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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024097058
(43)【公開日】2024-07-17
(54)【発明の名称】日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤
(51)【国際特許分類】
A61M 37/00 20060101AFI20240709BHJP
【ＦＩ】
A61M37/00 530
A61M37/00 520
【審査請求】有
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024072022
(22)【出願日】2024-04-26
(62)【分割の表示】P 2022536456の分割
【原出願日】2021-07-16
(31)【優先権主張番号】P 2020122621
(32)【優先日】2020-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】000173692
【氏名又は名称】一般財団法人阪大微生物病研究会
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】小山田 孝嘉
(72)【発明者】
【氏名】島田 俊雄
(72)【発明者】
【氏名】柿田 浩輔
(72)【発明者】
【氏名】岩田 浩明
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、皮下注射日本脳炎ワクチンの投与量よりも低い投与量、または皮下注射日本脳炎ワクチンの投与回数よりも少ない投与回数であっても、ヒトに対して十分な免疫を付与することができる日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明によれば、シート部１１６と、シート部の上面に存在する複数の針部１１２とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎予防剤が提供される。
【選択図】図１
【解決手段】本発明によれば、シート部１１６と、シート部の上面に存在する複数の針部１１２とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎予防剤が提供される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、前記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、ヒトにおける中和抗体産生誘導のための日本脳炎予防剤であり、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で、投与回数が１回又は２回である、ヒトにおける中和抗体産生誘導のための日本脳炎予防剤。
【請求項2】
シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、前記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、ヒトにおける中和抗体産生誘導のための日本脳炎予防剤であり、不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で、投与回数が１回又は２回である、ヒトにおける中和抗体産生誘導のための日本脳炎予防剤。
【請求項3】
マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している、請求項１又は２に記載の日本脳炎予防剤。
【請求項4】
針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の日本脳炎予防剤。
【請求項5】
初回投与２週間後の中和抗体価が、１．０以上である、請求項１から４の何れか一項に記載の日本脳炎予防剤；ただし、日本脳炎予防剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させ、反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養した際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
【請求項6】
シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、前記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、ヒトにおける中和抗体が産生されるための日本脳炎予防剤であり、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で、投与回数が１回又は２回である、ヒトにおける中和抗体が産生されるための日本脳炎予防剤。
【請求項7】
シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、前記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、ヒトにおける中和抗体が産生されるための日本脳炎予防剤であり、不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で、投与回数が１回又は２回である、ヒトにおける中和抗体が産生されるための日本脳炎予防剤。
【請求項8】
マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している、請求項６又は７に記載の日本脳炎予防剤。
【請求項9】
針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、請求項６から８の何れか一項に記載の日本脳炎予防剤。
【請求項10】
シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、前記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、ヒトにおける中和抗体産生誘導剤であり、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で、投与回数が１回又は２回である、ヒトにおける中和抗体産生誘導剤。
【請求項11】
シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、前記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、ヒトにおける中和抗体産生誘導剤であり、不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で、投与回数が１回又は２回である、ヒトにおける中和抗体産生誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤に関する。
【背景技術】
【0002】
適量の薬物を投与し、かつ十分な薬効を達成するための薬物の投与方法として、薬物を含有する高アスペクト比のマイクロニードル（針部）が形成されたマイクロニードルアレイを用いて、マイクロニードルによって角質バリア層を貫通して、苦痛を伴わずに薬物を皮膚内に注入する方法が注目されている。例えば、生体内溶解性を有する物質を基材とした自己溶解型マイクロニードルアレイが報告されている。自己溶解型マイクロニードルアレイにおいては、その基材に薬物を保持させておき、マイクロニードルが皮膚に挿入された際に基材が自己溶解することにより、薬物を皮膚内に投与することができる。
