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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6985705
(24)【登録日】2021年11月30日
(45)【発行日】2021年12月22日
(54)【発明の名称】新規インドロキナゾリン型化合物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 17/18 20060101AFI20211213BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20211213BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20211213BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20211213BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20211213BHJP
C07D 487/04 20060101ALI20211213BHJP
【ＦＩ】
C12P17/18 BZNA
C12N9/02
C12N15/52 Z
C12N15/63 Z
C12N1/21
C07D487/04 140
C07D487/04CSP
【請求項の数】6
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2018-558957(P2018-558957)
(86)(22)【出願日】2017年12月5日
(86)【国際出願番号】JP2017043634
(87)【国際公開番号】WO2018123467
(87)【国際公開日】20180705
【審査請求日】2019年5月23日
(31)【優先権主張番号】特願2016-252554(P2016-252554)
(32)【優先日】2016年12月27日
(33)【優先権主張国】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100177149
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 浩義
(72)【発明者】
【氏名】木村 信忠
(72)【発明者】
【氏名】藤田 雅紀
【審査官】
中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００９−０９５２８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
KIMURA N., et al.,"ACCESSION: AB649140 [GI: 803436461], DEFINITION: Uncultured bacterium DNA, clone: N43."，NCBI Sequence Revision History [online], 04 APR 2015 uploaded, NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/803436461?sat=3&satkey=26991678
【文献】
Microbes Environ.，2010年，vol.25, no.2，pp.133-139
【文献】
NASUNO E., et al., "A high-throughput screening for novel quorum sensing autoinducers from metagenomic libraries"，日本微生物生態学会講演要旨集, 2010.11.23, vol.26th, p. 67 (1A-13)
【文献】
J. Nat. Prod.，2008年，vol.71, no.7，pp.1275-1279
【文献】
NASUNO E., et al., "A high-throughput screening for novel quorum sensing autoinducers from metagenomic libraries"，日本微生物生態学会講演要旨集, 2011.11.23, vol.26th, p. 67 (1A-13)
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（ＩＩ）で示される新規インドロキナゾリン型化合物。
【化1】
【請求項2】
配列番号２（ＭＧ７９−１２）、配列番号３（ＭＧ７９−１５）、配列番号４（ＭＧ７９−１６）、配列番号５（ＭＧ７９−２０）、配列番号６（ＭＧ９２−５）、配列番号７（ＭＧ９２−６）からなる群から選択される１以上のインドール類酸化酵素をコードする核酸を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養することを特徴とする、下記式（ＩＩ）で示す新規インドロキナゾリン型化合物の製造方法。
【化2】
【請求項3】
請求項１記載の新規インドロキナゾリン型化合物を用いてＱＳ機構を制御する方法。
【請求項4】
式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物とを脱水縮合して脱水縮合物を得て、前記脱水縮合物に式（ＶＩ）で示すアミン化合物を添加する工程を含む、請求項１記載の新規インドロキナゾリン型化合物の製造方法。
【化3】
【請求項5】
式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物と式（ＶＩ）で示すアミン化合物を添加し、温度１０〜５０℃で反応させることを特徴とする、請求項１記載の新規インドロキナゾリン型化合物の製造方法。
【化4】
【請求項6】
前記式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と前記式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物とが、インジゴをジメチルスルホキシド中で温度６０〜１４０℃に加熱して得られたものである、請求項５記載の新規インドロキナゾリン型化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規インドロキナゾリン型化合物およびその製造方法に関する。【背景技術】
【0002】
細菌がオートインデューサー（Auto Inducer、以下ＡＩとも称する。）と呼ばれるシグナル分子を生産して細胞間コミュニケーションを行い、菌密度を調整し、菌密度に依存して種々の遺伝子の発現を制御することは公知である。ＡＩを利用し、自らの細胞数に応じた遺伝子発現の制御を行う機構を細菌クオラムセンシング（Quorum sensing 以下ＱＳとも称する。）という。従来から、ＡＩとしてアシルホモセリンラクトン(N-acyl-L-homoserine lactones、以下ＡＨＬとも称する。)、フラノシルホウ酸ジエステル、環状ペプチドが知られ、更にインドールがＡＩ活性を有するとの報告もある（非特許文献１）。【0003】
ＡＨＬ化合物をＡＩとする微生物に緑膿菌がある。緑膿菌のＱＳ機構は、I-遺伝子、R-遺伝子、およびターゲット遺伝子の３つの遺伝子により構成され、I-遺伝子はＡＨＬ合成酵素を、R-遺伝子は転写活性化因子をコードする。ＡＨＬ合成酵素により合成されたＡＨＬ化合物は細菌の外膜を通過することができる。細菌の増殖によって環境中の菌密度が上昇するに従い、菌内外のＡＨＬ化合物濃度も上昇する。ＡＨＬ化合物の濃度がある一定の閾値に達するとＡＨＬ化合物とR-遺伝子産物（転写活性化因子）との結合が加速して複合体を形成する。この複合体がターゲット遺伝子のプロモーターに結合して転写活性を増減させ、各種病原因子などのターゲット遺伝子が発現される。ＡＩ生合成遺伝子もターゲット遺伝子であり、その転写がＡＩ自身によって活性化される。なお、上記は緑膿菌に限定されず、他のＡＩにも共通する特徴である。【0004】
緑膿菌は、ターゲット遺伝子の発現により、ピオシアニンをはじめとする色素、バイオフィルム形成に重要な菌体外多糖に加え、細胞・組織障害性に直接関係する各種菌体外毒素（エラスターゼ、プロテアーゼ、エクソトキシンなど）を産生する。ＡＩ拮抗剤やＡＩ分解酵素によってＱＳ機構を阻害できれば、腸内細菌のような有益な菌を殺さずに毒素等の生産を抑えることができ、副作用を低減することができる。また、ＡＨＬ化合物等は、緑膿菌の宿主である哺乳類の細胞にもシグナル伝達物質として機能することが知られている。ＡＨＬ化合物であるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを皮膚に投与すると、残存する毛包が活性化され新たな毛包の再生が誘導され、毛包活性化や毛包再生誘導のための医薬として使用しうるという（特許文献１）。【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１２−１８８３９５号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Hirakawa et al., "Indole induces the expression of multidrug exporter genes in Escherichia coli", 2005, Mol Microbiol. Feb;55(4):1113-26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
