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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023008970
(43)【公開日】2023-01-19
(54)【発明の名称】高感度・高精度ＲＴ－ＰＣＲ法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20230111BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022106718
(22)【出願日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】P 2021109423
(32)【優先日】2021-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業「超高感度ウイルス計測に基づく感染症対策データ基盤」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願。令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、ウイルス等感染症対策技術開発事業「新型コロナウイルス等感染症の精確な検査を可能にする極微量ＲＮＡの超高感度増幅検出技術（ＲＴ－ＰＣＲ法）の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願。
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(71)【出願人】
【識別番号】504202472
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】松浦 俊一
(72)【発明者】
【氏名】池田 拓史
(72)【発明者】
【氏名】山口 有朋
(72)【発明者】
【氏名】馬場 知哉
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ10
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】
被検試料中の微量な標的ＲＮＡ分子を精確に検出又は同定するための高感度かつ高精度なＲＴ－ＰＣＲ法を提供する。
【解決手段】
被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスなどの標的ＲＮＡ分子に対して、ＲＴ－ＰＣＲ法を適用するにあたり、
用いる酵素系のうち、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内に固定化した「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として用いることにより、高感度かつ高精度に標的ＲＮＡ分子を検出又は同定できるＲＴ－ＰＣＲ法を提供した。
特に、シリカ系ナノ空孔材料として中心細孔直径が２～８ｎｍの製品を選択し、かつ製品表面をあらかじめ酸処理などで疎水性処理を施しておくことで、さらに高感度かつ高精度に標的ＲＮＡを検出又は同定することが可能となった。
【選択図】図１
被検試料中の微量な標的ＲＮＡ分子を精確に検出又は同定するための高感度かつ高精度なＲＴ－ＰＣＲ法を提供する。
【解決手段】
被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスなどの標的ＲＮＡ分子に対して、ＲＴ－ＰＣＲ法を適用するにあたり、
用いる酵素系のうち、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内に固定化した「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として用いることにより、高感度かつ高精度に標的ＲＮＡ分子を検出又は同定できるＲＴ－ＰＣＲ法を提供した。
特に、シリカ系ナノ空孔材料として中心細孔直径が２～８ｎｍの製品を選択し、かつ製品表面をあらかじめ酸処理などで疎水性処理を施しておくことで、さらに高感度かつ高精度に標的ＲＮＡを検出又は同定することが可能となった。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被検試料中の微量な標的ＲＮＡ分子をＲＴ－ＰＣＲ法を適用して精確に検出又は同定するための方法であって、
用いる酵素系のうち、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内に固定化した「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として用いることを特徴とする、方法。
用いる酵素系のうち、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内に固定化した「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として用いることを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記シリカ系ナノ空孔材料として、中心細孔直径が２～８ｎｍのシリカ系ナノ空孔材料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
標的ＲＮＡ分子がＲＮＡウイルス由来ＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法であるか、又は２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法であって、かつ用いる逆転写酵素が、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素と共にシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を形成している、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記シリカ系ナノ空孔材料が、あらかじめ疎水化処理が施された表面を有するシリカ系ナノ空孔材料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
請求項６に記載の方法で用いるための疎水性表面を有するシリカ系ナノ空孔材料の調製方法であって、下記の（１）又は（２）の工程を含む、方法：
（１）シリカ系ナノ空孔材料に対してＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を添加し、攪拌による懸濁工程と遠心分離による回収工程とを複数回繰り返す工程、
（２）シリカ系ナノ空孔材料に対して硝酸又は塩酸を加え、加熱処理後、洗浄、乾燥する工程。
（１）シリカ系ナノ空孔材料に対してＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を添加し、攪拌による懸濁工程と遠心分離による回収工程とを複数回繰り返す工程、
（２）シリカ系ナノ空孔材料に対して硝酸又は塩酸を加え、加熱処理後、洗浄、乾燥する工程。
【請求項8】
前記（１）のシリカ系ナノ空孔材料は、グリセロールを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液と混合攪拌させた懸濁液として、ＰＣＲ反応容器に分注させた後に遠心分離により沈殿物として得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットであって、
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素がシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素が固定された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含む、キット。
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素がシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素が固定された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含む、キット。
【請求項10】
前記シリカ系ナノ空孔材料が、疎水化処理が施されている表面を有するシリカ系ナノ空孔材料である、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
前記ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、請求項９に記載のキットであって、
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくはさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、並びに
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び（１）に含まれたＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素をさらに含む、ＰＣＲ反応溶液、
を含むキット。
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくはさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、並びに
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び（１）に含まれたＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素をさらに含む、ＰＣＲ反応溶液、
を含むキット。
【請求項12】
前記ＲＴ－ＰＣＲ法が２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、請求項１０に記載のキットであって、
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくはさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、ＤＮＡ増幅用プライマーをさらに含み、並びに、所望により、
（３）標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液、
を含むキット。
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくはさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、ＤＮＡ増幅用プライマーをさらに含み、並びに、所望により、
（３）標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液、
を含むキット。
【請求項13】
被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供する臨床検査用キットであって、
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくは「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器を含み、
前記ＰＣＲ反応溶液が１～４０％濃度のグリセロールを含有していることを特徴とする、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくは「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器を含み、
前記ＰＣＲ反応溶液が１～４０％濃度のグリセロールを含有していることを特徴とする、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
【請求項14】
前記ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である請求項１３に記載の臨床検査用キットであって、
ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び前記ＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素を含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び前記ＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素を含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
【請求項15】
前記ＲＴ－ＰＣＲ法が２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である請求項１３に記載の臨床検査用キットであって、
所望によりｄＮＴＰｓ及び緩衝液、ＤＮＡ増幅用プライマーを含み、
所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液をさらに含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
所望によりｄＮＴＰｓ及び緩衝液、ＤＮＡ増幅用プライマーを含み、
所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液をさらに含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、極微量のＲＮＡ分子検体を高感度・高精度かつ迅速に検出可能な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法、特にリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法に関する。更に詳しくは、シリカ系ナノ空孔材料もしくはその表面改良シリカ材料と、ＤＮＡ増幅酵素とを複合体化させたＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体、又はさらに逆転写酵素を固定化した逆転写酵素／ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いることによる、極微量のＲＮＡウイルスなどに由来するＲＮＡ分子検体の迅速かつ正確な検出方法及びそのためのキットに関する。すなわち、数分子レベルのＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象とすることができる極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの検出技術、並びに当該技術を用いたＲＮＡウイルス検出方法及びキットに関するものである。
【背景技術】
【0002】
現在、２０１９年に発生した新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）が世界的に猛威を振るっているが、コロナウイルスは、極めて変異しやすいウイルス種で重篤化や高感染性をもたらす変異株が生じやすく、以前にも重症肺炎に至ったコロナウイルス感染症として、２０１２年のＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、２００２年のＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）等が世界的な流行を引き起こしたことは記憶に新しい。また、他に感染力が強く集団食中毒や集団感染を引き起こす病原性ＲＮＡウイルスとしてノロウイルスも公衆衛生上関心が高いウイルスである。
【0003】
一般に、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の確定診断には逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ法）が用いられているが、ウイルス感染初期の患者からは、極めて微量のウイルスＲＮＡを含む検体しか得られないことが多く、現行のＲＴ－ＰＣＲ法では検出限界以下のため陰性と判定される、「偽陰性」が大きな問題となっている（検出感度の問題）。
また、感染後に回復して陰性と判定された後に再び陽性となる事例が発生していることから、現行法では検出限界以下となる極微量のウイルスが体内に残存している可能性が指摘されている。
１分子レベルからのＲＮＡ検出における先行技術として、１ステップのＲＴ－ＰＣＲ技術である「ＡｍｐｄｉｒｅｃｔTM ２０１９－ｎＣｏＶ検出キット」等が販売されている（特許文献１、２、非特許文献１）。本キットは生体サンプル（鼻咽頭拭い液、唾液など）からの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＲＮＡ検出が可能であり、増幅反応の標的となるＲＮＡ分子の最小検出感度は１０コピー／テストとされている。しかし、十分な感度を有しているにも係わらず、精度が低いために偽陽性と診断される可能性が指摘されている。
また、感染後に回復して陰性と判定された後に再び陽性となる事例が発生していることから、現行法では検出限界以下となる極微量のウイルスが体内に残存している可能性が指摘されている。
１分子レベルからのＲＮＡ検出における先行技術として、１ステップのＲＴ－ＰＣＲ技術である「ＡｍｐｄｉｒｅｃｔTM ２０１９－ｎＣｏＶ検出キット」等が販売されている（特許文献１、２、非特許文献１）。本キットは生体サンプル（鼻咽頭拭い液、唾液など）からの新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＲＮＡ検出が可能であり、増幅反応の標的となるＲＮＡ分子の最小検出感度は１０コピー／テストとされている。しかし、十分な感度を有しているにも係わらず、精度が低いために偽陽性と診断される可能性が指摘されている。
【0004】
このように、現行のＰＣＲ法において高感度化を図った場合、あるいはＲＴ－ＰＣＲ法よりも高感度とされる逆転写等温ＤＮＡ増幅法（ＲＴ－ＬＡＭＰ法）を用いた場合、バックグランド増幅と呼ばれる検体由来の夾雑核酸分子（ヒトＤＮＡなど）に起因すると考えられる非特異的な増幅反応での「偽陽性」が問題となる（検出精度の問題）。
当該ＲＴ－ＬＡＭＰ法に関しては、栄研化学から１ステップで行える簡便な新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の「Ｌｏｏｐａｍｐ（商標登録）新型コロナウイルス２０１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出試薬キット」が２０２０年から販売されている（非特許文献２）。本製品の最小検出感度は６０コピー／テストとされている。
いずれの手法も、現状では偽陰性及び偽陽性の問題は解決できておらず、現行の「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル」（非特許文献３）によれば、増幅反応の標的となる核酸分子の検出限界は１０分子程度とされている。
したがって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）等の精確な診断（偽陰性、偽陽性の軽減）のためには、より微量の検体に対する超高感度かつ高精度での検出法の確立及びそのための検出キットの開発が急務な状況である。
当該ＲＴ－ＬＡＭＰ法に関しては、栄研化学から１ステップで行える簡便な新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の「Ｌｏｏｐａｍｐ（商標登録）新型コロナウイルス２０１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出試薬キット」が２０２０年から販売されている（非特許文献２）。本製品の最小検出感度は６０コピー／テストとされている。
いずれの手法も、現状では偽陰性及び偽陽性の問題は解決できておらず、現行の「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル」（非特許文献３）によれば、増幅反応の標的となる核酸分子の検出限界は１０分子程度とされている。
したがって、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）等の精確な診断（偽陰性、偽陽性の軽減）のためには、より微量の検体に対する超高感度かつ高精度での検出法の確立及びそのための検出キットの開発が急務な状況である。
【0005】
ところで、従来から、ＭＣＭ、ＳＢＡ、ＦＳＭ型などのシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に蛋白質を吸着させ、活性を保持させる人工的な蛋白質複合体に関するタンパク質固定化技術を酵素に適用して、酵素をこれらシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に固定化し、基質と反応させる方法が知られていた（特許文献３、４、非特許文献４）。本発明者らは、最近、微量のＤＮＡを選択的に増幅するために、当該シリカ系ナノ空孔材料を用い、ＤＮＡ増幅酵素をシリカ系ナノ空孔材料に固定化して複合体化したＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造し、標的の微量及び極微量ＤＮＡを増幅する方法を開発した（特許文献５、６、非特許文献５、６、７、８、９）。しかし、当該手法を用いることで、０．０１ｆｇレベルの極微量ＤＮＡの増幅までは選択的に行えることが確認できたが、極微量のＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド試料に適用できるかは不明であった。
【0006】
また、ＤＮＡ増幅酵素の固定化に関する従来技術としては、他に、多孔性チタニア膜や金表面処理ガラス基板などにＤＮＡ増幅酵素を固定化し、酵素活性を高効率に発現させることなどの特徴を有する固定化酵素の開発が行われている（非特許文献１０、１１、１２）が、当該技術を、極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象としたＲＮＡ検出に適用した報告例は存在しない。
【0007】
以上のように、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）等のＲＮＡウイルス感染症に対する迅速な確定診断のための、偽陰性及び偽陽性の発生を極力抑えた超高感度かつ高精度な検出法の技術開発、および簡便な検出キットの開発が切望されていた。
そのため、従来の逆転写酵素やＤＮＡ増幅酵素を用いたＲＮＡ検出法において、多量の残存ＲＮＡ等の反応を阻害する夾雑物質の影響を最小化し、又、ＤＮＡ増幅反応中の副反応を極力抑制し、かつＤＮＡ増幅反応環境を至適化する技術を開発することで、ＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高め、数分子レベルの極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドにも適用できる高精度のＲＮＡ検出法の提供が強く要請されていた。また、ＰＣＲ反応における伸長温度の適用範囲を拡大させ、より効率的かつ迅速なＤＮＡ増幅反応を実行するための技術開発も必要とされていた。
そのため、従来の逆転写酵素やＤＮＡ増幅酵素を用いたＲＮＡ検出法において、多量の残存ＲＮＡ等の反応を阻害する夾雑物質の影響を最小化し、又、ＤＮＡ増幅反応中の副反応を極力抑制し、かつＤＮＡ増幅反応環境を至適化する技術を開発することで、ＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高め、数分子レベルの極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドにも適用できる高精度のＲＮＡ検出法の提供が強く要請されていた。また、ＰＣＲ反応における伸長温度の適用範囲を拡大させ、より効率的かつ迅速なＤＮＡ増幅反応を実行するための技術開発も必要とされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２０２０－８０８０６号公報
【特許文献2】特開２０１９－１９８２５９号公報
【特許文献3】特許第４７８５１７４号公報
【特許文献4】特開２０００－１３９４５９号公報
【特許文献5】特許第６１５２５５４号公報
【特許文献6】特許第６７１４２５１号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】「ＡｍｐｄｉｒｅｃｔTM ２０１９－ｎＣｏＶ検出キット」（２０２０年１１月改訂（第３版）（株）島津製作所
【非特許文献2】「Ｌｏｏｐａｍｐ(商標登録)新型コロナウイルス２０１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出試薬キット」添付書類（２０２０年４月作成）栄研化学（株）
【非特許文献3】国立感染症研究所， 病原体検出マニュアル（２０１９－ｎＣｏｖ Ｖｅｒ．２．９．１）
【非特許文献4】豊田研究所Ｒ＆Ｄレビュー Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２（２００１．６）第５７－６２
【非特許文献5】松浦俊一ら、ナノ空孔反応場を利用した高効率ＤＮＡ増幅システムの構築、分子生物学会講演要旨集（２０１２年１２月１１日）
【非特許文献6】松浦俊一ら、ナノ空間反応場を利用した１分子ＤＮＡ増幅システムの構築、生物工学会トピックス集（２０１６年０８月２５日）
【非特許文献7】松浦俊一ら、ナノ空間反応場を利用した１分子ＤＮＡ増幅システムの構築、生物工学会講演要旨集（２０１６年０９月３０日）
【非特許文献8】松浦俊一ら、シリカ系ナノ細孔を利用した１分子ＤＮＡ増幅技術の開発、分子生物学会講演要旨集（２０１６年１１月３０日）
【非特許文献9】Ｓ．Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．，ｖｏｌ．４，ｐｐ．２５９２０－２５９２３（２０１４）
【非特許文献10】Ｍ．Ｇ．Ｂｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．１２２１－１２２５（２０１０）
【非特許文献11】Ｇ．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４１９，ｐｐ．２０５－２１０（２０１１）
【非特許文献12】Ｇ．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４３２，ｐｐ．１３９－１４１（２０１３）
【非特許文献13】Ｓ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｐｐ．６８０－６８２（１９９３）
【非特許文献14】Ｔ．Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．５１１－５２７（２００９）
【非特許文献15】Ｄ．Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７９，ｐｐ．５４８－５５２（１９９８）
【非特許文献16】Ｙ．Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，ｖｏｌ．８，ｐｐ．６６８－６７４（２００７）
【非特許文献17】Ｎ．Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｐｏｒ． Ｍｅｓｏｐｏｒ． Ｍａｔｅｒ．， ｖｏｌ．２８０，ｐｐ．６６－７４（２０１９）
【非特許文献18】Ｎ．Ｗｏｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，ｖｏｌ．３９９，ｐｐ．４３７－４４６（２０２２）
【非特許文献19】Ｖ．Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．８１４，１４６１３４（２０２２）
【非特許文献20】Ｃ．Ｄａｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１１，ｐｐ．７１－７７（２０２２）
【非特許文献21】Ａ．Ｗ．Ｌａｍｂｉｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，８３６７２８（２０２２）
【非特許文献22】Ｋ．Ｉｔｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，ｖｏｌ．１５，ｅ０２３９４０３（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、極微量のＲＮＡ分子検体を高感度・高精度かつ迅速に検出可能なＲＴ－ＰＣＲ法、特にリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法を提供しようというものである。また、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）等のＲＮＡウイルス感染症に対する迅速かつ簡便な確定診断のための、１分子レベルのウイルス由来ＲＮＡの検出を可能とする高感度かつ高精度なＲＴ－ＰＣＲ技術を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
ＲＴ－ＰＣＲ法のうちでもリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法の場合は、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行う際に、ＤＮＡ増幅酵素の付近で逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写反応が速やかに起こる必要があり、かつ蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ）からの蛍光検出を正確に行えることが必要となる。
しかし、シリカ系ナノ空孔材料には蛍光検出を阻害する可能性が懸念されるため、まず、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応に対するシリカ系ナノ空孔材料の反応阻害について検討した。具体的には、中心細孔径の異なる６種類のシリカ系ナノ空孔材料を添加してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ増幅曲線の蛍光強度を測定した。その結果、いずれのシリカ系ナノ空孔材料自体もリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害する傾向がみられたものの、ＳＢＡ型／ＦＳＭ型のいずれも細孔径が小さいほど反応阻害が抑えられることがわかった。例えば、ＳＢＡ５．４（中心細孔径５．４ｎｍ）及びＦＳＭ２．６（中心細孔径２．６ｎｍ）であれば、蛍光検出にほぼ不都合がない。
しかし、シリカ系ナノ空孔材料には蛍光検出を阻害する可能性が懸念されるため、まず、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応に対するシリカ系ナノ空孔材料の反応阻害について検討した。具体的には、中心細孔径の異なる６種類のシリカ系ナノ空孔材料を添加してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ増幅曲線の蛍光強度を測定した。その結果、いずれのシリカ系ナノ空孔材料自体もリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害する傾向がみられたものの、ＳＢＡ型／ＦＳＭ型のいずれも細孔径が小さいほど反応阻害が抑えられることがわかった。例えば、ＳＢＡ５．４（中心細孔径５．４ｎｍ）及びＦＳＭ２．６（中心細孔径２．６ｎｍ）であれば、蛍光検出にほぼ不都合がない。
【0012】
また、本発明の実施例でＤＮＡ増幅酵素として用いたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単にＫＯＤともいう。）はＴａｑやＰｆｕと比較して、ＤＮＡ合成速度、プロセッシビティ、熱安定性などに優れたＤＮＡ増幅酵素であるが、ＴａｑやＰｆｕのように５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもっていないため、単独では、蛍光標識プローブ法によるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで使用することができない。したがって、シリカ系ナノ空孔材料に固定化するＤＮＡ増幅酵素としてＫＯＤを選択して、ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲに使用する場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ等の他のＤＮＡ増幅酵素と協調して働くことが求められる。しかも、上述のように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲでは、シリカ系ナノ空孔材料存在下での逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写反応及びシリカ系ナノ空孔材料内に吸着されたＫＯＤの付近でＫＯＤによるＤＮＡ増幅反応と共に、他のＤＮＡ増幅酵素由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による蛍光標識プローブの分解反応が速やかに起こる必要がある。
そのような懸念があったため、ＫＯＤをシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を、蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ）を用いたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法に適用し、遊離のＫＯＤ（未固定）を用いた場合、及び非特許文献３の病原体検出マニュアルに記載の従来のリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬の場合と比較した。
具体的には、まず、ＫＯＤ自身の添加効果をみるため、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ試料を、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に遊離のＫＯＤ（未固定）を添加してＲＴ－ＰＣＲを行い、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を作成し、ＫＯＤ未添加のポジティブコントロールの場合と比較したところ、両者に変化がないことを確認した。
次いで、同様に、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ試料と共に、１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬をＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４）複合体を含む反応溶液内でＲＴ－ＰＣＲを行い、その検出精度及び効率をポジティブコントロールと比較した。その結果、ＫＯＤをシリカ系ナノ空孔材料に固定化して用いた場合に高感度化を示唆するデータを得た。
以上のように、１ステップＲＴ－ＰＣＲ法のＤＮＡ増幅酵素としてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを採用した場合でも、１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬中に含まれていた５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素と協調してＤＮＡ増幅反応と同時にＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブの分解反応が速やかに行われたことと解される。すなわち、シリカ系ナノ空孔材料に固定化されたＫＯＤの場合は、他のＤＮＡ増幅酵素と、ＤＮＡ増幅反応においても高いシナジー効果が期待できることであり、当該効果が遊離のＫＯＤでは全く観察できなかったことから見て、予想外の効果であった。
そのような懸念があったため、ＫＯＤをシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を、蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ）を用いたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法に適用し、遊離のＫＯＤ（未固定）を用いた場合、及び非特許文献３の病原体検出マニュアルに記載の従来のリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬の場合と比較した。