【0003】
特許文献１には、基板と、基板上に配置されたマイクロニードルと、マイクロニードル上に形成されたコーティング層と、を備えるマイクロニードルデバイスであって、 マイクロニードルの長さは３００～５００μｍであり、マイクロニードルは２８～８０本／ｃｍ ２の密度で基板上に配置されており、コーティング層は生理活性物質を有する、マイクロニードルデバイスが記載されている。特許文献１には、コーティング層が日本脳炎ワクチンを含むマイクロニードルデバイスの動物に対する皮膚刺激性が記載されている。
【0004】
特許文献２には、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、針部は、電気的に中性である水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、日本脳炎ワクチン、および電気的に中性である界面活性剤を含み、シート部は、電気的に中性である水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、マイクロニードルアレイが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１８／１５５４３１
【特許文献2】国際公開ＷＯ２０１９／２２５６５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１には、ヒトに投与した際の中和抗体価や皮膚刺激性に関する記載はない。非特許文献１には、マイクロニードルと筋肉内注射との間に中和抗体価及び陽転率の有意な差は示されておらず、また日本脳炎ワクチンに関する記載もない。
【0007】
市販されている皮下注射日本脳炎ワクチンは、初回免疫として１～４週間の間隔で２回の接種が必要であり、さらに初回免疫後１年を経過した時期に追加免疫を行い、合計３回の接種をもって基礎免疫ができる。そのため、多量の日本脳炎ワクチンが必要となる。しかし、一般の医薬品に比べて生産に多くの時間を要するワクチンは、不測の事態により供給が不足することもある。
【0008】
本発明は、皮下注射日本脳炎ワクチンの投与量よりも低い投与量、または皮下注射日本脳炎ワクチンの投与回数よりも少ない投与回数であっても、ヒトに対して十分な免疫を付与することができる日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、シート部と、不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持している複数の針部とを有するマイクロニードルアレイを用いることによって、不活化日本脳炎ウイルスの投与量としては、皮下注射日本脳炎ワクチンの投与量の１／４量においても、ヒトに対する初回免疫として１回の投与で皮下注射２回投与の場合と同等の陽転率を示し、皮下注射日本脳炎ワクチンの投与量の１／１０量においても２回の投与で皮下注射の場合と同等の陽転率を示すことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【0010】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎予防剤。
（２） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～２．５μｇ／回の用量で投与する、（１）に記載の日本脳炎予防剤。
（３） 投与回数が１回又は２回である、（１）又は（２）に記載の日本脳炎予防剤。
（４） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で２回投与する、（１）から（３）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（５） 不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で１回又は２回投与する、（１）から（３）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（６） マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している、（１）から（５）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（７） 針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、（１）から（６）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（８） 初回投与２週間後の中和抗体価が、１．０以上である、（１）から（７）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤；ただし、日本脳炎予防剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させ、反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養した際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
（１） シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎予防剤。
（２） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～２．５μｇ／回の用量で投与する、（１）に記載の日本脳炎予防剤。
（３） 投与回数が１回又は２回である、（１）又は（２）に記載の日本脳炎予防剤。
（４） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で２回投与する、（１）から（３）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（５） 不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で１回又は２回投与する、（１）から（３）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（６） マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している、（１）から（５）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（７） 針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、（１）から（６）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤。
（８） 初回投与２週間後の中和抗体価が、１．０以上である、（１）から（７）の何れか一に記載の日本脳炎予防剤；ただし、日本脳炎予防剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させ、反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養した際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
