ホーム > 特許ランキング > 三菱ケミカル株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 三菱レイヨン株式会社の特許一覧 ▶ 独立行政法人産業技術総合研究所の特許一覧
特開2022-150327イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物およびこれを用いたイソプレン製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022150327
(43)【公開日】2022-10-07
(54)【発明の名称】イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物およびこれを用いたイソプレン製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220929BHJP
C12P 5/02 20060101ALI20220929BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220929BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12P5/02
C12N15/09 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021052892
(22)【出願日】2021-03-26
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）２０１６年度～２０２０年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発 高生産性微生物創製に資する情報解析システムの開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】000006035
【氏名又は名称】三菱ケミカル株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】湯村 秀一
(72)【発明者】
【氏名】阪本 剛
(72)【発明者】
【氏名】中島 信孝
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AB04
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB14
4B064CB22
4B064CC24
4B064CD04
4B064CE10
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA15X
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AA41X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065CA03
4B065CA54
(57)【要約】
【課題】再生可能資源であるバイオマスからイソプレンを製造するための技術の提供。
【解決手段】メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物。
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物。
【請求項2】
１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）活性、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）活性、およびイソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変体に比して増強されている、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項3】
クエン酸シンターゼ（GltA）活性が非改変株に比して低減されている、請求項１または２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項4】
２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）活性、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）活性、および２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、請求項１－３のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項5】
アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）活性、メバロン酸キナーゼ（MVK）活性、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、請求項１－４のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項6】
大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびシュードモナス（Pseudomonas）属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１－５のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項7】
水性媒体中でイソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物と有機原料とを接触させる工程を含む、イソプレンの製造方法であって、
前記遺伝子改変微生物が、
メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
製造方法。
前記遺伝子改変微生物が、
メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
製造方法。
【請求項8】
前記有機原料が、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、トレハノース、セロビオース、スクロース、デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロールおよび／またはマンニトールを含む、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物およびこれを用いたイソプレン製造方法に関する。より詳しくは、再生可能資源であるバイオマスからイソプレンを製造するための遺伝子改変微生物等に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリイソプレンゴム（IR）は、タイヤの重要な原料でもある天然ゴムの代替材料として注目されている。ポリイソプレンゴム（IR）の原料となるイソプレンモノマー（以下、単に「イソプレン」と称する）は、ナフサのクラッキングにより得られるC5留分から抽出されている。しかし、資源保護および環境保全の観点から、非石油資源、特に再生可能資源であるバイオマスからイソプレンを製造する技術が望まれている。
【0003】
本発明に関連して、例えば、非特許文献１では、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）遺伝子、イソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）遺伝子およびイソプレンシンターゼ（IspS）遺伝子を過剰発現させた大腸菌を用いたイソプレンの製造方法が提案されている。
非特許文献１は、同製造方法において、メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路内の１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）による反応がイソプレン生産の律速となっていることを示唆している。一方で、IspG遺伝子と、MEP経路内でIspGの下流に位置する１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）遺伝子と、を単純に過剰発現させるのみでは、IspGによる反応における律速は解除されず、イソプレン生産量は増加しないことが報告されている。
非特許文献１は、同製造方法において、メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路内の１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）による反応がイソプレン生産の律速となっていることを示唆している。一方で、IspG遺伝子と、MEP経路内でIspGの下流に位置する１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）遺伝子と、を単純に過剰発現させるのみでは、IspGによる反応における律速は解除されず、イソプレン生産量は増加しないことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】"Investigation of the methylerythritol 4-phosphate pathway for microbial terpenoid production through metabolic control analysis", Microbial Cell Factories, 2019, 18:192
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、再生可能資源であるバイオマスからイソプレンを製造するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］－［１３］を提供する。
［１］メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物。
［２］ １－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）活性、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）活性、およびイソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変体に比して増強されている、［１］の遺伝子改変微生物。
［３］ クエン酸シンターゼ（GltA）活性が非改変株に比して低減されている、［１］または［２］の遺伝子改変微生物。
［４］ ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）活性、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）活性、および２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［１］－［３］のいずれかの遺伝子改変微生物。
［５］ アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）活性、メバロン酸キナーゼ（MVK）活性、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［１］－［４］のいずれかの遺伝子改変微生物。
［６］ 大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびシュードモナス（Pseudomonas）属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［１］－［５］のいずれかの遺伝子改変微生物。
［１］メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
イソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物。
［２］ １－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）活性、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）活性、およびイソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変体に比して増強されている、［１］の遺伝子改変微生物。
［３］ クエン酸シンターゼ（GltA）活性が非改変株に比して低減されている、［１］または［２］の遺伝子改変微生物。
［４］ ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）活性、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）活性、および２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［１］－［３］のいずれかの遺伝子改変微生物。
［５］ アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）活性、メバロン酸キナーゼ（MVK）活性、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［１］－［４］のいずれかの遺伝子改変微生物。