具体的には、まず、ＫＯＤ自身の添加効果をみるため、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ試料を、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に遊離のＫＯＤ（未固定）を添加してＲＴ－ＰＣＲを行い、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を作成し、ＫＯＤ未添加のポジティブコントロールの場合と比較したところ、両者に変化がないことを確認した。
次いで、同様に、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ試料と共に、１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬をＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４）複合体を含む反応溶液内でＲＴ－ＰＣＲを行い、その検出精度及び効率をポジティブコントロールと比較した。その結果、ＫＯＤをシリカ系ナノ空孔材料に固定化して用いた場合に高感度化を示唆するデータを得た。
以上のように、１ステップＲＴ－ＰＣＲ法のＤＮＡ増幅酵素としてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを採用した場合でも、１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬中に含まれていた５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素と協調してＤＮＡ増幅反応と同時にＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブの分解反応が速やかに行われたことと解される。すなわち、シリカ系ナノ空孔材料に固定化されたＫＯＤの場合は、他のＤＮＡ増幅酵素と、ＤＮＡ増幅反応においても高いシナジー効果が期待できることであり、当該効果が遊離のＫＯＤでは全く観察できなかったことから見て、予想外の効果であった。
【0013】
一方、ＲＴ－ＰＣＲ法のうちの２ステップＲＴ－ＰＣＲ法の場合についても、遊離のＫＯＤ（未固定）では、極微量のＲＮＡ分子（１０、１コピー）を標的とした場合にＤＮＡ増幅が認められないが、シリカ系ナノ空孔材料に固定化されたＫＯＤを用いた場合には、予想を超えたＤＮＡ増幅反応の向上効果を観察した。
具体的には、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）では、４０サイクルで２段階のＰＣＲ反応（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）による検出に合計４時間（２時間のＰＣＲ反応を２回）を要し、通常は、１段階目のＰＣＲでの検出は困難であるとされているところ、遊離のＫＯＤ（未固定）を用いた場合はＤＮＡ増幅がみられないが、シリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４）に固定化されたＫＯＤを用いた場合は１段階目のＰＣＲにおいて１分子レベルの極微量ＲＮＡの精確な増幅検出を達成した（２時間のＰＣＲ反応を１回）。さらに、ＰＣＲ反応条件を最適化することによって反応時間の短縮にも成功した。
以上のように、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体は、極微量のＲＮＡ試料に対して用いる１ステップ及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法のいずれにおいても、その迅速かつ精確な増幅検出に寄与することができることがわかった。
具体的には、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）では、４０サイクルで２段階のＰＣＲ反応（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）による検出に合計４時間（２時間のＰＣＲ反応を２回）を要し、通常は、１段階目のＰＣＲでの検出は困難であるとされているところ、遊離のＫＯＤ（未固定）を用いた場合はＤＮＡ増幅がみられないが、シリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４）に固定化されたＫＯＤを用いた場合は１段階目のＰＣＲにおいて１分子レベルの極微量ＲＮＡの精確な増幅検出を達成した（２時間のＰＣＲ反応を１回）。さらに、ＰＣＲ反応条件を最適化することによって反応時間の短縮にも成功した。
以上のように、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体は、極微量のＲＮＡ試料に対して用いる１ステップ及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法のいずれにおいても、その迅速かつ精確な増幅検出に寄与することができることがわかった。
【0014】
本発明者らは、さらに高感度・高精度に被検ＲＮＡ試料を同定、検出するためのＲＴ－ＰＣＲ法を開発すべく、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体の改良ができないかを検討した。
ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いるためのＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造するにあたり、ＰＣＲ反応系用（通常、反応液量は２０～５０μＬ）のＰＣＲチューブやＰＣＲプレートなどのＰＣＲ用反応容器を用いる際に、シリカ系ナノ空孔材料の粉末を約０．１～０．５ｍｇずつ分注する必要がある。一般には、精密電子天秤などを用いてシリカ粉末の秤量を行うが、微量サンプルの取り扱いが難しいために多検体サンプルによるＰＣＲ反応に向けては、シリカ粉末の分散液からの分注操作が有効であることが考えられる。しかし、当該シリカ粉末は比重が大きいため、通常の緩衝液に分散させた状態では時間の経過とともに沈降してしまい、ピペッティング操作による正確な分注が困難である。つまり、その際のシリカ粉末材料の正確な分注が課題となる。
そこで、本発明者らは、グリセロール等の増粘剤を添加し、シリカ分散液の粘度を増大させ、沈降を抑制することで正確に分注することを思いついた。しかし、グリセロールは、確かにシリカ分散液の粘度を増大させ分注を容易にするが、高濃度のグリセロールの存在は、続くＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害することが懸念される。そればかりか、分注操作の際に偶然に混入した核酸夾雑物などが、数分子レベルの極微量ＲＮＡの選択的な検出を阻害する可能性もあった。
ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いるためのＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造するにあたり、ＰＣＲ反応系用（通常、反応液量は２０～５０μＬ）のＰＣＲチューブやＰＣＲプレートなどのＰＣＲ用反応容器を用いる際に、シリカ系ナノ空孔材料の粉末を約０．１～０．５ｍｇずつ分注する必要がある。一般には、精密電子天秤などを用いてシリカ粉末の秤量を行うが、微量サンプルの取り扱いが難しいために多検体サンプルによるＰＣＲ反応に向けては、シリカ粉末の分散液からの分注操作が有効であることが考えられる。しかし、当該シリカ粉末は比重が大きいため、通常の緩衝液に分散させた状態では時間の経過とともに沈降してしまい、ピペッティング操作による正確な分注が困難である。つまり、その際のシリカ粉末材料の正確な分注が課題となる。
そこで、本発明者らは、グリセロール等の増粘剤を添加し、シリカ分散液の粘度を増大させ、沈降を抑制することで正確に分注することを思いついた。しかし、グリセロールは、確かにシリカ分散液の粘度を増大させ分注を容易にするが、高濃度のグリセロールの存在は、続くＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害することが懸念される。そればかりか、分注操作の際に偶然に混入した核酸夾雑物などが、数分子レベルの極微量ＲＮＡの選択的な検出を阻害する可能性もあった。
【0015】
そのような重大な懸念材料があったことから、本発明者らは、グリセロール含有緩衝液（例えば、５０％グリセロール－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液）に分散させた当該シリカ粉末を適量、ＰＣＲチューブ等に分注した後、緩衝液による洗浄工程（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などで３度処理する方法）によってグリセロールを除去しようと想起した。
前記のグリセロールを含有させたシリカ粉末分散液に対して、緩衝液による洗浄工程を行った後にＤＮＡ増幅酵素の固定化を行い、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を調製し、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供したところ、驚くべきことに、核酸夾雑物に起因する副反応が抑制され、かつ増幅反応の効率も高まる、という実験結果を得ることができた。
固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて測定を行った結果、当該シリカ表面の末端シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）の分布に違いが見られ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で処理したサンプルではシリカ骨格構造中に隣接して存在するシラノール基同士が一部縮合していることが判明した。このことより、緩衝液の影響によってシリカの表面性状もより疎水的に変化したことが示唆された。
前記のグリセロールを含有させたシリカ粉末分散液に対して、緩衝液による洗浄工程を行った後にＤＮＡ増幅酵素の固定化を行い、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を調製し、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供したところ、驚くべきことに、核酸夾雑物に起因する副反応が抑制され、かつ増幅反応の効率も高まる、という実験結果を得ることができた。
固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて測定を行った結果、当該シリカ表面の末端シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）の分布に違いが見られ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で処理したサンプルではシリカ骨格構造中に隣接して存在するシラノール基同士が一部縮合していることが判明した。このことより、緩衝液の影響によってシリカの表面性状もより疎水的に変化したことが示唆された。
【0016】
蛍光標識プローブを用いたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法において前記の方法により疎水性を高めたシリカ系ナノ空孔材料の規則性細孔に固定化したＤＮＡ増幅酵素による効果を検証した。具体的には、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を、疎水性を高めたシリカ系ナノ空孔材料に固定化した場合と、未処理のシリカ系ナノ空孔材料に固定化した場合及びＰＣ（ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料を含まない場合）のそれぞれにおけるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲのＲＮＡ検出の検量線（１０００、１００、１０、１コピー）を作成したところ、ＫＯＤ－疎水性シリカ複合体＞ＫＯＤ－未処理シリカ複合体＞ＰＣの順でより低い位置に平行移動（Ｃｑ値が減少）したことを観察した。このことから、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を、疎水化処理シリカ系ナノ空孔材料に固定化することで、ＲＴ－ＰＣＲにおけるＲＮＡ検出のさらなる高感度化が示唆された。
また、前述のように、現行の病原体検出マニュアルでは４０サイクルで計４時間（２時間のＰＣＲ反応を２回）要するとされる２ステップＲＴ－ＰＣＲでの検出も、シリカ系ナノ空孔材料にＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を固定化することで１段階目のＰＣＲにおいて１分子レベルの極微量ＲＮＡの精確な増幅検出を達成できたが、前記の方法により疎水性を高めたシリカ系ナノ空孔材料を用いた場合においては、さらに１段階目のＰＣＲ反応で標的配列をより精確に検出できた。
また、前述のように、現行の病原体検出マニュアルでは４０サイクルで計４時間（２時間のＰＣＲ反応を２回）要するとされる２ステップＲＴ－ＰＣＲでの検出も、シリカ系ナノ空孔材料にＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を固定化することで１段階目のＰＣＲにおいて１分子レベルの極微量ＲＮＡの精確な増幅検出を達成できたが、前記の方法により疎水性を高めたシリカ系ナノ空孔材料を用いた場合においては、さらに１段階目のＰＣＲ反応で標的配列をより精確に検出できた。
【0017】
このような知見から、本発明において、シリカ系ナノ空孔材料表面の疎水化を促進することで、さらなる増幅反応の感度と精度を高めることが可能であることが示唆されたため、シリカ系ナノ空孔材料に対し、硝酸を用いた積極的な表面処理を施した。その結果、積極的に疎水性を高めたシリカ系ナノ空孔材料においても、より高いＤＮＡ増幅効率が示された。
【0018】
以上のように、本発明は、ＲＴ－ＰＣＲに用いるＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を細孔径の小さなシリカ系ナノ空孔材料に固定化し、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体とすることで、ＲＴ－ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ増幅反応の感度及び精度を高めることができ、はじめて数分子レベルという極微量のＲＮＡ試料を、高感度かつ高精度に検出することに成功した。
さらに、本発明は、ＤＮＡ増幅酵素を当該シリカ系ナノ空孔材料担体に固定化する前に、予め、グリセロールを含んだ緩衝液などを用いて当該シリカ粉末をＰＣＲチューブ等に正確に分注し、次いで、緩衝液により１回以上の洗浄工程及び遠心分離による回収工程を施すか、又は硝酸などによる表面処理を施すことで積極的に当該シリカ粉末の疎水化を促進させた上で、ＤＮＡ増幅酵素との複合体を形成させるというＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法も提供する。そのことにより、ＲＴ－ＰＣＲ反応中での副反応を極力抑え、さらに、ＲＮＡ検出の感度及び精度を高めることができた。
さらに、本発明は、ＤＮＡ増幅酵素を当該シリカ系ナノ空孔材料担体に固定化する前に、予め、グリセロールを含んだ緩衝液などを用いて当該シリカ粉末をＰＣＲチューブ等に正確に分注し、次いで、緩衝液により１回以上の洗浄工程及び遠心分離による回収工程を施すか、又は硝酸などによる表面処理を施すことで積極的に当該シリカ粉末の疎水化を促進させた上で、ＤＮＡ増幅酵素との複合体を形成させるというＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法も提供する。そのことにより、ＲＴ－ＰＣＲ反応中での副反応を極力抑え、さらに、ＲＮＡ検出の感度及び精度を高めることができた。
【0019】
また、１ステップＲＴ－ＰＣＲ法の場合、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）をシリカ系ナノ空孔材料に固定化しＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成後に、逆転写酵素を含むリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬を加えて攪拌しながら反応を開始させるだけで、逆転写酵素の大部分はナノ空孔内に吸着され、効率よく安定に反応が進むが、逆転写酵素をあらかじめＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）と共に、シリカ系ナノ空孔材料担体に固定化しておくと、さらに熱安定性が向上し、その結果、逆転写反応をより高温下で行うことができ、ｃＤＮＡを高収量で合成できるようになるため、ＲＴ－ＰＣＲの反応を高感度化できる。
以上の知見を得たことで、本発明を完成した。
以上の知見を得たことで、本発明を完成した。
【0020】
すなわち、上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
〔１〕 被検試料中の微量な標的ＲＮＡ分子をＲＴ－ＰＣＲ法を適用して精確に検出又は同定するための方法であって、
用いる酵素系のうち、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内に固定化した「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として用いることを特徴とする、方法。
〔２〕 前記シリカ系ナノ空孔材料として、中心細孔直径が２～８ｎｍのシリカ系ナノ空孔材料を用いることを特徴とする前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、中心細孔直径が４～８ｎｍのＳＢＡ、２～５ｎｍのＦＳＭ、２～４ｎｍのＭＣＭ、及び２～８ｎｍのＴＭＰＳのうちのいずれかの材料から選択されることを特徴とする、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕 標的ＲＮＡ分子がＲＮＡウイルス由来ＲＮＡである、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法であるか、又は２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
ここで、本発明のＲＴ－ＰＣＲ法としては、「リアルタイム２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」が含まれており、本発明において開示された方法は、これら「リアルタイム２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」にも適用できる。
〔６〕 ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法であって、かつ用いる逆転写酵素が、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素と共にシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を形成している、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、あらかじめ疎水化処理が施された表面を有するシリカ系ナノ空孔材料であることを特徴とする、前記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 前記〔７〕に記載の方法で用いるための疎水性表面を有するシリカ系ナノ空孔材料の調製方法であって、下記の（１）又は（２）の工程を含む、方法：
（１）シリカ系ナノ空孔材料に対してＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を添加し、攪拌による懸濁工程と遠心分離による回収工程とを複数回繰り返す工程、
（２）シリカ系ナノ空孔材料に対して硝酸又は塩酸を加え、加熱処理後、洗浄、乾燥する工程。
〔９〕 前記（１）のシリカ系ナノ空孔材料は、グリセロールを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液と混合攪拌させた懸濁液として、ＰＣＲ反応容器に分注させた後に遠心分離により沈殿物として得られる、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕 被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットであって、
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素がシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素が固定された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含む、キット。
〔１１〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、中心細孔直径が２～８ｎｍのシリカ系ナノ空孔材料である前記〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、疎水化処理が施されている表面を有するシリカ系ナノ空孔材料である、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載のキット。
〔１３〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載のキットであって、
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくはさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、並びに
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び（１）に含まれたＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素をさらに含む、ＰＣＲ反応溶液、
を含むキット。
なお、ｃＤＮＡ合成用プライマー及びＤＮＡ増幅用プライマー・蛍光検出用プローブセットはキットを実際に用いるユーザーが自由に選択できる方が好ましいので、通常はキットに含まない。
〔１４〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法が２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載のキットであって、
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、ＤＮＡ増幅用プライマーをさらに含み、並びに、所望により、
（３）標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液、
を含むキット。
なお、ＤＮＡ増幅用プライマー及びｃＤＮＡ合成用プライマーはキットを実際に用いるユーザーが使用時に自由に選択できる方が好ましいので、通常はキットに含まない。
〔１５〕 被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供する臨床検査用キットであって、
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくは「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器を含み、
前記ＰＣＲ反応溶液が１～４０％濃度のグリセロールを含有していることを特徴とする、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
〔１６〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である前記〔１５〕に記載の臨床検査用キットであって、
ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び前記ＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素を含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
〔１７〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法が２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である前記〔１５〕に記載の臨床検査用キットであって、
所望によりｄＮＴＰｓ及び緩衝液、ＤＮＡ増幅用プライマーを含み、
所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液をさらに含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
〔１〕 被検試料中の微量な標的ＲＮＡ分子をＲＴ－ＰＣＲ法を適用して精確に検出又は同定するための方法であって、
用いる酵素系のうち、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内に固定化した「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として用いることを特徴とする、方法。
〔２〕 前記シリカ系ナノ空孔材料として、中心細孔直径が２～８ｎｍのシリカ系ナノ空孔材料を用いることを特徴とする前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、中心細孔直径が４～８ｎｍのＳＢＡ、２～５ｎｍのＦＳＭ、２～４ｎｍのＭＣＭ、及び２～８ｎｍのＴＭＰＳのうちのいずれかの材料から選択されることを特徴とする、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕 標的ＲＮＡ分子がＲＮＡウイルス由来ＲＮＡである、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法であるか、又は２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
ここで、本発明のＲＴ－ＰＣＲ法としては、「リアルタイム２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」が含まれており、本発明において開示された方法は、これら「リアルタイム２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」にも適用できる。
〔６〕 ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法であって、かつ用いる逆転写酵素が、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素と共にシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を形成している、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、あらかじめ疎水化処理が施された表面を有するシリカ系ナノ空孔材料であることを特徴とする、前記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 前記〔７〕に記載の方法で用いるための疎水性表面を有するシリカ系ナノ空孔材料の調製方法であって、下記の（１）又は（２）の工程を含む、方法：
（１）シリカ系ナノ空孔材料に対してＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を添加し、攪拌による懸濁工程と遠心分離による回収工程とを複数回繰り返す工程、
（２）シリカ系ナノ空孔材料に対して硝酸又は塩酸を加え、加熱処理後、洗浄、乾燥する工程。
〔９〕 前記（１）のシリカ系ナノ空孔材料は、グリセロールを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液と混合攪拌させた懸濁液として、ＰＣＲ反応容器に分注させた後に遠心分離により沈殿物として得られる、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕 被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットであって、
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素がシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素が固定された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含む、キット。
〔１１〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、中心細孔直径が２～８ｎｍのシリカ系ナノ空孔材料である前記〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕 前記シリカ系ナノ空孔材料が、疎水化処理が施されている表面を有するシリカ系ナノ空孔材料である、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載のキット。
〔１３〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載のキットであって、
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくはさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、並びに
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び（１）に含まれたＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素をさらに含む、ＰＣＲ反応溶液、
を含むキット。
なお、ｃＤＮＡ合成用プライマー及びＤＮＡ増幅用プライマー・蛍光検出用プローブセットはキットを実際に用いるユーザーが自由に選択できる方が好ましいので、通常はキットに含まない。
〔１４〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法が２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載のキットであって、
（１）少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」が内包された反応容器、又は前記いずれかの複合体を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器、
（２）ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により、ＤＮＡ増幅用プライマーをさらに含み、並びに、所望により、
（３）標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液、
を含むキット。
なお、ＤＮＡ増幅用プライマー及びｃＤＮＡ合成用プライマーはキットを実際に用いるユーザーが使用時に自由に選択できる方が好ましいので、通常はキットに含まない。
〔１５〕 被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供する臨床検査用キットであって、
少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素を含む「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」もしくは「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含むＰＣＲ反応溶液が内包された反応容器を含み、
前記ＰＣＲ反応溶液が１～４０％濃度のグリセロールを含有していることを特徴とする、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
〔１６〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法がリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法である前記〔１５〕に記載の臨床検査用キットであって、
ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含み、所望により標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、逆転写酵素及び前記ＤＮＡ増幅酵素以外のＤＮＡ増幅酵素を含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
〔１７〕 前記ＲＴ－ＰＣＲ法が２ステップＲＴ－ＰＣＲ法である前記〔１５〕に記載の臨床検査用キットであって、
所望によりｄＮＴＰｓ及び緩衝液、ＤＮＡ増幅用プライマーを含み、
所望により、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、逆転写反応溶液をさらに含む、冷凍保管可能な臨床検査用キット。
【発明の効果】
【0021】
本発明においては、ＲＴ－ＰＣＲに用いるＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を、細孔径の小さなシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）に固定化し、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体とすることで、現行のリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法に対する高感度化（１０倍程度）を実現できる。さらに、同様にして、２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）法に対する高感度化（１００倍程度）を実現できる。現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）では、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおいて２段階のＰＣＲによる検出が行われている。そのため、通常は、１段階目のＰＣＲでの検出は困難であるが、メソポーラスシリカの規則性細孔にＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を固定化することで１段階目のＰＣＲにおいても１分子レベルの極微量ＲＮＡからの検出を可能にした。さらに、当該シリカ系ナノ空孔材料表面の疎水化を促進させることで、ＲＴ－ＰＣＲ反応中での副反応を極力抑え、ＲＮＡ検出の感度及び精度を高めることができた。
したがって、本発明におけるＲＴ－ＰＣＲ法の高感度化および高精度化により、偽陰性または偽陽性の低減が達成され、その結果、迅速で正確な新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などのＲＮＡウイルス検体の検出、判定が可能となる。
したがって、本発明におけるＲＴ－ＰＣＲ法の高感度化および高精度化により、偽陰性または偽陽性の低減が達成され、その結果、迅速で正確な新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などのＲＮＡウイルス検体の検出、判定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（合成品：新型コロナウイルス検出用標準物質）を対象としＲＮＡ検出におけるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔に固定化したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、逆転写酵素による（ａ）リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法及び（ｂ）２ステップＲＴ－ＰＣＲ法（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）の手順を模式的に示す説明図である。図中、（ａ）（ｂ）の写真は、酵素－メソポーラスシリカ複合体含有ＰＣＲ反応液を含んだＰＣＲチューブ、である。
