特許 6015894 タンパク質アレイの製造方法及びタンパク質アレイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6015894

(24)【登録日】2016年10月7日

(45)【発行日】2016年10月26日

(54)【発明の名称】タンパク質アレイの製造方法及びタンパク質アレイ

(51)【国際特許分類】

   C07K 17/02 20060101AFI20161013BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20161013BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20161013BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161013BHJP

【ＦＩ】

   C07K17/02ZNA

   C12M1/00 A

   G01N37/00 102

   !C12N15/00 F

【請求項の数】24

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2012-62451(P2012-62451)

(22)【出願日】2012年3月19日

(65)【公開番号】特開2013-193988(P2013-193988A)

(43)【公開日】2013年9月30日

【審査請求日】2015年3月19日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの

(73)【特許権者】

【識別番号】504190548

【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000004112

【氏名又は名称】株式会社ニコン

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(72)【発明者】

【氏名】根本 直人

(72)【発明者】

【氏名】上野 真吾

(72)【発明者】

【氏名】一木 隆範

(72)【発明者】

【氏名】塩野 博文

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５０６８９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 再公表特許第２００５／００１０８６（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 再公表特許第２００７／０４６５２０（ＪＰ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １７／０２

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＤＮＡが固定化された第一のビーズを準備する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる配列と、タンパク質との連結部を有するアーム部と、を含む核酸リンカーが固定化された第二のビーズを準備する工程と、
（ｃ１）複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、
（ｄ１）前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ１）の後、前記第一のビーズと前記第二のビーズとを前記反応槽内に配置する工程と、
（ｅ１）前記工程（ｄ１）の後、前記第一のビーズに固定化された前記ＤＮＡを転写し、ｍＲＮＡを合成し、前記ｍＲＮＡを前記第二のビーズに固定化された核酸リンカーにハイブリダイズさせる工程と、を有し、
前記タンパク質は、前記第一のビーズに固定化された前記ＤＮＡを転写してなる前記ｍＲＮＡを翻訳してなるものであり、
前記第一のビーズは、前記第二のビーズより大きいことを特徴とするタンパク質アレイの製造方法。

【請求項2】

前記反応槽の底面の直径又は一辺が前記第一のビーズの直径の１〜２倍である請求項１に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項3】

前記工程（ｄ１）において前記第一のビーズを前記反応槽内に配置した後、前記第二のビーズを前記反応槽に配置する請求項１又は請求項２に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項4】

更に、
（ｆ１）前記工程（ｅ１）の後、前記第一のビーズ及び前記第二のビーズを回収する工程と、
（ｇ１）前記工程（ｆ１）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｈ）複数の第二のビーズ用反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、（ｉ１）前記工程（ｇ１）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズを前記第二のビーズ用反応槽内に配置する工程と、を有し、
前記第一のビーズの直径は、前記第二のビーズ用反応槽底面の直径又は一辺よりも大きい請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項5】

前記工程（ｆ１）は、前記第二のビーズを回収後洗浄する工程を有する請求項４に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項6】

前記第二のビーズ用反応槽の底面の直径又は一辺が、前記第二のビーズの直径の１〜２倍である請求項４又は５に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項7】

前記工程（ｇ１）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有する請求項４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項8】

更に、
（ｇ２）前記工程（ｅ１）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項9】

前記工程（ｇ２）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有する請求項８に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項10】

（ａ）ＤＮＡが固定化された第一のビーズを準備する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる配列と、タンパク質との連結部を有するアーム部と、を含む核酸リンカーが固定化された第二のビーズを準備する工程と、
（ｃ２）連通孔を有する仕切りで仕切られ、底面の直径又は一辺の異なる２種類の微小反応槽を含む、複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、
（ｄ２）前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ２）の後、前記第一のビーズと前記第二のビーズのうち、大きいビーズを大きい微小反応槽内に配置した後、小さいビーズを小さい微小反応槽内に配置する工程と、
（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、転写系を用いて、前記第一のビーズに固定化されたＤＮＡを転写し、合成されたｍＲＮＡを、前記第二のビーズに固定化された核酸リンカーにハイブリダイズさせる工程と、を有し、
前記大きい微小反応槽の底面の直径又は一辺が前記大きいビーズの直径の１〜２倍であり、
前記小さい微小反応槽の底面の直径又は一辺が前記小さいビーズの直径の１〜２倍であることを特徴とするタンパク質アレイの製造方法。

【請求項11】

前記小さい微小反応槽の底面の直径又は一辺は、前記大きいビーズの直径よりも小さい請求項１０に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項12】

更に、
（ｆ２）前記工程（ｅ２）の後、前記第二のビーズを回収する工程と、
（ｇ３）前記工程（ｆ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｈ）複数の第二のビーズ用反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、
（ｉ２）前記工程（ｇ３）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズを前記第二のビーズ用反応槽内に配置する工程と、を有する請求項１０又は１１に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項13】

前記工程（ｆ２）は、前記第二のビーズを回収後洗浄する工程を有する請求項１２に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項14】

前記第二のビーズ用反応槽の底面の直径又は一辺が、前記第二のビーズの直径の１〜２倍である請求項１２又は１３に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項15】

前記工程（ｇ３）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有する請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項16】

更に、
（ｇ４）前記工程（ｅ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程を有する請求項１０又は１１に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項17】

前記工程（ｇ４）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有する請求項１６に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項18】

前記工程（ａ）において、エマルジョン１個あたり平均１分子以下のＤＮＡと平均１個以下の第一のビーズが含まれるように油中水型エマルジョンを調製する工程と、
前記エマルジョン内で核酸増幅反応を行い、固相結合部位が付加されたＤＮＡを前記ビーズに固定化する工程と、を有する請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項19】

前記第一のビーズに固定されるＤＮＡは一種類である請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項20】

前記第一のビーズに多分子のＤＮＡを固定する請求項１〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項21】

前記第二のビーズに多分子の核酸リンカーを固定する請求項１〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項22】

前記第一のビーズ及び前記第二のビーズは、磁気ビーズであり、前記ビーズ配置用基板は、磁気ビーズ配置用基板であり、前記工程（ｄ１）、（ｄ２）、（ｉ１）及び（ｉ２）は、前記磁気ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、前記磁気ビーズを前記反応槽に誘導する工程を有する請求項１〜２１のいずれか一項に記載のタンパク質アレイの製造方法。

【請求項23】

タンパク質が配置された複数の反応槽を備えたタンパク質アレイであって、前記反応槽にはそれぞれ、
ＤＮＡが固定化された第一のビーズと、
前記ＤＮＡを転写したｍＲＮＡとハイブリダイズし、前記ｍＲＮＡに基づき翻訳されたタンパク質とアーム部において連結した核酸リンカーが固定化され、前記第一のビーズより小さい第二のビーズと、が配設されたことを特徴とするタンパク質アレイ。

【請求項24】

タンパク質が配置された複数の反応槽を備えたタンパク質アレイであって、
前記反応槽には、ＤＮＡが固定化された第一のビーズと、
前記第一のビーズとはサイズが異なり、前記ＤＮＡを転写したｍＲＮＡとハイブリダイズし、前記ｍＲＮＡに基づき翻訳されたタンパク質とアーム部において連結した核酸リンカーが固定化された第二のビーズと、が配設され、
前記反応槽は連通孔を有する仕切りで仕切られた第一の微小反応槽と、
第一の微小反応槽よりも底面の直径又は一辺の大きい第二の微小反応槽と、から成り、
前記第一の微小反応槽には、
前記第一のビーズと、
前記第二のビーズのうち小さいビーズと、が配設され、
前記第二の微小反応槽には、
前記第一のビーズと、
前記第二のビーズのうち大きいビーズと、が配設されたことを特徴とするタンパク質アレイ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質アレイの製造方法、及びこれを用いて製造されたタンパク質アレイに関する。

