特許 6590330 経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法および経口免疫寛容増強組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6590330

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法および経口免疫寛容増強組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/06 20060101AFI20191007BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20191007BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20191007BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20191007BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/06 Z

   A61K35/74 C

   A61K35/74 D

   A61K35/747

   A61P37/06

【請求項の数】1

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2013-233082(P2013-233082)

(22)【出願日】2013年11月11日

(65)【公開番号】特開2015-92841(P2015-92841A)

(43)【公開日】2015年5月18日

【審査請求日】2016年9月1日

【審判番号】不服2018-8275(P2018-8275/J1)

【審判請求日】2018年6月15日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２５年６月２０日付けにて、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｉｔｙ／ａｂｓｔｒａｃｔ／Ｓ１０７４−７６１３（１３）００２４０−９およびｈｔｔｐ：／／ａｃ．ｅｌｓ−ｃｄｎ．ｃｏｍ／Ｓ１０７４７６１３１３００２４０９／１−ｓ２．０−Ｓ１０７４７６１３１３００２４０９−ｍａｉｎ．ｐｄｆ？＿ｔｉｄ＝３ｆ４８８７００−５１ａ６−１１ｅ３−ａｅｆ７−０００００ａａｂ０ｆ２６＆ａｃｄｎａｔ＝１３８４９２６２０３＿８０８９ｄｃｆｅｃｄｂ１ｅ１ｃ２６ｂ９３４４ｂｆ６４ｅ７ｆ９１７にて公開；平成２５年６月２１日付けにて、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｉｓｔ＿ｊ／ｐｒｅｓｓ＿ｒｅｌｅａｓｅ／ｐｒ２０１３／ｐｒ２０１３０６２１／ｐｒ２０１３０６２１．ｈｔｍｌにて公開；平成２５年６月２１日付けにてウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｋｋｏｍａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｒｐｏｒａｔｅ／ｎｅｗｓ／２０１３０６１９．ｈｔｍｌにて公開

(73)【特許権者】

【識別番号】000004477

【氏名又は名称】キッコーマン株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】川島 忠臣

(72)【発明者】

【氏名】藤田 友紀

(72)【発明者】

【氏名】松島 健一朗

(72)【発明者】

【氏名】大野 博司

(72)【発明者】

【氏名】郭 子進

(72)【発明者】

【氏名】辻 典子

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 澤田 浩平

【審判官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５１６２６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３８７０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／００５１２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１１１７３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１９９７年，Ｖｏｌ． １８，Ｎｏ． ７，ｐｐ．３３５−３４３

【文献】 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０年，Ｖｏｌ． ８８，４６８−４７６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K35/00-36/9068, C12N15/00-15/90

ＪＳＴ７５８０／ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍ３）

ＰｕｂＭｅｄ，Ｇｏｏｇｌｅ，Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペディオコッカス・アシディラクティシの培養物、菌体または菌体成分を有効成分として含む、食物アレルギー抗原を先に経口投与することで得られる経口免疫寛容を増強することで、前記食物アレルギーを治療又は予防するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、経口免疫寛容を増強する物質・乳酸菌のスクリーニング方法とその組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

食物アレルギーとは、「食物によって引き起こされる抗原特異的な免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状が惹起される現象」をいう（例えば、非特許文献１参照）。

【0003】

食物中のタンパク質が十分に消化されタンパク質が分解されてしまえば、吸収されても免疫反応は起こらない。消化酵素の働きによるタンパク質の分解、粘膜面の粘液による物理的なバリア、タンパク質と結合するＩｇＡ抗体の分泌など、経口的に摂取された食物を体内に吸収する過程で、腸管においては様々なバリアが存在する。腸管においてはこれらのバリアにより未消化な食物の体内への侵入を防いでいるものの、実際には未消化なタンパク質も日常的に吸収されている。

【0004】

しかし、そのような外来のタンパク質に対して免疫反応が起こらない仕組みである経口免疫寛容が働くことで、食物アレルギーが起こらないように制御されている（例えば、非特許文献２参照）。つまり、食物アレルギーとは特定の食物に対する免疫寛容がうまく働かなくなっている状態と考えられる。

【0005】

現在、特定の食物アレルゲン除去による食物アレルギー発症の防止が行われているものの、その原因アレルゲンに対する経口免疫寛容が生体に誘導されない限り、根本的な治療にはならない。加えて、重症患者は食器などに付着した微量なアレルゲンに対してアナフィラキシーショックを起こすこともあり、除去食には限界がある。現在は、病院で経口負荷試験により決定した範囲内で原因アレルゲンを摂取する、「正しい診断に基づいた必要最低限の原因食物の除去」が指導されている（例えば、非特許文献３参照）。

【0006】

しかし、この方法についても除去食同様、食物アレルギーの根本的な治療とはならない。根本的な治療を目指す治療法として、原因アレルゲンを含む食品を少量ずつ摂取することで原因アレルゲンに対する耐性の獲得を誘導する経口免疫療法が臨床研究されている。治療経過中にアナフィラキシーショックを起こすことも多く、かつ、重篤な副反応も起こりうるため現段階では、本治療法は、一般診療として推奨されていない（例えば、非特許文献４参照）。

【0007】

そこで、経口免疫寛容を効率的に誘導することが可能となれば、食物アレルギーの根本的な治療を安全に行え、さらには、まだ、食物アレルギーを発症していない人々にとっても食物アレルギーの発症を未然に防ぐことができる。