【図2】ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体の調製方法及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）の開始までの手順を模式的に示す説明図である。
【図3】固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて分析した、未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回処理したＳＢＡ５．４、又、硝酸と混和して表面疎水性を向上させたＳＢＡ５．４の２９Ｓｉ－ＤＤＭＡＳ ＮＭＲスペクトルを示す。右側は各シグナルが意味する２９Ｓｉ核周辺の局所構造。これらを定量的且つ詳細に解析することで、表面（細孔内壁面）の化学状態を推定することができる。
【図4】ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）とＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を混和した直後の上清及びシリカ細孔表面に含まれるＤＮＡ増幅酵素の含有率におけるｐＨ依存性を評価した結果、である。図中、（ａ）は、未処理のＳＢＡ５．４を用いた場合、また、（ｂ）は、硝酸と混和して表面疎水性を向上させたＳＢＡ５．４を用いた場合、である。
【図5】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００コピー）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線におけるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ：ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］、７．１ｎｍ［ＳＢＡ７．１］、１０．６ｎｍ［ＳＢＡ１０．６］）、ＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）、ＦＳＭ－２２（細孔径：４．２ｎｍ［ＦＳＭ４．２］、８．０ｎｍ［ＦＳＭ８．０］））の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝１）、である（ＰＣ：メソポーラスシリカを添加していないポジティブコントロール）。
【図6】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００、１００コピー）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線における遊離のＫＯＤ（未固定）、又、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－未処理ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）複合体の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝１）、である（ＰＣ：遊離のＫＯＤ（未固定）及びＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）。
【図7】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００コピー）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線におけるＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）複合体中のＫＯＤ含有量の影響を評価した結果（Ｎ＝１）、である（ＰＣ：ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）。図中、（ａ）は、未処理のＳＢＡ５．４を用いた場合、また、（ｂ）は、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回処理したＳＢＡ５．４を用いた場合、である。
【図8】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００、１００、１０、１コピー）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲの検量線における未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、又、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回処理したＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝３、平均値をプロット）、である（ＰＣ：ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）。
【図9】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００コピー）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線における未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、硝酸処理ＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４及び硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝１）、である（ＰＣ：ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）。
【図10】遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、未処理の３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカ（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］、７．１ｎｍ［ＳＢＡ７．１］、１０．６ｎｍ［ＳＢＡ１０．６］）に固定化したＤＮＡ増幅酵素を用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））、である。
【図11】遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回処理した３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカ（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］、７．１ｎｍ［ＳＢＡ７．１］、１０．６ｎｍ［ＳＢＡ１０．６］）に固定化したＤＮＡ増幅酵素を用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））、である。
【図12】遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、未処理の３種類のＦＳＭ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］、４．２ｎｍ［ＦＳＭ４．２］、８．０ｎｍ［ＦＳＭ８．０］）に固定化したＤＮＡ増幅酵素を用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））、である。
【図13】遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回処理した３種類のＦＳＭ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］、４．２ｎｍ［ＦＳＭ４．２］、８．０ｎｍ［ＦＳＭ８．０］）に固定化したＤＮＡ増幅酵素を用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））、である。
【図14】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、１コピー）のＳ領域（５４７塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、硝酸処理ＳＢＡ５．４、又、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４及び硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝３）、である（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））。
【図15】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０コピー）のＳ領域（５４７塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を、伸長温度を指標として評価した結果（Ｎ＝３）である。
【図16】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００コピー）のＮ２領域（１５８塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、又、ＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－メソポーラスシリカ複合体の添加の影響を、アニーリング及び伸長温度を指標として評価した結果である。
【図17】固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて分析した、（ａ）未処理のＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）及び１３Ｍ 硝酸で処理したＦＳＭ２．６、（ｂ）未処理のＭＣＭ－４１（細孔径：３．１ｎｍ［ＭＣＭ３．１］）及び１３Ｍ硝酸処理ＭＣＭ３．１、（ｃ）未処理のＴＭＰＳ（細孔径：２．０ｎｍ［ＴＭＰＳ２．０］）及び１３Ｍ硝酸処理ＴＭＰＳ２．０、又、（ｄ）未処理のＳBＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４の２９Ｓｉ－ＤＤＭＡＳ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図18】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００コピー）のＳ領域（５４７塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける未処理のＳBＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－メソポーラスシリカ複合体の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝３）である（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））。
【図19】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００コピー）のＳ領域（５４７塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける（ａ）未処理のＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）及び１３Ｍ 硝酸で処理したＦＳＭ２．６、（ｂ）未処理のＭＣＭ－４１（細孔径：３．１ｎｍ［ＭＣＭ３．１］）及び１３Ｍ硝酸処理ＭＣＭ３．１、（ｃ）未処理のＴＭＰＳ（細孔径：２．０ｎｍ［ＴＭＰＳ２．０］）及び１３Ｍ硝酸処理ＴＭＰＳ２．０、又、（ｄ）未処理のＳBＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－メソポーラスシリカ複合体の添加の影響を評価した結果（Ｎ＝３）である（ＰＣ：ＫＯＤ（未固定））。
【図20】未処理のＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）及び１３Ｍ 硝酸で処理したＦＳＭ２．６、未処理のＭＣＭ－４１（細孔径：３．１ｎｍ［ＭＣＭ３．１］）及び１３Ｍ硝酸処理ＭＣＭ３．１、未処理のＴＭＰＳ（細孔径：２．０ｎｍ［ＴＭＰＳ２．０］）及び１３Ｍ硝酸処理ＴＭＰＳ２．０、又、未処理のＳBＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４と、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を混和した直後の上清（図中、白棒状印）及びシリカ細孔表面（図中、黒棒状印）に含まれるＤＮＡ増幅酵素の含有率を評価した結果（緩衝液のｐＨがｐＨ＝8の場合）、である。図中、（ａ）は、ＫＯＤ（１０ｕｎｉｔｓ）、また、（ｂ）は、ＫＯＤ（１ｕｎｉｔ）を含んだ緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８））２０μＬと、各種シリカ系ナノ空孔材料（０．５ｍｇ）とを混和した場合、である。
【図21】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００コピー）のＳ領域（５４７塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、１３Ｍ 硝酸で処理したＳＢＡ５．４、又、未処理のＴＭＰＳ（細孔径：２．０ｎｍ［ＴＭＰＳ２．０］）を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－メソポーラスシリカ複合体の添加の影響を、－３０℃で冷凍保管し、解凍したＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体によるＰＣＲ産物濃度を指標として６３日間における長期保存安定性を評価した結果である。図中、（ａ）は、冷凍保管した酵素－メソポーラスシリカ複合体を含んだＰＣＲチューブ（液量：０μＬ）の写真、（ｂ）は、冷凍保管サンプルを解凍した後、反応基質を添加したＰＣＲチューブ（液量：２０μＬ）の写真、また、（ｃ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合（未固定ＫＯＤでのＰＣＲ産物濃度：０．２２ｎｇ／μＬ）、である。
【図22】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００コピー）のＳ領域（５４７塩基）を標的とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ））の１段階目のＰＣＲにおける未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を、グリセロール（０、１０、２０、３０、４０、５０％）、又、通常の２倍濃度のｄＮＴＰｓ及び塩化マグネシウム等を含んだ緩衝液１０μＬを重層し、－３０℃で冷凍保管し、解凍したＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体によるＰＣＲ産物濃度を指標として１４日間における長期保存安定性を評価した結果である。図中、（ａ）は、冷凍保管した酵素－メソポーラスシリカ複合体を含んだＰＣＲチューブ（液量：１０μＬ）の写真、（ｂ）は、冷凍保管サンプルを解凍した後、反応基質を添加したＰＣＲチューブ（液量：２０μＬ）の写真、また、（ｃ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。
【図23】（ａ）Ｓ遺伝子（３８２２塩基）を含む新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ゲノムマップ及びＳ遺伝子を標的とした遺伝子特異的プライマー（Ｓ遺伝子特異的プライマー－１及び－２）を用いた逆転写反応により合成された長鎖ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ増幅の標的領域（１－４）、又、（ｂ）遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、及び、未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域１：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－１を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
【図24】（ａ）遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、及び、（ｂ）未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域２：１２４５塩基対、標的領域３：１６７０塩基対、及び、標的領域４：９９８塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－１を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
【図25】遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、及び未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域３：１６７０塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
【図26】遊離のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、及び、未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域２：１２４５塩基対）をゲル電気泳動で解析し、ＰＣＲの感度を評価した結果である。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）粒子から抽出した完全長ＲＮＡ（９、３コピー）から、（ａ）Ｓ遺伝子特異的プライマー－１、及び、（ｂ）Ｓ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝５）、である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
１．本発明において用いる「シリカ系ナノ空孔材料」について
（１－１）シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の種類
本発明で固定化酵素担体として用いるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）は、二酸化ケイ素（シリカ）を材質とする、均一な細孔を持つ多孔質材料であって、細孔の中心細孔直径が２～５０ｎｍ（メソ孔：ＩＵＰＡＣ）であり、一般的には、全細孔容積が０．１～２．０ｍＬ／ｇで、比表面積が２００～１５００ｍ２／ｇである（非特許文献１３など）。メソポーラスシリカ内の細孔を規則的に形成させるための一般的合成方法には、（ａ）液晶の鋳型法と（ｂ）シート変形法の２種類あり、（ａ）では、界面活性剤をシリカ又はケイ酸ソーダと混和して縮合による自己組織化させ、焼成により界面活性剤を除去するのに対して、（ｂ）では界面活性剤を層状のカネマイト（ＮａＨＳｉ２Ｏ３・３Ｈ２Ｏ）に添加してイオン交換によりシート変形を起こさせてハニカム構造を形成させ界面活性剤を焼成除去する方法（非特許文献１４）がある。（ａ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＭＣＭ（ＭＣＭ－４１など）」、「ＳＢＡ（ＳＢＡ－１５）」などがあり、（ｂ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＦＳＭ（ＦＳＭ－１６など）」などがある。両法で得られる「シリカ系ナノ空孔材料」は、いずれも通常ハニカム構造の２次元六方晶系の結晶構造を有している。（ａ）と（ｂ）の両方の方法により合成されるものとして、ＴＭＰＳ（Ｔａｉｙｏ Ｋａｇａｋｕ Ｍｅｓｏ Ｐｏｒｏｕｓ Ｓｉｌｉｃａ、太陽化学社製）などがある。また、（ａ）の方法で得られる「ＭＣＭ」及び「ＳＢＡ」などでは、立方晶系の結晶構造を採るものもある。
本発明において用いられる「シリカ系ナノ空孔材料」は、上記いずれかの手法で合成された規則的な細孔構造を有する「シリカ系ナノ空孔材料」であり、より好ましくは、「ＳＢＡ」「ＦＳＭ」「ＭＣＭ」又は「ＴＭＰＳ」であり、特に好ましくは「ＳＢＡ」又は「ＳＢＡ」の後処理過程でＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、又は、硝酸と混和して表面疎水性を向上させた「酸処理ＳＢＡ」である。なお、「ＳＢＡ」及び「ＭＣＭ」は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製品なども適用できる。
（１－１）シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の種類
本発明で固定化酵素担体として用いるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）は、二酸化ケイ素（シリカ）を材質とする、均一な細孔を持つ多孔質材料であって、細孔の中心細孔直径が２～５０ｎｍ（メソ孔：ＩＵＰＡＣ）であり、一般的には、全細孔容積が０．１～２．０ｍＬ／ｇで、比表面積が２００～１５００ｍ２／ｇである（非特許文献１３など）。メソポーラスシリカ内の細孔を規則的に形成させるための一般的合成方法には、（ａ）液晶の鋳型法と（ｂ）シート変形法の２種類あり、（ａ）では、界面活性剤をシリカ又はケイ酸ソーダと混和して縮合による自己組織化させ、焼成により界面活性剤を除去するのに対して、（ｂ）では界面活性剤を層状のカネマイト（ＮａＨＳｉ２Ｏ３・３Ｈ２Ｏ）に添加してイオン交換によりシート変形を起こさせてハニカム構造を形成させ界面活性剤を焼成除去する方法（非特許文献１４）がある。（ａ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＭＣＭ（ＭＣＭ－４１など）」、「ＳＢＡ（ＳＢＡ－１５）」などがあり、（ｂ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＦＳＭ（ＦＳＭ－１６など）」などがある。両法で得られる「シリカ系ナノ空孔材料」は、いずれも通常ハニカム構造の２次元六方晶系の結晶構造を有している。（ａ）と（ｂ）の両方の方法により合成されるものとして、ＴＭＰＳ（Ｔａｉｙｏ Ｋａｇａｋｕ Ｍｅｓｏ Ｐｏｒｏｕｓ Ｓｉｌｉｃａ、太陽化学社製）などがある。また、（ａ）の方法で得られる「ＭＣＭ」及び「ＳＢＡ」などでは、立方晶系の結晶構造を採るものもある。
本発明において用いられる「シリカ系ナノ空孔材料」は、上記いずれかの手法で合成された規則的な細孔構造を有する「シリカ系ナノ空孔材料」であり、より好ましくは、「ＳＢＡ」「ＦＳＭ」「ＭＣＭ」又は「ＴＭＰＳ」であり、特に好ましくは「ＳＢＡ」又は「ＳＢＡ」の後処理過程でＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、又は、硝酸と混和して表面疎水性を向上させた「酸処理ＳＢＡ」である。なお、「ＳＢＡ」及び「ＭＣＭ」は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製品なども適用できる。
【0024】
（１－２）本発明で用いたシリカ系ナノ空孔材料の合成方法
本発明の実施例では、典型的な規則的な細孔構造を有する「シリカ系ナノ空孔材料」のうち、上記（ａ）のタイプの典型的な「ＳＢＡ（ＳＢＡ－１５）」及び上記（ｂ）のタイプの典型的な「ＦＳＭ（ＦＳＭ－１６、２２）」を用い、「ＦＳＭ」は、稲垣らの方法（非特許文献１４）、また、「ＳＢＡ」は、Ｚｈａｏらの方法（非特許文献１５）と卜部らの方法（非特許文献１６）の記載をそれぞれ参考にして合成した。
具体的には、「ＳＢＡ（ＳＢＡ－１５）」は、非イオン性界面活性剤を鋳型として用い、オルトケイ酸テトラエチルをシリカ源とした、酸性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得、「ＦＳＭ」は、カチオン性界面活性剤を鋳型として用い、層状ケイ酸塩であるカネマイトをシリカ源とした膨張剤（１，３，５－トリイソプロピルベンゼン）非存在あるいは存在下及び弱アルカリ性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得た。
本発明で用いる「シリカ系ナノ空孔材料」のうち、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ－１５）は、以下、細孔径に応じて単に、ＳＢＡ５．４（細孔径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ７．１（細孔径：７．１ｎｍ）、ＳＢＡ１０．６（細孔径：１０．６）ともいう。また、ＦＳＭ型メソポーラスシリカは、以下、細孔径に応じて単に、ＦＳＭ－１６については、ＦＳＭ２．６（細孔径：２．６ｎｍ）、ＦＳＭ－２２については、ＦＳＭ４．２（細孔径：４．２ｎｍ）及びＦＳＭ８．０（細孔径：８．０ｎｍ）ともいう。
本発明の実施例では、典型的な規則的な細孔構造を有する「シリカ系ナノ空孔材料」のうち、上記（ａ）のタイプの典型的な「ＳＢＡ（ＳＢＡ－１５）」及び上記（ｂ）のタイプの典型的な「ＦＳＭ（ＦＳＭ－１６、２２）」を用い、「ＦＳＭ」は、稲垣らの方法（非特許文献１４）、また、「ＳＢＡ」は、Ｚｈａｏらの方法（非特許文献１５）と卜部らの方法（非特許文献１６）の記載をそれぞれ参考にして合成した。
具体的には、「ＳＢＡ（ＳＢＡ－１５）」は、非イオン性界面活性剤を鋳型として用い、オルトケイ酸テトラエチルをシリカ源とした、酸性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得、「ＦＳＭ」は、カチオン性界面活性剤を鋳型として用い、層状ケイ酸塩であるカネマイトをシリカ源とした膨張剤（１，３，５－トリイソプロピルベンゼン）非存在あるいは存在下及び弱アルカリ性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得た。
本発明で用いる「シリカ系ナノ空孔材料」のうち、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ－１５）は、以下、細孔径に応じて単に、ＳＢＡ５．４（細孔径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ７．１（細孔径：７．１ｎｍ）、ＳＢＡ１０．６（細孔径：１０．６）ともいう。また、ＦＳＭ型メソポーラスシリカは、以下、細孔径に応じて単に、ＦＳＭ－１６については、ＦＳＭ２．６（細孔径：２．６ｎｍ）、ＦＳＭ－２２については、ＦＳＭ４．２（細孔径：４．２ｎｍ）及びＦＳＭ８．０（細孔径：８．０ｎｍ）ともいう。
【0025】
（１－３）シリカ系ナノ空孔材料の細孔径について
シリカ系ナノ空孔材料の一般的な細孔径は、中心細孔直径で２～５０ｎｍ（メソ孔）である。そのうち、本発明で用いられるシリカ系ナノ空孔材料の好ましい中心細孔直径は、２～９ｎｍであり、２～８ｎｍがより好ましい。具体的には、ＳＢＡの場合、中心細孔直径は４～９ｎｍ、好ましくは４～８ｎｍの範囲であり、より好ましくはＳＢＡ５．４（中心細孔直径：５．４ｎｍ）及びＳＢＡ７．１（中心細孔直径：７．１ｎｍ）であり、特にＳＢＡ５．４（中心細孔直径：５．４ｎｍ）が好ましい。ＦＳＭの場合は、中心細孔直径は２～８ｎｍ、好ましくは２～５ｎｍの範囲であり、より好ましくはＦＳＭ２．６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）及びＦＳＭ４．２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）であり、特にＦＳＭ２．６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）が好適である。また、ＭＣＭの好ましい中心細孔直径は２～４ｎｍであり、ＴＭＰＳの場合は２～８ｎｍである。
シリカ系ナノ空孔材料の一般的な細孔径は、中心細孔直径で２～５０ｎｍ（メソ孔）である。そのうち、本発明で用いられるシリカ系ナノ空孔材料の好ましい中心細孔直径は、２～９ｎｍであり、２～８ｎｍがより好ましい。具体的には、ＳＢＡの場合、中心細孔直径は４～９ｎｍ、好ましくは４～８ｎｍの範囲であり、より好ましくはＳＢＡ５．４（中心細孔直径：５．４ｎｍ）及びＳＢＡ７．１（中心細孔直径：７．１ｎｍ）であり、特にＳＢＡ５．４（中心細孔直径：５．４ｎｍ）が好ましい。ＦＳＭの場合は、中心細孔直径は２～８ｎｍ、好ましくは２～５ｎｍの範囲であり、より好ましくはＦＳＭ２．６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）及びＦＳＭ４．２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）であり、特にＦＳＭ２．６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）が好適である。また、ＭＣＭの好ましい中心細孔直径は２～４ｎｍであり、ＴＭＰＳの場合は２～８ｎｍである。
【0026】
２．本発明におけるシリカ系ナノ空孔材料表面の疎水化処理
本発明において、固定化酵素担体として用いるシリカ系ナノ空孔材料は、上記１．の製造法で得られたシリカ材料を未処理のまま用いるほか、以下に示す方法などにより、シリカ材料表面に疎水化処理を施すことが好ましい。
（２－１）シリカ系ナノ空孔材料のＰＣＲチューブ等への分注操作に伴う表面の「酸処理」
（２－１－１）ＰＣＲチューブ等への分注操作
本発明におけるＰＣＲチューブやＰＣＲプレートへのシリカ系ナノ空孔材料の粉末の分注方法では、グリセロール等の増粘性物質を含んだ緩衝液あるいは超純水をシリカ系ナノ空孔材料粉末と混合することで、粘度を増大させたシリカ分散液を得ることができる。その際、本発明においては、シリカ分散液調製用の緩衝液として、グリセロールを含有させた緩衝液、例えば、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）を用いることが好ましい。シリカ分散液の分注方法は、例えば、シリカ系ナノ空孔材料の粉末１０ｍｇを、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）緩衝液１ｍＬ中に懸濁させた後、５０μＬ分をＰＣＲチューブへ移し入れた場合、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇを分注したＰＣＲチューブを得ることができる。また、遠心分離後に上清を完全に除去することで、シリカ系ナノ空孔材料の沈殿物を得ることができる。
ここで、増粘性物質としては、グリセロールが好ましいが、グリセロールに代えて、プロピレングリコールの他、グリセリンやプロピレングリコールの脂肪酸エステルなどを用いることができる。またＲＴ－ＰＣＲ反応時にＰＣＲ反応阻害解消のために添加するベタイン類などの界面活性剤のうち、粘性のあるものを用いてもよく、その場合は続く洗浄工程が不完全であってもよい。
本発明において、固定化酵素担体として用いるシリカ系ナノ空孔材料は、上記１．の製造法で得られたシリカ材料を未処理のまま用いるほか、以下に示す方法などにより、シリカ材料表面に疎水化処理を施すことが好ましい。
（２－１）シリカ系ナノ空孔材料のＰＣＲチューブ等への分注操作に伴う表面の「酸処理」
（２－１－１）ＰＣＲチューブ等への分注操作
本発明におけるＰＣＲチューブやＰＣＲプレートへのシリカ系ナノ空孔材料の粉末の分注方法では、グリセロール等の増粘性物質を含んだ緩衝液あるいは超純水をシリカ系ナノ空孔材料粉末と混合することで、粘度を増大させたシリカ分散液を得ることができる。その際、本発明においては、シリカ分散液調製用の緩衝液として、グリセロールを含有させた緩衝液、例えば、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）を用いることが好ましい。シリカ分散液の分注方法は、例えば、シリカ系ナノ空孔材料の粉末１０ｍｇを、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）緩衝液１ｍＬ中に懸濁させた後、５０μＬ分をＰＣＲチューブへ移し入れた場合、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇを分注したＰＣＲチューブを得ることができる。また、遠心分離後に上清を完全に除去することで、シリカ系ナノ空孔材料の沈殿物を得ることができる。
ここで、増粘性物質としては、グリセロールが好ましいが、グリセロールに代えて、プロピレングリコールの他、グリセリンやプロピレングリコールの脂肪酸エステルなどを用いることができる。またＲＴ－ＰＣＲ反応時にＰＣＲ反応阻害解消のために添加するベタイン類などの界面活性剤のうち、粘性のあるものを用いてもよく、その場合は続く洗浄工程が不完全であってもよい。
【0027】
（２－１－２）シリカ系ナノ空孔材料のＨＣｌ含有緩衝液による洗浄処理による表面疎水性の向上
次いで、酵素固定化前のシリカ系ナノ空孔材料の沈殿物に対して、沈殿物が含有するグリセロールを除去するための洗浄工程を設ける。その際の洗浄液は、グリセロール等を含まない緩衝液あるいは超純水、好ましくは分注操作時に用いた緩衝液が好ましいが、緩衝液のモル濃度やｐＨ値は、酵素固定化後の沈殿物に対して行う洗浄工程、また、ＤＮＡ増幅工程で用いる反応媒体用の緩衝液と同一であってもよい。当該洗浄工程は１回でも良いが、２回以上行うことが好ましい。
ここで、洗浄水としては、「超純水」を用いずに、「Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）」緩衝液など、「ＨＣｌ」を含む緩衝液を用いることが好ましい。例えば、「Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）」を用いた場合、緩衝液自体のｐＨは８であるが、緩衝液中の極低濃度のＨＣｌ（酸）が局所的にシリカ表面に作用して表面のシラノールの縮合に関与し、結果的にシリカ担体表面の疎水性が高まると考えられる。シリカ担体表面の疎水化に寄与しているのが緩衝液中のＨＣｌ（酸）であると考えられるため、「酸処理シリカ担体」ともいう。
具体的には、例えば、グリセロールを含まない１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）１００μＬで該沈殿物を再懸濁することにより洗浄を行い、遠心分離後に上清を完全に除去する。これらの工程を合わせて３回繰り返す。当該洗浄操作を複数回繰り返すことによってシリカの表面性状をより疎水的に変化させることができる。
洗浄後の沈殿物は、２０００～４０００Ｇ、１０～３０秒間などの遠心分離処理を行い、上清と分離し、表面疎水性を向上させた「酸処理シリカ系ナノ空孔材料複合体」として回収する。
次いで、酵素固定化前のシリカ系ナノ空孔材料の沈殿物に対して、沈殿物が含有するグリセロールを除去するための洗浄工程を設ける。その際の洗浄液は、グリセロール等を含まない緩衝液あるいは超純水、好ましくは分注操作時に用いた緩衝液が好ましいが、緩衝液のモル濃度やｐＨ値は、酵素固定化後の沈殿物に対して行う洗浄工程、また、ＤＮＡ増幅工程で用いる反応媒体用の緩衝液と同一であってもよい。当該洗浄工程は１回でも良いが、２回以上行うことが好ましい。
ここで、洗浄水としては、「超純水」を用いずに、「Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）」緩衝液など、「ＨＣｌ」を含む緩衝液を用いることが好ましい。例えば、「Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）」を用いた場合、緩衝液自体のｐＨは８であるが、緩衝液中の極低濃度のＨＣｌ（酸）が局所的にシリカ表面に作用して表面のシラノールの縮合に関与し、結果的にシリカ担体表面の疎水性が高まると考えられる。シリカ担体表面の疎水化に寄与しているのが緩衝液中のＨＣｌ（酸）であると考えられるため、「酸処理シリカ担体」ともいう。
具体的には、例えば、グリセロールを含まない１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）１００μＬで該沈殿物を再懸濁することにより洗浄を行い、遠心分離後に上清を完全に除去する。これらの工程を合わせて３回繰り返す。当該洗浄操作を複数回繰り返すことによってシリカの表面性状をより疎水的に変化させることができる。
洗浄後の沈殿物は、２０００～４０００Ｇ、１０～３０秒間などの遠心分離処理を行い、上清と分離し、表面疎水性を向上させた「酸処理シリカ系ナノ空孔材料複合体」として回収する。
【0028】
（２－２）酸処理物質によるシリカ担体表面の「疎水化処理」
