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特開2024-145788アセトインを生成する組換え細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024145788
(43)【公開日】2024-10-15
(54)【発明の名称】アセトインを生成する組換え細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20241004BHJP
C12P 7/04 20060101ALI20241004BHJP
C12P 7/26 20060101ALI20241004BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241004BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20241004BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/04
C12P7/26
C12N15/31
C12N15/60
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023058286
(22)【出願日】2023-03-31
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「再生可能エネルギーを原料とした有用物質産生菌の分子育種」「再生可能エネルギーを活用した有用物質高生産微生物デザイン」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】中島田 豊
(72)【発明者】
【氏名】加藤 淳也
(72)【発明者】
【氏名】加藤 節
(72)【発明者】
【氏名】藤井 達也
(72)【発明者】
【氏名】森田 友岳
(72)【発明者】
【氏名】村上 克治
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC09
4B064AC31
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC06
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA19Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065BC03
4B065CA05
4B065CA09
4B065CA51
(57)【要約】
【課題】微生物発酵によって、糖からアセトインを高効率で得られるようにする。
【解決手段】アセトインを生成する組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含む。
【選択図】図１
【解決手段】アセトインを生成する組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、
遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含むことを特徴とするアセトインを生成する組換え細菌。
遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含むことを特徴とするアセトインを生成する組換え細菌。
【請求項2】
前記細菌は、好熱性細菌である請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項3】
前記好熱性細菌は、好熱性酢酸生成菌である請求項２に記載の組換え細菌。
【請求項4】
前記好熱性酢酸生成菌は、モーレラ（Moorella）属細菌であることを特徴とする請求項３に記載の組換え細菌。
【請求項5】
前記細菌は、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する内在性酵素を有し、
前記遺伝子工学的手法により導入された、前記アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子は、前記内在性酵素と同一の酵素を発現することを特徴とする請求項１に記載の組換え細菌。
前記遺伝子工学的手法により導入された、前記アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子は、前記内在性酵素と同一の酵素を発現することを特徴とする請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項6】
前記アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子は、Bacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ発現遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項7】
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３８６５として寄託された請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項8】
糖の存在下で請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え細菌を培養してアセトインを生成させるステップを備えていることを特徴とするアセトインの製造方法。
【請求項9】
生成されたアセトインを回収するステップをさらに備えていることを特徴とする請求項８に記載のアセトインの製造方法。
【請求項10】
前記細菌として好熱性細菌を用い、前記アセトインを生成させるステップにおいて、前記組換え細菌を５５℃～６５℃で培養することを特徴とする請求項８に記載のアセトインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アセトインを生成する組換え細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
これまで人類は石炭や石油等の化石燃料の消費によって産業を発達させてきた。しかし、これら化石燃料は限りある資源であるため枯渇が懸念されており、代替エネルギーや代替材料、代替製法の開発は急務である。
【0003】
例えば、アセトイン（ＩＵＰＡＣ名：３－ヒドロキシ－２－ブタノン）は香料として用いられ、またゴム原料となるブタジエンの合成前駆物質、及び炭化水素ジェット燃料の製造に用いられるメチルエチルケトンの合成前駆物質として用いられている。アセトインは果物や野菜に含まれており、このような天然資源から抽出することが可能である。しかし、アセトイン供給の大部分は化石燃料からの化学合成に依存しており、上述のような将来的な化石燃料の枯渇により、アセトインを十分に供給できなくなることが懸念されている。このため、近年においては、微生物発酵法によってアセトインを生成する種々の技術の開発が進められており、アセトインの新たな代替製法として注目を集めている。なお、アセトインは米国エネルギー省が定めたバイオベースの基幹化合物三十のうちの一つに指定されている。
【0004】
例えば、非特許文献１には遺伝子組換え微生物を利用して、メタノールからアセトインを生成する技術が提示されている。また、非特許文献２には天然由来好熱細菌Geobacillus XT15株を利用して、トウモロコシの湿式粉砕から得られる粉末状の副産物を含有する窒素源からアセトインを生成する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Drejer EB, Chan D, Haupka C, Wendisch VF, Brautaset T, Irla M. Methanol-based acetoin production by genetically engineered Bacillus methanolicus. Green Chem. 2020;22:788-802.
