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特開2023-150669担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023150669
(43)【公開日】2023-10-16
(54)【発明の名称】担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20231005BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20231005BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19 ZNA
C12N15/54
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022059891
(22)【出願日】2022-03-31
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター、イノベーション創出強化研究推進事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(71)【出願人】
【識別番号】504132881
【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100196405
【弁理士】
【氏名又は名称】小松 邦光
(72)【発明者】
【氏名】田中 瑞己
(72)【発明者】
【氏名】北本 宏子
(72)【発明者】
【氏名】田中 拓未
(72)【発明者】
【氏名】三浦 敦宏
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065CA29
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】本発明は、Ｐ．アンタクティカなどの担子菌酵母において、炭素カタボライト抑制を低減させた変異体を提供することを目的としている。
【解決手段】本発明は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母に関している。また、本発明は、担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む方法にも関している。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母に関している。また、本発明は、担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む方法にも関している。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母。
【請求項2】
シュードザイマ属の菌である、請求項１に記載の担子菌酵母。
【請求項3】
前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、請求項１又は２に記載の担子菌酵母。
【請求項4】
前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
【請求項5】
前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、請求項４に記載の担子菌酵母。
【請求項6】
キシロース誘導性プロモーターと、その下流に続く目的のタンパク質をコードする塩基配列とをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
【請求項7】
担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む、方法。
【請求項8】
前記担子菌酵母が、シュードザイマ属の菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記抑制工程が、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入する工程を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物はタンパク質を生産するために使用されている。一般的には、遺伝子の発現を促すプロモーター配列の下流に目的のタンパク質をコードする遺伝子を連結して作製した組換え遺伝子を、微生物に導入して培養することにより、当該目的のタンパク質を取得する。これまでに実用化されている微生物を宿主に用いたタンパク質発現系には、原核微生物を用いる系と、真核微生物を用いる系があり、前者においては、大腸菌、ブレビバチルス、及びコリネバクテリウムなど、多様な原核微生物が使用されている。一方、後者においては、出芽酵母又は麹菌、あるいはシュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）などの担子菌酵母（特許文献１及び２並びに非特許文献１）を、目的のタンパク質の生産のために使用することが知られている。
【0003】
また、微生物の培地中にグルコースなどの代謝されやすい炭素源があるときに、他の代謝されにくい炭素源（キシロースなど）の分解系の遺伝子発現を抑制する機構を炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）という。このＣＣＲに関して、グルコースの構造アナログである２－デオキシグルコース（２ＤＧ）は、グルコースによる抑制に対して抵抗性の変異の選択のために用いられている（非特許文献２）。そして、非特許文献３には、出芽酵母においてはヘキソキナーゼの１種であるＨxｋ２が、麹菌においてはグルコキナーゼが、それぞれＣＣＲを制御している旨が記載されており、特許文献３には、ＣｒｅＡ及びＣｒｅＢが麹菌などの糸状菌のＣＣＲを制御している旨が記載されている。他方、担子菌酵母のＣＣＲを制御する酵素については、いずれの文献にも記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２０１４／１０９３６０号