本発明においては、前記の分注及び洗浄処理を施さずに、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇを直接、ＰＣＲチューブ等へ移し入れた後に酵素の固定化を行うことも可能である。また、このようなシリカ系ナノ空孔材料については、別の方法によってもシリカ表面の疎水化をより強力に促進することができる。例えば、中澤らの方法（非特許文献１７）を参考にして、シリカ系ナノ空孔材料の粉末を、１～１３Ｍ 硝酸などに添加し、１５０～２００℃に加熱しながら、約６～２４時間静置する。加熱を止めて常温に戻した後、水を加えて吸引濾過を行い、約６０℃で乾燥させる。当該操作によってもシリカの表面性状をより疎水的に変化させることができる。ここで、表面を疎水化させるための酸処理物質として、硝酸以外にも塩酸を用いることができる。
この様に、まずシリカ系ナノ空孔材料に疎水化処理を施した後、（２－１）のグリセロールなどを用いた分注工程及び緩衝液もしくは超純水などによる洗浄工程を設けることにより、微量の疎水化シリカ系ナノ空孔材料を正確にＰＣＲチューブ内に測り入れることも可能となった。
本発明においては、前記の分注及び洗浄処理を施さずに、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇを直接、ＰＣＲチューブ等へ移し入れた後に酵素の固定化を行うことも可能である。また、このようなシリカ系ナノ空孔材料については、別の方法によってもシリカ表面の疎水化をより強力に促進することができる。例えば、中澤らの方法（非特許文献１７）を参考にして、シリカ系ナノ空孔材料の粉末を、１～１３Ｍ 硝酸などに添加し、１５０～２００℃に加熱しながら、約６～２４時間静置する。加熱を止めて常温に戻した後、水を加えて吸引濾過を行い、約６０℃で乾燥させる。当該操作によってもシリカの表面性状をより疎水的に変化させることができる。ここで、表面を疎水化させるための酸処理物質として、硝酸以外にも塩酸を用いることができる。
この様に、まずシリカ系ナノ空孔材料に疎水化処理を施した後、（２－１）のグリセロールなどを用いた分注工程及び緩衝液もしくは超純水などによる洗浄工程を設けることにより、微量の疎水化シリカ系ナノ空孔材料を正確にＰＣＲチューブ内に測り入れることも可能となった。
【0029】
３．「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料」複合体の製造方法
次に、本発明で用いるＤＮＡ増幅酵素、またはさらに逆転写酵素をシリカ系ナノ空孔材料に固定化する「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料」又は「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料」に、所望によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などをさらに備える、本発明の「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」などの製造について説明する。
（３－１）ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造
本発明において、ＤＮＡ増幅酵素のシリカ系ナノ空孔材料への固定化方法は、通常の酵素固定化方法が適用でき、ＤＮＡ増幅酵素及び緩衝液を、シリカ系ナノ空孔材料粉末と混合することで、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を沈殿物として得ることができる。（例えば、特許文献６参照）その際、本発明においては、酵素固定化用の緩衝液、また、固定化後の沈殿物に対して行う洗浄工程で用いる洗浄用緩衝液として、ＤＮＡ増幅用に市販されているＤＮＡ増幅用反応液（東洋紡社製など）をそのまま用いることができる。例えば、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ 塩化マグネシウムの組成の緩衝液を用いることができる。
ここで、シリカ系ナノ空孔材料としては、未処理のまま用いるほか、前記（２－１）又は（２－２）に示された「疎水化処理」表面を有するシリカ系ナノ空孔材料を用いる場合も、同様に、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造することができる。
具体的には、例えば、ＤＮＡ増幅酵素を、前記の緩衝液５０μＬ中に溶解又は懸濁させた後、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇと混合して５秒程度室温で攪拌し、遠心分離を行うことにより、沈殿物として、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の前駆体を得ることができる。また、ＤＮＡ増幅酵素と共に逆転写酵素もあらかじめシリカ担体に混和して固定化させておくことで、ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造することもできる。
次に、本発明で用いるＤＮＡ増幅酵素、またはさらに逆転写酵素をシリカ系ナノ空孔材料に固定化する「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料」又は「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料」に、所望によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などをさらに備える、本発明の「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」などの製造について説明する。
（３－１）ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造
本発明において、ＤＮＡ増幅酵素のシリカ系ナノ空孔材料への固定化方法は、通常の酵素固定化方法が適用でき、ＤＮＡ増幅酵素及び緩衝液を、シリカ系ナノ空孔材料粉末と混合することで、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を沈殿物として得ることができる。（例えば、特許文献６参照）その際、本発明においては、酵素固定化用の緩衝液、また、固定化後の沈殿物に対して行う洗浄工程で用いる洗浄用緩衝液として、ＤＮＡ増幅用に市販されているＤＮＡ増幅用反応液（東洋紡社製など）をそのまま用いることができる。例えば、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ 塩化マグネシウムの組成の緩衝液を用いることができる。
ここで、シリカ系ナノ空孔材料としては、未処理のまま用いるほか、前記（２－１）又は（２－２）に示された「疎水化処理」表面を有するシリカ系ナノ空孔材料を用いる場合も、同様に、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造することができる。
具体的には、例えば、ＤＮＡ増幅酵素を、前記の緩衝液５０μＬ中に溶解又は懸濁させた後、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇと混合して５秒程度室温で攪拌し、遠心分離を行うことにより、沈殿物として、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の前駆体を得ることができる。また、ＤＮＡ増幅酵素と共に逆転写酵素もあらかじめシリカ担体に混和して固定化させておくことで、ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造することもできる。
【0030】
本発明においては、次いで、沈殿物として得られたＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の前駆体を、前記の洗浄用緩衝液で再懸濁する工程を含む洗浄処理を施し、上清を除去してＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造する。当該洗浄工程は１回でも良いが、２回以上行うことが好ましい。例えば、洗浄用緩衝液１００μＬで該沈殿物を再懸濁することにより洗浄を行い、遠心分離後に上清を完全に除去する。必要に応じ、これらの工程を繰り返す。ここで、洗浄用緩衝液は、ＤＮＡ増幅酵素をシリカ系ナノ空孔材料に固定化する際に用いる酵素固定化用の緩衝液と、同一の組成であることが好ましいが、異なっていても良い。
洗浄後の沈殿物は、２０００～４０００Ｇ、１０～３０秒間などの遠心分離処理を行い、上清と分離し、「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として回収する。
必要に応じて、上記洗浄工程、及び遠心分離工程を繰り返す。
洗浄後の沈殿物は、２０００～４０００Ｇ、１０～３０秒間などの遠心分離処理を行い、上清と分離し、「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」として回収する。
必要に応じて、上記洗浄工程、及び遠心分離工程を繰り返す。
【0031】
（３－２）本発明リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で用いるＤＮＡ増幅酵素及び逆転写酵素について
本発明において対象とするＲＮＡの定量増幅方法は、汎用的でかつ最も簡便な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）であり、特にＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ等の蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法であるが、他にインターカレーションダイ法を基にしたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法や逆転写等温ＤＮＡ増幅法（ＲＴ－ＬＡＭＰ法）などにも適用可能である。
本発明のＲＴ－ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ増幅酵素としては、本発明の実施例で用いた高耐熱性ＤＮＡ増幅酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、他にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなども用いることができる。
蛍光標識プローブを用いたＲＴ－ＰＣＲ法を実施する際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がないため、当該活性を補うためにも、当該活性を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕポリメラーゼなどを併用する必要がある。すでに逆転写酵素などと共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが含まれている、市販のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬を併用してもよい。市販のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬としては、Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）やＴａｑＭａｎ（商標登録） Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）などがある。
ＲＴ－ＰＣＲ法用の逆転写酵素としては、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ及びＡｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ由来などの逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ、ＡＭＶ、Ｍ－ＭＬＶ、ＧｅｎｅＡｃｅなど）を用いることができる。
すなわち、本発明のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法のために用いる典型的な酵素試薬としては、「ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又は「ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである。
他に、ＲＴ－ＬＡＭＰ法には、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
また、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等を用いたインターカレーションダイ法を基にしたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法に本発明を適用する場合は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は不要なので、ＤＮＡ増幅酵素としては、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのみで十分である。
本発明において対象とするＲＮＡの定量増幅方法は、汎用的でかつ最も簡便な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）であり、特にＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ等の蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法であるが、他にインターカレーションダイ法を基にしたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法や逆転写等温ＤＮＡ増幅法（ＲＴ－ＬＡＭＰ法）などにも適用可能である。
本発明のＲＴ－ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ増幅酵素としては、本発明の実施例で用いた高耐熱性ＤＮＡ増幅酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、他にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなども用いることができる。
蛍光標識プローブを用いたＲＴ－ＰＣＲ法を実施する際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がないため、当該活性を補うためにも、当該活性を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕポリメラーゼなどを併用する必要がある。すでに逆転写酵素などと共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが含まれている、市販のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬を併用してもよい。市販のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬としては、Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）やＴａｑＭａｎ（商標登録） Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）などがある。
ＲＴ－ＰＣＲ法用の逆転写酵素としては、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ及びＡｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ由来などの逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ、ＡＭＶ、Ｍ－ＭＬＶ、ＧｅｎｅＡｃｅなど）を用いることができる。
すなわち、本発明のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法のために用いる典型的な酵素試薬としては、「ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又は「ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである。
他に、ＲＴ－ＬＡＭＰ法には、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
また、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等を用いたインターカレーションダイ法を基にしたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法に本発明を適用する場合は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は不要なので、ＤＮＡ増幅酵素としては、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼのみで十分である。
【0032】
４．本発明における極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの検出方法
（４－１）本発明に用いるＤＮＡ増幅酵素
本発明における「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」は、従来のＲＮＡ検出法におけるＤＮＡ増幅方法で用いられていた「ＤＮＡ増幅酵素」を、シリカ系ナノ空孔材料の細孔径の調整や、シリカ表面への疎水性処理などにより、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応及びそれに伴う逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写反応や蛍光標識プローブの分解反応などを阻害しない状態で固定化された「固定化ＤＮＡ増幅酵素」であるといえるから、本発明に用いる「ＤＮＡ増幅酵素」としては、一般的なＲＮＡ検出におけるＤＮＡ増幅方法で用いるＤＮＡ増幅酵素に適宜代替して用いることができる。
したがって、本発明のＲＮＡ検出におけるＤＮＡ増幅の増幅手段自体は、基本的には従来からのＤＮＡ増幅方法、特に固定化ＤＮＡ増幅酵素を用いたＤＮＡ増幅方法での増幅手段をそのまま適用することができ、増幅の対象となる標的ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの種類も同様である。
（４－１）本発明に用いるＤＮＡ増幅酵素
本発明における「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」は、従来のＲＮＡ検出法におけるＤＮＡ増幅方法で用いられていた「ＤＮＡ増幅酵素」を、シリカ系ナノ空孔材料の細孔径の調整や、シリカ表面への疎水性処理などにより、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応及びそれに伴う逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写反応や蛍光標識プローブの分解反応などを阻害しない状態で固定化された「固定化ＤＮＡ増幅酵素」であるといえるから、本発明に用いる「ＤＮＡ増幅酵素」としては、一般的なＲＮＡ検出におけるＤＮＡ増幅方法で用いるＤＮＡ増幅酵素に適宜代替して用いることができる。
したがって、本発明のＲＮＡ検出におけるＤＮＡ増幅の増幅手段自体は、基本的には従来からのＤＮＡ増幅方法、特に固定化ＤＮＡ増幅酵素を用いたＤＮＡ増幅方法での増幅手段をそのまま適用することができ、増幅の対象となる標的ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの種類も同様である。
【0033】
しかしながら、本発明のＲＴ－ＰＣＲ法における核酸増幅法において、特に、数分子レベル、さらには１分子レベルという極微量ＲＮＡ及び極微量ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの検出方法においては、ＤＮＡ増幅に際して用いるＤＮＡ増幅酵素として、「ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ」を用い、シリカ担体に固定化して「ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ－シリカ系ナノ空孔材料複合体」とすることが有効である。「ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ」は、通常ＲＴ－ＰＣＲ試薬には含まれないが、本発明では、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいても積極的に用いることが好ましい。「ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ」を用いることにより標的ＲＮＡの量が極微量の場合、特に被検試料中のＲＮＡ含有量が極微量の場合であっても、ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを高感度かつ高精度で検出できるという効果は予想外であった。
【0034】
ここで、２ステップＲＴ－ＰＣＲ（図１ｂ）の場合は、そのまま固定化ＫＯＤを適用することで、１分子レベルの高感度ＰＣＲが可能となる。
一方、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ（図１ａ）の場合は、ＫＯＤはＤＮＡを合成することはできるものの、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもたないために蛍光検出用プローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）を分解できない。そのため、蛍光検出をするために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ増幅酵素が必須となる。
その際、市販のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬を併用することで、当該試薬中に含まれるＤＮＡ増幅酵素が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するために蛍光検出が可能となる。むしろ、濃度を最適化した固定化ＫＯＤと、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬中のＤＮＡ増幅酵素との併用により、ＰＣＲ反応が促進し、高感度化が認められた。すなわち、このことから、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素（例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなど）とを併用することで、シナジー効果が奏せられることが強く示唆される。
また、本発明のＲＴ－ＰＣＲ法として、実施例などで具体的に説明しているのは、主として「リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」であるが、これらの方法はいずれも「リアルタイム２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」に適用可能である。
一方、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ（図１ａ）の場合は、ＫＯＤはＤＮＡを合成することはできるものの、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもたないために蛍光検出用プローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）を分解できない。そのため、蛍光検出をするために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ増幅酵素が必須となる。
その際、市販のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬を併用することで、当該試薬中に含まれるＤＮＡ増幅酵素が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するために蛍光検出が可能となる。むしろ、濃度を最適化した固定化ＫＯＤと、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬中のＤＮＡ増幅酵素との併用により、ＰＣＲ反応が促進し、高感度化が認められた。すなわち、このことから、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素（例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなど）とを併用することで、シナジー効果が奏せられることが強く示唆される。
また、本発明のＲＴ－ＰＣＲ法として、実施例などで具体的に説明しているのは、主として「リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」であるが、これらの方法はいずれも「リアルタイム２ステップＲＴ－ＰＣＲ法」及び「１ステップＲＴ－ＰＣＲ法」に適用可能である。
【0035】
以上のように、本発明の対象とするＲＮＡ検出におけるＤＮＡ増幅方法は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合のみに限られるものではないが、以下の説明では、主にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ－ＰＣＲ法を用いた場合について、詳細に説明する。
【0036】
（４－２）標的ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドについて
本発明における反応基質のＲＮＡとしては、その塩基長さが限定されるものではなく、また、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖などの適宜のＲＮＡが適用可能である。
反応基質のＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドとしても、その塩基長さが限定されるものではなく、また、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解除去した一本鎖ｃＤＮＡも適用することができる。
また、下記（４－４）において詳細に述べるが、本発明では数分子レベルの極微量の基質ＲＮＡであっても増幅可能であり、夾雑物の多い環境試料、血液、唾液など生体由来試料、病原微生物、ウイルスなど細胞由来試料中の極微量の標的ＲＮＡの検出も可能である。例えば、試料５０μＬ中に０．０３～３ａｇ含まれている極微量ＲＮＡの検出を対象とすることができ、これは、環境試料、生体試料中の５０μＬ中に１～１０個レベルという極微量含まれる病原菌やウイルス由来ＲＮＡが検出できることを意味する。
したがって、本発明の標的ＲＮＡというとき、一般的にＲＮＡ検出の対象とする基質ＲＮＡの他、被検試料中に極微量含まれている検出又は同定の対象となるＲＮＡを指す。
本発明における反応基質のＲＮＡとしては、その塩基長さが限定されるものではなく、また、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖などの適宜のＲＮＡが適用可能である。
反応基質のＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドとしても、その塩基長さが限定されるものではなく、また、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解除去した一本鎖ｃＤＮＡも適用することができる。
また、下記（４－４）において詳細に述べるが、本発明では数分子レベルの極微量の基質ＲＮＡであっても増幅可能であり、夾雑物の多い環境試料、血液、唾液など生体由来試料、病原微生物、ウイルスなど細胞由来試料中の極微量の標的ＲＮＡの検出も可能である。例えば、試料５０μＬ中に０．０３～３ａｇ含まれている極微量ＲＮＡの検出を対象とすることができ、これは、環境試料、生体試料中の５０μＬ中に１～１０個レベルという極微量含まれる病原菌やウイルス由来ＲＮＡが検出できることを意味する。
したがって、本発明の標的ＲＮＡというとき、一般的にＲＮＡ検出の対象とする基質ＲＮＡの他、被検試料中に極微量含まれている検出又は同定の対象となるＲＮＡを指す。
【0037】
（４－３）本発明における極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの検出方法
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないため、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの場合には通常は用いられないが、本発明においては、むしろＤＮＡ増幅用酵素としてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをシリカ系ナノ空孔材料に固定化して、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＲＮＡ検出を行う。
その場合、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）に際しては、上記ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物に、反応基質ＲＮＡ、２種類のプライマー、蛍光検出用プローブ、ｄＮＴＰｓ、ＢＳＡ等の他に、逆転写酵素と共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素（Ｔａｑ、Ｐｆｕなど）を含んだリアルタイムＰＣＲ反応溶液２０μＬを添加した後、該沈殿物を再懸濁することによって開始させることができる。さらに、上記ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）は、上記ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物に、別途、逆転写酵素を用いたＲＮＡから合成した反応基質ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド、２種類のプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＢＳＡ等を含んだＰＣＲ反応溶液５０μＬを添加した後、該沈殿物を再懸濁することによって開始させることができる。
本発明においては、前記の分注及び洗浄処理を施さない、未処理のシリカ系ナノ空孔材料の粉末にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを固定化した場合でも、遊離のＫＯＤを用いた場合に比較すると、リアルタイムＰＣＲなどにおいて良好な結果を得ている。そして、前記の緩衝液を用いた洗浄処理や硝酸を用いた処理によってシリカ表面の疎水化を促進することにより、さらに有利な効果が奏せられた。このようなシリカ系ナノ空孔材料の疎水性度の違いによる、各種ＤＮＡ増幅酵素の固定化状態の適正化と、固定化したＤＮＡ増幅酵素と相互作用できる前記の各種反応基質の供給量及び反応環境の至適化によって、１分子レベルからの高感度かつ高精度のＲＮＡ検出を可能にする。
また、本発明では、前記の洗浄工程により、遺伝子組換え逆転写酵素及びＤＮＡ増幅酵素などの精製品に含有されることがある宿主由来の夾雑ＲＮＡやＤＮＡ、また、反応系外から偶然に混入した標的ＲＮＡとは異なる、又は、同一の配列を有する核酸が極力取り除かれているため、極微量の標的ＲＮＡを特異的に増幅することもできる。
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないため、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの場合には通常は用いられないが、本発明においては、むしろＤＮＡ増幅用酵素としてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをシリカ系ナノ空孔材料に固定化して、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＲＮＡ検出を行う。
その場合、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）に際しては、上記ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物に、反応基質ＲＮＡ、２種類のプライマー、蛍光検出用プローブ、ｄＮＴＰｓ、ＢＳＡ等の他に、逆転写酵素と共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素（Ｔａｑ、Ｐｆｕなど）を含んだリアルタイムＰＣＲ反応溶液２０μＬを添加した後、該沈殿物を再懸濁することによって開始させることができる。さらに、上記ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）は、上記ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物に、別途、逆転写酵素を用いたＲＮＡから合成した反応基質ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド、２種類のプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＢＳＡ等を含んだＰＣＲ反応溶液５０μＬを添加した後、該沈殿物を再懸濁することによって開始させることができる。
本発明においては、前記の分注及び洗浄処理を施さない、未処理のシリカ系ナノ空孔材料の粉末にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを固定化した場合でも、遊離のＫＯＤを用いた場合に比較すると、リアルタイムＰＣＲなどにおいて良好な結果を得ている。そして、前記の緩衝液を用いた洗浄処理や硝酸を用いた処理によってシリカ表面の疎水化を促進することにより、さらに有利な効果が奏せられた。このようなシリカ系ナノ空孔材料の疎水性度の違いによる、各種ＤＮＡ増幅酵素の固定化状態の適正化と、固定化したＤＮＡ増幅酵素と相互作用できる前記の各種反応基質の供給量及び反応環境の至適化によって、１分子レベルからの高感度かつ高精度のＲＮＡ検出を可能にする。
また、本発明では、前記の洗浄工程により、遺伝子組換え逆転写酵素及びＤＮＡ増幅酵素などの精製品に含有されることがある宿主由来の夾雑ＲＮＡやＤＮＡ、また、反応系外から偶然に混入した標的ＲＮＡとは異なる、又は、同一の配列を有する核酸が極力取り除かれているため、極微量の標的ＲＮＡを特異的に増幅することもできる。
【0038】
（４－４）試料中の極微量ＲＮＡの検出及び同定方法
本発明の極微量ＲＮＡの検出方法は、感度及び精度の高い増幅が可能なため、生体試料（血液、鼻咽頭拭い液、唾液など）中に混入しているウイルス、病原菌由来のＲＮＡ検出、又、環境試料中にわずかに含まれるウイルス由来等の標的ＲＮＡの検出、同定においてきわめて有効である。
本発明における極微量ＲＮＡの検出及び同定方法において、対象とする被検試料中のＲＮＡ含有量は、１ｐｇ／ｍＬ以下であり、標的ＲＮＡの検出限界量は０．１ａｇ／ｍＬである。好ましくは０．２ａｇ～２ｆｇ／ｍＬであり、より好ましくは、０．５ａｇ～０．５ｆｇ／ｍＬである。
また、具体的な被検試料中の標的ＲＮＡの検出及び同定する方法は、以下の通りである。
（i）被検試料の標的ＲＮＡを抽出する工程、
被検試料の標的ＲＮＡを抽出する方法としては、被検試料が、例えば、ウイルスである場合は、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた方法が適用できるが、他のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてもよい。ここで、抽出された標的ＲＮＡはそのままＲＮＡ検出工程に供することもできるが、適宜、緩衝液や超純水などで希釈することもできる。
本発明の極微量ＲＮＡの検出方法は、感度及び精度の高い増幅が可能なため、生体試料（血液、鼻咽頭拭い液、唾液など）中に混入しているウイルス、病原菌由来のＲＮＡ検出、又、環境試料中にわずかに含まれるウイルス由来等の標的ＲＮＡの検出、同定においてきわめて有効である。
本発明における極微量ＲＮＡの検出及び同定方法において、対象とする被検試料中のＲＮＡ含有量は、１ｐｇ／ｍＬ以下であり、標的ＲＮＡの検出限界量は０．１ａｇ／ｍＬである。好ましくは０．２ａｇ～２ｆｇ／ｍＬであり、より好ましくは、０．５ａｇ～０．５ｆｇ／ｍＬである。
