフロン（登録商標）内筒型密閉容器（ＴＡＦ−ＳＲ型、内容積３００ｍｌ、耐圧硝子工業製）に入れて密閉後、１２０℃の水熱条件下で一晩静置した。容器を室温まで放冷して容器を開放し、純水４５ｍｌをゆっくりと添加、引き続いて塩化カリウム（和光純薬製）３０ｇを添加した。生じた沈澱は、吸引ろ過によりろ別し、２ｍｏｌ／ｌの酢酸カリウム（和光純薬製）水溶液（１５０ｍｌ）およびメタノール（和光純薬製）（１５０ｍｌ）で洗浄した。吸引条件下で乾燥すると薄い黄白色固体が得られた（約６０ｇ）。得られた黄白色固体（約６０ｇ）を１００度の熱水７０ｍｌに溶解し、静置してゆっくり室温まで放冷し、再結晶した。吸引ろ過して白色固体を得た（約２５ｇ）。この得られた白色固体（約２５ｇ）を１００度の熱水２０ｍｌに溶解し、静置して室温までゆっくり放冷し、再結晶した。析出した固体を吸引ろ過して、白色固体を得た（約２０ｇ）。実施例６と同様な方法で元素分析と³¹Ｐ−ＮＭＲを測定した。元素分析により、質量％での実測値（計算値）として、Ｋ：６．３１（６．５０）、Ｎａ：０．２８（０．２７）、Ｐ：１．８３（１．８４）、Ｗ：６５．５（６５．５）、Ｈ：０．５４（０．５５）が得られ、本化合物がＫ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・２３Ｈ₂Ｏであることを確認した。³¹Ｐ−ＮＭＲにより、−９．４ｐｐｍに［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］^14-アニオン由来のシグナルが確認された。

【0073】

なお、前述したように、リンタングステン酸の水和水量（ｎＨ₂Ｏ）は、乾燥状態や保管状態などにより変化するが、本発明においては、その変化は染色剤としての性能に影響を及ぼさない。また、本願発明者の検討により、Ｋ_14-xＮａ_x［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・ｎＨ₂ＯにおけるＮａの含有率ｘは、同様な調製条件で合成された場合にも、元素分析結果におけるｘが０〜１．５の間で変化する場合があることが分かった（例えば、実施例１と実施例６ではｘ＝１．５、実施例１４ではｘ＝０）。この変化も、原料としての性質および染色剤としての性能に影響は与えないため、ｘおよびｎの異なるＫ_14-xＮａ_x［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］・ｎＨ₂Ｏは本発明において問題なく使用できる。

【0074】

（観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察）
Ｋ₁₄［ＮａＰ₅Ｗ₃₀Ｏ₁₁₀］を染色剤として用いたこと以外は、実施例１と同様な方法で行った。結果を図１７に示す。

【符号の説明】

【0075】

１ ピンセット
２ グリッド
３ マイクロピペット
４ ろ紙

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】