特開 2024-144382 ダイズ植物、ダイズ植物の判定方法、及びダイズ植物のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024144382

(43)【公開日】2024-10-11

(54)【発明の名称】ダイズ植物、ダイズ植物の判定方法、及びダイズ植物のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20241003BHJP

   A01H 6/54 20180101ALI20241003BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20241003BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20241003BHJP

【ＦＩ】

A01H5/00 A

A01H6/54 ZNA

C12Q1/6827 Z

C12N15/29

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024054455

(22)【出願日】2024-03-28

(31)【優先権主張番号】P 2023055233

(32)【優先日】2023-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(71)【出願人】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100124062

【弁理士】

【氏名又は名称】三上 敬史

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(72)【発明者】

【氏名】姜 昌杰

(72)【発明者】

【氏名】小林 光智衣

(72)【発明者】

【氏名】前田 哲

(72)【発明者】

【氏名】石本 政男

(72)【発明者】

【氏名】加賀 秋人

(72)【発明者】

【氏名】平賀 勧

(72)【発明者】

【氏名】李 鋒

(72)【発明者】

【氏名】大和 誠司

(72)【発明者】

【氏名】岩橋 福松

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA06

4B063QA17

4B063QQ02

4B063QQ43

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】本発明は、これまで知られている抵抗性遺伝子を導入することなく、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物を提供することを目的とする。また、本発明は、これまで知られている抵抗性遺伝子を導入することなく、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法、及びダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法も提供することを目的とする。
【解決手段】ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であり、前記ダイズ植物が、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含み、前記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、ダイズ植物。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であり、
前記ダイズ植物が、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含み、
前記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、ダイズ植物。

【請求項2】

ステアリン酸からオレイン酸を生成する機能が低下している、請求項１に記載のダイズ植物。

【請求項3】

前記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアルギニン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に置換される変異を含む、請求項１に記載のダイズ植物。

【請求項4】

ＳＳＩ２Ｂ遺伝子変異を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載のダイズ植物。

【請求項5】

ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法であり、
ダイズ植物が、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有している場合に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であると判定することを含み、
前記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、判定方法。

【請求項6】

前記ダイズ植物の、ステアリン酸からオレイン酸を生成する機能が、低下している、請求項５に記載の判定方法。

【請求項7】

前記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアルギニン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に置換される変異を含む、請求項５に記載の判定方法。

【請求項8】

請求項５～７のいずれかのいずれか一項に記載の判定方法により、ダイズさび病に対する抵抗性を示すダイズ植物をスクリーニングすることを含む、ダイズ植物の作出方法。

【請求項9】

ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法であり、前記方法が、
ダイズ植物に対して、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含むダイズ植物を選別する選別工程を備え、
前記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ダイズ植物、ダイズ植物の判定方法、及びダイズ植物のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ダイズさび病は南北アメリカ大陸で蔓延しているダイズ植物の最重要病害である。現在、主にダイズ植物に殺菌剤を散布する方法によってダイズさび病の防除が行われている。また、抵抗性ダイズ系統が有するダイズさび病に対する抵抗性遺伝子を、ダイズ植物へ導入することによる抵抗性品種の開発も進められている（例えば、非特許文献１及び２）。一方、殺菌剤はコストが高いうえに殺菌剤抵抗性菌株が出現する。現在知られている抵抗性遺伝子は、さび病菌レースに特異的なものであり打破菌株が出現するため、多様なさび病菌レースに対応することができない。

【0003】

ダイズ植物には、オレイン酸（１８：１）の合成を触媒するステアロイル－アシルキャリア蛋白質－デサチュラーゼ（ＳＡＣＰＤ）をコードする遺伝子が存在しており、ＳＡＣＰＤ－Ａ、ＳＡＣＰＤ－Ｂ、ＳＡＣＰＤ－Ｃ、ＳＡＣＰＤ－Ｄ、ＳＡＣＰＤ－Ｅの５つのＳＡＣＰＤファミリー遺伝子が同定されている（例えば、非特許文献３及び４）。中でもＳＡＣＰＤ－Ａ、ＳＡＣＰＤ－ＢはそれぞれＳＳＩ２Ａ、ＳＳＩ２Ｂとも称されており、非常に相同性が高い。ダイズ植物において、ＳＡＣＰＤ－Ａ、及びＳＡＣＰＤ－Ｂ遺伝子の発現量が低減すると、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｇｌｙｃｉｎｅａが病原菌であるダイズ斑点細菌病、及びＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅが病原菌である茎疫病に対して抵抗性を示すようになることは知られている（例えば、非特許文献３）。しかしながら、これまで知られている抵抗性遺伝子以外の遺伝子が関与して、ダイズさび病に対する抵抗性が付与されることは具体的に明らかにされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Godoyet al., “Asian soybean rust in Brazil: past, present,and future”, Pesqui. Agropec. Bras., 2016;51:407-421.

【非特許文献2】Yamanakaet al., “Soybean Breeding Materials Useful forResistance to Soybean Rust in Brazil”, JARQ45(4)385-395(2011).

【非特許文献3】Kachrooet al., “An Oleic Acid-Mediated Pathway Induces Constitutive Defense Signaling and Enhanced Resistance to Multiple Pathogens inSoybean”, Molecular Plant-Microbe Interactions, vol.21,no.5, 2008, 564-575.