また、具体的な被検試料中の標的ＲＮＡの検出及び同定する方法は、以下の通りである。
（i）被検試料の標的ＲＮＡを抽出する工程、
被検試料の標的ＲＮＡを抽出する方法としては、被検試料が、例えば、ウイルスである場合は、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた方法が適用できるが、他のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてもよい。ここで、抽出された標的ＲＮＡはそのままＲＮＡ検出工程に供することもできるが、適宜、緩衝液や超純水などで希釈することもできる。
【0039】
（ii）本発明の前述のＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー（オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー、或いは、遺伝子特異的プライマー）、ＤＮＡ増幅用プライマー、蛍光検出用プローブ、ｄＮＴＰｓ等、及び、ＰＣＲ試薬に含まれる逆転写酵素、ＤＮＡ増幅酵素などと共に作用させて、標的ＲＮＡを検出する工程、
具体的には、前記被検試料の抽出ＲＮＡ含有緩衝液（例えば３～３０μＬ）を、本発明のＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔複合体と共に標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー等を含んだＰＣＲ反応溶液（例えば１０～２０μＬ）に対して添加した後、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ等を用いて約５秒間室温で攪拌し、反応を開始させることができる。あるいは、予め、逆転写酵素を用いて抽出した標的ＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質として適用することもできる。
具体的には、前記被検試料の抽出ＲＮＡ含有緩衝液（例えば３～３０μＬ）を、本発明のＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔複合体と共に標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー等を含んだＰＣＲ反応溶液（例えば１０～２０μＬ）に対して添加した後、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ等を用いて約５秒間室温で攪拌し、反応を開始させることができる。あるいは、予め、逆転写酵素を用いて抽出した標的ＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質として適用することもできる。
【0040】
（iii）標的ＲＮＡを検出する工程
ここで、本発明のＤＮＡ増幅法を適用して、標的ＲＮＡから特異的に増幅されたＤＮＡが、標的ＲＮＡ由来であることを確認するための方法としては、一般的なＤＮＡ同定方法が適用できるが、例えば以下の方法を例示することができる。
（ａ）配列特異的なプライマー等を適用することにより得られる、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）及び逆転写等温ＤＮＡ増幅法（ＲＴ－ＬＡＭＰ法）等における標的ＲＮＡの特異的増幅産物を電気泳動、濁度及び蛍光測定等で解析する方法
（ｂ）リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法等において、増幅ＤＮＡを染色するための蛍光物質にインターカレーターを使用するインターカレーションダイ法及びＴａｑＭａｎプローブ等を用いたハイブリダイゼーションプローブ法により検出する方法
ここで、本発明のＤＮＡ増幅法を適用して、標的ＲＮＡから特異的に増幅されたＤＮＡが、標的ＲＮＡ由来であることを確認するための方法としては、一般的なＤＮＡ同定方法が適用できるが、例えば以下の方法を例示することができる。
（ａ）配列特異的なプライマー等を適用することにより得られる、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）及び逆転写等温ＤＮＡ増幅法（ＲＴ－ＬＡＭＰ法）等における標的ＲＮＡの特異的増幅産物を電気泳動、濁度及び蛍光測定等で解析する方法
（ｂ）リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法等において、増幅ＤＮＡを染色するための蛍光物質にインターカレーターを使用するインターカレーションダイ法及びＴａｑＭａｎプローブ等を用いたハイブリダイゼーションプローブ法により検出する方法
【0041】
５．本発明における標的ＲＮＡの検出方法及び検出用キット
（５－１）本発明の検出対象となる標的ＲＮＡ
本発明の標的ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスゲノム全長、もしくはＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ断片、及び病原菌由来のＲＮＡ断片の検出などに用いることができる。
特に、血液、唾液、鼻汁などの生体試料、環境試料中にわずかに含まれるＲＮＡウイルス由来の数分子レベルの短いＲＮＡの検出、同定に対しても威力を発揮する。例えば、感染研の検出マニュアルに準拠した１５８塩基や５４７塩基といった比較的短い配列の検出での有意な効果が実証されている。
一方で、本発明では、ウイルスＲＮＡの全ゲノム解析などのような、「長い」ＲＮＡの検出に対しても有効である。例えば、本発明のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いて、１０００～１５００塩基対といったより長いＲＮＡ由来のＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを標的として、高感度かつ高精度に増幅できることをすでに検証している（data not shown）。
現行の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の全ゲノム解析法には、９８種類のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲが採用され、３８１～４６９塩基対のＰＣＲ増幅が行われているが、本発明の方法を適用することで、さらに効率的かつ高感度・高精度に増幅できることが期待できる。
（５－１）本発明の検出対象となる標的ＲＮＡ
本発明の標的ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスゲノム全長、もしくはＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ断片、及び病原菌由来のＲＮＡ断片の検出などに用いることができる。
特に、血液、唾液、鼻汁などの生体試料、環境試料中にわずかに含まれるＲＮＡウイルス由来の数分子レベルの短いＲＮＡの検出、同定に対しても威力を発揮する。例えば、感染研の検出マニュアルに準拠した１５８塩基や５４７塩基といった比較的短い配列の検出での有意な効果が実証されている。
一方で、本発明では、ウイルスＲＮＡの全ゲノム解析などのような、「長い」ＲＮＡの検出に対しても有効である。例えば、本発明のＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いて、１０００～１５００塩基対といったより長いＲＮＡ由来のＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを標的として、高感度かつ高精度に増幅できることをすでに検証している（data not shown）。
現行の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の全ゲノム解析法には、９８種類のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲが採用され、３８１～４６９塩基対のＰＣＲ増幅が行われているが、本発明の方法を適用することで、さらに効率的かつ高感度・高精度に増幅できることが期待できる。
【0042】
本発明の検出対象となるＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであれば、すべて含まれる。脂質二重層からなる外膜（エンベロープ）を持つＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスなど、また外膜を持たないノロウイルス、ロタウイルスなどが挙げられる。
【0043】
本発明の検体としては、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料などが挙げられる。生物試料としては、血液、唾液、鼻汁、組織分泌液などの体液が含まれる。
生物由来試料としては、前記生体試料またはその懸濁液に対して、超音波破砕処理などをしたものが含まれる。環境試料としては、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が挙げられる。環境由来試料としては、前記環境試料に対して、例えば超音波破砕処理などの処理をしたものが含まれる。
生物由来試料としては、前記生体試料またはその懸濁液に対して、超音波破砕処理などをしたものが含まれる。環境試料としては、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が挙げられる。環境由来試料としては、前記環境試料に対して、例えば超音波破砕処理などの処理をしたものが含まれる。
【0044】
（５－２）ＲＮＡウイルス検出用試料の調製方法
被検試料であるウイルス由来の標的ＲＮＡを抽出する方法としては、被検試料が、例えば、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である場合は、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた方法が適用できるが、他のウイルスＲＮＡ抽出キットや既知のＲＮＡ抽出法（ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法など）を用いてもよい。あるいは、ウイルスからのＲＮＡ抽出操作が不要である、ＡｍｐｄｉｒｅｃｔTM ２０１９－ｎＣｏＶ検出キット（特許文献１、２、非特許文献１）等を用いて、当該キットによる検体処理液をＰＣＲ反応溶液に直接添加する方法を用いてもよい。
ここで、ウイルス濃度の極めて低い環境試料、例えば、下水などの環境中に存在するウイルスを分析対象とする場合は、ウイルス濃縮法の選択が重要となる。ウイルス濃縮法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法、陰電荷膜破砕型濃縮法、また、限外ろ過膜法などが適用できる。ウイルス濃縮後に、前述のＲＮＡ抽出法や検出キットを用いて処理された標的ＲＮＡを含む試料はそのままＲＮＡ検出工程に供することもできるが、適宜、緩衝液や超純水などで希釈することもできる。
被検試料であるウイルス由来の標的ＲＮＡを抽出する方法としては、被検試料が、例えば、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である場合は、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた方法が適用できるが、他のウイルスＲＮＡ抽出キットや既知のＲＮＡ抽出法（ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法など）を用いてもよい。あるいは、ウイルスからのＲＮＡ抽出操作が不要である、ＡｍｐｄｉｒｅｃｔTM ２０１９－ｎＣｏＶ検出キット（特許文献１、２、非特許文献１）等を用いて、当該キットによる検体処理液をＰＣＲ反応溶液に直接添加する方法を用いてもよい。
ここで、ウイルス濃度の極めて低い環境試料、例えば、下水などの環境中に存在するウイルスを分析対象とする場合は、ウイルス濃縮法の選択が重要となる。ウイルス濃縮法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法、陰電荷膜破砕型濃縮法、また、限外ろ過膜法などが適用できる。ウイルス濃縮後に、前述のＲＮＡ抽出法や検出キットを用いて処理された標的ＲＮＡを含む試料はそのままＲＮＡ検出工程に供することもできるが、適宜、緩衝液や超純水などで希釈することもできる。
【0045】
（５－３）標的ＲＮＡウイルス検出・同定用キット
本発明の標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットは、以下のように記載できる。
被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットであって、
当該キットは、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素がシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素が固定された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含む。
ここで、シリカ系ナノ空孔材料は、中心細孔直径が２～８ｎｍであることが好ましく、かつあらかじめ表面に疎水化処理が施されているシリカ系ナノ空孔材料であることが好ましい。
また、標的ＲＮＡウイルス検出・同定用キットとしては、
（１）「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又は「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」をＰＣＲチューブなどＰＣＲ用反応容器に内包させておき、（２）シリカ系ナノ空孔材料に固定化されていない逆転写酵素、及びＤＮＡ増幅酵素を、ＲＴ－ＰＣＲ反応に必要な標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、ｄＮＴＰｓ、蛍光検出用プローブ等を必要に応じて適宜組み合わせ、マグネシウム塩などの緩衝液中に含有させたＰＣＲ反応溶液、とセットとすることが好ましい。
例えば、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法では、（２）のＰＣＲ反応溶液としては、ｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、ｄＮＴＰｓ、蛍光検出用プローブ等と共に、所望により、固定化されていない逆転写酵素、及びＤＮＡ増幅酵素をさらに含む緩衝液からなり、２ステップＲＴ－ＰＣＲ法では、（２）のＰＣＲ反応溶液としては、ＲＴ－ＰＣＲ反応に必要なＤＮＡ増幅用プライマー、ｄＮＴＰｓ等を含んだ緩衝溶液からなるが、さらに所望により、ｃＤＮＡ合成用プライマー、ｄＮＴＰｓ、逆転写酵素を含む緩衝溶液からなる逆転写反応溶液を含めてもよい。
そして、本発明の「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又は「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」は、ＲＴ－ＰＣＲ用のチューブに、緩衝液等を完全に除去した形態もしくはこれに適量のグリセロールを含有させた緩衝液を重層した形態にて、フリーザーで冷凍保存することで長期保存可能である。このことは、必要な時にいつでもどこでも安定的に「ＲＴ－ＰＣＲ用臨床検査用臨床検査用のキット」を提供できることを意味する。
なお、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用キットなどの場合、非特許文献３に記載の「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル」に従って、前記（２）のＰＣＲ反応溶液を調製できる。また、すでに非特許文献１及び２等に記載の市販の検出試薬キットが簡単に入手できるので、前記（２）のＰＣＲ反応溶液として、前記検出試薬キットを用いることもできる。
本発明の標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットは、以下のように記載できる。
被検試料中の微量な標的ＲＮＡウイルスを、ＲＴ－ＰＣＲ法により精確に検出又は同定するためのキットであって、
当該キットは、少なくとも１つのＤＮＡ増幅酵素がシリカ系ナノ空孔材料に固定化された「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又はさらに逆転写酵素が固定された「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を含む。
ここで、シリカ系ナノ空孔材料は、中心細孔直径が２～８ｎｍであることが好ましく、かつあらかじめ表面に疎水化処理が施されているシリカ系ナノ空孔材料であることが好ましい。
また、標的ＲＮＡウイルス検出・同定用キットとしては、
（１）「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又は「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」をＰＣＲチューブなどＰＣＲ用反応容器に内包させておき、（２）シリカ系ナノ空孔材料に固定化されていない逆転写酵素、及びＤＮＡ増幅酵素を、ＲＴ－ＰＣＲ反応に必要な標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、ｄＮＴＰｓ、蛍光検出用プローブ等を必要に応じて適宜組み合わせ、マグネシウム塩などの緩衝液中に含有させたＰＣＲ反応溶液、とセットとすることが好ましい。
例えば、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法では、（２）のＰＣＲ反応溶液としては、ｃＤＮＡ合成用プライマー、ＤＮＡ増幅用プライマー、ｄＮＴＰｓ、蛍光検出用プローブ等と共に、所望により、固定化されていない逆転写酵素、及びＤＮＡ増幅酵素をさらに含む緩衝液からなり、２ステップＲＴ－ＰＣＲ法では、（２）のＰＣＲ反応溶液としては、ＲＴ－ＰＣＲ反応に必要なＤＮＡ増幅用プライマー、ｄＮＴＰｓ等を含んだ緩衝溶液からなるが、さらに所望により、ｃＤＮＡ合成用プライマー、ｄＮＴＰｓ、逆転写酵素を含む緩衝溶液からなる逆転写反応溶液を含めてもよい。
そして、本発明の「ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」又は「ＤＮＡ増幅酵素－逆転写酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体」は、ＲＴ－ＰＣＲ用のチューブに、緩衝液等を完全に除去した形態もしくはこれに適量のグリセロールを含有させた緩衝液を重層した形態にて、フリーザーで冷凍保存することで長期保存可能である。このことは、必要な時にいつでもどこでも安定的に「ＲＴ－ＰＣＲ用臨床検査用臨床検査用のキット」を提供できることを意味する。
なお、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出用キットなどの場合、非特許文献３に記載の「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル」に従って、前記（２）のＰＣＲ反応溶液を調製できる。また、すでに非特許文献１及び２等に記載の市販の検出試薬キットが簡単に入手できるので、前記（２）のＰＣＲ反応溶液として、前記検出試薬キットを用いることもできる。
【実施例0046】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【0047】
（合成例）シリカ系ナノ空孔材料の合成
本実施例で用いる、２次元六方晶系の細孔配列構造を有していて、細孔径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料（「ＳＢＡ」及び「ＦＳＭ」）を、それぞれ複数種類合成した。
本実施例で用いる、２次元六方晶系の細孔配列構造を有していて、細孔径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料（「ＳＢＡ」及び「ＦＳＭ」）を、それぞれ複数種類合成した。
【0048】
（合成例１）ＳＢＡ－１５の合成
Ｚｈａｏらの方法（非特許文献１５）を参考にして、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［ＢＡＳＦ社製］）（１０ｇ）を、水３００ミリリットルに添加し、３５℃で一晩撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２１．８７ｇ及びオルトケイ酸テトラエチル（和光純薬工業社製）２１．３２ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて３５℃に加熱しながら、約２０時間撹拌した。
これを、異なる合成温度（ａ：３５℃、ｂ：８０℃、又は、ｃ：１３０℃）で２４時間静置した。
Ｚｈａｏらの方法（非特許文献１５）を参考にして、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［ＢＡＳＦ社製］）（１０ｇ）を、水３００ミリリットルに添加し、３５℃で一晩撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２１．８７ｇ及びオルトケイ酸テトラエチル（和光純薬工業社製）２１．３２ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて３５℃に加熱しながら、約２０時間撹拌した。
これを、異なる合成温度（ａ：３５℃、ｂ：８０℃、又は、ｃ：１３０℃）で２４時間静置した。
【0049】
これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、時間あたり１０５℃の速度で５５０℃まで昇温させ、更に、これを、５５０℃で１０時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ－１５）を得た。合成温度がａ、ｂ、ｃの場合、中心細孔直径は、各々ａ：５．４ｎｍ、ｂ：７．１ｎｍ、また、ｃ：１０．６ｎｍ、であった。
【0050】
（合成例２）ＦＳＭ－１６、－２２の合成
稲垣らの方法（非特許文献１３）を参考にして、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３．２ｇ、東京化成工業社製）、或いは、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（４．２４ｇ、ライオン・アクゾ社製）を、７０℃の水１００ミリリットルに添加し、溶解後、カネマイト（トクヤマシルテック社製）５ｇを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３時間撹拌した。
稲垣らの方法（非特許文献１３）を参考にして、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３．２ｇ、東京化成工業社製）、或いは、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（４．２４ｇ、ライオン・アクゾ社製）を、７０℃の水１００ミリリットルに添加し、溶解後、カネマイト（トクヤマシルテック社製）５ｇを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３時間撹拌した。
【0051】
また、卜部らの方法（非特許文献１６）を参考にして、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（１０ｇ、ライオン・アクゾ社製）を、７０℃の水１２５ミリリットルに添加し、溶解後、１，３，５－トリイソプロピルベンゼン（７．５ｇ、アルファエイサー社製）を添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３０分間撹拌（３０００ｒｐｍ）した。これに、予め、カネマイト（トクヤマシルテック社製）６．６７ｇを溶解した８０℃の水１３１ミリリットルを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで２時間撹拌（３０００ｒｐｍ）した。
【0052】
次に、これらに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ ８．５の状態で、約３時間撹拌（３０００ｒｐｍ）し、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＦＳＭ；界面活性剤の種類が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド、また、界面活性剤と膨張剤の種類が、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライドと１，３，５－トリイソプロピルベンゼンの場合）を得た。中心細孔直径は、各々２．６ｎｍ（ＦＳＭ－１６）、４．２ｎｍ（ＦＳＭ－２２）、また、８．０ｎｍ（ＦＳＭ－２２）、であった。
【0053】
（実施例１）シリカ系ナノ空孔材料による、反応阻害の検証
最初に、本発明の極微量ＲＮＡ分子の検出に用いるＲＴ－ＰＣＲ法において、酵素系の固定化担体としてシリカ系ナノ空孔材料を用いる場合の阻害要因について検討した。
特に、蛍光標識プローブを用いるリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法の場合は、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行う際に、ＤＮＡ増幅酵素の付近で逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写反応が速やかに起こる必要があり、かつ蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ）からの蛍光検出を正確に行えることが必要となる。
しかし、シリカ系ナノ空孔材料自体がリアルタイムＲＴ－ＰＣＲでの蛍光検出を阻害する可能性が懸念されたため、まずは、上記実施例１に記載の中心細孔直径の異なる６種類のシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４、ＳＢＡ７．１、ＳＢＡ１０．６、ＦＳＭ２．６、ＦＳＭ４．２、ＦＳＭ８．０）の添加（各０．５ｍｇ）の影響について検証した（図５）。その結果、ＰＣ（シリカ系ナノ空孔材料を添加していないポジティブコントロール）と比較して、各種のシリカ系ナノ空孔材料を添加した場合にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線における蛍光強度がいずれも小さくなることが観察され、シリカ系ナノ空孔材料の添加は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害する傾向が認められた。その一方で、ＳＢＡ型／ＦＳＭ型メソポーラスシリカ共に、細孔径が小さくなるにつれて、反応阻害の程度が抑えられることが明瞭に示された。例えば、ＳＢＡ型であれば、中心細孔径５．４ｎｍのＳＢＡ５．４の場合、ＦＳＭ型であれば、中心細孔径２．６ｎｍ又は４．２ｎｍのＦＳＭ２．６又はＦＳＭ４．２であれば、反応阻害程度が低いので、蛍光検出にもほとんど影響なく用いることができる。すなわち、ＲＴ－ＰＣＲ法に適用するシリカ系ナノ空孔材料の好ましい中心細孔直径の数値範囲は、２～８ｎｍであると解される。
最初に、本発明の極微量ＲＮＡ分子の検出に用いるＲＴ－ＰＣＲ法において、酵素系の固定化担体としてシリカ系ナノ空孔材料を用いる場合の阻害要因について検討した。
特に、蛍光標識プローブを用いるリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法の場合は、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行う際に、ＤＮＡ増幅酵素の付近で逆転写酵素によるｃＤＮＡへの逆転写反応が速やかに起こる必要があり、かつ蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ）からの蛍光検出を正確に行えることが必要となる。
しかし、シリカ系ナノ空孔材料自体がリアルタイムＲＴ－ＰＣＲでの蛍光検出を阻害する可能性が懸念されたため、まずは、上記実施例１に記載の中心細孔直径の異なる６種類のシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４、ＳＢＡ７．１、ＳＢＡ１０．６、ＦＳＭ２．６、ＦＳＭ４．２、ＦＳＭ８．０）の添加（各０．５ｍｇ）の影響について検証した（図５）。その結果、ＰＣ（シリカ系ナノ空孔材料を添加していないポジティブコントロール）と比較して、各種のシリカ系ナノ空孔材料を添加した場合にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線における蛍光強度がいずれも小さくなることが観察され、シリカ系ナノ空孔材料の添加は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害する傾向が認められた。その一方で、ＳＢＡ型／ＦＳＭ型メソポーラスシリカ共に、細孔径が小さくなるにつれて、反応阻害の程度が抑えられることが明瞭に示された。例えば、ＳＢＡ型であれば、中心細孔径５．４ｎｍのＳＢＡ５．４の場合、ＦＳＭ型であれば、中心細孔径２．６ｎｍ又は４．２ｎｍのＦＳＭ２．６又はＦＳＭ４．２であれば、反応阻害程度が低いので、蛍光検出にもほとんど影響なく用いることができる。すなわち、ＲＴ－ＰＣＲ法に適用するシリカ系ナノ空孔材料の好ましい中心細孔直径の数値範囲は、２～８ｎｍであると解される。
【0054】
なお、以上述べたように、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法でのシリカ系ナノ空孔材料による反応阻害の検証において、細孔径が小さくなるにつれて、反応阻害の程度が抑えられることが明瞭に示されたことから、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径としては約２～８ｎｍが好ましい、と結論付けたが、下記実施例４に示すように、蛍光検出の必要がない２ステップＲＴ－ＰＣＲ法の場合からも、同様の結果が導かれる。すなわち、実際に中心細孔直径の異なるＳＢＡ型のシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ５．４、ＳＢＡ７．１及びＳＢＡ１０．６）及びＦＳＭ型のシリカ系ナノ空孔材料（ＦＳＭ２．６、ＦＳＭ４．２及びＦＳＭ８．０）を用いて行ったＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象としたＤＮＡ増幅実験結果でも、細孔径が小さくなるほど、反応精度、反応効率が高まる傾向がみられたことから、ＲＴ－ＰＣＲ法で用いるシリカ系ナノ空孔材料の好ましい中心細孔直径の数値範囲は、約２～８ｎｍであるといえる。
【0055】
（実施例２）ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造及び酵素固定化評価
本実施例では、前記合成例で作製した各種シリカ系ナノ空孔材料とＤＮＡ増幅酵素から形成される複合体の製造、疎水処理を施したシリカ表面性状の分析、また、酵素固定化効率の評価を行った。図１に、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（合成品：新型コロナウイルス検出用標準物質）を対象としＲＮＡ検出におけるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔に固定化したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、逆転写酵素によるリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）の手順を模式的に表した説明図を示す。
本実施例では、前記合成例で作製した各種シリカ系ナノ空孔材料とＤＮＡ増幅酵素から形成される複合体の製造、疎水処理を施したシリカ表面性状の分析、また、酵素固定化効率の評価を行った。図１に、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（合成品：新型コロナウイルス検出用標準物質）を対象としＲＮＡ検出におけるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔に固定化したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）、又、逆転写酵素によるリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）の手順を模式的に表した説明図を示す。
【0056】
（２－１）ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造
シリカ系ナノ空孔材料には、中心細孔直径の異なる６種類のシリカ系ナノ空孔材料：１）ＳＢＡ－１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、２）ＳＢＡ－１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ［ＳＢＡ７．１］）、３）ＳＢＡ－１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ［ＳＢＡ１０．６］）、４）ＦＳＭ－１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）、５）ＦＳＭ－２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ［ＦＳＭ４．２］）、６）ＦＳＭ－２２（中心細孔直径：８．０ｎｍ［ＦＳＭ８．０］）、を使用し、また、ＤＮＡ増幅酵素には、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、分子量：約８６～９２ｋＤ）を用いた。
シリカ系ナノ空孔材料には、中心細孔直径の異なる６種類のシリカ系ナノ空孔材料：１）ＳＢＡ－１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、２）ＳＢＡ－１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ［ＳＢＡ７．１］）、３）ＳＢＡ－１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ［ＳＢＡ１０．６］）、４）ＦＳＭ－１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）、５）ＦＳＭ－２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ［ＦＳＭ４．２］）、６）ＦＳＭ－２２（中心細孔直径：８．０ｎｍ［ＦＳＭ８．０］）、を使用し、また、ＤＮＡ増幅酵素には、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、分子量：約８６～９２ｋＤ）を用いた。
【0057】
図２に、ＤＮＡ増幅酵素を固定化したシリカ系ナノ空孔材料粒子の製造法を示す。基本的な実験操作としては、予め、５０μＬのメソポーラスシリカ粉末分散液（１０ ｍｇ－シリカ粉末／１ ｍＬ－５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ８］）をＰＣＲチューブ等へ分注しておき、遠心分離操作（２０００～４０００Ｇ、１０～３０秒間）により上清を除去した後、１００μＬの１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）を加え、撹拌し、上清を除去し、さらに同様の操作をさらに２回繰り返す。次に、シリカ系ナノ空孔材料粉末の沈殿物（０．５ｍｇ）と、ＤＮＡ増幅酵素（０．０１～１ｕｎｉｔｓ）を含んだＰＣＲ用緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム）５０μＬとを、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で混合し、遠心分離を行い、上清を全て除去することによって、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得た。続いて、前記ＰＣＲ用緩衝液１００μＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、前記ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去し、最終的にＤＮＡ増幅酵素をシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化した複合体である、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を得た。