【背景技術】

【0002】

新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。

【0003】

新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であったが、より有用なタンパク質を取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。

【0004】

進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。

【0005】

ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた有用タンパク質のスクリーニング方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成し、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次いで、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製した後、作製したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製する。
次いで、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつタンパク質を選択し、選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択した後でもよい（非特許文献２参照）。

【0006】

上記ｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、効率的に有用タンパク質のスクリーニングを行うためには、膨大な数の変異体を同時並列的に評価する必要がある。
そのためには、ランダム変異を導入したＤＮＡからなるＤＮＡマイクロアレイに基づいてタンパク質アレイを効率よく製造する方法が望まれている。

【0007】

このような要望に対して、微小リアクターを備えたマイクロリアクターアレイと基板を重ね合わせる工程を繰り返すことにより、ＤＮＡマイクロアレイから、ｍＲＮＡアレイ、タンパク質アレイを一連の過程において製造する方法が提案されている（特許文献２参照）。
かかる方法においては、マイクロリアクターチップを構成する微小リアクターに転写系試薬を準備し、ＤＮＡマイクロアレイと該マイクロリアクターアレイを重ね合わせて、微小リアクター内で、ｍＲＮＡを合成する。
次いで、上述したような核酸リンカーが固定された基板を、合成されたｍＲＮＡが充填されているマイクロリアクターアレイと重ね合わせて、ｍＲＮＡと核酸リンカーを結合させ、ｍＲＮＡアレイを製造する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特許第４３１８７２１号公報

【特許文献2】特開２００８−１１６２１８号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｎｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、第４１４巻、第４０５〜４０８頁、１９９７年

【非特許文献2】Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第３７巻、ｅ１０８頁、２００９年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

進化分子工学的手法においては、スクリーニングの回数を増やすほど有用なタンパク質を得られる。従って、一連のサイクル数は多いほどよく、その一方でスクリーニングの精度の観点から、一サイクルにおける工程数は極力少ない方がよい。
そのためスクリーニング方法の更なる効率化が求められている。

【0011】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、迅速に、かつ効率よくタンパク質アレイを製造できるタンパク質アレイの製造方法、及び該製造方法により製造されたタンパク質アレイを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸を固定化するための大きさの異なる２種類のビーズを用いることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（２４）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、
（ａ）ＤＮＡが固定化された第一のビーズを準備する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる配列と、タンパク質との連結部を有するアーム部と、を含む核酸リンカーが固定化された第二のビーズを準備する工程と、
（ｃ１）複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、
（ｄ１）前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ１）の後、前記第一のビーズと前記第二のビーズとを前記反応槽内に配置する工程と、
（ｅ１）前記工程（ｄ１）の後、前記第一のビーズに固定化された前記ＤＮＡを転写し、ｍＲＮＡを合成し、前記ｍＲＮＡを前記第二のビーズに固定化された核酸リンカーにハイブリダイズさせる工程と、を有し、
前記タンパク質は、前記第一のビーズに固定化された前記ＤＮＡを転写してなる前記ｍＲＮＡを翻訳してなるものであり、
前記第一のビーズは、前記第二のビーズより大きいことを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記反応槽の底面の直径又は一辺が前記第一のビーズの直径の１〜２倍であることが好ましい。
（３）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｄ１）において前記第一のビーズを前記反応槽内に配置した後、前記第二のビーズを前記反応槽に配置することが好ましい。
（４）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、更に、
（ｆ１）前記工程（ｅ１）の後、前記第一のビーズ及び前記第二のビーズを回収する工程と、
（ｇ１）前記工程（ｆ１）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｈ）複数の第二のビーズ用反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、（ｉ１）前記工程（ｇ１）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズを前記第二のビーズ用反応槽内に配置する工程と、を有し、
前記第一のビーズの直径は、前記第二のビーズ用反応槽底面の直径又は一辺よりも大きいことが好ましい。
（５）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｆ１）は、前記第二のビーズを回収後洗浄する工程を有することが好ましい。
（６）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記第二のビーズ用反応槽の底面の直径又は一辺が、前記第二のビーズの直径の１〜２倍であることが好ましい。
（７）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｇ１）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有することが好ましい。
（８）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、更に、
（ｇ２）前記工程（ｅ１）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程を有することが好ましい。
（９）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｇ２）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製することが好ましい。
（１０）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、
（ａ）ＤＮＡが固定化された第一のビーズを準備する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる配列と、タンパク質との連結部を有するアーム部と、を含む核酸リンカーが固定化された第二のビーズを準備する工程と、
（ｃ２）連通孔を有する仕切りで仕切られ、底面の直径又は一辺の異なる２種類の微小反応槽を含む、複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、
（ｄ２）前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ２）の後、前記第一のビーズと前記第二のビーズのうち、大きいビーズを大きい微小反応槽内に配置した後、小さいビーズを小さい微小反応槽内に配置する工程と、
（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、転写系を用いて、前記第一のビーズに固定化されたＤＮＡを転写し、合成されたｍＲＮＡを、前記第二のビーズに固定化された核酸リンカーにハイブリダイズさせる工程と、を有し、
前記大きい微小反応槽の底面の直径又は一辺が前記大きいビーズの直径の１〜２倍であり、
前記小さい微小反応槽の底面の直径又は一辺が前記小さいビーズの直径の１〜２倍であることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記小さい微小反応槽の底面の直径又は一辺は、前記大きいビーズの直径よりも小さいことが好ましい。
（１２）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、更に、
（ｆ２）前記工程（ｅ２）の後、前記第二のビーズを回収する工程と、
（ｇ３）前記工程（ｆ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｈ）複数の第二のビーズ用反応槽が配設されたビーズ配置用基板を準備する工程と、
（ｉ２）前記工程（ｇ３）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズを前記第二のビーズ用反応槽内に配置する工程と、を有することが好ましい。
（１３）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｆ２）は、前記第二のビーズを回収後洗浄する工程を有することが好ましい。
（１４）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記第二のビーズ用反応槽の底面の直径又は一辺が、前記第二のビーズの直径の１〜２倍であることが好ましい。
（１５）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｇ３）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有することが好ましい。
（１６）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、更に、
（ｇ４）前記工程（ｅ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程を有することが好ましい。
（１７）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｇ４）は、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製した後、更に、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程を有することが好ましい。
（１８）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ａ）において、エマルジョン１個あたり平均１分子以下のＤＮＡと平均１個以下の第一のビーズが含まれるように油中水型エマルジョンを調製する工程と、
前記エマルジョン内で核酸増幅反応を行い、固相結合部位が付加されたＤＮＡを前記ビーズに固定化する工程と、を有することが好ましい。
（１９）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記第一のビーズに固定されるＤＮＡは一種類であることが好ましい。
（２０）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記第一のビーズに多分子のＤＮＡを固定することが好ましい。
（２１）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記第二のビーズに多分子の核酸リンカーを固定することが好ましい。
（２２）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイの製造方法は、前記第一のビーズ及び前記第二のビーズは、磁気ビーズであり、前記ビーズ配置用基板は、磁気ビーズ配置用基板であり、前記工程（ｄ１）、（ｄ２）、（ｉ１）及び（ｉ２）は、前記磁気ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、前記磁気ビーズを前記反応槽に誘導する工程を有することが好ましい。
（２３）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイは、タンパク質が配置された複数の反応槽を備えたタンパク質アレイであって、前記反応槽にはそれぞれ、
ＤＮＡが固定化された第一のビーズと、
前記ＤＮＡを転写したｍＲＮＡとハイブリダイズし、前記ｍＲＮＡに基づき翻訳されたタンパク質とアーム部において連結した核酸リンカーが固定化され、前記第一のビーズより小さい第二のビーズと、が配設されたことを特徴とする。
（２４）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイは、タンパク質が配置された複数の反応槽を備えたタンパク質アレイであって、
前記反応槽には、ＤＮＡが固定化された第一のビーズと、
前記第一のビーズとはサイズが異なり、前記ＤＮＡを転写したｍＲＮＡとハイブリダイズし、前記ｍＲＮＡに基づき翻訳されたタンパク質とアーム部において連結した核酸リンカーが固定化された第二のビーズと、が配設され、
前記反応槽は連通孔を有する仕切りで仕切られた第一の微小反応槽と、
第一の微小反応槽よりも底面の直径又は一辺の大きい第二の微小反応槽と、から成り、
前記第一の微小反応槽には、
前記第一のビーズと、
前記第二のビーズのうち小さいビーズと、が配設され、
前記第二の微小反応槽には、
前記第一のビーズと、
前記第二のビーズのうち大きいビーズと、が配設されたことを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイから、ｍＲＮＡアレイ、及びタンパク質アレイを迅速に、かつ効率よく得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1B】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1C】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1D】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1E】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1F】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1G】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1H】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図1I】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図2】本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。