【非特許文献4】NaoufalLakhssassi et al, “Soybean TILLING-by-Sequencing+reveals the role of novel GmSACPD members in unsaturated fatty acidbiosynthesis while maintaining healthy nodules”,Journal of Experimental Botany, Volume 71,Issue 22, 31 December 2020, Pages6969-6987

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、これまで知られている抵抗性遺伝子を導入することなく、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物を提供することを目的とする。また、本発明は、これまで知られている抵抗性遺伝子を導入することなく、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法、及びダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法も提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、鋭意研究の結果、ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有するダイズ植物は、ダイズさび病に対して抵抗性を示すことを見出し、本発明の完成に至った。

【0007】

すなわち、本発明は、例えば以下の発明に関する。
［１］
ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であり、
上記ダイズ植物が、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含み、
上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、ダイズ植物。
［２］
ステアリン酸からオレイン酸を生成する機能が低下している、［１］に記載のダイズ植物。
［３］
上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアルギニン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に置換される変異を含む、［１］又は［２］に記載のダイズ植物。
［４］
ＳＳＩ２Ｂ遺伝子変異を含まない、［１］～［３］のいずれかに記載のダイズ植物。
［５］
ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法であり、
ダイズ植物が、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有している場合に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であると判定することを含み、
上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、判定方法。
［６］
上記ダイズ植物の、ステアリン酸からオレイン酸を生成する機能が、低下している、［５］に記載の判定方法。
［７］
上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアルギニン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に置換される変異を含む、［５］又は［６］に記載の判定方法。
［８］
［５］～［７］に記載の判定方法により、ダイズさび病に対する抵抗性を示すダイズ植物をスクリーニングすることを含む、ダイズ植物の作出方法。
［９］
ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法であり、上記方法が、
ダイズ植物に対して、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含むダイズ植物を選別する選別工程を備え、
上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である、スクリーニング方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、これまで知られている抵抗性遺伝子を導入することなく、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物を提供することができる。また、本発明によれば、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法、及びダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法も提供することができる。

【0009】

また、非特許文献３に記載されているように、ＳＳＩ２Ａ遺伝子等を含むＳＳＩ２遺伝子の変異はサリチル酸が関与して広範囲な抵抗反応を誘導することが知られている。そのため、本発明によれば、ダイズさび病菌レースに特異的なダイズさび病に対する抵抗性遺伝子を導入しないため、打破菌株が出現しにくいと考えられ、また、多様なダイズさび病菌レースの防除が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施例１において、第２１５番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換されている変異をホモ型に有するダイズ植物（ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物）について、ダイズさび病に対する抵抗性の評価（病斑面積の計測）と遺伝子型の解析を行った結果を示すグラフである。

【図2】実施例１において、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異を有する（ダイズさび病に対して抵抗性を示す）ダイズ植物（ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物）の葉（Ｂ）とＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有しない（ダイズさび病に対して抵抗性を示さない）ダイズ植物の葉（Ａ）を比較した画像である。

【図3】実施例２において、ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物について、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現量を解析した結果を示すグラフである。

【図4】実施例３において、ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物の葉のステアリン酸の蓄積量（Ａ）、及び当該ダイズ植物の葉のオレイン酸の蓄積量（Ｂ）を示すグラフである。

【図5】実施例４において、第１８６番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換されている変異をホモ型に有するダイズ植物（ＳＳＩ２Ａ Ｇ１８６Ｄ変異ホモ型のダイズ植物）について、ダイズさび病に対する抵抗性の評価（病斑面積の計測）と遺伝子型の解析を行った結果を示すグラフである。

【図6】実施例５において、Ａｌｐｈａ－Ｆｏｌｄ２により、ダイズのＳＳＩ２Ａの立体構造予測をした結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。

【0012】

〔ダイズ植物〕
本実施形態に係るダイズ植物は、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含む。上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である。本実施形態に係るダイズ植物は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させるホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含むため、ダイズさび病に対して抵抗性を示す。

【0013】

ダイズ植物とは、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （Ｌ．） Ｍｅｒｒ．）を意味する。本明細書において、「植物」は、特段の限定がない限り、植物全体、植物細胞、植物プロトプラスト、植物カルス、又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、配偶子、種子、葉、花、枝、果実、茎、根、葯等を含む。

【0014】

ダイズさび病は、感染すると葉に１ｍｍ程度の多数の病斑をつくり、落葉を早め、子実の形成不全に至らしめる。ダイズさび病の病原菌は、ファコプソラ・パチリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）という担子菌門に属する糸状菌である。

【0015】

本明細書において、ＳＳＩ２Ａ（Ｇｌｙｍａ．０７Ｇ２０７２００）は、エンレイ品種ダイズ植物のステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼ－Ａ（ＳＡＣＰＤ－Ａ）を意味する。エンレイ品種ダイズ植物のＳＳＩ２Ａタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。

【0016】

本明細書において、「遺伝子」とは、細胞中でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含む、ＤＮＡ領域を意味する。すなわち、遺伝子とは転写領域のみならず転写領域の上流又は下流に存在する調節領域、及び非翻訳領域（５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ）も含むものであってもよく、転写領域のみからなるものであってもよい。転写領域は、エキソンのみならず、イントロンを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であってもよく、いわゆるｃＤＮＡであってもよい。ＳＳＩ２Ａ遺伝子のｃＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡ（Ｇｌｙｍａ．０７Ｇ２０７２００）が挙げられ、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の具体例としては、例えば、配列番号８で示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。