【0058】
（２－２）シリカ表面を硝酸処理することによる表面の疎水化
（２－１）の分注及び洗浄処理による疎水化処理に代えて、中澤らの方法（非特許文献１７）を参考にして、シリカ系ナノ空孔材料粉末の表面を、硝酸を用いて疎水化処理を行った。具体的には、ＰＣＲチューブ等反応容器内に直接測り入れたＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）の粉末１６０ｍｇを、１Ｍ 硝酸（４ｍＬ、富士フイルム和光純薬社製）に添加し、１７０℃に加熱しながら２４時間静置した。加熱を止め、さらに２４時間かけて常温に戻した後、水４００ミリリットルを用いて吸引濾過を行い、６０℃で乾燥させた。
（２－１）の分注及び洗浄処理による疎水化処理に代えて、中澤らの方法（非特許文献１７）を参考にして、シリカ系ナノ空孔材料粉末の表面を、硝酸を用いて疎水化処理を行った。具体的には、ＰＣＲチューブ等反応容器内に直接測り入れたＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）の粉末１６０ｍｇを、１Ｍ 硝酸（４ｍＬ、富士フイルム和光純薬社製）に添加し、１７０℃に加熱しながら２４時間静置した。加熱を止め、さらに２４時間かけて常温に戻した後、水４００ミリリットルを用いて吸引濾過を行い、６０℃で乾燥させた。
【0059】
（２－３）洗浄操作及び疎水処理後のシリカ表面性状の分析
固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて、未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４、又、硝酸で処理したＳＢＡ５．４の局所構造（２９Ｓｉ核）を詳細に解析し、表面（細孔内壁面）の化学状態を推定した（図３）。
固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて、未処理のＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４、又、硝酸で処理したＳＢＡ５．４の局所構造（２９Ｓｉ核）を詳細に解析し、表面（細孔内壁面）の化学状態を推定した（図３）。
【0060】
ＮＭＲ分析の結果、メソポーラスシリカ表面の末端シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）の分布に違いが見られ、表面親水性に違いがあることが判明した。具体的には、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に浸してもメソポーラスシリカの局所構造に変化は見られなかったが、更に３回、１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で洗浄すると、グリセロールは全て除去され、Ｔｒｉｓ緩衝液の成分が僅かに残るのみであった。興味深いことに、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で洗浄したサンプルでは表面末端の隣接するシラノール基同士が一部縮合していることが判明した。Ｓｉ原子周りの局所構造については、通常Ｑｎ（ｎ＝０～４）として表記し、具体的にはＯｎＳｉ（ＯＨ）４－ｎで表わされる５種類のＳｉ種（すなわちＱｎ）がある。図３からはＱ２／Ｑ４比およびＱ３／Ｑ４比が小さくなっている事から、Ｑ２、Ｑ３に属するＳｉ種同士が縮合してＱ４に変わったと考えられる。これらのことは、緩衝液の影響によってシリカの表面性状がより疎水的に変化することを意味する。緩衝液がｐＨ＝８であることから、一般的な縮合反応の条件に当たらないことから予想外の結果である。また、シリカ系ナノ空孔材料表面の疎水化をより促進させるため、硝酸を用いた表面処理を行い同様の分析を行い、Ｑ３／Ｑ４比が更に小さくなることを確認した。以上の結果より、緩衝液や酸の影響によってシリカの表面性状がより疎水的に変化したことが示唆された。
このように、メソポーラスシリカ粉末に対して、硝酸等の酸による疎水化処理をあらかじめ行っておき、その後、必要に応じてメソポーラスシリカをグリセロールなどに懸濁し、反応容器内に正確に分注し、次いで緩衝液による洗浄を行うという手順を踏むことができる。
このように、メソポーラスシリカ粉末に対して、硝酸等の酸による疎水化処理をあらかじめ行っておき、その後、必要に応じてメソポーラスシリカをグリセロールなどに懸濁し、反応容器内に正確に分注し、次いで緩衝液による洗浄を行うという手順を踏むことができる。
【0061】
（２－４）ＤＮＡ増幅酵素の固定化効率の評価（ｐＨ及び疎水化の影響）
未処理及び硝酸を用いて疎水処理を施したＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）に対するＤＮＡ増幅酵素の吸着能を調べるために、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を混和した直後の上清及びシリカ細孔表面に含まれるＤＮＡ増幅酵素の含有率におけるｐＨ依存性を評価した（図４）。
図中、白棒状印は、緩衝液のｐＨがｐＨ＝４の場合、ドット棒状印は、緩衝液のｐＨがｐＨ＝６の場合、また、黒棒状印は、緩衝液のｐＨがｐＨ＝８の場合、である。また、図４（ａ）は、未処理のＳＢＡ５．４を用いた場合、図４（ｂ）は、硝酸を用いて疎水処理を施したＳＢＡ５．４を用いた場合、である。
未処理及び硝酸を用いて疎水処理を施したＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）に対するＤＮＡ増幅酵素の吸着能を調べるために、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を混和した直後の上清及びシリカ細孔表面に含まれるＤＮＡ増幅酵素の含有率におけるｐＨ依存性を評価した（図４）。
図中、白棒状印は、緩衝液のｐＨがｐＨ＝４の場合、ドット棒状印は、緩衝液のｐＨがｐＨ＝６の場合、また、黒棒状印は、緩衝液のｐＨがｐＨ＝８の場合、である。また、図４（ａ）は、未処理のＳＢＡ５．４を用いた場合、図４（ｂ）は、硝酸を用いて疎水処理を施したＳＢＡ５．４を用いた場合、である。
【0062】
具体的には、精密ミクロ電子天秤（ザルトリウス社製、ＣｕｂｉｓＩＩ ＭＣＡ）を用いてＰＣＲチューブの中に精確に秤量したＳＢＡ５．４（０．５ｍｇ）と、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ、１０ｕｎｉｔｓ）を含んだ各種緩衝液（１２０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮａ－ＣＨ３ＣＯＯＨ（ｐＨ ４）、１２０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ ６）、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８））２０μＬとを、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で混合し、遠心分離（２０００～４０００Ｇ、１０～３０秒間）を行い、上清を全て回収した。次いで、回収サンプルに２×ＳＤＳ-ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０μＬ）を加えた後、アルミブロック恒温槽（タイテック社製、クールサーモユニット ＣＴＵ－Ｍｉｎｉ）を用いて９５℃で５分間加温し、２０μＬ分をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）に供した。一方、遠心分離後に沈殿したシリカ粒子に対して、ＳＤＳ-ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（４０μＬ）を添加した後、前記恒温槽を用いて９５℃で５分間加温し、遠心分離後の上清（２０μＬ分）を併せてＳＤＳ-ＰＡＧＥに供した。最終的に、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅによるゲル染色後に、電気泳動ゲル撮影・解析システム（バイオ・ラッド社製、ＧｅｌＤｏｃ Ｇｏイメージングシステム）で解析した結果から、上清及びシリカ細孔表面に含まれるＤＮＡ増幅酵素の含有率を評価した。
【0063】
図４（ａ）より、未処理のＳＢＡ５．４を用いた場合には、ｐＨ値が４から８と増大すると共に上清におけるＤＮＡ増幅酵素の量が減少し、逆にＳＢＡ５．４に固定化されていたＤＮＡ増幅酵素の量が増大するという結果が示された（ＫＯＤ含有率は最大で７０％程度）。ＤＮＡ増幅酵素であるＫＯＤの等電点（理論値、ｐＩ＝８．８）に近づくにつれて、酵素の固定化量が増大したことから、シリカ表面への酵素の固定化には静電的相互作用よりも疎水的相互作用が寄与している可能性が示唆された。一方、図４（ｂ）より、硝酸を用いて疎水処理を施したＳＢＡ５．４を用いた場合には、ｐＨ値が４から８の範囲において、７０～８０％程度のＫＯＤ含有率が示された。ｐＨの値に大きく依存せず、未処理のＳＢＡ５．４よりも最大で１０％程度、ＫＯＤ含有率が増大した。以上の結果から、シリカ表面への酵素の固定化には静電的相互作用よりも疎水的相互作用が大きく寄与していることが明らかとなった。
【0064】
（実施例３）ＲＮＡを対象としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ
本実施例では、上記実施例１で得られた「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」及び「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」と共に「未処理のシリカ系ナノ空孔材料」を用い、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）の固定化を行い、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を、「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル（非特許文献３）」に記載される手順通りに適用し、その評価を行った。
本実施例では、上記実施例１で得られた「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」及び「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」と共に「未処理のシリカ系ナノ空孔材料」を用い、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）の固定化を行い、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＮ２領域（１５８塩基）を標的としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を、「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル（非特許文献３）」に記載される手順通りに適用し、その評価を行った。
【0065】
酵素反応は、上記ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物（酵素：０．００００１～１ｕｎｉｔｓ）に、基質ＲＮＡとして上記新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００、１００、１０、１コピー）、プライマー・プローブとして新型コロナウイルス検出用プライマー・プローブセット（タカラバイオ社製、Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ Ｎ２（２０１９－ｎＣｏＶ））、また、蛍光検出用プローブとしてＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製、Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）を含んだリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応溶液２０μＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間混合し、遠心分離（２０００～４０００Ｇ、２～５秒間）を行った後に開始した。
反応条件は、５０℃で１０分間、次に９５℃で１０分間の加熱の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の温度サイクルを４５回繰り返すこととし、本反応には、リアルタイムＰＣＲ装置（バイオ・ラッド社製、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ リアルタイムＰＣＲ解析システム）を使用した。
反応条件は、５０℃で１０分間、次に９５℃で１０分間の加熱の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の温度サイクルを４５回繰り返すこととし、本反応には、リアルタイムＰＣＲ装置（バイオ・ラッド社製、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ リアルタイムＰＣＲ解析システム）を使用した。
【0066】
（３－１）高感度化の検証
（実施例１）で、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法において用いるシリカ系ナノ空孔材料として、細孔径が小さくなるにつれて、反応阻害の程度が抑えられることが明瞭に示されたが、とりわけＳＢＡ５．４の反応阻害が小さかったので、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲに係わる本実施例では、ＳＢＡ５．４を用いて行った。
ＤＮＡ増幅酵素（１００倍希釈したＫＯＤ）の添加効果をみるため、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００、１００コピー）を、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に遊離のＫＯＤ（未固定）及びＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を添加してＲＴ－ＰＣＲを行い、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を作成した（図６）。遊離のＫＯＤ（未固定）と、ＰＣ（遊離のＫＯＤ（未固定）及びＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）の場合とを比較したところ、両者に大きな変化はないことが確認され、むしろ、ＫＯＤが添加されることによる僅かな反応阻害が示唆された。一方、興味深いことに、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を添加した場合、遊離のＫＯＤ（未固定）及びＰＣと比較してＤＮＡ増幅活性が著しく増大した。
（実施例１）で、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法において用いるシリカ系ナノ空孔材料として、細孔径が小さくなるにつれて、反応阻害の程度が抑えられることが明瞭に示されたが、とりわけＳＢＡ５．４の反応阻害が小さかったので、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲに係わる本実施例では、ＳＢＡ５．４を用いて行った。
ＤＮＡ増幅酵素（１００倍希釈したＫＯＤ）の添加効果をみるため、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１０００、１００コピー）を、リアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に遊離のＫＯＤ（未固定）及びＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を添加してＲＴ－ＰＣＲを行い、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を作成した（図６）。遊離のＫＯＤ（未固定）と、ＰＣ（遊離のＫＯＤ（未固定）及びＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）の場合とを比較したところ、両者に大きな変化はないことが確認され、むしろ、ＫＯＤが添加されることによる僅かな反応阻害が示唆された。一方、興味深いことに、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を添加した場合、遊離のＫＯＤ（未固定）及びＰＣと比較してＤＮＡ増幅活性が著しく増大した。
【0067】
未処理のＳＢＡ５．４（図７（ａ））と、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄することで疎水化を促進させたＳＢＡ５．４（図７（ｂ））を用いたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体中のＫＯＤ濃度の影響を評価した。図７（ａ、ｂ）に示されるアルタイムＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線から、複合体中のＫＯＤ濃度の違いによっては、ＰＣ（ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）での反応活性を著しく増大できる可能性が示唆された（例えば、ＫＯＤ濃度を原液（１ｕｎｉｔ）から１００～１０００倍希釈した場合）。このことから、以下のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにおける検量線の作成（１０００、１００、１０、１コピーからのＲＮＡ検出）においては、１００倍希釈したＫＯＤを用いて調製したＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を適用した。
【0068】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの検量線における、未処理のＳＢＡ５．４と、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄することで疎水化を促進させたＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（１００倍希釈したＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体中の添加の効果を評価した（図８）。
図中、白丸印は、ＰＣ（ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）の場合、黒三角印は、未処理のＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた場合、また、白菱形印は、疎水化を促進させたＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた場合、である。
図中、白丸印は、ＰＣ（ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）の場合、黒三角印は、未処理のＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた場合、また、白菱形印は、疎水化を促進させたＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた場合、である。
【0069】
図８によれば、ＰＣでの検量線と比較して、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加した場合に、検量線（１０００、１００、１０、１コピー）がより低い位置に平行移動（Ｃｑ値が減少）したことより、高感度化を示唆するデータを得た。全体的には、疎水化を促進させたＳＢＡ５．４ ＞ 未処理のＳＢＡ５．４ ＞ ＰＣの順に感度が高まる傾向が認められた。ここで、ＫＯＤは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないために蛍光検出用プローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）を分解できない。そのため、通常は蛍光検出をするために、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬に含まれる、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ増幅酵素が必須となる。それにもかかわらず、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬中に含まれるＤＮＡ増幅酵素での反応活性を上回る効果が得られたことから、濃度を最適化した固定化ＫＯＤと、当該試薬中のＤＮＡ増幅酵素との併用により、ＰＣＲ反応が促進し、高感度化が認められた。すなわち、このことから、ＫＯＤと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼ及び／又はＰｆｕポリメラーゼなどのＤＮＡ増幅酵素を併用することで、シナジー効果が奏せられることが強く示唆された。本実施例で使用したリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬には、Ｐｆｕポリメラーゼも含め５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種類のポリメラーゼが含まれているが、両者を含む必要はない。当該試薬以外にも、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含むＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を適用した場合にも同様の効果が認められた。
【0070】
（３－２）シリカ表面の疎水化（硝酸処理）による影響
１０００コピーのＲＮＡを標的としたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにおいて、未処理のＳＢＡ５．４、硝酸処理ＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４及び硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（１００倍希釈したＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を評価した（図９）。その結果、硝酸処理により疎水化を促進させたＳＢＡ５．４においても、ＰＣ（ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）と比較して、より高い反応活性が示された。以上より、「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」においても、「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」等を用いた場合と同様に、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬中に含まれるＤＮＡ増幅酵素での反応活性を上回る効果が得られたことから、ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体と、当該試薬中のＤＮＡ増幅酵素とを併用することでシナジー効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
１０００コピーのＲＮＡを標的としたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにおいて、未処理のＳＢＡ５．４、硝酸処理ＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４及び硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いて調製したＤＮＡ増幅酵素（１００倍希釈したＫＯＤ）－ＳＢＡ５．４複合体の添加の影響を評価した（図９）。その結果、硝酸処理により疎水化を促進させたＳＢＡ５．４においても、ＰＣ（ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加していないポジティブコントロール）と比較して、より高い反応活性が示された。以上より、「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」においても、「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」等を用いた場合と同様に、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬中に含まれるＤＮＡ増幅酵素での反応活性を上回る効果が得られたことから、ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体と、当該試薬中のＤＮＡ増幅酵素とを併用することでシナジー効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
【0071】
（実施例４）ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象としたＤＮＡ増幅
本実施例では、上記実施例１で得られた「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」及び「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」と共に「未処理のシリカ系ナノ空孔材料」を用い、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）の固定化を行い、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＳ領域（５４７塩基）及びＮ２領域（１５８塩基）を標的として、予め、逆転写酵素を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ反応の評価（ゲル電気泳動解析）を行った。
本実施例では、上記実施例１で得られた「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」及び「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」と共に「未処理のシリカ系ナノ空孔材料」を用い、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）の固定化を行い、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＳ領域（５４７塩基）及びＮ２領域（１５８塩基）を標的として、予め、逆転写酵素を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ反応の評価（ゲル電気泳動解析）を行った。
【0072】
ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの合成は、逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ、２００ｕｎｉｔｓ）、２μＭ オリゴ（ｄＴ）１２－１８プライマー、２μＭ ランダムヘキサマー、ｄＮＴＰｓ（各々０．４ｍＭ）、４ｍＭ ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＲＮａｓｅＯＵＴ、４０ｕｎｉｔｓ）、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ、２０００、２００、２０、２コピー）を含んだ逆転写酵素反応溶液２５μＬを、２３℃で１０分間、５０℃で１０分間、８０℃で１０分間、と順次加温することで行った。
本反応には、ＰＣＲ装置（バイオ・ラッド社製、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ サーマルサイクラー）を使用した。反応後、各チューブに３５μＬのＲＴ－ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、混合した。
本反応には、ＰＣＲ装置（バイオ・ラッド社製、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ サーマルサイクラー）を使用した。反応後、各チューブに３５μＬのＲＴ－ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、混合した。
【0073】
ＰＣＲ反応は、上記ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物（酵素：１ｕｎｉｔｓ）に、反応基質として上記新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド、プライマーとして現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＳセット（１段階目のＰＣＲ用プライマー： ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ１－ｆ、ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ２－ｒ、各々０．４μＭ）、また、ｄＮＴＰｓ（各々０．２ｍＭ）を含んだＰＣＲ反応溶液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム）５０μＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間混合することによって開始した。
反応条件は、変性、アニーリング、ＤＮＡ伸長反応の３ステップの場合には、９５℃で１分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、５６～７４℃で３０秒間の温度サイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃で１分間の加熱反応とし、本反応には、上記ＰＣＲ装置を使用した。また、変性、アニーリング／ＤＮＡ伸長反応の２ステップの場合には、９８℃で２分間の加熱の後、９８℃で１０秒間、６３～６６℃で２０秒間の温度サイクルを４０回繰り返した。最終的には、ＰＣＲ反応産物を全自動電気泳動システム（アジレント・テクノロジー社製、Ａｇｉｌｅｎｔ ４１５０ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を用いて解析した。
反応条件は、変性、アニーリング、ＤＮＡ伸長反応の３ステップの場合には、９５℃で１分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、５６～７４℃で３０秒間の温度サイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃で１分間の加熱反応とし、本反応には、上記ＰＣＲ装置を使用した。また、変性、アニーリング／ＤＮＡ伸長反応の２ステップの場合には、９８℃で２分間の加熱の後、９８℃で１０秒間、６３～６６℃で２０秒間の温度サイクルを４０回繰り返した。最終的には、ＰＣＲ反応産物を全自動電気泳動システム（アジレント・テクノロジー社製、Ａｇｉｌｅｎｔ ４１５０ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を用いて解析した。
【0074】
（４－１）高感度化の検証
図１０に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理の３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４、ＳＢＡ７．１、ＳＢＡ１０．６、各０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ７．１複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ１０．６複合体の場合、である。
図１０に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理の３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４、ＳＢＡ７．１、ＳＢＡ１０．６、各０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ７．１複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ１０．６複合体の場合、である。
【0075】
現行の「ＲＴ－ＰＣＲによる病原体検出マニュアル」（非特許文献３）では、４０サイクルで２段階のＰＣＲ反応（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）による検出に合計４時間（２時間のＰＣＲ反応を２回）を要する。通常は、１段階目のＰＣＲでの検出は困難であるとされているところ、図１０によれば、未処理の３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカにＫＯＤを固定化することで１段階目のＰＣＲにおいて１分子レベルの極微量ＲＮＡの精確な増幅検出を達成した（２時間のＰＣＲ反応を１回）。具体的には、遊離のＫＯＤでは１００コピーからのみ増幅検出できたが、ＳＢＡ型メソポーラスシリカに固定化したＫＯＤを用いることで、１００、１０、１コピーのＲＮＡの精確な増幅検出の実現可能性が示唆された。
【0076】
図１１に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄した３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４、ＳＢＡ７．１、ＳＢＡ１０．６、各０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ７．１複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ１０．６複合体の場合、である。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ７．１複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ１０．６複合体の場合、である。
【0077】
図１１によれば、未処理のＳＢＡ型メソポーラスシリカを用いた場合（図１０）よりも全体的にはＤＮＡ増幅効率が低下したものの、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で洗浄処理を施した３種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカにＫＯＤを固定化することによっても１段階目のＰＣＲにおいて、１００、１０、１コピーのＲＮＡを検出できた。
【0078】
図１２に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理の３種類のＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６、ＦＳＭ４．２、ＦＳＭ８．０、各０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ２．６複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ４．２複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ８．０複合体の場合、である。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ２．６複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ４．２複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ８．０複合体の場合、である。
【0079】
図１２によれば、未処理のＦＳＭ型メソポーラスシリカにＫＯＤを固定化することで１段階目のＰＣＲにおいて１００～１０分子レベルの微量ＲＮＡの検出を確認できた。具体的には、ＦＳＭ２．６及びＦＳＭ４．２に固定化したＫＯＤを用いた場合に、１００～１０コピーのＲＮＡの検出の実現可能性が示唆された。一方、ＦＳＭ８．０を用いた場合には、ＲＮＡの検出が困難であった。
【0080】