一方、ＡＨＬ化合物は、基本的にラクトン環に脂肪酸が酸アミド結合した化合物であり、細菌内外の酵素によって分解されやすい。前記したフラノシルホウ酸ジエステルや環状ペプチド性化合物なども、エステル分解酵素やペプチダーゼによって分解されやすい点で共通する。従来の範囲を超えた使用を可能とするため、従来のＡＩに比して安定な新規化合物の開発が希求されている。更に、このような新規化合物が効率的に生産できれば、更に、用途を拡大することができる。新規化合物が、微生物分解耐性を有する場合には、発酵分野等で従来の範囲を超えた使用が可能となる。【0008】
上記現状に鑑み、本発明は、新規インドロキナゾリン型化合物を提供することを目的とする。【0009】
また、新規インドロキナゾリン型化合物合成酵素、この合成酵素をコードする核酸、この核酸を含むベクターで形質転換された形質転換体等を提供することを目的とする。【0010】
更に、効率的な新規インドロキナゾリン型化合物の製造方法を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0011】
上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、活性汚泥から得た複合微生物についてメタゲノム解析を行ったところ、ＡＨＬ化合物よりＡＩ活性に優れる新規化合物の合成酵素をコードする核酸が含まれること、この核酸によって合成される新規化合物はインドロキナゾリン（Indoroquinazoline）骨格を有するインドロキナゾリン型化合物（以下、ＩＱ型化合物と称する。）であることなどを見出し、本発明を完成させた。【0012】
すなわち本発明は、下記式（ＩＩ）で示される新規ＩＱ型化合物を提供するものである。【化1】
【0019】
また本発明は、配列番号２（ＭＧ７９−１２）、配列番号３（ＭＧ７９−１５）、配列番号４（ＭＧ７９−１６）、配列番号５（ＭＧ７９−２０）、配列番号６（ＭＧ９２−５）、配列番号７（ＭＧ９２−６）からなる群から選択される１以上のインドール類酸化酵素をコードする核酸を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養することを特徴とする、上記式（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物の製造方法を提供するものである。
【0020】
更に本発明は、上記新規ＩＱ型化合物を用いてＱＳ機構を制御する方法を提供するものである。【0021】
加えて本発明は、式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物とを脱水縮合して脱水縮合物を得て、前記脱水縮合物に式（ＶＩ）で示すアミン化合物を添加する工程を含む、上記新規ＩＱ型化合物の製造方法を提供するものである。【0022】
【化2】
(式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は、それぞれ同一でも異なっていてもよい水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲン原子、アルキル基（−Ｒ）、アルキルアミノ基（−ＮＲＲ’）、アルコキシ基（−ＯＲ）、アシル基（−ＣＯＲ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ’）、もしくはアルキルシリル基（−ＳｉＲＲ’Ｒ”）、並びに／または、Ｒ１〜Ｒ４の内いずれか２つは、炭素原子および／もしくは炭素以外の原子を含んで互いに結合してなる環構造であり、Ｒ９，Ｒ１０は、それぞれ同一でも異なっていてもよい水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基（−Ｒ）、アルキルアミノ基（−ＮＲＲ’）、アルコキシ基（−ＯＲ）、アシル基（−ＣＯＲ）、もしくはカルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ’）であり、前記Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、不飽和結合および／または置換基を含んでいてもよい炭素数１〜２２のアルキル基である。）
【0023】
加えて本発明は、上記式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と上記式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物と上記式（ＶＩ）で示すアミン化合物を添加し、温度１０〜５０℃で反応させることを特徴とする、上記新規ＩＱ型化合物の製造方法を提供するものである。【発明の効果】
【0025】
本発明により、新規ＩＱ型化合物、新規ＩＱ型化合物合成酵素、前記合成酵素をコードする遺伝子等が提供される。【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】インドールから新規ＩＱ型化合物が合成される経路の一例を説明する図である。
【図2】実施例５で調製した化合物の１Ｈ-ＮＭＲチャートである。なお、図中、横軸はｐｐｍを表す。
【図3】実施例５で調製した化合物の１３Ｃ-ＮＭＲチャートである。なお、図中、横軸はｐｐｍを表す。
【図4】実施例５で調製した化合物のＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置による質量分析のチャートである。
【図6】実施例８の結果を示し、インドール類酸化酵素をコードする各種核酸を含む大腸菌クローンのＡＩ活性の結果を示す図である。
【図7】実施例５で得た新規ＩＱ型化合物とＡＨＬ化合物（３−オキソ−ホモセリンラクトン）とのＡＩ活性を、微生物センサーの発光強度によって比較した結果を示す図である。
【図8】実施例５で得た新規ＩＱ型化合物とＡＨＬ化合物（３−オキソ−ホモセリンラクトン）との、バイオフィルム形成能を比較した結果を示す図である。
【図9】実施例５で得た新規ＩＱ型化合物とＡＨＬ化合物（３−オキソ−ホモセリンラクトン）との、バチルス・セレウスによる分解耐性を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
（１）新規ＩＱ型化合物本発明の新規ＩＱ型化合物は、下記式（Ｉ）で示される。
【0028】
【化3】
式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８は、それぞれ同一でも異なっていてもよい水素原子（−Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ハロゲン原子、アルキル基（−Ｒ）、アルキルアミノ基（−ＮＲＲ’）、アルコキシ基（−ＯＲ）、アシル基（−ＣＯＲ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ’）、もしくはアルキルシリル基（−ＳｉＲＲ’Ｒ”）である。前記Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、不飽和結合および／または置換基を含んでいてもよい炭素数１〜２２、好ましくは炭素数１〜１８、より好ましくは炭素数１〜１２、特に好ましくは炭素数１〜８の直鎖または分岐を有していてもよいアルキル基である。前記置換基としては、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、ただしＲは炭素数１〜５のアルキル基である。）、ハロゲン原子、アミノ基（−ＮＲＲ’、ただし、ＲおよびＲ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）がある。また、Ｒ１〜Ｒ４の内いずれか２つ、および／またはＲ５〜Ｒ８の内いずれか２つは、炭素原子および／または炭素以外の原子を含んで互いに結合して環構造を形成していてもよい。環構造としては、炭素数３〜１２のシクロアルカン、ビシクロアルカン、不飽和結合を含むベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、チッソ、イオウ、酸素などのヘテロ原子を含む複素環であってもよい。