【0017】

調節領域としては、例えば、転写調節領域であってもよく、翻訳調節領域であってもよい。転写調節領域としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等が挙げられる。翻訳調節領域としては、例えば、リボソーム結合領域等が挙げられる。

【0018】

ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物は、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異（以下、単に「ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異」）を含み、すなわち、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物において、ホモ型の変異ＳＳＩ２Ａ遺伝子を含む。ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異（すなわち、ホモ型の変異ＳＳＩ２Ａ遺伝子における変異）は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させるホモ型の変異であればよい。発現産物とは、ＳＳＩ２Ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡであってもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡによって翻訳されるタンパク質（すなわち、該ＳＳＩ２Ａ遺伝子のコードするタンパク質）であってもよい。

【0019】

ここで、本明細書において「変異」とは、ＳＳＩ２Ａ遺伝子における変異であって、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異を意味する。ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物におけるＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異は、例えばＳＳＩ２Ａ遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質が、野生型のダイズ植物における野生型ＳＳＩ２Ａ遺伝子又はそれによってコードされる野生型ＳＳＩ２Ａタンパク質（すなわち、ステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼ－Ａ）と少なくとも１塩基又は１アミノ酸残基において異なっていることを意味する。また、変異は塩基又はアミノ酸残基の置換、挿入、付加及び／又は欠失であってもよい。

【0020】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能が低下されることとは、野生型のダイズ植物と比較して発現産物の量又は機能を低下させることであってもよく、例えば、野生型のダイズ植物と比較して、（１）発現産物の機能が同じであるか増強するが、発現産物の量が低下すること；（２）発現産物の量が同じであるか増強するが、発現産物の機能が低下すること；（３）発現産物の機能も量も低下すること、が挙げられる。ここで、（１）の場合は、発現産物の機能が同じであるが、発現産物の量が低下することが好ましく、（２）の場合は、発現産物の量が同じであるが、発現産物の機能が低下することが好ましい。ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能の低下は、特に限定されないが、例えば、野生型のダイズ植物と比較して、発現産物の量又は機能が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上の低下であってよく、また、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下の低下、９５％以下の低下、１００％以下の低下であってもよい。

【0021】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量は、ｍＲＮＡ又はタンパク質の量であってよく、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、及びウエスタンブロッティング等によって、当業者に公知の方法で測定することができる。

【0022】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の機能は、タンパク質の機能であってよく、特にオレイン酸（１８：１）の合成を触媒する機能であってよい。ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の機能は、例えば、ステアリン酸（１８：０）からオレイン酸（１８：１）を生成する機能を測定することで解析することができ、例えば、本実施形態に係るダイズ植物（例えば、葉）に含まれるステアリン酸（１８：０）及び／又はオレイン酸（１８：１）の蓄積をガスクロマトグラフィー質量分析計によって測定することで解析できる。

【0023】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子上に存在していればよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の調節領域上であってもよく、転写領域上であってもよく、非翻訳領域上であってもよく、調節領域、転写領域、及び非翻訳領域から選択される２以上の領域に存在してもよい。本実施形態に係るダイズ植物において、変異がＳＳＩ２Ａ遺伝子の調節領域のみに存在する場合、該ダイズ植物が野生型のダイズ植物に比較して、発現産物の量が低下していてよく、変異がＳＳＩ２Ａ遺伝子の転写領域のみに存在する場合、該ダイズ植物が野生型のダイズ植物におけるに比較して、発現産物の機能が低下していてよい。調節領域、転写領域、非翻訳領域については上述のものが挙げられる。

【0024】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異であれば特に限定されず、目的によって当業者が適宜に行うことができる。例えば、ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が転写領域（ＯＲＦ又はｃＤＮＡ）上にある場合、１塩基以上、２塩基以上、３塩基以上、４塩基以上、５塩基以上、１～３塩基、１～５塩基、又は２～３塩基の置換、挿入及び／又は付加であってよい。転写領域の一部又は全部の欠失、例えば、１～３塩基、１～１０塩基、１０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上、５００塩基以上、１０００塩基以上の欠失であってもよい。また、ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、例えば、１２０９塩基以下、１０００塩基以下、５００塩基以下、１００塩基以下、５０塩基以下、１０塩基以下、５塩基以下の置換、挿入、付加及び／又は欠失であってもよい。

【0025】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、２塩基以上の変異である場合、連続した塩基が変異していてもよく、不連続な塩基が変異していてもよく、これらの組み合わせであってもよい。ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が連続した塩基の欠失である場合、転写領域、調節領域、及び／又は非翻訳領域等の全部又は一部が欠失する変異であってもよい。より具体的には、例えば、ＳＳＩ２Ａ遺伝子におけるプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リボソーム結合領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はＯＲＦのエキソン若しくはイントロンの欠失であってもよい。また、ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異が連続した塩基の変異である場合、ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子のコードする発現産物（タンパク質）のＮ末端側からであってもＣ末端側からであってもよい。

