特許 6963249 菌根菌の培養培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6963249

(24)【登録日】2021年10月19日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】菌根菌の培養培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

【請求項の数】8

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2017-70158(P2017-70158)

(22)【出願日】2017年3月31日

(65)【公開番号】特開2018-170973(P2018-170973A)

(43)【公開日】2018年11月8日

【審査請求日】2020年3月4日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２６年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究事業（ＡＣＣＥＬ）「共生ネットワークの分子基盤とその応用展開」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(73)【特許権者】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(73)【特許権者】

【識別番号】504180239

【氏名又は名称】国立大学法人信州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100104307

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 尚司

(72)【発明者】

【氏名】秋山 康紀

(72)【発明者】

【氏名】川口 正代司

(72)【発明者】

【氏名】田中 幸子

(72)【発明者】

【氏名】亀岡 啓

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 勝晴

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−０９５３３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０２７５４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Wang E et al，A common signaling process that promotes mycorrhizal and oomycete colonization of plants，Curr Biol.，2012年，22(23)，2242-2246

【文献】 Akiyama K et al，Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi，Nature，2005年，435（7043），824-827

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２μｇ／ｍＬを超える濃度で、ミリスチン酸及び／又はパルミチン酸が添加されたか、または、２μｇ／ｍＬを超える濃度で、ステアリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸の少なくともいずれか１種の脂肪酸を添加して、さらにパルミトレイン酸も添加されたアーバスキュラー菌根菌用の培養培地。

【請求項2】

前記脂肪酸のいずれかは脂肪酸塩として添加された請求項１に記載の培養培地。

【請求項3】

ストリゴラクトンが添加された請求項１又は２に記載の培養培地。

【請求項4】

有機性窒素源が添加された請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養培地。

【請求項5】

培地中２μｇ／ｍＬを超える濃度で、ミリスチン酸及び／又はパルミチン酸を添加するか、または、２μｇ／ｍＬを超える濃度で、ステアリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸の少なくともいずれか１種の脂肪酸を添加して、さらにパルミトレイン酸も添加して、宿主植物根の非存在下でアーバスキュラー菌根菌を培養する方法。

【請求項6】

前記脂肪酸のいずれかを脂肪酸塩として添加する請求項５に記載の方法。

【請求項7】

さらにストリゴラクトンを添加して培養する請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

有機性窒素源を添加して培養する請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は菌根菌の培養培地、より具体的にはアーバスキュラー菌根菌の培養に適した培養培地に関する。

【背景技術】

【0002】

菌根菌は植物と共生して菌根を作り、その菌糸から主としてリンや窒素を吸収して宿主植物に供給する。中でも内生菌根菌の１種であるアーバスキュラー菌根菌（Rhizophagus irregularis）は、特定の植物とのみ共生するのではなく、多数の宿主植物と共生し、農産物の育成における重要性は大きい。また、アーバスキュラー菌根菌の共生は、リン等の吸収促進の他にも、耐病性の向上や水分吸収の促進に貢献する。特に、リン資源であるリン鉱石の枯渇が懸念されていることから、リン肥料を軽減するためにもアーバスキュラー菌根菌のさらなる活用が望まれる。

【0003】

ところで、アーバスキュラー菌根菌は宿主植物根を必要とする絶対共生菌であるため、その純粋培養のために宿主植物が必要となる。菌根菌を純粋培養する方法として、これまで殺菌した土壌や砂などを利用したポット培養法がある。また、ポット培養法の改良法として、液体肥料を噴霧しながら培養するエアロポニック培養法、形質転換したニンジン毛状根を用いるin vitro系培養法などもあるが、いずれの方法にしても宿主植物との共生による二者培養法である。

【0004】

しかしながら、二者培養法においては、雑菌の混入の危険性がある、培養のための土地の確保などからコストが高くなると言った問題点があり、アーバスキュラー菌根菌のみを純粋培養できる簡便な方法が望まれる。