【0008】

体内で共生する細菌は、適正な免疫応答を誘導し、アレルギーの発生を抑制することが期待される。特に、乳酸菌は、食経験が豊富である上、菌種により様々な免疫反応を惹起することが知られており、経口免疫寛容の誘導にも何らかの役割を果たしていることが期待される。その一方で、どのような性質を持つ乳酸菌が経口免疫寛容の正常な機能に関わっているかは定かではない。

【0009】

乳酸菌の摂取により、通年性アレルギー性鼻炎や花粉症、気管支喘息などのＩ型アレルギーの症状が緩和することは知られている（例えば、特許文献１、２参照）。

【0010】

しかし、食物アレルギーの発症メカニズムは現在も不明な点が多く、また、Ｉ型アレルギーのみを対象とした治療は、対症療法に過ぎず根本的な解決にはならない。そこで、Ｉ型アレルギーの抑制のみならず、経口免疫寛容を増強し、それをしっかりと機能させることで食物アレルギーの根本的な解決を達成することが求められている。つまり、経口免疫寛容の増強因子を特定し、経口免疫寛容を増強する物質を選択することが可能となれば、上述のような課題が解決される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】「食物アレルギーの診療の手引き２０１１」２０１１年、ｐ２

【非特許文献2】「食物アレルギー診療ガイドライン２０１２」２０１２年、ｐ２０−２５

【非特許文献3】「食物アレルギーの栄養指導の手引き２０１１」２０１１年、ｐ４

【非特許文献4】「食物アレルギー診療ガイドライン２０１２」２０１２年

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】特開２０１１−２５４７７３号公報

【特許文献2】特開２０１０−２０９０１５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法およびそれを含む組成物の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、経口免疫寛容の増強に関与する因子を特定し、それを元に経口免疫寛容を増強する組成物を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法であって、
インターフェロンβの産生を促進させる被験物質を経口免疫寛容増強物質と評価する工程を含む、スクリーニング方法。
（２）前記評価工程の前に、乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を被験物質として選定する工程を含む、（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）前記乳酸菌がペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属またはテトラジェノコッカス属の乳酸菌である、（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）前記評価工程の前に、インターフェロンβ産生細胞と前記被験物質とを接触させ、当該細胞におけるインターフェロンβ産生促進活性を測定する工程を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（５）前記インターフェロンβ産生細胞がトル様受容体３（ＴＬＲ３）及び／又はトル様受容体９（ＴＬＲ９）を発現している、（４）に記載のスクリーニング方法。
（６）前記インターフェロンβ産生細胞が樹状細胞である、（４）又は（５）に記載のスクリーニング方法。
（７）乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分として含む、経口免疫寛容増強組成物。
（８）前記乳酸菌がペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属またはテトラジェノコッカス属の乳酸菌である、（７）に記載の経口免疫寛容増強組成物。
（９）前記乳酸菌がペディオコッカス・アシディラクティシである、（８）に記載の経口免疫寛容増強組成物。
（１０）前記乳酸菌がペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５株である、（９）に記載の経口免疫寛容増強組成物。

【発明の効果】

【0015】

本発明の経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法によれば、インターフェロンβ産生促進作用の有無を指標として候補物質が選定されるため、候補物質をヒトや動物に直接投与することなく、in vitroで簡便にスクリーニングすることが可能になる。乳酸菌は経口免疫寛容増強物質の有力な候補であるが、これは、乳酸菌のＲＮＡ・ＤＮＡが樹状細胞等で発現しているトル様受容体３（ＴＬＲ３）及び／又はトル様受容体９（ＴＬＲ９）を介して経口免疫寛容の増強に関与しているためと考えられる。しかしながら、ＲＮＡ・ＤＮＡと経口免疫寛容増強との関係については理論に拘束されることを意図するものではない。得られた経口免疫寛容増強組成物は、抗ＩＶ型アレルギー剤、食物アレルギーの治療剤、経口免疫療法の治療補助剤
、または食物アレルギーの予防剤として好適に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】コントロール抗体、もしくは抗インターフェロンβ中和抗体を投与したマウスに経口免疫寛容を誘導した際の遅延型過敏反応の結果を示す図である。

【図2】コントロール抗体、もしくは抗インターフェロンβ中和抗体を投与したマウスに経口免疫寛容を誘導した際の血清中ＯＶＡ特異的抗体価の結果を示す図である。

【図3】コントロール抗体、もしくは抗インターフェロンβ中和抗体を投与したマウスに経口免疫寛容を誘導した際の脾臓細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生の結果を示す図である。

【図4】各種乳酸菌で刺激した際の骨髄由来樹状細胞のインターフェロンβ産生促進試験の結果を示す図である。

【図5】ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べたときの遅延型過敏反応の結果を示す図である。

【図6】ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べたときのＯＶＡ特異的抗体価の結果を示す図である。

【図7】ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べたときの脾臓細胞の抗原特異的サイトカイン産生の結果を示す図である。