【0026】

ＳＳＩ２（ＳＡＣＰＤ）ファミリー遺伝子は、その活性を発揮するために２つの鉄イオンの配位が必要であることが知られている（Naoufal Lakhssassi, et al., Plant Physiology, Volume 174, Issue 3,July 2017, 1531-1543.）。そのため、ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）における鉄イオンの配位に関与する領域に存在するアミノ酸残基の変異を含んでいてもよい。この場合、当該変異によって鉄イオンの配位ができなくするか、鉄イオンの配位がしにくくする変異であることが好ましい。例えば、鉄イオンの配位に関与する領域のアミノ酸残基の置換、挿入、付加及び／又は欠失であってよく、置換の場合は、非保存的置換であってよい。「非保存的置換」とは、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とで化学的性質（例えば、疎水性、親水性、イオン電荷、極性、非極性、酸性、及び塩基性等）が異なるアミノ酸置換変異を意味する。

【0027】

ダイズＳＡＣＰＤ－Ｃでは、鉄イオンの配位子及び架橋配位子が予測されている（Naoufal Lakhssassi, et al., Plant Physiology, Volume 174, Issue 3,July 2017, 1531-1543.）。図６は、ダイズＳＡＣＰＤ－Ｃのアミノ酸配列及び立体構造に基づき推定される、ＳＳＩ２Ａにおける鉄イオンの配位に関与する領域を示す。したがって、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列における鉄イオンの配位に関与するアミノ酸残基は、ダイズＳＡＣＰＤ－Ｃをもとに予測されている、鉄イオンの配位子が第１４４番目、１８５番目、２３５番目及び２７１番目のアミノ酸残基であり、架橋配位子は、１８２番目及び２６８番目のアミノ酸残基である。そのため、ＳＳＩ２Ａ遺伝子において、上記のアミノ酸残基又はその近傍のアミノ酸残基に変異が生じると、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の機能が低下すると考えられる。

【0028】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）の第１４４番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基、第１８５番目のヒスチジン残基に相当するアミノ酸残基、第２３５番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基、第２７１番目のヒスチジン残基に相当するアミノ酸残基、第１８２番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基、第２６８番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基、第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基、及び第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基の変異を含んでいてもよく、例えば、上記１つ以上のアミノ酸残基の非保存的置換であってよい。ここで、「配列番号１の第１４４番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基」とは、対象のタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１で示されるアミノ酸配列に対してアライメントを行う際に、配列番号１の第１４４番目のグリシン残基の位置に対応する位置にある、対象タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を意味する。他のアミノ酸残基と同様である。

【0029】

グルタミン酸残基の非保存的置換としては例えば、リシン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、プロリン残基、グリシン残基、アラニン残基、又はセリン残基への置換が挙げられる。ヒスチジン残基の非保存的置換としては、例えば、フェニルアラニン残基、バリン残基、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、又はリシン残基への置換が挙げられる。グリシン残基の非保存的置換としては、例えば、フェニルアラニン残基、プロリン残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残残基、リシン残基、アルギニン残基、又はセリン残基への置換が挙げられる。

【0030】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が、アルギニン残基に置換される変異を含んでいてもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が、アルギニン残基に置換される変異であってもよい。ここで、「配列番号１の第２１５番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基」とは、対象のタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１で示されるアミノ酸配列に対してアライメントを行う際に、配列番号１の第２１５番目のグリシン残基の位置に対応する位置にある、対象タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を意味する。

【0031】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）の第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基に置換される変異を含んでいてもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）の第１８６番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が、アスパラギン酸残基に置換される変異であってもよい。

【0032】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含むことは、例えば、後述の実施例に示す方法により解析することができる。より具体的には、ダイズ植物から常法に従ってＤＮＡを抽出し、ＤＮＡシーケンス解析を実施する方法等が挙げられる。

【0033】

本実施形態に係るダイズ植物は、ＳＳＩ２Ｂ遺伝子変異を含まないものであってもよい。

【0034】

本明細書において、ＳＳＩ２Ｂ（Ｇｌｙｍａ．０２Ｇ１３８１００）は、エンレイ品種ダイズ植物のステアロイル－アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼ－Ｂ（ＳＡＣＰＤ－Ｂ）を意味する。エンレイ品種ダイズ植物のＳＳＩ２Ｂタンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。

【0035】

「ＳＳＩ２Ｂ遺伝子に変異を含まない」とは、野生型のダイズ植物とＳＳＩ２Ｂ遺伝子の塩基配列が同一である、又はＳＳＩ２Ｂ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が同一であることを意味する。ＳＳＩ２Ｂ遺伝子変異を含まないことの解析は、上述のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含むことの解析と同様の方法で実施することができる。

【0036】

ＳＳＩ２Ｂ遺伝子のｃＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号４で示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられ、ＳＳＩ２Ｂ遺伝子の具体例としては、例えば、配列番号９で示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。

【0037】

上述のとおり、ＳＳＩ２Ａ遺伝子及びＳＳＩ２Ｂ遺伝子の発現量が低下することで、ダイズ植物が特定の病原菌に対して抵抗性を示すようになることは知られている。しかしながら、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能が低下する変異のみでダイズさび病菌に対して抵抗性を示すことは知られていない。本実施形態に係るダイズ植物が、ＳＳＩ２Ｂ遺伝子変異を含まない場合、本発明による効果がより顕著に発揮される。また、本実施形態に係るダイズ植物が、上記ＳＳＩ２Ｂ遺伝子変異を含まないものである場合、ＳＳＩ２Ａ遺伝子及びＳＳＩ２Ｂ遺伝子の両方の発現産物の量又は機能が低下する変異を含むダイズ植物と比較して、生育阻害が低減される。