また、Ｒ９，Ｒ１０は、それぞれ同一でも異なっていてもよい、水素原子（−Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アルキル基（−Ｒ）、アルキルアミノ基（−ＮＲＲ’）、アルコキシ基（−ＯＲ）、アシル基（−ＣＯＲ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ’）であり、前記Ｒ、およびＲ’は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、不飽和結合および／または置換基を含んでいてもよい炭素数１〜２２、好ましくは炭素数１〜１８、より好ましくは炭素数１〜１２、特に好ましくは炭素数１〜８の直鎖または分岐を有していてもよいアルキル基である。前記置換基としては、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、ただしＲは炭素数１〜５のアルキル基である）、ハロゲン原子、アミノ基（−ＮＲＲ’、ただし、ＲおよびＲ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）がある。
また、Ｒ１１は、水素原子（−Ｈ）、アルキル基（−Ｒ）、アシル基（−ＣＯＲ）、またはアルキルシリル基（−ＳｉＲＲ’Ｒ”）であり、前記Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、不飽和結合および／または置換基を含んでいてもよい炭素数１〜２２、好ましくは炭素数１〜１８、より好ましくは炭素数１〜１２、特に好ましくは炭素数１〜８の直鎖または分岐を有していてもよいアルキル基である。前記置換基としては、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、ただしＲは炭素数１〜５のアルキル基である）、ハロゲン原子、アミノ基（−ＮＲＲ’、ただし、ＲおよびＲ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）がある。
好ましくは、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８、Ｒ９，Ｒ１０，およびＲ１１が、水素原子である下記式（ＩＩ）に示す化合物である。
【0029】
【化4】
【0030】
後記する実施例に示すように、上記式（ＩＩ）で示される化合物の発見は、メタゲノム解析によって検出された遺伝子に由来する。この遺伝子は、ＡＨＬレセプター遺伝子（ＬｕｘＲ）、ＡＨＬ合成酵素遺伝子のプロモーター（ＬｕｘＩ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むｐＪＢＡ１３２プラスミドを有する大腸菌を微生物センサーとして使用し、ＧＦＰの発現によって検出された。ＧＦＰの発現は、ＬｕｘＲによって生産されたＡＨＬレセプターとＡＩ化合物との結合が前提である。したがって、上記微生物センサーで検出された化合物の構造は、ＡＨＬ化合物の構造に類似すると推定された。しかしながら驚いたことに、前記遺伝子がコードするタンパク質は、インドロキナゾリン骨格を含む式（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物の合成酵素であった。この合成酵素によって生産される新規ＩＱ型化合物は、従来公知のＡＨＬ化合物である３−オキソヘキサノイル−ホモセリンラクトン(3-oxohexanoyl-homoserine lactone)と比較して２倍以上の発光強度を有し、高いＡＩ活性を有することが示された。ＡＩによって制御されるＱＳ機構では、ＡＩ生合成遺伝子もターゲット遺伝子であり、その転写がＡＩ自身によって活性化される。新規ＩＱ型化合物は上記発光強度が高く、かつ新規ＩＱ型化合物の微生物による生産効率にも優れる。【0031】
新規ＩＱ型化合物は、グラム陰性菌に対するＡＩとして作用する。したがって、従来のＡＨＬ化合物と同様にＱＳ機構を制御し、バイオフィルム形成の制御、哺乳類に対する育毛効果や創傷治療などのＡＩとして使用することができる。しかも、後記する実施例に示すように、新規ＩＱ型化合物は、微生物分解耐性に優れることも判明した。このため、発酵食品製造や環境浄化などの微生物環境下で長期に亘りＱＳ機構を制御することができる。従来、インドロキナゾリン骨格を有するＡＩは知られていない。したがって、ＱＳ機構を解析するための試薬として、またはＡＩ拮抗薬の開発のための研究試薬としても使用することができる。このように、新規ＩＱ型化合物は、ＡＩ活性を利用して、医薬、研究用、化成品開発、研究試薬、食品製造、プロバイオティクスの分野で使用することができる。なお、含窒素複素環化合物であるインドロキナゾリンが、心筋様細胞への分化促進作用があるとの報告がある。心筋細胞自体は再生できないが、インドロキナゾリンによって万能細胞が分化できれば心筋細胞を再生させることができ、重度な心疾患患者の治療の糸口となることが期待されている。新規ＩＱ型化合物もインドロキナゾリン骨格を有するため、このような医薬原料として使用することができる。更に、新規ＩＱ型化合物は黄色化合物であり、染料やその前駆体として使用することもできる。【0032】
（２）新規ＩＱ型化合物の化学的製造方法新規ＩＱ型化合物は、イサチンを原料として化学的に合成することができる。また、イサチンは、インドールやインジゴから製造することができる。便宜のため、図１にインドールからの合成経路の一例を記載する。インドール（１）は酸化（工程Ａ）によりインドキシル（２）となり、インドキシル（２）の酸化（工程Ｂ）によりインジゴ（３）となる。インジゴ（３）は酸化（工程Ｃ）によりイサチン（４）を生成し、イサチン（４）を加水分解（工程Ｄ）するとイサチン酸（５）が生成される。イサチン（４）とイサチン酸（５）とを脱水縮合（工程Ｅ）するとインドロキナゾリン骨格を有する前駆体（６）が形成され、これにアンモニアを加えてアミノ化（工程Ｆ）すると上記（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物となる。
【0033】
工程Ａ〜工程Ｃの空気酸化反応はわずかで副生成物も多い。そこで、イサチン（４）を原料として新規ＩＱ型化合物を化学的に合成することが好ましい。イサチン（４）溶液に、例えば水酸化ナトリウムなどのアルカリを加えて加水分解してイサチン酸（５）を生成し、これに濃アンモニア溶液を加えると、上記式（ＩＩ）に示す新規ＩＱ型化合物を製造することができる。この反応は、温度１０〜５０℃が好ましく、より好ましくは室温（温度２５±７℃）である。なお、濃アンモニアとは濃度２０〜３０ｗ／ｗ％のアンモニア溶液を意味する。【0034】
なお、イサチン（４）の加水分解（工程Ｄ）によってイサチン酸（５）が生成されるため、イサチン酸（５）を反応系に添加することなく、イサチン（４）を原料として上記式（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物が製造できる。工程Ｄの加水分解は、アンモニアや水酸化ナトリウム、水酸化カリウムその他のアルカリの添加によって室温で進行する。イサチン（４）にアンモニアを添加すると、イサチン（４）の一部がイサチン酸（５）となり、イサチン（４）とイサチン酸（５）とが脱水縮合（工程Ｅ）して前駆体（６）を形成し、かつ前駆体（６）がアミノ化（工程Ｆ）し、上記式（ＩＩ）に示す新規ＩＱ型化合物が製造される。このことは、イサチン（４）にアンモニアを添加すると、温度１０〜５０℃、例えば室温（温度２５±７℃）で上記式（ＩＩ）に示す新規ＩＱ型化合物が製造できることを意味する。【0035】
また、イサチン酸（５）を温度６０℃以上に加熱するとアンモニアが離脱する可能性がある（工程Ｇ）。この離脱したアンモニアが反応系に含まれる場合には、イサチン（４）やイサチン酸（５）に別途アンモニアを添加することなく、上記（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物を製造することができる。【0036】
更に、インジゴ（３）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で温度６０〜１４０℃、好ましくは６０〜１２０℃、特には８０〜９０℃で１２時間〜１０日間、好ましくは１〜８日間で加熱しても、上記式（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物が製造できることが判明した。インジゴ（３）、イサチン（４）、イサチン酸（５）はいずれも窒素含有化合物であり、ＤＭＳＯ中でアンモニアを遊離する可能性がある。また、上記したようにイサチン酸（５）の加熱によってもアンモニアが離脱する。結果として反応系にアンモニアが混在するため、別個にアンモニアを添加することなく、上記式（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物が製造できる。【0037】