【図8】Ｋ１５ノトバイオートマウス作製時の糞便中のＫ１５生菌数の結果を示す図である。

【図9】無菌マウス・Ｋ１５ノトバイオートマウスのパイエル板細胞の各サイトカインのｍＲＮＡ発現量の結果を示す図である。

【図10】無菌マウス・Ｋ１５ノトバイオートマウスの脾臓樹状細胞の各サイトカインｍＲＮＡ発現量の結果を示す図である。

【図11】Ｋ１５ノトバイオートマウス、Ｋ１６２ノトバイオートマウス作製時の糞便中の生菌数の測定結果を示す図である。

【図12】Ｋ１５ノトバイオートマウス、Ｋ１６２ノトバイオートマウスに経口免疫寛容を誘導した際の血清中ＯＶＡ特異的抗体価を示す図である。

【図13】Ｋ１５ノトバイオートマウス、Ｋ１６２ノトバイオートマウスに経口免疫寛容を誘導した際の脾臓細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生を示す図である。

【図14】食物アレルギーモデルでＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べた際の下痢の発症率を示す図である。

【図15】食物アレルギーモデルでＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べた際の小腸の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量を示す図である。

【図16】食物アレルギーモデルでＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べた際の腸間膜リンパ節細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生を示す図である。

【図17】食物アレルギーモデルでＫ１５の経口免疫寛容増強効果を調べた際の血清中ＯＶＡ特異的抗体価を示す図である。

【図18】ニンジン発酵液中のＫ１５の菌数の経時変化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明について更に詳しく説明する。尚、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

【0018】

（１）経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法においては、経口免疫寛容増強作用を決定する指標の一つとして、候補物質がインターフェロンβ産生促進作用を有するか否かについて評価される。ここで、「経口免疫寛容」とは、本明細書で使用する場合、経口的に摂取された抗原に対し免疫応答が抑制される状態（すなわち免疫寛容状態）が誘導されることを意味する。免疫寛容状態は、当業者にとって公知の方法、例えば、免疫寛容において重要な役割を果たすＴ細胞の反応性等の測定により評価することができる。

【0019】

本明細書で使用する場合、「経口免疫寛容増強」とは、対照物質との比較で、被験物質により有意に、例えば５％以上、１０％以上、２０％以上、又は５０％以上経口免疫寛容が増強されることを意味する。経口免疫寛容増強作用について評価される被験物質は特定の化学物質又はその混合物に限定されず、細菌の培養物、菌体または菌体成分であってもよい。食経験によって安全性を担保されている細菌を被験物質として選定することで、効率的なスクリーニングが可能になる。食品への応用性、安全性の観点から、被験物質としての細菌は乳酸菌であることが好ましく、特にペディオコッカス属（例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシ、ペディオコッカス・ペントサセウス）、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属またはテトラジェノコッカス属の乳酸菌であることがより好ましい。

【0020】

細菌の菌体は細菌の発酵物から得ることができ、例えば、乳酸菌を使用する場合、ニンジン搾汁液やトマト搾汁液等、乳酸菌が生育できる素材を用いて発酵することで得ることができる。菌体成分とは、例えば、細菌が保有する核酸であり、具体的にはＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡである。細菌の核酸成分は通常の分画方法によって得ることができる。

【0021】

細菌を被験物質として使用する場合、追加のスクリーニング指標として、細菌に含まれる二重鎖ＲＮＡの多寡を予め評価してもよい。これは、多量の二重鎖ＲＮＡを保有している細菌はインターフェロン産生促進作用を有する場合があるためである（結果は示さず）。細菌に含まれる二重鎖ＲＮＡの多寡は、病原菌、例えばリステリア菌、サルモネラ菌、ウエルシュ菌、ピロリ菌、チフス菌等に含まれるものとの比較で決定することができる。

【0022】

選定された被験物質は、インターフェロンβ産生細胞と接触して当該細胞におけるインターフェロンβ産生促進活性が測定される。被験物質のインターフェロンβ産生促進活性は常用の方法により評価することができる。限定することを意図するものではないが、インターフェロン産生細胞と被験物質とを共培養し、その培養上清中インターフェロンβ濃度を測定することでインターフェロン産生促進活性を測定してもよい。共培養条件は当業者により適宜決定されるものであるが、例えば、培養時間を６〜８時間としてもよい。また、インターフェロンβ産生細胞が骨髄由来樹状細胞である場合、インターフェロンβの十分な産生量を確保するために、当該細胞と乳酸菌とを両者の比率が１：１０〜１：１００（骨髄由来樹状細胞：乳酸菌）となるように培養液中に添加してもよい。あるいは、培養液１ｍｌ当たり乳酸菌が少なくとも１０μｇ〜１００μｇ存在すればインターフェロンβの産生を確認することができる。

【0023】

被験物質を添加したインターフェロンβ産生細胞におけるインターフェロンβの産生が、対照物質との比較で有意に、例えば５％以上、１０％以上、２０％以上、又は５０％以上増大する場合、被験物質を経口免疫寛容増強物質と評価することができる。インターフェロンβの産生は、当業者にとって公知の方法、例えばインターフェロンβ抗体による抗原抗体反応を利用する方法（酵素免疫測定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）等）や、インターフェロンβの抗ウィルス作用を利用した方法（CPE（cytopathogenic effect）法等）を介して測定してもよい。

【0024】

本発明で使用するインターフェロンβ産生細胞の例として、二重鎖ＲＮＡを認識する受容体、例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ９等を発現している細胞、特に、樹状細胞が挙げられる。