【図3A】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図3B】本実施形態におけるタンパク質アレイの製造方法の模式図である。

【図4】実施例における電気泳動の結果である。

【図5】実施例において、ＧＦＰのｍＲＮＡと、核酸リンカーをハイブリダイズさせたものの概略図である。

【図6】実施例における電気泳動の結果である。

【図7】実施例における電気泳動の結果である。

【図8】実施例における電気泳動の結果である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

≪タンパク質アレイの製造方法≫
［第１実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、タンパク質が配置された複数の反応槽を備えたタンパク質アレイの製造方法であって、
（ａ）前記タンパク質をコードするＤＮＡが固定化された第一のビーズを準備する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる配列と、前記タンパク質との連結部を有するアーム部と、を含む核酸リンカーが固定化された第二のビーズを準備する工程と、
（ｃ１）ビーズ配置用基板に配設された複数の反応槽を準備する工程と、
（ｄ１）前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ１）の後、前記第一のビーズを前記反応槽内に配置した後、前記第二のビーズを前記反応槽内に配置する工程と、
（ｅ１）前記工程（ｄ１）の後、転写系を用いて、前記第一のビーズに固定化されたＤＮＡを転写し、合成されたｍＲＮＡを、前記第二のビーズに固定化された核酸リンカーにハイブリダイズさせる工程と、を有し、
前記第一のビーズは、前記第二のビーズより大きく、
前記反応槽の底面の直径又は一辺が前記第一のビーズの直径の１〜２倍である。
以下、図１Ａ〜図１Ｅを参照しながら、各工程について説明する。

【0016】

工程（ａ）は、タンパク質３３をコードするＤＮＡ１３が固定化された第一のビーズ１４を準備する工程である（図１Ａ、図２参照）。
固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、ＤＮＡ１３をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。

【0017】

工程（ａ）において、前記固相は、第一のビーズ１４である。ビーズは、後にＤＮＡ１３を容易に回収でき、かつ、球体であるために、基板と比べて、表面積が大きく、基板上にＤＮＡ１３を固定する場合より多分子数のＤＮＡを固定できる観点から優れている。更に、第一のビーズ１４は、後述するビーズ配置用基板１１中の各反応槽１２に、短時間で配列させることが可能であるという観点から磁気ビーズであることが好ましい。

【0018】

ＤＮＡ１３は、ｃＤＮＡでもゲノムＤＮＡでもよく、進化分子工学的観点から、ランダム変異が導入されたものであることが好ましい。

ランダム変異を導入したＤＮＡ１３からなるＤＮＡマイクロアレイを製造する際には膨大な分子数の変異ＤＮＡライブラリーを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ上の１スポットに１種類のＤＮＡ分子を固定する。
このような固定化を容易にするものとして、１分子エマルジョンＰＣＲ法を利用することが好ましい。
１分子エマルジョンＰＣＲ法とは、乳化剤が混和した油の中に水を攪拌して逆ミセルコロイド（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）エマルジョン ）を形成させることで限られた反応空間の中に１分子変異ＤＮＡを容易に隔離することを可能とする方法である。
ＤＮＡ１３が１分子封入されたエマルジョン内で核酸増幅反応を行えば、１個のエマルジョン中には増幅された１種類のＤＮＡ１３のみが存在することになる。

【0019】

各々の変異ＤＮＡを解析する必要性の観点から、１個のエマルジョン中に複数の変異ＤＮＡが混在することは適切ではないため、本実施形態においては、エマルジョン１個あたり平均１分子以下のＤＮＡが含まれるように油中水型エマルジョンを調製する工程を有することが好ましい。

【0020】

従って、前記工程（ａ）は、エマルジョン１個あたり平均１分子以下のＤＮＡ１３と平均１個以下の第一のビーズ１４が含まれるように油中水型エマルジョンを調製する工程を有することが好ましい。

【0021】

前記工程（ａ）では、鋳型として用いられる変異ＤＮＡ（以下、鋳型ＤＮＡ）や核酸増幅に必要な試薬等が調製されている水性成分に、油、乳化剤を混合して油中水型エマルジョンを調製することが好ましい。これによって、複数個の鋳型ＤＮＡが複数のエマルジョン（逆ミセル）によって区画化される。即ち、鋳型ＤＮＡを内包する複数のエマルジョン（逆ミセル）が得られる。
エマルジョンの調製には、攪拌処理（磁気攪拌子、プロペラ式などの使用）、ホモジナイズ（ホモジナイザー、乳鉢などの使用）、超音波処理（ソニケーターなどの使用）などを利用できる。
エマルジョンの大きさは特に限定されないが、エマルジョン１個の体積は、エマルジョンの平均粒径を基に算出できる。エマルジョンの平均粒径は、１μｍ〜１００μｍが好ましく、５μｍ〜５０μｍがより好ましく、１０μｍ〜３０μｍが特に好ましい。
エマルジョン粒子の数は前記水性成分の体積からエマルジョン１個の体積を割ることにより算出される。よって、エマルジョン１個あたり平均１分子以下のＤＮＡが含まれるように油中水型エマルジョンを調製するためには、全体におけるエマルジョンの数以下の分子数のＤＮＡを用意すればよい。

【0022】

エマルジョンとしては、熱安定性に優れているものが好ましい。熱安定性に優れたエマルジョンを用いれば、ＰＣＲ法などの高温処理を伴う核酸増幅反応の間、エマルジョンを維持することができる。従って、各ミセル間でコンタミネーションが起こることを防止でき、効率よく核酸増幅が行われる。これによって、各ミセル内に鋳型ＤＮＡが一分子含まれるように条件設定すれば、各ミセル内において鋳型一分子に由来する核酸分子を多分子数得ることが可能となる。
従って、エマルジョンを用いた核酸増幅反応を行うことにより、高密度化したＤＮＡマイクロアレイを製造することができる。さらにかかるＤＮＡマイクロアレイを用いて製造されたタンパク質アレイもまた各スポットに多分子のタンパク質が固定化された高密度なものとすることができ、特定の活性を有するタンパク質を選択する際の検出感度が向上する。
かかるエマルジョンに用いられる乳化剤としては、ゴールドシュミット社製ＡＢＩＬ（登録商標）ＷＥ０９、ＡＢＩＬ（登録商標）ＷＳ０８、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０等が挙げられる。