イサチン（４）やイサチン酸（５）に代えてこれらの誘導体を使用した場合も工程Ｅ〜工程Ｆが進行し、上記式（ＩＩ）以外の新規ＩＱ型化合物を製造することができる。すなわち、下記式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と下記式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物とを脱水縮合して脱水縮合物を得て、前記脱水縮合物に下記式（ＶＩ）で示すアミン化合物を添加する工程を経ることで、上記式（Ｉ）に示す新規ＩＱ型化合物を製造することができる。【0038】
【化5】
式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は、それぞれ同一でも異なっていてもよい水素原子（−Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、ハロゲン原子、アルキル基（−Ｒ）、アルキルアミノ基（−ＮＲＲ’）、アルコキシ基（−ＯＲ）、アシル基（−ＣＯＲ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ’）、もしくはアルキルシリル基（−ＳｉＲＲ’Ｒ”）である。前記Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、不飽和結合および／または置換基を含んでいてもよい炭素数１〜２２、好ましくは炭素数１〜１８、より好ましくは炭素数１〜１２、特に好ましくは炭素数１〜８の直鎖または分岐を有していてもよいアルキル基である。前記置換基としては、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、ただしＲは炭素数１〜５のアルキル基である。）、ハロゲン原子、アミノ基（−ＮＲＲ’、ただし、ＲおよびＲ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）がある。また、Ｒ１〜Ｒ４の内いずれか２つは、炭素原子および／または炭素以外の原子を含んで互いに結合して環構造を形成していてもよい。環構造としては、炭素数３〜１２のシクロアルカン、ビシクロアルカン、不飽和結合を含むベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、チッソ、イオウ、酸素などのヘテロ原子を含む複素環であってもよい。
Ｒ９，Ｒ１０は、それぞれ同一でも異なっていてもよい、水素原子（−Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アルキル基（−Ｒ）、アルキルアミノ基（−ＮＲＲ’）、アルコキシ基（−ＯＲ）、アシル基（−ＣＯＲ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＲＲ’）であり、前記Ｒ、およびＲ’は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、不飽和結合および／または置換基を含んでいてもよい炭素数１〜２２、好ましくは炭素数１〜１８、より好ましくは炭素数１〜１２、特に好ましくは炭素数１〜８の直鎖または分岐を有していてもよいアルキル基である。前記置換基としては、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸誘導体（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＲ、ただしＲは炭素数１〜５のアルキル基である）、ハロゲン原子、アミノ基（−ＮＲＲ’、ただし、ＲおよびＲ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）がある。
【0039】
合成反応に使用する式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物とは、Ｒ１〜Ｒ４で示す基が、それぞれ同一でもよく異なっていてもよい。例えば、式（ＩＶ）で示すイサチン化合物において、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ４が水素原子、Ｒ３がメトキシ基であるイサチン化合物と、式（Ｖ）で示すＲ１，Ｒ２，Ｒ３が水素原子、Ｒ４がアミノ基であるイサチン酸化合物とを反応させることができる。例えば、５−メトキシイサチン溶液に水酸化ナトリウムなどのアルカリを加えて加水分解し、５−メトキシイサチン酸とする。これに４−アミノイサチンおよび濃アンモニア溶液を加えると、上記式（Ｉ）のＲ７がメトキシ基およびＲ４がアミノ基の新規ＩＱ型化合物を合成することができる。なお、イサチンは加水分解により対応するイサチン酸を生成するため、原料として２分子の上記式（ＩＶ）で示すイサチン化合物を使用して式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物を生成させ、これを用いて新規ＩＱ型化合物を合成することもできる。【0040】
また、図１の工程Ｆで使用するアンモニアに代えて、上記式（ＶＩ）で示すアミン化合物（ＮＨＲ９Ｒ１０）を使用すれば、Ｒ９、Ｒ１０が水素原子以外の新規ＩＱ型化合物を合成することもできる。アンモニア以外のアミン化合物を使用する場合、図１で示すインドロキナゾリン骨格を有する前駆体（６）のカルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等の脱水縮合剤で活性化すると、円滑にアミン化合物とのアミド化反応が進行する。すなわち、予め調製した前記インドロキナゾリン骨格を有する前駆体（６）や、Ｒ１〜Ｒ８が上記式（Ｉ）で示すＲ１〜Ｒ８である前駆体（６）をジクロロメタンに溶解し、室温下で当モル量のＤＣＣおよびＨＯＢｔを加え撹拌し、アンモニア以外の式（ＶＩ）で示すアミン化合物（ＮＨＲ９Ｒ１０）を当モル量添加し、撹拌することで、Ｒ９、Ｒ１０が水素原子以外の新規ＩＱ型化合物を製造することができる。【0041】
なお、Ｒ１１が水素原子以外の新規ＩＱ型化合物は、予めＲ１１が水素原子の新規ＩＱ型化合物を得た後、Ｒ１１を修飾することで合成することができる。例えば、Ｒ１１がアシル基である新規ＩＱ型化合物を合成する場合は、予め調製したＲ１１が水素原子である新規ＩＱ型化合物をジクロロメタンなどの溶媒に溶解し、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンを添加し、そこに対応する酸塩化物あるいは酸無水物を加え撹拌する。これにより、Ｒ１１がアシル基である新規ＩＱ型化合物を製造することができる。なお、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１0のいずれかが反応性の置換基である場合は、予め保護しておけばよい。【0042】
また、Ｒ１１がシリル基の新規ＩＱ型化合物を合成する場合は、予め調製したＲ１１が水素原子である新規ＩＱ型化合物をジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶解し、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンを添加し、そこに対応するシリルクロライドを加え撹拌する。これにより、Ｒ１１がシリル基である新規ＩＱ型化合物を製造することができる。なお、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１0のいずれかが反応性の置換基である場合は、予め保護しておけばよい。【0043】
また、Ｒ１１がアルキル基の新規ＩＱ型化合物を合成する場合は、予め調製したＲ１１が水素原子である新規ＩＱ型化合物をジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶解し、当モル量の水素化ナトリウムを加え、そこに対応するハロゲン化アルキルを加え撹拌する。これにより、Ｒ１１がアルキル基である新規ＩＱ型化合物を製造することができる。なお、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１0のいずれかが反応性の置換基である場合は、予め保護しておけばよい。【0044】