【0025】

（２）経口免疫寛容増強組成物
本発明の経口免疫寛容増強組成物は、上記スクリーニング方法により得られた経口免疫寛容増強物質、例えば乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分を有効成分とする。乳酸菌とは、例えば、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、テトラジェノコッカス属の乳酸菌である。ペディオコッカス属の乳酸菌が好ましく、例えばディオコッカス・アシディラクティシ、特にペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５株がより好ましい。

【0026】

経口免疫寛容増強作用を示す限り、有効成分である乳酸菌の培養物、菌体または菌体成分は、どのような方法で調製されたものでもよい。乳酸菌の菌体は、ニンジン搾汁液やトマト搾汁液等、乳酸菌が生育できる素材を用いて発酵することで得ることができる。菌体成分とは、例えば、乳酸菌が保有する核酸であり、具体的にはＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡである。乳酸菌の核酸成分は通常の分画方法によって得ることができる。

【0027】

食物アレルギーの発症予防、もしくは経口免疫療法の治療補助を目的として本発明の経口免疫寛容増強組成物を摂取する場合、その摂取量は、摂取者の症状や体格に合わせて適宜設定すればよい。ペディオコッカス属に属する乳酸菌の菌体を有効成分とする場合、その菌体摂取量は、例えば１〜１０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。

【0028】

有効成分である乳酸菌の菌体または菌体成分は単独で使用してもよいし、他の成分と組み合わせて、例えば飲食品、医薬品に添加して使用することもできる。

【0029】

（３）経口免疫寛容増強組成物の製造法
本発明の経口免疫寛容増強組成物は、乳酸菌を培養し、培養物、菌体または菌体成分を採取することにより得られる。有効成分である経口免疫寛容増強活性を示す成分が得られる限り、乳酸菌の培養条件や、有効成分である培養物、菌体または菌体成分の採取方法は特に限定されない。

【0030】

以下に、ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５株の菌体を有効成分とする経口免疫寛容増強組成物の製造法を例示する。

【0031】

まず、例えば１０分間煮沸したニンジンを破砕し、遠心分離により得られた上清をニンジン搾汁液とする。ニンジン搾汁液にペディオコッカス・アシディラクティシを植菌し、２５〜３７℃で１２〜７２時間培養する。培養後に１０分間煮沸することで、乳酸菌のニンジン発酵液が得られる。

【0032】

上記のようにして得られたニンジン発酵液は、本発明の経口免疫寛容増強組成物として使用可能である。

【実施例1】

【0033】

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0034】

〔経口免疫寛容に関わる液性因子〕
インターフェロンβが経口免疫寛容の誘導に関わることを示した。

【0035】

１．マウスに対する抗体の投与
５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社）に対し、１日おきに７回、Ｒａｔ ＩｇＧコントロール抗体（シグマ社）もしくは抗インターフェロンβ中和抗体（ヤマサ社）を５０μｇ／匹で静脈投与した。

【0036】

２．マウスに対する経口免疫寛容の誘導
４回目の静脈投与の際に、経口免疫寛容を誘導するために、オボアルブミン（ＯＶＡ、シグマ社）を２５ｍｇ経口投与した。

【0037】

３．ＯＶＡ感作
７回目の静脈投与の９日後に、アレルギーを誘導するためにＯＶＡ３００μｇ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ １００μｌを背面皮下に投与した。

【0038】

４．遅延型過敏反応の測定
背面皮下免疫から１４日後にＯＶＡ５０μｇを足の裏の背面皮下に投与し、２４時間後に腫れの大きさを測定することで、遅延型過敏反応を調べた。この結果を図１に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0039】

図１に示すように、コントロール抗体投与マウスでは、ＯＶＡ経口投与（経口免疫寛容誘導）により、遅延型過敏反応が抑制されている一方で、抗インターフェロンβ中和抗体投与マウスでは遅延型過敏反応が抑制されなかった。

【0040】

５．血清中のＯＶＡ特異的抗体価の測定
遅延型過敏反応の測定後、イソフルラン麻酔下で採血を行った。１５００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、血清を得た。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ量、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、抗マウスＩｇＧ抗体、抗マウスＩｇＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液 （ｐＨ８．２）に５００倍希釈で添加し、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、血清サンプルを２倍−５００００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識ＯＶＡを１％ＢＳＡ添加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌとなるように溶解し、プレート上に５０μｌずつ分注した。ビオチン標識ＯＶＡは、シグマ社製のＯＶＡと、同仁化学研究所製のビオチン化キットを用いて作製した。１時間インキュベートした後に洗浄を行い、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり５０μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、生理食塩水摂取群に対する相対値でＯＶＡ特異的ＩｇＧ、ＩｇＥ量を定量化した。この結果を、図２に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0041】

図２に示すように、コントロール抗体投与マウスではＯＶＡ特異的ＩｇＧ，ＩｇＥ共に経口免疫寛容の誘導により抑制されていた。抗インターフェロンβ中和抗体投与群でも経口免疫寛容の誘導によりＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＧが抑制されていたことから、インターフェロンβは抗体産生の抑制には関与していないことが確認された。

【0042】

６．脾臓細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生の測定
採血後に脾臓を採取し、細胞の調製を行った。脾臓を採取後、メッシュにより脾臓をすり潰し、細胞の懸濁を行い、脾臓細胞を回収した。その後、９６ウェル丸底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）を用い、ＯＶＡ（シグマ社製）を１００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社）添加ＲＰＭＩ１６４０培地において脾臓細胞を１×１０⁶個／ウェルとなるように懸濁し、３日間培養を行った。培養後、１５００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を回収し、エンザイムイムノアッセイによりＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４濃度を測定した。ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４についてはＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅ社製のＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定し、ＩＬ−１７についてはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。結果を図３に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0043】

