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特開2023-131616ＤＮＡ編集システム、並びに、それを用いた標的ＤＮＡの編集方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023131616
(43)【公開日】2023-09-22
(54)【発明の名称】ＤＮＡ編集システム、並びに、それを用いた標的ＤＮＡの編集方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230914BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230914BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230914BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230914BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230914BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230914BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230914BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230914BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230914BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/09 100
C12N5/10 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z
C12N15/55
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022036476
(22)【出願日】2022-03-09
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(71)【出願人】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 哲史
(72)【発明者】
【氏名】山本 卓
(72)【発明者】
【氏名】西堀 奈穂子
(72)【発明者】
【氏名】吉間 忠彦
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01Y
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】 特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法を提供すること。
【解決手段】 標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
【請求項2】
標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
【請求項3】
前記融合タンパク質がさらに、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記融合タンパク質におけるＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのＤＮＡ編集システムであり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を含む、ＤＮＡ編集システム。
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を含む、ＤＮＡ編集システム。
【請求項9】
前記融合タンパク質がさらに、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、請求項８に記載のＤＮＡ編集システム。
【請求項10】
前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、請求項８又は９に記載のＤＮＡ編集システム。
【請求項11】
前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載のＤＮＡ編集システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＤＮＡ編集システム、並びに、それを用いた標的ＤＮＡの編集方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法に関し、より詳しくは、標的ＤＮＡを編集する方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いる組み合わせに関する。
【背景技術】
【0002】
細菌及び古細菌は、ウイルスや外来プラスミド等に対する免疫機構としてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを有している。細菌及び古細菌におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細胞内に侵入した外来核酸の配列に対して相補的なＲＮＡ分子をガイドとしてＣａｓタンパク質を誘導し、Ｃａｓタンパク質による当該外来核酸の切断によってその分解を促す機構である。現在、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス１及びクラス２の２つのクラスに分類されており、また、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、及びタイプＶＩの６つのタイプにも分類されている。クラス２には、タイプＩＩシステム、タイプＶシステム、及びタイプＶＩシステムが含まれ、これらは、ガイドＲＮＡと１つのＣａｓタンパク質とで複合体を形成して核酸を切断する。クラス１には、タイプＩシステム、タイプＩＩＩシステム、及びタイプＩＶシステムが含まれ、これらは、ガイドＲＮＡと複数のＣａｓタンパク質とで複合体（カスケード複合体）を形成し、核酸を切断する。
【0003】
近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとして、タイプＩＩシステムやタイプＶシステムを利用したゲノム編集技術が多く開発されており、特に、タイプＩＩシステムであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを利用した技術が盛んに開発されている。例えば、ヌクレアーゼ活性の全て又は一部が喪失したＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９とデアミナーゼ等の核酸塩基変換酵素とを組み合わせた塩基編集方法は、２０１６年に最初の報告（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）（非特許文献１））がなされて以降、その編集効率の高さとドナ－ＤＮＡを必要としない簡便さとから、急速に利用が広まり、さまざまな生物や細胞での実施例が報告されると共に、改良システムも多数開発されている（Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １９，７７０－７８８（２０１８）（非特許文献２）等）。
【0004】
例えば、塩基ＣからＴへの塩基編集（Ｃ→Ｔ（Ｇ→Ａ））においては、ラットのＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を利用したシステム（上記初出論文でのＢＥ３から、現在ではＡｎｃＢＥ４ｍａｘと呼ばれるシステムへと改良が進められている；Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８）(非特許文献３））と、ヤツメウナギのＣＤＡ１（ＰｍＣＤＡ１）を利用したシステム（Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ８７２９（２０１６）（非特許文献４））と、がよく用いられており、その他にＡＰＯＢＥＣ３ＡやＡＰＯＢＥＣ３Ｂ等が利用可能であることも報告されている（Ｇｅｈｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，９７７－９８２（２０１８）（非特許文献５）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，４９７（２０１９）（非特許文献６））。
【0005】
また、例えば、塩基ＡからＧへの塩基編集（Ａ→Ｇ（Ｔ→Ｃ））システムとして、大腸菌に由来するＴａｄＡタンパク質をエンジニアリングして構築したＡｄｅｎｉｎｅ Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（ＡＢＥ）システムも報告されている（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）（非特許文献７））。さらに、例えば、デアミナーゼをＮ末ドメインとＣ末ドメインとに分割（ｓｐｌｉｔ）し、ＺＦとｎＣａｓ９とにそれぞれ融合させることで、ＺＦ及びｎＣａｓ９の両者の標的配列が近傍に存在するときに初めて塩基編集が施されるようなシステムも報告されている（国際公開第２０１８／２１８１６６号（特許文献１））。
【0006】
一方、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのうち、タイプＩシステムについては、近年の様々な細菌類の全ゲノム配列の解析から、複数のサブタイプに分類されており、現在では、大きく分けてサブタイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、及びＩ－Ｇ（Ｉ－Ｕ）の７つに分類されている（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８，６７－８３（２０２０）（非特許文献８）等）。
【0007】
タイプＩシステムを利用した技術としては、例えば、サブタイプＩ－Ｂ及びＩ－Ｅのシステム（Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３７，１４９３－１５０１（２０１９）（非特許文献９））や、サブタイプＩ－Ｆのシステム（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１，３１３６（２０２０）（特許文献１０））を用いて標的遺伝子の転写活性を制御する方法等が報告されている。しかしながら、タイプＩシステムについては、未だ十分に解明や研究が進んでいない。また、タイプＩシステムでは、何種類ものタンパク質を発現させなくてはならない煩雑さ等から、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによるゲノム編集ツールとしての開発は遅れがちであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１８／２１８１６６号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）
【非特許文献2】Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １９，７７０－７８８（２０１８）
【非特許文献3】Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８）
【非特許文献4】Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ８７２９（２０１６）
【非特許文献5】Ｇｅｈｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，９７７－９８２（２０１８）
【非特許文献6】Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，４９７（２０１９）
【非特許文献7】Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）
【非特許文献8】Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８，６７－８３（２０２０）
【非特許文献9】Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３７，１４９３－１５０１（２０１９）
【非特許文献10】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１，３１３６（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集技術では、塩基編集における編集可能領域（ウインドウ）が狭く、通常、数塩基から十塩基程度の塩基の編集しか導入できないため、遺伝子内の広域編集の誘導等には不向きであった。また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムではガイドＲＮＡの標的配列が短い（通常、好ましくは２０塩基程度）ことから、特異性が十分ではないという課題や、このシステムのみに依存すると、ＰＡＭ配列が限られるために標的配列が限定されてしまうという課題も有していた。そのため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムに依存しない、従来技術よりも標的特異性が高いゲノム編集技術の開発が求められている。
【0011】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのうち、タイプＩシステムを利用して標的ＤＮＡを特異的かつ効率的に編集可能なゲノム編集技術の開発を試みた。タイプＩシステム（本明細書中、「タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」ともいう）はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとＰＡＭ配列が異なるため、標的配列の制約が異なり、また、ウインドウのサイズが大きいため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムでは標的とすることが困難な部位の塩基編集が可能となる。
【0013】
本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、核酸塩基変換酵素をｓｐｌｉｔ化することなくＴＡＬＥ等のＤＮＡ結合ドメインに融合しつつ、かかるＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素融合タンパク質（例えば、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ融合タンパク質）と、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと、の両者を標的ＤＮＡの標的部位の近傍に結合させるシステムを開発した。核酸塩基変換酵素をｓｐｌｉｔ化しない構造は、デアミナーゼの場合には、例えば既報の高活性システムであるＡｎｃＢＥ４ｍａｘに準拠しているが、これをＣａｓタンパク質に直接連結するのではなく、ＤＮＡ結合ドメインに連結させていることにより、ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素融合タンパク質のみが標的ＤＮＡに結合しても、基質となる一本鎖ＤＮＡが露出していないために塩基編集は起こらない。また、上記のタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、Ｃａｓタンパク質群によるヌクレアーゼ活性を有さないため、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群＋ガイドＲＮＡ）のみが標的ＤＮＡに結合しても、前記核酸塩基変換酵素が存在しないために、やはり塩基編集は起こらない。本発明者らは、上記のＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素融合タンパク質とタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとの組み合わせにおいて、標的ＤＮＡ上のＤＮＡ結合ドメイン認識配列（又はその相補配列）～標的部位間のスペーサー１、及び標的ＤＮＡ上のＲＮＡ標的配列の相補配列の位置の検討により、従来のＡｎｃＢＥ４ｍａｘシステムに近い塩基編集効率を達成できることを見出した。
【0014】
したがって、本発明者らは、かかるＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素融合タンパク質とタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとの組み合わせによれば、これら両者が、標的部位を中心として、特定の距離を置いて標的ＤＮＡにそれぞれ結合したときに初めて塩基編集が起こり、高い特異性が担保されること、及び前記核酸塩基変換酵素をＤＮＡ結合ドメインに結合させたことにより高い編集効率を実現できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
かかる知見により提供される本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
［２］
標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
［３］
前記融合タンパク質がさらに、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記融合タンパク質におけるＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである、［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［６］
前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［７］
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［６］に記載の方法。
［８］
［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのＤＮＡ編集システムであり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を含む、ＤＮＡ編集システム。
［９］
前記融合タンパク質がさらに、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、［８］に記載のＤＮＡ編集システム。
［１０］
前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、［８］又は［９］に記載のＤＮＡ編集システム。
［１１］
前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、［８］～［１０］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［１１］に記載のＤＮＡ編集システム。
［１］
標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
［２］
標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
［３］
前記融合タンパク質がさらに、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記融合タンパク質におけるＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである、［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［６］
前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［７］
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［６］に記載の方法。
［８］
［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのＤＮＡ編集システムであり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を含む、ＤＮＡ編集システム。
［９］
前記融合タンパク質がさらに、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、［８］に記載のＤＮＡ編集システム。
［１０］
前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、［８］又は［９］に記載のＤＮＡ編集システム。
［１１］
前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、［８］～［１０］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［１１］に記載のＤＮＡ編集システム。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1A】標的ＤＮＡの編集方法の第１の態様（ａ）及び第２の態様（ｂ）における融合タンパク質、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＰＡＭ配列、及び標的ＤＮＡの関係を示す概念図である。
【図1B】標的ＤＮＡの編集方法の第３の態様（ａ）及び第４の態様（ｂ）における融合タンパク質、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＰＡＭ配列、及び標的ＤＮＡの関係を示す概念図である。
【図2】レポータープラスミドにおけるＴＡＬＥ－デアミナーゼによる塩基編集の態様例を示す模式図である。図２の（ａ）は、挿入配列がＴＡＬＥ認識配列（１１）の相補配列を含む場合を示し、図２の（ｂ）は、挿入配列がＴＡＬＥ認識配列（１１）を含む場合を示す。
【図3】ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造の態様例を示す概念図である。図３の（ａ）は、実施例で用いたＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズの構造を示し、図３の（ｂ）は、実施例で用いたＢＥ４－ＴＡＬＥシリーズの構造を示し、図３の（ｃ）は、実施例で用いたＡＢＥ８ｅシリーズの構造を示す。
【図4】試験１の（１）で得られたＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を示すグラフである（（ａ）：ＴｙｐｅＩ－Ｆ、（ｂ）：ＴｙｐｅＩ－Ｂ）。
【図5】試験１の（２）で得られたＢＥ４－ＴＡＬＥシリーズの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を示すグラフである（（ａ）：ＴｙｐｅＩ－Ｆ、（ｂ）：ＴｙｐｅＩ－Ｂ）。
【図6A】内因性ＤＮＡのＣＣＲ５遺伝子上のターゲットサイトであるＡＳ１４サイトにおけるＰＡＭ配列、ｇＲＮＡ－ＩＦ－１の標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）、ＴＡＬＥ認識配列（ｂ、ｃ）又はＴＡＬＥ認識配列の相補配列（ａ）の位置、並びに、これに対応するファミリー遺伝子ＣＣＲ２とのアラインメントをまとめて示す概念図である。
【図6B】内因性ＤＮＡのＣＣＲ５遺伝子上のターゲットサイトであるＡＳ１４サイトにおけるＰＡＭ配列、ｇＲＮＡ－ＩＦ－２の標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－２）、ＴＡＬＥ認識配列（ｂ）又はＴＡＬＥ認識配列の相補配列（ａ）の位置、並びに、これに対応するファミリー遺伝子ＣＣＲ２とのアラインメントをまとめて示す概念図である。
【図7】内因性ＤＮＡのＨＢＢ遺伝子上のターゲットサイトであるＳ１サイト及びＳ２サイトにおけるＰＡＭ配列、ｇＲＮＡ－ＩＦ－７、ＩＢ－１、ＩＢ－２の標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－７、ＩＢ－１、ＩＢ－２）、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列の位置、並びに、これに対応するファミリー遺伝子ＨＢＤとのアラインメントをまとめて示す概念図である。
【図8】内因性ＤＮＡのＡＰＣ遺伝子上のターゲットサイトであるＡＰＣサイトにおけるＰＡＭ配列、ｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２、ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃの標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２、ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃ）、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列の位置を示す概念図である。
【図9A】ＡＳ１４サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ１４－２とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）範囲内の各ＣにおけるＴの割合、並びに、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ５としたＢＥ４－３２－４７及びＢＥ４－１３５－６３について、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【図9B】ＡＳ１４サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ５としたＡＢＥ８ｅ－１３５－４７について、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）範囲内の各ＡにおけるＧの割合を示すグラフである。
【図9C】ＡＳ１４サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ１４－２とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－２）範囲内の各ＣにおけるＴの割合、並びに、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ１４－３としたＢＥ４－３２－４７及びＢＥ４－１３５－６３について、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－２）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【図10】Ｓ２サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ２とした４７－１０４－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－７とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－７）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【図11A】ＡＰＣサイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＰＣ－Ｒ１７とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【図11B】ＡＰＣサイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＰＣ－Ｒ１７とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃとし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【図12】Ｓ１サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ１とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとして、ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドに加えて、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１発現プラスミド又はＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－１）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフ（ａ）、並びに、Ｓ２サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ２とした４７－１０４－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとして、ＴｙｐｅＩ－Ｂ複合体のＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドに加えて、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１発現プラスミド又はＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－２）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフ（ｂ）である。