［６］ 大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびシュードモナス（Pseudomonas）属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［１］－［５］のいずれかの遺伝子改変微生物。
【0007】
［７］ 水性媒体中でイソプレン産生能を有する遺伝子改変微生物と有機原料とを接触させる工程を含む、イソプレンの製造方法であって、
前記遺伝子改変微生物が、
メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
製造方法。
［８］ 前記有機原料が、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、トレハノース、セロビオース、スクロース、デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロールおよび／またはマンニトールを含み、好ましくはグルコースおよび／またはスクロースを含む、［７］の製造方法。
［９］ 前記遺伝子改変微生物が、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）活性、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）活性、およびイソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変体に比して増強されている、［７］または［８］の製造方法。
［１０］ 前記遺伝子改変微生物が、クエン酸シンターゼ（GltA）活性が非改変株に比して低減されている、［７］－［９］のいずれかの製造方法。
［１１］ 前記遺伝子改変微生物が、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）活性、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）活性、および２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［７］－［１０］のいずれかの製造方法。
［１２］ 前記遺伝子改変微生物が、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）活性、メバロン酸キナーゼ（MVK）活性、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［７］－［１１］のいずれかの製造方法。
［１３］ 前記遺伝子改変微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびシュードモナス（Pseudomonas）属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［７］－［１２］のいずれかの製造方法。
前記遺伝子改変微生物が、
メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有し、
非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性と、
非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性と、
非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性と、を有する、
製造方法。
［８］ 前記有機原料が、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、トレハノース、セロビオース、スクロース、デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロールおよび／またはマンニトールを含み、好ましくはグルコースおよび／またはスクロースを含む、［７］の製造方法。
［９］ 前記遺伝子改変微生物が、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）活性、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）活性、およびイソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変体に比して増強されている、［７］または［８］の製造方法。
［１０］ 前記遺伝子改変微生物が、クエン酸シンターゼ（GltA）活性が非改変株に比して低減されている、［７］－［９］のいずれかの製造方法。
［１１］ 前記遺伝子改変微生物が、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）活性、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）活性、および２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［７］－［１０］のいずれかの製造方法。
［１２］ 前記遺伝子改変微生物が、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）活性、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）活性、メバロン酸キナーゼ（MVK）活性、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株に比して増強されている、［７］－［１１］のいずれかの製造方法。
［１３］ 前記遺伝子改変微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびシュードモナス（Pseudomonas）属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［７］－［１２］のいずれかの製造方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明により、再生可能資源であるバイオマスからイソプレンを製造するための技術が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0010】
［遺伝子改変微生物］
本開示に係る遺伝子改変微生物は以下の特徴を備える。
（１）メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有する。
（２）非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性を有する。
（３）非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性を有する。
（４）非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性を有する。
（５）イソプレン産生能を有する。
本開示に係る遺伝子改変微生物は以下の特徴を備える。
（１）メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路とメバロン酸（MVA）経路とを有する。
（２）非改変体に比較して低減されたホスホグルコースイソメラーゼ（Pgi）活性を有する。
（３）非改変体に比較して増強されたイソプレンシンターゼ（IspS）活性を有する。
（４）非改変体に比較して増強された１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）活性および／または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）活性を有する。
（５）イソプレン産生能を有する。
【0011】
本開示に係る遺伝子改変微生物は、細菌では大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌およびシュードモナス（Pseudomonas）属細菌などであってよい。
また、本開示に係る遺伝子改変微生物は、酵母ではSaccharomyces属、Candida属、Shizosaccharomyces属、Pichia属、糸状菌ではAspergillus属などであってもよい。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、上記（１）－（５）の特徴を具備する限り限定されないが、特に大腸菌を用いることが簡便であり、遺伝子改変ツールが充実しているため、好ましい。
また、本開示に係る遺伝子改変微生物は、酵母ではSaccharomyces属、Candida属、Shizosaccharomyces属、Pichia属、糸状菌ではAspergillus属などであってもよい。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、上記（１）－（５）の特徴を具備する限り限定されないが、特に大腸菌を用いることが簡便であり、遺伝子改変ツールが充実しているため、好ましい。
【0012】
遺伝子改変微生物の作製は、従来公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
目的の酵素について非改変体に比較して低減された活性を有する遺伝子改変微生物の作製は、例えば、微生物の染色体上の酵素をコードする核酸を破壊する手法、酵素をコードする核酸をより微弱なプロモーターに置換する手法、酵素をコードする核酸のプロモーターやシャインダルガーノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を発現量が低下するように改変する手法、アンチセンスＲＮＡを発現させて標的ｍＲＮＡへのリボソーム結合を阻害することにより翻訳を抑制する手法、ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅにより転写を抑制する手法、酵素をコードする核酸に変異を導入することによって酵素１分子当たりの活性を低下させる手法などによって行うことができる。
目的の酵素について非改変体に比較して増強された活性を有する遺伝子改変微生物の作製は、例えば、酵素をコードする核酸をベクターに導入し、該ベクター系で微生物を形質転換する手法、酵素をコードする核酸を含む発現カセットを微生物の染色体に導入する手法、酵素をコードする核酸をより強力なプロモーターに置換する手法、酵素をコードする核酸のプロモーターやシャインダルガーノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を発現量が増加するように改変する手法、酵素をコードする核酸に変異を導入することによって酵素１分子当たりの活性を増加させる手法などによって行うことができる。
目的の酵素について非改変体に比較して低減された活性を有する遺伝子改変微生物の作製は、例えば、微生物の染色体上の酵素をコードする核酸を破壊する手法、酵素をコードする核酸をより微弱なプロモーターに置換する手法、酵素をコードする核酸のプロモーターやシャインダルガーノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を発現量が低下するように改変する手法、アンチセンスＲＮＡを発現させて標的ｍＲＮＡへのリボソーム結合を阻害することにより翻訳を抑制する手法、ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅにより転写を抑制する手法、酵素をコードする核酸に変異を導入することによって酵素１分子当たりの活性を低下させる手法などによって行うことができる。
目的の酵素について非改変体に比較して増強された活性を有する遺伝子改変微生物の作製は、例えば、酵素をコードする核酸をベクターに導入し、該ベクター系で微生物を形質転換する手法、酵素をコードする核酸を含む発現カセットを微生物の染色体に導入する手法、酵素をコードする核酸をより強力なプロモーターに置換する手法、酵素をコードする核酸のプロモーターやシャインダルガーノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を発現量が増加するように改変する手法、酵素をコードする核酸に変異を導入することによって酵素１分子当たりの活性を増加させる手法などによって行うことができる。
【0013】
［メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路・メバロン酸（MVA）経路］
MEP経路は、イソペンテニル二リン酸（IPP）およびジメチルアリル二リン酸（DMAPP）の生合成経路である。MEP経路には、上流から順に以下の遺伝子が関与する。
１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）
１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）
２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）
４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）
２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）
１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）
１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）
イソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）
MEP経路は、イソペンテニル二リン酸（IPP）およびジメチルアリル二リン酸（DMAPP）の生合成経路である。MEP経路には、上流から順に以下の遺伝子が関与する。
１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸シンターゼ（Dxs）
１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Dxr）
２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸シチジルトランスフェラーゼ（IspD）
４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（IspE）
２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（IspF）
１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸シンターゼ（IspG）
１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル ４－二リン酸レダクターゼ（IspH）
イソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Idi）
【0014】
MVA経路は、イソペンテニル二リン酸（IPP）の生合成経路である。MVA経路には、上流から順に以下の遺伝子が関与する。
アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）
３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）
３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）
メバロン酸キナーゼ（MVK）
ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性
なお、MvaEは、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性と３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ活性の双方の活性を有する。以下、「MvaE活性」と表記した場合は、両方の酵素活性を指すこととする。
アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（MvaE）
３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（MvaS）
３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（MvaE）
メバロン酸キナーゼ（MVK）
ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）活性
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（MVD）活性
なお、MvaEは、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性と３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ活性の双方の活性を有する。以下、「MvaE活性」と表記した場合は、両方の酵素活性を指すこととする。
【0015】
本開示に係る遺伝子改変微生物において、MEP経路およびMVA経路は、遺伝子改変前に天然に備わっているものであってよく、遺伝子改変により新たに形質導入されたものであってもよい。例外は存するが、MEP経路は多くの原核生物および植物（葉緑体）が有し、MVA経路は多くの真核生物および植物（細胞質）が有する。
【0016】
［Pgi遺伝子］
本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して低減されたPgi活性を有する。
Pgiは、グルコース－６－リン酸をフルクトース－６－リン酸に変換する酵素である。
本発明において、「非改変体」とは、天然の微生物であるが、本開示に係る遺伝子改変が施されていない微生物であれば他の遺伝子改変を有する微生物であってもよいものとする。
「非改変体に比較して低減された活性」とは、単位量あたりの遺伝子改変微生物またはそれが発現する酵素によって触媒される反応の単位時間あたりの生成物の量が、非改変体またはそれが発現する酵素に比して少ないことを意味し、例えば１０％以上、２０％以上、好ましくは３０％以上、４０％以上、より好ましくは５０％以上、６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、８０％以上、最も好ましくは９０％以上、９５％以上、特に好ましくは９９％以上、９９．５％以上少ない。「非改変体に比較して低減された活性」には、遺伝子の欠失により酵素活性が０である場合も含まれる。
酵素活性の測定は、目的とする酵素と該酵素が触媒する反応の反応基質とを用いて、該反応が進行可能な条件下で当該反応を行い、反応基質からの生成する反応生成物の量を測定することによって行うことができる。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して低減されたPgi活性を有する。
Pgiは、グルコース－６－リン酸をフルクトース－６－リン酸に変換する酵素である。
本発明において、「非改変体」とは、天然の微生物であるが、本開示に係る遺伝子改変が施されていない微生物であれば他の遺伝子改変を有する微生物であってもよいものとする。
「非改変体に比較して低減された活性」とは、単位量あたりの遺伝子改変微生物またはそれが発現する酵素によって触媒される反応の単位時間あたりの生成物の量が、非改変体またはそれが発現する酵素に比して少ないことを意味し、例えば１０％以上、２０％以上、好ましくは３０％以上、４０％以上、より好ましくは５０％以上、６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、８０％以上、最も好ましくは９０％以上、９５％以上、特に好ましくは９９％以上、９９．５％以上少ない。「非改変体に比較して低減された活性」には、遺伝子の欠失により酵素活性が０である場合も含まれる。
酵素活性の測定は、目的とする酵素と該酵素が触媒する反応の反応基質とを用いて、該反応が進行可能な条件下で当該反応を行い、反応基質からの生成する反応生成物の量を測定することによって行うことができる。
【0017】
［MEP経路遺伝子］
本開示に係る遺伝子改変微生物は、MEP経路において、非改変体に比較して増強されたIspS活性と、IspH活性またはIspG活性と、を有する。より好ましくは、本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して増強されたIspS活性と、IspH活性およびIspG活性と、を有する。
「非改変体に比較して増強された活性」とは、単位量あたりの遺伝子改変微生物またはそれが発現する酵素によって触媒される反応の単位時間あたりの生成物の量が、非改変体またはそれが発現する酵素に比して多いことを意味し、例えば５０％以上、６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、より好ましくは８０％以上、９０％以上、さらに好ましくは１００％以上、１５０％以上、最も好ましくは２００％以上、３００％以上、特に好ましくは４００％以上、５００％以上多い。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、MEP経路において、非改変体に比較して増強されたIspS活性と、IspH活性またはIspG活性と、を有する。より好ましくは、本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して増強されたIspS活性と、IspH活性およびIspG活性と、を有する。
「非改変体に比較して増強された活性」とは、単位量あたりの遺伝子改変微生物またはそれが発現する酵素によって触媒される反応の単位時間あたりの生成物の量が、非改変体またはそれが発現する酵素に比して多いことを意味し、例えば５０％以上、６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、より好ましくは８０％以上、９０％以上、さらに好ましくは１００％以上、１５０％以上、最も好ましくは２００％以上、３００％以上、特に好ましくは４００％以上、５００％以上多い。
【0018】
また、本開示に係る遺伝子改変微生物は、MEP経路において、好ましくは、非改変体に比較して増強されたDxs活性、Dxr活性、および／またはIdi活性をさらに有する。より好ましくは、本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して増強されたDxs活性、Dxr活性、およびIdi活性を有する。
【0019】
本開示に係る遺伝子改変微生物は、MEP経路において、より好ましくは、非改変体に比較して増強されたIspD活性、IspE活性、および／またはIspF活性をさらに有するものとできる。
【0020】
［MVA経路遺伝子］
本開示に係る遺伝子改変微生物は、MVA経路において、非改変体に比較して増強されたMvaE活性、MvaS活性、MVK活性、PMK活性、および／またはMVD活性を有する。より好ましくは、本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して増強されたMvaE活性、MvaS活性、MVK活性、PMK活性、およびMVD活性を有する。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、MVA経路において、非改変体に比較して増強されたMvaE活性、MvaS活性、MVK活性、PMK活性、および／またはMVD活性を有する。より好ましくは、本開示に係る遺伝子改変微生物は、非改変体に比較して増強されたMvaE活性、MvaS活性、MVK活性、PMK活性、およびMVD活性を有する。
【0021】
［GltA遺伝子］
本開示に係る遺伝子改変微生物は、好ましくは、非改変体に比較して低減されたGltA活性を有する。
GltAは、アセチルCoAとオキサロ酢酸からクエン酸を合成する酵素である。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、好ましくは、非改変体に比較して低減されたGltA活性を有する。
GltAは、アセチルCoAとオキサロ酢酸からクエン酸を合成する酵素である。
【0022】
上述したMEP経路遺伝子およびMVA経路遺伝子には、微生物の種類に応じて、当該微生物由来の遺伝子を用いてもよいし、あるいは異種由来の遺伝子を用いてもよい。
例えば、IspS遺伝子には、Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔｅ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１４の５７７－２２３２番目に示す）を用いることができる。
IspH遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１８の４－９５４番目に示す）を用いることができる。
IspG遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１７の４－１１２２番目に示す）を用いることができる。
Dxs遺伝子には、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１３の３－１９２２番目に示す）を用いることができる。
Dxr遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１３の１９４７－３１４３番目に示す）を用いることができる。
Idi遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１４の４－５５２番目に示す）を用いることができる。
MvaE遺伝子には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１５の３－２４５０番目に示す）を用いることができる。
MvaS遺伝子には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１５の２４７４－３６２８番目に示す）を用いることができる。
MVK遺伝子には、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１６の４－９１５番目に示す）を用いることができる。
PMK遺伝子には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１６の９３９－２２９４番目に示す）を用いることができる。
MVD遺伝子には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１６の２３１６－３５０６番目に示す）を用いることができる。
