特開 2023-38023 ＤＮＡを二本鎖切断するヌクレアーゼドメイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023038023

(43)【公開日】2023-03-16

(54)【発明の名称】ＤＮＡを二本鎖切断するヌクレアーゼドメイン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20230309BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230309BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/16 Z ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 100

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021144906

(22)【出願日】2021-09-06

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(71)【出願人】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】佐久間 哲史

(72)【発明者】

【氏名】山本 卓

(72)【発明者】

【氏名】西堀 奈穂子

(72)【発明者】

【氏名】吉間 忠彦

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC05

4B050DD02

4B050HH01

4B050LL03

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】 ＤＮＡを効率的に二本鎖切断することが可能なヌクレアーゼドメインを提供すること。
【解決手段】 リンカーを介して連結させた２つのＮＤ１を、部位特異的ＤＮＡ切断酵素のヌクレアーゼドメインとして用いたところ、ＤＮＡ上の標的部位を効率的に二本鎖切断することを見出した。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リンカーを介して結合した２つのヌクレアーゼドメイン１を含む、融合ヌクレアーゼドメイン。

【請求項2】

ＤＮＡ結合ドメインおよび請求項１に記載の融合ヌクレアーゼドメインを含む、部位特異的ＤＮＡ切断酵素。

【請求項3】

請求項１に記載の融合ヌクレアーゼドメインまたは請求項２に記載の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸。

【請求項4】

請求項３に記載の核酸またはその翻訳産物を含むベクター。

【請求項5】

下記（ａ）～（ｃ）から選択される分子を細胞に導入することを含む、標的ＤＮＡが改変された細胞を製造する方法。
（ａ）請求項２に記載の部位特異的ＤＮＡ切断酵素
（ｂ）（ａ）の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸
（ｃ）（ｂ）に記載の核酸またはその翻訳産物を含むベクター

【請求項6】

下記（ａ）～（ｃ）から選択される分子を含む、標的ＤＮＡの改変のためのキット。
（ａ）請求項２に記載の部位特異的ＤＮＡ切断酵素
（ｂ）（ａ）の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸
（ｃ）（ｂ）に記載の核酸またはその翻訳産物を含むベクター

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＮＡを二本鎖切断するヌクレアーゼドメインに関し、より詳しくは、リンカーを介して結合した２つのヌクレアーゼドメイン１（ＮＤ１）を含む融合ヌクレアーゼドメイン、およびその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

２０１０年に第二世代ゲノム編集技術として開発された人工の制限酵素であるＴＡＬＥＮによるＤＮＡの２本鎖切断には、タイプＩＩＳ制限酵素のＦｏｋＩの非特異的ＤＮＡ切断ドメインの２量体形成が必要であり、ＴＡＬＥＮ技術では、一組の対合するＴＡＬＥリピートを必要とする。一組のＴＡＬＥＮは合わせて３０－４０塩基の標的配列を認識して切断することから、切断の特異性が極めて高く、オフターゲットの発生を強く抑制する優れたゲノム編集技術である。しかしながら、１００ｋＤａ以上の巨大分子である２分子のＴＡＬＥＮを同時に細胞に発現させる、あるいは同量のＴＡＬＥＮ蛋白質を細胞に導入する困難さと、その作製に必要な労力から、ＴＡＬＥＮに代わり２０１２年に発表されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が急速に普及した。

【0003】

その一方で、ＴＡＬＥＮ分子の改良研究も継続され、高活性型ＴＡＬＥであるＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥの開発を始めとし、種々の派生技術が生み出されている。その中に、２個のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを連結し（ｓｃＦｏｋＩ）、ジンクフィンガーやＴＡＬＥに結合させて二本鎖切断を誘導した報告がある（非特許文献１、２）。この技術により、ＴＡＬＥＮによる標的配列の切断において一組のＴＡＬＥを用いる必要がなくなった。しかしながら、ｓｃＦｏｋＩは切断活性が低く、ヒト細胞での効率的なゲノム編集は困難であり、さらなる改良が必要であった。

【0004】

なお、本発明者らは、従来のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとは異なる、新規な２つのヌクレアーゼドメイン（ヌクレアーゼドメイン１；ＮＤ１、およびヌクレアーゼドメイン２；ＮＤ２）を開発し、これらヌクレアーゼドメインをＺＦまたはＴＡＬＥと融合し、一組のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮとして利用することにより、標的部位のゲノム編集に成功している（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開２０２０／０４５２８１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｍｉｎｃｚｕｋ ｅｔ ａｌ （２００８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３６（１２）， ３９２６－３９３８

【非特許文献2】Ｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４０（３－４）， １５６－１６１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＤＮＡを簡便かつ効率的に二本鎖切断することが可能なヌクレアーゼドメインを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、リンカーを介して連結させた２つのＮＤ１を、部位特異的ＤＮＡ切断酵素（一例としてＴＡＬＥＮ）のヌクレアーゼドメインとして用いたところ、ＤＮＡ上の標的部位を効率的に二本鎖切断することを見出した。その一方、ヌクレアーゼドメインとして、リンカーを介して連結させた２つのＮＤ２を用いた場合、および、リンカーを介して連結させた２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを用いた場合には、ＮＤ１のような二本鎖切断は認められなかった。これら事実から、連結させたＮＤ１のＤＮＡに対する優れた二本鎖切断活性は、ヌクレアーゼドメインに共通の事象ではなく、ＮＤ１特有の作用であることが判明した。

【0009】

また、本発明者らは、ＮＤ１とＮＤ１の間のリンカー配列の検討を行った結果、リンカー配列の種類や鎖長を調整することにより、二本鎖切断活性をさらに高めることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

従って、本発明は、リンカーを介して結合した２つのＮＤ１を含む融合ヌクレアーゼドメイン、およびその利用に関し、より詳しくは、以下を提供するものである。

【0011】

（１）リンカーを介して結合した２つのヌクレアーゼドメイン１を含む、融合ヌクレアーゼドメイン。

【0012】

（２）ＤＮＡ結合ドメインおよび（１）に記載の融合ヌクレアーゼドメインを含む、部位特異的ＤＮＡ切断酵素。

【0013】

（３）（１）に記載の融合ヌクレアーゼドメインまたは（２）に記載の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸。