【図13】Ｓ１サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ１とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－１）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【図14】Ｓ２サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ２とした４７－１０４－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとして、ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドに加えて、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドを用いたときの、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－２）範囲内の各ＣにおけるＴの割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0019】
＜標的ＤＮＡ編集方法＞
本発明の標的ＤＮＡ編集方法は、
標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法である。
本発明の標的ＤＮＡ編集方法は、
標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を標的ＤＮＡに接触させ、前記核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法である。
【0020】
（融合タンパク質）
本発明に係る融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質である。本明細書においては、前記本発明に係る融合タンパク質を、場合により、「ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素融合タンパク質」又は「ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素」という。前記融合タンパク質としては、Ｎ末から、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸塩基変換酵素の順に結合されていても、Ｎ末から、核酸塩基変換酵素、ＤＮＡ結合ドメインの順に結合されていてもよい。また、本発明に係る融合タンパク質としては、２以上（例えば２つ）の核酸塩基変換酵素を含んでいてもよく、この場合の核酸塩基変換酵素としては、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。例えば、本発明に係る融合タンパク質が２つの核酸塩基変換酵素（第１の核酸塩基変換酵素、第２の核酸塩基変換酵素）を含む場合、これらは、第１の核酸塩基変換酵素、ＤＮＡ結合ドメイン、第２の核酸塩基変換酵素の順に結合されていてもよい。これらの中でも、本発明に係る融合タンパク質としては、Ｎ末から、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸塩基変換酵素の順に結合されているか、Ｎ末から、核酸塩基変換酵素、ＤＮＡ結合ドメインの順に結合されていることが好ましい。
本発明に係る融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質である。本明細書においては、前記本発明に係る融合タンパク質を、場合により、「ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素融合タンパク質」又は「ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素」という。前記融合タンパク質としては、Ｎ末から、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸塩基変換酵素の順に結合されていても、Ｎ末から、核酸塩基変換酵素、ＤＮＡ結合ドメインの順に結合されていてもよい。また、本発明に係る融合タンパク質としては、２以上（例えば２つ）の核酸塩基変換酵素を含んでいてもよく、この場合の核酸塩基変換酵素としては、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。例えば、本発明に係る融合タンパク質が２つの核酸塩基変換酵素（第１の核酸塩基変換酵素、第２の核酸塩基変換酵素）を含む場合、これらは、第１の核酸塩基変換酵素、ＤＮＡ結合ドメイン、第２の核酸塩基変換酵素の順に結合されていてもよい。これらの中でも、本発明に係る融合タンパク質としては、Ｎ末から、ＤＮＡ結合ドメイン、核酸塩基変換酵素の順に結合されているか、Ｎ末から、核酸塩基変換酵素、ＤＮＡ結合ドメインの順に結合されていることが好ましい。
【0021】
前記ＤＮＡ結合ドメインとしては、例えば、ＴＡＬＥ、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）、ＰＰＲタンパク質（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられ、ＴＡＬＥ及びジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）からなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、ＴＡＬＥがより好ましい。
【0022】
〔ＴＡＬＥ〕
ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：転写活性化因子様エフェクター）は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種プロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を活性化するタンパク質である。本発明に係る「ＴＡＬＥ」は、少なくとも、Ｎ末ドメイン及びＴＡＬＥリピートドメインを含み、Ｃ末ドメインをさらに含んでいてもよい。
ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：転写活性化因子様エフェクター）は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種プロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を活性化するタンパク質である。本発明に係る「ＴＡＬＥ」は、少なくとも、Ｎ末ドメイン及びＴＡＬＥリピートドメインを含み、Ｃ末ドメインをさらに含んでいてもよい。
【0023】
ＴＡＬＥリピートドメインは、右巻き超らせん（ｓｕｐｅｒｈｅｌｉｃａｌ）を形成するＴＡＬＥ配列の、複数、例えば１０～３０、好ましくは１３～２５、より好ましくは１５～２０のタンデムリピート（ＴＡＬＥリピート）で構成される。典型的なＴＡＬＥリピート１単位（１つのＴＡＬＥ配列）は、３３～３５アミノ酸からなり、その１２番目と１３番目の２アミノ酸残基からなる可変残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）によって、ＤＮＡの特定の塩基を認識する。塩基を特異的に認識するＲＶＤの例としては、Ｃを認識するＨＤ、Ｔを認識するＮＧ、Ａを認識するＮＩ、Ｇ又はＡを認識するＮＮ、及びＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを認識するＮＳ等が挙げられる。かかるＴＡＬＥリピートドメインのＤＮＡ認識機構に基づき、特定の塩基を認識するＴＡＬＥ配列を人工的に連結することにより、ＤＮＡ上の所望の塩基配列（ＴＡＬＥ認識配列）を認識して結合できるＴＡＬＥを作成することができる。
【0024】
本発明に係るＴＡＬＥの前記ＴＡＬＥ配列は、それぞれ、ＴＡＬＥリピートドメインがＴＡＬＥ認識配列を認識して結合できるものである限り、天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、前記ＴＡＬＥ配列においては、それぞれ独立に、ＲＶＤの位置が変更されていても、ＲＶＤ以外のアミノ酸残基が１個又は複数個（例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）置換、挿入、及び／又は欠失していてもよく、また、ＲＶＤの１２番目と１３番目の２アミノ酸残基は、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧに対する特異性を増強するために他のアミノ酸残基に置換されてもよい。
【0025】
また、本発明に係るＴＡＬＥのＴＡＬＥリピートドメインは、標的ＤＮＡの標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在する塩基配列又はその相補配列を認識するように、すなわち、ＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列が、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在する塩基配列となるように、設計される。このような所望のＴＡＬＥを設計、作製する技術は公知であり（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，１４３－１４８（２０１１）；Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ３，３３７９（２０１３））、例えば、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅシステムによって、前記塩基配列に対する高い結合活性を有するＴＡＬＥを作製することができる。
【0026】
本発明に係るＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明に係る融合タンパク質の機能（ＴＡＬＥ認識配列への結合能、標的部位における編集能等）に負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失していてもよい。また、精製や検出のためのフラグタグ、ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素を細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を含んでいてもよい。
【0027】
このようなＮ末ドメインとしては、Ｎ末ドメインの鎖長が、４９～２８７アミノ酸残基であることが好ましく、８０～２００アミノ酸残基であることがより好ましく、１２０～１８０アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記Ｎ末ドメインの鎖長が前記下限未満であると、標的ＤＮＡに結合できなくなる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
【0028】
本発明に係るＴＡＬＥのＮ末ドメインの具体例としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０６９９）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列や、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0029】
本発明に係るＴＡＬＥがＣ末ドメインをさらに含む場合、かかるＴＡＬＥのＣ末ドメインとしても、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明に係る融合タンパク質の機能（ＴＡＬＥ認識配列への結合能、標的部位における編集能等）に負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失していてもよい。
【0030】
本発明に係るＴＡＬＥがＣ末ドメインをさらに含む場合、前記ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列においてＣ末側の一部のアミノ酸配列が除去されたものであってもよい。このようなＣ末ドメインとしては、Ｃ末ドメインの鎖長が、１～１８０アミノ酸残基であることが好ましく、２０～１００アミノ酸残基であることがより好ましく、４０～７０アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記Ｃ末ドメインの鎖長が前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
【0031】
前記Ｃ末ドメインの具体例としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（ＷＴ：アミノ酸数＝１８０）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８９～３２１９２）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸数＝６３）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸数＝４７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0032】
〔ジンクフィンガーアレイ〕
本発明に係るジンクフィンガーアレイは、ＤＮＡ結合領域及びヌクレアーゼドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のうちのＤＮＡ結合領域を示す。ジンクフィンガーアレイは、通常、２～１５、好ましくは３～８、より好ましくは４～６のジンクフィンガータンパク質からなり、各ジンクフィンガータンパク質間は直接、又はリンカーを介して結合される。各ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上の亜鉛と特定の塩基を認識するヘリックス構造とを含み、１つのジンクフィンガーでＤＮＡの特定の３塩基を認識する。
本発明に係るジンクフィンガーアレイは、ＤＮＡ結合領域及びヌクレアーゼドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のうちのＤＮＡ結合領域を示す。ジンクフィンガーアレイは、通常、２～１５、好ましくは３～８、より好ましくは４～６のジンクフィンガータンパク質からなり、各ジンクフィンガータンパク質間は直接、又はリンカーを介して結合される。各ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上の亜鉛と特定の塩基を認識するヘリックス構造とを含み、１つのジンクフィンガーでＤＮＡの特定の３塩基を認識する。
【0033】
本発明に係るジンクフィンガーアレイは、それぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列を認識して結合できるものである限り、特に制限されず、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失していてもよい。また、本発明に係るジンクフィンガーアレイは、標的ＤＮＡの標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在する塩基配列又はその相補配列を認識するように、すなわち、ジンクフィンガーアレイが認識するジンクフィンガーアレイ認識配列又はその相補配列が、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在する塩基配列となるように、設計される。このようなジンクフィンガーアレイは、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０，１３５－１４１（２００２）、Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７－６９（２０１１）等に記載の方法を参照して適宜設計、作製することができる。
【0034】
〔核酸塩基変換酵素〕
本発明において、核酸塩基変換酵素とは、ＤＮＡ塩基のプリン又はピリミジン環上の置換基を他の基若しくは原子に変換、又は脱落させる反応を触媒することにより、ＤＮＡ鎖を切断することなく、標的の塩基を他の塩基に変換又は脱落させ得る酵素を意味する。
本発明において、核酸塩基変換酵素とは、ＤＮＡ塩基のプリン又はピリミジン環上の置換基を他の基若しくは原子に変換、又は脱落させる反応を触媒することにより、ＤＮＡ鎖を切断することなく、標的の塩基を他の塩基に変換又は脱落させ得る酵素を意味する。
【0035】
このような核酸塩基変換酵素としては、上記の反応を触媒し得るものであれば特に制限はなく、例えば、デアミナーゼ、グリコシラーゼが挙げられ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、本発明に係る核酸塩基変換酵素としては、デアミナーゼが好ましい。
【0036】
（デアミナーゼ）
前記デアミナーゼは、塩基のアミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒する酵素であり、核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーに属する。このようなデアミナーゼとしては、シトシン又は５－メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼが挙げられ、目的の塩基置換に応じて、使い分けることができる。
前記デアミナーゼは、塩基のアミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒する酵素であり、核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーに属する。このようなデアミナーゼとしては、シトシン又は５－メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼが挙げられ、目的の塩基置換に応じて、使い分けることができる。
【0037】
前記デアミナーゼの由来としては特に制限されず、例えば、ヤツメウナギ；ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。
【0038】
このようなデアミナーゼとして、シチジンデアミナーゼとしては、例えば、ＡＰＯＢＥＣ（ラット由来のｒＡＰＯＢＥＣ１、ヒト由来のｈＡＰＯＢＥＣ１、ｈＡＰＯＢＥＣ２、ｈＡＰＯＢＥＣ３（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ（３Ｅ）、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ）、ｈＡＰＯＢＥＣ４等）；ＡＰＯＢＥＣの祖先アミノ酸配列であるＡｎｃ６８９；哺乳動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＣＤＡ））；ＡＩＤのファミリーであり、ヤツメウナギ由来のＰｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ １）が挙げられる。また、アデノシンデアミナーゼとしては、例えば、大腸菌由来のＴａｄＡが挙げられる。上記の各デアミナーゼには、それぞれ、その改変体（例えば、ＴａｄＡ－８ｅ、ＴａｄＡ７．１０、さらにこれらの改変体等）を含む。これらの中でも、前記デアミナーゼとしては、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡ（それぞれ、その改変体を含む）からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0039】
また、本発明に係る融合タンパク質がデアミナーゼを２以上含む場合、これらの組み合わせは、目的の塩基置換に応じて適宜選択することができ、例えば、同一又は異なるシチジンデアミナーゼの組み合わせ、同一又は異なるアデノシンデアミナーゼの組み合わせ、同一又は異なるグアノシンデアミナーゼの組み合わせ、シチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとの組み合わせ、シチジンデアミナーゼとグアノシンデアミナーゼとの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼとグアノシンデアミナーゼとの組み合わせが挙げられる。これらの中でも、デアミナーゼの組み合わせとしては、ＴａｄＡとＰｍＣＤＡ１との組み合わせが好ましい。なお、これらのデアミナーゼの塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得することができる。
【0040】
また、前記デアミナーゼとしては、脱アミノ化活性（デアミナーゼ活性）を有する限り、これらの公知のデアミナーゼの塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて、改変（例えば、アミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失の導入）がされたものであってもよい。デアミナーゼ活性の有無は、公知の方法を適宜用いて確認することができる。例えば、シチジンデアミナーゼでは、シチジンを基質として酵素反応を行い、シチジンの代謝産物であるウリジンを検出、定量することにより確認することができる。
【0041】
〔リンカー１〕
本発明に係る融合タンパク質としては、リンカー１をさらに含むことが好ましい。この場合、本発明に係る融合タンパク質において、ＤＮＡ結合ドメイン及び前記核酸塩基変換酵素は、リンカー１により連結される。また、本発明に係る融合タンパク質が前記核酸塩基変換酵素を複数含む場合には、それに対応してリンカー１は複数であることが好ましい。本発明に係る融合タンパク質がリンカー１を複数含む場合、これらは、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
本発明に係る融合タンパク質としては、リンカー１をさらに含むことが好ましい。この場合、本発明に係る融合タンパク質において、ＤＮＡ結合ドメイン及び前記核酸塩基変換酵素は、リンカー１により連結される。また、本発明に係る融合タンパク質が前記核酸塩基変換酵素を複数含む場合には、それに対応してリンカー１は複数であることが好ましい。本発明に係る融合タンパク質がリンカー１を複数含む場合、これらは、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
【0042】
本発明に係る融合タンパク質がリンカー１をさらに含む場合、リンカー１の鎖長としては、特に制限されないが、１～４５０アミノ酸残基であることが好ましく、５～２５０アミノ酸残基であることがより好ましく、５～２００アミノ酸残基であることがより好ましく、１２～１５０アミノ酸残基であることがより好ましく、１２～１０４アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記リンカー１の鎖長が前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
【0043】
また、リンカー１の鎖長としては、例えば、前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼであって、Ａｎｃ６８９である場合には、５～２５０アミノ酸残基であることが好ましく、５～１５０アミノ酸残基であることがより好ましく、ＰｍＣＤＡ１である場合には、１２～１０４アミノ酸残基であることが好ましく、１２～５０アミノ酸残基であることがより好ましく、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ－８ｅ等）である場合には、５～２５０アミノ酸残基であることが好ましく、５～１５０アミノ酸残基であることがより好ましい傾向にある。
【0044】
本発明に係るリンカー１としては、例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７ １３３３０（２０１６）に記載の１２アミノ酸、及びＮｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ８７２９（２０１６）に記載の１０４アミノ酸、Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８）に記載の３２アミノ酸、Ｓｕｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，Ｍｏｌ ＢｉｏＳｙｓｔ １０，４４６－４５３（２０１４）に記載のＨＴＳ９５アミノ酸配列（９５アミノ酸）及びその繰り返しが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0045】
また、本発明の融合タンパク質としては、例えば、前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥの場合、前記核酸塩基変換酵素がＴＡＬＥのＣ末側に位置する場合には、ＴＡＬＥリピートドメインと前記核酸塩基変換酵素との間が、１～６３０アミノ酸残基離れていることが好ましい。そのため、本発明の融合タンパク質としては、前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥの場合、前記ＴＡＬＥのＣ末ドメイン及びリンカー１のうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。この場合のＴＡＬＥリピートドメインと前記核酸塩基変換酵素との間の鎖長（ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末端のＣ末側に隣接するアミノ酸残基を１残基目として、核酸塩基変換酵素のＮ末端のＮ末側に隣接する残基までのアミノ酸残基の数）としては、２５～３００アミノ酸残基であることがより好ましく、５２～１７４アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記鎖長が前記下限未満であると、塩基編集の効率が低下する傾向にあり、他方、前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
【0046】
なお、このときの前記ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末端の残基は、前記ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末側に位置するｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｌａｓｔ ｈａｌｆ－ｒｅｐｅａｔ（ＬＨＲ）の直前（Ｎ末側）に位置するＴＡＬＥ配列（好ましくは１単位：３３～３５アミノ酸）のＣ末端の残基（ＬＨＲが存在しない場合には前記ＴＡＬＥリピートドメインを構成する最後のＴＡＬＥ配列（好ましくは１単位：３３～３５アミノ酸）のＣ末端の残基）とすることができる。また、前記核酸塩基変換酵素のＮ末端の残基は、公知のデータベース（例えば、ＮＣＢＩ）から取得可能な典型的な核酸塩基変換酵素のアミノ酸配列と公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いた相同性検索で同一性が８５％以上（好ましくは９０％以上）であるアミノ酸配列の開始残基（通常はメチオニン）とすることができる。
【0047】
〔塩基除去修復インヒビター、リンカー２〕
本発明に係る融合タンパク質としては、さらにＣ末側、すなわち、前記核酸塩基変換酵素のＣ末（前記核酸塩基変換酵素が前記ＤＮＡ結合ドメインのＣ末側に位置する場合）又は前記ＤＮＡ結合ドメインのＣ末（前記核酸塩基変換酵素が前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末側のみに位置する場合）に、リンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含むことが好ましい。塩基除去修復インヒビターをさらに含む場合、当該塩基除去修復インヒビターは、前記融合タンパク質あたり、１つであっても、さらにリンカー２を介して２以上（好ましくは２つ）であってもよい。また、複数である場合には、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、１種であることが好ましい。