図１３に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄した３種類のＦＳＭＡ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６、ＦＳＭ４．２、ＦＳＭ８．０、各０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ２．６複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ４．２複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ８．０複合体の場合、である。
図中、（ａ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡ（１００、１０、１、０．１コピー）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、（ｂ）は、ＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。また、図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ２．６複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ４．２複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－ＦＳＭ８．０複合体の場合、である。
【0081】
図１３によれば、未処理のＦＳＭ型メソポーラスシリカを用いた場合（図１２）よりも全体的にはＤＮＡ増幅効率が低下し、最も細孔径のＦＳＭ２．６を用いた場合のみ、１段階目のＰＣＲにおいて、１００～１０コピーのＲＮＡを検出できた。
【0082】
ＳＢＡ型、ＦＳＭ型ともに全体的には細孔径が小さくなる程、ＤＮＡ増幅効率が増幅する傾向が認められ、さらに、ＦＳＭ型と比較してＳＢＡ型メソポーラスシリカを用いた場合により高感度に検出できた。また、未処理のメソポーラスシリカのみならず、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で洗浄処理を施したメソポーラスシリカ（ＳＢＡ型、ＦＳＭ型）を用いた場合においても１段階目のＰＣＲ反応で標的配列を検出できた。当該処理を施した６種類のメソポーラスシリカの中ではＳＢＡ５．４を用いた場合により高いＤＮＡ増幅効率が認められたため（図１１）、このことからも当該処理ＳＢＡ５．４を実施例２でのＲＮＡを反応基質としたリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲに適用した。
【0083】
（４－２）シリカ表面の疎水化（硝酸処理）による影響
図１４に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４、硝酸処理ＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４及び硝酸処理ＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を解析した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００、１０、１コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。
図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、市松模様状印は、ＫＯＤ－洗浄処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－洗浄処理／硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、である。
図１４に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４、硝酸処理ＳＢＡ５．４、５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したＳＢＡ５．４及び硝酸処理ＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を解析した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００、１０、１コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。
図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、黒棒状印は、ＫＯＤ－硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、市松模様状印は、ＫＯＤ－洗浄処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、また、ドット棒状印は、ＫＯＤ－洗浄処理／硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、である。
【0084】
図１４によれば、ＰＣでのＰＣＲ産物濃度と比較して、各種のＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加した場合に、著しくＰＣＲ産物濃度が増大したことより、高感度化を示唆するデータを得た。全体的には、硝酸処理ＳＢＡ５．４ ＞ 洗浄処理ＳＢＡ５．４ ＞ 洗浄処理／硝酸処理ＳＢＡ５．４ ＞ 未処理のＳＢＡ５．４ ＞ ＰＣの順に感度が高まる傾向が認められた。１０コピーのＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドからのＰＣＲ反応に着目すれば、各サンプル間（Ｎ＝３）での多少のバラツキはみられたものの、硝酸処理ＳＢＡ５．４、及び、洗浄処理／硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いた場合に、より高い反応活性が示された。以上より、「硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」においても、「５０％グリセロール－６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で処理したサンプルを更に１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）で３回洗浄したシリカ系ナノ空孔材料」を用いた場合と同様に、未処理のシリカ系ナノ空孔材料での反応活性を上回る効果が得られたことから、硝酸によりシリカ表面の疎水化を促進させることで、固定化したＫＯＤによるＤＮＡ増幅反応の向上効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
【0085】
（４－３）アニーリング及び伸長温度の最適化による反応の迅速化の検証
図１５に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を、伸長温度（５６、６０、７４℃）を指標として評価した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００、１０コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合である。
図中、黒三角印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］、１０コピー）の場合、白三角印は、ＰＣ（１００コピー）の場合、黒四角印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体（１０コピー）の場合、また、白四角印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体（１００コピー）の場合、である。
図１５に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を、伸長温度（５６、６０、７４℃）を指標として評価した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００、１０コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合である。
図中、黒三角印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］、１０コピー）の場合、白三角印は、ＰＣ（１００コピー）の場合、黒四角印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体（１０コピー）の場合、また、白四角印は、ＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体（１００コピー）の場合、である。
【0086】
図１５によれば、遊離のＫＯＤを用いたＰＣＲ反応においては、伸長温度が７４℃である条件で１００コピーからのみ増幅検出できた。一方、興味深いことに、伸長温度（通常は７４℃）を６０℃／５６℃と低く設定した場合、遊離の酵素では１０～１００コピーのＲＮＡの検出はできなかったが、ＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤでは７４～５６℃の温度範囲においても高感度の検出の実現可能性が示唆された。このことより、ＰＣＲ反応における伸長温度の選択の自由度が高くなり、ＰＣＲの厳密な反応条件の設定が不要になる可能性が示唆されたため、以下の実験（図１６）では、伸長温度をより低い温度に設定し、アニーリング及び伸長温度を同一とした２ステップＰＣＲについて検証した。
【0087】
図１６に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理の２種類のメソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４、ＦＳＭ２．６、各０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＮ２領域：１５８塩基対）を、アニーリング及び伸長温度（６３℃、６４．２℃、６４．９℃、６６℃）を指標として評価した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）をゲル電気泳動で解析した場合である。また、ゲル中で分離・検出されたＰＣＲ反応産物のバンドの上方に示した数値は、ＰＣＲ産物濃度（ｎｇ／μＬ）である。
【0088】
標的ＲＮＡ試料が、新型コロナウイルスＲＮＡなどＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ試料の場合、ＧＣ含量（３８％）が少ない配列なので、プライマーのアニーリング温度を高く設定することができないため、高温域での２ステップＰＣＲが実行できない。本発明では、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）をシリカ系ナノ空孔材料に固定化したことで伸長反応の温度範囲が拡がる効果により、プライマー分子のアニーリングに最適なより低温での反応が可能になる。実際に、アニーリングに最適な温度（６０℃）に向けて反応温度を低下させても、副反応を抑えながらＤＮＡ増幅活性が増大されるという顕著な効果が認められた（図１６）。このように、アニーリング温度をひろく設定できることから、標的の配列（ＧＣ含量）の違いによって、プライマーの選択の幅が広がるメリットもある。
【0089】
図１６により、遊離のＫＯＤ（未固定）を用いた場合には、アニーリング及び伸長温度が低くなると共にＰＣＲ産物濃度が低下したが、逆に２種類のメソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４及びＦＳＭ２．６）に固定化したＫＯＤを用いた場合には、ＰＣＲ産物濃度が増大するという結果が示された。アニーリング及び伸長温度が６３℃の場合は、ＳＢＡ５．４（１１．８ｎｇ／μＬ） ＞ ＦＳＭ２．６（４．７７ｎｇ／μＬ） ＞ ＫＯＤ（未固定）（１．１９ｎｇ／μＬ）の順にＰＣＲ産物濃度が高まる傾向が認められた。当該反応系において、アニーリング及び伸長温度を同一とした２ステップＰＣＲを適用することで１５分程度の反応時間の短縮が可能となった。また、変性及びアニーリング／伸長反応の時間をそれぞれ半分に設定することによっても、標的のＰＣＲ産物濃度を維持しながら、さらに１０分程度、反応時間を短縮することができた。
以上より、２ステップＲＴ－ＰＣＲ法においてもＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いることによる反応条件の最適化によって反応の高効率化および迅速化を達成した。また、前記（３－１）での検証結果と同様に、ＦＳＭ型と比較してＳＢＡ型メソポーラスシリカを用いた場合により高感度に検出できた。
以上より、２ステップＲＴ－ＰＣＲ法においてもＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いることによる反応条件の最適化によって反応の高効率化および迅速化を達成した。また、前記（３－１）での検証結果と同様に、ＦＳＭ型と比較してＳＢＡ型メソポーラスシリカを用いた場合により高感度に検出できた。
【0090】
（実施例５）ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象としたＤＮＡ増幅（２０μＬ反応系）
（５－１）シリカ表面の高濃度硝酸処理による疎水化の影響
シリカ系ナノ空孔材料のシリカ表面を硝酸などにより疎水処理をすることで、より高感度の標的ＲＮＡウイルス検体の検出が可能となることが確認できたので、本実施例では、さらに疎水化効果を高めるために、硝酸濃度を１３Ｍまで高め、シリカ系ナノ空孔材料に前記実施例２（２－２）と同様の調製方法により、シリカ表面に疎水処理を施した。
固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて、未処理のＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）及び１３Ｍ 硝酸で処理したＦＳＭ２．６、未処理のＭＣＭ－４１（細孔径：３．１ｎｍ［ＭＣＭ３．１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製］）及び１３Ｍ硝酸処理ＭＣＭ３．１、未処理のＴＭＰＳ（細孔径：２．０ｎｍ［ＴＭＰＳ２．０、太陽化学社製］）及び１３Ｍ硝酸処理ＴＭＰＳ２．０、又、未処理のＳBＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製］）、１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４の局所構造（２９Ｓｉ核）を詳細に解析し、表面（細孔内壁面）の化学状態を推定した（図１７）。
（５－１）シリカ表面の高濃度硝酸処理による疎水化の影響
シリカ系ナノ空孔材料のシリカ表面を硝酸などにより疎水処理をすることで、より高感度の標的ＲＮＡウイルス検体の検出が可能となることが確認できたので、本実施例では、さらに疎水化効果を高めるために、硝酸濃度を１３Ｍまで高め、シリカ系ナノ空孔材料に前記実施例２（２－２）と同様の調製方法により、シリカ表面に疎水処理を施した。
固体核磁気共鳴（ＳＳ－ＮＭＲ）装置を用いて、未処理のＦＳＭ－１６（細孔径：２．６ｎｍ［ＦＳＭ２．６］）及び１３Ｍ 硝酸で処理したＦＳＭ２．６、未処理のＭＣＭ－４１（細孔径：３．１ｎｍ［ＭＣＭ３．１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製］）及び１３Ｍ硝酸処理ＭＣＭ３．１、未処理のＴＭＰＳ（細孔径：２．０ｎｍ［ＴＭＰＳ２．０、太陽化学社製］）及び１３Ｍ硝酸処理ＴＭＰＳ２．０、又、未処理のＳBＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製］）、１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４の局所構造（２９Ｓｉ核）を詳細に解析し、表面（細孔内壁面）の化学状態を推定した（図１７）。
【0091】
ＮＭＲ分析の結果、４種類のシリカ系ナノ空孔材料のいずれも硝酸処理の有無により、シリカ表面の末端シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）の分布に違いが見られた。具体的には、前記実施例２（２－３）での検証結果と同様に、硝酸処理を施すことでＱ２／Ｑ４比およびＱ３／Ｑ４比が小さくなっている事から、Ｑ２、Ｑ３に属するＳｉ種同士が縮合してＱ４に変わったと考えられる。また、ＳＢＡ５．４に関して、未処理サンプルでの分析結果を基に硝酸濃度（１Ｍ及び１３Ｍ）の影響を調べた結果、未処理ＳＢＡ５．４ ＞ １Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４ ＞ １３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４の順にＱ３／Ｑ４比が小さくなることが確認された。このことより、硝酸濃度を１３Ｍまで高めることでシリカの表面性状がより疎水的に変化したことが示唆された。
【0092】
当該「１３Ｍ 硝酸を用いてシリカ表面の疎水化を促進したシリカ系ナノ空孔材料」と共に「未処理のシリカ系ナノ空孔材料」を用い、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）の固定化を行い、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＳ領域（５４７塩基）を標的として、予め、逆転写酵素を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象とした２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ反応の評価（ゲル電気泳動解析）を行った。
【0093】
上述のとおり、１３Ｍ 硝酸を用いてシリカ表面の疎水化を促進できたが、ＰＣＲ産物濃度の増大が示されるかどうかは不明であったため、まず、前記実施例４（４－２）での検証と同様の反応系（液量：５０μＬ）にて、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４、１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４、及び１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４に固定化したＫＯＤを用いたＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を解析した（図１８）。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。
図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、グレー棒状印は、ＫＯＤ－１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、また、黒棒状印は、ＫＯＤ－１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、である。
図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、グレー棒状印は、ＫＯＤ－１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、また、黒棒状印は、ＫＯＤ－１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体の場合、である。
【0094】
図１８によれば、ＰＣでのＰＣＲ産物濃度と比較して、各種のＫＯＤ－ＳＢＡ５．４複合体を添加した場合に、ＰＣＲ産物濃度が増大したことより、高感度化を示唆するデータを得た。また、１Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４と比較して、１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４を用いた場合に、より高い反応活性が示されたことから、硝酸濃度を１３Ｍまで高め、よりシリカ表面の疎水化を促進させることで、固定化したＫＯＤによるＤＮＡ増幅反応の向上効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
以下の実験では、「１３Ｍ 硝酸を用いてシリカ表面の疎水化を促進したシリカ系ナノ空孔材料」を適用すると共に、反応液量を５０μＬから２０μＬに変更することとした。
以下の実験では、「１３Ｍ 硝酸を用いてシリカ表面の疎水化を促進したシリカ系ナノ空孔材料」を適用すると共に、反応液量を５０μＬから２０μＬに変更することとした。
【0095】
ＰＣＲ反応は、前記ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物（酵素：１ｕｎｉｔｓ）に、反応基質として前記実施例４で得られたＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）、ＰＣＲ用プライマー（ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ１－ｆ、ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ２－ｒ、各々０．５μＭ）、また、ｄＮＴＰｓ（各々０．２ｍＭ）を含んだＰＣＲ反応溶液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム）２０μＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間混合することによって開始した。
反応条件は、９５℃で１分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、７４℃で３０秒間の温度サイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃で１分間の加熱反応とし、本反応には、前記ＰＣＲ装置を使用した。最終的には、ＰＣＲ反応産物を前記の全自動電気泳動システムを用いて解析した。
反応条件は、９５℃で１分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、７４℃で３０秒間の温度サイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃で１分間の加熱反応とし、本反応には、前記ＰＣＲ装置を使用した。最終的には、ＰＣＲ反応産物を前記の全自動電気泳動システムを用いて解析した。
【0096】
（５－２）シリカ表面の疎水化（１３Ｍ 硝酸処理）による高感度化の検証
図１９に、遊離のＫＯＤ（未固定）、及び未処理の４種類のメソポーラスシリカ粉末（ＦＳＭ２．６、ＭＣＭ３．１、ＴＭＰＳ２．０、ＳＢＡ５．４、各０．５ｍｇ）並びに、１３Ｍ 硝酸で処理した前記４種類のメソポーラスシリカ粉末に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を解析した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。
図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－未処理メソポーラスシリカ複合体の場合、また、黒棒状印は、ＫＯＤ－硝酸処理メソポーラスシリカ複合体の場合、である。
図１９に、遊離のＫＯＤ（未固定）、及び未処理の４種類のメソポーラスシリカ粉末（ＦＳＭ２．６、ＭＣＭ３．１、ＴＭＰＳ２．０、ＳＢＡ５．４、各０．５ｍｇ）並びに、１３Ｍ 硝酸で処理した前記４種類のメソポーラスシリカ粉末に固定化したＫＯＤを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）を解析した結果を示す。図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。
図中、白棒状印は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）の場合、斜線棒状印は、ＫＯＤ－未処理メソポーラスシリカ複合体の場合、また、黒棒状印は、ＫＯＤ－硝酸処理メソポーラスシリカ複合体の場合、である。
【0097】
図１９によれば、１段階目のＰＣＲにおいてＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］）でのＰＣＲ産物濃度は極めて低い値に留まったが、各種のＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体を添加した場合に、ＰＣＲ産物濃度が増大したことより、高感度化を示唆するデータを得た。 また、前記実施例３及び４での検証結果と同様に、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）にバックグランドとして含まれるヒトゲノムＤＮＡの存在下でも目的のＲＮＡの精確なＲＴ-ＰＣＲ増幅検出が可能であることが確認できた。硝酸処理の有無に着目すれば、４種類のメソポーラスシリカのいずれにおいても、硝酸処理を施した場合に、より高い反応活性が示された。全体的には、硝酸処理ＳＢＡ５．４ ＞ 硝酸処理ＴＭＰＳ２．０ ＞ 未処理のＳＢＡ５．４ ＞ 硝酸処理ＭＣＭ３．１ ＞ 硝酸処理ＦＳＭ２．６ ＞ 未処理のＴＭＰＳ２．０ ＞ 未処理のＭＣＭ３．１ ＞ 未処理のＦＳＭ２．６ ＞ ＰＣの順に感度が高まる傾向が認められた。以上より、「１３Ｍ 硝酸を用いて疎水処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」においても、前記実施例４の「１Ｍ 硝酸処理を施したシリカ系ナノ空孔材料」を用いた場合と同様に、未処理のシリカ系ナノ空孔材料での反応活性を上回る効果が得られたことから、硝酸によりシリカ表面の疎水化を促進させることで、固定化したＫＯＤによるＤＮＡ増幅反応の向上効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
なお、一般的な傾向として、用いたシリカ系ナノ空孔材料の孔が小さいほど、ＤＮＡ増幅反応の効率が高い傾向がみられる。
なお、一般的な傾向として、用いたシリカ系ナノ空孔材料の孔が小さいほど、ＤＮＡ増幅反応の効率が高い傾向がみられる。
【0098】
シリカ表面の酸処理における硝酸濃度の影響については、上記「２０μＬ反応系」では比較を行っていないが、前記（５－１）の「５０μＬ反応系」では（図１８）に示されるように、ＳＢＡ５．４によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）について、１Ｍ硝酸及び１３Ｍ硝酸の濃度での比較実験を行っている。その結果、本来表面の疎水化度の高いＳＢＡ５．４であっても、硝酸濃度１Ｍ＜１３Ｍと疎水化程度に従いＰＣＲ反応産物濃度が高まり、ＲＴ－ＰＣＲ反応の感度が上昇することが示されている。
なお、前記（図１７(d)）のＳＢＡ５．４のＮＭＲ分析によるメソポーラスシリカ表面の末端シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）の分布の測定結果からも、硝酸濃度を高めることでシリカ表面の疎水化がより促進され、Ｑ３／Ｑ４比が更に小さくなったことが確認されている。
なお、前記（図１７(d)）のＳＢＡ５．４のＮＭＲ分析によるメソポーラスシリカ表面の末端シラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）の分布の測定結果からも、硝酸濃度を高めることでシリカ表面の疎水化がより促進され、Ｑ３／Ｑ４比が更に小さくなったことが確認されている。
【0099】
ＫＯＤ固定化における酸処理（疎水化処理）による固定化量の変化を測定したところ、ＦＳＭ２．６及びＭＣＭ３．１では固定化量は減少するが、未処理でも固定化量が多いＳＢＡ５．４では、さほど変わらず、ＴＭＰＳ２．０では固定化量が増大するという結果が得られた（図２０）。
硝酸処理で固定化量が減少したＦＳＭ２．６及びＭＣＭ３．１の場合は、未処理の場合もＰＣＲ増幅活性は低いが、硝酸処理により感度が著しく増大する（図１９）。その結果、固定化量が減少しても、シリカ表面への疎水的な結合により、ＰＣＲ反応において、よりアクティブな状態で酵素（ＫＯＤ）が固定化されるようになったと推察される。
このように、いずれのシリカ系ナノ空孔材料を採用した場合でも硝酸処理効果によりＲＴ－ＰＣＲ反応の感度が高まることで、ＤＮＡ増幅効率が著しく増大するという予想外の効果が得られた。なお、ＳＢＡ系メソポーラスシリカは最も表面の疎水性が高いシリカ系ナノ空孔材料なので、硝酸処理という疎水化処理に基づく効果は他の材料よりも顕著ではなく、未処理のＳＢＡ５．４でも十分な感度を発揮する。特に２０μＬ反応系の場合、５０μＬ反応系よりも感度が高いので、以下の実験（２０μＬ反応系）でＳＢＡ５．４を用いる場合は未処理のままで用いる。
硝酸処理で固定化量が減少したＦＳＭ２．６及びＭＣＭ３．１の場合は、未処理の場合もＰＣＲ増幅活性は低いが、硝酸処理により感度が著しく増大する（図１９）。その結果、固定化量が減少しても、シリカ表面への疎水的な結合により、ＰＣＲ反応において、よりアクティブな状態で酵素（ＫＯＤ）が固定化されるようになったと推察される。
このように、いずれのシリカ系ナノ空孔材料を採用した場合でも硝酸処理効果によりＲＴ－ＰＣＲ反応の感度が高まることで、ＤＮＡ増幅効率が著しく増大するという予想外の効果が得られた。なお、ＳＢＡ系メソポーラスシリカは最も表面の疎水性が高いシリカ系ナノ空孔材料なので、硝酸処理という疎水化処理に基づく効果は他の材料よりも顕著ではなく、未処理のＳＢＡ５．４でも十分な感度を発揮する。特に２０μＬ反応系の場合、５０μＬ反応系よりも感度が高いので、以下の実験（２０μＬ反応系）でＳＢＡ５．４を用いる場合は未処理のままで用いる。
【0100】
（５－３）ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の冷凍保管及び長期保存安定性評価
次いで、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の冷凍保管時における長期保存安定性の評価を行った。
図２１に、未処理の２種類のメソポーラスシリカ粉末（ＳＢＡ５．４、ＴＭＰＳ２．０、各０．５ｍｇ）及び１３Ｍ 硝酸で処理した前記ＳＢＡ５．４の粉末に固定化したＫＯＤの－３０℃での冷凍保管サンプルを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）の濃度を、各種のＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体の凍結保存期間（０～６３日）を指標として長期保存安定性を評価した結果を示す。
図中、（ａ）は、冷凍保管した酵素－メソポーラスシリカ複合体を含んだＰＣＲチューブ（液量：０μＬ）の写真、（ｂ）は、冷凍保管サンプルを解凍した後、反応基質を添加したＰＣＲチューブ（液量：２０μＬ）の写真、また、（ｃ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。図中、破線は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］、冷凍保管０日目）の場合、黒四角印は、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体（冷凍保管０～６３日目）の場合、白四角印は、ＫＯＤ－硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体（冷凍保管０～６３日目）の場合、また、黒三角印は、ＫＯＤ－未処理ＴＭＰＳ２．０複合体（冷凍保管０～６３日目）の場合、である。
次いで、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体の冷凍保管時における長期保存安定性の評価を行った。
図２１に、未処理の２種類のメソポーラスシリカ粉末（ＳＢＡ５．４、ＴＭＰＳ２．０、各０．５ｍｇ）及び１３Ｍ 硝酸で処理した前記ＳＢＡ５．４の粉末に固定化したＫＯＤの－３０℃での冷凍保管サンプルを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）の濃度を、各種のＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体の凍結保存期間（０～６３日）を指標として長期保存安定性を評価した結果を示す。
図中、（ａ）は、冷凍保管した酵素－メソポーラスシリカ複合体を含んだＰＣＲチューブ（液量：０μＬ）の写真、（ｂ）は、冷凍保管サンプルを解凍した後、反応基質を添加したＰＣＲチューブ（液量：２０μＬ）の写真、また、（ｃ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。図中、破線は、ＰＣ（遊離のＫＯＤ［未固定］、冷凍保管０日目）の場合、黒四角印は、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体（冷凍保管０～６３日目）の場合、白四角印は、ＫＯＤ－硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体（冷凍保管０～６３日目）の場合、また、黒三角印は、ＫＯＤ－未処理ＴＭＰＳ２．０複合体（冷凍保管０～６３日目）の場合、である。
【0101】
図２１によれば、１段階目のＰＣＲにおいてＰＣ（冷凍保管０日目）でのＰＣＲ産物濃度は極めて低い値に留まったが、各種のＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体を添加した場合は、前記（５－１）での検証結果と同様に、ＰＣＲ産物濃度が増大したことより、高感度化を示唆するデータを得た。興味深いことに、各種のＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体の冷凍保存時の形態が、酵素の冷凍保存時の安定性を高めるためのグリセロール等の試薬を含有していなかったにもかかわらず、いずれのＫＯＤ－未処理メソポーラスシリカ複合体（ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体、及び、ＫＯＤ－未処理ＴＭＰＳ２．０複合体）においても、６３日目までの冷凍保管によっても０日目と同等のＰＣＲ産物濃度が示された。しかし、ＫＯＤ－１３Ｍ硝酸処理ＳＢＡ５．４複合体では、冷凍保管０日目を基準とした場合の冷凍保管６３日目のＰＣＲ産物濃度が１７．５％程度減少する傾向が示された。このことより、冷凍によるＫＯＤ－未処理メソポーラスシリカ複合体の長期保存の実現可能性が示唆された。しかも、一般に酵素製剤の長期冷凍保存に汎用されるグリセロール等の試薬の添加が不要になる可能性すら示唆された。
【0102】
（５－４）ＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体の冷凍保管時の保存安定性へのグリセロールの影響
前記（５－３）では、ＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体における冷凍保存安定性は、グリセロール等の添加がなくても高い安定性を有していることが実証されたが、それと共に、もともと表面の疎水性が高いＳＢＡ５．４においては、反応性の高い２０μＬの反応系の場合は、表面の硝酸処理の効果が認められない結果となっていた。そこで、本実験では、ＫＯＤと未処理のＳＢＡ５．４との複合体を用いて、グリセロール（濃度範囲：０～５０％）を添加した場合の冷凍保管時における保存安定性の向上効果について検証した。
図２２に、未処理のメソポーラスシリカ粉末（ＳＢＡ５．４、０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤに対して、グリセロール及びｄＮＴＰｓ（各々０．４ｍＭ）を含んだ２×プレミックス溶液（２４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、１２ｍＭ 硫酸アンモニウム、２０ｍＭ 塩化カリウム、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００２％ ＢＳＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム）１０μＬを添加した後、－３０℃で冷凍保管したサンプルを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）の濃度を、ＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体に添加したグリセロールの濃度（０、１０、２０、３０、４０、５０％）及び凍結保存期間（０、７、１４日）を指標として保存安定性を評価した結果を示す。