【0023】

工程（ａ）では、油中水型エマルジョンに平均１個以下の第一のビーズ１４が含まれるように調製することが好ましい。
エマルジョンの数は、上記計算により算出され、全体におけるエマルジョンの数以下の個数の第一のビーズ１４を用意すればよい。各エマルジョンに含まれる第一のビーズ１４の数が２個以上の場合、核酸増幅反応後の第一のビーズ１４の１個当たりが固定するＤＮＡ１３の分子数が減少することになる。これは、高密度ＤＮＡマイクロアレイを作製するという観点から適切ではない。また、同じ種類のＤＮＡが固定化されたビーズが複数存在する確率が高くなるため、スクリーニング効率の観点からも適切ではない。

【0024】

このようにＤＮＡ１３の固相担体として第一のビーズ１４を用いれば、基板上にＤＮＡ１３を直接固定する場合より多分子数のＤＮＡ１３を固定することができる。

【0025】

前記工程（ａ）において、膨大な分子数の変異ＤＮＡを準備することが好ましいため、鋳型ＤＮＡは、変異ＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡであることが好ましい。
変異ＤＮＡライブラリーとしては、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ（エラープローンＰＣＲ）を利用したライブラリー、Ｇｅｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、Ｒａｎｄｏｍ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー、ＩＴＣＨＹ Ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＳＣＲＡＴＣＨＹ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー等が挙げられる。

【0026】

エラープローンＰＣＲ法とは、ＰＣＲ反応中に人為的にランダムなエラーを発生させる方法である。該エラープローンＰＣＲ法においては、プルーフリーディング（校正）機能のないＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。エラープローンである該ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの本来の性質を利用したものである。更に、１突然変異が有用な頻度で起こるようにするために、反応液中にＭｎ^２＋を添加することや、ｄＮＴＰ濃度を不均衡にすることがより好ましく、かかる処理により、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエラー発生率が増加する。

【0027】

工程（ａ）における前記エマルジョン内での鋳型ＤＮＡの核酸増幅反応としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられ、ＰＣＲ法による増幅反応を利用することが好ましい。

【0028】

前記エマルジョン内での鋳型ＤＮＡの核酸増幅反応に用いられる試薬は、採用する核酸増幅反応に合わせて適当な核酸増幅反応用試薬を使用することが好ましい。例えば、核酸増幅反応としてＰＣＲを採用する場合には、ＰＣＲを構成する各反応に必要な試薬、即ちｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼが用いられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼや、プルーフリーディング（校正）機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。これらの試薬は市販されており、容易に入手可能である。

【0029】

鋳型ＤＮＡや核酸増幅に必要な試薬等を含む水性成分は、核酸増幅反応に適した溶液として調製される。例えば、ＰＣＲ反応が良好に進行するように、トリス−塩酸等のバッファーを用いて、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０程度の溶液とする。

【0030】

また、工程（ａ）は、エマルジョン内で核酸増幅反応を行い、固相結合部位が付加されたｃＤＮＡをビーズに固定化する工程を有することが好ましい。
本実施形態では、鋳型ＤＮＡの特定領域をＰＣＲ反応で増幅可能な一対のプライマーセット（以下、便宜上「第１プライマーと第２プライマー」と称する）が用いられることが好ましい。この態様において片方のプライマー（第２プライマー）を固相化しておけば、第２プライマーを介して固相担体（第一のビーズ１４）に結合した状態で増幅産物を得ることができる。

【0031】

前記第２プライマーと前記第一のビーズ１４との結合としては、上述したように、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、前記第２プライマーをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。

【0032】

エマルジョンＰＣＲを行った後、ＤＮＡ固定化ビーズを取出すためにエマルジョンを破壊させることが好ましい。該エマルジョンの破壊は、当技術分野で公知の任意の手段によって可能であり、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００やノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０等の界面活性剤を加えることにより行われる。

【0033】

工程（ｂ）は、ＤＮＡ１３を転写してなるｍＲＮＡ２３とハイブリダイズし得る配列５０と、タンパク質３３との連結部２ａを有するアーム部６０と、を含む核酸リンカー２が固定化された第二のビーズ２４を準備する工程である（図１Ｂ、図２参照）。
上述した様に、用いられるビーズは、球体であり、基板と比べて表面積が大きいため、固相担体として第二のビーズ２４を用いることにより、固定化する核酸リンカー２の分子数を増やすことができる。固定化された核酸リンカー２の分子数は、後記工程（ｅ１）において、第二のビーズ２４が固定化するｍＲＮＡ２３の分子数、及び後記工程（ｇ１）において、無細胞翻訳系を用いて合成されるタンパク質３３の分子数に反映されるため、本実施形態によれば、１スポット当たりに多分子数のタンパク質を固定することができる。

【0034】

以下、本実施形態において用いられる核酸リンカー２の構造について、図２を用いて説明する。
なお、核酸リンカーは、後述するように、前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズし得る配列と、前記タンパク質との連結部を有するアーム部と、ビーズへの固定化に用いられる基を含む構造のものであればよく、図２の構造に限定されるものではない。

【0035】

（核酸リンカー）
工程（ｂ）において用いられる核酸リンカー２は、ｍＲＮＡ２３と、これらがコードするタンパク質３３とを連結するためのリンカーである。
図２中、Ｐはピューロマイシン、Ｆはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（フルオロセイン）を示している。

【0036】

核酸リンカー２は、３’側の領域にスクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の３’末端側の配列とハイブリダイズし得る配列５０（以下、配列５０）と、タンパク質３３との連結部２ａを末端に有するアーム部６０を有する。

【0037】

配列５０は，ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど，当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。

【0038】

アーム部６０は、ｍＲＮＡ２３とタンパク質連結部２ａとを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部６０の５’末端は、配列５０の３’末端側の箇所で配列５０と結合し、アーム部６０の３’末端はタンパク質連結部２ａを有する。

【0039】

配列５０とアーム部６０との連結は、配列５０上の連結箇所に存在する修飾ヌクレオチド（例えばアミノ基がスペーサーを介して塩基部分に導入されたヌクレオチド）と、アーム部６０の末端に存在する修飾ヌクレオチド（例えばチオールを５’末端にもつヌクレオチド）とを二官能性試薬を用いて架橋することにより行うことができる。
後述するようにスクリーニングすべきタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、アーム部６０の５’末端は、配列５０の３’末端から数塩基５’側の位置で配列５０と結合し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。逆転写の際に配列５０の３’末端がプライマーとして機能するからである。

【0040】

３’末端を除くアーム部６０は、標識物質を用いて標識されてもよい。標識物質は、蛍光色素や放射性物質等から適宜選択される。本実施形態においては、図２に示されるように、３’末端を除くアーム部６０がフルオロセイン２ｄで修飾されている。かかる修飾により核酸リンカー２が蛍光標識され、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体、又は、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を容易に検出することができる。

【0041】

アーム部６０の３’末端にはタンパク質３３の連結部２ａが存在する。タンパク質連結部２ａとは，所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質３３のＣ末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質３３の連結部２ａとしては、伸張中のタンパク質３３のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などを挙げることができる。