【特許文献2】特開２０１８－１５７８１４号公報
【特許文献3】特開２０１５－３９３４９号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Sameshima-Yamashita Y, et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2019), 83:8, 1547-1556
【非特許文献2】McCartney et al., Genetics (2014), 198: 635-646
【非特許文献3】田中瑞己, 生物工学 (2020), Vol. 98, No. 4, pp. 186-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
Ｐ．アンタクティカ由来のキシロース誘導性プロモーター（キシラナーゼプロモーター）は、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥなどのタンパク質を、Ｐ．アンタクティカによって生産するために使用されているが、安価な炭素源であるグルコースを含む培地ではＣＣＲによりプロモーター機能が制限されてしまう。そこで、本発明は、Ｐ．アンタクティカなどの担子菌酵母において、ＣＣＲが緩和された変異体を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、担子菌酵母のグルコキナーゼがＣＣＲを制御していることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法を提供するものである。
〔１〕グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母。
〔２〕シュードザイマ属の菌である、前記〔１〕に記載の担子菌酵母。
〔３〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の担子菌酵母。
〔４〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔５〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔４〕に記載の担子菌酵母。
〔６〕キシロース誘導性プロモーターと、その下流に続く目的のタンパク質をコードする塩基配列とをさらに含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔７〕担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む、方法。
〔８〕前記担子菌酵母が、シュードザイマ属の菌である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記抑制工程が、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入する工程を含む、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１〕グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母。
〔２〕シュードザイマ属の菌である、前記〔１〕に記載の担子菌酵母。
〔３〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の担子菌酵母。
〔４〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔５〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔４〕に記載の担子菌酵母。
〔６〕キシロース誘導性プロモーターと、その下流に続く目的のタンパク質をコードする塩基配列とをさらに含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔７〕担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む、方法。
〔８〕前記担子菌酵母が、シュードザイマ属の菌である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記抑制工程が、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入する工程を含む、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔１１〕に記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明に従えば、担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入することにより、当該担子菌酵母のＣＣＲを緩和することができる。したがって、安価なグルコースを炭素源とすることが可能となり、組換えタンパク質の製造コストの低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）含有平板寒天培地上に形成されたコロニー及びクリアゾーンの写真を示す。