図中、（ａ）は、酵素－メソポーラスシリカ複合体に前記の２×プレミックス溶液を添加し、冷凍保管したＰＣＲチューブ（液量：１０μＬ）の写真、（ｂ）は、冷凍保管サンプルを解凍した後、前記ＰＣＲ用プライマー及び反応基質を含んだ１０μＬのＲＴ－ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒを添加したＰＣＲチューブ（液量：２０μＬ）の写真、また、（ｃ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。図中、黒四角印は、冷凍保管０日目の場合、白四角印は、冷凍保管７日目の場合、また、黒三角印は、冷凍保管１４日目の場合、である。
前記（５－３）では、ＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体における冷凍保存安定性は、グリセロール等の添加がなくても高い安定性を有していることが実証されたが、それと共に、もともと表面の疎水性が高いＳＢＡ５．４においては、反応性の高い２０μＬの反応系の場合は、表面の硝酸処理の効果が認められない結果となっていた。そこで、本実験では、ＫＯＤと未処理のＳＢＡ５．４との複合体を用いて、グリセロール（濃度範囲：０～５０％）を添加した場合の冷凍保管時における保存安定性の向上効果について検証した。
図２２に、未処理のメソポーラスシリカ粉末（ＳＢＡ５．４、０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤに対して、グリセロール及びｄＮＴＰｓ（各々０．４ｍＭ）を含んだ２×プレミックス溶液（２４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、１２ｍＭ 硫酸アンモニウム、２０ｍＭ 塩化カリウム、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００２％ ＢＳＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム）１０μＬを添加した後、－３０℃で冷凍保管したサンプルを用いた２ステップＲＴ－ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）における１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＳ領域：５４７塩基対）の濃度を、ＫＯＤ－メソポーラスシリカ複合体に添加したグリセロールの濃度（０、１０、２０、３０、４０、５０％）及び凍結保存期間（０、７、１４日）を指標として保存安定性を評価した結果を示す。
図中、（ａ）は、酵素－メソポーラスシリカ複合体に前記の２×プレミックス溶液を添加し、冷凍保管したＰＣＲチューブ（液量：１０μＬ）の写真、（ｂ）は、冷凍保管サンプルを解凍した後、前記ＰＣＲ用プライマー及び反応基質を含んだ１０μＬのＲＴ－ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒを添加したＰＣＲチューブ（液量：２０μＬ）の写真、また、（ｃ）は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来のＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００コピー）を反応基質としたＰＣＲ反応産物（Ｎ＝３）の濃度をグラフ化した場合、である。図中、黒四角印は、冷凍保管０日目の場合、白四角印は、冷凍保管７日目の場合、また、黒三角印は、冷凍保管１４日目の場合、である。
【0103】
図２２によれば、冷凍保管０日目でのＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体においてグリセロール濃度が０％の場合のＰＣＲ産物濃度（２３．８ｎｇ／μＬ）を基準にすれば、興味深いことに、冷凍保管時のグリセロール濃度が低濃度領域である１０％又は２０％の場合のＰＣＲ産物濃度は２６．９ｎｇ／μＬ又２９．９ｎｇ／μＬまで著しく増大されるという顕著な効果が認められた。一方、冷凍保管時のグリセロール濃度が高濃度領域である３０％、４０％又５０％の場合のＰＣＲ産物濃度は２６．２ｎｇ／μＬ、２２．２ｎｇ／μＬ又１３．７ｎｇ／μＬの順に減少する傾向が認められた。また、冷凍保管０日目を基準とした冷凍保管１４日目のＰＣＲ産物濃度の減少率に着目すれば、グリセロール濃度は、１０％（減少率：２８％）＞ ０％（減少率：２２％）＞ ２０％（減少率：５％）＞ ３０％（減少率：０％）＞ ４０％（減少率：０％）＞ ５０％（減少率：０％）の順に減少率が高まる傾向が示されたことより、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体の長期保存のためには冷凍保管時のグリセロール濃度は２０％以上に設定することが好ましいことが判明した。全体的には、冷凍保管時のグリセロール濃度が２０％の場合に最も高い活性（冷凍保管０日目のＰＣＲ産物濃度：２９．９ｎｇ／μＬ）が示され、冷凍保管１４日目のＰＣＲ産物濃度の減少率も５％程度に抑えることができた。
以上より、「グリセロール等を添加したＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体」においても、上記の「グリセロール等を添加せず、洗浄用緩衝液を極力除去したＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を用いた場合と同様に、冷凍保管時における長期保存の実現可能性が示唆された。また、２倍濃度のｄＮＴＰｓ、ＢＳＡ及び塩化マグネシウム等を含んだ２×プレミックス溶液の状態で保存できることも明らかとなった。さらに、冷凍保管時のグリセロール濃度の最適化により、グリセロール濃度が０％の場合のＰＣＲ産物濃度を上回る予想外の効果が得られたことから、ＰＣＲ反応時にＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体と、グリセロールとを併用することでシナジー効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
以上より、「グリセロール等を添加したＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体」においても、上記の「グリセロール等を添加せず、洗浄用緩衝液を極力除去したＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体」を用いた場合と同様に、冷凍保管時における長期保存の実現可能性が示唆された。また、２倍濃度のｄＮＴＰｓ、ＢＳＡ及び塩化マグネシウム等を含んだ２×プレミックス溶液の状態で保存できることも明らかとなった。さらに、冷凍保管時のグリセロール濃度の最適化により、グリセロール濃度が０％の場合のＰＣＲ産物濃度を上回る予想外の効果が得られたことから、ＰＣＲ反応時にＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体と、グリセロールとを併用することでシナジー効果が奏せられ、ＲＴ－ＰＣＲ反応における有意な感度の向上が認められた。
【0104】
以上の結果から、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供する臨床検査用キット内に含まれるＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体は、グリセロールなしでも高い冷凍保存安定性を発揮する。しかし、溶液中にグリセロールを添加すると、特にグリセロール濃度を１０％以上とすることで、さらに冷凍保存安定性及びＰＣＲ増幅の反応性を高めることができ、特に濃度２０～３０％が最も効果的であったが、濃度４０％以上では逆に反応性が低下する。なお、冷凍保管は２×プレミックス溶液の形態で行っているために、実際のＰＣＲ反応系でのグリセロール濃度は半分となる。
すなわち、ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を含有するＲＴ－ＰＣＲ反応用臨床検査用キットを冷凍保管する際の溶液中のグリセロール濃度は、１～４０％、好ましくは１０～４０％、最も好ましくは２０～３０％であるといえる。
また、黒菱形印及び白三角印は、それぞれ未固定ＫＯＤを用いた場合の、冷凍保管０日目及び７日目の場合、である。
すなわち、ＫＯＤ－シリカ系ナノ空孔材料複合体を含有するＲＴ－ＰＣＲ反応用臨床検査用キットを冷凍保管する際の溶液中のグリセロール濃度は、１～４０％、好ましくは１０～４０％、最も好ましくは２０～３０％であるといえる。
また、黒菱形印及び白三角印は、それぞれ未固定ＫＯＤを用いた場合の、冷凍保管０日目及び７日目の場合、である。
【0105】
（実施例６）新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）特異的な逆転写反応および長鎖ＤＮＡの増幅検証
本実施例では、前記実施例５で検証したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－未処理ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）複合体を用いた２０μＬでのＰＣＲ反応系において、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマーをオリゴ（ｄＴ）プライマー及びランダムプライマーから「Ｓ遺伝子特異的プライマー」に変更し、更に、アニーリング温度及び伸長温度を同一とした２ステップＰＣＲを適用した。また、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（合成品）を対象とした場合、並びに、新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡを対象とした場合、について、Ｓ領域を標的とした１０００塩基対程度から１５００塩基対を超えるような長鎖ＤＮＡの増幅における高感度化の検証を試みた。
本実施例では、前記実施例５で検証したＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－未処理ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）複合体を用いた２０μＬでのＰＣＲ反応系において、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ合成用プライマーをオリゴ（ｄＴ）プライマー及びランダムプライマーから「Ｓ遺伝子特異的プライマー」に変更し、更に、アニーリング温度及び伸長温度を同一とした２ステップＰＣＲを適用した。また、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（合成品）を対象とした場合、並びに、新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡを対象とした場合、について、Ｓ領域を標的とした１０００塩基対程度から１５００塩基対を超えるような長鎖ＤＮＡの増幅における高感度化の検証を試みた。
【0106】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は非常に変異しやすく、最近のＯｍｉｃｒｏｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の世界的流行が示すように、世界中に容易に拡散する（非特許文献１８）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性にはＳ領域が関与しており、Ｏｍｉｃｒｏｎ変異体では、Ｓ領域に３２以上の変異が存在する（非特許文献１９、２０）。現在、最も広く用いられているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの配列決定プロトコルは、全ゲノムをカバーするＡＲＴＩＣ Ｎｅｔｗｏｒｋのプライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲに基づいており、それぞれ約４００ｎｔの９８の断片を増幅するように設計されているが、変異に応じて特異的なプライマーの再設計が必要である（非特許文献２１）。
【0107】
そこで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のＳ遺伝子の多重変異部位を迅速かつ高感度に同定するために、ＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）－未処理ＳＢＡ－１５（細孔径：５．４ｎｍ［ＳＢＡ５．４］）複合体を用いたＰＣＲ法の適用可能性について検証した。まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのＳ遺伝子全体を標的とした長鎖のＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを合成するために、Ｓ遺伝子の下流に位置するＯＲＦ３ａ遺伝子の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ： ＭＮ９０８９４７．３）に基づき、逆転写反応用の２種類のＳ遺伝子特異的プライマー（Ｓ遺伝子特異的プライマー－１及び－２：配列番号１、２）を設計した（図２３（ａ）、表１）。
【0108】
【表1】
【0109】
（６－１）Ｓ遺伝子特異的プライマーを用いた逆転写反応によるｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの合成は、前記の逆転写酵素（２００ｕｎｉｔｓ）、０．５μＭ Ｓ遺伝子特異的プライマー（表１、プライマー配列：Ｎｏ．１、或いは、２）、ｄＮＴＰｓ（各々０．４ｍＭ）、４ｍＭ ＤＴＴ、前記のＲＮａｓｅ阻害剤（４０ｕｎｉｔｓ）、又、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）、或いは、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、新型コロナウイルス粒子（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖａｒｉａｎｔ Ｐａｎｅｌ、Ｄｅｌｔａ株）から抽出した完全長ＲＮＡを、２０００、２００、８０、２０コピー含んだ逆転写酵素反応溶液２５μＬを、２３℃で１０分間、５０℃で１０分間、８０℃で１０分間、と順次加温することで行った。本反応には、前記ＰＣＲ装置を使用し、反応後、各チューブに３５μＬのＲＴ－ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒを添加し、混合した。
ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの合成は、前記の逆転写酵素（２００ｕｎｉｔｓ）、０．５μＭ Ｓ遺伝子特異的プライマー（表１、プライマー配列：Ｎｏ．１、或いは、２）、ｄＮＴＰｓ（各々０．４ｍＭ）、４ｍＭ ＤＴＴ、前記のＲＮａｓｅ阻害剤（４０ｕｎｉｔｓ）、又、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（バイオ・ラッド社製、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ）、或いは、現行の病原体検出マニュアル（非特許文献３）に記載のＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、新型コロナウイルス粒子（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖａｒｉａｎｔ Ｐａｎｅｌ、Ｄｅｌｔａ株）から抽出した完全長ＲＮＡを、２０００、２００、８０、２０コピー含んだ逆転写酵素反応溶液２５μＬを、２３℃で１０分間、５０℃で１０分間、８０℃で１０分間、と順次加温することで行った。本反応には、前記ＰＣＲ装置を使用し、反応後、各チューブに３５μＬのＲＴ－ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒを添加し、混合した。
【0110】
ＰＣＲ反応は、前記実施例５（５－２）と同様の方法により調製したＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体の沈殿物（酵素：１ｕｎｉｔｓ）に、反応基質として前記のＳ遺伝子特異的プライマーを用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド（１００、１０、４、１コピー）、ＰＣＲ用プライマー（ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ１－ｆ、ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ２－ｒ、又は、表２に記載の３種類のプライマーセット、各々０．５μＭ）、また、ｄＮＴＰｓ（各々０．２ｍＭ）を含んだＰＣＲ反応溶液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム）２０μＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間混合することによって開始した。
２ステップＰＣＲ増幅条件は、９８℃で３０秒間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で１５秒（プライマーセットがＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ１－ｆ、ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ２－ｒの場合）または９０秒（表２に記載の３種類のプライマーセットの場合）のサイクルを４０回繰り返した。本反応には、前記ＰＣＲ装置を使用し、最終的には、ＰＣＲ反応産物を前記の全自動電気泳動システムを用いて解析した。
２ステップＰＣＲ増幅条件は、９８℃で３０秒間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で１５秒（プライマーセットがＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ１－ｆ、ＷｕｈａｎＣｏＶ－ｓｐｋ２－ｒの場合）または９０秒（表２に記載の３種類のプライマーセットの場合）のサイクルを４０回繰り返した。本反応には、前記ＰＣＲ装置を使用し、最終的には、ＰＣＲ反応産物を前記の全自動電気泳動システムを用いて解析した。
【0111】
（６－２）長鎖ＤＮＡ増幅における高感度化の検証（新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ［合成品］を対象とした場合）
まず、Ｓ遺伝子特異的プライマー－１（図２３（ａ）、表１、プライマー配列：Ｎｏ．１（配列番号１））を用いて、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（合成品）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質として、４つの標的領域（図２３（ａ）、標的領域１－４）の２ステップＰＣＲ増幅（アニーリング温度及び伸長温度：６５℃）を試みた。
まず、Ｓ遺伝子特異的プライマー－１（図２３（ａ）、表１、プライマー配列：Ｎｏ．１（配列番号１））を用いて、新型コロナウイルス検出用標準物質ＲＮＡ（合成品）から合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質として、４つの標的領域（図２３（ａ）、標的領域１－４）の２ステップＰＣＲ増幅（アニーリング温度及び伸長温度：６５℃）を試みた。
【0112】
図２３（ｂ）に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４（０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いたＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおける１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域１：５４７塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図２３（ｂ）の図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－１を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、同表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
図２３（ｂ）の図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－１を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、同表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
【0113】
図２３（ｂ）によれば、前記実施例５で示したＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおける１段階目のＰＣＲに相当する「標的領域１（５４７塩基対）」のＰＣＲ増幅時間は、２ステップＰＣＲを適用することで半分程度に短縮された。また、前記実施例４での検証結果（３ステップＰＣＲ）と同様に、２ステップＰＣＲの場合においても、遊離のＫＯＤ（未固定）では１０コピー以下の鋳型ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを明確に検出できなかったが、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体では１～１００コピーのｃＤＮＡを高感度かつ高精度に検出できた。
【0114】
次に、Ｓ遺伝子全体はＡＲＴＩＣ Ｎｅｔｗｏｒｋの修正版（Ｖ３）プライマーセットによる１４個の増幅断片でカバーされるが（非特許文献２２）、Ｏｍｉｃｒｏｎ変異体の多重変異領域をカバーする３個の増幅断片である「標的領域２－４」を設計した（図２３（ａ）、表２：プライマーセット配列：Ｎｏ．１（配列番号３，４），Ｎｏ．２（配列番号５，６）、Ｎｏ．３（配列番号７，８））。
【0115】
【表2】
【0116】
図２４に、（ａ）遊離のＫＯＤ（未固定）、又、（ｂ）未処理のＳＢＡ５．４（０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いたＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおける１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域２：１２４５塩基対、標的領域３：１６７０塩基対、及び、標的領域４：９９８塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－１を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－１を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
【0117】
図２４（ａ）によれば、「標的領域１」よりも２～３倍長い「標的領域２－４」の増幅断片の場合、遊離のＫＯＤ（未固定）では、１００コピーのＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドであっても非特異的な増幅に起因するスメアリングの傾向が観察され、選択的な増幅ができなかった。これは、反応溶液中の鋳型ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのコピー数が少ないため、プライマー分子が過剰にＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）に結合し、非特異的な増幅反応が生じたためと考えられる。一方、図２４（ｂ）によれば、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を用いると、１０コピーでも選択的増幅が達成された。また、「標的領域２、及び、４」では、１～４コピーでも１／３～２／３の確率で選択的に増幅検出できることが確認された。最も長い「標的領域３」では１～４コピーからの増幅は困難であったため、次に、Ｓ遺伝子特異的プライマー－１の４２８ｎｔ上流に設計したＳ遺伝子特異的プライマー－２（図２３（ａ）、表１、プライマー配列：Ｎｏ．２（配列番号２））を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質とした２ステップＰＣＲ増幅において高感度化の検証を試みた。
【0118】
図２５に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４（０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤを用いたＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおける１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域３：１６７０塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の合成ＲＮＡ（１００、１０、４、１コピー）からＳ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝３）、である。
【0119】
図２５によれば、Ｓ遺伝子特異的プライマー－１の４２８ｎｔ上流に設計したＳ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドでは、最も長い「標的領域３」であっても、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体により４～１００のｃＤＮＡを高感度かつ高精度に検出できた。以上の結果より、コピー数の少ないＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド断片であっても、より長く安定なｃＤＮＡを調製することできれば、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたＰＣＲ法による迅速かつ高感度な増幅が実現可能であることが強く示唆された。
【0120】
（６－３）長鎖ＤＮＡ増幅における高感度化の検証（新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡを対象とした場合）
次いで、前記のＳ遺伝子特異的プライマー－１及び－２を用いて、新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質として、標的領域２の２ステップＰＣＲ増幅（アニーリング温度及び伸長温度：６５℃）を試みた。
次いで、前記のＳ遺伝子特異的プライマー－１及び－２を用いて、新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡから合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質として、標的領域２の２ステップＰＣＲ増幅（アニーリング温度及び伸長温度：６５℃）を試みた。
【0121】
図２６に、遊離のＫＯＤ（未固定）、又、未処理のＳＢＡ５．４（０．５ｍｇ）に固定化したＫＯＤによるＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおける１段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ反応産物（標的領域２：１２４５塩基対）をゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）粒子から抽出した完全長ＲＮＡ（９、３コピー）から、（ａ）Ｓ遺伝子特異的プライマー－１（配列番号１）、及び、（ｂ）Ｓ遺伝子特異的プライマー－２（配列番号２）を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝５）、である。
図は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）粒子から抽出した完全長ＲＮＡ（９、３コピー）から、（ａ）Ｓ遺伝子特異的プライマー－１（配列番号１）、及び、（ｂ）Ｓ遺伝子特異的プライマー－２（配列番号２）を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質としたＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動像、また、表は、対応するＰＣＲ反応産物の濃度及び検出された数（Ｎ＝５）、である。
【0122】
図２６（ａ）によれば、遊離のＫＯＤ（未固定）では、前記（６－２）での検証結果と同様に、９又は３コピーのＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのどちらも非特異的な増幅に起因するスメアリングの傾向が観察され、選択的な増幅ができなかった。一方、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を用いると、９又は３コピーでも選択的増幅が達成され、それぞれ１／５又は１／５の確率で選択的に増幅検出できることが確認された。
【0123】
また、図２６（ｂ）によれば、遊離のＫＯＤ（未固定）では、同様に、９又は３コピーのＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのどちらも非特異的な増幅に起因するスメアリングの傾向が観察され、選択的な増幅ができなかった。一方、ＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体を用いると、９又は３コピーでも選択的増幅が達成され、それぞれ４／５又は２／５の確率で選択的に増幅検出できることが確認された。本実施例におけるＫＯＤ－未処理ＳＢＡ５．４複合体は、前記実施例５（５－３）と同様の方法により、一旦、－３０℃で冷凍保管し、解凍した複合体を使用しており、９コピーの場合は、冷凍保管１日目、又、３コピーの場合は、冷凍保管２日目の複合体を適用した。それにもかかわらず、前記実施例５（５－３）での検証結果と同様に、数分子レベルの極微量の新型コロナウイルスＲＮＡの精確な増幅検出を達成した。
また、前記（６－２）での検証結果と同様に、Ｓ遺伝子特異的プライマー－１の４２８ｎｔ上流に設計したＳ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質とすることで検出確率が増大したことから、新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡにおいても、より長く安定なｃＤＮＡを調製することができれば、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたＰＣＲ法による迅速かつ高感度な増幅が実現可能であることが強く示唆された。
以上より、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたＰＣＲ技術は、より少ないＲＮＡコピー数から１０００塩基以上の長鎖ＰＣＲ増幅を可能にしたことから、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の全ゲノム増幅及び解析に貢献できる可能性が示された。
このことは、変異の早い新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などでオミクロン株のように、脅威となる新しい変異株が出現した場合、変異株試料が少量しか入手できなくても、迅速にゲノムが解析可能となるから、対応するワクチン開発も迅速に対応できることを意味する。
また、前記（６－２）での検証結果と同様に、Ｓ遺伝子特異的プライマー－１の４２８ｎｔ上流に設計したＳ遺伝子特異的プライマー－２を用いて合成したＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを反応基質とすることで検出確率が増大したことから、新型コロナウイルス粒子から抽出した完全長ＲＮＡにおいても、より長く安定なｃＤＮＡを調製することができれば、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたＰＣＲ法による迅速かつ高感度な増幅が実現可能であることが強く示唆された。
以上より、ＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたＰＣＲ技術は、より少ないＲＮＡコピー数から１０００塩基以上の長鎖ＰＣＲ増幅を可能にしたことから、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の全ゲノム増幅及び解析に貢献できる可能性が示された。
このことは、変異の早い新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などでオミクロン株のように、脅威となる新しい変異株が出現した場合、変異株試料が少量しか入手できなくても、迅速にゲノムが解析可能となるから、対応するワクチン開発も迅速に対応できることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【0124】
以上詳述したように、本発明は、極微量ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドの検出可能なＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体に関するものであり、更に詳しくは、上記複合体が反応基質である核酸（ＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド）と相互作用を示し、かつ核酸増幅能を安定に発現できる複合化状態にある構造を有することを特徴とするＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体による、多量の残存ＲＮＡ等の核酸夾雑物に起因する反応阻害や非特異的ＤＮＡ増幅を抑制できるＤＮＡの増幅方法、及び数分子のＲＮＡ及びＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを対象とした極微量核酸の検出方法などを提供することができる。
【0125】
本発明は、より具体的には、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化されたＤＮＡ増幅酵素（ＫＯＤ）を反応基質の核酸（ＲＮＡ、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド及びＤＮＡ）の検出に適用する改良されたＲＴ－ＰＣＲ技術であり、現行のリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法及び２ステップＲＴ－ＰＣＲ法のいずれに対しても高感度かが実現でき、更に、シリカ系ナノ空孔材料表面の疎水性度を高めることで、ＲＴ－ＰＣＲ反応中での副反応を極力抑え、ＲＮＡ検出の感度及び精度を高めることができたものである。その結果、ＲＴ－ＰＣＲ法の高感度化および高精度化により、偽陰性または偽陽性の低減が達成され、迅速で正確なＲＮＡウイルス検体の検出、判定を可能にするものである。
【0126】
更に、本発明は、汎用性が高く、既存の装置や試薬を利用した簡便かつ迅速な検査手法にも適用が可能なため、極微量ＲＮＡウイルスの高感度および高精度での検出法への展開が可能である。また、本発明によるＲＴ－ＰＣＲ試薬キット等の使用により、医療および公衆衛生分野における新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、さらには広くＲＮＡウイルス感染症に対する高感度かつ高精度な検査が可能となり、ＲＮＡウイルスそのものの性質や感染経路を把握する手段となり得る。本発明において対象とするＲＮＡ方法は、典型的には汎用的でかつ最も簡便な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ法）であるが、逆転写等温ＤＮＡ増幅法（ＲＴ－ＬＡＭＰ法）などにも適用可能である。
【0127】
また、本発明のＤＮＡ増幅酵素－シリカ系ナノ空孔材料複合体は、既存の酵素製品よりも冷凍保管時における保存安定性が高く、さらに、ＲＮＡ以外の反応基質（プライマー、ｄＮＴＰｓ等）、逆転写酵素、ＢＳＡなども含ませた状態で保存することができるので、信頼性の高い迅速、簡便なＲＮＡ及びＤＮＡ診断に用いるキット製品等として提供できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】