【0005】

これまでのところ、純粋培養する方法として、ＭＭＮ（Modified Melin-Norkrans）培地を用いて培養する方法がある。しかし、この方法では発芽や胞子形成、菌糸量の増加は見られるが、胞子の形成数は十分には増加せず、得られた胞子は小さく成熟仕切れているとは言えないために、アーバスキュラー菌根菌の効率的な利用のためには不十分であった。また、トリプトファンダイマーやロイシルプロリンを添加したＭＭＮ培地を用いる方法（例えば特許文献１参照）、バーミキュライトやパーライトなどの多孔質担体を用いる方法（例えば特許文献２参照）も知られている。しかしながら、前者の方法では胞子の大きさが十分に成長せず、胞子を大きくするためには赤色の光源が必要とされる。後者の方法では、担体とともに土壌や培養土に混入することができるという利便性があるが、担体が必要となるので高いコストとなるという問題がある。このため、簡便な方法でアーバスキュラー菌根菌を純粋培養できる新たな培養法が求められていた。

【0006】

一方、炭素数が１６〜１８である不飽和脂肪酸，炭素数が１３〜１８である直鎖飽和脂肪酸，イソ及びアンテイソ脂肪酸と、アーバスキュラー菌根菌を接触させたところ、一部のイソ、アンテイソ脂肪酸が菌糸分岐を誘導し、炭素数１６の不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸と接触させた菌の一部に次世代の胞子が形成されたとする報告がある（非特許文献１、２）。ここでは、培地を入れた平板培地上に各脂肪酸を含浸させたディスクを２枚載置することで、アーバスキュラー菌根菌と脂肪酸が接触されている。このときの接触量は表１及び表２に示すように、１ディスク当たり0.25μg〜10μgの範囲であり、その他の直鎖飽和脂肪酸やイソ及びアンテイソ脂肪酸はそのような作用を示さなかった。また、効果があったとされるパルミトレイン酸（C16:1(9)）やアンテイソ脂肪酸（isoC15）の含浸量を増やした場合には、図７に示すようにその効果は抑制され、促進効果がほとんど失われる傾向を示した。これらの結果からは、その他の直鎖飽和脂肪酸やイソ及びアンテイソ脂肪酸はそのような作用を示さず、菌糸分岐や胞子形成を誘導しなかった直鎖飽和脂肪酸などを含む培地中で培養すると、次世代の胞子形成を促進し、当該娘胞子を成熟させて大きくすることは期待できなかった。

【表1】

【表2】

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００９−０９５３３２号公報

【特許文献2】特開２００５−０２７５４６号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】秋山ら、２０１０年日本農芸化学会 年次大会講演発表講演要旨集、３ＡＣｐ１９

【非特許文献2】筒井 一歩、平成２２年度 大阪府立大学大学院 生命環境科学研究科 修士論文

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本願発明が解決しようとする課題は、アーバスキュラー菌根菌の純粋培養に用いられ得る新たな培地及び培養方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本願発明では、炭素数が１３〜１８である飽和脂肪酸をアーバスキュラー菌根菌培養用の培地中に２μｇ／ｍＬを越える濃度で含ませることにしている。

【発明の効果】

【0011】

本願発明によるとアーバスキュラー菌根菌用の新規な培養培地が提供される。この培地を用いることで、アーバスキュラー菌根菌を簡便に効率良く純粋培養できる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は各種飽和脂肪酸を含む培地で培養した結果を示す画像である。

【図2】図２は各種飽和脂肪酸を含む培地で培養したときの娘胞子の形成量を示すグラフである。

【図3】図３は各種飽和脂肪酸とパルミトレイン酸を共存させて培養したときの娘胞子の形成量を示すグラフである。

【図4】図４は脂肪酸と脂肪酸塩の効果を示すグラフである。

【図5】図５はストリゴラクトン及びペプトンの添加効果を示すグラフである。

【図6】図６はストリゴラクトンとペプトンを共存させて培養した結果を示す画像である。

【図7】図７は不飽和直鎖脂肪酸、分岐鎖飽和脂肪酸を含む培地で培養したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本願発明に係る培地は、炭素数が１３〜１８である飽和脂肪酸を含む。飽和脂肪酸は直鎖脂肪酸、分岐鎖脂肪酸（イソ脂肪酸、アンテイソ脂肪酸など）の何れでもよく、例えば、炭素数１４のミリスチン酸であり、炭素数１５のペンタデシル酸であり、炭素数１６のパルミチン酸であり、炭素数１８のステアリン酸であり得る。これらの脂肪酸のうち１種又は２種以上が用いられる。好ましくはミリスチン酸及び／又はパルミチン酸である。また、飽和脂肪酸は遊離の脂肪酸でもその塩でもよい。塩はナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などであり得るが、好ましくは水溶性の塩、例えばカリウム塩である。