本発明に係る融合タンパク質としては、さらにＣ末側、すなわち、前記核酸塩基変換酵素のＣ末（前記核酸塩基変換酵素が前記ＤＮＡ結合ドメインのＣ末側に位置する場合）又は前記ＤＮＡ結合ドメインのＣ末（前記核酸塩基変換酵素が前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末側のみに位置する場合）に、リンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含むことが好ましい。塩基除去修復インヒビターをさらに含む場合、当該塩基除去修復インヒビターは、前記融合タンパク質あたり、１つであっても、さらにリンカー２を介して２以上（好ましくは２つ）であってもよい。また、複数である場合には、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、１種であることが好ましい。
【0048】
本発明に係る塩基除去修復インヒビターとしては、塩基除去修復を阻害するものであれば特に制限はないが、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤が好ましい。前記ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤としては、チミンＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、アルキルグアニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤が挙げられる。例えば、前記核酸塩基変換酵素としてデアミナーゼであるシチジンデアミナーゼを用いる場合には、変異により生じたＤＮＡのＵ：Ｇ又はＧ：Ｕミスマッチの修復を阻害するため、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を用いることが適している。この場合、デアミナーゼとＵＧＩとが一つのポリペプチド上に存在することにより、塩基編集の効率がさらに向上する。
【0049】
このようなウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージであるＰＢＳ１由来のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）又は枯草菌バクテリオファージであるＰＢＳ２由来のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）が挙げられるが、これらに制限されない。これらの塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得することができる。また、本発明に係る塩基除去修復インヒビターとしては、上記ＤＮＡのミスマッチの修復阻害活性を有する限り、公知の塩基除去修復インヒビターの塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて、改変（例えば、アミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失の導入）がされたものであってもよい。
【0050】
本発明に係る融合タンパク質が前記塩基除去修復インヒビターをさらに含む場合であって、前記塩基除去修復インヒビターが複数である場合には、融合タンパク質－リンカー２－第１の塩基除去修復インヒビター－リンカー２－第２の塩基除去修復インヒビター－・・・のように、リンカー２を介して連結することができる。このときの複数あるリンカー２としては、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、１種であることが好ましい。
【0051】
このようなリンカー２としては、特に制限されないが、鎖長が１～５０アミノ酸残基であることが好ましく、５～３０アミノ酸残基であることがより好ましく、８～１５アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記リンカー２の鎖長が前記下限未満であると、前記塩基除去修復インヒビターの機能性が低下する傾向にあり、他方、前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
【0052】
本発明に係るリンカー２としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＣＭＶ＿ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿Ｐ２Ａ＿ＧＦＰ（ＩＤ：１１２１００）に記載の１０アミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0053】
〔その他〕
本発明に係る融合タンパク質としては、さらに、Ｎ末及び／又はＣ末に、精製や検出のためのフラグタグ、ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素を細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を含んでいてもよく、これらは、上記のように前記ＤＮＡ結合ドメイン（例えばＴＡＬＥのＮ末ドメイン）に含まれていても、融合タンパク質のＮ末及び／又はＣ末に付加されていてもよい。
本発明に係る融合タンパク質としては、さらに、Ｎ末及び／又はＣ末に、精製や検出のためのフラグタグ、ＤＮＡ結合ドメイン－核酸塩基変換酵素を細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を含んでいてもよく、これらは、上記のように前記ＤＮＡ結合ドメイン（例えばＴＡＬＥのＮ末ドメイン）に含まれていても、融合タンパク質のＮ末及び／又はＣ末に付加されていてもよい。
【0054】
本発明に係る融合タンパク質は、例えば、上記のＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素、並びに、必要に応じてリンカー１、前記塩基除去修復インヒビター、リンカー２、及びその他アミノ酸をコードする遺伝子を一体として転写・発現させることで得ることができる。また、本発明に係る融合タンパク質は、従来公知の方法を適宜採用、改良することによって生産することができ、例えば、そのアミノ酸配列に基づいて市販の合成機によって化学的に合成する方法や、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法において述べるように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は該融合タンパク質を発現するベクターを前記細胞に導入して発現させる方法によって得ることができる。
【0055】
（タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
本発明に係るタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失した（ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を初めから有さない場合も含む。本明細書中、同様。）タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含む。
本発明に係るタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失した（ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を初めから有さない場合も含む。本明細書中、同様。）タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含む。
【0056】
〔タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群〕
本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのうち、タイプＩに分類されるシステム（タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）に係る複数のＣａｓタンパク質を示し、下記のガイドＲＮＡと共に複合体を形成する。本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群としては、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質のうち、少なくともガイドＲＮＡと複合体を形成し、一本鎖ＤＮＡを露出させるヘリカ－ゼ活性を有するエフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質を含んでいればよい。タイプＩシステムは、Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、及びＩ－Ｇ（Ｉ－Ｕ）の７つのサブタイプに分類され、これらのサブタイプにはバリアントも含む（例えば、Ｉ－ＦのＩ－Ｆｖ１型、Ｉ－Ｆｖ２型）。
本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのうち、タイプＩに分類されるシステム（タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）に係る複数のＣａｓタンパク質を示し、下記のガイドＲＮＡと共に複合体を形成する。本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群としては、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質のうち、少なくともガイドＲＮＡと複合体を形成し、一本鎖ＤＮＡを露出させるヘリカ－ゼ活性を有するエフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質を含んでいればよい。タイプＩシステムは、Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、及びＩ－Ｇ（Ｉ－Ｕ）の７つのサブタイプに分類され、これらのサブタイプにはバリアントも含む（例えば、Ｉ－ＦのＩ－Ｆｖ１型、Ｉ－Ｆｖ２型）。
【0057】
サブタイプＩ－ＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８（Ｃａｓ８ａ１という場合もある）、Ｃａｓ１１（Ｃｓｅ５という場合もある）が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、及びＣａｓ１１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0058】
サブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８（Ｃａｓ８ｂ２という場合もある）、Ｃａｓ１１が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0059】
サブタイプＩ－ＣのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８（Ｃａｓ８ｃという場合もある）、Ｃａｓ１１が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0060】
サブタイプＩ－ＤのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ１０（Ｃａｓ１０ｄという場合もある）、Ｃａｓ１１が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ１０が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0061】
サブタイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８（Ｃａｓ８ｅという場合もある）、Ｃａｓ１１が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、及びＣａｓ１１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0062】
サブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５（Ｃｓｙ２という場合もある）、Ｃａｓ６（Ｃｓｙ４、Ｃａｓ６ｆという場合もある）、Ｃａｓ７（Ｃｓｙ３という場合もある）、Ｃａｓ８（Ｃｓｙ１、Ｃａｓ８ｆという場合もある）が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0063】
サブタイプＩ－Ｇ（Ｉ－Ｕ）のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８（Ｃａｓ８ｕ２という場合もある）が挙げられ、このうち、前記エフェクター複合体を構成するＣａｓタンパク質の一例としては、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0064】
本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群は、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのサブタイプに応じて、各Ｃａｓタンパク質を複数含んでいてよい。例えば、サブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムやサブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群としては、本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群として、図１Ａ～図１Ｂに示すように、１つのＣａｓ５（Ｃｓｙ２ともいう）（図中の３１）と、１つのＣａｓ６（Ｃｓｙ４ともいう）（図中の３２）と、６つのＣａｓ７（Ｃｓｙ３ともいう）（図中の３３）と、１つのＣａｓ８（Ｃｓｙ１ともいう）（図中の３４）と、からなるタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（図中の３０）とすることができる。この場合、ＰＡＭ配列は、典型的に、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（３０）の一末端に位置するＣａｓ８（３４）／Ｃａｓ５（３１）複合体によって認識される。タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（３０）の一末端に位置する大きなサブユニットＣａｓ８（３４）はガイドＲＮＡ（４０）の５’末端を包み（図１Ａ～図１Ｂでは説明の都合上突出している）、複数のＣａｓ７（３３）がガイドＲＮＡ骨格と相互作用する。Ｃａｓ６（３２）は、主にガイドＲＮＡの３’末端の繰り返し配列（少なくとも１つのヘアピン構造を含む）との会合を介して、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群に会合する。
【0065】
本発明に係る各タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群としては、Ｃａｓ３等のヌクレアーゼとして機能するタンパク質を含んでいてもよいが、ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を有さないことが必要であるため、含まないことが好ましく、含む場合には、かかるタンパク質のヌクレアーゼ活性の一部又は全部が喪失するように改変されていることが必要である。
【0066】
また、本発明に係る各タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群としては、Ｃａｓ８をコードする遺伝子から翻訳されるＣａｓ８以外のサブユニット（以下、場合により「ＳＳＵ２」という）をさらに含んでいることが好ましい。ＳＳＵ２は、典型的には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のサブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓ８（Ｃａｓ８ｂ２）の遺伝子から翻訳される、１２．１ｋＤのタンパク質である。ＳＳＵ２の典型的アミノ酸配列に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を付加した配列を配列番号１５１に示し、同アミノ酸配列をコードする好ましい塩基配列（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の塩基配列をヒト細胞に対してコドン最適化等したもの）を配列番号１５０に示す。本発明においては、ＳＳＵ２をタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（例えば、サブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群）と共存させると、ゲノム編集効率がより向上する傾向にある。
【0067】
現在の技術水準においては、当業者であれば、タンパク質のアミノ酸配列情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、コードするタンパク質の機能は維持したままで、さらにその機能を向上させたり他の機能を付したタンパク質を調製することも可能である。したがって、ＳＳＵ２のアミノ酸配列としては、「配列番号１５１で示されるアミノ酸配列（ただしＮＬＳは含んでいなくてもよい）において、１又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子」や、「配列番号１５１で示されるアミノ酸配列（ただしＮＬＳは含んでいなくてもよい）と９０％以上（好ましくは、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上））の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」であってもよい。前記アミノ酸配列の相同性及び同一性は、例えば、前記ＢＬＡＳＴのプログラムを用いて決定することができる。
【0068】
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を構成するＣａｓタンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は、公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：ＷＰ＿００３１１６９１０．１、ＷＰ＿００１１９４０１２．１、ＷＰ＿０１１１７６７０７．１（Ｃａｓ５）、ＷＰ＿０００８７２４７６．１、ＫＪ７９６４８５（Ｃａｓ６）、ＷＰ＿００３１３９２２２．１、ＷＰ＿０００７７５４８８．１、ＷＰ＿０１１１７６７０９．１（Ｃａｓ７）、ＷＰ＿００３１３９２２４．１、ＷＰ＿０１１１７６７０８．１（Ｃａｓ８）等）、本発明においてはこれらを利用することができる。また、各Ｃａｓタンパク質には、本発明の効果を阻害しない範囲内で、上記の他に例えば、ＰＡＭ配列の認識を改変するため等の改変が適宜導入されていてもよい。例えば、公知のアミノ酸配列から、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失していてもよい。さらに、各Ｃａｓタンパク質としては、例えば、細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を付加したものであってもよい。また、このようなＣａｓタンパク質としては、市販の入手可能なプラスミド内に含まれる配列にコードされるものであってもよい。
【0069】
本発明に係る各タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群が構成するタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのサブタイプとしては、サブタイプＩ－Ｂ、サブタイプＩ－Ｄ、サブタイプＩ－Ｅ、及びサブタイプＩ－Ｆからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、サブタイプＩ－Ｂ、サブタイプＩ－Ｅ、及びサブタイプＩ－Ｆからなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、サブタイプＩ－Ｂ及びサブタイプＩ－Ｆからなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましい。
【0070】
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群については、ガイドＲＮＡ標的配列が、下記の標的ＤＮＡの標的部位の相補塩基を含むように、下記のガイドＲＮＡが設計される。なお、本発明において、標的ＤＮＡの標的部位の相補塩基とは、前記標的部位が存在する鎖の相補鎖上の、前記標的部位１塩基の相補塩基を示す。これにより、二本鎖である標的ＤＮＡにおいて、一本鎖ＤＮＡを露出させるヘリカ－ゼ活性により標的部位を特異的に露出させ、前記核酸塩基変換酵素による編集効率を向上させる。
【0071】
〔ガイドＲＮＡ〕
本発明に係るタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、ガイドＲＮＡは、標的となるＤＮＡ上の配列（ガイドＲＮＡ標的配列）に相補的な塩基配列を含むＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）ともいう）である。前記ガイドＲＮＡは、少なくとも１つのヘアピン構造を形成可能な繰り返し塩基配列（１単位がそれぞれ約１０～７０塩基、好ましくは３０～５０塩基）を３’側に含むため、かかるヘアピン構造（二重鎖ＲＮＡ）により、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成する１又は複数のＣａｓタンパク質（典型的にはＣａｓ６）と相互作用する。このため、前記ガイドＲＮＡは、下記の標的ＤＮＡ上のガイドＲＮＡ標的配列を認識して結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を当該標的ＤＮＡに誘導して、誘導されたタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群が、そのヘリカ－ゼ活性によって、当該標的ＤＮＡの標的部位において一本鎖ＤＮＡを露出する。
本発明に係るタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、ガイドＲＮＡは、標的となるＤＮＡ上の配列（ガイドＲＮＡ標的配列）に相補的な塩基配列を含むＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）ともいう）である。前記ガイドＲＮＡは、少なくとも１つのヘアピン構造を形成可能な繰り返し塩基配列（１単位がそれぞれ約１０～７０塩基、好ましくは３０～５０塩基）を３’側に含むため、かかるヘアピン構造（二重鎖ＲＮＡ）により、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成する１又は複数のＣａｓタンパク質（典型的にはＣａｓ６）と相互作用する。このため、前記ガイドＲＮＡは、下記の標的ＤＮＡ上のガイドＲＮＡ標的配列を認識して結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を当該標的ＤＮＡに誘導して、誘導されたタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群が、そのヘリカ－ゼ活性によって、当該標的ＤＮＡの標的部位において一本鎖ＤＮＡを露出する。
【0072】
下記の標的ＤＮＡにおいて、標的部位の塩基の編集は、前記ガイドＲＮＡの塩基配列とガイドＲＮＡ標的配列との間の塩基対形成の相補性と、ガイドＲＮＡ標的配列の相補鎖の５’側に存在するＰＡＭ配列と、の両方によって決定される位置で起きる。本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群のガイドＲＮＡは、そのガイドＲＮＡ標的配列が、前記標的部位の相補塩基を含む配列となり、当該標的部位を含むガイドＲＮＡ標的配列の相補鎖の５’側のＰＡＭ配列をタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を構成するＣａｓタンパク質（例えば、図１Ａ及び図１ＢではＣａｓ８タンパク質（３４））が認識可能となるように設計される。これにより、二本鎖である標的ＤＮＡにおいて、一本鎖ＤＮＡを露出させるヘリカ－ゼ活性により標的部位を特異的に露出させ、前記核酸塩基変換酵素による編集効率を向上させる。
【0073】
このようなＣａｓタンパク質のＰＡＭ配列及びガイドＲＮＡ標的配列は、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に応じて、適宜設計することができる。
【0074】
本発明に係るタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、例えば、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法において述べるように、上記のタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群、及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子をそれぞれ同時に転写・発現させることで得ることができる。本発明に係るタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を構成するＣａｓタンパク質、及びガイドＲＮＡは、それぞれ、従来公知の方法を適宜採用、改良することによって生産することができ、例えば、これらをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを前記細胞に導入して発現させる方法によって得ることができる。
【0075】
（標的ＤＮＡ）
本発明においては、目的とするＤＮＡ編集の対象となる標的部位を含むＤＮＡを「標的ＤＮＡ」という。本発明に係る標的ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡであり、上記の融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとの対応を示すために、便宜的に、少なくとも一方の鎖が、５’側から順に、ＰＡＭ配列、前記標的部位、スペーサー１、前記ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列を含む構造であるか（図１Ａの第１の態様及び第２の態様）、少なくとも一方の鎖が、５’側から順に、前記ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列、ＰＡＭ配列及びスペーサー１、前記標的部位、を含む構造である（図１Ｂの第３の態様及び第４の態様）ものとする。
本発明においては、目的とするＤＮＡ編集の対象となる標的部位を含むＤＮＡを「標的ＤＮＡ」という。本発明に係る標的ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡであり、上記の融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとの対応を示すために、便宜的に、少なくとも一方の鎖が、５’側から順に、ＰＡＭ配列、前記標的部位、スペーサー１、前記ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列を含む構造であるか（図１Ａの第１の態様及び第２の態様）、少なくとも一方の鎖が、５’側から順に、前記ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列、ＰＡＭ配列及びスペーサー１、前記標的部位、を含む構造である（図１Ｂの第３の態様及び第４の態様）ものとする。
【0076】
５’側又は３’側にＤＮＡ結合ドメイン認識配列の相補配列を含むとは、当該鎖の相補鎖が、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列を含むことを示す。すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、前記標的部位と同じ鎖上に設定しても、その相補鎖上に設定してもよい。また、当該鎖の相補鎖が、前記標的部位の相補塩基を含むように、ガイドＲＮＡ標的配列を含むものとする。
【0077】
本発明に係る標的部位とは、前記核酸塩基変換酵素による編集（好ましくはデアミナーゼによる脱アミノ化）の標的とする１塩基を示す。ただし、当該１塩基の両側近傍の塩基（特に、デアミナーゼによる脱アミノ化の標的となる塩基が存在する場合。好ましくは、５’側及び３’側のそれぞれ１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基、さらに好ましくは１～２塩基）がさらに編集（デアミナーゼの場合には脱アミノ化）されることを否定するものではない。