上記したように、イサチン酸（５）はアルカリ条件でイサチン（４）から生成され、同様に、上記式（ＩＶ）で示すイサチン化合物からも式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物が生成される。従って、式（ＩＶ）で示すイサチン化合物の使用により、式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物を添加することなく、式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物との混合物が得られる。したがって、本発明において、「式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物と」とは、式（ＩＶ）で示すイサチン化合物と式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物と使用する場合の他、式（Ｖ）で示すイサチン酸化合物を添加することなく、式（ＩＶ）で示すイサチン化合物のみを使用する場合を含むものとする。【0045】
上記に加え、公知化合物である下記（ＩＩＩ）に示すメチルイソトイド（methylisatoid）を原料とし、メトキシ基に代えてアミノ基を導入して、前記式（ＩＩ）に示す化合物を調製することもできる。【0046】
【化6】
【0047】
（３）新規ＩＱ型化合物の微生物による生合成式（ＩＩ）で示す新規ＩＱ型化合物は、インドールやインドール誘導体の酸化酵素（以下、単にインドール類酸化酵素と称する。）をコードする核酸を含むベクターで形質転換された形質転換体から生合成することができる。図１に示すように、新規ＩＱ型化合物は、インドールを酸化条件下に制御して生成されるイサチン（４）とイサチン酸（５）との脱水縮合（工程Ｅ）、および脱水縮合物（６）のアミノ化（工程Ｆ）によって生成される。したがって、インドールの第３位を酸化できるインドール類酸化酵素は、新規ＩＱ型化合物合成酵素となる。インドールは、微生物内でトリプトファンの分解産物として生産されるため、インドール類酸化酵素を発現しうる微生物を使用すれば、新規ＩＱ型化合物を生合成することができる。このような微生物として、インドール類酸化酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を使用することができる。なお、インドール誘導体とは、インドールのベンゼン環の水素原子が上記式（Ｉ）で示すＲ１〜Ｒ４であるインドール化合物を意味する。
【0048】
新規ＩＱ型化合物合成酵素として、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質を好適に使用することができる。配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、新規ＩＱ型化合物の合成能のある酵素活性を有するタンパク質であってもよい。ここで、「１若しくは数個」というとき、１〜８５個、好ましくは１〜６４個、より好ましくは１〜４２個を表す。また、新規ＩＱ型化合物の合成能を有することを条件に、配列番号１に示す新規ＩＱ型化合物合成酵素の一部の配列であってもよく、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％のホモロジーを有するアミノ酸配列のタンパク質であってもよい。新規ＩＱ型化合物の合成能を有するため、これらタンパク質を新規ＩＱ型化合物合成酵素と称する。【0049】
インドール類酸化酵素は、新規ＩＱ型化合物合成酵素として使用することができる。このような酵素として、上記の他に、海洋環境サンプル由来のＭＧ７９−１２（配列番号２）、ＭＧ７９−１５（配列番号３）、ＭＧ７９−１６（配列番号４）、ＭＧ７９−２０（配列番号５）、ＭＧ９２−５（配列番号６）、ＭＧ９２−６（配列番号７）、昆虫共生菌由来のＭｏｘＹ（配列番号８）などがある。なお、新規ＩＱ型化合物を合成できることを条件に、上記したインドール類酸化酵素に限定されない。【0050】
（４）新規ＩＱ型化合物合成酵素をコードする核酸（ｑｓｓＡ）新規ＩＱ型化合物合成酵素として、メタゲノム解析およびＡＩ活性を検出する微生物センサーによって見出された配列番号１に示す新規ＩＱ型化合物合成酵素がある。この新規ＩＱ型化合物合成酵素をＱｓｓＡと称し、ＱｓｓＡをコードする核酸として配列番号９で示される遺伝子があり、これをｑｓｓＡと称する。また、上記式（Ｉ）で示す新規ＩＱ型化合物の合成活性を有するタンパク質をコードすることを条件に、配列番号９に示される塩基配列の相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列や、配列番号９に示される塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一性を有する塩基配列に示されるいずれかの塩基配列であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ９０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。このような「ストリンジェントな条件」としては、例えば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で２５℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素があり、これら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【0051】
（５）遺伝子ｑｓｓＡの調製方法遺伝子ｑｓｓＡは、活性汚泥環境に含まれる微生物に由来するメタゲノムライブラリーを用いて調製される。活性汚泥から複合微生物の由来のＤＮＡを抽出し、約４０ｋｂのＤＮＡ画分を分取する。これらＤＮＡをそれぞれフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ベクターなどに導入し、このベクターを大腸菌（Escherichia coli）などの宿主に導入して各ＤＮＡのクローンからなるメタゲノムライブラリーを構築する。これを適当な微生物センサーを使用してＡＩ活性を有する大腸菌クローンを選択する。微生物センサーとしては、例えば、ＡＨＬレセプター遺伝子（ＬｕｘＲ）、ＡＨＬ合成酵素遺伝子のプロモーター（ＬｕｘＩ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むプラスミドが導入された大腸菌などを使用することができる。メタゲノムライブラリーのクローンが、新規ＩＱ型化合物合成酵素を発現してＡＩ活性を有するとＧＦＰの緑色蛍光を発するから、ＡＩ活性を有するクローンを検出することができる。緑色蛍光を発したクローンに含まれる約４０ｋｂのＤＮＡの中からＡＩ活性を有する遺伝子配列を特定するには、このクローンの変異体を用いればよい。このような変異体として、例えば、緑色蛍光を発したクローンのＤＮＡの任意の位置にトランスポゾンを導入した複数の変異体群を調製する。これらを前記微生物センサーで培養し、緑色蛍光を発しないクローンを検出する。このクローンのトランスポゾン導入位置は、新規ＩＱ型化合物合成酵素の遺伝子領域と推定することができる。このようにして検出された遺伝子領域の一つがｑｓｓＡである。上記によって検出されたｑｓｓＡは、適当なプライマーを使用し、ＰＣＲ等の公知の方法で増幅することができる。
【0052】
（６）海洋環境サンプル由来インドール類酸化酵素遺伝子の調製方法前記ＭＧ７９−１２（配列番号２）、ＭＧ７９−１５（配列番号３）、ＭＧ７９−１６（配列番号４）、ＭＧ７９−２０（配列番号５）、ＭＧ９２−５（配列番号６）、ＭＧ９２−６（配列番号７）をコードする遺伝子は、それぞれ配列番号１３（ＭＧ７９−１２のＤＮＡ配列）、配列番号１４（ＭＧ７９−１５のＤＮＡ配列）、配列番号１５（ＭＧ７９−１６のＤＮＡ配列）、配列番号１６（ＭＧ７９−２０のＤＮＡ配列）、配列番号１７（ＭＧ９２−５のＤＮＡ配列）、配列番号１８（ＭＧ９２−６のＤＮＡ配列）で示すことができる。これらは、海洋環境あるいは海洋無脊椎動物に含まれる微生物に由来するメタゲノムライブラリーを用いて、インジゴ生産能を指標に調製することができる。
【0053】
例えば、海水、海底堆積物、干潟砂泥、海綿やホヤ等の海洋底生無脊椎動物から複合微生物の由来のＤＮＡを抽出し、約４０ｋｂのＤＮＡ画分を分取する。これらＤＮＡを、遺伝子ｑｓｓＡの調製方法と同様に、それぞれフォスミドベクターなどに導入し、このベクターを大腸菌などの宿主に導入して、各ＤＮＡのクローンからなるメタゲノムライブラリーを構築する。ついで、これをインドール酸化活性を指標に選択する。具体的にはコロニーが濃青色を呈するインジゴの生産能を指標とする。濃青色を示したクローンに含まれる約４０ｋｂのＤＮＡの中からインドール酸化に関する遺伝子配列を特定するには、以下の方法を用いる。フォスミドＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３ｋｂ程度にランダムに断片化した後、プラスミドにサブクローニングし、インジゴ生産能を有するサブクローンを選択する。インジゴ生産サブクローンに組み込まれたＤＮＡの配列を決定し、遺伝子領域を推定する。上記によって検出された遺伝子は、適当なプライマーを使用し、ＰＣＲ等の公知の方法で増幅することができる。なお、最終的にＰＣＲ増幅で作成したクローンは、前記遺伝子ｑｓｓＡの調製の際にＡＩ活性物質の検出に使用した微生物センサーを用いて、ＡＩ活性物質の生産を確認することができる。【0054】