【図2】ＰＢＳＡ含有平板寒天培地上に形成されたコロニー及びクリアゾーンの写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の担子菌酵母は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含んでいる。本明細書に記載の「グルコキナーゼ」とは、グルコースからグルコース－６－リン酸へのリン酸化を促進する酵素である。本明細書に記載の「機能低下型変異」とは、グルコキナーゼのタンパク質としての発現を低下させたり、グルコースのリン酸化促進活性が低下したグルコキナーゼ変異体を発現させたりすることにより、前記担子菌酵母においてグルコキナーゼとしての機能の低下を引き起こす変異のことをいう。ある態様では、前記機能低下型変異は、グルコキナーゼの機能を実質的に失う機能喪失型変異であってもよい。前記機能喪失型変異としては、特に限定されないが、例えば、グルコキナーゼのタンパク質の発現が失われるような変異（スプライシング異常、フレームシフト変異、又は遺伝子の一部若しくは全体の欠失、あるいは遺伝子破壊など）であってもいいし、タンパク質としては発現するがグルコキナーゼとしての機能が失われるような変異（活性部位でのアミノ酸置換を伴う変異など）であってもよい。
本発明の担子菌酵母は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含んでいる。本明細書に記載の「グルコキナーゼ」とは、グルコースからグルコース－６－リン酸へのリン酸化を促進する酵素である。本明細書に記載の「機能低下型変異」とは、グルコキナーゼのタンパク質としての発現を低下させたり、グルコースのリン酸化促進活性が低下したグルコキナーゼ変異体を発現させたりすることにより、前記担子菌酵母においてグルコキナーゼとしての機能の低下を引き起こす変異のことをいう。ある態様では、前記機能低下型変異は、グルコキナーゼの機能を実質的に失う機能喪失型変異であってもよい。前記機能喪失型変異としては、特に限定されないが、例えば、グルコキナーゼのタンパク質の発現が失われるような変異（スプライシング異常、フレームシフト変異、又は遺伝子の一部若しくは全体の欠失、あるいは遺伝子破壊など）であってもいいし、タンパク質としては発現するがグルコキナーゼとしての機能が失われるような変異（活性部位でのアミノ酸置換を伴う変異など）であってもよい。
【0011】
背景技術の項で上述したように、出芽酵母ではＨｘｋ２がＣＣＲを制御していること、及び、麹菌ではグルコキナーゼ、又はＣｒｅＡ及びＣｒｅＢがＣＣＲを制御していることが知られており（非特許文献３及び特許文献３を参照）、ＣＣＲを制御しているタンパク質は、微生物の種類によって異なっている。すなわち、グルコキナーゼのＣＣＲへの関与は、特定の微生物においてしか知られておらず、またグルコキナーゼ以外にもＣＣＲを制御するタンパク質は知られていたので、出芽酵母とも麹菌とも異なる担子菌酵母においてＣＣＲを制御しているタンパク質を特定することは困難であった。本発明では、意外なことに、担子菌酵母においてはグルコキナーゼがＣＣＲに関与していること、及び、グルコキナーゼの機能を低下させることがＣＣＲの緩和に十分であることが明らかになった。
【0012】
グルコキナーゼ遺伝子は、担子菌酵母の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、担子菌酵母であるＰ．アンタクティカのグルコキナーゼ遺伝子（ＰａＧＬＫ１遺伝子）は、配列番号１で示される以下の配列を有している。すなわち、ある態様では、前記グルコキナーゼ遺伝子は、以下の配列番号１で示される塩基配列（小文字はイントロン）を含む遺伝子又はそのホモログであってもよい。
【0013】
本発明の担子菌酵母の種類は、特に限定されないが、例えば、Ｐ．アンタクティカ、Ｐ．アフィディス、Ｐ．ルグローサ、Ｐ．パラアンタクティカ、Ｐ．グラミニコラ、Ｐ．ツクバエンシス、Ｐ．フロキュロッサ、Ｐ．ヒューピエンシス、及びＰ．シャンシエンシスなどのシュードザイマ属の菌であってもよい。なお、Ｐ．アンタクティカは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌（酵母）の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素（ＰａＥ）などを産生し得るものである。最近の分類変更により、Ｐ．アンタクティカは、モエスジオマイセス・アンタクティクス（Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）と呼ばれることもある。
【0014】
特定の糖の存在により活性化するプロモーター、例えば、キシロースで活性化するキシラナーゼプロモーター及びＰａＥプロモーターなどのキシロース誘導性プロモーターや、セルロースで活性化するセルラーゼプロモーターなどは、目的のタンパク質の発現のために利用されているが、グルコースの存在下ではＣＣＲにより活性が抑制される。本発明の担子菌酵母においては、ＣＣＲが緩和されているため、たとえ培養する菌の炭素源としてグルコースを使用していても、前記キシロース誘導性プロモーターなどの特定の糖の存在により活性化するプロモーターを利用して、効率的に目的のタンパク質を生産することができる。すなわち、ある態様では、前記担子菌酵母は、キシロース誘導性プロモーターをさらに含んでもよく、任意で、当該キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含んでもよい。前記目的のタンパク質は、特に限定されないが、例えば、ＰａＥであってもよい。