【0014】

（４）（３）に記載の核酸またはその翻訳産物を含むベクター。

【0015】

（５）下記（ａ）～（ｃ）から選択される分子を細胞に導入することを含む、標的ＤＮＡが改変された細胞を製造する方法。
（ａ）（２）に記載の部位特異的ＤＮＡ切断酵素
（ｂ）（ａ）の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸
（ｃ）（ｂ）に記載の核酸またはその翻訳産物を含むベクター

【0016】

（６）下記（ａ）～（ｃ）から選択される分子を含む、標的ＤＮＡの改変のためのキット。
（ａ）（２）に記載の部位特異的ＤＮＡ切断酵素
（ｂ）（ａ）の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸
（ｃ）（ｂ）に記載の核酸またはその翻訳産物を含むベクター

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、一分子のヌクレアーゼドメインによりＤＮＡを二本鎖切断することが可能となり、従来のように、ＤＮＡの二本鎖切断のために二分子のヌクレアーゼドメインを用いる必要がない。このためＴＡＬＥＮやＺＦＮなどの部位特異的ＤＮＡ切断酵素において、本発明のヌクレアーゼドメインを利用すれば、簡便かつ効率的に、部位特異的なＤＮＡの編集を行うことが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】リンカーを介して結合した２つのＦｏｋＩを含むＴＡＬＥＮ（「ＴＡＬＥ－ｓｃＦｏｋＩ」と称する）のＤＮＡ切断活性をＳＳＡアッセイ法により検出した結果を示すグラフである。なお、図中の「９５」は、９５アミノ酸残基のＨＴＳ９５リンカーを示し、「６０」は、６０アミノ酸残基のＧＧＧＧＳ×１２リンカーを示す（以下、同様）。

【図2】リンカーを介して結合した２つのヌクレアーゼドメイン（ＮＤ１またはＮＤ２）を含むＴＡＬＥＮ（それぞれ「ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１」、「ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ２」と称する）の構造を示す図である。ＴＡＬＥ（ＤＮＡ結合ドメイン）の例として、ＴＡＬＥ６３を用いる場合を示した。なお、図中の「１２０」は、１２０アミノ酸残基のＧＧＧＧＳ×２４リンカーを、「１８０」は、１８０アミノ酸残基のＧＧＧＧＳ×３６リンカーを示す（以下、同様）。

【図3】図２に示すＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１およびＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ２を用いてＳＳＡアッセイ法によりＤＮＡ切断活性を検出した結果を示すグラフである。

【図4】ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１のＤＮＡ切断活性におけるＴＡＬＥの構造およびリンカーの鎖長の影響をＳＳＡアッセイ法により評価した結果を示すグラフである。ＴＡＬＥとして、ＴＡＬＥ６３およびＴＡＬＥ４７を用いた。

【図5】ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１のＤＮＡ切断活性における標的遺伝子の種類およびリンカーの鎖長の影響をＳＳＡアッセイ法により評価した結果を示すグラフである。標的遺伝子として、（Ａ）ＡＰＣ遺伝子、ならびに（Ｂ）Ｒｏｓａ２６遺伝子およびＨＰＲＴ１遺伝子を用いた。ＴＡＬＥとして、ＴＡＬＥ４７を用いた。

【図6】ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１のＤＮＡ切断活性におけるＴＡＬＥのＣ末ドメインの長鎖化の影響をＳＳＡアッセイ法により評価した結果を示すグラフである。標的遺伝子として、Ｒｏｓａ２６遺伝子を用いた。ＴＡＬＥとして、ＴＡＬＥ４７を用いた。２つのＮＤ１を結合するリンカーとしては、９５アミノ酸残基のＨＴＳ９５リンカーを用いた。

【図7】ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１のＤＮＡ切断活性におけるＴＡＬＥのＣ末ドメインの短鎖化の影響をＳＳＡアッセイ法により評価した結果を示すグラフである。標的遺伝子として、Ｒｏｓａ２６遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、およびＨＰＲＴ１遺伝子を用いた。ＴＡＬＥとして、ＴＡＬＥ４７を用いた。２つのＮＤ１を結合するリンカーとしては、９５アミノ酸残基のＨＴＳ９５リンカーを用いた。

【図8】図９の実験に用いたＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１の構造を示す図である。

【図9】ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１のＤＮＡ切断活性におけるリンカーの種類の影響をＳＳＡアッセイ法により評価した結果を示すグラフである。リンカーとしては、ＨＴＳ９５（９５アミノ酸残基）、ＧＳＳ×３２（９６アミノ酸残基）、ＳＡＧＧ×２４（９６アミノ酸残基）、およびＧＧＧＧＳ×１９（９５アミノ酸残基）を用いた。標的遺伝子として、（Ａ）Ｒｏｓａ２６遺伝子、（Ｂ）ＡＰＣ遺伝子、および（Ｃ）ＨＰＲＴ１遺伝子を用いた。ＴＡＬＥとして、ＴＡＬＥ２４を用いた。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、リンカーを介して結合した２つのＮＤ１を含む、融合ヌクレアーゼドメイン（ｓｃＮＤ１）を提供する。

【0020】

本発明における「ＮＤ１」は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの同一性が３５％～７０％の範囲に存在する相同配列のスクリーニングによって、本発明者が見出したヌクレアーゼドメインの一つである（特許文献１）。

【0021】

ＮＤ１を含む全長タンパク質（代表例として、バチルス属ＳＧＤ－Ｖ－７６由来）のアミノ酸配列を配列番号９７に示す。ＮＤ１は、典型的には、配列番号９７の３９１～５８５位に相当する部分ペプチドであり、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列と７０％の同一性を有する。

【0022】

本発明における「ＮＤ１」には、リンカーを介して二分子を結合した場合に、ＤＮＡの二本鎖切断活性を有する限り、配列番号９７の３９１～５８５位に相当するアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなるヌクレアーゼドメインが含まれる。このようなヌクレアーゼドメインには、例えば、他の細菌由来のＮＤ１やＮＤ１の変異体（天然の変異体および人工的な変異体）が含まれる。

【0023】

ここで「高い同一性」とは、８５％以上の同一性を意味し、好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性である。

【0024】

本発明におけるアミノ酸配列の同一性は、配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）を求める方法は、当業者に公知である。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者に既知のいずれかのアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等）を利用すればよい。アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。