【0042】

アーム部６０は、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。アーム部６０にはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や、複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。

【0043】

本実施形態に用いられる核酸リンカー２は、切断部位２ｃ１，２ｃ２を含む。切断部位２ｃ１，２ｃ２としては、光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位が挙げられる。
切断部位２ｃ１，２ｃ２により、タンパク質３３と対応づけられるｍＲＮＡ２３（またはｃＤＮＡ４３）を回収することができる。
光切断性部位とは，紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとして、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）などが挙げられる。
光切断性部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよい。また、１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。

【0044】

本実施形態においては、核酸リンカー２は、第二のビーズ２４と固定するための固相結合部位２ｂを有する。また、第二のビーズ２４は、核酸リンカー２と結合するための固相結合部位認識部位２４ａを有する。
核酸リンカー２の固定化には、工程（ａ）におけるＤＮＡ１３を第一のビーズ１４に固定化する場合と同様に、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、第二のビーズ２４をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
また、第二のビーズ２４は、後述するビーズ配置用基板１１中の反応槽１２に、短時間で配列させることが可能であるという観点から磁気ビーズであることが好ましい。
このように、工程（ｂ）において、核酸リンカー２が固定化された第二のビーズ２４を準備する（図１Ｂ参照）。

【0045】

工程（ｃ１）は、ビーズ配置用基板１１に配設された複数の反応槽１２を準備する工程である（図１Ｃ参照）。
ビーズ配置用基板１１の表面及び反応槽１２内壁を、ＤＮＡ等生体分子の非特異吸着防止用ブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）で好適にコーティングすることができる。かかるブロッキング剤をコーティングすることで、ビーズ配置用基板１１表面や反応槽１２の内壁への生体分子の非特異吸着を抑制することができる。

【0046】

ビーズ配置用基板１１に用いられる基板材料は、透明なガラス又はポリマー材であることが好ましく、リークを抑える目的からは、ポリジメチルシロキサンなどのエラストマー材料であることがより好ましい。なお、ビーズ配置用基板１１に用いられる基板材料にエラストマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が反応槽１２とビーズ配置用基板１１との間に挟まれた時に生じる反応槽１２全体のビーズ配置用基板１１との密着性に及ぼす悪影響がエラストマーの局所的な変形により回避される利点がある。

【0047】

本実施形態において、第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４として磁気ビーズを用いる場合には、ビーズ配置用基板１１に用いられる基板材料下に、磁性体板が配設されていることが好ましい。
かかる構造のビーズ配置用基板１１を用いることにより、反応槽１２に第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４を容易にかつ確実に配置することができる。

【0048】

工程（ｄ１）は、前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ１）の後、第一のビーズ１４を反応槽１２内に配置した後、第二のビーズ２４を反応槽１２内に配置する工程である（図１Ｄ参照）。本実施形態においては、第一のビーズ１４が第二のビーズ２４より大きいものである。
反応槽１２の底面は、正方形又は円であり、かかる底面の直径又は一辺は、前記第一のビーズの直径の１〜２倍である。そのため、第一のビーズ１４を先に反応槽１２内に配置させることにより、反応槽１２内に第一のビーズ１４が１個配置される。
これにより、後記工程（ｅ１）において、１種類のＤＮＡ由来のｍＲＮＡが第二のビーズ２４に固定化される。

【0049】

上述したように、第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４は、磁気ビーズであることが好ましく、ビーズ配置用基板１１は、磁気ビーズ配置用基板であることが好ましい。かかる場合、工程（ｄ１）は、磁気ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、磁気ビーズを反応槽１２に誘導する工程を有することが好ましい。
具体的には、先ず、ビーズ配置用基板１１（磁気ビーズ配置用基板）の下部に磁石を配置し、ビーズ配置用基板１１（磁気ビーズ配置用基板）上に、ＤＮＡ１３を固定化した第一のビーズ１４（磁気ビーズ）を分散させた分散液を滴下する。第一のビーズ１４（磁気ビーズ）及び磁性体薄膜による磁力の作用により、反応槽１２内へ第一のビーズ１４（磁気ビーズ）が誘引されることにより配置されやすくなる。さらに磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで第一のビーズ１４（磁気ビーズ）が分散し、反応槽１２内への充填率が向上する。
次いで、反応槽１２内にＤＮＡ１３が固定された第一のビーズ１４を配置した後、核酸リンカー２が固定化された第二のビーズ２４を配置する。
具体的な配置方法は、第一のビーズ１４の配置方法と同様である。反応槽１２内には、既に第一のビーズ１４が１個充填されており、反応槽１２内の残りの空間に、第二のビーズ２４が少なくとも１個充填される。反応槽１２に先に大きいビーズ（第一のビーズ１４）を配置した後に、小さいビーズ（第二のビーズ２４）を配置することにより、１つの反応槽１２には、１個の第一のビーズ１４と少なくとも１個の第二のビーズ２４がそれぞれ配置される。

【0050】

磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００〜１００００ガウスである。
また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズは安定した配置を保持し続けることが可能となる。

【0051】

かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができ、本実施形態においては残留磁化の大きな磁性材料を用いることが好ましい。

【0052】

反応槽１２は、親水化されていることが好ましく、反応槽１２を酸素プラズマ照射などにより親水化処理することにより、反応槽１２内部への磁気ビーズを分散させた液の充填が容易になり、充填率が向上する。

【0053】

工程（ｅ１）は、前記工程（ｄ１）の後、転写系を用いて、第一のビーズ１４に固定化されたＤＮＡ１３を転写し、合成されたｍＲＮＡ２３を、第二のビーズ２４に固定化された核酸リンカー２にハイブリダイズさせる工程である（図１Ｅ参照）。
従来は、ビーズ間のｍＲＮＡの移送として、第一のビーズに固定化されたＤＮＡを転写して合成されたｍＲＮＡを、ピペット等を用いて、核酸リンカーが固定化されている第二のビーズが充填されている反応槽に移し変えるしかなく、作業の迅速性、及び、ｍＲＮＡの移送効率の面で問題があった。
本実施形態においては、同一の反応槽１２内に、第一のビーズ１４に固定化されたＤＮＡ１３と、第二のビーズ２４に固定化された核酸リンカー２が配置されているため、転写系を用いて、ＤＮＡ１３を転写してｍＲＮＡ２３が合成されると同時に、合成されたｍＲＮＡ２３がビーズ間（第一のビーズ１４から第二のビーズ２４へ）を拡散し、核酸リンカー２にハイブリダイズする。従って、本実施形態によれば、迅速に、且つ、効率よく、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体が形成される。

【0054】

工程（ｅ１）における転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
また、工程（ｅ１）において、ｍＲＮＡ２３の３’末端と核酸リンカー２の５’末端とをライゲーションさせる工程を有することが好ましい。ライゲーションに際し、ｍＲＮＡ２３の３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。

【0055】

本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、更に、
（ｆ１）前記工程（ｅ１）の後、前記第一のビーズ及び前記第二のビーズを回収して洗浄する工程と、
（ｇ１）前記工程（ｆ１）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させ、前記第二のビーズ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｈ）ビーズ配置用基板配置用基板に配設された複数の第二のビーズ用反応槽であって、底面の直径又は一辺が前記第二のビーズの直径の１〜２倍であるものを準備する工程と、
（ｉ１）前記工程（ｇ１）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズを前記第二のビーズ用反応槽内に配置する工程と、を有し、
前記第一のビーズの直径は、前記第二のビーズ用反応槽底面の直径又は一辺よりも大きいことが好ましい。
以下、図１Ｆ〜図１Ｈを参照しながら、各工程について説明する。