【0015】
本発明の担子菌酵母は、本発明の目的を損なわない限り、任意の変異をさらに含んでもよく、ＣＣＲを低減するための別の処理をさらに受けたものであってもよい。
【0016】
別の態様では、本発明は、担子菌酵母のＣＣＲを低減する方法にも関しており、当該方法は、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含んでいる。前記グルコキナーゼの機能を抑制する手段は、特に制限されないが、例えば、前記担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子への機能低下型変異（例えば機能喪失型変異）の導入、前記担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子の発現抑制（例えばＲＮＡｉなど）、又は、前記担子菌酵母の培地中へのグルコキナーゼ阻害剤（例えば抗体又はＤ－マンノヘプツロースなど）の添加などであってもよい。
【0017】
本発明のＣＣＲを低減する方法は、本発明の目的を損なわない限り、任意の操作工程をさらに含んでもよく、別の手段によりＣＣＲを低減する工程をさらに含んでもよい。その余の点については、本発明の担子菌酵母について上述したとおりである。
【0018】
また別の態様では、本発明は、目的のタンパク質の生産方法にも関しており、当該方法は、
（１－１）グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含み、かつ、キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意する工程、又は、
（１－２）キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意し、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程と、
（２）前記担子菌酵母を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記工程（２）で用いる担子菌酵母においては、ＣＣＲが緩和されているため、培養時の炭素源としてグルコースを採用することができる。すなわち、ある態様では、前記培養工程は、前記担子菌酵母をグルコース存在下で培養する工程を含んでもよい。
（１－１）グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含み、かつ、キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意する工程、又は、
（１－２）キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意し、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程と、
（２）前記担子菌酵母を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記工程（２）で用いる担子菌酵母においては、ＣＣＲが緩和されているため、培養時の炭素源としてグルコースを採用することができる。すなわち、ある態様では、前記培養工程は、前記担子菌酵母をグルコース存在下で培養する工程を含んでもよい。
【0019】
本発明の生産方法は、本発明の目的を損なわない限り、任意の操作工程をさらに含んでもよく、別の手段によりＣＣＲを低減する工程をさらに含んでもよい。その余の点については、本発明の担子菌酵母及び本発明のＣＣＲを低減する方法について上述したとおりである。
【0020】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例0021】
１．炭素カタボライト抑制が解除された変異株の取得
炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）が解除される変異を見出すため、Ｐ．アンタクティカのウラシル要求性自然変異株（ＰＧＢ３７１株）に紫外線を照射し、グルコースの構造アナログである２－デオキシグルコース（２ＤＧ）を含むキシロース培地で生育可能な菌株を選抜した。２ＤＧは細胞内においてリン酸化されて２ＤＧ－６－リン酸を生じるが、これは炭素源として代謝されないだけでなく、ＣＣＲを引き起こすことで他の炭素源の代謝を阻害する。そのため、２ＤＧを含むキシロース培地では、炭素カタボライト抑制が解除された株のみが生育可能である。具体的には、０．１％の２ＤＧを添加したキシロース培地で生育可能なＰＧＢ３７１株の変異株を選抜し、ＣＣＲが緩和されているか否かを調べた。野生型Ｐ．アンタクティカでは、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥの遺伝子（ＰａＥプロモーターの制御下）の発現がＣＣＲを受けることから、グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン、１％グルコース、及び１％キシロース寒天培地）に２ＤＧ耐性株を植菌し、ＰＢＳＡの分解によって生じる透明の領域（クリアゾーン）の形成を比較した。なお、ＰＢＳＡ含有平板寒天培地については、要すれば特許文献２を参照されたい。
炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）が解除される変異を見出すため、Ｐ．アンタクティカのウラシル要求性自然変異株（ＰＧＢ３７１株）に紫外線を照射し、グルコースの構造アナログである２－デオキシグルコース（２ＤＧ）を含むキシロース培地で生育可能な菌株を選抜した。２ＤＧは細胞内においてリン酸化されて２ＤＧ－６－リン酸を生じるが、これは炭素源として代謝されないだけでなく、ＣＣＲを引き起こすことで他の炭素源の代謝を阻害する。そのため、２ＤＧを含むキシロース培地では、炭素カタボライト抑制が解除された株のみが生育可能である。具体的には、０．１％の２ＤＧを添加したキシロース培地で生育可能なＰＧＢ３７１株の変異株を選抜し、ＣＣＲが緩和されているか否かを調べた。野生型Ｐ．アンタクティカでは、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥの遺伝子（ＰａＥプロモーターの制御下）の発現がＣＣＲを受けることから、グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン、１％グルコース、及び１％キシロース寒天培地）に２ＤＧ耐性株を植菌し、ＰＢＳＡの分解によって生じる透明の領域（クリアゾーン）の形成を比較した。なお、ＰＢＳＡ含有平板寒天培地については、要すれば特許文献２を参照されたい。
【0022】
大きなクリアゾーンを形成した７株を選抜し、グルコース及びキシロースを炭素源とした液体培地で培養し、炭素カタボライト抑制を受けるキシラナーゼの生産量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより比較した。その結果、グルコースが存在してもキシラナーゼの生産量が低下しない２ＤＧｒ２株及び２ＤＧｒ３株の２株をＣＣＲ解除株として選抜した。
【0023】
２．ＣＣＲ解除株におけるキシラナーゼプロモーターの働き
ＣＣＲの影響を受けることが知られているキシラナーゼプロモーターが、ＣＣＲ解除株ではグルコース存在下でも機能するかどうか確認するため、Ｐ．アンタクティカのＰａＥ遺伝子をレポーター遺伝子とする試験系を構築した。具体的には、キシラナーゼプロモーター、ＰａＥ遺伝子（ＰａＣＬＥ１）、その上流配列及び下流配列、遺伝子導入の選抜マーカーとしてＰ．アンタクティカのＵｒａ３遺伝子（ウラシルなどのピリミジン合成経路の遺伝子ＰａＵＲＡ３）、その上流配列及び下流配列、並びに、キシラナーゼターミネーターを組み合わせて、次の二種類のＰａＥ発現カセットを作製した。
＊ＰａＥ発現カセット１の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子（マーカー）］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
＊ＰａＥ発現カセット２の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子上流配列］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＵｒａ３遺伝子下流配列］－３’
ＣＣＲの影響を受けることが知られているキシラナーゼプロモーターが、ＣＣＲ解除株ではグルコース存在下でも機能するかどうか確認するため、Ｐ．アンタクティカのＰａＥ遺伝子をレポーター遺伝子とする試験系を構築した。具体的には、キシラナーゼプロモーター、ＰａＥ遺伝子（ＰａＣＬＥ１）、その上流配列及び下流配列、遺伝子導入の選抜マーカーとしてＰ．アンタクティカのＵｒａ３遺伝子（ウラシルなどのピリミジン合成経路の遺伝子ＰａＵＲＡ３）、その上流配列及び下流配列、並びに、キシラナーゼターミネーターを組み合わせて、次の二種類のＰａＥ発現カセットを作製した。
＊ＰａＥ発現カセット１の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子（マーカー）］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
＊ＰａＥ発現カセット２の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子上流配列］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＵｒａ３遺伝子下流配列］－３’
【0024】
ＰａＥ発現カセット１を、ＣＣＲ解除株として選抜した２ＤＧｒ２株及び２ＤＧｒ３株に、ウラシル要求性相補を指標として常法によりランダムに導入した。これらを、グルコースを含むＰＢＳＡ含有寒天培地に植菌し、最も大きなクリアゾーンを形成する形質転換体をそれぞれ１株ずつ選抜した（２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株）。また、コントロール用に、ＰａＥ発現カセット２を１コピー有するＣＣＲが解除されていないコントロール株（ｄｎＵ株）を作製した。具体的には、野生型Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のＰａＥ遺伝子上流配列、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉのＴＥＦ１プロモーターとターミネーターの間にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉのｎａｔ１を挿入したＮｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子、ＰａＥ遺伝子下流配列を組合せたＤＮＡカセットをＧＢ－４（０）株に導入し、相同組換えにより染色体上のＰａＥ遺伝子をＮｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子と置換した株を、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性によって選抜を行った。次に、染色体上のＵＲＡ３遺伝子をＰａＥ発現カセット２で置換して１コピーのＰａＥ発現カセットを組み込み、５’－ＦＯＡ（５’－フルオロオロチン酸）耐性を指標としてウラシル要求性となった株を選抜し、ＰＧＢ８１７株を得た。上記の手順で作製されたＰＧＢ８１７株を宿主として、染色体上のＮｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子をＰａＵｒａ３遺伝子と置換し、ウラシル要求性相補によって選抜を行い、得られた株をｄｎＵ株とした。そして、２ＤＧｒ２－３株、２ＤＧｒ３－２株、及びｄｎＵ株を、炭素源の異なる以下の３種類の液体培地でそれぞれ４８時間培養した。