【0078】
ＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、前記ＤＮＡ結合ドメインが認識する配列である。ＤＮＡ結合ドメイン認識配列の塩基数としては、前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである場合、１０～３０塩基であることが好ましく、１３～２５塩基であることが好ましく、１５～２０塩基であることがさらに好ましい。また、前記ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガーアレイである場合、６～４５塩基であることが好ましく、９～２４塩基であることが好ましく、１２～１８塩基であることがさらに好ましい。
【0079】
前記ＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在するように選択される。スペーサー１の鎖長がかかる範囲内にあることにより、特異的かつ高効率で前記標的部位の１塩基を脱アミノ化することができる。前記スペーサー１の鎖長は、標的部位の塩基の５’側又は３’側に隣接する塩基を１塩基目として、前記ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列の３’側又は５’側に隣接する塩基までの長さである。このようなスペーサー１の鎖長としては、１０～３１塩基であることがより好ましく、１０～２８塩基であることがさらに好ましく、１３～２５塩基であることがさらにより好ましい。
【0080】
また、スペーサー１の鎖長としては、例えば、前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼであって、Ａｎｃ６８９又はＰｍＣＤＡ１又はＴａｄ－Ａである場合には、７～３１塩基であることが好ましく、７～２５塩基であることがより好ましい傾向にある。また、スペーサー１の鎖長としては、例えば、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群がサブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群である場合、７～３１塩基であることが好ましく、７～１９塩基であることがより好ましく、サブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群である場合、７～３１塩基であることが好ましく、１３～２５塩基であることがより好ましい傾向にある。
【0081】
ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列は、前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群が認識する配列であり、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの種類に応じてその長さは異なるが、典型的には、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接する２～５塩基である。ＰＡＭ配列としても、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの種類に応じて異なるが、典型的には、例えば、前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群がＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のサブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群やサブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群である場合、これらが認識するＰＡＭ配列としては、５’－ＣＣＡ、５’－ＣＣ、５’－ＡＣＮ等が挙げられ、同サブタイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群である場合、これらが認識するＰＡＭ配列としては、５’－ＡＡＧ、５’－ＡＧＧ、５’－ＧＡＧ等が挙げられる。ただしこれらは、上記のとおり、前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群に含まれるＣａｓタンパク質の改変（例えば、変異の導入）によって変更することも可能であり、これにより標的部位の選択肢を拡大することが可能である。
【0082】
本発明において、前記ＰＡＭ配列は前記標的部位の５’側に存在し、前記ガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記ＰＡＭ配列の位置に応じて決定される。本発明において、前記ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列内における前記標的部位の相補塩基の位置は、特に限定されないが、例えば、第１位～第５０位の間であることが好ましく、第１位～第３５位の間であることがより好ましい。なお、前記ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列内における塩基の位置は、前記ガイドＲＮＡ標的配列のＰＡＭ配列に隣接する塩基を第１位とした位置である。前記塩基位置の上限及び下限は、前記ガイドＲＮＡ標的配列の長さに依存し、前記ガイドＲＮＡの長さを調節することにより調整可能である。
【0083】
前記ガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含む配列となるように選択される。ガイドＲＮＡ標的配列の位置をこのように選択することにより、特異的かつ高効率で前記標的部位の１塩基を編集することができる。本発明に係るガイドＲＮＡ標的配列の長さ（塩基数）としては、１０～７０塩基であることが好ましく、２０～５０塩基であることがより好ましく、３０～４０塩基であることがさらに好ましい。本発明では、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いるため、ガイドＲＮＡ標的配列の長さをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いた場合（例えば、好ましくは２０塩基程度）よりも長くすることができ、ガイドＲＮＡによる標的認識の配列特異性を増大させることが可能である。他方、ガイドＲＮＡ標的配列が前記上限を超えると、ガイドＲＮＡとガイドＲＮＡ標的配列との間に形成される塩基対のＴｍ値が高くなる傾向にある。
【0084】
このような標的ＤＮＡの塩基配列としては、特に制限されず、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列、スペーサー１、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列、前記ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列に含まれる標的部位、及びＰＡＭ配列が、上記条件を満たすように、ＤＮＡ結合ドメイン及びガイドＲＮＡを設計し、目的の塩基置換に応じた核酸塩基変換酵素を選択し、及必要に応じてＰＡＭ配列の認識特異性を改変することにより、本発明のＤＮＡ編集方法の標的とすることができる。
【0085】
さらに、本発明に係る標的ＤＮＡとしては、目的に応じて、細胞内に存在するＤＮＡ（内在性ＤＮＡ）又は細胞外に存在するＤＮＡとすることができる。細胞内に存在するＤＮＡとしては、内因性ＤＮＡであっても、外因性ＤＮＡであってもよい。内因性ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡが挙げられ、外因性ＤＮＡとしては、例えば、細胞内に導入したＤＮＡが挙げられる。細胞外に存在するＤＮＡとしては、細胞に由来するＤＮＡであっても、細胞外で増幅、合成したＤＮＡであってもよい。
【0086】
（標的ＤＮＡ編集方法）
本発明の標的ＤＮＡ編集方法では、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、前記標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により、前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する。
本発明の標的ＤＮＡ編集方法では、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、前記標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により、前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する。
【0087】
前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを標的ＤＮＡに接触させると、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが標的ＤＮＡ上のＤＮＡ結合ドメイン認識配列を認識して結合し、ＤＮＡ結合ドメインに連結された核酸塩基変換酵素を当該標的ＤＮＡに誘導する。他方、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは標的ＤＮＡの相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列を認識して結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を当該標的ＤＮＡに誘導する。これにより、標的部位において、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群とガイドＲＮＡとの複合体が構成され、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群のヘリカ－ゼ活性によって一本鎖ＤＮＡを露出するため、前記核酸塩基変換酵素により、目的の塩基の置換（例えば、塩基の脱アミノ化）を効率的に起こすことができる。
【0088】
本発明の標的ＤＮＡの編集方法における、前記融合タンパク質、前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＰＡＭ配列、及び前記標的ＤＮＡの関係を、図１Ａ～図１Ｂに示す概念図を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。
【0089】
本発明の標的ＤＮＡの編集方法の一態様としては、例えば、標的ＤＮＡを、５’側から順に、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ）、標的部位（図ではＣ又はＡ）、スペーサー１（１２）、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列（１１）（第１の態様：図１Ａの（ａ））、又は、５’側から順に、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ）、標的部位（図ではＣ又はＡ）、スペーサー１（１２）、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列（１１）の相補配列（第１の態様：図１Ａの（ｂ））とする態様が挙げられる。このとき、ガイドＲＮＡ（４０）の標的配列は、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ）の３’側に隣接する配列の相補配列上、かつ、当該相補配列が標的部位（Ｃ又はＡ）を含むように設定される。これにより、ガイドＲＮＡ（４０）にＣａｓ５～Ｃａｓ８タンパク質（３１～３４）からなるタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（３０）が誘導されて、そのヘリカ－ゼ活性により標的部位（Ｃ又はＡ）を含む一本鎖を特異的に露出させる。さらに、融合タンパク質（２０）のＤＮＡ結合ドメイン（２２）がＤＮＡ結合ドメイン認識配列（１１）を認識して結合し、その核酸塩基変換酵素（２１）も標的部位（Ｃ又はＡ）に誘導されるため、標的部位（Ｃ又はＡ）の塩基の置換を効率的に起こすことができる。
【0090】
本発明の標的ＤＮＡの編集方法の別の態様としては、例えば、標的ＤＮＡを、５’側から順に、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列（１１）、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ）及びスペーサー１（１２）、標的部位（図ではＣ又はＡ）（第３の態様：図１Ｂの（ａ））、又は、５’側から順に、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列（１１）の相補配列、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ）及びスペーサー１（１２）、標的部位（図ではＣ又はＡ）（第４の態様：図１Ｂの（ｂ））とする態様が挙げられる。第３の態様及び第４の態様において、ＰＡＭ配列はスペーサー１上に設定される。このとき、ガイドＲＮＡ（４０）の標的配列は、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ）の３’側に隣接する配列の相補配列上、かつ、当該相補配列が標的部位（Ｃ又はＡ）を含むように設定される。これにより、ガイドＲＮＡ（４０）にＣａｓ５～Ｃａｓ８タンパク質（３１～３４）からなるタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（３０）が誘導されて、そのヘリカ－ゼ活性により標的部位（Ｃ又はＡ）を含む一本鎖を特異的に露出させる。さらに、融合タンパク質（２０）のＤＮＡ結合ドメイン（２２）がＤＮＡ結合ドメイン認識配列（１１）を認識して結合し、その核酸塩基変換酵素（２１）も標的部位（Ｃ又はＡ）に誘導されるため、標的部位（Ｃ又はＡ）の塩基の置換を効率的に起こすことができる。
【0091】
なお、本発明の標的ＤＮＡの編集方法は、図１Ａ～図１Ｂに示す態様に限定されるものではない。例えば、図１Ａ～図１Ｂでは、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を、サブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムやサブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓ５～Ｃａｓ８タンパク質（３１～３４）からなるタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群（３０）としているが、そのサブタイプや改変体に応じて別の構成であってよい。
【0092】
これにより、標的部位で１塩基の置換が起こり（例えば、Ｃ→Ｕ）、また、例えば細胞内では、二本鎖ＤＮＡのミスマッチにより、置換が起こった鎖の反対鎖の塩基が置換塩基と対形成するように修復されたり（例えば、Ｇ→Ａ）、修復の際に他の塩基に置換されたり（例えば、Ｕ→Ａ、Ｇ）、或いは１塩基又は十数塩基の欠失若しくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入され得る。
【0093】
したがって、本発明に係るＤＮＡの編集には、前記核酸塩基変換酵素で変換された標的部位及びそれを含む近傍における、１以上の塩基の欠失、他の１以上の塩基への置換、若しくは１以上の塩基の挿入、又はこれらの変異の組み合わせを含む。
【0094】
本発明の標的ＤＮＡ編集方法は、細胞内において行っても、無細胞系において行ってもよい。本発明の標的ＤＮＡ編集方法の場となる「細胞内」としては、真核細胞内であっても原核細胞内であってもよく、好ましくは真核細胞内である。前記真核細胞としては、例えば、動物細胞（哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞等）、植物細胞、藻細胞、酵母が挙げられ、前記原核細胞としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、乳酸菌、高度好熱菌が挙げられる。
【0095】
「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞等が含まれる。具体的には、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成に用いられる卵母細胞としては、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞は、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
【0096】
「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞等が含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、カルスなどが挙げられる。
【0097】
また、本発明の標的ＤＮＡ編集方法の場となる「無細胞系」とは、生きた細胞（前記真核細胞、原核細胞）のない系を示す。本発明に係る無細胞系としては、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと、前記標的ＤＮＡとが接触可能な系であれば特に制限されず、例えば、緩衝液内；前記真核細胞又は原核細胞の細胞破砕液内、細胞抽出液内等が挙げられる。
【0098】
前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと、前記標的ＤＮＡとを接触させる方法としては特に制限されない。細胞内においては、例えば、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法のように、前記標的ＤＮＡを含む細胞に対して前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを導入する又はこれらをコードするベクター等を細胞に導入して発現させる方法が挙げられる。無細胞系においては、例えば、標的ＤＮＡの溶液と前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの溶液とを混合すればよい。これらの溶液の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が好ましい。
【0099】
＜標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法＞
本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法は、
標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法である。
本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法は、
標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
前記ＤＮＡ結合ドメインが認識するＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側又は３’側に７～３１塩基の鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法である。
【0100】
本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法（以下、場合により単に「製造方法」という）において、前記融合タンパク質、タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、及び標的ＤＮＡは、上記の本発明の標的ＤＮＡ編集方法で述べたとおりである。本発明の製造方法における標的ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡであり、当該ゲノムＤＮＡの編集目的に応じて、前記融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを設計することができる。
【0101】
また、本発明の製造方法において、融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと細胞内の標的ＤＮＡとの接触は、前記融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの、細胞へのタンパク質の形態での導入、細胞へのポリヌクレオチドの形態での導入、及び／又は、細胞への発現ベクターの形態での導入により細胞内で発現させることにより行う。したがって、前記融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、前記融合タンパク質及びタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を構成する各Ｃａｓタンパク質を、それぞれ独立に、タンパク質の形態で細胞に導入しても、当該タンパク質をコードするＲＮＡやＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させても、当該タンパク質を発現するベクター（発現ベクター）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させてもよい。また、これと独立して、前記ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞に導入しても、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させても、当該ＲＮＡを発現するベクター（発現ベクター）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させてもよい。
【0102】
前記融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを発現ベクターの形態で細胞に導入して細胞内で発現させる場合には、例えば、前記融合タンパク質を発現するベクター、前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を構成する各Ｃａｓタンパク質を発現するベクター、及び前記ガイドＲＮＡを発現するベクターをそれぞれ細胞内に導入してもよく、また、これらのうちの２種以上を組み合わせて発現するベクターを細胞内に導入してもよい。
【0103】
また、前記融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを発現ベクターの形態で細胞に導入して細胞内で発現させる場合、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を構成する各Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、それぞれ独立して、導入する細胞に応じて適宜コドン最適化されたものであってもよい。また、当該発現ベクターとしては、発現させるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結しているプロモーター及び／又はその他の制御配列を含むことが好ましい。さらに、当該発現ベクターとしては、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものであることが好ましい。このような発現ベクターは、適宜従来公知の方法に準じて作製することができる。
【0104】
前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの、タンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該タンパク質を発現するベクターを細胞に導入する方法としては、タンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡ断片を細胞に導入するための公知の方法を細胞の種類に応じて適宜採用することができ、このような方法としては、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法、リポソーム法（リポフェクション法）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、ウイルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウィルス等）、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、熱ショック法（塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）等が挙げられる。このような方法は、「Ｄａｖｉｓｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６」等、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【0105】
前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが細胞に導入又は細胞内で発現すると、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと細胞内の標的ＤＮＡとが接触し、上記の本発明の標的ＤＮＡ編集方法で述べた標的ＤＮＡ編集により、標的部位で目的の塩基の置換が起こり、その結果、標的ＤＮＡが編集された細胞を得ることが可能となる。
【0106】
本発明はまた、前記標的ＤＮＡの編集がされた細胞を含む非ヒト個体の作製方法を提供する。この方法は、上記の製造方法により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程を含む。前記非ヒト個体としては、例えば、非ヒト動物及び植物が挙げられる。前記非ヒト動物としては、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。モデル動物を作製する場合、哺乳動物は、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類であり、特に好ましくはマウスである。前記植物としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類が挙げられる。具体的な作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションを例示することができる。
【0107】
前記標的ＤＮＡの編集がされた細胞から非ヒト個体を作製する方法としては、公知の方法を利用することができる。動物において細胞から非ヒト個体を作製する場合、通常、生殖細胞又は多能性幹細胞が利用される。例えば、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを卵母細胞にマイクロインジェクションし、得られた卵母細胞を偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得ることができる。また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、例えば、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを植物細胞にマイクロインジェクションし、得られた植物細胞から植物体を再生することにより、所望のＤＮＡが編集された植物体を得ることができる。また、得られた非ヒト個体からは、所望のＤＮＡが編集された子孫やクロ－ンを得ることもできる。
【0108】
標的ＤＮＡ編集の有無の確認、及び遺伝子型の決定は、従来公知の手法に基づいて行うことができ、例えばＰＣＲ法、配列決定法、サザンブロッティング法等を利用することができる。
【0109】
＜ＤＮＡ編集システム＞
また、本発明は、上記本発明の標的ＤＮＡ編集方法、本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法、又は上記本発明の非ヒト個体の作製方法に用いるための、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を含む、ＤＮＡ編集システムを提供する。
また、本発明は、上記本発明の標的ＤＮＡ編集方法、本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法、又は上記本発明の非ヒト個体の作製方法に用いるための、
（１）ＤＮＡ結合ドメイン及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群及びそのガイドＲＮＡを含むタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