【0025】

ＮＤ１の変異体としては、例えば、配列番号９７の３９１～５８５位に示されるアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列からなるヌクレアーゼドメインが挙げられる。ここで、「１ないし数個」とは、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個）である。

【0026】

２つのＮＤ１を結合するための「リンカー」としては、本発明の融合ヌクレアーゼドメインが二本鎖切断活性を発揮しうる限り、その鎖長や種類において、特に制限はない。リンカーの鎖長は、通常、３０～３００アミノ酸残基であり、好ましくは５０～２００アミノ酸残基である。リンカーのタイプとしては、例えば、ＨＴＳ９５リンカー、ＧＳＳリンカー、ＳＡＧＧリンカー、ＧＧＧＧＳリンカー、ＨＴＥＮリンカーなどが挙がれるが、ＨＴＳ９５リンカーが好ましい。これらリンカーを用いる場合、リンカーの必要な鎖長に応じて、複数個連結して用いてもよい。

【0027】

２つのＮＤ１とリンカーとの結合は、核酸レベルおよびアミノ酸レベルで行うことができる。すなわち、「ＮＤ１をコードする核酸→リンカーをコードする核酸→ＮＤ１をコードする核酸」の順となるように、それぞれの核酸をライゲーション反応により連結することにより、本発明の融合ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を調製することができる。こうして得られた核酸を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞内で発現させれば、「ＮＤ１→リンカー→ＮＤ１」の順にアミノ酸レベルで連結された融合ヌクレアーゼドメインとなる。宿主細胞およびベクターについては、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素の場合（後述）と同様である。また、融合ヌクレアーゼドメインは、アミノ酸配列情報を基に人工合成して調製することも可能である。

【0028】

融合ヌクレアーゼドメインがＤＮＡの二本鎖切断活性を有するか否かは、後述の通り、ＤＮＡ結合ドメインと融合して得られた部位特異的ＤＮＡ切断酵素が、部位特異的なＤＮＡの二本鎖切断活性を示すか否かにより評価することができる。例えば、本願実施例に記載のように、特定の遺伝子の特定の部位を標的化するＴＡＬＥと融合することにより得られた部位特異的ＤＮＡ切断酵素が、当該特定の部位で二本鎖切断活性を示すか否かを評価すればよい。この評価においては、プラスミド上のレポーター遺伝子（例えば、ＴＡＬＥ認識配列が挿入されたＥＧＦＰ遺伝子）を標的としたＳＳＡアッセイ系を用い、レポーター活性を指標に評価してもよく、また、細胞内の内因性遺伝子を標的とした部位特異的ＤＮＡ切断酵素を調製し、当該部位特異的ＤＮＡ切断酵素による標的部位の塩基配列の改変（変異）を指標に評価してもよい。

【0029】

本発明は、また、ＤＮＡ結合ドメインおよび上記融合ヌクレアーゼドメインを含む、部位特異的ＤＮＡ切断酵素を提供する。本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素は、ＤＮＡ結合ドメインを介してＤＮＡ上の標的配列に結合し、融合ヌクレアーゼドメインによって標的切断部位でＤＮＡを二本鎖切断する。

【0030】

本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素の「標的ＤＮＡ」は、その特性が最も効果的に発揮できるという観点から、二本鎖ＤＮＡが好適である。二本鎖ＤＮＡとしては、限定するものではないが、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡなどが挙げられる。

【0031】

ＤＮＡ結合ドメインは、任意のＤＮＡ配列（標的配列）に特異的に結合させることが可能なタンパク質ドメインであれば特に制限はないが、例えば、ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ジンクフィンガー、ＰＰＲ（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡの複合体）などが挙げられる。

【0032】

ＴＡＬＥは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属プロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を活性化するタンパク質である。本発明に用いるＴＡＬＥは、ＴＡＬＥリピートドメインに加えて、Ｎ末ドメインおよび／またはＣ末ドメインを含んでいてもよい。

【0033】

ＴＡＬＥリピートドメインは、右巻き超らせん（ｓｕｐｅｒｈｅｌｉｃａｌ）を形成するＴＡＬＥ配列の、複数、例えば１０～３０、好ましくは１３～２５、より好ましくは１５～２０のタンデムリピート（ＴＡＬＥリピート）で構成される。典型的なＴＡＬＥリピート１単位（１つのＴＡＬＥ配列）は、３３～３５アミノ酸からなり、その１２番目と１３番目の２アミノ酸残基からなる可変残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）によって、ＤＮＡの特定の塩基を認識する。塩基を特異的に認識するＲＶＤの例としては、Ｃを認識するＨＤ、Ｔを認識するＮＧ、Ａを認識するＮＩ、Ｇ又はＡを認識するＮＮ、及びＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを認識するＮＳなどが挙げられる。かかるＴＡＬＥリピートドメインのＤＮＡ認識機構に基づき、特定の塩基を認識するＴＡＬＥ配列を人工的に連結することにより、ＤＮＡ上の所望の塩基配列（ＴＡＬＥ認識配列）を認識して結合できるＴＡＬＥを作製することができる。

【0034】

ＴＡＬＥとしては、ＴＡＬＥリピート１単位の２つの特定の位置のアミノ酸がＴＡＬＥリピート４単位ごとに変化している、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮ（特開２０１５－３３３６５号公報）のＴＡＬＥの態様であることが好ましい。

【0035】

ＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素の機能（標的切断部位でのＤＮＡの二本鎖切断）に負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。ＴＡＬＥのＮ末ドメインの具体例としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０６９９）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列や、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0036】

ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素の機能（標的切断部位でのＤＮＡの二本鎖切断）に負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。Ｃ末ドメインの具体例としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（ＷＴ：アミノ酸数＝１８０）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８９～３２１９２）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸数＝６３）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸数＝４７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。実際、本実施例においては、Ｃ末ドメインが存在しないＴＡＬＥを用いた場合でも、１８０アミノ酸残基という長鎖のＣ末ドメインを有するＴＡＬＥを用いた場合でも、部位特異的なＤＮＡの二本鎖切断活性が認められている（図６、７）。

【0037】

ジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインは、複数、例えば、３～９個のジンクフィンガーからなるジンクフィンガーアレイ（以下、「ＺＦＡ」ともいう）で構成される。１つのジンクフィンガーは、３塩基配列を認識することが知られており、例えば、ＧＮＮ、ＡＮＮ、またはＣＮＮ等を認識するジンクフィンガーが知られている。