【非特許文献2】Xiao, Z., Wang, X., Huang, Y. et al. Thermophilic fermentation of acetoin and 2,3-butanediol by a novel Geobacillus strain. Biotechnol Biofuels 5, 88 (2012). https://doi.org/10.1186/1754-6834-5-88
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、従来の非特許文献１に開示された組換え微生物によってアセトインを生成するためには基質としてメタノールを用いる必要があるが、メタノールの供給についても化石燃料からの合成に依存している。このため、天然資源を基質として用いるアセトインの代替製法を開発することが望ましい。一方、従来の非特許文献２に開示された天然由来好熱細菌を用いる方法では、天然資源を基質としてアセトインを製造する技術が提示されている。しかし、非特許文献２に開示された微生物では、アセトイン以外にも多種の副生物が生成し、アセトインの生成効率が高いとは言えない。このため、未だ更にアセトインの生成効率が高い方法と共に、その方法を可能とするための微生物が求められている。
【0007】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、微生物発酵によって、糖からアセトインを高効率で得られるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌に対して、遺伝子工学的手法により、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを導入することで、アセトインを高効率で生成可能な組換え細菌を提供できることを見出して本発明を完成した。
【0009】
具体的に、本発明に係るアセトインを生成する組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含むことを特徴とする。
【0010】
本発明に係る組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有しており、さらに、当該代謝において生成されるアセト乳酸からアセトインを生成する外来の酵素を発現する。このため、当該組換え細菌を糖の存在下で培養することによってアセトインを生成でき、すなわち天然資源を基質としてアセトインを生成可能な組換え細菌を提供することができる。また、本発明に係る組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子をさらに導入している。このような当該組換え細菌は、糖の存在下で培養することによってアセトインを高効率で生成することができる。
【0011】
本発明に係る組換え細菌において、前記細菌は、好熱性細菌であることが好ましい。
【0012】
好熱性細菌は、中温菌等と比較して代謝反応速度が大きく、アセトイン生成に有利である。また、好熱性細菌は、多くの汚染微生物の生育温度より高い温度が至適生育温度となり、当該汚染微生物のコンタミネーションによるアセトインの生成効率の低下や副生物生成の問題が生じにくい。
【0013】
本発明に係る組換え細菌において、前記好熱性細菌は、好熱性酢酸生成菌であることが好ましい。また、本発明に係る組換え好熱性細菌において、前記好熱性酢酸生成菌は、モーレラ（Moorella）属細菌であることが好ましい。
【0014】
このような好熱性細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有するため、アセトインを生成する組換え細菌として好適に使用できる。
【0015】
本発明に係る組換え細菌において、前記細菌は、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する内在性酵素を有し、前記遺伝子工学的手法により導入された、前記アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子は、前記内在性酵素と同一の酵素を発現することが好ましい。
【0016】
このようにすると、組換え細菌が糖からアセトインを高効率で生成するため、アセトインの生成効率を向上させた組換え細菌を提供することができる。
【0017】
本発明に係る組換え細菌において、前記アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子は、Bacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ発現遺伝子とすることができる。
【0018】
本発明に係る組換え細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に受領日２０２３年３月２７日、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３８６５として寄託された細菌であることが好ましい。
【0019】
本発明に係るアセトインの製造方法は、糖の存在下で上記本発明に係る組換え細菌を培養してアセトインを生成させるステップを備えていることを特徴とする。
【0020】
本発明に係るアセトインの製造方法によると、上記本発明に係る組換え細菌を糖の存在下で培養するため、上述の通り、当該組換え細菌の代謝によって高効率でアセトインを得ることができる。
【0021】
本発明に係るアセトインの製造方法は、生成されたアセトインを回収するステップをさらに備えていてもよい。
【0022】
本発明に係るアセトインの製造方法は、前記細菌として好熱性細菌を用い、前記アセトインを生成させるステップにおいて、前記組換え細菌を５５℃～６５℃で培養することが好ましい。
【0023】
本発明に係るアセトインの製造方法において好熱性細菌を用いた場合、上記温度範囲である５５℃～６５℃において特に優れた代謝速度を示し、アセトインを高効率で生成することができる。
【発明の効果】
【0024】
本発明に係るアセトインを生成する組換え細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法によると、微生物発酵によって、糖からアセトインを高効率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0027】
本発明の一実施形態は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌である。特に、本実施形態の組換え細菌は、遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含む。
【0028】
本実施形態の親細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有するものであれば特に限定されず、例えば酢酸生成菌を用いることができる
。また、本実施形態の親細菌は、好熱性細菌であることが好ましく、例えば好熱性酢酸生成菌などを用いることができる。古細菌が含まれてもよい。好熱性酢酸生成菌とは、至適生育温度が４５℃以上であり、糖などの有機物に加えて、一酸化炭素、又は二酸化炭素と水素といったガス基質を利用して酢酸を生成する細菌である。好熱性酢酸生成菌は、水素等の電子供与体をエネルギー源として利用できるが、水素以外にも一酸化炭素やメタノールを利用することができる（Arch Microbiol (2003) 179, p315-320を参照）。さらに、
本実施形態においては、モーレラ属細菌であることが好ましく、そのような細菌として例えばモーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）又はモーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）を用いることができる。モーレラ属細菌以
外の例としては、サーモアナエロバクター・キヴイ（Thermoanaerobacter kivui）が挙げられ、古細菌の例としてはアルカエオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）が挙げられる。
。また、本実施形態の親細菌は、好熱性細菌であることが好ましく、例えば好熱性酢酸生成菌などを用いることができる。古細菌が含まれてもよい。好熱性酢酸生成菌とは、至適生育温度が４５℃以上であり、糖などの有機物に加えて、一酸化炭素、又は二酸化炭素と水素といったガス基質を利用して酢酸を生成する細菌である。好熱性酢酸生成菌は、水素等の電子供与体をエネルギー源として利用できるが、水素以外にも一酸化炭素やメタノールを利用することができる（Arch Microbiol (2003) 179, p315-320を参照）。さらに、
本実施形態においては、モーレラ属細菌であることが好ましく、そのような細菌として例えばモーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）又はモーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）を用いることができる。モーレラ属細菌以
外の例としては、サーモアナエロバクター・キヴイ（Thermoanaerobacter kivui）が挙げられ、古細菌の例としてはアルカエオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）が挙げられる。
【0029】
本実施形態に係る組換え細菌は、代謝によって糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成し、また、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素を発現でき、すなわち糖からアセトインを生成する代謝経路が導入されている。具体的に、下記式に係る代謝経路が導入されている。
【化1】
【0030】