を含む、ＤＮＡ編集システムを提供する。
【0110】
前記融合タンパク質、及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、上記の本発明の標的ＤＮＡ編集方法及び製造方法で述べたとおりである。これらはそれぞれ独立して、タンパク質又はＲＮＡの形態であっても、当該タンパク質又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの形態であっても、当該タンパク質又はＲＮＡを発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。
【0111】
また、発現ベクターの形態である場合、本発明は、標的ＤＮＡの標的部位に応じて、ユ－ザ－が前記融合タンパク質及びタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを設計することができるように、
（ａ）ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と前記融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン以外をコードするポリヌクレオチドとを含むベクター、並びに、
（ｂ）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドを含むベクター若しくは該ポリヌクレオチドの挿入部位を含むベクター、
を含む、ＤＮＡ編集システムを提供する。なお、（ａ）～（ｃ）の各ベクターは、それぞれ、各ポリヌクレオチドを発現可能にする発現ユニットを含むものである。
（ａ）ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と前記融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン以外をコードするポリヌクレオチドとを含むベクター、並びに、
（ｂ）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドを含むベクター若しくは該ポリヌクレオチドの挿入部位を含むベクター、
を含む、ＤＮＡ編集システムを提供する。なお、（ａ）～（ｃ）の各ベクターは、それぞれ、各ポリヌクレオチドを発現可能にする発現ユニットを含むものである。
【0112】
本発明のＤＮＡ編集システムは、それぞれ、前記融合タンパク質及び前記タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む組み合わせからなる組み合わせ物としても、前記組み合わせを含むキットとしてもよい。キットとする場合、当該キットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含んでいてもよい。このような追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のデアミナーゼ）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書をさらに含んでいてもよい。
【0113】
前記キットに含まれる各要素は、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、同一の容器に収容されていてもよい。各要素は、一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい。各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒（緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等を含む溶媒）中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
【実施例0114】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0115】
１．レポータープラスミドの作製
レポーターとして、ｐＮＬＦ１－Ｃ［ＣＭＶ Ｈｙｇｒｏ］（ＰＲＯＭＥＧＡ社製，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、部位特異的変異導入法によって７１番目と１０７番目のメチオニンコドン（ＡＴＧ）をアラニンコドン（ＧＣＣ）に変更してｐＮＬＦ－Ｍ／Ａとした。次いで、ｐＮＬＦ－Ｍ／Ａに、表１に示した配列に対応するように設計したオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＮｈｅＩとＸｈｏＩで処理したｐＮＬＦ－Ｍ／Ａプラスミドに挿入し、ＴＡＬＥ－ＡＩＤ用、又はＢＥ４－ＴＡＬＥ用のレポータープラスミドを作製した。レポータープラスミドの挿入配列を下記の表１に示す。挿入配列は、ＰＡＭ配列（表１中の下線（＊１））、ターゲット塩基を含むコドン（ターゲットコドン；表１の下線（＊２）：５’－ＡＣＧ－３’）、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列（表１中の下線（＊３）：５’－ＣＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴａ－３’；小文字はＴＡＬＥのＮ末ドメインが認識するチミンの相補塩基を示す）、若しくはＴＡＬＥ認識配列（表１中の下線（＊４）：５’－ｔＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧ－３’；小文字はＴＡＬＥのＮ末ドメインが認識するチミンを示す）及びこれらの間のスペーサー配列を含み、スペーサーの長さはターゲット塩基の３’側にある塩基を含めて７ｂｐ、１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐ、又は３１ｂｐとした。
レポーターとして、ｐＮＬＦ１－Ｃ［ＣＭＶ Ｈｙｇｒｏ］（ＰＲＯＭＥＧＡ社製，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、部位特異的変異導入法によって７１番目と１０７番目のメチオニンコドン（ＡＴＧ）をアラニンコドン（ＧＣＣ）に変更してｐＮＬＦ－Ｍ／Ａとした。次いで、ｐＮＬＦ－Ｍ／Ａに、表１に示した配列に対応するように設計したオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＮｈｅＩとＸｈｏＩで処理したｐＮＬＦ－Ｍ／Ａプラスミドに挿入し、ＴＡＬＥ－ＡＩＤ用、又はＢＥ４－ＴＡＬＥ用のレポータープラスミドを作製した。レポータープラスミドの挿入配列を下記の表１に示す。挿入配列は、ＰＡＭ配列（表１中の下線（＊１））、ターゲット塩基を含むコドン（ターゲットコドン；表１の下線（＊２）：５’－ＡＣＧ－３’）、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列（表１中の下線（＊３）：５’－ＣＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴａ－３’；小文字はＴＡＬＥのＮ末ドメインが認識するチミンの相補塩基を示す）、若しくはＴＡＬＥ認識配列（表１中の下線（＊４）：５’－ｔＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧ－３’；小文字はＴＡＬＥのＮ末ドメインが認識するチミンを示す）及びこれらの間のスペーサー配列を含み、スペーサーの長さはターゲット塩基の３’側にある塩基を含めて７ｂｐ、１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐ、又は３１ｂｐとした。
【0116】
なお、前記ＴＡＬＥ認識配列は、細胞内活性が確認されているｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ遺伝子に対するＴＡＬＥＮのＲｉｇｈｔ ＴＡＬＥ 配列（Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ３，３３７９（２０１３））である。
【0117】
【表1】
【0118】
完成したレポータープラスミドの構造を示す概念図を図２に示す。図２の（ａ）は、挿入配列がＴＡＬＥ認識配列（１１）の相補配列を含む場合（ＴＡＬＥ－ＡＩＤ用）、図２の（ｂ）は、挿入配列がＴＡＬＥ認識配列（１１）を含む場合（ＢＥ４－ＴＡＬＥ用）を示す。これらのレポータープラスミドにおいて、ターゲットコドンは、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの開始コドンに相当する箇所に位置しているが、「ＡＣＧ」となっている。かかるレポータープラスミドによれば、ＴＡＬＥ認識配列に結合したＴＡＬＥ－デアミナーゼにより、ターゲットコドンであるＡＣＧがＡＴＧに変換される（すなわち、ターゲット塩基（標的部位）であるＣがＴに置換される）と、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを発現する。
【0119】
２．ＴＡＬＥベクターセット及びＴＡＬＥ発現プラスミドの作製
ＴＡＬＥベクターセットの配列及び構成は、ＴＡＬＥリピートユニットが上記１．で作製したレポータープラスミドのＴＡＬＥ認識配列に対応するように、上記Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）にしたがって構築した。先ず、１２番目と１３番目の２アミノ酸で構成される可変残基の４種（ＲＶＤ：ＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、ＮＮ）をコードする配列以外のモジュ－ル配列（ｎｏｎ－ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ（ｎｏｎ－ＲＶＤ））に改変（特に、４番目と３２番目）を加え、さらにその両端に制限酵素ＢｓＡＩ認識サイトを付加した配列（モジュ－ル配列）を人工ＤＮＡ合成した（計１６種：１ＨＤ～４ＨＤ、１ＮＧ～４ＮＧ、１ＮＩ～４ＮＩ、１ＮＮ～４ＮＮ）。次いで、これらモジュ－ル配列をｐＥＸ－Ａ２Ｊ２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に挿入して、モジュ－ルプラスミドセット（計１６種：ｐＥＸ１ＨＤ～ｐＥＸ４ＨＤ、ｐＥＸ１ＮＧ～ｐＥＸ４ＮＧ、ｐＥＸ１ＮＩ～ｐＥＸ４ＮＩ、及びｐＥＸ１ＮＮ～ｐＥＸ４ＮＮ）を作製した。
ＴＡＬＥベクターセットの配列及び構成は、ＴＡＬＥリピートユニットが上記１．で作製したレポータープラスミドのＴＡＬＥ認識配列に対応するように、上記Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）にしたがって構築した。先ず、１２番目と１３番目の２アミノ酸で構成される可変残基の４種（ＲＶＤ：ＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、ＮＮ）をコードする配列以外のモジュ－ル配列（ｎｏｎ－ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ（ｎｏｎ－ＲＶＤ））に改変（特に、４番目と３２番目）を加え、さらにその両端に制限酵素ＢｓＡＩ認識サイトを付加した配列（モジュ－ル配列）を人工ＤＮＡ合成した（計１６種：１ＨＤ～４ＨＤ、１ＮＧ～４ＮＧ、１ＮＩ～４ＮＩ、１ＮＮ～４ＮＮ）。次いで、これらモジュ－ル配列をｐＥＸ－Ａ２Ｊ２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に挿入して、モジュ－ルプラスミドセット（計１６種：ｐＥＸ１ＨＤ～ｐＥＸ４ＨＤ、ｐＥＸ１ＮＧ～ｐＥＸ４ＮＧ、ｐＥＸ１ＮＩ～ｐＥＸ４ＮＩ、及びｐＥＸ１ＮＮ～ｐＥＸ４ＮＮ）を作製した。
【0120】
また、アレイプラスミドを構成するＤＮＡ配列ＦＵＳ２＿ａＸＸ（計７種：ＸＸ＝１ａ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ）及びＦＵＳ２＿ｂ（１－４）（計４種）を人工ＤＮＡ合成により作製した。これらをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に挿入して、ｐＣＲ８＿ＦＵＳ２＿ａＸＸ及びｐＣＲ８＿ＦＵＳ＿ｂ（１－４）を作製した。次いで、これを上記Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅシステムにおける最初のアセンブルステップ（ステップ１）の捕捉ベクターとして使用し、同文献に記載の方法にしたがって、ＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドを作製した。
【0121】
次いで、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）から薬剤耐性遺伝子発現ユニットを除去したｐｃＤＮＡ３．１ｓに、人工ＤＮＡ合成により作製した、ＴＡＬＥのＮ末ドメインをコードする配列に加え、前記モジュ－ル配列を１つと、この３’末に続くＴＡＬＥのＣ末ドメインをコードする配列と、を挿入したデスティネーションベクター（ＴＡＬＥ－６３、ＴＡＬＥ－４７）を作製した。ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、Ｃ末ドメインのアミノ酸数が６３のもの（６３）、Ｃ末ドメインのアミノ酸数が４７のもの（４７）、の２種を用い、「６３」をコードする配列はＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８９～３２１９２）に含まれるＣ末ドメインの配列を、「４７」をコードする配列はＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインの配列を、それぞれ参照して人工ＤＮＡ合成した。また、ＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、これらＣ末ドメインに対応させて、６３：ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０６９９）に含まれるＮ末ドメインの配列；４７：ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインの配列を、それぞれ参照して人工ＤＮＡ合成した。上記で作製したアレイプラスミド及びデスティネーションベクターを用いて、上記Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載の方法にしたがい、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法によってＴＡＬＥ発現プラスミドを作製した。
【0122】
３．ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製－１（ＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズ）
（１）１０４アミノ酸リンカーシリーズ（ＴＡＬＥ－１０４－ＡＩＤ）
先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ遺伝子（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８））と、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ遺伝子（Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ８７２９（２０１６））とをｐｃＤＮＡ３．１ｓのＢａｍＨＩ認識サイトとＥｃｏＲＶ認識サイトとの間にそれぞれ挿入することにより、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド及びＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミドを作製した。
（１）１０４アミノ酸リンカーシリーズ（ＴＡＬＥ－１０４－ＡＩＤ）
先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ遺伝子（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８））と、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ遺伝子（Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ８７２９（２０１６））とをｐｃＤＮＡ３．１ｓのＢａｍＨＩ認識サイトとＥｃｏＲＶ認識サイトとの間にそれぞれ挿入することにより、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド及びＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミドを作製した。
【0123】
次いで、１０４アミノ酸リンカー１を有するＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、上記ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドのＡｎｃＢＥ４ｍａｘ遺伝子を鋳型として、下記の表２に記載のプライマーを用いて、１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩ遺伝子の２回繰り返し配列（１０ａａ ｌｉｎｋｅｒ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅ：プライマー配列番号１１、１２）をＰＣＲにより増幅した。また、上記Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミドを鋳型として、下記の表２に記載のプライマーを用いて、ＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ遺伝子（ＰｍＣＤＡ１：プライマー配列番号１３、１４）、及び１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列（１０４ａａ ｌｉｎｋｅｒ：プライマー配列番号１５、１６）をＰＣＲにより増幅した。さらに、上記２．で作製したデスティネーションベクターＴＡＬＥ－４７を鋳型として、β－ｌａｃｔａｍａｓｅからＴＡＬＥのＣ末ドメイン（４７）をコードする配列までを含む配列（β－ｌａｃｔａｍａｓｅ－ＴＡＬＥ＿４７：プライマー配列番号１８、１９）をＰＣＲにより増幅した。
【0124】
下記の表２に、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを構築するために使用した各プライマー及びその配列番号を示す。表２中、１０４ａａ ｌｉｎｋｅｒのｆｏｒ以下の「４７－１０４－ＡＩＤ」は、当該配列が、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７であり、かつ、前記１０４アミノ酸リンカー１及びＰｍＣＤＡ１を含むＴＡＬＥ－デアミナーゼ用のリンカー１をコードする配列であることを示す。なお、下記の各表中、「ＡＩＤ」は、デアミナーゼがＡＩＤであることを示すものではなく、「Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ」に由来するＰｍＣＤＡ１であることを示す。
【0125】
【表2】
【0126】
β－ｌａｃｔａｍａｓｅからＴＡＬＥのＣ末ドメイン（４７）をコードする配列までを含む配列、１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列、ＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ、及び１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩ遺伝子の２回繰り返し配列からβ－ｌａｃｔａｍａｓｅまでを含む配列を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ，Ｓｈｉｇａ社製）により連結し、Ｎ末から順に、ＴＡＬＥ＿４７、１０４アミノ酸リンカー１（１０４ａａ）、ＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、ＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、及びＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）の順で結合されたＴＡＬＥ－デアミナーゼを発現するためのデスティネーションベクタープラスミド４７－１０４－ＡＩＤを作製した。このプラスミドと、２．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－１０４－ＡＩＤ（４７－１０４－ＡＩＤ））を作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図を図３の（ａ）に示す。
【0127】
（２）１２アミノ酸リンカーシリーズ（ＴＡＬＥ－１２－ＡＩＤ）
また、前記１０４アミノ酸リンカー１に代えて、１２アミノ酸リンカー１（１２ａａ）を有するＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドは以下の方法で作製した。すなわち、先ず、下記の表３に記載のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて１２アミノ酸リンカー１をコードする配列を作製した。表３中、１２ａａ ｌｉｎｋｅｒのｆｏｒ以下の「ＴＡＬＥ＿４７－１２－ＡＩＤ」は、当該配列が、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７であり、かつ、前記１２アミノ酸リンカー１及びＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ）を含むＴＡＬＥ－デアミナーゼ用のリンカー１をコードする配列であることを示す。かかる１２アミノ酸リンカー１は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７ １３３３０（２０１６）に記載の１２アミノ酸からなる。次いで、上記ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを作製するためのデスティネーションベクタープラスミド４７－１０４－ＡＩＤの１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列以外を、下記の表４に示したプライマーを用いて、それぞれ、インバ－スＰＣＲにて増幅し、前記１２アミノ酸リンカー１をコードする配列をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入して、Ｎ末から順に、ＴＡＬＥ＿４７、１２アミノ酸リンカー１（１２ａａ）、ＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、ＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、及びＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）の順で結合されたＴＡＬＥ－デアミナーゼを発現するためのデスティネーションベクタープラスミド４７－１２－ＡＩＤを作製した。このプラスミドと、２．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－１２－ＡＩＤ（４７－１２－ＡＩＤ））を作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図は図３の（ａ）と同様である。下記の表３に、１２アミノ酸リンカー１をコードする配列及びその配列番号を示し、表４に、インバースＰＣＲに使用したプライマー及びその配列番号を示す。
また、前記１０４アミノ酸リンカー１に代えて、１２アミノ酸リンカー１（１２ａａ）を有するＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドは以下の方法で作製した。すなわち、先ず、下記の表３に記載のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて１２アミノ酸リンカー１をコードする配列を作製した。表３中、１２ａａ ｌｉｎｋｅｒのｆｏｒ以下の「ＴＡＬＥ＿４７－１２－ＡＩＤ」は、当該配列が、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７であり、かつ、前記１２アミノ酸リンカー１及びＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ）を含むＴＡＬＥ－デアミナーゼ用のリンカー１をコードする配列であることを示す。かかる１２アミノ酸リンカー１は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７ １３３３０（２０１６）に記載の１２アミノ酸からなる。次いで、上記ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを作製するためのデスティネーションベクタープラスミド４７－１０４－ＡＩＤの１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列以外を、下記の表４に示したプライマーを用いて、それぞれ、インバ－スＰＣＲにて増幅し、前記１２アミノ酸リンカー１をコードする配列をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入して、Ｎ末から順に、ＴＡＬＥ＿４７、１２アミノ酸リンカー１（１２ａａ）、ＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、ＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、及びＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）の順で結合されたＴＡＬＥ－デアミナーゼを発現するためのデスティネーションベクタープラスミド４７－１２－ＡＩＤを作製した。このプラスミドと、２．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－１２－ＡＩＤ（４７－１２－ＡＩＤ））を作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図は図３の（ａ）と同様である。下記の表３に、１２アミノ酸リンカー１をコードする配列及びその配列番号を示し、表４に、インバースＰＣＲに使用したプライマー及びその配列番号を示す。
【0128】
【表3】
【0129】
【表4】
【0130】
また、ＴＡＬＥ－デアミナーゼのネガティブコントロール（ＮＣ）として、ＴＡＬＥリピートユニットがヒトゲノムに結合しないように、上記１．で作製したレポータープラスミドのＴＡＬＥ認識配列に代えて、次のＮＣ配列：５’－ｔＴＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＴＣＧＣＧ－３’（配列番号：２２、ＮＣ＿ＴＡＬＥ）を認識して結合するように構築したＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣを発現するようにしたこと以外は上記と同様にして、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼに対応するＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣを発現するプラスミド（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミド；ＴＡＬＥ－１０４／１２－ＡＩＤ－ＮＣ（４７－１０４／１２－ＡＩＤ－ＮＣ））をそれぞれ作製した。
【0131】
作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表５にそれぞれ示す。なお、表５中のＩＤにおいて、「ＡＩＤ」は、デアミナーゼがＡＩＤであることを示すものではなく、「Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ」に由来するＰｍＣＤＡ１であることを示す。
【0132】
【表5】
【0133】
４．ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製－２（ＢＥ４－ＴＡＬＥシリーズ）
（１）３２アミノ酸リンカーシリーズ（ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ）