（１）８質量％キシロース（８Ｘ）
（２）４質量％キシロース＋４質量％グルコース（４Ｘ４Ｇ）
（３）１質量％キシロース＋７質量％グルコース（１Ｘ７Ｇ）
（１）８質量％キシロース（８Ｘ）
（２）４質量％キシロース＋４質量％グルコース（４Ｘ４Ｇ）
（３）１質量％キシロース＋７質量％グルコース（１Ｘ７Ｇ）
【0025】
（ＰａＥ活性の測定方法）
ＰａＥ活性は、その生分解性プラスチック分解活性に基づき、非特許文献１に記載の方法を一部改良したＰａＥ活性測定法によって評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）８～９μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）７５μＬ、及び滅菌水５６～５７μＬと、９６穴マイクロプレート（プロテオセーブ(R)ＳＳ、住友ベークライト株式会社製）中で混合してＯＤ６６０（濁度）が０．８となる１５０μＬの反応液を調製し、ディープウェルプレートミキサーを用いて３０℃、９００ｒｐｍで振盪した。そして、反応後のＯＤ６６０（濁度）を測定して単位時間当たりの濁度減少量を測定し、１分間に反応溶液のＯＤ６６０を１減少させる酵素活性を１Ｕ／ｍＬと定義し、ＰａＥ活性値を算出した。その結果を表１に示す。なお、括弧内は８質量％キシロースを含む液体培地で培養したときの培養上清の活性値を基準とした相対活性を示す。
ＰａＥ活性は、その生分解性プラスチック分解活性に基づき、非特許文献１に記載の方法を一部改良したＰａＥ活性測定法によって評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）８～９μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）７５μＬ、及び滅菌水５６～５７μＬと、９６穴マイクロプレート（プロテオセーブ(R)ＳＳ、住友ベークライト株式会社製）中で混合してＯＤ６６０（濁度）が０．８となる１５０μＬの反応液を調製し、ディープウェルプレートミキサーを用いて３０℃、９００ｒｐｍで振盪した。そして、反応後のＯＤ６６０（濁度）を測定して単位時間当たりの濁度減少量を測定し、１分間に反応溶液のＯＤ６６０を１減少させる酵素活性を１Ｕ／ｍＬと定義し、ＰａＥ活性値を算出した。その結果を表１に示す。なお、括弧内は８質量％キシロースを含む液体培地で培養したときの培養上清の活性値を基準とした相対活性を示す。
【0026】
【表1】
【0027】
ＣＣＲが解除されていないコントロールのｄｎＵ株は、８Ｘ培地ではＰａＥを産生することができるものの、４Ｘ４Ｇ培地では培地中のＰａＥ活性（すなわちＰａＥの産生量）は低下し、１Ｘ７Ｇ培地では８Ｘ培地と比較して７５％以上低下した。これに対して、２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株は、炭素源が変わっても同じようにＰａＥを産生することができた。しかも、２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株には上記ＰａＥ発現カセットが複数コピー導入されているため、培地中のＰａＥ活性（すなわちＰａＥの産生量）が全体的に高かった。このことから、ＣＣＲ解除株を用いれば、グルコースを高濃度に含む培地においてもキシラナーゼプロモーターにより、その下流に挿入した遺伝子を高い効率で発現させることができることが示された。
【0028】
３．ＣＣＲの解除に寄与する変異遺伝子の同定
（１）変異体の遺伝子のシーケンシング
出芽酵母では、ヘキソキナーゼの１種であるＨｘｋ２遺伝子の変異体で炭素カタボライト抑制が解除されることが知られている（非特許文献３）。そこで、Ｐ．アンタクティカＪＣＭ１０３１７株のゲノム上を探索すると、出芽酵母のＨｘｋ２のアミノ酸配列と相同性を示す配列が２つ存在していることが分かった。ＸＰ＿０１４６５３６７６．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２のアミノ酸配列に対して４４％の同一性を示し、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１は３６％の同一性を示す。ＸＰ＿０１４６５６５０２．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２よりも出芽酵母のグルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）とより高い同一性（３９％）を示すため、ＸＰ＿０１４６５３６７６．１をＰａＨＸＫ１、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１をＰａＧＬＫ１と命名した。２ＤＧｒ２株と２ＤＧｒ３株におけるこれらの遺伝子配列を調べた結果、いずれもＰａＨｘｋ１遺伝子には変異が存在せず、ＰａＧｌｋ１遺伝子に変異が存在していることが分かった。具体的な変異は以下のとおりだった。
（１）変異体の遺伝子のシーケンシング