本実施形態の組換え細菌において、糖から中間体としてのピルビン酸の生成は、例えば解糖系により行うことができる。また、本実施形態の組換え細菌において、ピルビン酸からアセト乳酸の生成は、例えばピルビン酸からアセト乳酸を生成する脱炭酸反応を触媒する内在性の酵素により行われる。
【0031】
本実施形態の組換え細菌において、アセト乳酸からアセトインの生成は、例えばアセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素を用いて行うことができる。当該酵素としてはアセト乳酸デカルボキシラーゼ（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（以下「ＡＬＤＣ」ともいう）を用いることができるが、当該細菌の至適生育温度で作用することができるものであれば特に限定されない。例えば、アセト乳酸からアセトインを生成する外来の酵素としては、Bacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｓＡＬＤＣ、遺伝子番号Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＫＹ２３１２４７）を用いることができる。
【0032】
また、本実施形態に係る組換え細菌は、遺伝子工学的手法により導入された、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子を含む。これにより、当該組換え細菌による糖からアセトインへの生成効率を高めることができる。アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素としてはピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（以下「ｐｆｏ」ともいう）を用いることができるが、当該細菌の至適生育温度で作用することができるものであれば特に限定されない。例えば、組換え細菌としてモーレラ・サーモアセチカを用いる場合、モーレラ・サーモアセチカ由来のピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ｐｆｏ、遺伝子番号Ｍｏｔｈ＿００６４）を用いることができる。すなわち、本実施形態の組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸
を生成する反応を触媒する内在性酵素を有し、また、遺伝子工学的手法により導入された、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子は、内在性酵素と同一の酵素を発現することが好ましい。このようにすると、より多くのアセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素を発現できて、当該組換え細菌による糖からアセトインへの生成効率を更に高めることができる。
を生成する反応を触媒する内在性酵素を有し、また、遺伝子工学的手法により導入された、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子は、内在性酵素と同一の酵素を発現することが好ましい。このようにすると、より多くのアセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素を発現できて、当該組換え細菌による糖からアセトインへの生成効率を更に高めることができる。
【0033】
本実施形態に係る組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部が欠損されているものであってもよい。そのために、種々の遺伝子工学的手法を用いることができる。その手法は、細菌のゲノム上の当該酵素の発現遺伝子を除去する又は変異させる等により、当該酵素を安定的に発現させないことができるものであれば特に限定されない。当該遺伝子工学的手法としては、例えば相同組換えを利用した遺伝子ノックアウト法等を用いることができる。
【0034】
欠損させるアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素は、当該代謝経路に関わる酵素であれば特に限定されない。好熱性酢酸生成菌の場合、炭素源から種々の酵素の作用によりアセチル‐ＣｏＡを生成した後に、所定の酵素の作用によりアセチル‐ＣｏＡからＣｏＡを脱離させ、リン酸を付加させてアセチルリン酸を生成し、その後、他の酵素によってリン酸を脱離させて酢酸を生成する。このため、これらの過程に関わる酵素の一部の発現を欠損させることが好ましい。欠損させる酵素としては、例えばアセチル‐ＣｏＡからアセチルリン酸を生成するホスホアセチルトランスフェラーゼとすることができる。また、モーレラ属の場合、例えば２つのホスホアセチルトランスフェラーゼのうちの１つの酵素を欠損させることができ、具体的には、ホスホアセチルトランスフェラーゼＰｄｕＬ１及びＰｄｕＬ２のうちの１つの酵素を欠損させることができる。また、ＰｄｕＬ２を欠損させることが好ましい。
【0035】
本実施形態において、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子及びアセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子は、種々の遺伝子工学的手法を用いることによって細菌内に導入される。当該手法は、それらの酵素を安定的に発現できるように細菌内に導入させることができるものであれば特に限定されない。本実施形態において、当該遺伝子工学的手法としては、例えば相同組換えを利用した染色体への遺伝子ノックイン法等を用いることができる。特に、上記アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部を欠損させるのと同時に上記２種の酵素発現遺伝子を導入することが好ましい。すなわち、細菌のゲノム上における欠損させるためのアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するための酵素の遺伝子座と上記２種の酵素発現遺伝子とを相同組換えすることにより、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部を欠損させるのと同時に上記２種の酵素発現遺伝子を導入することが好ましい。これにより、１度の工程で上記内在酵素の発現遺伝子の欠損と上記２種の酵素発現遺伝子の導入とを同時にできる。
【0036】
本実施形態に係る組換え細菌としては、例えば受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３８６５の細菌を用いることができる。当該細菌は、モーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）を親株として、内在のホスホアセチルトランスフェラーゼのうちの１つであるＰｄｕＬ２の発現遺伝子が欠損され、且つBacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼの発現遺伝子及びモーレラ・サーモアセチカ由来のピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼの発現遺伝子が導入されたものである。
【0037】
本発明に係る他の実施形態は、上記組換え細菌を用いたアセトインの製造方法である。本実施形態の方法は、上記組換え細菌を培養してアセトインを生成させるステップを備えている。組換え細菌の培養は、アセトインを生成できるように糖の存在下で行われる。糖の種類は、特に限定されるものではなく、例えば五炭糖、六炭糖、及びこれらの糖を組み合わせたものを用いることができる。また、組換え細菌の培養は、上記の糖に加えて水素、メタノールなどの少なくとも１つの電子供与体の存在下で行うものであってもよい。
【0038】
また、組換え細菌の培養は、可能な限り高い効率でアセトインを生成させるために、組換え細菌として好熱性細菌を用い、当該細菌の至適生育温度で行われることが好ましく、モーレラ属細菌を用いる場合、５５℃～６５℃で培養することが好ましい。
【0039】
本実施形態に係る方法において、上記細菌の培養によってアセトインを生成させた後に、当該アセトインを回収するステップをさらに備えていることが好ましい。アセトインを回収する方法は、他の成分からアセトインを分離して、純度の高いアセトインを得ることができる方法であれば特に限定されない。そのような方法として、例えば細菌の培養液の蒸留によってアセトインを分離精製する方法を用いることができる。本実施形態において、上記組換え細菌は、例えば親株として酢酸生成菌を用いた場合、アセトインと酢酸とを生成するが、アセトインの沸点は１４８℃であり、酢酸は１１８℃であり、蒸留によりそれらの分離は容易にできて好ましい。
【実施例0040】
以下に、本発明に係るアセトインを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【0041】
［使用菌株、プラスミド及びプライマー］
本実施例で使用した菌株、プラスミド及びＰＣＲプライマーをそれぞれ下記表１～表３に示す。
本実施例で使用した菌株、プラスミド及びＰＣＲプライマーをそれぞれ下記表１～表３に示す。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
【表3】
【0045】
［基本培地及び基本溶液の調製］
（モーレラ細菌用基本培地の調製）
本実施例では、C. ljungdahliiの培養に用いられるＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地を改変したものを基本培地として用いた。改変として、塩酸システイン・一水和物の最終濃度を１．２ｇ／Ｌに減らし、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除いた。培地の作製において、還元剤（システイン及びＴｉ（ＩＩＩ）クエン酸）及び基質（フルクトース等）は別に調製し
た。嫌気的に培地を調製する方法として、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）を改変したＭｉｌｌｅｒらの方法（Miller, T. L.