Ｎ末から、Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）、リンカー１（３２アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：６３、又は４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ」という）の発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、先ず、３．（１）において作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、下記の表６に記載のプライマーを用いて、３２アミノ酸リンカー１をコードする配列を含めて５’側（プライマー配列番号１９、２３、２４）、１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩの２回繰り返しをコードする配列を含めて３’側（プライマー配列番号１２、２５、２６）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。また、２．で作製したデスティネーションベクター（ＴＡＬＥ－６３、ＴＡＬＥ－４７）をそれぞれ鋳型として、各ＴＡＬＥをコードする配列（プライマー配列番号１７、１８、２７、２８）をＰＣＲにより増幅した。下記の表６に、ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ発現プラスミドを構築するために使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
（１）３２アミノ酸リンカーシリーズ（ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ）
Ｎ末から、Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）、リンカー１（３２アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：６３、又は４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ」という）の発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、先ず、３．（１）において作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、下記の表６に記載のプライマーを用いて、３２アミノ酸リンカー１をコードする配列を含めて５’側（プライマー配列番号１９、２３、２４）、１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩの２回繰り返しをコードする配列を含めて３’側（プライマー配列番号１２、２５、２６）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。また、２．で作製したデスティネーションベクター（ＴＡＬＥ－６３、ＴＡＬＥ－４７）をそれぞれ鋳型として、各ＴＡＬＥをコードする配列（プライマー配列番号１７、１８、２７、２８）をＰＣＲにより増幅した。下記の表６に、ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ発現プラスミドを構築するために使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
【0134】
【表6】
【0135】
上記３断片をそれぞれ組み合わせて、３．（１）と同様に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により、Ｎ末から順に、デアミナーゼ（Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４））、リンカー１（３２アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：６３、又は４７）の順に配置されるＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ発現プラスミドを発現するためのデスティネーションベクター（ＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－３２－４７）をそれぞれ作製した。これらと、２．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミド、又は、３．で作製したＮＣ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、３．と同様に、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ（ＢＥ４－３２－６３／４７））及びＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミド（ＢＥ４－３２－６３／４７－ＮＣ（ＢＥ４－３２－６３／４７－ＮＣ））をそれぞれ作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図を図３の（ｂ）に示す。
【0136】
作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表７にそれぞれ示す。
【0137】
【表7】
【0138】
（２）１３５アミノ酸リンカーシリーズ（ＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥ）
次いで、デアミナーゼとＴＡＬＥとの間のリンカー１長（３２アミノ酸）をコードする配列の下流側に、既知のリンカー配列であるＨＴＳ９５アミノ酸配列（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，Ｍｏｌ ＢｉｏＳｙｓｔ １０，４４６－４５３（２０１４））をコードする配列を挿入したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥ」という）の発現プラスミド（リンカー１長：ＨＴＳ９５アミノ酸配列の前後に付加した繋ぎ配列を含めて、１３５アミノ酸（ＨＴＳ９５ａ．ａ．：塩基配列の配列番号１１４、アミノ酸配列の配列番号１１５）を以下の方法により作製した。すなわち、４．（１）で作製したＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－３２－４７の各デスティネーションベクターを鋳型として、下記の表８に記載のプライマーを用いて、３２アミノ酸リンカー１をコードする配列を含めて５’側（プライマー配列番号１９、２９）、各ＴＡＬＥをコードする配列以降の３’側（プライマー配列番号１２、３０、３１）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。下記の表８に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
次いで、デアミナーゼとＴＡＬＥとの間のリンカー１長（３２アミノ酸）をコードする配列の下流側に、既知のリンカー配列であるＨＴＳ９５アミノ酸配列（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，Ｍｏｌ ＢｉｏＳｙｓｔ １０，４４６－４５３（２０１４））をコードする配列を挿入したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥ」という）の発現プラスミド（リンカー１長：ＨＴＳ９５アミノ酸配列の前後に付加した繋ぎ配列を含めて、１３５アミノ酸（ＨＴＳ９５ａ．ａ．：塩基配列の配列番号１１４、アミノ酸配列の配列番号１１５）を以下の方法により作製した。すなわち、４．（１）で作製したＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－３２－４７の各デスティネーションベクターを鋳型として、下記の表８に記載のプライマーを用いて、３２アミノ酸リンカー１をコードする配列を含めて５’側（プライマー配列番号１９、２９）、各ＴＡＬＥをコードする配列以降の３’側（プライマー配列番号１２、３０、３１）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。下記の表８に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
【0139】
【表8】
【0140】
上記３断片をそれぞれ組み合わせて、３．（１）と同様に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により、Ｎ末から順に、デアミナーゼ（Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４））、リンカー１（１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：６３、又は４７）の順に配置されるＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥを発現するためのデスティネーションベクター（ＢＥ４－１３５－６３、ＢＥ４－１３５－４７、）をそれぞれ作製した。これらと、２．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミド、又は、３．で作製したＮＣ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、３．と同様に、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥ（ＢＥ４－１３５－６３／４７））、又は、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミド（ＢＥ４－１３５－６３／４７－ＮＣ（ＢＥ４－１３５－６３／４７－ＮＣ））を作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図は図３の（ｂ）と同様である。
【0141】
作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を上記の表７にそれぞれ示す。
【0142】
５．ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製－３（ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥシリーズ）
先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＡＢＥｍａｘ遺伝子（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８））を、ｐｃＤＮＡ３．１ｓのＢａｍＨＩ認識サイトとＥｃｏＲＶ認識サイトとの間にそれぞれ挿入することにより、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミドを作製した。次いで、ＡＢＥｍａｘの改良型であるＡＢＥ８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）（Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８，８８３－８９１（２０２０））発現プラスミドを作製した。すなわち、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、下記の表９に記載のプライマー（プライマー配列番号１５４、１５５）を用いて、３’－ＡＢＥｍａｘ遺伝子のＮ末のＮＬＳをコードする配列～３２アミノ酸リンカー１のＣ末迄をコードする配列－５’を、ＰＣＲにより増幅してアクセプターとした。また、ＡＢＥ７．１０遺伝子上に、Ｖ１０６Ｗ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、Ｄ１６７Ｎとなる変異を含むようにプライマーをデザインし、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、断片Ａ（プライマー配列番号１５６、１５７）と、断片Ｂ（プライマー配列番号１５８、１５９）とをＰＣＲにより増幅した。次いで、２個の断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により前記アクセプターに挿入し、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））発現プラスミドを作製した。下記の表９に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。なお、下記の各表中、「ＡＢＥ８ｅ」は、デアミナーゼがＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）であることを示す。
先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＡＢＥｍａｘ遺伝子（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６（２０１８））を、ｐｃＤＮＡ３．１ｓのＢａｍＨＩ認識サイトとＥｃｏＲＶ認識サイトとの間にそれぞれ挿入することにより、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミドを作製した。次いで、ＡＢＥｍａｘの改良型であるＡＢＥ８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）（Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８，８８３－８９１（２０２０））発現プラスミドを作製した。すなわち、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、下記の表９に記載のプライマー（プライマー配列番号１５４、１５５）を用いて、３’－ＡＢＥｍａｘ遺伝子のＮ末のＮＬＳをコードする配列～３２アミノ酸リンカー１のＣ末迄をコードする配列－５’を、ＰＣＲにより増幅してアクセプターとした。また、ＡＢＥ７．１０遺伝子上に、Ｖ１０６Ｗ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、Ｄ１６７Ｎとなる変異を含むようにプライマーをデザインし、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、断片Ａ（プライマー配列番号１５６、１５７）と、断片Ｂ（プライマー配列番号１５８、１５９）とをＰＣＲにより増幅した。次いで、２個の断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により前記アクセプターに挿入し、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））発現プラスミドを作製した。下記の表９に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。なお、下記の各表中、「ＡＢＥ８ｅ」は、デアミナーゼがＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）であることを示す。
【0143】
【表9】
【0144】
次いで、Ｎ末から、ＡＢＥデアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）、リンカー１（１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７」）の発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、４．（２）で作製したＢＥ４－１３５－４７のデスティネーションベクターを鋳型として、下記の表１０に記載のプライマーを用いて、Ｎ末端のＮＬＳをコードする配列を含めた５’側と、３２アミノ酸リンカーからＣ末側をコードする配列を含めた３’側とを、ベクターを含めてＰＣＲにより増幅して（プライマー配列番号１６０、１６１）アクセプターとした。また、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））発現プラスミドを鋳型としてＰＣＲにより増幅した（プライマー配列番号１６２、１６３）、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））遺伝子部分を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により前記アクセプターに挿入し、ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７を発現するためのデスティネーションベクターを作製した。下記の表１０に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
【0145】
【表10】
【0146】
６．内因性ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）をターゲットとするＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製
内因性ＤＮＡ上の配列をターゲットとするため、内因性ＤＮＡ上のＡＳ１４サイト、Ｓ１サイト、Ｓ２サイト、及びＡＰＣサイトの４種類のターゲットサイトに対して、ＴＡＬＥ認識配列が下記の表１１に記載の６種類の配列となるように、２．と同様の方法でＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドを作製した。前記内因性ＤＮＡ及びターゲットサイトとしては、相同性の高いファミリー遺伝子（ＣＣＲ２）が存在するＣＣＲ５遺伝子上のＡＳ１４サイト、相同性の高いファミリー遺伝子（ＨＢＤ）が存在するＨＢＢ遺伝子上のＳ１サイト及びＳ２サイト、及びＡＰＣ遺伝子上のＡＰＣサイトをそれぞれ設定した。
内因性ＤＮＡ上の配列をターゲットとするため、内因性ＤＮＡ上のＡＳ１４サイト、Ｓ１サイト、Ｓ２サイト、及びＡＰＣサイトの４種類のターゲットサイトに対して、ＴＡＬＥ認識配列が下記の表１１に記載の６種類の配列となるように、２．と同様の方法でＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドを作製した。前記内因性ＤＮＡ及びターゲットサイトとしては、相同性の高いファミリー遺伝子（ＣＣＲ２）が存在するＣＣＲ５遺伝子上のＡＳ１４サイト、相同性の高いファミリー遺伝子（ＨＢＤ）が存在するＨＢＢ遺伝子上のＳ１サイト及びＳ２サイト、及びＡＰＣ遺伝子上のＡＰＣサイトをそれぞれ設定した。
【0147】
上記各アレイプラスミドを用いたこと以外は、３．と同様にして、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、Ｎ末から、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７）、リンカー１（１２アミノ酸、又は１０４アミノ酸）、デアミナーゼ（ＡＩＤ）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（４７（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１０４－ＡＩＤ：括弧内の＊はそれぞれターゲットサイト名）の発現プラスミド（ＴＡＬＥ－ＡＩＤ発現プラスミド）を作製した。
【0148】
また、上記各アレイプラスミドを用いたこと以外は、４．と同様にして、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、Ｎ末から、デアミナーゼ（ＢＥ４）、リンカー１（３２アミノ酸、又は１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：６３、又は４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－３２－４７（＊）、ＢＥ４－１３５－６３（＊）：括弧内の＊はそれぞれターゲットサイト名）の発現プラスミド（ＢＥ４－ＴＡＬＥ発現プラスミド）を作製した。
【0149】
さらに、５．で作製したデスティネーションベクター及び各アレイプラスミドを用いたこと以外は、３．と同様にして、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により、Ｎ末から、デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）、リンカー１（１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７（＊）：括弧内の＊はそれぞれターゲットサイト名）の発現プラスミド（ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ発現プラスミド）を作製した。
【0150】
下記の表１１に、各ターゲットサイトのためのＴＡＬＥ認識配列を示し、表１２に、作製した各発現プラスミドにおける、ターゲットサイト、ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構成、及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧をそれぞれ示す。
【0151】
【表11】
【0152】
【表12】
【0153】
７．タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドの作製
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群として、以下の各文献に記載のＣａｓタンパク質群：
ＴｙｐｅＩ－Ｆ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＵＣＢＰＰ－ＰＡ１４株のＴｙｐｅＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１、３１３６（２０２０）に記載のサブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群；
ＴｙｐｅＩ－Ｂ：Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｆｉｎｌａｎｄ＿１９９８株のＴｙｐｅＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７，１４９３－１５０１（２０１９））に記載のサブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群；
を用いた。
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群として、以下の各文献に記載のＣａｓタンパク質群：
ＴｙｐｅＩ－Ｆ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＵＣＢＰＰ－ＰＡ１４株のＴｙｐｅＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１、３１３６（２０２０）に記載のサブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群；
ＴｙｐｅＩ－Ｂ：Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｆｉｎｌａｎｄ＿１９９８株のＴｙｐｅＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７，１４９３－１５０１（２０１９））に記載のサブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成するＣａｓタンパク質群；
を用いた。
【0154】
先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＴｙｐｅＩ－ＦのＣｓｙ１、Ｃｓｙ２遺伝子と、３．で作製した４７－１２－ＡＩＤ発現プラスミドとを鋳型として、下記の表１３に記載のプライマーを用いて、Ｃｓｙ１遺伝子（ＴｙｐｅＩ－Ｆ＿Ｃｓｙ１：プライマー配列番号３８、３９）、Ｃｓｙ２遺伝子（ＴｙｐｅＩ－Ｆ＿Ｃｓｙ２：プライマー配列番号４０、４１）、β－ｌａｃｔａｍａｓｅからＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒをコードする配列までを含む配列（β－ｌａｃｔａｍａｓｅ－ＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒ：プライマー配列番号４２、１９）、ＳＶ４０ＮＬＳ―β－ｌａｃｔａｍａｓｅを含む配列（ＮＬＳ－ＣｏｌＥ１－β－ｌａｃｔａｍａｓｅ：プライマー配列番号４３、１２）をＰＣＲにより増幅した。下記の表１３に、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドを構築するために使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
【0155】
【表13】
【0156】
増幅産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結して、ＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ２－ＮＬＳ発現プラスミドをそれぞれ作製した。また、作製したＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ発現プラスミドを鋳型として、β－ｌａｃｔａｍａｓｅからＮ末のＮＬＳまでの配列（β－ｌａｃｔａｍａｓｅ－ＮＬＳ）を下記の表１４に記載のプライマー（プライマー配列番号５６、１９）を用いて、また、ＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ遺伝子の終始コドンからβ－ｌａｃｔａｍａｓｅまでの配列（Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅ）を下記の表１４に記載のプライマー（プライマー配列番号５７、１２）を用いて、それぞれ増幅した。これら断片と、人工ＤＮＡ合成により作製したＴｙｐｅＩ－ＦのＣｓｙ３、Ｃｓｙ４遺伝子；ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ｂ２遺伝子とを鋳型として、下記の表１４に記載のプライマーを用いてＰＣＲによりそれぞれ増幅し、各増幅産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結して、ＮＬＳ－Ｃｓｙ３発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ４発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ５発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ６発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ７発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２発現プラスミドをそれぞれ作製した。
【0157】
【表14】
【0158】
さらに、Ｃａｓ８ｂ２については、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅから翻訳される可能性のある２種類の翻訳物（Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１、Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２）の発現プラスミドも作製した。すなわち、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２発現プラスミドを鋳型として、下記の表１５に記載のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結して、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドをそれぞれ作製した。作製した各発現プラスミドにおける、各Ｃａｓ分子の配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表１６にそれぞれ示す。
【0159】
【表15】
【0160】
【表16】
【0161】
８．Ｃａｓ９用のガイドＲＮＡ発現プラスミドの作製