（７）新規ＩＱ型化合物合成酵素産生能を有する形質転換体適当なベクターにｑｓｓＡを連結することで、新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子発現ベクター（以下、単に組換えベクターと称する。）を調製することができる。ＱｓｓＡは新規ＩＱ型化合物合成酵素であり、インドール類酸化酵素である。したがって、新規ＩＱ型化合物を合成し得ることを条件に、他のインドール類酸化酵素をコードする核酸をｑｓｓＡと同様に使用し、組換えベクターを調製することができる。このようなインドール類酸化酵素の遺伝子として、前記ＭＧ７９−１２（配列番号２）、ＭＧ７９−１５（配列番号３）、ＭＧ７９−１６（配列番号４）、ＭＧ７９−２０（配列番号５）、ＭＧ９２−５（配列番号６）、ＭＧ９２−６（配列番号７）をコードする遺伝子は、それぞれ配列番号１３（ＭＧ７９−１２のＤＮＡ配列）、配列番号１４（ＭＧ７９−１５のＤＮＡ配列）、配列番号１５（ＭＧ７９−１６のＤＮＡ配列）、配列番号１６（ＭＧ７９−２０のＤＮＡ配列）、配列番号１７（ＭＧ９２−５のＤＮＡ配列）、配列番号１８（ＭＧ９２−６のＤＮＡ配列）がある。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。宿主は、組換えベクターが機能するものであれば特に限定されず、大腸菌、放線菌なども使用することができる。なお、ベクター中に導入する遺伝子の方向及び順序は、遺伝子が発現され、および発現されたタンパク質が新規ＩＱ型化合物合成酵素として機能できればよく、任意に配列及び選択することができる。
【0055】
形質転換体は、上記組換えベクターを宿主に導入し、形質転換することで調製できる。形質転換体を調製する際に組換えベクターを宿主に導入する方法として、従来公知のエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)などの手法を用いることができる。また、形質転換体の作製に際し、使用するベクター、宿主、高発現を誘導する誘導基質、プロモーター、オペレーター、エンハンサーなどを適宜選択し、使用することができる。一般には、新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子を発現プラスミドベクターに組み込み、大腸菌に導入するが、これに限定されない。【0056】
（８）新規ＩＱ型化合物合成酵素の調製方法新規ＩＱ型化合物合成酵素は、上記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれも意味するものである。培養は、組換えベクターを導入した宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。例えば、形質転換体が大腸菌である場合、当研究分野で通常用いる栄養培地で培養し、必要に応じてｌａｃプロモーター誘導剤であるＩＰＴＧ(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)などの誘導物質を加え、大腸菌が増殖できる栄養培地中での酵素の高発現を行うことができる。通常の培養条件では、適宜、抗生物質を加えたＬＢ培地（１．０％ペプトン、０．５％乾燥酵母エキス、１．０％ＮａＣｌから成る）で３７℃、８〜１２時間前培養し、この十分増殖した菌体を種菌として、新しいＬＢ培地に容量比１〜５％植菌、３７℃、２〜４時間本培養し、ＩＰＴＧを加え、さらに３０℃で２〜４時間培養する。他の形質転換体の場合も、それぞれの宿主細胞用に適した培地で培養する。形質転換体を懸濁培養する場合には、懸濁液の濃度は、６００ｎｍの濁度で１〜２が好適であり、必要に応じて増減できる。
【0057】
形質転換体が新規ＩＱ型化合物合成酵素を生成する場合、培養液中に新規ＩＱ型化合物も含まれる。よって、当該化合物のＡＩ活性を確認することで、形質転換体が新規ＩＱ型化合物合成酵素を生産の有無を確認することができる。当該酵素の生産を確認した後、培養液から新規ＩＱ型化合物合成酵素を抽出する。新規ＩＱ型化合物合成酵素が菌体外に生産される場合には、培養液から菌体を除去し、新規ＩＱ型化合物合成酵素を抽出する。一方、新規ＩＱ型化合物合成酵素が菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより新規ＩＱ型化合物合成酵素を抽出する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用い、新規ＩＱ型化合物合成酵素を単離する。【0058】
（９）形質転換体による新規ＩＱ型化合物の調製新規ＩＱ型化合物は、インドールを基質として新規ＩＱ型化合物合成酵素によって生成する。新規ＩＱ型化合物合成酵素がインドールを酸化すると微生物内でイサチンおよびイサチン酸が生成し、これらの脱水縮合し、および１３位の水酸基がアミノ基と置換して、新規ＩＱ型化合物が生成する。インドールは、微生物内でトリプトファンの分解によって生成するから、培養液中にトリプトファンが含まれるとインドールが生成される。なお、図１に示すように、インドロキナゾリン骨格を有する前駆体（６）は、アミノ化（工程Ｆ）して上記式（ＩＩ）に示す新規ＩＱ型化合物を生成するため、アンモニアが供給される必要がある。しかしながら、後記する実施例に示すように、上記形質転換体を培養すると培養液にアンモニアを供給することなく直接培養液中に上記式（ＩＩ）に示す新規ＩＱ型化合物が生成される。
【0059】
新規ＩＱ型化合物は、上記形質転換体の培養菌体、若しくは培養上清又は酵素反応液から、有機溶媒等を用いて抽出する。新規ＩＱ型化合物を精製するためには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーなどを単独又は組み合わせて用いることができる。【実施例】
【0060】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。【0061】
（実施例１）新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子の調製排水処理に利用する活性汚泥から複合微生物由来のＤＮＡを抽出し、ゲル電気泳動で４０ｋｂ程度のサイズのＤＮＡを分取した。ベクターとしてフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ベクターｐＣＣ１Ｆｏｓを使用し、大腸菌（Escherichia coli）ＥＰＩ３００株を宿主として、前記分画したＤＮＡのクローンからなるメタゲノムライブラリーを構築した。これを抗生物質（クロラムフェニコール）を添加したＬＢ（Luria-bertani）液体培地で培養し、ＡＨＬレセプター遺伝子（ＬｕｘＲ）、ＡＨＬ合成酵素遺伝子のプロモーター（ＬｕｘＩ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むｐＪＢＡ１３２プラスミドを有する大腸菌を微生物センサーとして使用し、前記微生物センサーがＧＦＰの蛍光を発するクローンを得た。これをメタゲノムクローンＮ４３株と称する。
【0062】
次いで、メタゲノムクローンＮ４３株に含まれるメタゲノムＤＮＡにコードされる遺伝子の中から、新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子を特定した。具体的には、メタゲノムクローンＮ４３株のメタゲノムＤＮＡへ配列番号１０で示すトランスポゾンをランダムに挿入したメタゲノムクローンＮ４３株の複数の変異体を作製した。トランスポゾンを利用した変異体の調製は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製,ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭ＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔを利用した。これら変異体について、上記微生物センサーを使用し、ＧＦＰの蛍光を発しないクローンを得た。このクローンのメタゲノムＤＮＡの塩基配列決定によってトランスポゾンが挿入した遺伝子を特定し、この遺伝子を新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子とした。この遺伝子をｑｓｓＡと称し、その配列を配列番号９に示す。【0063】
(実施例２）新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子による形質転換体の調製上記実施例１で単離した新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子ｑｓｓＡ（配列番号９）をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーセットの配列は、次の通りである。