なお、MvaE遺伝子がコードする酵素は、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性と３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ活性の双方の活性を有するが、MvaE遺伝子に替えて、それぞれの活性を単独で有する酵素をコードする遺伝子を別々に用いてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅにより大腸菌においてGltA遺伝子の転写を抑制するためのガイドＲＮＡには、ＰＡＭ配列に隣接したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子の部分配列（塩基配列を配列番２０の６３１５－６３３４番目に示す）を用いることができる。
例えば、IspS遺伝子には、Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔｅ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１４の５７７－２２３２番目に示す）を用いることができる。
IspH遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１８の４－９５４番目に示す）を用いることができる。
IspG遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１７の４－１１２２番目に示す）を用いることができる。
Dxs遺伝子には、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１３の３－１９２２番目に示す）を用いることができる。
Dxr遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番号１３の１９４７－３１４３番目に示す）を用いることができる。
Idi遺伝子には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１４の４－５５２番目に示す）を用いることができる。
MvaE遺伝子には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１５の３－２４５０番目に示す）を用いることができる。
MvaS遺伝子には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１５の２４７４－３６２８番目に示す）を用いることができる。
MVK遺伝子には、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１６の４－９１５番目に示す）を用いることができる。
PMK遺伝子には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１６の９３９－２２９４番目に示す）を用いることができる。
MVD遺伝子には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の遺伝子（塩基配列を配列番１６の２３１６－３５０６番目に示す）を用いることができる。
なお、MvaE遺伝子がコードする酵素は、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性と３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ活性の双方の活性を有するが、MvaE遺伝子に替えて、それぞれの活性を単独で有する酵素をコードする遺伝子を別々に用いてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅにより大腸菌においてGltA遺伝子の転写を抑制するためのガイドＲＮＡには、ＰＡＭ配列に隣接したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子の部分配列（塩基配列を配列番２０の６３１５－６３３４番目に示す）を用いることができる。
【0023】
各遺伝子の塩基配列は、上記の塩基配列に限定されず、塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる酵素がその活性を維持する限りにおいて上記の塩基配列に数個あるいは数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加された塩基配列であってもよい。
【0024】
［IspG反応およびIspH反応の電子伝達に関わる遺伝子］
本開示に係る遺伝子改変微生物は、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの発現量が非改変株と比較して増加するように改変されていることが好ましい。
MEP経路におけるIspGおよびIspHは鉄―硫黄クラスターを含む酵素であり、フェレドキシンまたはフラボドキシンを介して電子伝達されることでそれぞれ還元反応が進行する。したがって、当該改変により、IspG活性および／またはIspH活性を効率よく増強させることでき、イソプレンの産生量の向上が期待できる。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの発現量が非改変株と比較して増加するように改変されていることが好ましい。
MEP経路におけるIspGおよびIspHは鉄―硫黄クラスターを含む酵素であり、フェレドキシンまたはフラボドキシンを介して電子伝達されることでそれぞれ還元反応が進行する。したがって、当該改変により、IspG活性および／またはIspH活性を効率よく増強させることでき、イソプレンの産生量の向上が期待できる。
【0025】
また、本開示に係る遺伝子改変微生物は、さらに、フェレドキシン／フラボドキシン－ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変されていることが好ましい。
フェレドキシン／フラボドキシン－ＮＡＤＰ+レダクターゼは、IspGおよび／またはIspHの酵素反応の進行に伴って、還元型から酸化型となったフェレドキシンおよび／またはフラボドキシンを再び還元型に戻すことができる。当該改変により、IspG活性および／またはIspH活性を効率よく増強させることでき、イソプレンの産生量の向上が期待できる。
フェレドキシン／フラボドキシン－ＮＡＤＰ+レダクターゼは、IspGおよび／またはIspHの酵素反応の進行に伴って、還元型から酸化型となったフェレドキシンおよび／またはフラボドキシンを再び還元型に戻すことができる。当該改変により、IspG活性および／またはIspH活性を効率よく増強させることでき、イソプレンの産生量の向上が期待できる。
【0026】
［イソプレンの製造方法］
本開示に係る遺伝子改変微生物は、顕著なイソプレン産生能を有する。したがって、本開示に係る遺伝子改変微生物は、水性媒体中で有機原料と接触させることでイソプレンを製造するために利用できる。
本開示に係る遺伝子改変微生物は、顕著なイソプレン産生能を有する。したがって、本開示に係る遺伝子改変微生物は、水性媒体中で有機原料と接触させることでイソプレンを製造するために利用できる。
【0027】
本開示に係るイソプレン製造方法において、有機原料は、再生可能資源であるバイオマスとでき、特に限定されないが、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、トレハノース、セロビオース、スクロース、デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、マンニトールなどであってよい。このうちグルコースおよび／またはスクロースが好ましい。
【0028】
遺伝子改変微生物は、培養液をそのまま用いるか、または、該培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体またはその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を部分精製した無細胞抽出物、並びにこれらから酵素を抽出した粗酵素または精製酵素等が挙げられる。
【0029】
遺伝子改変微生物と有機原料と接触させる工程は、適当な水性媒体中で行えばよい。水性媒体は、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。水性媒体は、窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物等が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩等が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの微生物の生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【0030】
工程の時間や温度、ｐＨ、遺伝子改変微生物および有機原料の添加量は、特に制限されず、適宜調整され得る。
温度は、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、大腸菌を用いる場合には、通常２０－４５℃の範囲、好ましくは２５－３７℃である。酵母を用いる場合には、通常２０－４５℃の範囲、好ましくは２７－４０℃である。
時間は、通常１～１６８時間とされ、好ましくは３～１２０時間であり、より好ましくは６～７２時間である。
ｐＨ条件も、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、大腸菌を用いる場合には、通常ｐＨ４．５～９．０の範囲、好ましくはｐＨ５．５～８．０である。酵母を用いる場合には、通常ｐＨ２．５～８．５の範囲、好ましくはｐＨ３．５～７．５である。
遺伝子改変微生物の添加量は、湿菌体重量として、通常１～７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４００ｇ／Ｌである。
有機原料の使用濃度は、そこに含まれる糖質の濃度で、水性媒体に対して、通常０．１－１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．２－５％（Ｗ／Ｖ）である。また、イソプレン生産の進行に伴う有機原料の減少にあわせて、有機原料を追加で添加してもよい。
温度は、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、大腸菌を用いる場合には、通常２０－４５℃の範囲、好ましくは２５－３７℃である。酵母を用いる場合には、通常２０－４５℃の範囲、好ましくは２７－４０℃である。
時間は、通常１～１６８時間とされ、好ましくは３～１２０時間であり、より好ましくは６～７２時間である。
ｐＨ条件も、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、大腸菌を用いる場合には、通常ｐＨ４．５～９．０の範囲、好ましくはｐＨ５．５～８．０である。酵母を用いる場合には、通常ｐＨ２．５～８．５の範囲、好ましくはｐＨ３．５～７．５である。
遺伝子改変微生物の添加量は、湿菌体重量として、通常１～７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４００ｇ／Ｌである。
有機原料の使用濃度は、そこに含まれる糖質の濃度で、水性媒体に対して、通常０．１－１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．２－５％（Ｗ／Ｖ）である。また、イソプレン生産の進行に伴う有機原料の減少にあわせて、有機原料を追加で添加してもよい。
【実施例0031】
［実施例１］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0032】
（Ａ）ｌａｍｂｄａ ｒｅｄ発現プラスミドの構築
プラスミドの自律複製に必要な配列とアンピシリン耐性マーカー配列を持つＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１０１２およびｓＳＮ１０１３プライマー（配列番号１および配列番号２）を用い、ｐＨＮ１００９プラスミド（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００６）３４：ｅ１３８）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の一方の末端を制限酵素ＮｓｉＩで処理し、精製した。
一方、ドキシサイクリン誘導プロモーター配列とそのプロモーターの発現制御タンパク質の配列の配列を得るために、ｓＳＮ１１７５およびｓＳＮ１０１１プライマー（配列番号３および配列番号４）を用い、ｐＨＮ１２７１プラスミド（特開２０１４－２０９８７２）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。また、ＰＣＲに先立って、ｓＳＮ１０１１はＴ４ ＤＮＡ ｋｉｎａｓｅによりその５‘末端をリン酸化しておいた。得られたＤＮＡ断片の一方の末端を制限酵素ＰｓｔＩで処理し、精製した。
これらのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅにより連結し、プラスミドｐＨＮ１３４０を得た。ｐＨＮ１３４０は、ｐＢＲ３２２由来の自律複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、ドキシサイクリン誘導プロモーター、ドキシサイクリン誘導プロモーターの発現制御タンパク質（ＴｅｔＲ）の配列を持つ。