先ず、ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｐｌａｓｍｉｄ ４２２３０）のＵ６プロモーターからＢＧＨポリＡ付加配列までの領域を人工ＤＮＡ合成し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＶ認識サイトとＢａｍＨＩ認識サイトとの間にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入することでＣａｓ９発現プラスミドｐＸ３３０＿ＢＳを作製した。これをＸｂａＩ及びＮｏｔＩで処理してＣａｓ９遺伝子を除去し、フィルイン反応後、セルフライゲ－ションによりプラスミド（ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９）を作製した。次いで、下記の表１７に示した、ガイドＲＮＡ（Ａｎｃ－１）の標的配列（ｔａｒｇｅｔ－Ａｎｃ－１：表１７には、ガイドＲＮＡの標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列を示す）に対応するように設計したオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＢｐｉＩ処理及びライゲ－ションによってｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９に挿入して、Ｃａｓ９用のガイドＲＮＡ（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ用のガイドＲＮＡ）発現プラスミドを作製した。前記ガイドＲＮＡ（Ａｎｃ－１）の標的配列は、１．で作製したレポータープラスミド上にある。
先ず、ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｐｌａｓｍｉｄ ４２２３０）のＵ６プロモーターからＢＧＨポリＡ付加配列までの領域を人工ＤＮＡ合成し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＶ認識サイトとＢａｍＨＩ認識サイトとの間にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入することでＣａｓ９発現プラスミドｐＸ３３０＿ＢＳを作製した。これをＸｂａＩ及びＮｏｔＩで処理してＣａｓ９遺伝子を除去し、フィルイン反応後、セルフライゲ－ションによりプラスミド（ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９）を作製した。次いで、下記の表１７に示した、ガイドＲＮＡ（Ａｎｃ－１）の標的配列（ｔａｒｇｅｔ－Ａｎｃ－１：表１７には、ガイドＲＮＡの標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列を示す）に対応するように設計したオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＢｐｉＩ処理及びライゲ－ションによってｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９に挿入して、Ｃａｓ９用のガイドＲＮＡ（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ用のガイドＲＮＡ）発現プラスミドを作製した。前記ガイドＲＮＡ（Ａｎｃ－１）の標的配列は、１．で作製したレポータープラスミド上にある。
【0162】
【表17】
【0163】
９．タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム用のガイドＲＮＡ発現プラスミドの作製
先ず、下記の表１８に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれアニーリングさせて、ＴｙｐｅＩ－Ｆ又はＴｙｐｅＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ配列のリピート配列間にＢｂｓＩ認識配列を２箇所有するリンカー配列を挟んだ配列を作製した。次いで、上記ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９プラスミドのｇＲＮＡスキャフォ－ルド配列以外を、下記の表１９に示したプライマーを用いてインバ－スＰＣＲにて増幅し、前記配列（リピート配列－リンカー配列－リピート配列）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入し、Ｉ－Ｆ－ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃＩＦｃｒＲＮＡ）、Ｉ－Ｂ－ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃＩＢｃｒＲＮＡ）をそれぞれ作製した。
先ず、下記の表１８に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれアニーリングさせて、ＴｙｐｅＩ－Ｆ又はＴｙｐｅＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ配列のリピート配列間にＢｂｓＩ認識配列を２箇所有するリンカー配列を挟んだ配列を作製した。次いで、上記ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９プラスミドのｇＲＮＡスキャフォ－ルド配列以外を、下記の表１９に示したプライマーを用いてインバ－スＰＣＲにて増幅し、前記配列（リピート配列－リンカー配列－リピート配列）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入し、Ｉ－Ｆ－ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃＩＦｃｒＲＮＡ）、Ｉ－Ｂ－ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃＩＢｃｒＲＮＡ）をそれぞれ作製した。
【0164】
【表18】
【0165】
【表19】
【0166】
次いで、上記の表１７に示した、各ガイドＲＮＡの標的配列（表１７には、ガイドＲＮＡの標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列を示す）に対応するように設計したオリゴヌクレオチドをそれぞれアニールさせ、ＢｐｉＩ処理及びライゲ－ションによって、作製したｃｒＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃｌＦｃｒＲＮＡ、ｐｃｌＢｃｒＲＮＡ）にそれぞれ挿入し、各タイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム用のガイドＲＮＡ発現プラスミドを作製した。前記ガイドＲＮＡのうち、ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｆ及びｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｂの標的配列は、１．で作製したレポータープラスミド上にあり、それ以外のガイドＲＮＡの配列は、６．で設定した内因性ＤＮＡ上の各ターゲットサイト上にある。
【0167】
１０．ＨＥＫ細胞への形質転換
（１）レポーターアッセイ
上記１．で作製した各レポータープラスミドを標的ＤＮＡとした場合は、以下のとおりとした。すなわち、上記１．で作製したレポータープラスミドのうちのいずれか２０ｎｇ；上記３．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズ）及びそのＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミド、並びに、上記４．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＢＥ４－ＴＡＬＥシリーズ）及びそのＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドのうちのいずれか７５ｎｇ；上記７．で作製したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ：ＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ２－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ３発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃｓｙ４発現プラスミドの組み合わせ、又は、ＴｙｐｅＩ－Ｂ：ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ５発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ６発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ７発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２発現プラスミドの組み合わせ）をそれぞれ４０ｎｇずつ；上記９．で作製したタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム用のガイドＲＮＡ発現プラスミド２０ｎｇ；並びに、リファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４ ５ｎｇ；を組み合わせて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて各ウェルあたり５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間培養した。リファレンスプラスミドは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）を発現するプラスミドである。
（１）レポーターアッセイ
上記１．で作製した各レポータープラスミドを標的ＤＮＡとした場合は、以下のとおりとした。すなわち、上記１．で作製したレポータープラスミドのうちのいずれか２０ｎｇ；上記３．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズ）及びそのＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミド、並びに、上記４．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＢＥ４－ＴＡＬＥシリーズ）及びそのＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドのうちのいずれか７５ｎｇ；上記７．で作製したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ：ＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ２－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ３発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃｓｙ４発現プラスミドの組み合わせ、又は、ＴｙｐｅＩ－Ｂ：ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ５発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ６発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ７発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２発現プラスミドの組み合わせ）をそれぞれ４０ｎｇずつ；上記９．で作製したタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム用のガイドＲＮＡ発現プラスミド２０ｎｇ；並びに、リファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４ ５ｎｇ；を組み合わせて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて各ウェルあたり５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間培養した。リファレンスプラスミドは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）を発現するプラスミドである。
【0168】
また、ポジティブコントロールとして、上記１．で作製したレポータープラスミドのうちのいずれか２０ｎｇ；上記３．で作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド７５ｎｇ；上記７．で作製したＣａｓ９用のガイドＲＮＡ発現プラスミド２０ｎｇ；リファレンスプラスミドｐＧＬ４．５４ ５ｎｇ；を組み合わせたこと以外は同様にして、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0169】
（２）内因性ＤＮＡ編集アッセイ
上記６．に記載の内因性ＤＮＡを標的ＤＮＡとした場合には、以下のとおりとした。すなわち、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－ＡＩＤ発現プラスミド、ＢＥ４－ＴＡＬＥ発現プラスミド、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ発現プラスミドのうちのいずれか）６０ｎｇ；上記７．で作製したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ：ＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ２－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ３発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃｓｙ４発現プラスミドの組み合わせ、又はＴｙｐｅＩ－Ｂ：ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ５、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ６、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ７発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２発現プラスミドの組み合わせ）をそれぞれ１０ｎｇずつ；上記９．で作製したタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム用のガイドＲＮＡ発現プラスミド２０ｎｇ；を組み合わせて、各ウェルあたり３×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、７２時間培養した。
上記６．に記載の内因性ＤＮＡを標的ＤＮＡとした場合には、以下のとおりとした。すなわち、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＴＡＬＥ－ＡＩＤ発現プラスミド、ＢＥ４－ＴＡＬＥ発現プラスミド、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ発現プラスミドのうちのいずれか）６０ｎｇ；上記７．で作製したタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ：ＮＬＳ－Ｃｓｙ１－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ２－ＮＬＳ発現プラスミド、ＮＬＳ－Ｃｓｙ３発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃｓｙ４発現プラスミドの組み合わせ、又はＴｙｐｅＩ－Ｂ：ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ５、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ６、ＮＬＳ－Ｌｍｏ－Ｃａｓ７発現プラスミド、及びＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２発現プラスミドの組み合わせ）をそれぞれ１０ｎｇずつ；上記９．で作製したタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム用のガイドＲＮＡ発現プラスミド２０ｎｇ；を組み合わせて、各ウェルあたり３×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、７２時間培養した。
【0170】
１１．ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性値の測定
上記１０．の（１）で形質転換してから２４時間培養後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）で処理して細胞を溶解し、細胞溶解液とした。前記細胞溶解液をＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて、ＴｒｉＳｔａｒ Ｓ ＬＢ９４２ プレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコア及びホタルルシフェラーゼ活性スコアを測定した。
上記１０．の（１）で形質転換してから２４時間培養後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）で処理して細胞を溶解し、細胞溶解液とした。前記細胞溶解液をＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて、ＴｒｉＳｔａｒ Ｓ ＬＢ９４２ プレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコア及びホタルルシフェラーゼ活性スコアを測定した。
【0171】
各スコアのネガティブコントロールとしては、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを導入した細胞についてのＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコアを測定した。なお、ポジティブコントロール（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドを導入した細胞）に対しては、ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９プラスミドを導入した細胞（ガイドＲＮＡを発現させていない細胞）についての活性スコアを測定してネガティブコントロール（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ－ＮＣ）とした。
【0172】
活性の数値化は以下のように行った。先ず、リファレンスプラスミドによるホタルルシフェラーゼ活性スコアを用いて各ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコアを標準化した。次いで、標準化された活性スコアを用い、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを導入した細胞の活性スコアからＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを導入した細胞の活性スコアを差し引き、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性の活性値とした。また、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘの発現プラスミドを導入した細胞の活性スコアからＡｎｃＢＥ４ｍａｘ－ＮＣを差し引き、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値とした。さらに、各試験間でＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性を比較するために、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値は、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値を１とした時の相対活性で示した。試験は少なくとも３回繰り返して行い、平均値に標準偏差を付与してグラフ化した。
【0173】
１２．塩基編集活性の解析
上記１０．の（２）で形質転換してから７２時間後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、ＤＮＡｚｏｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）５０μＬを添加して細胞を溶解し、細胞溶解液とした。前記細胞溶解液をテンプレートにして、下記の表２０に記載のプライマーをそれぞれ用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｉｇａ社製）により、前記内因性ＤＮＡのターゲットサイトを含む領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製後、株式会社ファスマックにシークエンスを依頼した。ＥｄｉｔＲ（Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊ １，２３９－２５０（２０１８））を用いてシークエンスデータを解析し、ターゲットサイト上の標的（ｃｒＤＮＡ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合（％）、又は各ＡにおけるＧの割合（％）を算出した。
上記１０．の（２）で形質転換してから７２時間後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、ＤＮＡｚｏｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）５０μＬを添加して細胞を溶解し、細胞溶解液とした。前記細胞溶解液をテンプレートにして、下記の表２０に記載のプライマーをそれぞれ用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｉｇａ社製）により、前記内因性ＤＮＡのターゲットサイトを含む領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製後、株式会社ファスマックにシークエンスを依頼した。ＥｄｉｔＲ（Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊ １，２３９－２５０（２０１８））を用いてシークエンスデータを解析し、ターゲットサイト上の標的（ｃｒＤＮＡ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合（％）、又は各ＡにおけるＧの割合（％）を算出した。
【0174】
【表20】
【0175】
＜試験１＞ ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性に及ぼすスペーサー１長の影響
（１）ＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズ
ＴＡＬＥ認識配列とターゲット塩基との間の距離（スペーサー１）が７～３１ｂｐである５種類のレポータープラスミドのいずれか；ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７であり、アミノ酸リンカーが１２アミノ酸又は１０４アミノ酸であり、デアミナーゼがＡＩＤ（ＰｍＣＤＡ１）である、上記３．で作製した２種類のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（４７－１２－ＡＩＤ、４７－１０４－ＡＩＤ）のいずれか；２種類のタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ、ＴｙｐｅＩ－Ｂ）のいずれか；並びに２種類のガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｆ、ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｂ）のいずれか；を組み合わせて、上記１０．（１）の方法で共発現させ、上記１１．の方法でＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。また、対照として、ガイドＲＮＡ発現プラスミドを共発現させなかったこと以外はそれぞれ同様にして、ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。結果を図４に示す。図４の（ａ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示し、図４の（ｂ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示す。
（１）ＴＡＬＥ－ＡＩＤシリーズ
ＴＡＬＥ認識配列とターゲット塩基との間の距離（スペーサー１）が７～３１ｂｐである５種類のレポータープラスミドのいずれか；ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７であり、アミノ酸リンカーが１２アミノ酸又は１０４アミノ酸であり、デアミナーゼがＡＩＤ（ＰｍＣＤＡ１）である、上記３．で作製した２種類のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（４７－１２－ＡＩＤ、４７－１０４－ＡＩＤ）のいずれか；２種類のタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ、ＴｙｐｅＩ－Ｂ）のいずれか；並びに２種類のガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｆ、ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｂ）のいずれか；を組み合わせて、上記１０．（１）の方法で共発現させ、上記１１．の方法でＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。また、対照として、ガイドＲＮＡ発現プラスミドを共発現させなかったこと以外はそれぞれ同様にして、ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。結果を図４に示す。図４の（ａ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示し、図４の（ｂ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示す。
【0176】
図４に示したように、いずれのタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を発現させた場合にも、ガイドＲＮＡが存在しない場合（ガイドなし）、すなわちタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムがターゲット塩基付近に結合していない場合はほとんど活性が認められなかった。一方、ガイドＲＮＡの存在下では、いずれのタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を発現させた場合にも活性が認められた。活性は、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合の方が、ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合よりも高い傾向にあった。また、リンカー１のアミノ酸数が１２の場合（４７－１２－ＡＩＤ）の方が、１０４の場合（４７－１０４－ＡＩＤ）よりも活性が高い傾向にあった。
【0177】
また、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合、スペーサー１が１３～２５ｂｐで活性が高く、４７－１２－ＡＩＤでは１９ｂｐで、４７－１０４－ＡＩＤでは２５ｂｐで、それぞれ最も活性が高かった。タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合、スペーサー１が７～１９ｂｐで活性が高く、１９ｂｐで最も活性が高かった。
【0178】
（２）ＢＥ４－ＴＡＬＥシリーズ
ＴＡＬＥ認識配列とターゲット塩基との間の距離（スペーサー１）が７～３１ｂｐである５種類のレポータープラスミドのいずれか；デアミナーゼがＡｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）であり、アミノ酸リンカーが３２アミノ酸又は１３５アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７又は６３である、上記４．で作製した４種類のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－３２－４７、ＢＥ４－１３５－４７、ＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－１３５－６３）のいずれか；２種類のタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ、ＴｙｐｅＩ－Ｂ）のいずれか；並びに２種類のガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｆ、ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｂ）のいずれか；を組み合わせて、上記１０．（１）の方法で共発現させ、上記１１．の方法でＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。また、対照として、ガイドＲＮＡ発現プラスミドを共発現させなかったこと以外はそれぞれ同様にして、ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。結果を図５に示す。図５の（ａ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示し、図５の（ｂ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示す。