et al., 1974, Appl. Microbiol., 27: 985-987）を用いた。各成分の組成は以下の通りである。１．０ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇの ＮａＣｌ、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
１．０ｇの酵母エキス（酵母エキス無添加の場合は０．０１ｇのウラシル）、２．０ｇのＮａＨＣＯ３、１０ｍｌの微量元素溶液、１０ｍｌのビタミン溶液、１０００ｍｌのイオン交換水、（必要に応じて２０ｇのアガー）、（必要に応じて２．０ｇのフルクトース）。調製手順は以下の通りである。まず、上記各成分を混合し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨ６．９
に調整後、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地を湯浴でボイル（２０分間）した。その後、ＣＯ２を注入しながら氷中で冷却（２０分間）し、予めＣＯ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に１８ｍＬずつ分注し、さらに、ＣＯ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで密閉した。その後、当該バイアル瓶をオートクレーブ（１２１℃、１５分）した。
（モーレラ細菌用基本培地の調製）
本実施例では、C. ljungdahliiの培養に用いられるＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地を改変したものを基本培地として用いた。改変として、塩酸システイン・一水和物の最終濃度を１．２ｇ／Ｌに減らし、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除いた。培地の作製において、還元剤（システイン及びＴｉ（ＩＩＩ）クエン酸）及び基質（フルクトース等）は別に調製し
た。嫌気的に培地を調製する方法として、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）を改変したＭｉｌｌｅｒらの方法（Miller, T. L.
et al., 1974, Appl. Microbiol., 27: 985-987）を用いた。各成分の組成は以下の通りである。１．０ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇの ＮａＣｌ、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
１．０ｇの酵母エキス（酵母エキス無添加の場合は０．０１ｇのウラシル）、２．０ｇのＮａＨＣＯ３、１０ｍｌの微量元素溶液、１０ｍｌのビタミン溶液、１０００ｍｌのイオン交換水、（必要に応じて２０ｇのアガー）、（必要に応じて２．０ｇのフルクトース）。調製手順は以下の通りである。まず、上記各成分を混合し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨ６．９
に調整後、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地を湯浴でボイル（２０分間）した。その後、ＣＯ２を注入しながら氷中で冷却（２０分間）し、予めＣＯ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に１８ｍＬずつ分注し、さらに、ＣＯ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで密閉した。その後、当該バイアル瓶をオートクレーブ（１２１℃、１５分）した。
【0046】
（微量元素溶液の調製）
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｇのニトリロトリ酢酸（ニトリロトリ酢酸を溶解させた後、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）、１．０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ４、２０．０ｍｇのＮａ２ＷＯ４。溶液は遮光し４℃で保存した。
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｇのニトリロトリ酢酸（ニトリロトリ酢酸を溶解させた後、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）、１．０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ４、２０．０ｍｇのＮａ２ＷＯ４。溶液は遮光し４℃で保存した。
【0047】
（ビタミン溶液の調製）
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｍｇのビオチン、２．０ｍｇの葉酸、１０．０ｍｇのピリドキシン塩酸塩、５．０ｍｇのチアミン・ＨＣｌ、５．０ｍｇのリボフラビン、５．０ｍｇのニコチン酸、５．０ｍｇのカルシウム Ｄ－（＋）－パントテン酸、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５．０ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、５．０ｍｇのチオクト酸。溶液は遮光し４℃で保存した。
イオン交換水に以下の成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。２．０ｍｇのビオチン、２．０ｍｇの葉酸、１０．０ｍｇのピリドキシン塩酸塩、５．０ｍｇのチアミン・ＨＣｌ、５．０ｍｇのリボフラビン、５．０ｍｇのニコチン酸、５．０ｍｇのカルシウム Ｄ－（＋）－パントテン酸、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５．０ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、５．０ｍｇのチオクト酸。溶液は遮光し４℃で保存した。
【0048】
（フルクトース溶液（２００ｇ／Ｌ）の調製）
フルクトースをイオン交換水と混合して２００ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、室温保存した。
フルクトースをイオン交換水と混合して２００ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、室温保存した。
【0049】
（還元剤システイン（６０ｇ／Ｌ）の調製）
Ｌ－システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏをイオン交換水と混合して６０ｇ／Ｌの濃度で調製し
、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、遮光し室温保存した。培地使用前に１／５０量を添加した。
Ｌ－システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏをイオン交換水と混合して６０ｇ／Ｌの濃度で調製し
、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、遮光し室温保存した。培地使用前に１／５０量を添加した。
【0050】
（還元剤Ｔｉ（ＩＩＩ）クエン酸溶液の調製）
イオン交換水にクエン酸ナトリウム二水和物（１１．７６ｇ）を加えて、２００ｍＬにメスアップした。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。その後、２０％塩化チタン（ＩＩＩ）水溶液（ナカライテスク）（１０．６ｍＬ）を混合し、湯煎で沈殿を溶解させた飽和炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整後、予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に８０ｍＬずつ分注した。さらにＮ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に遮光し室温保存した。これを培地に対して１、２滴添加した。