【0011】
（９） シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎ワクチン剤。
（１０） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～２．５μｇ／回の用量で投与する、（９）に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１１） 投与回数が１回又は２回である、（９）又は（１０）に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１２） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で２回投与する、（９）から（１１）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１３） 不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で１回又は２回投与する、（９）から（１１）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１４） マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している、（９）から（１３）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１５） 針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、（９）から（１４）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１６） 初回投与２週間後の中和抗体価が、１．０以上である、（９）から（１５）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤；ただし、日本脳炎ワクチン剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させ、反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養した際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
（１０） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～２．５μｇ／回の用量で投与する、（９）に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１１） 投与回数が１回又は２回である、（９）又は（１０）に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１２） 不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で２回投与する、（９）から（１１）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１３） 不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で１回又は２回投与する、（９）から（１１）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１４） マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している、（９）から（１３）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１５） 針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、（９）から（１４）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤。
（１６） 初回投与２週間後の中和抗体価が、１．０以上である、（９）から（１５）の何れか一に記載の日本脳炎ワクチン剤；ただし、日本脳炎ワクチン剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させ、反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養した際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
【0012】
（Ａ） シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを、対象に投与することを含む、日本脳炎の予防方法。
（Ｂ） シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを、対象に投与することを含む、日本脳炎に対する免疫を付与する方法。
（Ｃ） 日本脳炎を予防するための処置において使用するための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイ。
（Ｄ） 日本脳炎に対する免疫を付与するための処置において使用するための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイ。
（Ｅ） 日本脳炎予防剤の製造のための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイの使用。
（Ｆ） 日本脳炎ワクチン剤の製造のための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイの使用。
（Ｂ） シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを、対象に投与することを含む、日本脳炎に対する免疫を付与する方法。
（Ｃ） 日本脳炎を予防するための処置において使用するための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイ。
（Ｄ） 日本脳炎に対する免疫を付与するための処置において使用するための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイ。
（Ｅ） 日本脳炎予防剤の製造のための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイの使用。
（Ｆ） 日本脳炎ワクチン剤の製造のための、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイの使用。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、皮下注射日本脳炎ワクチンの投与量よりも低い投与量、または皮下注射日本脳炎ワクチンの投与回数よりも少ない投与回数であっても、ヒトに対して十分な免疫を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において、「不活化日本脳炎ウイルスを含む」とは、体表に穿刺する際に、日本脳炎ワクチンの効果が発揮される量の不活化日本脳炎ウイルスを含むことを意味する。「不活化日本脳炎ウイルスを含まない」とは、日本脳炎ワクチンの効果が発揮される量の不活化日本脳炎ウイルスを含んでいないことを意味し、不活化日本脳炎ウイルスの量の範囲が、不活化日本脳炎ウイルスを全く含まない場合から、効果が発揮されない量までの範囲を含む。