【0038】

ＰＰＲを含むＤＮＡ結合ドメインは、複数、例えば１０～３０個のタンデムリピート（ＰＰＲリピート）で構成される。典型的なＰＰＲリピートの１単位は、３５アミノ酸からなり、ＰＰＲリピートの１単位で１塩基を認識することが知られている。また、ＴＡＬＥがリピートの１単位に存在する２アミノ酸で結合塩基を指定するのに対し、ＰＰＲは３アミノ酸で結合塩基を指定することが知られている。

【0039】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含む複合体であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｂ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３などが挙げられる。本発明において用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、好ましくは、ヌクレアーゼ活性を不活性化したＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ）を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓである。ヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣａｓ変異体は公知である。本発明の融合ヌクレアーゼドメインをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓに適用する場合には、通常、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを構成するタンパク質に結合される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが複数のタンパク質（サブユニット）を構成要素とするタイプＩのシステムである場合には、本発明の融合ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼ活性を持たないサブユニット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３においてＣａｓｃａｄｅを構成するサブユニット）に融合してもよい。この場合、ヌクレアーゼ活性を持つサブユニット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３におけるＣａｓ３）はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素から除外することができる。

【0040】

本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素において、融合ヌクレアーゼドメインとＤＮＡ結合ドメインは、直接結合されていてもよく、またはリンカーを介して結合されていてもよい。リンカーが存在する場合、本発明の融合ヌクレアーゼドメインが二本鎖切断活性を発揮しうる限り、その鎖長やタイプにおいて、特に制限はない。リンカーの鎖長は、通常、２～１８０アミノ酸残基であり、好ましくは２～１２０アミノ酸残基である。リンカーのタイプとしては、例えば、ＨＴＳ９５リンカー、ＧＳＳリンカー、ＳＡＧＧリンカー、ＧＧＧＧＳリンカー、ＨＴＥＮリンカーが挙げられるが、これらに制限されない。これらリンカーを用いる場合、リンカーの必要な鎖長に応じて、複数個連結して用いることができる。

【0041】

融合ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に結合していても、Ｃ末端側に結合していてもよい。また、融合ヌクレアーゼドメインの両端にＤＮＡ結合ドメインを配置して、サンドイッチ型としてもよい（サンドイッチ型については、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ３９０（３）， ６９４－６９７を参照のこと）。さらに、精製や検出のためのフラグタグや、各種移行シグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリア移行シグナル、色素体移行シグナルなど）が付加されていてもよい。

【0042】

本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素のＤＮＡ結合ドメインが認識する標的配列は、ＤＮＡ上の任意の配列である。一組（二分子）で用いられていた従来のＺＦＮやＴＡＬＥＮなどでは、標的配列がスペーサー配列を挟んだ２つの配列である必要があるが、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素は、一分子で用いることができ、標的化における制約が少ない点においても有利である。

【0043】

本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸を適当な発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主細胞に導入して、当該宿主細胞内で該部位特異的ＤＮＡ切断酵素を発現させる方法や、当該部位特異的ＤＮＡ切断酵素のアミノ酸配列情報を基に人工合成する方法が挙げられる。発現ベクターとしては、当該分野で使用されるベクターから適宜選択すればよく、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、ＢＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＭＡＣベクター、ＨＡＣベクターなどが挙げられる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、発現ベクターとの適合性を考慮して適宜選択すればよく、例えば、大腸菌、放線菌、古細菌などの原核生物や酵母、ウニ、カイコ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、カエル、タバコ、シロイヌナズナ、イネなどの真核生物の細胞が挙げられる。

【0044】

本発明は、上記融合ヌクレアーゼドメインをコードする核酸、および上記部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸を提供する。ここで「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれも包含する。上記核酸においては、細胞内での発現効率を高めるなどの目的で、コドンの最適化を行っていてもよい。

【0045】

本発明は、また、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素、該部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸、該核酸またはその翻訳産物を含むベクターを細胞に導入することを含む、標的ＤＮＡが改変された細胞を製造する方法を提供する。

【0046】

本発明における標的ＤＮＡの「改変」には、標的ＤＮＡにおける少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。

【0047】

上記分子の細胞への導入は、物理的な導入、またはウイルスまたは生物の感染などを介する導入であってもよく、当該分野で既知の様々な方法を用いることができる。物理的な導入方法としては、特に制限はないが、例えば、エレクトロポレーション法、パーティンクルガン法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、プロテイントランスダクション法などが挙げられる。ウイルスまたは生物の感染などを介する導入方法としては、特に制限はないが、例えば、ウイルス形質導入、アグロバクテリウム法、ファージ感染、接合などが挙げられる。

【0048】

上記導入には、適宜、ベクターが用いられる。ベクターとしては、導入する分子や細胞の種類に応じて適宜選択すればよく、特に制限はないが、例えば、上記のプラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、ＢＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＭＡＣベクター、ＨＡＣベクターなどが挙げられる。また、ｍＲＮＡ（転写産物）やタンパク質（翻訳産物）などを運搬することのできるリポソームやレンチウイルスなどのベクター、および融合または結合させた分子を細胞内に導入することのできる細胞透過性ペプチドなどのペプチドベクターが挙げられる。従って、本発明における「部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸またはその翻訳産物を含むベクター」には、部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードするＤＮＡが挿入された上記プラスミドベクターなどのベクターのみならず、ｍＲＮＡ（転写産物）やタンパク質（翻訳産物）を保持する上記リポソームなどのベクターが含まれる。

【0049】

上記分子を導入する細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよい。例えば、細菌、古細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）などが挙げられる。該細胞はまた、生体内の細胞であってもよく、または単離された細胞であってもよく、また、初代細胞であっても、培養細胞であってもよい。該細胞はまた、体細胞、生殖細胞、または幹細胞であってもよい。