Fwd:5’- GGAATTCCATATGAACATCAGAAAGAACCCT TTA-3’（配列番号１１）
Rvs:5’- CGGGATCCTTAGTCGCGTTCGCCCTCGTTGTAT-3’（配列番号１２）
ＰＣＲはフォスミドＤＮＡであるｐＮ４３を鋳型とし、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を利用して、以下の反応条件で行った。最初、９４℃で３０秒間加熱し、それから９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間を３０回繰り返した。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー（タカラバイオ社製）を使用した。ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（２５０）（キアゲン社製）で精製し、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ導入し、このようにして構築したプラスミドベクターで、大腸菌（Escherichia coli DH5alpha）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地に植菌し、形質転換体を得た。
【0064】
（実施例３）新規ＩＱ型化合物の発酵的調製実施例２で得た形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪して前培養した。前培養した形質転換体を１Ｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃でさらに２４時間培養した。培養液５００ｍｌ容量の遠心チューブに入れ８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し上清を得た。これを合計１６０Ｌ分調製した。
【0065】
（実施例４）新規ＩＱ型化合物の単離前記実施例３で得た上清１．６Ｌあたり酢酸エチル０．６Ｌで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を２０％メタノールに溶解し、逆相クロマトグラフィー（ナカライテスク製「Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ」）を用い、含水メタノールを溶出液として化合物の分離を行った。実施例１で使用した微生物センサーによってＡＩ活性が確認された活性画分をゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＥ・ヘルスケア製「Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０」）に供し、メタノールを溶出液として化合物を分離した。次いで、得られた活性画分をゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＥ・ヘルスケア製、「Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０」）に供し、５０％含水メタノールを溶出液として化合物を分離した。得られた活性画分を下記条件１、条件２、および条件３の逆相高速液体クロマトグラムにより分画し、新規ＩＱ型化合物を得た。
【0066】
逆相高速液体クロマトグラムの条件は以下のとおりである。条件１：
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＧＳ−３２０ ＨＱ（昭和電工製、内径７．６ｍｍ、長さ３０ｃｍ）、
溶出条件：６０％から１００％メタノール（０．２ｖ／ｖ％酢酸）、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
解析時間：４０分、
検出波長：２５４ｎｍ、
保持時間：３３〜３５ｍｉｎ
【0067】
条件２：カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ πＮＡＰ（ナカライテスク製、内径１０ｍｍ、長さ２５ｃｍ）
溶出条件：１０％から１００％メタノール（０．２ｖ／ｖ％酢酸）、
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、
解析時間：３０分、
検出波長：２５４ｎｍ、
保持時間：２２〜２４ｍｉｎ
【0068】
条件３：カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−II（ナカライテスク製、内径１０ｍｍ、長さ２５ｃｍ）、
溶出条件：２０％から１００％メタノール（０．２ｖ／ｖ％酢酸）、
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、
解析時間：４０分、
検出波長：２５４ｎｍ、
保持時間：１７．５ｍｉｎ
【0069】
（実施例５）新規ＩＱ型化合物の化学的合成−１インジゴのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）６３Ｌを８０℃で３〜７日間保温した。これに２倍量の水を加え、Ｃ１８担体（ナカライテスク製、「Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ」）を用いて固相抽出を行った。吸着画分をメタノールで溶出して濃縮し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＥ・ヘルスケア製、「Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０」）に供し、５０％含水メタノールを溶離液として、実施例１で使用した微生物センサーによってＡＩ活性を有する画分を分取した。得られた活性画分をヘキサン‐酢酸エチル混合溶媒（１：３）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（和光純薬製、「Ｗａｋｏｇｅｌ−Ｃ２００Ｅ」）に供した。次いで、得られた活性画分を、下記の条件１および条件２の高速液体クロマトグラフィーで精製し、新規ＩＱ型化合物を得た。
【0070】
高速液体クロマトグラムの条件は以下の通りである。条件１：
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ πＮＡＰ（ナカライテスク製、内径１０ｍｍ、長さ２５ｃｍ）
溶出条件：３０％から９０％メタノール（０．２ｖ／ｖ％酢酸）、
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、
解析時間：４０分、
検出波長：２５４ｎｍ、４５３ｎｍ、
保持時間：２７．５ｍｉｎ
【0071】
条件２：カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ５（野村化学製、内径１０ｍｍ、長さ２５ｃｍ）
溶出条件：２５％から６５％メタノール、
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、
解析時間：４０分、
検出波長：２５４ｎｍ、４５３ｎｍ、
保持時間：１７．５ｍｉｎ
【0072】
（実施例６）新規ＩＱ型化合物の化学的合成−２イサチン２０ｇを２Ｌの水に懸濁し、２８％アンモニア水溶液３０ｍＬを加えて、室温で３時間反応させた。イサチンが完全に反応し、暗赤色の溶液となったら、酢酸３０ｍＬを加えて中和し、Ｃ１８担体（ナカライテスク製、「Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ」）を用いて固相抽出を行った。その後、実施例５と同様に操作して、新規ＩＱ型化合物を得た。
【0073】
（実施例７）新規ＩＱ型化合物の化学的合成−３イサチン３ｇを３０ｍＬの水に懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２００μＬ加えて、室温で３０分反応した。イサチンが完全に反応し、暗赤色の溶液となったら、酢酸１ｍＬを加えて中和した。その中に、別途イサチン３ｇを３０ｍＬのメタノールに溶解したものを加えて、室温で一晩静置した。上記混合溶液に２８％アンモニア水溶液を３ｍＬ加えて、さらに室温で２４時間静置した。その後、酢酸３ｍＬを加えた後、エバポレーターで２０ｍＬ程度まで濃縮し、Ｃ１８担体（ナカライテスク製、「Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＰＲＥＰ」）を用いて固相抽出を行った。その後、実施例５と同様に操作して、新規ＩＱ型化合物を得た。