【0038】

ダイズ植物がダイズさび病に対して抵抗性を示すことは、当業者が通常用いる方法にて判定することができ、例えば、後述の実施例に記載の方法にて判定することができる。より具体的には、ダイズ植物を人工的にダイズさび病菌に感染させ、同様にダイズさび病菌を感染させた罹病性のダイズ植物と比較して、病斑面積が小さくなれば抵抗性を有し、病斑面積が同等であれば抵抗性を有さない（罹病性である）と判定する方法が挙げられる。

【0039】

ダイズ植物がダイズさび病に対して抵抗性を示すことは、ダイズさび病の病斑面積が０％以上５０％未満である場合に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すと判断してもよい。ダイズ植物がダイズさび病に対して抵抗性を示すことは、ダイズさび病の病斑面積が、４０％以下、３０％以下、又は２０％以下である場合にダイズさび病に対して抵抗性を示すと判断してもよい。

【0040】

〔ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法〕
本実施形態に係るダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法（以下、「本実施形態に係る判定方法」ともいう。）は、ダイズ植物が、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有している場合に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であると判定することを含む。上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である。ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異については、上述のとおりである。

【0041】

本実施形態に係る判定方法は、本実施形態に係るダイズ植物はダイズさび病に対して抵抗性を示すため、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させるホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含む場合に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズであると判定できる。

【0042】

本実施形態に係る判定方法において、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であると判定する場合は、例えば、ダイズ植物を人工的にダイズさび病菌に感染させた際に、ダイズさび病の病斑面積が０％以上５０％未満である場合であってもよい。ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物であると判定することは、ダイズ植物を人工的にダイズさび病菌に感染させた際に、ダイズさび病の病斑面積が、４０％以下、３０％以下、又は２０％以下である場合であってもよい。

【0043】

本実施形態に係る判定方法は、判定することの前に、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有していることを決定することを更に含んでいてもよい。ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有していることを決定することは、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の遺伝子型を決定することであってもよい。ＳＳＩ２Ａ遺伝子の遺伝子型の決定は、公知の方法で行うことができ、例えば、シークエンス解析を用いる方法、制限酵素認識配列の有無による方法、ＤＮＡプローブを用いた方法等により行うことができる。

【0044】

〔ダイズ植物の作出方法〕
上述のとおり、本実施形態に係る判定方法は、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物を判定することができる。よって、本実施形態に係る判定方法により、ダイズさび病に対する抵抗性を示すダイズ植物をスクリーニングすることを含む、ダイズ植物の作出方法とすることもできる。本実施形態に係るダイズ植物の作出方法は、上記本実施形態に係る判定方法を限定なく適用することができる。

【0045】

本実施形態に係る作出方法におけるスクリーニングは、上述のダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の判定方法による判定結果に基づいて行う。本実施形態に係る判定方法におけるスクリーニングの対象としては、ダイズ植物であれば特に限定されないが、例えば、ランダムに変異が導入されたダイズ植物の変異体ライブラリーであってもよい。変異体ライブラリーの具体例としては、例えば、Ｔｓｕｄａ等によって作製された変異体ライブラリーであってもよい（“Construction of a high-density mutant library in soybean anddevelopment of a mutant retrieval method using amplicon sequencing”, BMC Genomics 16, 1014 (2015)）。

【0046】

本実施形態に係る作出方法におけるスクリーニングは、１回のみ行ってもよく、複数回行ってもよい。複数回とは、特に限定されないが、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、１０回以上、５０回以上、１００回以上であってもよい。

【0047】

本実施形態に係る作出方法におけるスクリーニングは、複数回行われる場合、本実施形態に係る判定方法によりダイズさび病に対する抵抗性を示すダイズ植物をスクリーニングすること以外に、その他の形質を示すダイズ植物をスクリーニングすることを含んでいてもよい。その他の形質としては例えば、害虫耐性形質、ストレス耐性形質、生育阻害を受けない形質、生育阻害を受ける形質、葉に細胞死・黄化等形態変化を示す形質等が挙げられる。

【0048】

本実施形態に係る作出方法は、ダイズさび病に対して抵抗性を示すと判定されたダイズ植物を選別することを含んでいてもよい。

【0049】

本実施形態に係る作出方法は、交配させることを含んでいてもよい。本実施形態に係る作出方法が、交配させることを含むことにより、より優れた形質を有するダイズ植物を得ることができる。

【0050】

交配させることは、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をホモ型に有するダイズ植物とＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をホモ型に有するダイズ植物を交配させることを含んでいてもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をヘテロ型に有するダイズ植物とＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をヘテロ型に有するダイズ植物を交配させることを含んでいてもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をホモ型に有するダイズ植物とＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をヘテロ型に有するダイズ植物を交配させることを含んでいてもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異を有していないダイズ植物とＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をヘテロ型に有するダイズ植物を交配させることを含んでいてもよく、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異を有していないダイズ植物とＳＳＩ２Ａ遺伝子の変異をホモ型に有するダイズ植物を交配させることを含んでいてもよい。