【0056】

工程（ｆ１）は、前記工程（ｅ１）の後、第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４を回収して洗浄する工程である（図１Ｆ参照）。前記工程（ｅ１）の後、転写系による反応槽１２中の粘性が高いものとなっている。そこで、一度反応槽１２から第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４をバッチに回収し、洗浄により異物を取り除くことで、後記工程（ｇ１）において前記第二のビーズ２４にハイブリダイズされたｍＲＮＡ２３を翻訳する際、翻訳効率を上昇させることができる。
洗浄に用いられる洗浄液としては、後記工程（ｇ１）で用いられる翻訳系のバッファー等を用いることが好ましい。洗浄方法としては、遠心分離による従来公知の方法が用いられる。

【0057】

工程（ｇ１）は、前記工程（ｆ１）の後、翻訳系を用いて、第二のビーズ２４にハイブリダイズされたｍＲＮＡ２３を翻訳し、合成されたタンパク質３３を、核酸リンカー２を介して第二のビーズ２４に連結させ、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程である（図１Ｆ参照）。

【0058】

工程（ｇ１）における翻訳系とは、無細胞タンパク質合成系を意味する。
無細胞タンパク質合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
このような翻訳系を用いることにより、第二のビーズ２４にハイブリダイズされたｍＲＮＡ２３を翻訳し、タンパク質３３が合成される。合成されたタンパク質３３は、核酸リンカー２のタンパク質連結部２ａに連結される。即ち、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体が固定される。

【0059】

また、工程（ｇ１）は、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製した後、更に、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を逆転写反応に供して、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ４３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程を有していてもよい（図２参照）。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
逆転写されたｃＤＮＡ４３はｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体のｍＲＮＡ２３とハイブリッドを形成する。ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体中のｍＲＮＡ２３は、化学的に不安定であるほか、アプタマーとして非特異的相互作用する可能性が高いため、タンパク質間相互作用解析を行う場合には、このようなｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ４３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製しておくことが好ましい。
また、スクリーニングにより、有用性の見出されたタンパク質をコードするｃＤＮＡを解析するためには、この複合体の作製が必須である。

【0060】

工程（ｈ）は、ビーズ配置用基板６１に配設された複数の第二のビーズ用反応槽６２であって、底面の直径又は一辺が前記第二のビーズ２４の直径の１〜２倍であるものを準備する工程である（図１Ｇ、図１Ｈ参照）。
ビーズ配置用基板６１及び第二のビーズ用反応槽６２の材質等については、ビーズ配置用基板１１及び反応槽１２の材質等と同様である。第二のビーズ２４を、第二のビーズ用反応槽６２へ効率よく充填させる観点から、ビーズ配置用基板６１は、磁気ビーズ配置用基板であることが好ましい。
第二のビーズ用反応槽６２の底面は、正方形又は円であり、かかる底面の直径又は一辺は、第二のビーズ２４の直径の１〜２倍である。そのため、後記工程（ｉ１）において、第二のビーズ用反応槽６２内に第二のビーズ２４が１個配置される。

【0061】

工程（ｉ１）は、前記工程（ｇ１）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズ２４を前記第二のビーズ用反応槽６２内に配置する工程である（図１Ｈ参照）。
工程（ｇ１）において、バッチ中の翻訳反応により得られたｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体が固定化された第二のビーズ２４、及び第一のビーズ１４を分散させた分散液を、ビーズ配置用基板６１上に滴下する。
前記第一のビーズ１４の直径は、第二のビーズ用反応槽６２底面の直径又は一辺よりも大きいため、第二のビーズ２４に固定されたｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を前記第二のビーズ用反応槽６２内に配置する際には、第一のビーズ１４は、第二のビーズ用反応槽６２内に充填されることなく、第二のビーズ用反応槽６２内に第二のビーズ２４のみが充填される。
上述したように、第二のビーズ２４を、第二のビーズ用反応槽６２へ効率よく充填させる観点から、ビーズ配置用基板６１は、磁気ビーズ配置用基板であり、磁気を利用することが好ましい。

【0062】

また、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｆ１）、（ｇ１）、（ｈ）及び（ｉ１）に代えて、更に、前記工程（ｅ１）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズ２４にハイブリダイズされたｍＲＮＡ２３を翻訳し、合成されたタンパク質３３を、前記核酸リンカー２を介して前記第二のビーズ２４に連結させる工程（ｇ２）を有していてもよい（図１Ｉ参照）。
即ち、転写・翻訳カップリング反応液中、もしくは、転写反応を終えた反応槽１２に翻訳系を重層し、転写系等の異物の混ざった翻訳反応液中で、第二のビーズ２４上のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体から、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を合成してもよい。
また、工程（ｇ２）は、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製した後、更に、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を逆転写反応に供して、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ４３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程を有していてもよい。

【0063】

本実施形態のタンパク質アレイの製造方法によれば、ビーズ間のｍＲＮＡの移送を自動的に効率よく行えるため、工程数を削減することができ、作業の迅速化を図ることができる。
また、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法によれば、ＤＮＡマイクロアレイから精度よく転写・翻訳されてなるタンパク質アレイを得ることができる。
さらに、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、ビーズに固定されたＤＮＡから、ビーズに固定された核酸リンカーを介してｍＲＮＡ、タンパク質をビーズに固定する方法であるため、基板上に直接固定されたＤＮＡから、転写・翻訳反応を介して、基板上に直接タンパク質を固定する場合よりも高密度のタンパク質アレイを得ることができる。

【0064】

［第２実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、タンパク質が配置された複数の反応槽を備えたタンパク質アレイの製造方法であって、
（ａ）前記タンパク質をコードするＤＮＡが固定化された第一のビーズを準備する工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡを転写してなるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる配列と、前記タンパク質との連結部を有するアーム部と、を含む核酸リンカーが固定化された第二のビーズを準備する工程と、
（ｃ２）ビーズ配置用基板に配設された複数の反応槽内であって、連通孔を有する仕切りで仕切られ、底面の直径又は一辺の異なる２種類の微小反応槽からなるものを準備する工程と、
（ｄ２）前記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ２）の後、前記第一のビーズと前記第二のビーズのうち、大きいビーズを大きい微小反応槽内に配置した後、小さいビーズを小さい微小反応槽内に配置する工程と、
（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、転写系を用いて、前記第一のビーズに固定化されたＤＮＡを転写し、合成されたｍＲＮＡを、前記第二のビーズに固定化された核酸リンカーにハイブリダイズさせる工程と、を有し、
前記大きい微小反応槽の底面の直径又は一辺が前記大きいビーズの直径の１〜２倍であり、
前記小さい微小反応槽の底面の直径又は一辺が前記小さいビーズの直径の１〜２倍である。本実施形態において、第１実施形態の工程と同様のものについては説明を省略し、図１Ａ〜図１Ｉのタンパク質アレイの製造方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。

【0065】

工程（ｃ２）は、ビーズ配置用基板１１に配設された複数の反応槽１２であって、連通孔を有する仕切り１２ａで仕切られ、径の異なる２種類の微小反応槽からなるものを準備する工程である（図３Ａ参照）。
複数の反応槽１２は、連通孔を有する仕切り１２ａで仕切られ、大きい微小反応槽１２ｂと小さい微小反応槽１２ｃからなる。仕切り１２ａの有する連通孔の大きさは、ｍＲＮＡ２３を通すことのできる大きさで、かつ、小さいビーズを通さない大きさであれば、特に限定されない。また、仕切り１２ａに設けられる連通孔の数についても特に限定されない。