イオン交換水にクエン酸ナトリウム二水和物（１１．７６ｇ）を加えて、２００ｍＬにメスアップした。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。その後、２０％塩化チタン（ＩＩＩ）水溶液（ナカライテスク）（１０．６ｍＬ）を混合し、湯煎で沈殿を溶解させた飽和炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整後、予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に８０ｍＬずつ分注した。さらにＮ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉した。オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に遮光し室温保存した。これを培地に対して１、２滴添加した。
【0051】
（ウラシル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）の調製）
ウラシル（３００ｍｇ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（３０ｍＬ）に溶解した。バイアル瓶に移し、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉、遮光し室温保存した。なお、ウラシル溶液は、ウラシル要求性変異株（ΔｐｙｒＦ株）培養時のみ培地に対して１／１０００量を添加した。
ウラシル（３００ｍｇ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（３０ｍＬ）に溶解した。バイアル瓶に移し、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉、遮光し室温保存した。なお、ウラシル溶液は、ウラシル要求性変異株（ΔｐｙｒＦ株）培養時のみ培地に対して１／１０００量を添加した。
【0052】
（モーレラ属細菌用エレクトロポレーション・バッファー（２７２ｍＭスクロース溶液）の調製）
スクロースをミリＱ水に溶解し、２７２ｍＭ溶液を調製した。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉し、オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に室温保存した。
スクロースをミリＱ水に溶解し、２７２ｍＭ溶液を調製した。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。ブチルゴム栓及びアルミキャップで密閉し、オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に室温保存した。
【0053】
（ＬＢ培地の作製）
１０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作製時には寒天末を１．５％添加した。
１０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作製時には寒天末を１．５％添加した。
【0054】
（２×ＹＴ培地の作製）
１６ｇのトリプトン（ナカライテスク）、１０ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、５ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作製時には寒天末を１％添加した。
１６ｇのトリプトン（ナカライテスク）、１０ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、５ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作製時には寒天末を１％添加した。
【0055】
（ＳＯＢ培地の作製）
９５０ｍＬのイオン交換水に対して、２０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、０．５ｇのＮａＣｌ、及び１０ｍＬの２５０ｍＭＫＣｌを溶解後、ｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップした。オートクレーブ後、使用直前にオートクレーブ滅菌した２ＭＭｇＣｌ２（５ｍＬ）を添加した。
９５０ｍＬのイオン交換水に対して、２０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、０．５ｇのＮａＣｌ、及び１０ｍＬの２５０ｍＭＫＣｌを溶解後、ｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップした。オートクレーブ後、使用直前にオートクレーブ滅菌した２ＭＭｇＣｌ２（５ｍＬ）を添加した。
【0056】
［使用機器］
本実施形態において使用した機器は以下の通りである。
インキュベーター
ＢＲ－４３ＦＨ（タイテック）：振とう培養（５５℃、１８０ｒｐｍ）
ＴＶＡ６６０ＤＡ（アドバンテック）：静置培養（５５℃）
ＩＳ－６１（ヤマト科学）：静置培養（３７℃）
ＬＴＥ－１０１０（ＥＹＥＬＡ）：静置培養（５５℃）
ＳＬＩ－２２０（ＥＹＥＬＡ）：静置培養（３７℃）
遠心分離機
ＭＸ３００（トミー精工）
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１０（エッペンドルフ）
ＭＤＸ３１０（トミー精工）
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４３０Ｒ（エッペンドルフ）
吸光光度計
Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス）：菌体濃度測定、ＤＮＡ、ＲＮＡ濃度測定
ＵＶ－１６００（島津製作所）：酵素活性測定
ＧｅｎｅＱｕａｎｔ１３００（ＧＥヘルスケア）：菌体濃度測定
ＮＤ－１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ）：ＤＮＡ濃度測定
ｐＨメーター
Ｆ－２１（堀場製作所）：電極はＣＭ０５７－ＢＮＣ（ＣＥＭＣＯ）を使用
ＨＭ－３０Ｇ（ＴＯＡ）：電極はＧＳＴ－５７２７Ｃ（ＴＯＡ）を使用
ＰＣＲ装置
ＰＣ８０８（アステック）
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー）
Ｔ１００（バイオラッド）
ブロックインキュベーター ＢＩ?５２５Ａ（アステック）
超音波破砕機 Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ブランソン）
ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ １．５（ロシュ・ダイアグノスティックス
）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（詳細は後に説明する。）
本実施形態において使用した機器は以下の通りである。
インキュベーター
ＢＲ－４３ＦＨ（タイテック）：振とう培養（５５℃、１８０ｒｐｍ）
ＴＶＡ６６０ＤＡ（アドバンテック）：静置培養（５５℃）
ＩＳ－６１（ヤマト科学）：静置培養（３７℃）
ＬＴＥ－１０１０（ＥＹＥＬＡ）：静置培養（５５℃）
ＳＬＩ－２２０（ＥＹＥＬＡ）：静置培養（３７℃）
遠心分離機
ＭＸ３００（トミー精工）
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１０（エッペンドルフ）
ＭＤＸ３１０（トミー精工）
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４３０Ｒ（エッペンドルフ）
吸光光度計
Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス）：菌体濃度測定、ＤＮＡ、ＲＮＡ濃度測定
ＵＶ－１６００（島津製作所）：酵素活性測定
ＧｅｎｅＱｕａｎｔ１３００（ＧＥヘルスケア）：菌体濃度測定
ＮＤ－１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ）：ＤＮＡ濃度測定
ｐＨメーター
Ｆ－２１（堀場製作所）：電極はＣＭ０５７－ＢＮＣ（ＣＥＭＣＯ）を使用
ＨＭ－３０Ｇ（ＴＯＡ）：電極はＧＳＴ－５７２７Ｃ（ＴＯＡ）を使用
ＰＣＲ装置
ＰＣ８０８（アステック）
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー）
Ｔ１００（バイオラッド）
ブロックインキュベーター ＢＩ?５２５Ａ（アステック）
超音波破砕機 Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ブランソン）
ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ １．５（ロシュ・ダイアグノスティックス
）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（詳細は後に説明する。）
【0057】
ＨＰＬＣのシステムは、以下の通りである。
ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓ（ＨＰＬＣポンプ）、ＲＩ－２０３１ Ｐｌｕｓ（ＲＩディテクター）、ＣＯ－２０６５ Ｐｌｕｓ（カラムオーブン）、ＡＳ－２０５７ Ｐｌｕｓ（オートサンプラー）を用いた（いずれもＪＡＳＣＯ）。移動相は０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を用い、０．７ｍＬ／分の流速で流した。分離カラムには、ＲＳｐａｋＫＣ－８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。また、ガードカラムとして、ＲＳｐａｋ ＫＣ－Ｇ（Ｓｈｏ
ｄｅｘ）を分離カラムの前に設置した。カラムオーブンの温度は、６０℃に設定した。測定時にはサンプルの上清に、内部標準として２０ｍＭのクロトン酸を含む０．２％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を１：１で混合し、酢酸セルロース親水性フィルター０．２０μｍ（Ｄｉｓｍｉｃ（登録商標）−１３ＣＰ）で濾過してから測定を行った。オートサンプラーのインジェクションボリュームは１０μＬとした。
ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓ（ＨＰＬＣポンプ）、ＲＩ－２０３１ Ｐｌｕｓ（ＲＩディテクター）、ＣＯ－２０６５ Ｐｌｕｓ（カラムオーブン）、ＡＳ－２０５７ Ｐｌｕｓ（オートサンプラー）を用いた（いずれもＪＡＳＣＯ）。移動相は０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を用い、０．７ｍＬ／分の流速で流した。分離カラムには、ＲＳｐａｋＫＣ－８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。また、ガードカラムとして、ＲＳｐａｋ ＫＣ－Ｇ（Ｓｈｏ
ｄｅｘ）を分離カラムの前に設置した。カラムオーブンの温度は、６０℃に設定した。測定時にはサンプルの上清に、内部標準として２０ｍＭのクロトン酸を含む０．２％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を１：１で混合し、酢酸セルロース親水性フィルター０．２０μｍ（Ｄｉｓｍｉｃ（登録商標）−１３ＣＰ）で濾過してから測定を行った。オートサンプラーのインジェクションボリュームは１０μＬとした。
【0058】
［組換え細菌（モーレラ・サーモアセチカ）の作製］
（大腸菌の培養）
大腸菌をＬＢ培地、２×ＹＴ培地及びＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。カナマイシン耐性株のスクリーニングはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用した。
（大腸菌の培養）
大腸菌をＬＢ培地、２×ＹＴ培地及びＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。カナマイシン耐性株のスクリーニングはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用した。
【0059】
（プラスミドｐＨＭ２３の構築）
モーレラ・サーモアセチカ細菌の内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼの発現遺伝子（ＰｄｕＬ２）の破壊、及びＧ３ＰＤプロモーターにつないだBacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デキルボキシラーゼの発現遺伝子（ｂｓＡＬＤＣの発現遺伝子）を導入するプラスミドｐＨＭ２３は、以下の手順で構築した。まず、ｂｓＡＬＤＣ遺伝子は配列をモーレラ・サーモアセチカ細菌での発現に最適となるようコドン最適化を行い、人工遺伝子合成（Ｇｅｎｅｗｉｚ）により用意した。ｂｓＡＬＤＣ遺伝子の配列（遺伝子番号Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＫＹ２３１２４７）は、配列番号２１に示している。続いて、人工合成したｂｓＡＬＤＣ遺伝子を鋳型として、プライマーセットＪＫ１０９、ＪＫ１１０を用いて、ＫＯＤ －ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いてＰＣＲ法により増幅した。プロトコルは添付のマニュアルに従った。同様に、ｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ（Iwasaki et al.,2017, Appl. Environ. Microbiol. 83(8) e00247-17）を鋳型として、プライマーセットＪＫ５２、ＪＫ７１を用いて、ｐｄｕＬ２の上流と下流それぞれ約１ｋｂｐ、Ｇ３ＰＤプロモーター及びｐｙｒＦマーカーがｐＫ１８ｍｏｂベクターにつながれた配列を同様にＰＣＲ法により増幅した。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてつなげ、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでクローニングした。得られたＤＮＡコンストラクトは、サンガーシーケンスによりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。得られたプラスミドｐＨＭ２３の配列は、配列番号２２に示している。
モーレラ・サーモアセチカ細菌の内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼの発現遺伝子（ＰｄｕＬ２）の破壊、及びＧ３ＰＤプロモーターにつないだBacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デキルボキシラーゼの発現遺伝子（ｂｓＡＬＤＣの発現遺伝子）を導入するプラスミドｐＨＭ２３は、以下の手順で構築した。まず、ｂｓＡＬＤＣ遺伝子は配列をモーレラ・サーモアセチカ細菌での発現に最適となるようコドン最適化を行い、人工遺伝子合成（Ｇｅｎｅｗｉｚ）により用意した。ｂｓＡＬＤＣ遺伝子の配列（遺伝子番号Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＫＹ２３１２４７）は、配列番号２１に示している。続いて、人工合成したｂｓＡＬＤＣ遺伝子を鋳型として、プライマーセットＪＫ１０９、ＪＫ１１０を用いて、ＫＯＤ －ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いてＰＣＲ法により増幅した。プロトコルは添付のマニュアルに従った。同様に、ｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ｌｄｈ（Iwasaki et al.,2017, Appl. Environ. Microbiol. 83(8) e00247-17）を鋳型として、プライマーセットＪＫ５２、ＪＫ７１を用いて、ｐｄｕＬ２の上流と下流それぞれ約１ｋｂｐ、Ｇ３ＰＤプロモーター及びｐｙｒＦマーカーがｐＫ１８ｍｏｂベクターにつながれた配列を同様にＰＣＲ法により増幅した。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてつなげ、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでクローニングした。得られたＤＮＡコンストラクトは、サンガーシーケンスによりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。得られたプラスミドｐＨＭ２３の配列は、配列番号２２に示している。