【0050】

上記細胞の由来する原核生物としては、例えば、大腸菌、放線菌、古細菌などが挙げられる。また、上記細胞の由来する真核生物としては、例えば、酵母、キノコ、カビなどの真菌類、ウニ、ヒトデ、ナマコなどの棘皮動物、カイコ、ハエなどの昆虫類、マグロ、タイ、フグ、スマ、ゼブラフィッシュなどの魚類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、トカゲなどの爬虫類、カエルなどの両生類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどのネコ目、ニワトリ、ダチョウ、ウズラなどの鳥類、タバコ、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、メロン、アブラナ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、アサガオ、シクラメン、カーネーションなどの植物が挙げられる。「動物細胞」としては、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞；受精卵などが挙げられる。

【0051】

標的ＤＮＡは、上記細胞中のゲノムＤＮＡ中の任意の遺伝子または遺伝子外領域のＤＮＡであってもよい。標的ＤＮＡ中の標的部位を切断するためには、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素に含まれるＤＮＡ結合ドメインが該標的切断部位の近傍の配列（該ＤＮＡ結合ドメインの標的配列として選択される）に結合するように、本発明の部位特異的ＤＮＡ切断酵素を設計する。その結果、該標的ＤＮＡ中の標的切断部位の配列が切断され、例えば、該遺伝子の発現が低下または消失し、あるいは該遺伝子の機能が低下または機能が発現しなくなる。

【0052】

本発明の方法においては、上記の部位特異的ＤＮＡ切断酵素に加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的切断部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。本発明の方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、標的切断部位で相同組換え修復が起こり、ドナーポリヌクレオチドが該部位に挿入されるか、または該部位がドナー配列に置換される。その結果、標的切断部位に所望の改変が導入される。

【0053】

本発明の方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的切断部位は、主に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、標的ＤＮＡは、標的切断部位において改変される。

【0054】

また、本発明は、上記部位特異的ＤＮＡ切断酵素、該部位特異的ＤＮＡ切断酵素をコードする核酸、または該核酸もしくはその翻訳産物を含むベクターを含む、標的ＤＮＡの改変のためのキットを提供する。該キットは、一つまたは複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬が挙げられるが、これらに制限されない。通常、キットには取扱説明書が添付される。

【実施例0055】

１．方法
（１）ＴＡＬＥベクターセットおよびＴＡＬＥ発現プラスミドの作製
ＴＡＬＥベクターセットの配列および構成は、文献（Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ３， １－８）に従いつつ、マテリアルを一から構築した。まず，ｎｏｎ－ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ（ｎｏｎ－ＲＶＤ）と呼ばれるバリエーションを保有しつつ、ＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、ＮＮの各種ＲＶＤに対応するモジュールプラスミド（計１６種）について、各塩基配列の両端に制限酵素ＢｓＡＩの認識サイトを付加した配列を人工遺伝子合成により作製した。それらをｐＥＸ－Ａ２Ｊ２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）に挿入して、モジュールプラスミドセット（ｐＥＸ１ＨＤ－ｐＥＸ４ＨＤ、ｐＥＸ１ＮＧ－ｐＥＸ４ＮＧ、ｐＥＸ１ＮＩ－ｐＥＸ４ＮＩ、およびｐＥＸ１ＮＮ－ｐＥＸ４ＮＮ）を作製した。次に、アレイプラスミドを構成するＤＮＡ配列ＦＵＳ２＿ａｘｘ（７種類）とｂ（１－４）（４種類）を人工遺伝子合成により作製した。それらをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）に挿入してｐＣＲ８＿ＦＵＳ２＿ａｘｘおよびｐＣＲ８＿ＦＵＳ ｂ（１－４）を作製し，上記Ｓａｋｕｍａらの文献に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅシステムにおける最初のアセンブリーステップの捕捉ベクターとして使用した。最終ベクターは，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から薬剤耐性遺伝子発現ユニットを除去したｐｃＤＮＡ３．１ｓに，人工遺伝子合成により作製した３種類のＴＡＬＥ構造，ＷＴ，＋１３６／＋６３，＋１５３／＋４７および最終リピートを挿入することで作製した。上記プラスミドを用いて、上記Ｓａｋｕｍａらの文献に従い，Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法によってＴＡＬＥ発現プラスミドを作製した。

【0056】

（２）ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ＦｏｋＩ、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ＮＤ１、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ＮＤ２発現プラスミドの作製
ＨＴＳ９５アミノ酸配列（Ｓｕｎ， Ｎ．， ＆ Ｚｈａｏ， Ｈ． （２０１４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， １０（３）， ４４６－４５３）をコードするＤＮＡ配列を介して、ＦｏｋＩ遺伝子のヌクレアーゼドメインをコードしている部分遺伝子を２個連結させた人工遺伝子を合成した（ＦｏｋＩ－９５－ＦｏｋＩ）。また、ＨＴＳ９５アミノ酸配列をＧＧＧＧＳｘ１２（計６０アミノ酸残基）のリンカーをコードするＤＮＡ配列に置換した人工遺伝子も合成した（ＦｏｋＩ－ＧＧＧＧＳｘ１２－ＦｏｋＩ）。ＮＤ１遺伝子とＮＤ２遺伝子については、ＮＤ１のヌクレアーゼドメインをコードしている部分遺伝子間にＧＧＧＧＳｘ１２（計６０アミノ酸残基）のリンカーを挿入したＮＤ１－６０－ＮＤ１と、ＮＤ２のヌクレアーゼドメインをコードしている部分遺伝子間にＨＴＳ９５アミノ酸配列を挿入したＮＤ２－９５－ＮＤ２を人工合成した。なお、人工合成の際に、ＧＧＧＧＳｘ１２とＨＴＳ９５のリンカー配列の前に制限酵素ＡｌｅＩ／ＸｍａＩ部位を、後ろに制限酵素ＰｓｈＡＩ／ＳａｃＩＩ部位をそれぞれ共通配列として付加して合成を行った。これら人工合成遺伝子は、ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）に挿入した。