出芽酵母では、ヘキソキナーゼの１種であるＨｘｋ２遺伝子の変異体で炭素カタボライト抑制が解除されることが知られている（非特許文献３）。そこで、Ｐ．アンタクティカＪＣＭ１０３１７株のゲノム上を探索すると、出芽酵母のＨｘｋ２のアミノ酸配列と相同性を示す配列が２つ存在していることが分かった。ＸＰ＿０１４６５３６７６．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２のアミノ酸配列に対して４４％の同一性を示し、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１は３６％の同一性を示す。ＸＰ＿０１４６５６５０２．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２よりも出芽酵母のグルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）とより高い同一性（３９％）を示すため、ＸＰ＿０１４６５３６７６．１をＰａＨＸＫ１、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１をＰａＧＬＫ１と命名した。２ＤＧｒ２株と２ＤＧｒ３株におけるこれらの遺伝子配列を調べた結果、いずれもＰａＨｘｋ１遺伝子には変異が存在せず、ＰａＧｌｋ１遺伝子に変異が存在していることが分かった。具体的な変異は以下のとおりだった。
【0029】
【表2】
【0030】
（２）ＰａＧｌｋ１遺伝子の破壊
ＰａＧｌｋ１のＣＣＲへの関与を調べるため、ＰａＥ発現カセットが１コピー導入されているＰＧＢ８１７株のＰａＧｌｋ１遺伝子を常法によりＰａＵｒａ３遺伝子に置換することで、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を作製した。そして、コントロール株（ｄｎＵ株）又はＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を、８質量％のグルコースを含む培地で２４時間培養した後、培地量に対して１質量％のキシロース及び３質量％のグルコースを新たに添加してさらに２４時間培養し、その培養上清中のＰａＥ活性を上記項目２と同様にして測定した。その結果、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株では、コントロール株と比較してＰａＥ活性が増加した（表３）。このことから、ＰａＧＬＫ１がＣＣＲに関与していることが示された。
ＰａＧｌｋ１のＣＣＲへの関与を調べるため、ＰａＥ発現カセットが１コピー導入されているＰＧＢ８１７株のＰａＧｌｋ１遺伝子を常法によりＰａＵｒａ３遺伝子に置換することで、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を作製した。そして、コントロール株（ｄｎＵ株）又はＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を、８質量％のグルコースを含む培地で２４時間培養した後、培地量に対して１質量％のキシロース及び３質量％のグルコースを新たに添加してさらに２４時間培養し、その培養上清中のＰａＥ活性を上記項目２と同様にして測定した。その結果、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株では、コントロール株と比較してＰａＥ活性が増加した（表３）。このことから、ＰａＧＬＫ１がＣＣＲに関与していることが示された。
【0031】
【表3】
【0032】
（３）変異ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入
ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株において、ＰａＵｒａ３遺伝子を、常法により２ＤＧｒ２株の変異ＰａＧｌｋ１遺伝子と置換し、変異ＰａＧＬＫ１導入株を作製した。また、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株のＰａＵｒａ３遺伝子を常法により除去することでＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株を作製した。ＰＧＢ８１７株、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株、及び変異ＰａＧＬＫ１導入株は、ＰａＵｒａ３遺伝子を含まないウラシル要求性変異株であって、ＰａＥ発現カセットを１コピー有しているという点で共通の遺伝的バックグラウンドを有している一方、野生型ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているか、ＰａＧｌｋ１遺伝子を有していないか、又は変異ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているという点でのみ相違している。これらの３種類の菌株を、２質量％キシロースを含む（グルコースを含まない）ＰＢＳＡ含有平板寒天培地（２Ｘ）又は１％キシロース及び１質量％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（１Ｘ１Ｇ）にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図１に示し、各直径の測定結果を表４に示す。
ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株において、ＰａＵｒａ３遺伝子を、常法により２ＤＧｒ２株の変異ＰａＧｌｋ１遺伝子と置換し、変異ＰａＧＬＫ１導入株を作製した。また、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株のＰａＵｒａ３遺伝子を常法により除去することでＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株を作製した。ＰＧＢ８１７株、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株、及び変異ＰａＧＬＫ１導入株は、ＰａＵｒａ３遺伝子を含まないウラシル要求性変異株であって、ＰａＥ発現カセットを１コピー有しているという点で共通の遺伝的バックグラウンドを有している一方、野生型ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているか、ＰａＧｌｋ１遺伝子を有していないか、又は変異ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているという点でのみ相違している。これらの３種類の菌株を、２質量％キシロースを含む（グルコースを含まない）ＰＢＳＡ含有平板寒天培地（２Ｘ）又は１％キシロース及び１質量％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（１Ｘ１Ｇ）にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図１に示し、各直径の測定結果を表４に示す。
【0033】
【表4】
【0034】
野生型ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているＰＧＢ８１７株は、グルコースを含まない培地ではクリアゾーンを形成し、グルコースを含む培地ではクリアゾーンを形成しなかったのに対し、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株及び変異ＰａＧＬＫ１導入株は、グルコースの有無にかかわらず、いずれの培地でもクリアゾーンを形成した。このように、ＰａＧｌｋ１遺伝子の破壊によって解除されたＣＣＲは変異ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入によっては回復しなかったことから、変異ＰａＧｌｋ１遺伝子は機能を喪失していることが示された。
【0035】
また、ＰＧＢ８１７株、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株、及び変異ＰａＧＬＫ１導入株を、８質量％のグルコースを含む培地で２４時間培養した後、遠心分離により培地を除き、各菌体を４質量％キシロースを含む液体培地（４Ｘ）又は１質量％キシロース及び３質量％グルコースを含む液体培地（１Ｘ３Ｇ）に移し替え、さらに２４時間培養した。そして、上記項目２と同様にして、各培養上清のＰａＥ活性を測定した。結果を表５に示す。なお、括弧内は４質量％キシロースの液体培地で培養したときの培養上清の活性値を基準とした相対活性を示す。
【0036】
【表5】
【0037】
固体培養のときと同様に、液体培養においても、ＰａＧｌｋ１遺伝子の破壊によってＣＣＲが解除され、この状態は変異ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入によっては回復しないことが確認された。
【0038】
（４）正常ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入
２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株に対して、常法により正常なＰａＧｌｋ１遺伝子を導入して、正常ＰａＧＬＫ１再導入株を作製した。２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株並びにこれらの正常ＰａＧＬＫ１再導入株を、４％キシロース及び４％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図２に示す。
２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株に対して、常法により正常なＰａＧｌｋ１遺伝子を導入して、正常ＰａＧＬＫ１再導入株を作製した。２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株並びにこれらの正常ＰａＧＬＫ１再導入株を、４％キシロース及び４％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図２に示す。
【0039】
２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株（親株Ｐ）は、明確なクリアゾーンを形成したが、これらの正常ＰａＧＬＫ１再導入株（＋ＰａＧＬＫ１）は、クリアゾーンをほとんど形成しなかった。すなわち、正常ＰａＧＬＫ１再導入株は、グルコース存在下ではＰａＥを産生することができず、ＰＢＳＡ分解活性が低下した。このことから、２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株のＰａＥ高生産能は、ＰａＧｌｋ１遺伝子の変異に起因することが示された。
【0040】
以上より、担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入することにより、当該担子菌酵母のＣＣＲを低減することができることが分かった。したがって、安価なグルコースを炭素源とすることが可能となり、組換えタンパク質の製造コストの低減を図ることができる。
【図1】
【図2】
【配列表】