【0066】

工程（ｄ２）は、工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ２）の後、第一のビーズ１４と第二のビーズ２４のうち、大きいビーズを大きい微小反応槽１２ｂ内に配置した後、小さいビーズを小さい微小反応槽１２ｃ内に配置する工程である（図３Ｂ参照）。
ビーズ配置用基板１１において、大きい微小反応槽１２ｂの底面の直径又は一辺は、大きいビーズの直径の１〜２倍であり、小さい微小反応槽１２ｃの底面の直径又は一辺は、小さいビーズの直径の１〜２倍である。
第一のビーズ１４と第二のビーズ２４のうち、どちらが大きい方であってもよいが、後記工程（ｉ２）において、第二のビーズ２４を第二のビーズ用反応槽６２内に効率よく配置する観点から、本実施形態においては、第一のビーズ１４を大きい方とする。
これにより、仮に後記工程（ｆ２）において回収した第二のビーズ２４に不純物として第一のビーズ１４が混入していたとしても、後記工程（ｉ２）において、大きさの大きい第一のビーズ１４は、第二のビーズ用反応槽６２内に充填されず、第二のビーズ２４のみが第二のビーズ用反応槽６２内に充填される。

【0067】

本実施形態におけるビーズの具体的な配置方法としては、先ず、大きいビーズである第一のビーズ１４を、大きい微小反応槽１２ｂ内に配置する。
次いで、小さいビーズである第二のビーズ２４を、小さい微小反応槽１２ｃ内に配置する。大きい微小反応槽１２ｂ内には、既に第一のビーズ１４が１個充填されているため、第二のビーズ２４が充填される余地はなく、第二のビーズ２４は、小さい微小反応槽１２ｃに１個充填される。

【0068】

工程（ｅ２）は、前記工程（ｄ２）の後、転写系を用いて、第一のビーズ１４に固定化されたＤＮＡ１３を転写し、合成されたｍＲＮＡ２３を、第二のビーズ２４に固定化された核酸リンカー２にハイブリダイズさせる工程である。
本実施形態においては、隣接する微小反応槽１２ｂ，１２ｃ内に、１個の第一のビーズ１４に固定化されたＤＮＡ１３と、１個の第二のビーズ２４に固定化された核酸リンカー２が仕切り１２ａを介して配置されている。そのため、転写系を用いて、ＤＮＡ１３を転写してｍＲＮＡ２３を合成すると同時に、合成されたｍＲＮＡ２３が連通孔を通って、ビーズ間（第一のビーズ１４から第二のビーズ２４へ）を拡散し、核酸リンカー２にハイブリダイズする。
従って、本実施形態によれば、所定の大きさのビーズを所定の微小反応槽に、１個ずつ配置することができるため、１個の第二のビーズ２４上に、より多分子数のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体が形成される。

【0069】

工程（ｅ２）における転写系としては、工程（ｅ１）における転写系と同様のものが挙げられる。
また、工程（ｅ２）において、ｍＲＮＡ２３の３’末端と核酸リンカー２の５’末端とをライゲーションさせる工程を有することが好ましい。工程（ｅ１）と同様に、ライゲーションに際し、ｍＲＮＡ２３の３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。

【0070】

本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、更に、
（ｆ２）前記工程（ｅ２）の後、前記第二のビーズを回収して洗浄する工程と、
（ｇ３）前記工程（ｆ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズにハイブリダイズされたｍＲＮＡを翻訳し、合成されたタンパク質を、前記核酸リンカーを介して前記第二のビーズに連結させる工程と、
（ｈ）ビーズ配置用基板に配設された複数の第二のビーズ用反応槽であって、底面の直径又は一辺が前記第二のビーズの直径の１〜２倍であるものを準備する工程と、
（ｉ２）前記工程（ｇ３）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズを前記第二のビーズ用反応槽内に配置する工程と、を有することが好ましい。
以下、各工程について説明する。

【0071】

工程（ｆ２）は、前記工程（ｅ２）の後、前記第二のビーズ２４を回収して洗浄する工程である。本実施形態においては、第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４がそれぞれ別の微小反応槽１２ｂ，１２ｃに配置されているため、微小反応槽１２ｃから第二のビーズ２４のみを回収することができる。また、工程（ｆ１）と同様に、第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４の両方を回収した後、工程（ｉ１）で第二のビーズ２４のみを選別して、第二のビーズ２４を第二のビーズ用反応槽６２内に配置してもよい。

【0072】

工程（ｇ３）は、前記工程（ｆ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズ２４にハイブリダイズされたｍＲＮＡ２３を翻訳し、合成されたタンパク質３３を、前記核酸リンカー２を介して前記第二のビーズ２４に連結させ、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程である。工程（ｇ３）は、前記工程（ｆ２）の後に行われること以外は、前記工程（ｇ１）と同様であるため、説明を省略する。
また、工程（ｇ３）は、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製した後、更に、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を逆転写反応に供して、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ４３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程を有していてもよい。

【0073】

工程（ｉ２）は、前記工程（ｇ３）及び（ｈ）の後、前記第二のビーズ２４を前記第二のビーズ用反応槽６２内に配置する工程である。
工程（ｆ２）において、第一のビーズ１４及び第二のビーズ２４の両方を回収する場合には、前記第一のビーズ１４の直径は、前記第二のビーズ２４の直径の２倍以上であることが好ましい。第一のビーズ１４の直径が係る場合には、第一のビーズ１４は、第二のビーズ用反応槽６２内に充填されることなく、第二のビーズ用反応槽６２内に第二のビーズ２４のみが充填される。
また、工程（ｆ２）において、第二のビーズ２４のみを回収する場合には、第一のビーズ１４の直径についての上記限定は必要とされない。

【0074】

また、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、前記工程（ｆ２）、（ｇ３）、（ｈ）及び（ｉ２）に代えて、更に、前記工程（ｅ２）の後、翻訳系を用いて、前記第二のビーズ２４にハイブリダイズされたｍＲＮＡ２３を翻訳し、合成されたタンパク質３３を、前記核酸リンカー２を介して前記第二のビーズ２４に連結させる工程（ｇ４）を有していてもよい。工程（ｇ４）は、前記工程（ｅ２）の後に行われること以外は、前記工程（ｇ２）と同様であるため、説明を省略する。
また、工程（ｇ４）は、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製した後、更に、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を逆転写反応に供して、第二のビーズ２４上にｍＲＮＡ２３／ｃＤＮＡ４３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を作製する工程を有していてもよい。

【0075】

本実施形態のタンパク質アレイの製造方法によれば、所定の大きさのビーズを所定の微小反応槽に、１個ずつ配置することができるため、１個の第二のビーズ２４上に多分子数のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体が形成される。従って、第１実施形態の効果に加えて、より高密度のタンパク質アレイを得ることができる。