【0074】
（実施例８）新規ＩＱ型化合物の構造決定実施例５で得た新規ＩＱ型化合物について、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）（ＪＥＯＬ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ製、「ＪＮＭ−ＥＣＺＳ ４００」）を用い、ＤＭＳＯ（ｄ−６）中で核磁気共鳴スペクトルを得た。１Ｈ−ＮＭＲの結果を図２および表１に、１３Ｃ−ＮＭＲの結果を図３および表１に示す。なお、表１の下部に当該化合物の基本骨格と位置番号とを示す。また、高分解能ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）（ＡＢ ＳＣＩＥＸ製、「ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００＋」）を用いて質量分析を行い、その分子式をＣ１６Ｈ１１Ｎ３Ｏ３と決定した。結果を図４に示す。新規ＩＱ型化合物の化学合成経路、ＮＭＲの結果、質量分析の結果から、公知化合物であるメチルイソトイドと類似の構造を有することが推定された。そこで、メチルイソトイドのＮＭＲなどを参照し、その他、各種２次元ＮＭＲを測定（結果不図示）し、最終的に実施例５で得た新規ＩＱ型化合物の構造は、6-oxo-12-hydroxy-6,12-dihydroindolo[2,1-b]quinazoline-12-carboxamideと同定した。
【0075】
【表1】
【0076】
【化7】
【0077】
なお、実施例６および実施例７で得た化合物も、実施例5で得た化合物と同じ6-oxo-12-hydroxy-6,12-dihydroindolo[2,1-b]quinazoline-12-carboxamideであることを確認した。【0078】
（実施例９）実施例４で形質転換体の発酵により調製した新規ＩＱ型化合物について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図５（Ａ）に示す。その他、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ分析の結果（結果不図示）より、実施例４で得た化合物と実施例５で得た新規ＩＱ型化合物とは同一構造であることを確認した。なお、実施例５で得た新規ＩＱ型化合物について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った結果を図５（Ｂ）に示す。
【0079】
(実施例１０）海洋環境由来の新規ＩＱ型化合物合成酵素遺伝子の調製海水、海底堆積物、干潟砂泥、海綿やホヤ等の海洋底生無脊椎動物から複合微生物由来のＤＮＡを抽出し、ゲル電気泳動で４０ｋｂ程度のサイズのＤＮＡを分取した。ベクターとしてフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ベクターｐＣＣ１Ｆｏｓを使用し、大腸菌（Escherichia coli）ＥＰＩ３００株を宿主として、前記分画したＤＮＡのクローンからなるメタゲノムライブラリーを構築した。フォスミドDNAを制限酵素Sau３AIで３ｋｂ程度にランダムに断片化後、プラスミドにサブクローニングし、コロニーが濃青色を呈するインジゴ生産能を有するサブクローンを選択した。次いで、インジゴ生産サブクローンに組み込まれたDNAの配列を決定し、遺伝子領域を特定した。これにより、ＭＧ７９−１２の塩基配列（配列番号１３）、ＭＧ７９−１５の塩基配列（配列番号１４）、ＭＧ７９−１６の塩基配列（配列番号１５）、ＭＧ７９−２０の塩基配列（配列番号１６）、ＭＧ９２−５の塩基配列（配列番号１７）、ＭＧ９２−６の塩基配列（配列番号１８）で示されるインドール類酸化酵素の遺伝子を調製した。これら遺伝子は、インジゴ産生クローンに由来し、いずれもインジゴを生産しうる遺伝子である。
【0080】
(実施例１１）実施例１で使用したメタゲノムライブラリーのクローンに代えて、実施例１０で調製したＭＧ７９−１２の塩基配列（配列番号１３）、ＭＧ７９−１５の塩基配列（配列番号１４）、ＭＧ７９−１６の塩基配列（配列番号１５）、ＭＧ７９−２０の塩基配列（配列番号１６）、ＭＧ９２−５の塩基配列（配列番号１７）、ＭＧ９２−６の塩基配列（配列番号１８）で示されるインドール類酸化酵素の遺伝子をプラスミドベクターに導入し、大腸菌（Escherichia coli）ＮＥＢ−１０β株を宿主として各インドール類酸化酵素のクローンを調製した。これを、実施例１と同様に微生物センサーと培養し、ｅｘ：４８５ｎｍ、ｅｍ：５３８ｎｍで蛍光強度を測定してＡＩ活性を評価した。ＱｓｓＡ、ＭＧ７９−１５、ＭＧ７９−１６、ＭＧ７９−２０、ＭＧ９２−５、ＭＧ９２−６およびプラスミドのＡＩ活性の結果を図６に示す。図６に示すように、ＱｓｓＡ以外のインドール類酸化酵素によっても、ＡＩ活性が観察された。なお、図示しないが、ＭＧ７９−１２にもＡＩ活性が認められた。
【0081】
(実施例１２）実施例５で得た新規ＩＱ型化合物を滅菌水に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で仕込み、化合物濃度０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌの希釈液を調製した。実施例１で使用した微生物センサーを培養液と共に９倍量添加し、３０℃、１２時間培養し、培養後の発光強度を４８０ｎｍで測定した。また、比較のため、新規ＩＱ型化合物に代えてＡＨＬ化合物である３−オキソヘキサノイル−ホモセリンラクトン(3-oxo-hexanoyl-homoserine lactone)を使用し、同様に操作して発光強度を４８０ｎｍで測定した。結果を図７に示す。図７に示すように、新規ＩＱ型化合物は、終濃度１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌにて、ＡＨＬ化合物より２倍の発光強度を有した。
【0082】
(実施例１３）海洋微生物であるビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveri）の培養液に実施例５で得た新規ＩＱ型化合物を終濃度０．１、１、１０、１００および１０００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、バイオフィルム形成能を評価した。比較のため新規ＩＱ型化合物に代えてＡＨＬ化合物である３−オキソヘキサノイル−ホモセリンラクトンを使用し、同様に処理した。培養は、２５℃、２４時間、静置により行った。培養後、染色および脱染し、５９５ｎｍにて吸光度を測定した。結果を図８に示す。なお、図８において０ｎｇ／ｍｌは、新規ＩＱ型化合物を添加しなかった結果である。図８に示すように、新規ＩＱ型化合物はＡＨＬ化合物（３−オキソヘキサノイル−ホモセリンラクトン）と同様に、バイオフィルム形成能を発揮した。
【0083】
(実施例１４）バチルス・セレウス（Bacillus cereus）培養液に、実施例５で得た新規ＩＱ型化合物を終濃度１μｇ／ｍｌとなるように添加し、３０℃で１２時間培養し、培養後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清について実施例１で使用した微生物センサーにより発光強度を４８０ｎｍで測定した。また、比較のため、新規ＩＱ型化合物に代えてＡＨＬ化合物（３−オキソヘキサノイル−ホモセリンラクトン）を使用し、同様に操作した。微生物センサー、バチルス・セレウス、新規ＩＱ型化合物およびＡＨＬ化合物単独での結果と併せて図９に示す。新規ＩＱ型化合物は、バチルス・セレウスと培養した後も新規ＩＱ型化合物単独の場合と同様の高い発光強度を示し、バチルス・セレウスによる分解に高い耐性を有することが示された。
【0084】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。【0085】
本発明は２０１６年１２月２７日に出願された日本国特許出願２０１６−２５２５５４号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１６−２５２５５４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。【産業上の利用可能性】
【0086】
本発明により、ＱＳ機構による微生物の病原性発現の調節作用が注目される新規ＩＱ型化合物が提供される。この化合物は、微生物の生分解性に耐性があり、発酵分野でのＱＳ機構の制御に有用である。しかも、化学的にまたは生物学的に製造することができるため安定供給も可能であり、各種分野の産業分野で有用である。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]