【0051】

本実施形態に係る作出方法が交配させることを含む場合、交配させたものを更に交配させてもよく、ダイズさび病に対して抵抗性を示すと判定されたダイズ植物を選抜し、更に交配させてもよい。

【0052】

本実施形態に係る作出方法は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有していないダイズ植物に対して、変異を導入することを含んでいてもよい。導入する変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を導入してもよく、ダイズ植物に対してランダムな変異を導入してもよい。

【0053】

ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を導入する場合、特に限定されないが、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いる方法等が挙げられる。

【0054】

ダイズ植物に対してランダムな変異を導入する場合、ダイズ植物に対してランダムな変異を誘導できればよく、物理的な処理であっても、化学的な処理であっても、これらを組み合わせた処理であってもよい。物理的な処理としては、例えば、Ｘ線処理、γ線処理等が挙げられる。化学的な処理としては、例えば、ダイズ植物に変異導入物質を接触させることであってもよく、ダイズ植物を変異導入物質に浸漬することであってもよく、ダイズ植物に変異導入物質を散布又は塗布することであってもよい。変異導入物質としては、特に限定されないが、例えば、ＥＭＳ（メチルメタンスルホネート）、ＤＥＢ（ジエポキシブタン）等が挙げられる。

【0055】

本実施形態に係る作出方法が、変異体を導入する工程を含まない場合、あらかじめ作製されたダイズ植物の変異体ライブラリーをスクリーニングの対象として用いてもよい。ダイズ植物の変異体ライブラリーの具体例としては例えば、上述のものが挙げられる。

【0056】

〔ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法〕
本実施形態に係るダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング方法（以下、「本実施形態に係るスクリーニング方法」ともいう。）は、ダイズ植物に対して、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を含むダイズ植物を選別する選別工程を備える。上記ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させる変異である。ＳＳＩ２Ａ遺伝子変異については、上述のとおりである。

【0057】

選別工程は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させるホモ型の変異を有するダイズ植物を選別する。選別工程は、ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有していることを決定することを更に含んでいてもよい。ホモ型のＳＳＩ２Ａ遺伝子変異を有していることを決定することは、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の遺伝子型を決定することであってもよい。ＳＳＩ２Ａ遺伝子の遺伝子型を決定する方法は上述のとおりである。

【0058】

スクリーニングの対象は、ダイズ植物であれば特に限定されないが、例えば、ダイズ植物の変異体ライブラリーであってもよい。ダイズ植物の変異体ライブラリーは、例えば、Ｔｓｕｄａ等により作製された変異体ライブラリー等を用いてもよく、後述の変異誘導工程により変異体ライブラリーを作製したものを用いてもよい。また、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量又は機能を低下させるホモ型の変異を有するダイズ植物を選別すること以外のその他の形質を示すダイズ植物を選別した後の変異体ライブラリーであってもよい。その他の形質としては、上述のものが挙げられる。

【0059】

選別工程は、１回のみ行ってもよく、複数回行ってもよい。複数回とは、特に限定されないが、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、１０回以上、５０回以上、１００回以上であってもよい。

【0060】

本実施形態に係るスクリーニング方法は、選別工程の前にダイズ植物に対してランダムな変異を誘導する変異誘導工程を更に含んでいてもよい。

【0061】

変異誘導工程は、ダイズ植物に対してランダムな変異を誘導できればよく、物理的な処理であっても、化学的な処理であっても、これらを組み合わせた処理であってもよい。物理的な処理、及び化学的な処理としては、上述のとおりである。

【実施例0062】

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0063】

［実施例１：ダイズさび病に対する抵抗性の評価（１）］
＜１．ダイズ植物の突然変異体ライブラリー＞
ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物の選抜には、Ｔｓｕｄａ等により作出された変異体ライブラリーを用いた。ダイズ植物の変異体ライブラリーは、より具体的には、エンレイ品種ダイズ植物の種子に対して０．３５％ＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）による変異原処理を施してＭ１ダイズ植物を得たのち、Ｍ１ダイズ植物から得られたＭ２種子に、再度０．３５％ＥＭＳにて変異原処理を施したものである。

【0064】

＜２．ダイズ植物の栽培＞
上記１．で説明した突然変異体ライブラリーのうち、４０個の種子をランダムに抽出した。抽出した４０個の乾燥種子を加湿低温条件（１００％、４℃、２日）で調湿した後、セルトレイに播種した。播種した種子を、２７℃、１２時間日長（赤色ＬＥＤ）条件で１６日間栽培し、第一本葉をダイズさび病菌の接種に供試した。

【0065】

＜３．ダイズさび病菌に対して抵抗性を示すダイズ植物のスクリーニング＞
ダイズさび病菌は、兵庫県伊丹市でクズから採取された菌株を使用した。上記２．で得たそれぞれの第一本葉に対して、０．０１％ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ７７（バイオメディカルサイエンス社製）を加えた滅菌水に懸濁した胞子（１×１０^５胞子／ｍｌ）を噴霧してダイズさび病菌を接種し、接種した第一本葉を、２２～２３℃、湿度１００％、１２時間日長（蛍光灯）の条件下で３週間静置した。ダイズさび病菌を接種してから３週間後のダイズ植物の第一本葉上に形成された胞子を回収し、当該胞子を０．０１％ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ７７を加えた滅菌水に懸濁した。縦２５ｃｍ、幅３６ｃｍ、高さ５ｃｍのプラスチックボックスに湿らせたキッチンペーパーを敷き、ダイズ植物の小葉を切り取り、その葉裏を上面にして並べた。１×１０^５胞子／ｍｌに調整した胞子懸濁液を１ボックスあたり５ｍｌずつ噴霧し、プラスチック蓋で密閉して２２～２３℃、１２時間日長（蛍光灯）条件で１５日間静置した。接種してから１５日後に葉裏に形成された病斑面積を計測することにより、ダイズさび病に対する抵抗性を評価した。また、上記評価に供したダイズ植物の遺伝子型を解析した。遺伝子型解析と抵抗性評価（病斑面積の計測）の結果を図１に、評価に供した抵抗性を示すダイズ植物の葉と抵抗性を示さないダイズ植物の葉を比較した画像を図２に示す。