【0057】

次に、ＮＤ１－６０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－９５－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２を制限酵素ＡｌｅＩとＰｓｈＡＩで切断し、それぞれＨＴＳ９５アミノ酸配列をコードする２９５ｂｐＤＮＡ断片（９５ａａ）、ＧＧＧＧＳｘ１２のリンカーをコードする１９０ｂｐＤＮＡ断片（６０ａａ）、および各残りのベクター部分の断片を単離した。６０ａａを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応により連結した後、制限酵素ＸｍａＩとＳａｃＩＩで切断し、これにより得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離することにより、３８０ｂｐＤＮＡ断片（１２０ａａ）と５７０ｂｐＤＮＡ断片（１８０ｂｐ）を単離精製した。ＮＤ１－６０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２を制限酵素ＡｌｅＩとＰｓｈＡＩで切断して得られたベクター部分の断片に、９５ａａ、１２０ａａ、１８０ａａの断片をそれぞれ挿入し、またＮＤ２－９５－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２を制限酵素ＡｌｅＩとＰｓｈＡＩで切断して得られたベクター部分の断片に、６０ａａ、１２０ａａ、１８０ａａの断片をそれぞれ挿入することにより、プラスミドＮＤ１－９５－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ１－１２０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ１－１８０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－６０－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－１２０－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、およびＮＤ２－１８０－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２を得た。

【0058】

次に，上記のｓｃＦｏｋＩ、ｓｃＮＤ１、ｓｃＮＤ２の各配列をＴＡＬＥ（＋１３６／＋６３）の下流に連結したＴＡＬＥ６３－ｓｃＦｏｋＩ発現プラスミド、ＴＡＬＥ６３－ｓｃＮＤ１発現プラスミド、ＴＡＬＥ６３－ｓｃＮＤ２発現プラスミドを以下の方法により作製した。上述のプラスミドのＦｏｋＩ－９５－ＦｏｋＩ／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＦｏｋＩ－ＧＧＧＧＳｘ１２－ＦｏｋＩ／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ１－９５－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ１－６０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ１－１２０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ１－１８０－ＮＤ１／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－９５－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－６０－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－１２０－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２、ＮＤ２－１８０－ＮＤ２／ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２を鋳型として、ｓｃＦｏｋＩ、ｓｃＮＤ１、ｓｃＮＤ２の各配列をそれぞれＰＣＲにより増幅した。これらをＴＡＬＥ発現プラスミドのプラチナＴＡＬＥ構造である＋１３６／＋６３の下流にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ， Ｓｈｉｇａ， Ｊａｐａｎ）により挿入してＴＡＬＥ６３－ｓｃＦｏｋＩ発現プラスミド、ＴＡＬＥ６３－ｓｃＮＤ１発現プラスミド、ＴＡＬＥ６３－ｓｃＮＤ２発現プラスミドを作製した。これらの作製に用いたプライマーを表１に示す。

【0059】

【表1】

【0060】

なお、ＴＡＬＥ＋１３６／＋６３のＮ末ドメインおよびＣ末ドメインの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号６４～６７に、各ｓｃＦｏｋＩの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号６０～６３に、各ｓｃＮＤ１の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号７２～７９に、各ｓｃＮＤ２の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号８０～８７に、それぞれ示す。ＴＡＬＥ＋１３６／＋６３のＣ末ドメインのアミノ酸配列（配列番号６７）は、融合ヌクレアーゼドメインとしてｓｃＦｏｋＩを用いる場合には、Ｃ末側に、さらに２アミノ酸「ＬＫ」が付加されている。

【0061】

（３）シングルストランドアニーリング（ＳＳＡ）アッセイ用レポータープラスミドの作製
ＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドにおいては、まず、文献（Ｍａｓｈｉｋｏ ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ３， １－６）記載の配列情報を参照し、全合成したＥＧＦＰ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ＥＧｘｘＦＰ配列のＮ末側とＣ末側の２断片の増幅産物を得た。次いで、Ｎ末側とＣ末側の間のリンカー配列を付加したプライマーで再度ＰＣＲを行って増幅産物を得た後、それらをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐｃＤＮＡ３．１ｓの制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位に挿入し作製した（得られたプラスミドを「ｐｃＥＧｘｘＦＰ」と称する）。ｐｃＥＧｘｘＦＰの作製の際に用いたプライマーを表２に示す。

【0062】

【表2】

【0063】

ＳＳＡアッセイに用いる各標的配列をゲノムからＰＣＲにより単離し、それらをｐｃＥＧｘｘＦＰ内のＥＧＦＰのＮ末側とＣ末側の間に挿入したリンカー内の制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入することにより、各ＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドを作製した。ＳＳＡアッセイ評価に用いた標的配列（ＡＰＣ、Ｒｏｓａ２６、ＨＰＲＴ１）を配列番号９４～９６に示す。

【0064】

（４）ＴＡＬＥ Ｃ末長検討用プラスミドの作製
ｓｃＮＤ１とＴＡＬＥリピート間の鎖長の検討は、ＴＡＬＥ＋１５３／＋４７のＣ末を起点としてＣ末長を変化させることで行った。より長くする場合は、ＴＡＬＥ ＷＴを鋳型としてＰＣＲを行い、６３残基から１８０残基までの鎖長を有する９種類のＴＡＬＥ Ｃ末領域を作製し、ＴＡＬＥ＋１５３／＋４７のＮ末領域と連結させた。より短くする場合は、ＴＡＬＥ＋１５３／＋４７を鋳型としてＰＣＲを行い、０残基から３６残基までの鎖長を有する４種類のＴＡＬＥを作製した。Ｃ末長が異なる各ＴＡＬＥの発現プラスミドの作製に用いたプライマーを表３に示す。また、ＴＡＬＥ＋１５３／＋４７のＮ末ドメインおよびＣ末ドメインの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号６８～７１に示す。

【0065】

【表3】

【0066】

（５）フレキシブルリンカーの作製
３種類のフレキシブルリンカーＧＳＳ、ＳＡＧＧ、およびＧＧＧＧＳをそのリピート数を調節可能な形態で目的の配列中に挿入できるように作製した。まず、５’末端に制限酵素ＸｍａＩ、３’末端にＢａｍＨＩあるいはＭｒｏＩの５‘突出切断配列を配置したリンカー配列ＧＳＳｘ４アダプター、ＳＡＧＧｘ３アダプター、およびＧＧＧＧＳｘ３アダプター（各フォワード、リバース）を合成した。これらの作製に用いたプライマーを表４に示す。

【0067】

【表4】

【0068】

各オリゴの５’末端をリン酸化しアニーリング後、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｒｏＩを各１か所有しているプラスミドに挿入した（例えば、ＴＡＬＥ６３－ＮＤ１－６０－ＮＤ１の６０ａａリンカー配列中には、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｒｏＩが１か所ずつ存在するため、本実施例ではＴＡＬＥ６３－ＮＤ１－６０－ＮＤ１／ｐｃＤＮＡ３．１ｓを仮ベクターとして使用した）。それぞれ、ＧＳＳアダプターベクター、ＳＡＧＧアダプターベクター、ＧＧＧＧＳアダプターベクターとした。