図３に示すように、コントロール抗体投与マウスにおいては全てのサイトカイン産生が経口免疫寛容の誘導により抑制された。一方で、抗インターフェロンβ中和抗体投与マウスでは、ＩＬ−４以外のサイトカインは抑制されなかった。以上より、インターフェロンβが生体において経口免疫寛容の誘導に関わっていることが示された。また、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥや脾臓細胞のＯＶＡ特異的ＩＬ−４産生は抑制されないことから、インターフェロンβはこれらが関わるＩ型アレルギーには大きな影響は与えないことが示された。しかし、Ｔ細胞等を介した遅延型のＩＶ型アレルギーには強く関わっていることが確認された。

【実施例2】

【0044】

〔マウス骨髄由来樹状細胞を用いた各種乳酸菌のインターフェロンβ産生促進試験〕
表１に示す乳酸菌を使用し、インターフェロンβ産生促進試験を実施した。

【表1】

【0045】

１．乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌を１×１０⁷個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で２４〜４８時間静置培養した後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。テトラジェノコッカス属については、食塩を１０％含むＭＲＳ培地で培養した後、集菌した。その後、生理食塩水にて菌体を洗浄後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行い、凍結乾燥を行った。

【0046】

２．インターフェロンβ産生促進試験
（１）骨髄由来樹状細胞懸濁液の調製
骨髄由来樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８−１２週齢、雌、日本クレア社）をイソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して安楽死させた後、下肢から大腿骨、頸骨を取り出し、氷冷した１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ， 非動化したもの）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）の入った細胞培養用６ｃｍ ディッシュ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に入れた。１％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０を注入して骨髄を押し出した後、懸濁した。得られた細胞懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ， ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）で濾過した後、４４０×ｇで５分間遠心分離した。

【0047】

溶血バッファー（５ｍＬ，０．１５５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．５）を加え５分間氷上に置いた後、１％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１１６４０（５ｍＬ）を加えて遠心分離し、１％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０でさらに２回洗浄した。ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗Ｉ−Ａ抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｍ５／１１４．１４．２， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製， ０．２ｍｇ／ｍＬ）、ＰＥ標識抗ＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製，０．２ｍｇ／ｍＬ）およびＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｃｌｏｎｅ ５３−６．７，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製，０．２ｍｇ／ｍＬ）をＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１０００倍希釈した抗体カクテル（１００μＬ／１０⁷ ｃｅｌｌｓ）およびウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ， Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、氷上で３０分間静置した。

【0048】

ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、抗ＰＥ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（２０μＬ／１０⁷ ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）とＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（８０μＬ／１０⁷ ｃｅｌｌｓ）を加え、４〜８℃で１５分間静置した。反応液の２０倍量のＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬ／１０⁸ ｃｅｌｌｓ）に懸濁し、自動磁気分離システム（Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてネガティブフラクションを分離した。分離した細胞を１％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した後、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）添加基本培地に懸濁した。基本培地は、１００，０００ Ｕ／Ｌペニシリン・１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ社）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ，和光純薬工業社製）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ，ナカライテスク社製）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ，同仁化学研究所製）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化したＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を１０％添加したものを用いた。

【0049】

ＧＭ−ＣＳＦはマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入したｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ Ｘ６３−Ａｇ８（Ｊ５５８Ｌ−ＧＭ−ＣＳＦ）の培養上清を基本培地に１０％添加した。細胞液をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、血球計算板を用いて細胞数を計測した後、細胞培養用６ウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に１．２×１０⁶／４ｍＬ／ウェルとなるように分注し、培養した。培養開始後３日目および６日目に培地を２ｍＬ吸引除去して新しいＧＭ−ＣＳＦ添加基本培地を２ｍＬ加え、培養開始後８日目に浮遊細胞を未成熟樹状細胞として回収した（ＣＤ１１ｃ陽性細胞＞８５％）。細胞を１％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、基本培地に懸濁し、骨髄由来樹状細胞懸濁液とした。

【0050】

（２）インターフェロンβ産生促進活性の測定
上記のようにして得た細胞と乳酸菌を用い、共培養を行った。９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に骨髄由来樹状細胞を２×１０⁵／ウェル、乳酸菌（テトラジェノコッカス属以外）を１００μｇ／ウェルとなるように添加した。テトラジェノコッカス属（対照としてＫ１５も用いた）については、骨髄由来樹状細胞：乳酸菌＝１：１００となるように添加した。６時間培養後に上清を回収し、インターフェロンβ測定キット（ＰＢＬ社製）を用い、上清中インターフェロンβ濃度を測定した。結果を図４に示す。

【0051】

図４に示すように、乳酸菌の中でも属、種によりインターフェロンβ産生量が様々であった。一方で、ペディオコッカス・アシディラクティシ、ペディオコッカス・ペントサセウス、テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌は非常に高い活性を有することが確認された。

【実施例3】

【0052】

〔ペディオコッカス属に属する乳酸菌の経口免疫寛容増強試験〕
５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、日本クレア社）に対して乳酸菌ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５の連続強制経口投与を行い、経口免疫寛容増強効果を調べた。オボアルブミン（ＯＶＡ、シグマ社）感作を行い、アレルギーを誘導することで、乳酸菌摂取が遅延型過敏反応、血清中ＯＶＡ特異的抗体価、脾臓細胞の抗原特異的サイトカイン産生に及ぼす影響を調べた。試験は下記の方法に従い行った。