ＴＡＬＥ認識配列とターゲット塩基との間の距離（スペーサー１）が７～３１ｂｐである５種類のレポータープラスミドのいずれか；デアミナーゼがＡｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）であり、アミノ酸リンカーが３２アミノ酸又は１３５アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７又は６３である、上記４．で作製した４種類のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－３２－４７、ＢＥ４－１３５－４７、ＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－１３５－６３）のいずれか；２種類のタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ、ＴｙｐｅＩ－Ｂ）のいずれか；並びに２種類のガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｆ、ｇＲＮＡ－ＲＥＰ－Ｉ－Ｂ）のいずれか；を組み合わせて、上記１０．（１）の方法で共発現させ、上記１１．の方法でＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。また、対照として、ガイドＲＮＡ発現プラスミドを共発現させなかったこと以外はそれぞれ同様にして、ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を取得した。結果を図５に示す。図５の（ａ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示し、図５の（ｂ）には、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた結果を示す。
【0179】
図５に示したように、いずれのタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を発現させた場合にも、ガイドＲＮＡが存在しない場合（ガイドなし）、すなわちタイプＩ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムがターゲット塩基付近に結合していない場合はほとんど活性が認められなかった。一方、ガイドＲＮＡの存在下では、いずれのタイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を発現させた場合にも活性が認められた。活性は、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合の方が、ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合よりも高い傾向にあった。
【0180】
また、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合、スペーサー１が１３～３１ｂｐで活性が高く、ＢＥ４－３２－４７及びＢＥ４－１３５－４７では１３ｂｐ及び２５ｂｐで、ＢＥ４－３２－６３及びＢＥ４－１３５－６３では２５ｂｐで、それぞれ最も活性が高かった。タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いた場合、スペーサー１が１３～２５ｂｐで活性が高かった。
【0181】
＜試験２＞ 内因性ＤＮＡにおける塩基編集効率－１
（サブタイプＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
デアミナーゼがＡＩＤ（ＰｍＣＤＡ１）であり、アミノ酸リンカーが１２アミノ酸又は１０４アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７である、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（４７（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１０４－ＡＩＤ）；デアミナーゼがＡｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）であり、アミノ酸リンカーが３２アミノ酸又は１３５アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７又は６３である、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－３２－４７（＊）、ＢＥ４－１３５－６３（＊））；及びデアミナーゼがＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）であり、アミノ酸リンカーが１３５アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７である、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７（＊））；のいずれかと、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ）と、５種類の各ターゲットサイト用のガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ＩＦ－１、ｇＲＮＡ－ＩＦ－２、ｇＲＮＡ－ＩＦ－７、ｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２、ｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃ）のいずれかと、を組み合わせて、上記１０．（２）の方法で共発現させ、上記１２．の方法で各ターゲットサイト上の標的（ｃｒＤＮＡ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合、又は各ＡにおけるＧの割合（％）を取得した。また、対照として、前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を共発現させなかったこと以外はそれぞれ同様にして、各標的（ｃｒＤＮＡ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合、又は各ＡにおけるＧの割合（％）を取得した（ｗ／ｏ Ｉ－Ｆ ｃａｓｃａｄｅ）。結果を図９Ａ～図１１Ｂに示す。
（サブタイプＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
デアミナーゼがＡＩＤ（ＰｍＣＤＡ１）であり、アミノ酸リンカーが１２アミノ酸又は１０４アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７である、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（４７（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１０４－ＡＩＤ）；デアミナーゼがＡｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）であり、アミノ酸リンカーが３２アミノ酸又は１３５アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７又は６３である、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－３２－４７（＊）、ＢＥ４－１３５－６３（＊））；及びデアミナーゼがＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）であり、アミノ酸リンカーが１３５アミノ酸であり、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７である、上記６．で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７（＊））；のいずれかと、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミド（ＴｙｐｅＩ－Ｆ）と、５種類の各ターゲットサイト用のガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ＩＦ－１、ｇＲＮＡ－ＩＦ－２、ｇＲＮＡ－ＩＦ－７、ｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２、ｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃ）のいずれかと、を組み合わせて、上記１０．（２）の方法で共発現させ、上記１２．の方法で各ターゲットサイト上の標的（ｃｒＤＮＡ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合、又は各ＡにおけるＧの割合（％）を取得した。また、対照として、前記タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群を共発現させなかったこと以外はそれぞれ同様にして、各標的（ｃｒＤＮＡ）範囲内の各ＣにおけるＴの割合、又は各ＡにおけるＧの割合（％）を取得した（ｗ／ｏ Ｉ－Ｆ ｃａｓｃａｄｅ）。結果を図９Ａ～図１１Ｂに示す。
【0182】
図６Ａ及び図６Ｂには、内因性ＤＮＡのＣＣＲ５遺伝子上のターゲットサイトとしたＡＳ１４サイトにおけるＰＡＭ配列、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ）、ＴＡＬＥ認識配列又はＴＡＬＥ認識配列の相補配列の位置、これに対応するファミリー遺伝子ＣＣＲ２とのアラインメントをまとめた概念図を示す。また、ＣＣＲ５遺伝子上のＡＳ１４サイトの配列（図６Ａの（ａ）の配列）を配列番号１３０に示す。図６Ａ及び図６Ｂ中、上記デアミナーゼに編集され得るターゲット塩基Ｃ又はＡには、それぞれ、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ）の５’側の端の塩基からの番号を付す。
【0183】
図７には、内因性ＤＮＡのＨＢＢ遺伝子上のターゲットサイトとしたＳ１サイト及びＳ２サイトにおけるＰＡＭ配列、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ）、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列の位置、これに対応するファミリー遺伝子ＨＢＤとのアラインメントをまとめた概念図を示す。また、ＨＢＢ遺伝子上のＳ１サイトの配列（図７の（ｂ）の配列）を配列番号１３１に、ＨＢＢ遺伝子上のＳ２サイトの配列（図７の（ｃ）の配列）を配列番号１３２に、それぞれ示す。図７中、上記デアミナーゼに編集され得るターゲット塩基Ｃには、それぞれ、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ）の５’側の端の塩基からの番号を付す。
【0184】
図８には、内因性ＤＮＡのＡＰＣ遺伝子上のターゲットサイトとしたＡＰＣサイトにおけるＰＡＭ配列、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ）、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列の位置の概念図を示す。ＡＰＣ遺伝子上のＡＰＣサイトの配列（図８の（ａ）の配列）を配列番号１３３に示す。図８中、上記デアミナーゼに編集され得るターゲット塩基Ｃには、それぞれ、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列（ｃｒＤＮＡ）の５’側の端の塩基からの番号を付す。
【0185】
図９Ａには、ＡＳ１４サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ１４－２とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図６Ａの（ａ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）範囲内の各Ｃ（Ｃ１７、１８、２６、３２）におけるＴの割合、並びに、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ５としたＢＥ４－３２－４７及びＢＥ４－１３５－６３について、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図６Ａの（ｂ）、図１Ａの（ａ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）範囲内の各Ｃ（Ｃ１７、１８、２６、３２）におけるＴの割合を示す。
【0186】
図９Ｂには、ＡＳ１４サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ５としたＡＢＥ８ｅ－１３５－４７について、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図６Ａの（ｃ）、図１Ａの（ａ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－１）範囲内の各Ａ（Ａ１２、１９、２２、２３）におけるＧの割合を示す。
【0187】
図９Ｃには、ＡＳ１４サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ１４－２とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図６Ｂの（ａ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－２）範囲内の各Ｃ（Ｃ２０、２６、２７）におけるＴの割合、並びに、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＳ１４－３としたＢＥ４－３２－４７及びＢＥ４－１３５－６３について、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図６Ｂの（ｂ）、図１Ａの（ａ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－２）範囲内の各Ｃ（Ｃ２０、２６、２７）におけるＴの割合を示す。
【0188】
図１０には、Ｓ２サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ２とした４７－１０４－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＦ－７とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図７の（ａ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＦ－７）範囲内の各Ｃ（Ｃ１７、１８、２０、２４、２７、３２）におけるＴの割合を示す。
【0189】
図１１Ａには、ＡＰＣサイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＰＣ－Ｒ１７とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図８の（ａ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ２）範囲内の各Ｃ（Ｃ１８、２０、２１、２３、２４、２５、３０、３２）におけるＴの割合を示す。
【0190】
図１１Ｂには、ＡＰＣサイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－ＡＰＣ－Ｒ１７とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃとし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＦのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図８の（ｂ）、図１Ｂの（ａ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃ）範囲内の各Ｃ（Ｃ１、５、６、７、１５、１９）におけるＴの割合を示す。
【0191】
図９Ａ～図１１Ｂに示したように、いずれのターゲットサイトにおいても、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群が存在しない場合（ｗ／ｏ）はほとんど塩基編集が確認されなかった。一方、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群の存在下では、全てのターゲットサイトで塩基編集が確認された。ＡＣ１４サイトのガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ－ＩＦ－１における最大塩基編集効率（Ｔの割合又はＧの割合）は２９～３３％（図９Ａ）及び１９％（図９Ｂ）であり、ガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ－ＩＦ－２では１７～２１％であった（図９Ｃ）。また、Ｓ２サイト及びＡＰＣサイトにおける最大塩基編集効率は１５％及び１６％であった（図１０、図１１Ａ）。さらに、ＡＰＣサイトにおいて、ガイドＲＮＡ：ｇＲＮＡ－ＡＰＣ－Ｆ７－Ｃとして、ＰＡＭ配列の位置をターゲット塩基とＴＡＬＥ認識配列との間にした場合でも塩基編集が確認され、最大塩基編集効率は１５％であった（図１１Ｂ）。
【0192】
ＴＡＬＥ－ＡＩＤでは、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列の５’側の端から１８番目～３２番目に存在するＣで塩基編集（Ｔへの置換）の効率が特に高くなったが、ＢＥ４－ＴＡＬＥでは、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列の５’側の端から２０番目～２７番目に存在するＣで塩基編集（Ｔへの置換）の効率が特に高くなった。また、ＴＡＬＥ－デアミナーゼは、ターゲットであるＣＣＲ５遺伝子及びＨＢＢ遺伝子に対して塩基編集活性を示したが、相同性は高いが、ターゲットではないＣＣＲ２遺伝子及びＨＢＤ遺伝子に対しては、ほとんど塩基編集活性を示さなかった。したがって、サブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムとＴＡＬＥ－デアミナーゼとの共発現システムによれば、高い特異性で標的ＤＮＡの編集を行うことができるといえる。
【0193】
＜試験２＞ 内因性ＤＮＡにおける塩基編集効率－２
（サブタイプＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
〔Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵの共導入効果〕
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとして、ｗ／ｏ：ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド；ＳＳＵ１：ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド＋ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１発現プラスミドの組み合わせ；又はＳＳＵ２：ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド＋ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドの組み合わせを用いたとこと以外は上記（サブタイプＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）と同様にして、塩基編集効率（Ｔの割合）を取得した。結果を図１２に示す。
（サブタイプＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
〔Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵの共導入効果〕
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとして、ｗ／ｏ：ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド；ＳＳＵ１：ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド＋ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１発現プラスミドの組み合わせ；又はＳＳＵ２：ＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド＋ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドの組み合わせを用いたとこと以外は上記（サブタイプＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）と同様にして、塩基編集効率（Ｔの割合）を取得した。結果を図１２に示す。
【0194】
図１２の（ａ）には、Ｓ１サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ１とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－１としたとき（図７の（ｂ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－１）範囲内の各Ｃ（Ｃ１９、２１、２２、２５、２８、３１、３２）におけるＴの割合を示す。図１２の（ｂ）には、Ｓ２サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ２とした４７－１０４－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－２としたとき（図７の（ｃ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－２）範囲内の各Ｃ（Ｃ１９、２１、２７、２８、３０）におけるＴの割合を示す。
【0195】
図１２の（ａ）に示したように、Ｓ１サイトでは、既に塩基編集活性が高いため、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ１発現プラスミド及びＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドの発現の追加による塩基編集活性の向上効果は大きくなかった。一方、図１２の（ｂ）に示したように、Ｓ２サイトでは、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドの追加によって、塩基編集活性の向上が確認された。これより、サブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム複合体とＴＡＬＥ－デアミナーゼとの共発現システムにおいては、Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２（ＳＳＵ２）をさらに共発現させることにより、塩基編集活性をさらに向上することが可能であるといえ、これは、塩基編集活性の低いターゲットサイトにおいて特に有効であるといえる。
【0196】
〔内因性ＤＮＡにおける塩基編集効率〕
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたこと以外は上記（サブタイプＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）と同様にして、塩基編集効率（Ｔの割合）を取得した。なお、Ｓ２サイトにおいては、ＴｙｐｅＩ－Ｂの組み合わせに加えて、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドも共発現させた。結果を図１３～図１４に示す。
タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたこと以外は上記（サブタイプＩ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）と同様にして、塩基編集効率（Ｔの割合）を取得した。なお、Ｓ２サイトにおいては、ＴｙｐｅＩ－Ｂの組み合わせに加えて、ＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドも共発現させた。結果を図１３～図１４に示す。
【0197】
図１３には、Ｓ１サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ１とした４７－１２－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－１とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミドを用いたとき（図７の（ｂ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－１）範囲内の各Ｃ（Ｃ１８、１９、２１、２２、２５、２８、３１、３２）におけるＴの割合を示す。
【0198】
図１４には、Ｓ２サイトにおいて、ＴＡＬＥをＴＡＬＥ－Ｓ２とした４７－１０４－ＡＩＤについて、ガイドＲＮＡをｇＲＮＡ－ＩＢ－２とし、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群発現プラスミドとしてＴｙｐｅＩ－ＢのＣａｓタンパク質群を発現するプラスミド及びＮＬＳ－Ｃａｓ８ｂ２－ＳＳＵ２発現プラスミドを用いたとき（図７の（ｃ）、図１Ａの（ｂ）の態様）の、標的（ｃｒＤＮＡ－ＩＢ－２）範囲内の各Ｃ（Ｃ１９、２１、２７、２８、３０）におけるＴの割合を示す。
【0199】
図１３～図１４に示したように、いずれのターゲットサイトにおいても、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群が存在しない場合（ｗ／ｏ）はほとんど塩基編集が確認されなかった。一方、タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群の存在下では、どちらのターゲットサイトでも塩基編集が起きた。Ｓ１サイト及びＳ２サイトにおける最大塩基編集効率（Ｔの割合）は２３％及び２４％であった。また、ＴＡＬＥ－デアミナーゼは、ターゲットであるＨＢＢ遺伝子に対して塩基編集活性を示したが、相同性は高いが、ターゲットではないＨＢＤ遺伝子に対しては、ほとんど塩基編集活性を示さなかった。したがって、サブタイプＩ－ＢのＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムとＴＡＬＥ－デアミナーゼとの共発現システムによれば、上記のサブタイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムとＴＡＬＥ－デアミナーゼとの共発現システムと同様に、高い特異性で標的ＤＮＡの編集を行うことができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【0200】
以上説明したように、本発明によれば、特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムを提供することが可能となる。そのため、本発明は、高い編集効率と共に高い安全性が求められる遺伝子編集治療などの分野での利活用が期待される。
【符号の説明】
【0201】
１１…ＤＮＡ結合ドメイン認識配列、１２…スペーサー１、２０…融合タンパク質、２１…核酸塩基変換酵素、２２…ＤＮＡ結合ドメイン、３０…タイプＩ－Ｃａｓタンパク質群、３１…Ｃａｓ５タンパク質（Ｃｓｙ２タンパク質）、３２…Ｃａｓ６タンパク質（Ｃｓｙ４タンパク質）、３３…Ｃａｓ７タンパク質（Ｃｓｙ３タンパク質）、３４…Ｃａｓ８タンパク質（Ｃｓｙ１タンパク質）、４０…ガイドＲＮＡ。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】