【0066】

図１の横軸は、ダイズさび病に対する抵抗性の評価において、評価に供した葉全体の面積に対する、病斑面積を示す。病斑面積が５０％未満であるダイズ植物を、ダイズさび病に対して抵抗性を示すダイズ植物として評価した。

【0067】

また、ダイズ植物の遺伝子型を以下の手順で解析した。ダイズ植物の葉１００ｍｇを液体窒素中で粉砕し、ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。ＳＳＩ２Ａのゲノム領域をＳＳＩ２Ａ－ＦプライマーとＳＳＩ２Ａ－Ｒプライマーにより増幅し、ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）処理により未反応のプライマーとｄＮＴＰを除去した後、Ｓｅｑ－Ｆ４プライマーを用いてサンガーシーケンスにより遺伝子型を解析した。それぞれのプライマーは下記表１に示す。

【0068】

【表1】

【0069】

図１に示すとおり、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物（タンパク質）において、第２１５番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換されている変異をホモ型に有するダイズ植物（以下、ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物と記す。）は、病斑面積が５０％未満であり、ダイズさび病に対して抵抗性を示すことが確認された（図１中、「ホモ型」）。ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物（タンパク質）において、第２１５番目のグリシン残基がアルギニン残基に置換されている変異をヘテロ型に有するダイズ植物（図１中、「ヘテロ型」）、又はＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有しないダイズ植物、すなわちＳＳＩ２Ａ遺伝子には変異を有しないが、その他の遺伝子変異を有するエンレイ品種ダイズ植物由来のダイズ植物（図１中、「エンレイ型」）は、病斑面積が５０％以上であり、ダイズさび病に対して罹患性を示すことが確認された。

【0070】

また、図２に示すとおり、ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物の葉（図２（Ｂ））は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物（タンパク質）において、ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有しないダイズ植物の葉（図２（Ａ））と比較してダイズさび病の病斑が少なく、病斑面積が小さいことが確認された。

【0071】

［実施例２：ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型のダイズ植物におけるＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現解析］
実施例１にて作出したＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物において、以下の手順で、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現量を解析した。

【0072】

ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物の乾燥種子を、加湿低温条件（１００％、４℃、２日）で調湿した後、セルトレイに播種した。播種した種子を、２７℃、１２時間日長（赤色ＬＥＤ）条件で１６日間栽培し、第一本葉をＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現量の解析に供試した。１００ｍｇの葉を液体窒素中で破砕し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ（タカラバイオ製）を用いて、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ（４００ｎｇ）からＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡製）を用いてｃＤＮＡを合成し、下記表２に示すＳＳＩ２Ａプライマー、及びダイズアクチンプライマーを用いてＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩＩシステム（タカラバイオ）でＣｔ値を算出した。ダイズアクチンをリファレンスとした比較Ｃｔ法によりＳＳＩ２Ａの遺伝子発現量を定量した。結果を図３に示す。

【0073】

【表2】

【0074】

図３に示すとおり、ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物の葉（ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型）におけるＳＳＩ２Ａの遺伝子発現量は、ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有しないダイズ植物、すなわちＳＳＩ２Ａ遺伝子には変異を有しないが、その他の遺伝子変異を有するエンレイ品種ダイズ植物由来のダイズ植物（エンレイ型）及び野生型エンレイ品種ダイズ植物（エンレイ）と比較して有意差は認められなかった。

【0075】

［実施例３：ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型のダイズ植物における脂肪酸量の解析］
ＳＳＩ２Ａは脂肪酸不飽和化酵素であり、ステアリン酸（１８：０）からオレイン酸（１８：１）を生成する反応を触媒する。ＳＳＩ２Ａの遺伝子発現抑制により機能を欠損したダイズ植物では、ステアリン酸の蓄積量が増加する一方でオレイン酸の蓄積量が減少する（非特許文献３）ことが知られている。実施例１にて作出したＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物において、以下の手順で、当該ダイズ植物の葉に蓄積された脂肪酸量を解析した。

【0076】

ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物の乾燥種子を、加湿低温条件（１００％、４℃、２日）で調湿した後、セルトレイに播種した。播種した種子を、２７℃、１２時間日長（赤色ＬＥＤ）条件で１６日間栽培し、第一本葉を脂肪酸量の解析に供試した。ダイズ本葉を液体窒素中で冷凍及び破砕を行った。液体窒素が揮発したのちに、破砕されたダイズ本葉に対して、内部標準物質としてヘプタデカン酸メチルを添加したクロロホルム、メタノール、水の混合溶液を加え、Ｂｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒ法に従って脂質を含むクロロホルム層を回収した。その後、減圧乾燥装置を用いて有機溶媒を留去し、脂質画分を濃縮した。この方法にて、ＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ホモ型のダイズ植物（ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型）、ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有しないダイズ植物、すなわちＳＳＩ２Ａ遺伝子には変異を有しないが、その他の遺伝子変異を有するエンレイ品種ダイズ植物由来のダイズ植物（エンレイ型）、及び野生型エンレイ品種ダイズ植物（エンレイ）の葉において脂肪酸を定量した。