【0014】

これらの飽和脂肪酸及び／又は脂肪酸塩の培地中濃度は適宜決定することができるが、例えば、液体培地とした場合、好ましくは培地中２μｇ／ｍＬを越える濃度であり、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上であり、望ましくは２０μｇ／ｍＬ以上である。また、上限濃度は菌根菌の生育を阻害しない程度であればよく、好ましくは１ｇ／ｍＬ、より好ましくは０.１ｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ、望ましくは２ｍｇ／ｍＬである。

【0015】

当該培地はさらにストリゴラクトンを含み得る。ストリゴラクトンは、菌糸分岐誘導物質（Branching factor：ＢＦ）として単離同定された物質である。ストリゴラクトンの培地中濃度も適宜決定することができるが、液体培地とした場合、好ましくは培地中０.１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、望ましくは１００μｇ／ｍＬ以上である。また、上限濃度も悪影響を与えない範囲であればよく、好ましくは１ｇ／ｍＬ、より好ましくは０.５ｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０.１ｇ／ｍＬ、望ましくは１０ｍｇ／ｍＬである。

【0016】

これらの飽和脂肪酸及び／又は脂肪酸塩やストリゴラクトンは、いわゆる基礎培地に添加される。培養される菌根菌は、内生菌根菌であるアーバスキュラー菌根菌である。基礎培地は、アーバスキュラー菌根菌の培養に用いられている培地であれば特に限定されることはない。基礎培地は必須構成成分として、グルコース，マンノース，キシロース，フルクトース，スクロース，ラクトース，ラフィノースなどの資化性糖とリン酸水素ナトリウムなどの無機塩を含む培地であり、その他に必要に応じて、酵母粉末や酵母エキス、チアミンやピリドキシンなどの各種ビタミン類、ペプトンや麦芽エキス，ＮＺアミン（カゼインの酵素加水分解物）等の有機性窒素源、無機酸等のｐＨ調整剤、さらには平板培地作製用の基剤、例えば寒天などを含む。公知である基礎培地として、例えば浜田培地、改変浜田培地、太田培地、ＯＨ培地、ＭＭＮ培地が示される。また、胞子形成の観点から、ペプトンのような有機性窒素源を含む培地が好ましい。そして、必要に応じて、パルミトレイン酸（C16:1）のように炭素数が１４〜１８である不飽和脂肪酸を加えることもできる。なお、これらの基礎培地には上記のように酵母エキスや麦芽エキス、ペプトンを含む培地もあり得るが、これらの成分を含む基礎培地には上記飽和脂肪酸やパルミトレイン酸のような不飽和脂肪酸が含まれているとは考えられない。これらの成分は水に溶解された後に液体培地又は平板培地として培養に用いられる。また、必要に応じて培地のｐＨが調整される。ｐＨは使用時において酸性側、好ましくは５〜７である。平板培地とする場合の基剤の添加量は、概ね１〜２０ｍｇ／ｍＬである。

【0017】

本願発明にかかる培養方法は、上記のような基礎培地に炭素数が１３〜１８である飽和脂肪酸、さらに必要に応じてストリゴラクトンを添加して培養する方法である。培養方法は、菌根菌の一般的な培養方法と特に変わるところはなく、菌根菌の胞子を培地（液体培地であるか平板培地であるかを問わず）に植菌し、２５〜３５℃、好ましくは２８℃付近の適温にて培養する。培養後には、植菌した胞子から菌糸が成長し、菌糸からは新たに娘胞子が発芽し、十分に大きく成長した娘胞子が多数形成される。