【0053】

１．乳酸菌の投与
乳酸菌Ｋ１５の懸濁液は、ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ社製）培養液で２４時間培養後、生理食塩水にて２回洗浄し、１０分間煮沸を行い、５×１０⁹個／ｍｌとなるように調製した。未処理（アレルギー非誘導）対照群、アレルギー誘導対照群、経口免疫寛容誘導群には生理食塩水０．２ｍｌ／日を、Ｋ１５摂取群には乳酸菌懸濁液０．２ｍｌ／日を試験開始０日目から１４日目まで１５日間摂取させた。

【0054】

２．経口免疫寛容の誘導
経口免疫寛容誘導群、およびＫ１５摂取群には、試験開始７日目、９日目、１１日目、１４日目にＯＶＡ２０ｍｇ／０．２ｍｌ生理食塩水を投与し、経口免疫寛容を誘導した。未処理対照群、アレルギー誘導対照群には生理食塩水を０．２ｍｌ投与した。

【0055】

３．アレルギー誘導
試験開始２１日目にアレルギーを誘導するためにＯＶＡ（シグマ社）３００μｇ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ １００μｌを背面皮下に投与した。

【0056】

４．遅延型過敏反応の測定
背面皮下免疫から１４日後（試験開始３５日目）にＯＶＡ５０μｇを足の裏の背面皮下に投与し、２４時間後に腫れの大きさを測定することで、遅延型過敏反応を調べた。この結果を図５に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0057】

図５に示すように、経口免疫寛容の誘導により遅延型過敏反応は抑制されたが、Ｋ１５を摂取することでその抑制作用が増強していることが確認された。

【0058】

５．血清中のＯＶＡ特異的抗体価の測定
遅延型過敏反応の測定後、イソフルラン麻酔下で採血を行った。１５００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、血清を得た。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ１量、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ量、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を５０μｇ／ｍｌとなるよ
うに１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液 （ｐＨ８．２）に溶解し、９６ウェルプレートを５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、血清サンプルを２〜５００００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＧ１抗体，抗マウスＩｇＧ２ａ抗体，抗マウスＩｇＥ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ添加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェル当たり５０μｌ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、アレルギー誘導対照群に対する相対値で各ＯＶＡ特異的抗体価を定量化した。この結果を、図６に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0059】

図６に示すように、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は経口免疫寛容群とＫ１５摂取群で差がなかったが、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａについては、Ｋ１５摂取群で経口免疫寛容群に比べ強く抑制されていることが確認された。

【0060】

６．脾臓細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生の測定
採血後に脾臓を採取し、細胞の調製を行った。細胞調製、およびサイトカインの測定は実施例１と同様に行った。結果を図７に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0061】

図７に示すように、各サイトカインの産生量が、Ｋ１５摂取群で最も抑制されていることが確認された。これらの結果から、Ｋ１５摂取により経口免疫寛容が増強され、遅延型過敏反応、血清中の抗原特異的抗体価、脾臓細胞の抗原特異的サイトカイン産生が抑制されていることが示された。

【実施例4】

【0062】

〔ペディオコッカス属に属する乳酸菌のノトバイオートマウス試験〕
無菌マウスを用い、Ｋ１５ノトバイオートマウスを作製することで、実際に生体においてＩＦＮ−βが誘導されていることを確かめた。試験は以下のように行った。

【0063】

１．Ｋ１５ノトバイオートマウスの作製
無菌マウス（４〜５週齢、三協ラボサービス社）に対し、乳酸菌Ｋ１５の懸濁液の投与を行った。乳酸菌懸濁液は、ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ社製）培養液で２４時間培養後、遠心・集菌を行い、上清の培地を廃棄後、滅菌済み生理食塩水に５×１０⁹個／ｍｌとなるように懸濁した。乳酸菌懸濁液を無菌マウスに対し０．４ｍｌ投与した。そして、４〜５週間飼育した後、イソフルラン麻酔下で頚椎脱臼を行い、脾臓、パイエル板の採取を行った後、各組織の解析を行った。１群５匹で行った。

【0064】

２．乳酸菌の定着の確認
乳酸菌の定着を確認するために、乳酸菌投与１日後、３日後、２８日後に糞便を採取し、乳酸菌数を測定した。乳酸菌数は糞便を生理食塩水に懸濁後、ＭＲＳ寒天培地に塗布し、３０℃４８時間培養し、コロニー数をカウントすることで行った。結果を図８に示す。

【0065】

図８に示すように、乳酸菌投与３日後には１×１０⁹個／ｇ糞便に達し、その後試験期間中菌数が維持されていることが確認された。

【0066】

３．パイエル板の解析
パイエル板を採取後、１０％ ＦＣＳ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌ ポリミキシンＢ（シグマ社）、１００，０００ Ｕ／Ｌペニシリン・１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ社）、１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社）含有のリン酸バッファー中で２０分間インキュベートした。その後、リン酸バッファーで洗浄し、上皮細胞を除いた後、４００ユニット／ｍｌ コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社）、５０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１０％ ＦＣＳ含有の１００，０００ Ｕ／Ｌペニシリン・１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ社）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で処理することでパイエル板細胞を得た。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）によりＲＮＡを抽出後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ社製）により逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。