【0076】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0077】

（ビオチン修飾二本鎖ＤＮＡの調製）
５’側にＴ７、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３’末端にリンカーのＤＮＡ部分と相補な配列をもち、終止コドンを削ったＧＦＰ遺伝子（配列番号１：８８９ｂｐ）を鋳型とし、ビオチン修飾されたプライマーを用いてＰＣＲによりビオチン修飾二本鎖ＤＮＡを調製した。反応液を表１に記載の組成となるように調製し、９８℃で２分間保持した後、９８℃１０秒、６８℃１０秒、７２℃２０秒の３ステップＰＣＲを２０サイクル行い、４℃で冷却した。
用いたプライマーの配列を以下に示す。
（１） Ｂｉｏｔｉｎ−Ｎｅｗ Ｌｅｆｔ (２２ｍｅｒ)
［配列：５’−（Ｂ）−Ｘ−３’］
ここで、Ｘは以下の配列を表す。
ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号２：３３ｍｅｒ）

（２）Ｎｅｗ Ｙｔａｇ ｔｏ ＨＧＧＳ−Ｒ (３３ｍｅｒ)
［配列：５’−ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴ−３’］ （配列番号３：３９ｍｅｒ）

【0078】

【表1】

【0079】

ＰＣＲ産物に対してＰＡＧＥ解析（４％非変性ＰＡＧＥ, ＳｙｂｒＧｏｌｄ染色)を行い、８８９ｂｐの目的産物の増幅を確認した。その結果を図４に示す。上記ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ (Ｑｉａｇｅｎ) で精製し、濃度２．９ｘ１０^−８Ｍのビオチン修飾二本鎖ＤＮＡを得た。

【0080】

（磁気ビーズの前処理）
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（１０ｍｇ／ｍｌ, ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) １００μｌを、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ （０．１Ｍ ＮａＯＨ， ０．０５Ｍ ＮａＣｌ) １００μｌを用いて２回ｗａｓｈし、ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ （０．１Ｍ ＮａＣｌ）１００μｌを用いて１回ｗａｓｈし、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ (１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００) １００ μｌに懸濁した。懸濁液を３本のエッペンドルフチューブに１０μlずつ分注し、更に３本のエッペンドルフチューブに２０μlずつ分注した。

【0081】

（ビオチン修飾二本鎖ＤＮＡの固定）
１０μlずつ分注した懸濁液の上清を除去し、表２に記載された組成の溶液に懸濁し、室温で３０分間攪拌した。懸濁液中の磁気ビーズを、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １００ μｌで３回ｗａｓｈした後、１ｘ Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （ｐｒｏｍｅｇａ) ２０ μl に懸濁した。

【0082】

【表2】

【0083】

（核酸リンカーの固定）
２０μlずつ分注した懸濁液の上清を除去し、表３に記載された組成の溶液に懸濁し、室温で３０分間攪拌した。懸濁液中の磁気ビーズを、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １００ μｌで３回ｗａｓｈした後、１ｘ Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （ｐｒｏｍｅｇａ) ２０ μl に懸濁した。

【0084】

【表3】

【0085】

表３中、ＳＢＰ（Ｉ）とは、核酸リンカーを表す。図５に、ＧＦＰのｍＲＮＡと核酸リンカー（ＳＢＰ（Ｉ））をハイブリダイズさせたものの概略図を示す。図５中、Ｐはピューロマイシン、ＦはＦＩＴＣ、ＥＭＣＳは二価架橋剤、Ｂはビオチンを示す。（Ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を示す。
大文字で示した部分はＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡを示す。Ｉはデオキシイノシンを示し、矢印はＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶによる切断部位を示す。

【0086】

（転写反応）
ビオチン修飾二本鎖ＤＮＡ固定化磁気ビーズ４０μｌと核酸リンカー固定化磁気ビーズ ８０μｌを混合した後、上清を除去し、表４に記載された組成の転写反応液に懸濁し、３７℃で、２時間撹拌反応した。尚、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットとして、Ｒｉｂｏｍａｘ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｔ７) （Ｐｒｏｍｅｇａ)を使用した。
反応後の上清の一部をＰＡＧＥ解析（８ Ｍ Ｕｒｅａ ４％ ＰＡＧＥ，ＳｙｂｒＧｏｌｄ染色）した。結果を図６に示す。レーンＡ，Ｂ，Ｃは、３連の結果を示す。
図６に示されるように、磁気ビーズ上に固定されたビオチン修飾二本鎖ＤＮＡをテンプレートにした転写反応によって、ｍＲＮＡが生成されていることが確認された。

【0087】

【表4】

【0088】

（逆転写反応・ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理）
懸濁液中の磁気ビーズを、１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １００ μｌで３回ｗａｓｈし、１ｘ ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ) ２０ μｌで１回ｗａｓｈした後、表５に記載された組成の溶液に懸濁し、４２℃で３０分間攪拌した。

【0089】

【表5】

【0090】

（ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理）
懸濁液の上清を除去し、表６に記載された組成の溶液に懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理反応後の上清を回収し、回収された上清３μｌに対してＰＡＧＥ解析（４％非変性ＰＡＧＥ, ＳｙｂｒＧｏｌｄ染色、およびＦＩＴＣ蛍光検出) を行った。結果を図７に示す。レーンＡ，Ｂ，Ｃは、３連の結果を示す。

【0091】

【表6】

【0092】

図７中、逆転写反応後でＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理反応前の上清（逆転写反応上清）、及び逆転写反応後でＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理反応後の上清（ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理後上清）の両レーンにおいて、ＳｙｂｒＧｏｌｄ染色によりバンドが検出されたことから、逆転写反応によりｃＤＮＡが生成されていることが確認された。
更に、ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理後上清のレーンでのみ、核酸リンカーに標識されたＦＩＴＣ蛍光が検出されたことから、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が形成され、ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理により、核酸リンカーの有する切断部位でｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が切断されていることが確認された。

【0093】

更に、ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理後上清のＰＡＧＥ（８Ｍ Ｕｒｅａ ５％ ＰＡＧＥ, ＳｙｂｒＧｏｌｄ染色、およびＦＩＴＣ蛍光検出)解析を行った。結果を図８に示す。図８左は、ＳｙｂｒＧｏｌｄ染色による解析結果を示し、図８右は、ＦＩＴＣ蛍光検出による解析結果を示す。
図８左において、逆転写処理後、未反応のｍＲＮＡが存在しないことから、核酸リンカー（ＳＢＰ（Ｉ））にハイブリダイズしたｍＲＮＡは全て逆転写されていることが確認された。ＦＩＴＣ蛍光検出像から、ハイブリダイズ効率は１５−４０％であった。

【0094】

以上の結果から、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法によれば、ビーズ間のｍＲＮＡの移送を自動的に効率よく行えるため、工程数を削減することができ、作業の迅速化を図ることができる。また、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法によれば、ＤＮＡマイクロアレイから精度よく転写・翻訳されてなるタンパク質アレイを得ることができる。
さらに、本実施形態のタンパク質アレイの製造方法は、ビーズに固定されたＤＮＡから、ビーズに固定された核酸リンカーを介してｍＲＮＡ、タンパク質をビーズに固定する方法であるため、基板上に直接固定されたＤＮＡから、転写・翻訳反応を介して、基板上に直接タンパク質を固定する場合よりも高密度のタンパク質アレイを得ることができることが明らかである。

【符号の説明】

【0095】

２…核酸リンカー、２ａ…連結部、２ｂ…固相結合部位、２ｃ１，２ｃ２…切断部位、２ｄ…フルオロセイン、１１，６１…ビーズ配置用基板、１２…反応槽、１２ａ…仕切り、１２ｂ，１２ｃ…微小反応槽、１３，４３…ｃＤＮＡ、１４…第一のビーズ、２３…ｍＲＮＡ、２４…第二のビーズ、２４ａ…固相結合部位認識部位、３３…タンパク質、５０…配列、６０…アーム部、６２…第二のビーズ用反応槽

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図5】

【図4】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]