【0060】
（プラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣの構築）
モーレラ・サーモアセチカ細菌の内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼの発現遺伝子（ＰｄｕＬ２）の破壊、及びＧ３ＰＤプロモーターにつないだモーレラ・サーモアセチカ由来のピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼの発現遺伝子（ｐｆｏ発現遺伝子）及び外来のアセト乳酸デキルボキシラーゼの発現遺伝子（ｂｓＡＬＤＣ発現遺伝子）を導入するプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣは、以下の手順で構築した。まず、ｐｋ１８－ｋａｎ２を鋳型として、プライマーセットＪＫ５２、ＪＫ７４を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片と、コドン最適化して人工合成したｃａｔ遺伝子（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を鋳型として、プライマーセットＪＫ７５、ＪＫ７６を用いてＰＣＲ法により増幅した断片とをそれぞれ得た。これら２つのＰＣＲ増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてつなげ、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することで構築した。なお、ＰＣＲ酵素はＫＯＤ －ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。次に、モーレラ・サーモアセチカ由来のｐｆｏ発現遺伝子は、モーレラ・サーモアセチカＹ７２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＴＦ１、ＴＦ２及びＫＯＤ ＯＮＥ（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いてＰＣＲ法により増幅した。プロトコルは添付のマニュアルに従った。モーレラ・サーモアセチカ由来のｐｆｏ発現遺伝子の配列（遺伝子番号Ｍｏｔｈ＿００６４）は、配列番号２３に示している。同様に、上記ｐＨＭ１０を鋳型として、プライマーセットＴＦ３、ＴＦ４を用いるインバースＰＣＲにより、ｐｋ１８－ｋａｎ２と相同する配列を増幅した。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでプラスミドｐＰＹ－ｐｆｏを得た。続いて、上記のように作製したプラスミドｐＨＭ２３を鋳型として、プライマーセットＴＦ９、ＴＦ１１を用いてＰＣＲ法により増幅した断片と、プラスミドｐＰＹ－ｐｆｏを鋳型としてプライマーセットＴＦ３、ＴＦ１２を用いてＰＣＲ法により増幅した断片とをそれぞれ得た。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでプラスミドｐＰＹ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣを得た。次に、ｐＰＹ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣを鋳型として、プライマーセットＴＦ２５、ＴＦ３０を用いてＰＣＲ法により増幅した断片と、上記のように作製したｐＨＭ２３を鋳型としてプライマーセットＴＦ８、ＴＦ２６を用いてＰＣＲ法により増幅した断片とをそれぞれ得た。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣを得た。得られたＤＮＡコンストラクトは、サンガーシーケンスによりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。得られたプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣの配列は、配列番号２４に示している。
モーレラ・サーモアセチカ細菌の内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼの発現遺伝子（ＰｄｕＬ２）の破壊、及びＧ３ＰＤプロモーターにつないだモーレラ・サーモアセチカ由来のピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼの発現遺伝子（ｐｆｏ発現遺伝子）及び外来のアセト乳酸デキルボキシラーゼの発現遺伝子（ｂｓＡＬＤＣ発現遺伝子）を導入するプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣは、以下の手順で構築した。まず、ｐｋ１８－ｋａｎ２を鋳型として、プライマーセットＪＫ５２、ＪＫ７４を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片と、コドン最適化して人工合成したｃａｔ遺伝子（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を鋳型として、プライマーセットＪＫ７５、ＪＫ７６を用いてＰＣＲ法により増幅した断片とをそれぞれ得た。これら２つのＰＣＲ増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてつなげ、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することで構築した。なお、ＰＣＲ酵素はＫＯＤ －ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。次に、モーレラ・サーモアセチカ由来のｐｆｏ発現遺伝子は、モーレラ・サーモアセチカＹ７２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＴＦ１、ＴＦ２及びＫＯＤ ＯＮＥ（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いてＰＣＲ法により増幅した。プロトコルは添付のマニュアルに従った。モーレラ・サーモアセチカ由来のｐｆｏ発現遺伝子の配列（遺伝子番号Ｍｏｔｈ＿００６４）は、配列番号２３に示している。同様に、上記ｐＨＭ１０を鋳型として、プライマーセットＴＦ３、ＴＦ４を用いるインバースＰＣＲにより、ｐｋ１８－ｋａｎ２と相同する配列を増幅した。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでプラスミドｐＰＹ－ｐｆｏを得た。続いて、上記のように作製したプラスミドｐＨＭ２３を鋳型として、プライマーセットＴＦ９、ＴＦ１１を用いてＰＣＲ法により増幅した断片と、プラスミドｐＰＹ－ｐｆｏを鋳型としてプライマーセットＴＦ３、ＴＦ１２を用いてＰＣＲ法により増幅した断片とをそれぞれ得た。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでプラスミドｐＰＹ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣを得た。次に、ｐＰＹ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣを鋳型として、プライマーセットＴＦ２５、ＴＦ３０を用いてＰＣＲ法により増幅した断片と、上記のように作製したｐＨＭ２３を鋳型としてプライマーセットＴＦ８、ＴＦ２６を用いてＰＣＲ法により増幅した断片とをそれぞれ得た。これら２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換することでプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣを得た。得られたＤＮＡコンストラクトは、サンガーシーケンスによりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。得られたプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣの配列は、配列番号２４に示している。