本明細書において，製剤中の不活化日本脳炎ウイルスの量は，タンパク質含量として含有する量を意味する。
本明細書において、「不活化日本脳炎ウイルスを含む」とは、体表に穿刺する際に、日本脳炎ワクチンの効果が発揮される量の不活化日本脳炎ウイルスを含むことを意味する。「不活化日本脳炎ウイルスを含まない」とは、日本脳炎ワクチンの効果が発揮される量の不活化日本脳炎ウイルスを含んでいないことを意味し、不活化日本脳炎ウイルスの量の範囲が、不活化日本脳炎ウイルスを全く含まない場合から、効果が発揮されない量までの範囲を含む。
本明細書において，製剤中の不活化日本脳炎ウイルスの量は，タンパク質含量として含有する量を意味する。
【0016】
本発明は、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイを含む、日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤に関する。
【0017】
本発明によれば、皮下注射日本脳炎ワクチンに比べて、不活化日本脳炎ウイルスの初回免疫における投与回数を低減させることができ、不活化日本脳炎ウイルスの１回当たりの用量を減らすことができ、さらに皮下注射と比べて同等以上の中和抗体価が得られる。
【0018】
日本脳炎予防剤とは、日本脳炎の予防のために使用される医薬を意味する。
日本脳炎ワクチン剤とは、不活化日本脳炎ウイルスを有効成分であるワクチンとして含み、日本脳炎に対する免疫を付与するために使用される医薬を意味する。
日本脳炎ワクチン剤とは、不活化日本脳炎ウイルスを有効成分であるワクチンとして含み、日本脳炎に対する免疫を付与するために使用される医薬を意味する。
【0019】
[日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤の投与]
本発明の日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤を、ヒトを対象にして投与する場合には、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～２．５μｇ／回の用量で投与することが好ましく、０．０１μｇ～２μｇ／回の用量で投与することがより好ましく、０．０１μｇ～１μｇ／回の用量で投与することがさらに好ましい。
本発明の日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤を、ヒトを対象にして投与する場合には、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～２．５μｇ／回の用量で投与することが好ましく、０．０１μｇ～２μｇ／回の用量で投与することがより好ましく、０．０１μｇ～１μｇ／回の用量で投与することがさらに好ましい。
【0020】
本発明の日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤の投与回数は、特に限定されないが、好ましくは１回又は２回である。
本発明の日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤を、ヒトを対象にして投与する場合には、例えば、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で２回投与すること、または不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で１回又は２回投与することが好ましい。
本発明の日本脳炎予防剤及び日本脳炎ワクチン剤を、ヒトを対象にして投与する場合には、例えば、不活化日本脳炎ウイルスを０．０１μｇ～０．２２μｇ／回の用量で２回投与すること、または不活化日本脳炎ウイルスを０．２３μｇ～１μｇ／回の用量で１回又は２回投与することが好ましい。
【0021】
本発明の日本脳炎予防剤又は日本脳炎ワクチン剤を用いた場合、初回投与２週間後の中和抗体価が、１．０以上であることが好ましく、１．１以上であることがより好ましく、１．２以上であることがさらに好ましい。初回投与２週間後の中和抗体価は、１．５以上、１．８以上、２．０以上、または２．４以上でもよい。
本発明の日本脳炎予防剤又は日本脳炎ワクチン剤は、初回投与２週間後の中和抗体価が１．０以上（あるいは１．１以上、１．２以上、１．５以上、１．８以上、２．０以上、または２．４以上でもよい）となるような、用量で用いることができる。中和抗体価とは、以下の方法により測定したものである。日本脳炎予防剤又は日本脳炎ワクチン剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させる。反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養する。上記培養の際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
本発明の日本脳炎予防剤又は日本脳炎ワクチン剤は、初回投与２週間後の中和抗体価が１．０以上（あるいは１．１以上、１．２以上、１．５以上、１．８以上、２．０以上、または２．４以上でもよい）となるような、用量で用いることができる。中和抗体価とは、以下の方法により測定したものである。日本脳炎予防剤又は日本脳炎ワクチン剤の投与から２週間後の対象から採取した血清を段階的に希釈することにより得た２０μＬの血清サンプルと、８０ｐｆｕの日本脳炎ウイルスとを、３７℃及び５％ＣＯ２下において１．５時間反応させる。反応後の混合液２５μＬを、２．０×１０４ｃｅｌｌｓのＶｅｒｏ細胞に感染させて３７℃及び５％ＣＯ２下において６日間培養する。上記培養の際に、日本脳炎ウイルスによる細胞変性効果を５０％以上抑制した血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とする。
【0022】
[マイクロニードルアレイの構成]
本発明におけるマイクロニードルアレイは、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持している。本発明において複数とは、１つ以上のことを意味する。
本発明におけるマイクロニードルアレイは、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持している。本発明において複数とは、１つ以上のことを意味する。
【0023】
マイクロニードルアレイは、シート部の上面側に、複数の針部がアレイ状に配置されている。針部はシート部の上面側に配置されていることが好ましい。針部はシート部の上面に直接配置されていてもよいし、または針部はシート部の上面に配置された部材（好ましくは錐台部の形状を有する部材）の上面に配置されていてもよい。
【0024】
マイクロニードルアレイとしては、以下の態様が挙げられる。
第一の態様では、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包し、針部が皮膚に挿入された際に、針部が溶解して不活化日本脳炎ウイルスを皮膚内に投与することができる（以下、自己溶解型マイクロニードルアレイと呼ぶことがある）。