【0077】

濃縮された画分は、脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク製）を使用してメチルエステル化し、メチルエステル化された試料をガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）により分析した。具体的には、Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ガスクロマトグラフィーとＡｇｉｌｅｎｔ ５９７５Ｃ 質量選択検出器を組み合わせたシステムを使用し、ＤＢ－５ＭＳカラム（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を用いた。分析にはヘリウムガス（流速１ｍＬ／分）をキャリアガスとして使用し、メチルエステル化された試料１μＬをスプリット比２０：１で注入した。ＧＣオーブンの温度プログラムは、１２０℃から２４０℃まで４０分間にわたり昇温させた。分析データはＡｇｉｌｅｎｔ ＭＳＤ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアによって処理し、測定成分のピーク面積を基に内部標準法を適用して試料中の脂肪酸の定量を行った。結果を図４に示す。

【0078】

図４に示すとおり、ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型（図４中、「Ｇ２１５Ｒ」）ではエンレイ型（図４中、「Ｇ２１５」）及びエンレイ（図４中、「ＷＴ」）と比較して、ステアリン酸の蓄積量が５％水準で有意に増加した（図４（Ａ））。ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型（図４中、「Ｇ２１５Ｒ」）、エンレイ型（図４中、「Ｇ２１５」）、及びエンレイ（図４中、「ＷＴ」）間で、オレイン酸の蓄積量に有意差はなかったものの、ＳＳＩ２Ａ変異ホモ型（図４中、「Ｇ２１５Ｒ」）ではオレイン酸の蓄積量が減少する傾向が認められた（図４（Ｂ））。以上から、Ｇ２１５Ｒの変異はＳＳＩ２Ａの機能を欠損する変異であると考えられる。

【0079】

［実施例４：ダイズさび病に対する抵抗性の評価（２）］
実施例１と同様の方法で、ダイズさび病に対する抵抗性を評価し、上記評価に供したダイズ植物の遺伝子型を解析した。

【0080】

ダイズさび病に対する抵抗性の評価及びダイズ植物の遺伝子型の解析の結果、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物（タンパク質）において、第１８６番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換されている変異をホモ型に有するダイズ植物（以下、ＳＳＩ２Ａ Ｇ１８６Ｄ変異ホモ型のダイズ植物と記す。）を得た。そして、ＳＳＩ２Ａ Ｇ１８６Ｄ変異ホモ型のダイズ植物においては、図５に示すとおり、病斑面積が５０％未満であるダイズ植物がほとんどを占めており、ダイズさび病に対して抵抗性を示すことが確認された（図５中、「ホモ型」）。一方、ＳＳＩ２Ａ遺伝子に変異を有しないダイズ植物（図５中、「エンレイ型」）及び野生型エンレイ品種ダイズ植物（図５中、「エンレイ」）においては、病斑面積が５０％以上であるダイズ植物がほとんどを占めており、ダイズさび病に対して罹患性を示すことが確認された。

【0081】

［実施例５：ＳＳＩ２Ａのアミノ酸置換の影響］
ＳＳＩ２Ａタンパク質の立体構造予測からアミノ酸置換の影響を推定した。ＳＳＩ２は活性に２つの鉄イオンの配位が必要であり、ダイズＳＳＩ２の一つであるＳＡＣＰＤ－Ｃにおいて鉄イオンの配位子及び架橋配位子が予測されている（Naoufal Lakhssassi, et al., Plant Physiology, Volume 174, Issue 3,July 2017, 1531-1543.）。Ａｌｐｈａ－Ｆｏｌｄ２（https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb）に、配列番号１のアミノ酸配列を入力してダイズＳＳＩ２Ａの立体構造を予測した。予測したダイズＳＳＩ２Ａの立体構造を図６に示す。図６及び表３には、上記ＳＡＣＰＤ－Ｃの文献をもとに予測した、活性に必要な鉄イオン配位子及び架橋配位子のアミノ酸残基を示す（図６右図）。

【0082】

第１８６番目のグリシン残基は、鉄イオンが配位する極近傍に位置することから、その変異により鉄イオンの配位、ひいてはＳＳＩ２Ａの活性に影響が与えられている可能性が高いと考えられる。また、以上実施例１～５の結果から、ホモ型に、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の機能を低下させる変異を有するダイズ植物は、ホモ型のＳＳＩ２Ａ Ｇ２１５Ｒ変異ダイズ植物、及びホモ型のＳＳＩ２Ａ Ｇ１８６Ｄ変異ダイズ植物と同様に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すと考えられる。そしてこのことから、ホモ型に、ＳＳＩ２Ａ遺伝子の発現産物の量を低下させる変異を有するダイズ植物も同様に、ダイズさび病に対して抵抗性を示すと考えられる。

【0083】

【表3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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