【0067】

これを用い、Ｓｙｂｒ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）により定量的リアルタイムＰＣＲを行った。各ｍＲＮＡに対する特異的なプライマーとして、インターフェロンβは、センス ５’−ＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス ５’−ＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡ−３’（配列番号２）、インターロイキン６は、センス ５’−ＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号３）、アンチセンス ５’−ＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号４）、インターロイキン１２ｐ４０は、センス ５’−ＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＴＣＣ−３’（配列番号５）、アンチセンス ５’−ＡＴＧＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＡＧ−３’（配列番号６）、インターロイキン１０は、センス ５’−ＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号７）、アンチセンス ５’−ＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡ−３’（配列番号８）、βアクチンは、センス ５’−ＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号９）、アンチセンス ５’−ＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号１０）を用い、Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により測定した。各発現量は、βアクチンの発現量にて標準化を行い、無菌マウスに対する相対発現量を求めた。結果を図９に示す。

【0068】

図９に示すように、パイエル板細胞においてインターフェロンβのｍＲＮＡ発現量のみがＫ１５ノトバイオートマウスにおいて上昇していることが確認された。このことから、Ｋ１５が生体に対しインターフェロンβを亢進していることが示された。

【0069】

４．脾臓の樹状細胞の解析
脾臓細胞を採取後、４００ユニット／ｍｌ コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社）、１０％ ＦＣＳ含有の１００，０００ Ｕ／Ｌペニシリン・１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ社）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で処理することで脾臓細胞を得た。その後、ＰＥ標識抗マウスＣＤ１１ｃ抗体、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ１１ｂ抗体と反応させ、標識を行った。そして、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いてソーティングを行い、ＣＤ１１ｂ^-ＣＤ１１ｃ⁺細胞およびＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１１ｃ⁺細胞を得た。それぞれについてＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）によりＲＮＡを抽出後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ社製）により逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。これを用い、Ｓｙｂｒ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）により定量的リアルタイムＰＣＲを行った。結果を図１０に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0070】

図１０に示すように、Ｋ１５ノトバイオートマウスの脾臓のＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１１ｃ⁺細胞においてインターフェロンβのｍＲＮＡ発現量が上昇していることが確認された。一方で、その他のサイトカインの発現量に大きな変化は確認されなかった。以上より、Ｋ１５が生体においてインターフェロンβの発現亢進を引き起こすことが示された。

【実施例5】

【0071】

〔ペディオコッカス属に属する乳酸菌のノトバイオートマウスを用いた経口免疫寛容誘導試験〕
実施例４と同様にノトバイオートマウスを作製した後に、経口免疫寛容が誘導されるかを確認した。対照としてインターフェロンβを誘導しないラクトバチルス・プランタラムＫ１６２を用いた。

【0072】

１．ノトバイオートマウスの作製
Ｋ１５、Ｋ１６２共に実施例４と同様にノトバイオートマウスを作製した。各乳酸菌の定着に関しては実施例４と同様の方法で確認し、図１１のように両菌株とも定着していることを確認した。

【0073】

２．経口免疫寛容の誘導
乳酸菌投与から４週後にＯＶＡ５０ｍｇ／２５０μｌ生理食塩水を経口投与し、経口免疫寛容を誘導した。経口免疫寛容非誘導群には生理食塩水を２５０μｌ投与した。投与するＯＶＡはフナバシファーム社においてガンマ線滅菌を行った。

【0074】

３．ＯＶＡ感作
経口免疫寛容の１週後にアレルギーを誘導するためにＯＶＡ（シグマ社）３００μｇ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ １００μｌを背面皮下に投与した。

【0075】

４．ＯＶＡ特異的抗体価の測定
ＯＶＡ特異的抗体価は実施例１と同様の方法で測定した。Ｋ１５ノトバイオートマウスの対照（経口免疫寛容非誘導）群に対する相対値として定量化した。結果を図１２に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0076】

Ｋ１５ノトバイオートマウスにおいては抗原特異的ＩｇＥ，ＩｇＧ量が経口免疫寛容の誘導により有意に抑制されているのに対し、Ｋ１６２ノトバイオートマウスにおいては経口免疫寛容の誘導が弱かった。

【0077】

５．脾臓細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生の測定
脾臓細胞のＯＶＡ特異的サイトカイン産生を実施例１と同様の方法で測定した。結果を図１３に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0078】

Ｋ１５ノトバイオートマウスにおいては経口免疫寛容の誘導により各サイトカイン産生が有意に抑制されているのに対し、Ｋ１６２ノトバイオートマウスでは経口免疫寛容の誘導による抑制が弱いことが確認された。このことから、腸管を介したインターフェロンβの誘導が経口免疫寛容の増強に関わっていることが示された。

【実施例6】

【0079】

〔ペディオコッカス属に属する乳酸菌の食物アレルギー試験〕
経口免疫寛容の増強により食物アレルギーの発症が強く抑制されることを、食物アレルギーモデルで確認した。

【0080】

１．乳酸菌の投与
Ｋ１５乳酸菌懸濁液を実施例３と同様に作製した。試験開始０日目から２０日目まで乳酸菌懸濁液を０．２ｍｌ投与した。未処理（アレルギー非誘導）対照群、アレルギー誘導／非発症群、アレルギー誘導／発症群、アレルギー誘導／経口免疫寛容誘導／発症群、アレルギー誘導／Ｋ１５投与＋経口免疫寛容誘導／発症群で試験を実施し、Ｋ１５投与群以外は生理食塩水を０．２ｍｌ投与した。