プラスミドの自律複製に必要な配列とアンピシリン耐性マーカー配列を持つＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１０１２およびｓＳＮ１０１３プライマー（配列番号１および配列番号２）を用い、ｐＨＮ１００９プラスミド（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００６）３４：ｅ１３８）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の一方の末端を制限酵素ＮｓｉＩで処理し、精製した。
一方、ドキシサイクリン誘導プロモーター配列とそのプロモーターの発現制御タンパク質の配列の配列を得るために、ｓＳＮ１１７５およびｓＳＮ１０１１プライマー（配列番号３および配列番号４）を用い、ｐＨＮ１２７１プラスミド（特開２０１４－２０９８７２）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。また、ＰＣＲに先立って、ｓＳＮ１０１１はＴ４ ＤＮＡ ｋｉｎａｓｅによりその５‘末端をリン酸化しておいた。得られたＤＮＡ断片の一方の末端を制限酵素ＰｓｔＩで処理し、精製した。
これらのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅにより連結し、プラスミドｐＨＮ１３４０を得た。ｐＨＮ１３４０は、ｐＢＲ３２２由来の自律複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、ドキシサイクリン誘導プロモーター、ドキシサイクリン誘導プロモーターの発現制御タンパク質（ＴｅｔＲ）の配列を持つ。
【0033】
ｌａｍｂｄａ ｒｅｄに由来するｇａｍ－ｂｅｔ－ｅｘｏ遺伝子の配列を持つＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮｒｅｄＮおよびｓＳＮ１０９９プライマー（配列番号５および配列番号６）を用い、ｐＫＤ４６プラスミド（ＣＧＳＧより入手：https://cgsc.biology.yale.edu/Site.php?ID=64672）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の末端を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで処理し、精製した。この断片を、ｐＨＮ１０９２（特開２０１３－００５７６４）の制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１１０２を得た。さらに、このｐＨＮ１１０２を制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩで切断し、精製したＤＮＡ断片（ｌａｍｂｄａ ｒｅｄに由来するｇａｍ－ｂｅｔ－ｅｘｏ遺伝子を含む）を、ｐＨＮ１３４０の制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＳｐｅＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１７５５を得た。
【0034】
一方、アラビノース誘導プロモーター配列、アラビノース誘導プロモーターの発現制御タンパク質（ＡｒａＣ）、トキシンＭａｚの配列を持つＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１５８３およびｓＳＮ１４８２プライマー（配列番号７および配列番号８）を用い、ｐＨＮ１６２９プラスミド（特開２０１３－００５７６４）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の末端を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで処理し、精製した。この断片を、ｐＨＮ１７５５の制限酵素サイトＮｈｅＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１７５７を得た。このｐＨＮ１７５７は、ｐＢＲ３２２由来の自律複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、ドキシサイクリン誘導プロモーター、ドキシサイクリン誘導プロモーターの発現制御タンパク質（ＴｅｔＲ）、ドキシサイクリン誘導プロモーターの下流にｇａｍ－ｂｅｔ－ｅｘｏ遺伝子、アラビノース誘導プロモーター配列、アラビノース誘導プロモーターの発現制御タンパク質（ＡｒａＣ）、アラビノース誘導プロモーターの下流にｍａｚＦを持つ。ｇａｍ－ｂｅｔ－ｅｘｏ遺伝子は、ｒｅｃＡ遺伝子を欠く大腸菌株に相同組み換え能を付与することができ、ｍａｚＦは、プラスミドのキュアリングに用いることができる。
【0035】
（Ｂ）ｐｇｉ破壊プラスミドの構築
ｐｇｉ遺伝子の一部とｐｇｉ遺伝子の上流配列を含むＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１５９３およびｓＳＮ１６８４プライマー（配列番号９および配列番号１０）を用い、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の末端を制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｅＩで処理し、精製した。この断片を、ｐＨＮ１２３４（特開２０１４－２０９８７２）の制限酵素サイトＰｓｔＩおよびＸｂａＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１８９２を得た。ｐｇｉ遺伝子の一部とｐｇｉ遺伝子の下流配列を含むＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１６８２Ｒ２およびｓＳＮ１６８３Ｒプライマー（配列番号１１および配列番号１２）を用い、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の末端を制限酵素ＮｓｉＩおよびＰｃｉＩで処理し、精製した。この断片を、ｐＨＮ１８９２の制限酵素サイトＮｓｉＩおよびＮｃｏＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１９２２を得た。このｐＨＮ１９２２はｓａｃＢ遺伝子、ｐＳＣ１０１由来の温度感受性自律複製起点、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐｇｉ遺伝子の一部とｐｇｉ遺伝子の上流および下流配列を持つ。
ｐｇｉ遺伝子の一部とｐｇｉ遺伝子の上流配列を含むＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１５９３およびｓＳＮ１６８４プライマー（配列番号９および配列番号１０）を用い、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の末端を制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｐｅＩで処理し、精製した。この断片を、ｐＨＮ１２３４（特開２０１４－２０９８７２）の制限酵素サイトＰｓｔＩおよびＸｂａＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１８９２を得た。ｐｇｉ遺伝子の一部とｐｇｉ遺伝子の下流配列を含むＤＮＡ断片を得るために、ｓＳＮ１６８２Ｒ２およびｓＳＮ１６８３Ｒプライマー（配列番号１１および配列番号１２）を用い、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片の末端を制限酵素ＮｓｉＩおよびＰｃｉＩで処理し、精製した。この断片を、ｐＨＮ１８９２の制限酵素サイトＮｓｉＩおよびＮｃｏＩへ挿入し、プラスミドｐＨＮ１９２２を得た。このｐＨＮ１９２２はｓａｃＢ遺伝子、ｐＳＣ１０１由来の温度感受性自律複製起点、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐｇｉ遺伝子の一部とｐｇｉ遺伝子の上流および下流配列を持つ。
【0036】
（Ｃ）ｐｇｉ破壊株の作製
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株のｐｇｉ遺伝子の破壊は、文献（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４ １５：２７７３－２７９３）に記載の方法に従って行った。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株を実施例１（Ａ）および（Ｂ）にて構築したプラスミドｐＨＮ１７５７およびｐＨＮ１９２２で形質転換し、相同組み換えに必要なｇａｍ－ｂｅｔ－ｅｘｏ遺伝子を発現させるために、ＬＢ培地には２０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン塩酸塩を常に加えて遺伝子破壊の操作を行った。また、遺伝子破壊完了後、ｐＨＮ１７５７のキュアリングのために、０．０２％濃度のＬ－アラビノースを含んだＬＢ培地で３７度にて培養した。得られたｐｇｉ遺伝子破壊株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉとした。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株のｐｇｉ遺伝子の破壊は、文献（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４ １５：２７７３－２７９３）に記載の方法に従って行った。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株を実施例１（Ａ）および（Ｂ）にて構築したプラスミドｐＨＮ１７５７およびｐＨＮ１９２２で形質転換し、相同組み換えに必要なｇａｍ－ｂｅｔ－ｅｘｏ遺伝子を発現させるために、ＬＢ培地には２０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン塩酸塩を常に加えて遺伝子破壊の操作を行った。また、遺伝子破壊完了後、ｐＨＮ１７５７のキュアリングのために、０．０２％濃度のＬ－アラビノースを含んだＬＢ培地で３７度にて培養した。得られたｐｇｉ遺伝子破壊株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉとした。
【0037】
（Ｄ）ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｄｉ、ｉｓｐＳ増強プラスミドの構築
リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）由来ｄｘｓ遺伝子、およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｄｘｒ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＢｓｐＨＩ、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１３）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒと名付けた。
リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）由来ｄｘｓ遺伝子、およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｄｘｒ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＢｓｐＨＩ、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１３）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒと名付けた。
【0038】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｄｉ遺伝子、およびムクナ（Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔｅ）由来ｉｓｐＳ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１４）。ｉｓｐＳ遺伝子は、葉緑体移行シグナルを切断し、大腸菌で効率的に発現させるためにコドンの最適化を行い、さらに、４８１番目のリジンをグルタミン酸に変異させた配列を設計した。合成したＤＮＡは、上記にて構築したｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒの制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳと名付けた。
【0039】
（Ｅ）ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ増強プラスミドの構築
エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来ｍｖａＥ遺伝子、およびｍｖａＳ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１５）。ｍｖａＥ遺伝子、およびｍｖａＳ遺伝子は、大腸菌で効率的に発現させるためにコドンを最適化した配列を設計した。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳと名付けた。
エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来ｍｖａＥ遺伝子、およびｍｖａＳ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１５）。ｍｖａＥ遺伝子、およびｍｖａＳ遺伝子は、大腸菌で効率的に発現させるためにコドンを最適化した配列を設計した。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳと名付けた。
【0040】
メタノコッコイド・ブルトニィ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）由来ＭＶＫ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来ＰＭＫ遺伝子、およびＭＶＤ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１６）。ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子、およびＭＶＤ遺伝子は、大腸菌で効率的に発現させるためにコドンを最適化した配列を設計した。合成したＤＮＡは、上記にて構築したｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳの制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤと名付けた。
【0041】
（Ｆ）ｉｓｐＧ増強プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｓｐＧ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１７）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧと名付けた。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｓｐＧ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１７）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧと名付けた。
【0042】
（Ｇ）ｐｇｉ破壊、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＧ、ｉｄｉ、ｉｓｐＳ、ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ増強株の作製
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧとした。
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧとした。
【0043】
【表1】
【0044】
［実施例２］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0045】
（Ａ）ｉｓｐＨ増強プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｓｐＨ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１８）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨと名付けた。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｓｐＨ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１８）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨと名付けた。
【0046】
（Ｂ）ｐｇｉ破壊、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＳ、ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ増強株の作製
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および実施例２（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨとした。
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および実施例２（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨとした。
【0047】
［実施例３］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0048】
（Ａ）ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ増強プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｓｐＧ遺伝子、およびｉｓｐＨ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１９）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨと名付けた。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｉｓｐＧ遺伝子、およびｉｓｐＨ遺伝子を、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付与して合成した（配列番号１９）。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素サイトＮｄｅＩおよびＸｈｏＩへ挿入し、Ｔ７プロモーター下流に連結した。構築したプラスミドはｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨと名付けた。
【0049】
（Ｂ）ｐｇｉ破壊、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＳ、ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ増強株の作製
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および実施例３（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨとした。
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および実施例３（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨとした。
【0050】
［実施例４］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強、ＧｌｔＡ遺伝子の発現低減を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強、ＧｌｔＡ遺伝子の発現低減を行った（表１参照）。
【0051】
（Ａ）ＧｌｔＡ低減プラスミドの構築
ラムノース誘導プロモーターに連結させたストレプトコッカス・パイオジェン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９遺伝子、および構成的プロモーターＪ２３１１９に連結させたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｇｌｔＡ遺伝子を標的としたガイドＲＮＡ配列を、５’末端側に制限酵素ＰｓｔＩ
、３’末端側に制限酵素ＳｐｅＩの認識配列を付与して合成した（配列番号２０）。なお
、Ｃａｓ９遺伝子は、ヌクレアーゼ活性を消失させるために、１０番目のアスパラギン酸をアラニン、８４０番目のヒスチジンをアラニンに変異させた配列（ｄＣａｓ９）を設計した。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＲＫ２（配列番号２１）の制限酵素サイトＰｓｔＩおよびＳｐｅＩへ挿入した。構築したプラスミドはｐＲＫ２＿Ｐrha－ｄＣ
ａｓ９＿ＰJ23119－ｇＲＮＡ－ｇｌｔＡと名付けた。
ラムノース誘導プロモーターに連結させたストレプトコッカス・パイオジェン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９遺伝子、および構成的プロモーターＪ２３１１９に連結させたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ｇｌｔＡ遺伝子を標的としたガイドＲＮＡ配列を、５’末端側に制限酵素ＰｓｔＩ
、３’末端側に制限酵素ＳｐｅＩの認識配列を付与して合成した（配列番号２０）。なお
、Ｃａｓ９遺伝子は、ヌクレアーゼ活性を消失させるために、１０番目のアスパラギン酸をアラニン、８４０番目のヒスチジンをアラニンに変異させた配列（ｄＣａｓ９）を設計した。合成したＤＮＡは、大腸菌用発現ベクターｐＲＫ２（配列番号２１）の制限酵素サイトＰｓｔＩおよびＳｐｅＩへ挿入した。構築したプラスミドはｐＲＫ２＿Ｐrha－ｄＣ
ａｓ９＿ＰJ23119－ｇＲＮＡ－ｇｌｔＡと名付けた。
【0052】
（Ｂ）ｐｇｉ破壊、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＳ、ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ増強、ＧｌｔＡ低減株の作製
実施例３（Ｂ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨ株を、実施例４（Ａ）にて構築したプラスミドｐＲＫ２＿Ｐrha－ｄＣａｓ９＿ＰJ23119－ｇＲＮＡ－ｇｌｔＡで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨ／ｐＲＫ２＿Ｐrha－ｄＣａｓ９＿ＰJ23119－ｇＲＮＡ－ｇｌｔＡとした。
実施例３（Ｂ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨ株を、実施例４（Ａ）にて構築したプラスミドｐＲＫ２＿Ｐrha－ｄＣａｓ９＿ＰJ23119－ｇＲＮＡ－ｇｌｔＡで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨ／ｐＲＫ２＿Ｐrha－ｄＣａｓ９＿ＰJ23119－ｇＲＮＡ－ｇｌｔＡとした。
【0053】
［比較例１］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0054】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を実施例１（Ｄ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳとした。
【0055】
［比較例２］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0056】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を実施例１（Ｄ）、および（Ｆ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧとした。
【0057】
［比較例３］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0058】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を実施例１（Ｄ）、および実施例２（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨとした。
【0059】
［比較例４］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0060】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を実施例１（Ｄ）、および実施例３（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨとした。
【0061】
［比較例５］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0062】
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳとした。
【0063】
［比較例６］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0064】
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、および（Ｆ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧとした。
【0065】
［比較例７］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0066】
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、および実施例２（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＨとした。