【0069】

また、各アダプターベクターに挿入するフレキシブルリンカーリピート配列として、５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩおよび３’末端にＢａｍＨＩの、あるいは５’末端にＸｍａＩおよび３’末端にＭｒｏＩの各５’突出切断配列を配置したリンカー配列オリゴＧＳＳｘ４、ＧＳＳｘ７、ＳＡＧＧｘ３、ＳＡＧＧｘ４、ＧＧＧＧＳｘ３、およびＧＧＧＧＳｘ４（各フォワード、リバース）を合成した（表４）。

【0070】

各オリゴの５’末端をリン酸化しアニーリング後、ライゲーション反応を行い、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩあるいはＸｍａＩとＭｒｏＩの２重切断を実施し、目的のリピート数となった断片をアガロースゲル電気泳動にて回収した。例えばＧＳＳｘ４リピートの場合では、ＧＳＳｘ８、ＧＳＳｘ１２ 、ＧＳＳｘ１６などのリピート配列が得られ、ＧＳＳｘ７と混合してライゲーション反応を行うことで、ＧＳＳｘ１１、ＧＳＳｘ１４、ＧＳＳｘ１５など様々なリピート数を有するＤＮＡ断片を得ることができる。

【0071】

各目的リピート数（最終目的リピート数－アダプターベクターに挿入されたリピート数）を有するＤＮＡ断片を、ＧＳＳアダプターベクター、ＳＡＧＧアダプターベクター、ＧＧＧＧＳアダプターベクターのＢａｍＨＩ部位、あるいはＭｏｒＩ部位に挿入することにより、最終目的リピート数のリンカー配列を得た。これらリンカー配列をＸｍａＩとＢａｍＨＩあるいは、ＸｍａＩとＭｏｒＩの２重切断により単離した。

【0072】

最終リピート断片をＮＤ１－９５－ＮＤ１配列の９５ａａリンカーと入れ替える形で挿入するため、ＴＡＬＥ２４－ＮＤ１－９５－ＮＤ１発現プラスミド中のＣ末側ＮＤ１の直前にＢａｍＨＩあるいはＭｏｒＩの制限酵素部位を挿入したプラスミドＴＡＬＥ２４－ｓｃＮＤ１（ｂａｍ）／ｐｃＤＮＡ３．１ｓおよびＴＡＬＥ２４－ｓｃＮＤ１（ｍｒｏ）／ｐｃＤＮＡ３．１ｓを作製した。これらプラスミドの作製に用いたプライマーを表５に示す。

【0073】

【表5】

【0074】

次に、それぞれのプラスミドをＸｍａＩとＢａｍＨＩあるいは、ＸｍａＩとＭｏｒＩの２重切断後、アルカリフォスファターゼによる５’末端の脱リン酸化を行った。その後、先に用意した最終目的リピート数のリンカー配列と共にライゲーション反応を行い、最終的に、ＴＡＬＥ２４－ＮＤ１－ＧＳＳｘ３２－ＮＤ１、ＴＡＬＥ２４－ＮＤ１－ＳＡＧＧｘ２４－ＮＤ１、およびＴＡＬＥ２４－ＮＤ１－ＧＧＧＧＳｘ１９－ＮＤ１を得た。各融合ヌクレアーゼドメインの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号８８～９３に示す。それぞれのプラスミドに各標的に対するＴＡＬＥリピートを挿入し、ＳＳＡアッセイに供した。

【0075】

（６）ＳＳＡアッセイによるＤＮＡに対する二本鎖切断活性の定量
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で生育させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ｘ１０^４細胞ずつ９６ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクション前日に播種した。ＴＡＬＥ－Ｌ発現プラスミド３３ｎｇ、ＴＡＬＥ－Ｒ発現プラスミド発現プラスミド３３ｎｇ、ＥＧｘｘＦＰレポータープラスミド３３ｎｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。導入プラスミドの種類あるいは導入量を減らす場合においては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）で補い、導入プラスミド全量を１００ｎｇとした。

【0076】

トランスフェクション後４８時間培養し、各ウェルの単位面積当たりのＥＧＦＰタンパク質による蛍光量をプレートリーダーで測定した。ウェル内の細胞の局在によるばらつきを低減させるために、各ウェル１６ポイントで蛍光測定を行い、その平均値を蛍光量とした。独立した３ウェルの値の平均値及び標準偏差をグラフ化した。

【0077】

２．結果
（１）ｓｃＦｏｋＩの活性の確認
まず、塩基認識活性を欠如したモノマー型のヌクレアーゼとして、既報分子のｓｃＦｏｋＩ活性を確認した。ＴＡＬＥ標的配列としてはすでに非特許文献において細胞内活性が確認されているｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ （ＡＰＣ）遺伝子に対するＴＡＬＥＮのＲｉｇｈｔ ＴＡＬＥ配列（ｔＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧ／配列番号９４の１１９～１３６位に対応）、Ｌｅｆｔ ＴＡＬＥ配列（ｔＡＴＧＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧ／配列番号９４の８５～１０２位に対応）（上記Ｓａｋｕｍａらの文献）を用いた。陽性コントロールとして、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮ（ＡＰＣ－Ｒ）＋ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮ（ＡＰＣ－Ｌ）を置き、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＳＡアッセイ法にて評価を実施したところ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥ（＋１３６／＋６３ ｓｃａｆｆｏｌｄ、ＡＰＣ－Ｒ）－ｓｃＦｏｋＩやＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥ（＋１３６／＋６３ ｓｃａｆｆｏｌｄ、ＡＰＣ－Ｌ）－ｓｃＦｏｋＩは活性がＳＳＡアッセイのレポーターのみの場合と有意差がなかった（図１）。そこで活性の改善を期待し、ＦｏｋＩ間のリンカー配列をＧＧＧＧＳｘ１２のフレキシブルリンカーに変更したＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥ（＋１３６／＋６３ ｓｃａｆｆｏｌｄ、ＡＰＣ－Ｒ）－ｓｃＦｏｋＩ－１２やＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥ（＋１３６／＋６３ ｓｃａｆｆｏｌｄ、ＡＰＣ－Ｌ）－ｓｃＦｏｋＩ－１２を作製し、同様に評価を行ったが、ｓｃＦｏｋＩと同様活性を確認することが出来なかった（図１）。ｓｃＦｏｋＩは切断活性が非常に低く、ヒト細胞での効率的なゲノム編集への利用は困難であると判断された。