【0018】

次に下記の実施例に基づいて本願発明についてさらに詳細に説明する。

【実施例1】

【0019】

シャーレ中のスクロース−酵母エキス（SY）培地（液体培地）に、アーバスキュラー菌根菌（R.irregularis）の胞子（200個／プレート）を植菌し、その上から滅菌処理後、４０℃まで冷ました0.3％Phytagel（商標名）(MgSO₄・7H₂O 750mg/L)を、下記の組成となるように流し込んだ。また、１シャーレ当たり培地量が１０mLとなるようにした。プレートを３０℃の暗所で３日間培養した後、各サンプル溶液を染み込ませ風乾させたペーパーディスク（6mm）を飽和脂肪酸１種類につき、２枚ずつ菌体付近に置き、同培養条件で培養して、菌糸生育及び胞子形成について経時観察を行った。コントロールにはパルミトレイン酸を、ネガティブコントロールにはアセトンを使用した。以上の操作は全て無菌条件下で行った。ＳＹ培地（pH6.5）の組成は、Sucrose：10g/L、Yeast extract：0.5g/L、MgSO₄・7H₂O：0.75g/L、Phytagel：2.5g/Lである。また、各飽和脂肪酸の添加量は１ディスク当たり100μg、パルミトレイン酸は１ディスク当たり10μg、アセトンは１ディスク当たり10μLとした。

【0020】

一定期間培養後、プレート中から定めた５区画内の全胞子数を計数し、次世代娘胞子の数を母胞子の数で割った値を娘胞子の形成量として評価した。経時変化の画像を図１に、次世代胞子の形成量の結果を図２に示した。

【0021】

飽和脂肪酸を添加した場合には、コントロールに比べて明らかに菌糸の分岐及び胞子の形成が増加した形態が観察された。また、娘胞子の形成量はコントロールに比べて多くなり、胞子の大きさも十分に大きくなった。

【実施例2】

【0022】

既に報告のあるパルミトレイン酸との併用効果について調べた。実施例１と同様の操作を行った。各飽和脂肪酸の添加量は１ディスク当たり100μgに対してパルミトレイン酸は１ディスク当たり10μg、コントロールは１ディスク当たり10μg、アセトンは１ディスク当たり10μLとした。その結果を図３に示した。

【0023】

パルミトレイン酸を併用することによって、明らかに菌糸の分岐及び胞子の形成が増加した形態が観察され、胞子の大きさも十分に大きくなった（図示せず）。また、娘胞子の形成量はコントロールに比べて多くなった（図３参照）。

【実施例3】

【0024】

脂肪酸塩との比較及びストリゴラクトンの添加効果を調べた。
オートクレーブ滅菌した改変Ｍ培地にビタミン類と100μMのミリスチン酸又はミリスチン酸カリウム、100nMのGR24（合成ストリゴラクトン）、1mg/mlのペプトン（BD Difco Bacto-Peptone）を添加し、シャーレに約25mlずつ分注した。培地上にアーバスキュラー菌根菌の胞子約100個を植菌し、２８℃の暗所で６週間培養した。改変Ｍ培地並びに用いたビタミン類の組成は次のとおりである。その結果を図４、図５に示した。

【0025】

遊離の脂肪酸を用いた場合に比べて脂肪酸塩を用いた方が娘胞子の形成量は多くなり、ストリゴラクトンや、さらにはペプトンを加えることで娘胞子の形成量は著しく多くなった。

【0026】

（改変Ｍ培地の組成）
MgSO₄・7H₂O：731mg/L、KNO₃：80mg/L、KCl：65mg/L、KH₂PO₄：4.8mg/L、Ca(NO₃)・4H₂O：288mg/L、Fe(III)EDTA：8mg/L、MnCl₂・4H₂O：3mg/L、ZnSO₄・7H₂O：1.3mg/L、H₃BO₃：1.5mg/L、CuSO₄・5H₂O：65μg/L、Na₂MoO₄・2H₂O：1.2μg/L、KI：750g/L、Sucrose：10g/L、MES(pH6.5)：10mM、Phytagel：3g/L、Glycine：3μg/L
（ビタミン類の組成）
Thiamine-HCl：100μg/L、Pyridoxine-HCl：100μg/L、Nicotinic acid：500μg/L、Myo-inositol：50μg/L

【産業上の利用可能性】

【0027】

本発明は、アーバスキュラー菌根菌のような菌根菌を共生植物の併用なく純粋培養できる培地及び方法を提供する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】