【0067】
［比較例８］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0068】
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、および実施例３（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨとした。
【0069】
［比較例９］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0070】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および実施例３（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤとした。
【0071】
［比較例１０］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0072】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を実施例１（Ｄ）、（Ｅ）、および実施例３（Ａ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ、およびｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤ／ｐＣＤＦ＿ＰT7－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨとした。
【0073】
［比較例１１］
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株について、ｐｇｉ遺伝子の破壊、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、ＭＶＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の発現増強を行った（表１参照）。
【0074】
実施例１（Ｃ）にて作製したＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ株を実施例１（Ｄ）、および（Ｅ）にて構築したプラスミドｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ、およびｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤで形質転換し、得られた株をＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／Δｐｇｉ／ｐＣＯＬＡ＿ＰT7－ｄｘｓ－ｄｘｒ＿ＰT7－ｉｄｉ－ｉｓｐＳ／ｐＡＣＹＣ＿ＰT7－ｍｖａＥ－ｍｖａＳ＿ＰT7－ＭＶＫ－ＰＭＫ－ＭＶＤとした。
【0075】
［試験例］
実施例１－３および比較例１－１１にて作製した遺伝子改変株について、イソプレン生産評価を行った。
実施例１－３および比較例１－１１にて作製した遺伝子改変株について、イソプレン生産評価を行った。
【0076】
各遺伝子改変株を５０μｇ／ｍＬ カナマイシン、３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、および５０μｇ／ｍＬ アプラマイシン（抗生物質は使用する菌株によって適切な組み合わせを選択する）を含むＬＢ培地（１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ－ｔｒｙｐｔｏｎ、１０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）にて一晩培養した。５０ｍＬフラスコに０．５％グルコース、５０μｇ／ｍＬ カナマイシン、３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、および５０μｇ／ｍＬ アプラマイシン（ｄＣａｓ９遺伝子の発現を誘導する菌株を使用する場合はさらに１ｍＭ Ｌ－ラムノース）を含むＭ９＋ＹＥ培地（６ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ4Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ チアミン塩酸塩、８．３ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）を１０ｍＬ添加し、上記ＬＢ培地での培養液を１／４０希釈となるよう植菌、１８０ｒｐｍ、３０℃で１６時間振とう培養を行った。５０ｍＬフラスコに０．５％グルコース、５０μｇ／ｍＬ カナマイシン、３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、および０．５ｍＭ ＩＰＴＧを含むＭ９＋ＹＥ培地を２０ｍＬ添加し、上記Ｍ９＋ＹＥ培地での培養液をＯＤ600＝０．６となるよう植菌、１８０ｒｐｍ、３０℃で４時間振とう培養を行った。
【0077】
得られた培養液を３０００×ｇ、５分の遠心分離により集菌し、０．５％グルコース、５０μｇ／ｍＬ カナマイシン、３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬ スペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬ アプラマイシン、および０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（ｄＣａｓ９遺伝子の発現を誘導する菌株を使用する場合はさらに１ｍＭ Ｌ－ラムノース）を含むＭ９培地（６ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ4Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ チアミン塩酸塩、８．３ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）にＯＤ600＝１２となるように懸濁した。２０ｍＬヘッドスペースバイアル（島津ジーエルシー）に菌体懸濁液を１ｍＬ添加し、ブチルゴムセプタム付きキャップ（島津ジーエルシー）にて密栓後、１８０ｒｐｍ、３０℃で１９時間振とう培養を行った。培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をＧＣ－ＭＳ（島津製作所：ＧＣＭＳ－ＴＱ８０４０ＮＸ）により測定した。また、培養液中の残存グルコース濃度をグルコースアナライザー（王子計測機器：ＢＦ－５）により測定した。イソプレン生成量、残存グルコース濃度、およびイソプレンの対消費糖収率を表２に示す。
【0078】
なお、ＧＣ－ＭＳ（島津製作所：ＧＣＭＳ－ＴＱ８０４０ＮＸ）におけるイソプレン濃度の測定は、以下に示した分析条件にて行った。
ガスクロマトグラフィー部においてジーエルサイエンス社製カラムＴＣ－７０（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ）を用い、キャリアガスにはヘリウムを用いた。ガスクロマトグラフィー質量分析器の設定は、試料気化室温度２２０℃、カラムオーブン温度８０℃一定、スプリットレス注入、圧力１００ ｋＰａ、線速度４４．５ ｃｍ／秒一定制御、質量分析部インターフェース温度８０℃、イオン源温度２００℃、Ｓｃａｎ測定モード、測定質量範囲（ｍ／ｚ）６０から７０、分析時間３分とした。１．１７５から１．１８０分程度に出現するイソプレンのピークで定量した。イソプレン標準液として、和光純薬工業社製の和光一級イソプレンを用い、適量をＭ９培地に混合したものをガスクロマトグラフィー質量分析器に供することで検量線を作成した。
ガスクロマトグラフィー部においてジーエルサイエンス社製カラムＴＣ－７０（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ）を用い、キャリアガスにはヘリウムを用いた。ガスクロマトグラフィー質量分析器の設定は、試料気化室温度２２０℃、カラムオーブン温度８０℃一定、スプリットレス注入、圧力１００ ｋＰａ、線速度４４．５ ｃｍ／秒一定制御、質量分析部インターフェース温度８０℃、イオン源温度２００℃、Ｓｃａｎ測定モード、測定質量範囲（ｍ／ｚ）６０から７０、分析時間３分とした。１．１７５から１．１８０分程度に出現するイソプレンのピークで定量した。イソプレン標準液として、和光純薬工業社製の和光一級イソプレンを用い、適量をＭ９培地に混合したものをガスクロマトグラフィー質量分析器に供することで検量線を作成した。
【0079】
【表2】
【0080】
ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子を発現増強した遺伝子改変株（比較例１）のイソプレン産生量は２６．４ｍｇ／Ｌであった。さらにｉｓｐＧ遺伝子の発現増強を行った場合（比較例２）、ｉｓｐＨ遺伝子の発現増強を行った場合（比較例３）、およびｉｓｐＧ遺伝子とｉｓｐＨ遺伝子の両者の発現増強を行った場合（比較例４）、イソプレン産生量はそれぞれ１．４ｍｇ／Ｌ、１．７ｍｇ／Ｌ、１．６ｍｇ／Ｌであり、比較例１に対して増加せず、逆に減少した。
この結果は、ｄｘｓ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子およびｉｓｐＳ遺伝子を過剰発現させた大腸菌において、ｉｓｐＧ遺伝子とｉｓｐＨ遺伝子とを過剰発現させてもイソプレン生産量は増加しないことを報告した非特許文献１にも合致するものである。
この結果は、ｄｘｓ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子およびｉｓｐＳ遺伝子を過剰発現させた大腸菌において、ｉｓｐＧ遺伝子とｉｓｐＨ遺伝子とを過剰発現させてもイソプレン生産量は増加しないことを報告した非特許文献１にも合致するものである。
【0081】
ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強（比較例１参照）に加えて、ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＧ遺伝子および／またはｉｓｐＨ遺伝子の発現増強、ならびにＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例１－３）ではイソプレン生産量の顕著な増加がみられた。
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＧ遺伝子の発現増強およびＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例１）のイソプレン産生量は８７．４ｍｇ／Ｌであった。
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＨ遺伝子の発現増強およびＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例２）のイソプレン産生量は１８５．６ｍｇ／Ｌであった。
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＧ遺伝子およびｉｓｐＨ遺伝子の発現増強、ならびにＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例３）のイソプレン産生量は２１１．７ｍｇ／Ｌであった。
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＧ遺伝子の発現増強およびＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例１）のイソプレン産生量は８７．４ｍｇ／Ｌであった。
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＨ遺伝子の発現増強およびＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例２）のイソプレン産生量は１８５．６ｍｇ／Ｌであった。
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｉｓｐＧ遺伝子およびｉｓｐＨ遺伝子の発現増強、ならびにＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った遺伝子改変株（実施例３）のイソプレン産生量は２１１．７ｍｇ／Ｌであった。
【0082】
ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強（比較例１参照）に加えて、ＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行わずにｐｇｉ遺伝子の破壊のみを行った場合には、イソプレン産生量はほとんど増加しなかった（比較例５）。さらに、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強に加えて、ＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行わずにｐｇｉ遺伝子の破壊のみを行った場合（比較例５参照）において、ｉｓｐＧ遺伝子および／またはｉｓｐＨ遺伝子の発現増強を行うと、イソプレン産生量は逆に減少した（比較例６－８）。