【0078】

（２）ｓｃＮＤ１の作製と活性の確認
次に、ｓｃＦｏｋＩの構造を踏襲しながら、ＦｏｋＩの代替因子として見いだされたＮＤ１／ＮＤ２で同様の検討を実施した。

【0079】

＋１３６／＋６３ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥをｓｃａｆｆｏｌｄとして、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ１ｍｏｎｏ、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｒ）ＮＤ１ｍｏｎｏ、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ１－６０－ＮＤ１、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ１－９５－ＮＤ１、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ１－１２０－ＮＤ１、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ１－１８０－ＮＤ１、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ２ ｍｏｎｏ、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｒ）ＮＤ２ ｍｏｎｏ、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ２－６０－ＮＤ２、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ２－９５－ＮＤ２、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ２－１２０－ＮＤ２、ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ２－１８０－ＮＤ２の発現プラスミドを作製し（図２）、２９３Ｔ細胞におけるＳＳＡアッセイにより評価した。その結果、通常型のＴＡＬＥ－ＮＤ１（ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ１ｍｏｎｏ＋ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｒ）ＮＤ１ｍｏｎｏ）は、通常型のＴＡＬＥ－ＮＤ２（ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｌ）ＮＤ２ｍｏｎｏ＋ＴＡＬＥ（ＡＰＣ－Ｒ）ＮＤ２ｍｏｎｏ）と比較して活性が顕著に低かったが、連結して一本鎖化した場合には、驚くべきことに、ＮＤ１がいずれも優れた活性を示したのに対して、ＮＤ２はいずれも活性を示さなかった（図３）。さらに、＋１５３／＋４７ ｓｃａｆｆｏｌｄにＴＡＬＥを変更した場合、＋１３６／＋６３ ｓｃａｆｆｏｌｄとの比較において、ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１は全体的に減弱した活性を示したが、ＴＡＬＥ－ＮＤ１－９５－ＮＤ１はより高い活性を保持した（図４）。以上のｓｃＮＤ１に関する知見は、ＡＰＣ－Ｌに対するＴＡＬＥリピートで得た結果であるが、他の５種類の標的配列、具体的には、ＡＰＣ－Ｒ、ヒト ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ＨＰＲＴ１）遺伝子座上に設計したＴＡＬＥＮのＲｉｇｈｔ ＴＡＬＥ配列（ｔＣＧＡＣＡＴＡＧＴＧＡＴＴＡＧＧＡ／配列番号９６の３５７～３７４位に対応）およびＬｅｆｔ ＴＡＬＥ配列（ｔＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣ／配列番号９６の３２４～３４０位に対応）（上記Ｓａｋｕｍａらの文献）、ヒトＲｏｓａ２６遺伝子座上に設計したＴＡＬＥＮのＲｉｇｈｔ ＴＡＬＥ配列（ｔＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＣＣＣＧ／配列番号９５の１６３～１７９位に対応）およびＬｅｆｔ ＴＡＬＥ配列（ｔＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＧＣ／配列番号９５の１３０～１４７位に対応）（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １４；５（１）， ７５－８２）においても同様にＴＡＬＥ－ＮＤ１－９５－ＮＤ１は活性を示した（図５）。以上の結果から、ＮＤ１間のリンカー配列はＨＴＳで見いだされた９５アミノ酸の配列が好ましいことが判明した。以降の実験では、主として、ＮＤ１－９５－ＮＤ１との組み合わせで特に高い活性を発揮する＋１５３／＋４７ ｓｃａｆｆｏｌｄのＴＡＬＥを用いた。

【0080】

（３）ＴＡＬＥ－ｓｃＮＤ１構造最適化
次に、ＴＡＬＥ ｓｃａｆｆｏｌｄ＋１５３／＋４７のＣ末側配列長が活性に与える影響の検討を行った。まず、ＴＡＬＥ（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）ｓｃＮＤ１とＴＡＬＥ（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）ｓｃＮＤ１において、Ｃ末側配列を延長（６３、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、１６５、１８０残基）したところ、残基数に応じた活性の変化は認められなかった（図６）。逆に（３６、２４、１２、０）と残基数を減じたところ、標的配列によっては０、１２、３６残基で活性が減弱する場合がある一方、２４残基では元の４７残基に比して安定して同等以上となった（図７）。

【0081】

「（２）ｓｃＮＤ１の作製と活性の確認」において、ＮＤ１間のリンカー長を６０、９５、１２０、１８０残基と変化させ、９５残基が最適であるとの結果を得た。しかし、９５残基のリンカーはＨＴＳから得られた特有の配列であり、他の６０、１２０、１８０残基はＧＧＧＧＳ配列の繰り返しフレキシブルリンカーで構成されており、９５残基という鎖長がリンカーとして最適であるのか、ＨＴＳ配列が最適であるのかは不明である。そこで、３種類のフレキシブルリンカー（ＧＳＳｘ３２、ＳＡＧＧｘ２４、ＧＧＧＧＳｘ１９）を作製し、「（２）ｓｃＮＤ１の作製と活性の確認」において使用したｓｃＮＤ１のリンカーとして挿入し（図８）、ＨＴＳ９５配列をリンカーとして用いた場合と活性を比較した（図９）。その結果、ＨＴＳ９５配列を用いた場合に、全体として良好な活性が認められた。ＡＰＣ遺伝子を標的とした場合には、他のリンカーでも、ＨＴＳ９５配列と同等の活性が認められた。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明の融合ヌクレアーゼドメインを用いた人工核酸切断酵素は、一分子で部位特異的なＤＮＡの二本鎖切断活性を有し、ＤＮＡのそれぞれの鎖に結合する２分子を一組として用いていた従来のＴＡＬＥＮと比較して、簡便にＤＮＡの編集を行うことが可能である。本発明の融合ヌクレアーゼドメインを含む人工核酸切断酵素は、優れたゲノム編集ツールとして、医療、農業、工業などの幅広い産業分野で利用することが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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