【0081】

２．経口免疫寛容の誘導
経口免疫寛容の誘導は試験開始１４日目にアレルギー誘導／経口免疫寛容誘導／発症群、アレルギー誘導／Ｋ１５投与＋経口免疫寛容誘導／発症群に対し、ＯＶＡ２５ｍｇ／０．２ｍｌ生理食塩水を投与することで行った。その他の群には０．２ｍｌの生理食塩水を投与した。

【0082】

３．アレルギー誘導
試験開始２１日目と３５日目にＯＶＡ（シグマ社製）１０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水、水酸化アルミニウムゲル（和光純薬工業社製）０．１ｍｌを混合し、腹腔内に０．２ｍｌを投与した。

【0083】

４．発症
試験開始５１日目、５３日目、５５日目、５７日目、５９日目、６１日目、６３日目に１回あたりＯＶＡ５０ｍｇ／２５０μｌ生理食塩水を経口投与し、発症を行った。６３日目に下痢の観察を行った後に、イソフルラン麻酔下で採血を行い、その後腸間膜リンパ節、小腸組織の採取を行った。

【0084】

５．下痢の観察
試験開始６３日目のＯＶＡ経口投与の１時間後に下痢の観察を行った。結果を図１４に示す。経口免疫寛容の誘導により下痢の発症が抑制していたが、Ｋ１５摂取群で最も下痢の発症が抑制されていることが確認された。

【0085】

６．小腸組織の炎症性サイトカインｍＲＮＡ発現量
小腸組織よりＴＲＩｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出後、実施例４と同様に逆転者反応、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。各ｍＲＮＡに対する特異的なプライマーとして、マウスＫＣ（Keratinocyte Chemoattractant）は、センス ５’−ＣＴＧＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１１）、アンチセンス ５’−ＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１２）、ＴＮＦ−αは、センス ５’−ＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴ−３’（配列番号１３）、アンチセンス ５’−ＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＧ−３’（配列番号１４）、インターロイキン１βは、センス ５’−ＡＡＡＴＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＣＣ−３’（配列番号１５）、アンチセンス ５’−ＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＣ−３’（配列番号１６）を用いた。Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により測定した。各発現量は、βアクチンの発現量にて標準化を行い、未処理群に対する相対値で定量化をした。結果を図１５に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0086】

図１５に示すように、各炎症性サイトカインの発現量は経口免疫寛容の誘導により抑制された。その中でもＫ１５摂取群で最も強く抑制されていることが確認された。

【0087】

７．腸間膜リンパ節のＯＶＡ特異的サイトカイン産生
腸間膜リンパ節を群ごとに採取後、メッシュにより腸間膜リンパ節をすり潰し、細胞の懸濁を行い、腸間膜リンパ節細胞を回収した。その後、９６ウェル丸底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）を用い、ＯＶＡ（シグマ社製）を１００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地において腸間膜リンパ節細胞を１×１０⁶個／ウェルとなるように懸濁し、３日間培養を行った。培養後、１５００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を回収し、エンザイムイムノアッセイにより各サイトカイン産生量を測定した。測定方法は実施例１と同様に行った。結果を図１６に示す。

【0088】

図１６に示すように、Ｋ１５摂取群でＯＶＡ特異的サイトカイン産生が最も抑制されていることが確認された。

【0089】

８．血清中のＯＶＡ特異的抗体価の測定
実施例１と同様に血清中のＯＶＡ特異的抗体価の測定を行った。ＯＶＡ特異的ＩｇＭについては、抗マウスＩｇＭ抗体（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）でコーティングを行うことで測定した。結果を図１７に示す。なお、有意差検定はｔ検定により行なった。

【0090】

図１７に示すように、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ，ＩｇＭがＫ１５摂取群で強く抑制されていることが確認された。このことから、経口免疫寛容の増強によりアレルギー誘導が抑制されていることが示された。

【実施例7】

【0091】

〔ペディオコッカス属に属する乳酸菌を用いたニンジン発酵液の製造〕
経口免疫寛容増強組成物をペディオコッカス属の乳酸菌とニンジンを用いて製造した。

【0092】

１．ニンジン搾汁液の作製
市販のニンジンを輪切りにし、ニンジン２００ｇに対し水を２００ｍｌ添加し、１０分間煮沸を行った。その後、ミキサーにて破砕を行い、ニンジン破砕液を作製した。その後、遠心分離を行うことで、固形物を除去した。その後、エバポレーターにより濃縮することでニンジン搾汁液を採取した。

【0093】

２．ニンジン搾汁液を培地としたペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５の培養
ニンジン搾汁液のブリックス値が５，１０，１５、２０となるように調整し、その後ｐＨが６．８−７．０となるように５Ｎの水酸化ナトリウムで調整した。そして、１０分間加熱処理したものを培地とした。各培地に対しペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５を約１×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌとなるように摂取し、３０℃で培養した。そのときの菌数の変化を図１８に示す。菌数はＭＲＳ寒天培地に塗布することで測定した。

【0094】

図１８に示すように、各ブリックス値の培地において、ペディオコッカス・アシディラクティシＫ１５は良好に生育した。このニンジン発酵液を経口免疫寛容増強組成物として用いることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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