また、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強（比較例１参照）に加えて、ｐｇｉ遺伝子の破壊を行わずにＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った場合にも、イソプレン産生量は比較的軽度にとどまった（比較例９，１０）。
さらに、上述のとおり、比較例１－４ではｉｓｐＧ遺伝子および／またはｉｓｐＨ遺伝子の発現増強によるイソプレン生産の向上はみられなかった。
これら比較例１－１０の結果から、実施例１－３でみられた顕著なイソプレン産生量の増加は、ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強と、ｉｓｐＧ遺伝子および／またはｉｓｐＨ遺伝子の発現増強と、が相乗的に機能してもたらされた効果であるといえ、全く予想外のものであった。
また、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子の発現増強（比較例１参照）に加えて、ｐｇｉ遺伝子の破壊を行わずにＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強を行った場合にも、イソプレン産生量は比較的軽度にとどまった（比較例９，１０）。
さらに、上述のとおり、比較例１－４ではｉｓｐＧ遺伝子および／またはｉｓｐＨ遺伝子の発現増強によるイソプレン生産の向上はみられなかった。
これら比較例１－１０の結果から、実施例１－３でみられた顕著なイソプレン産生量の増加は、ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強と、ｉｓｐＧ遺伝子および／またはｉｓｐＨ遺伝子の発現増強と、が相乗的に機能してもたらされた効果であるといえ、全く予想外のものであった。
【0083】
比較例２、３、および４のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例１の０．０５２倍、０．０６４倍、０．０６０倍と大幅に低下した。
以上の結果より、ＭＶＡ経路を導入せず、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合、ＩｓｐＧやＩｓｐＨ増強を行ってもイソプレン対消費糖収率は低下することが明らかとなった。
比較例６、７、および８のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例５の０．０５３倍、０．０８２倍、０．０７６倍と大幅に低下した。
以上の結果より、Ｐｇｉ破壊株において、ＭＶＡ経路を導入せず、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合においても、上記と同様の傾向となり、ＩｓｐＧやＩｓｐＨ増強を行ってもイソプレン対消費糖収率は大幅に低下することが明らかとなった。
さらに、比較例１０のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例９の１．０３倍とほぼ同等であった。
以上の結果より、ＭＶＡ経路を導入し、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合、ＩｓｐＧ、およびＩｓｐＨ増強を行ってもイソプレン対消費糖収率はほとんど変化しないことが明らかとなった。
しかし、実施例１、２、および３のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例１１の１．５倍、２．３倍、２．４倍と大幅に向上した。
以上の結果より、Ｐｇｉ破壊株において、ＭＶＡ経路を導入し、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合は、ＩｓｐＧやＩｓｐＨ増強を行うことでイソプレン対消費糖収率が大幅に向上することが明らかとなった。
以上の結果より、ＭＶＡ経路を導入せず、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合、ＩｓｐＧやＩｓｐＨ増強を行ってもイソプレン対消費糖収率は低下することが明らかとなった。
比較例６、７、および８のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例５の０．０５３倍、０．０８２倍、０．０７６倍と大幅に低下した。
以上の結果より、Ｐｇｉ破壊株において、ＭＶＡ経路を導入せず、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合においても、上記と同様の傾向となり、ＩｓｐＧやＩｓｐＨ増強を行ってもイソプレン対消費糖収率は大幅に低下することが明らかとなった。
さらに、比較例１０のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例９の１．０３倍とほぼ同等であった。
以上の結果より、ＭＶＡ経路を導入し、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合、ＩｓｐＧ、およびＩｓｐＨ増強を行ってもイソプレン対消費糖収率はほとんど変化しないことが明らかとなった。
しかし、実施例１、２、および３のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例１１の１．５倍、２．３倍、２．４倍と大幅に向上した。
以上の結果より、Ｐｇｉ破壊株において、ＭＶＡ経路を導入し、Ｄｘｓ、およびＤｘｒ増強を行い、ＭＥＰ経路にてイソプレンを生産した場合は、ＩｓｐＧやＩｓｐＨ増強を行うことでイソプレン対消費糖収率が大幅に向上することが明らかとなった。
【0084】
ｐｇｉ遺伝子の破壊と、ｄｘｓ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＳ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子およびｉｓｐＨ遺伝子の発現増強、ならびにＭＶＡ経路の遺伝子の発現増強（実施例３参照）に加えて、ｇｌｔＡ遺伝子の発現低減を行った遺伝子改変株（実施例４）ではイソプレン生産量のさらなる増加がみられ、イソプレン産生量は４８１．８ｍｇ／Ｌであった。実施例４のイソプレン対消費糖収率はそれぞれ比較例１１の３．８倍と大幅に向上した。
【配列表フリーテキスト】
【0085】
配列番号１：ｓＳＮ１０１２プライマーの塩基配列
配列番号２：ｓＳＮ１０１３プライマーの塩基配列
配列番号３：ｓＳＮ１１７５プライマーの塩基配列
配列番号４：ｓＳＮ１０１１プライマーの塩基配列
配列番号５：ｓＳＮｒｅｄＮプライマーの塩基配列
配列番号６：ｓＳＮ１０９９プライマーの塩基配列
配列番号７：ｓＳＮ１５８３プライマーの塩基配列
配列番号８：ｓＳＮ１４８２プライマーの塩基配列
配列番号９：ｓＳＮ１５９３プライマーの塩基配列
配列番号１０：ｓＳＮ１６８４プライマーの塩基配列
配列番号１１：ｓＳＮ１６８２Ｒ２プライマーの塩基配列
配列番号１２：ｓＳＮ１６８３Ｒプライマーの塩基配列
配列番号１３：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来ｄｘｓ遺伝子およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｄｘｒ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＢｓｐＨＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含む）
配列番号１４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｄｉ遺伝子およびＭｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔｅ由来ｉｓｐＳ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を含む）
配列番号１５：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来ｍｖａＥ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含む）
配列番号１６：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ由来ＭＶＫ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を含む）
配列番号１７：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｓｐＧ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含む）
配列番号１８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｓｐＨ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含む）
配列番号１９：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｓｐＧ遺伝子およびｉｓｐＨ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含む）
配列番号２０：ラムノース誘導プロモーターに連結させたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９遺伝子、および構成的プロモーターＪ２３１１９に連結させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｇｌｔＡ遺伝子を標的としたガイドＲＮＡの塩基配列（５’末端側に制限酵素ＰｓｔＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＳｐｅＩの認識配列を含む）
配列番号２１：大腸菌用発現ベクターｐＲＫ２の配列
配列番号２：ｓＳＮ１０１３プライマーの塩基配列
配列番号３：ｓＳＮ１１７５プライマーの塩基配列
配列番号４：ｓＳＮ１０１１プライマーの塩基配列
配列番号５：ｓＳＮｒｅｄＮプライマーの塩基配列
配列番号６：ｓＳＮ１０９９プライマーの塩基配列
配列番号７：ｓＳＮ１５８３プライマーの塩基配列
配列番号８：ｓＳＮ１４８２プライマーの塩基配列
配列番号９：ｓＳＮ１５９３プライマーの塩基配列
配列番号１０：ｓＳＮ１６８４プライマーの塩基配列
配列番号１１：ｓＳＮ１６８２Ｒ２プライマーの塩基配列
配列番号１２：ｓＳＮ１６８３Ｒプライマーの塩基配列
配列番号１３：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来ｄｘｓ遺伝子およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｄｘｒ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＢｓｐＨＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含む）
配列番号１４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｄｉ遺伝子およびＭｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔｅ由来ｉｓｐＳ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を含む）
配列番号１５：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来ｍｖａＥ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含む）
配列番号１６：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ由来ＭＶＫ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ遺伝子およびＭＶＤ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列を含む）
配列番号１７：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｓｐＧ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含む）
配列番号１８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｓｐＨ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含む）
配列番号１９：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｉｓｐＧ遺伝子およびｉｓｐＨ遺伝子の塩基配列（５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含む）
配列番号２０：ラムノース誘導プロモーターに連結させたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９遺伝子、および構成的プロモーターＪ２３１１９に連結させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｇｌｔＡ遺伝子を標的としたガイドＲＮＡの塩基配列（５’末端側に制限酵素ＰｓｔＩの認識配列、３’末端側に制限酵素ＳｐｅＩの認識配列を含む）
配列番号２１：大腸菌用発現ベクターｐＲＫ２の配列
【配列表】