【0061】
（モーレラ・サーモアセチカへのアセトイン合成遺伝子群導入）
Kita et al.,2013, Biosci. Biotechnol. Biochem., 77 (2), 301-306にて確立された
方法に従いモーレラ・サーモアセチカＹ７２株の形質転換を行った。構築したプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣは、大腸菌ＴＯＰ１０株（ＳＩＧＭＡ）よりＤＮＡを調製した。形質転換は、以下の通り行った。ウラシル要求性宿主Ｙ７２ ｐｙｒＦ：：Ｋｍを用い、ｐｙｒＦ遺伝子をマーカーとして用いた。菌体は、合成培地に糖源として終濃度１１ｍＭフルクトースを添加し、５５℃で培養、吸光度ＯＤ６００の値が０．３～０．６程度となった培養から用意した。添加したＤＮＡ量は５μｇ～１０μｇとした。形質転換により得られたクローンは、プライマーセットＴＦ３１、ＴＦ３２を用いてＰＣＲ法によってｐｄｕＬ２領域のＤＮＡを増幅し、遺伝子導入により相当の大きさにサイズが変化したことにより確認した。
Kita et al.,2013, Biosci. Biotechnol. Biochem., 77 (2), 301-306にて確立された
方法に従いモーレラ・サーモアセチカＹ７２株の形質転換を行った。構築したプラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣは、大腸菌ＴＯＰ１０株（ＳＩＧＭＡ）よりＤＮＡを調製した。形質転換は、以下の通り行った。ウラシル要求性宿主Ｙ７２ ｐｙｒＦ：：Ｋｍを用い、ｐｙｒＦ遺伝子をマーカーとして用いた。菌体は、合成培地に糖源として終濃度１１ｍＭフルクトースを添加し、５５℃で培養、吸光度ＯＤ６００の値が０．３～０．６程度となった培養から用意した。添加したＤＮＡ量は５μｇ～１０μｇとした。形質転換により得られたクローンは、プライマーセットＴＦ３１、ＴＦ３２を用いてＰＣＲ法によってｐｄｕＬ２領域のＤＮＡを増幅し、遺伝子導入により相当の大きさにサイズが変化したことにより確認した。
【0062】
以上のようにして、モーレラ・サーモアセチカを親株とし、内在性ＰｄｕＬ２が欠損し、且つｂｓＡＬＤＣ発現遺伝子及びｐｆｏ発現遺伝子が導入された組換え株（Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ）を得た。なお、この株は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３８６５として寄託されている（図１（ａ）も参照）。
【0063】
また、後述する参考例用として、プラスミドｐＰＤ－ｐｆｏ－ｂｓＡＬＤＣの代わりにプラスミドｐＨＭ２３を用いた点以外は、同様にしてモーレラ・サーモアセチカへのアセトイン合成遺伝子導入を行った。これにより、モーレラ・サーモアセチカを親株とし、内在性ＰｄｕＬ２が欠損し、且つｂｓＡＬＤＣ発現遺伝子が導入された組換え株（Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｂｓＡＬＤＣ）を得た。なお、この株は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３８６４として寄託されている（図２（ａ）も参照）。
【0064】
［組換え株のアセトイン生成能の評価］
上記のようにして得られた組換え株（Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ）のアセトイン生成能を以下の通りに評価した。
上記のようにして得られた組換え株（Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ）のアセトイン生成能を以下の通りに評価した。
【0065】
Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ株をフルクトースの存在下で培養したときの菌体濁度（ＯＤ６００）及び代謝物の濃度（ｍＭ）の経時測定を行った。培地は上述の基本培地を使用し、フルクトース濃度を１５．６ｍＭとし、培養温度を５５℃とした。菌体濁度（ＯＤ６００）の測定は吸光光度計を用いて行い、また、代謝物の濃度（ｍＭ）の測定は上記ＨＰＬＣを用いてフルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、アセトイン（Ａｃｅｔｏｉｎ）及び酢酸（Ａｃｅｔａｔｅ）について行った。その結果、図１（ｂ）に示すように、Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ株の菌体濁度（ＯＤ６００）は５日後まで増加を続けた。また、図１（ｂ）に示すように、培養開始から７日後にＹ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ株は１５．６ｍＭのフルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を完全に消費し、１０．７ｍＭのアセトイン（Ａｃｅｔｏｉｎ）を生産した。一方、副生物の酢酸（Ａｃｅｔａｔｅ）は５．０ｍＭ生産された。以上の結果から、Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ株は、フルクトースからアセトインを高い効率で生成できることが示された。
【0066】
次に、Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｂｓＡＬＤＣ株を用いた点以外は、上記と同様にして参考例に係る菌体濁度（ＯＤ６００）及び代謝物の濃度（ｍＭ）の経時測定を行った。その結果、図２（ｂ）に示すように、Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｂｓＡＬＤＣ株の菌体濁度（ＯＤ６００）は５日後まで増加した。しかし、図２（ｂ）に示すように、培養開始から５日後において、Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｐｆｏ‐ｂｓＡＬＤＣ株は１３．６ｍＭのフルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を完全に消費したが、４．５ｍＭのアセトイン（Ａｃｅｔｏｉｎ）生産にとどまった。また、酢酸（Ａｃｅｔａｔｅ）は１８．７ｍＭ生産された。以上の結果から、Ｙ７２ ｐｄｕＬ２：：ｂｓＡＬＤＣ株は、糖からアセトインを生成することができるが、高い効率での生成は難しいことが示された。
【0067】
以上から、本発明に係る組換え細菌によると、糖からアセトインを高い効率で生成できることが示された。特に、本実施例の組換え細菌では、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子を導入することによって、糖からアセトインを高い効率で生成可能な組換え細菌を提供できることが示された。
【図1】
【図2】
【配列表】