第二の態様では、針部の表面に塗布または担持された不活化日本脳炎ウイルスを有し、針部が皮膚に挿入された際に、針部は生体内で溶解せず、針部の表面にある不活化日本脳炎ウイルスを皮膚内に投与することができる（以下、塗布型マイクロニードルアレイと呼ぶことがある）。
好ましくは、マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している。
第一の態様では、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包し、針部が皮膚に挿入された際に、針部が溶解して不活化日本脳炎ウイルスを皮膚内に投与することができる（以下、自己溶解型マイクロニードルアレイと呼ぶことがある）。
第二の態様では、針部の表面に塗布または担持された不活化日本脳炎ウイルスを有し、針部が皮膚に挿入された際に、針部は生体内で溶解せず、針部の表面にある不活化日本脳炎ウイルスを皮膚内に投与することができる（以下、塗布型マイクロニードルアレイと呼ぶことがある）。
好ましくは、マイクロニードルアレイが自己溶解型であり、針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包している。
【0025】
[自己溶解型マイクロニードルアレイ]
針部の高さ（長さ）は、針部の先端から、錐台部またはシート部（錐台部が存在しない場合）へ下ろした垂線の長さで表す。針部の高さ（長さ）は特に限定されないが、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上１５００μｍ以下であり、さらに好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下である。針部の長さが５０μｍ以上であれば不活化日本脳炎ウイルスの経皮投与を行うことができ、また針部の長さが３０００μｍ以下とすることで針部が神経に接触することによる痛みの発生を防止し、また出血を回避できるため好ましい。
針部の高さ（長さ）は、針部の先端から、錐台部またはシート部（錐台部が存在しない場合）へ下ろした垂線の長さで表す。針部の高さ（長さ）は特に限定されないが、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上１５００μｍ以下であり、さらに好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下である。針部の長さが５０μｍ以上であれば不活化日本脳炎ウイルスの経皮投与を行うことができ、また針部の長さが３０００μｍ以下とすることで針部が神経に接触することによる痛みの発生を防止し、また出血を回避できるため好ましい。
【0026】
針部は、１つのマイクロニードルアレイにあたり１～２０００本配置されることが好ましく、３～１０００本配置されることがより好ましく、５～５００本配置されることがさらに好ましい。１つのマイクロニードルアレイあたり２本の針部を含む場合、針部の間隔は、針部の先端から錐台部またはシート部（錐台部が存在しない場合）へ下ろした垂線の足の間の距離で表す。１つのマイクロニードルあたり３本以上の針部を含む場合、配列される針部の間隔は、全ての針部においてそれぞれ最も近接した針部に対して先端から錐台部またはシート部（錐台部が存在しない場合）へ下ろした垂線の足の間の距離を求め、その平均値で表す。針部の間隔は、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
【0027】
針部は不活化日本脳炎ウイルスを含有する。針部は、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種をさらに含むことが好ましく、電気的に中性である水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種をさらに含むことがより好ましい。針部は必要に応じて界面活性剤（好ましくは電気的に中性である界面活性剤）を含む。
【0028】
針部は、不活化日本脳炎ウイルスを含有する。例えば、日本脳炎ウイルスをVero細胞（アフリカミドリザル腎臓由来株化細胞）の培養液から調製したホルマリン不活化ウイルス調製物、日本脳炎ウイルスに感染したマウスの脳から調製したホルマリン不活化ウイルス調製物などを使用することができる。
【0029】
針部全体における不活化日本脳炎ウイルスの含有量は、特に限定されないが、質量％として針部の固形分質量に対して、好ましくは０．０００１～１０質量％であり、より好ましくは０．０００１～１質量％であり、特に好ましくは０．０００１～０．５質量％である。
【0030】
針部全体における不活化日本脳炎ウイルスの含有量は、本発明の用量用法に適合するようにマイクロニードルアレイ１枚あたりの不活化日本脳炎ウイルスの含有量を調整すればよい。マイクロニードルアレイ１枚あたりの不活化日本脳炎ウイルスの含有量として、特に限定されないが、タンパク質含量として、好ましくは０．０１～２．５μｇであり、より好ましくは０．０１～２μｇである。
【0031】
針部は、界面活性剤（好ましくは電気的に中性である界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤）を含むことが好ましい。界面活性剤として、例えば、ショ糖脂肪酸エステルなどの糖アルコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレン共重合ポリマー、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、オクチルフェノールエトキシレートなどが挙げられる。上記の中でも、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレン共重合ポリマー、またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が特に好ましい。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８、ＨＣＯ－６０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘなどの市販品を使用することもできる。
【0032】
界面活性剤の添加量は、特に限定されないが、マイクロニードルアレイ１枚（面積は１ｃｍ２）あたり０．０１μｇ以上であることが好ましく、０．１μｇ以上であることがより好ましい。
【0033】
針部に含まれる水溶性高分子としては、特に限定されないが、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールを挙げることができる。上記の多糖類としては、例えば、プルラン、デキストラン、デキストリン、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの、セルロースを部分的に変性した水溶性セルロース誘導体）、ヒドロキシエチルデンプン、アラビアゴムなどが挙げられる。上記の成分は、１種単独で用いてもよいし、２種以上の混合物として用いてもよい。針部が皮膚内に残留しても人体に支障が生じないように、水溶性高分子は生体内で溶解できる物質（生体溶解性物質）であることが好ましい。
【0034】
上記の中でも、針部に含まれる水溶性高分子は、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びポリビニルアルコールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、ヒドロキシエチルデンプンが特に好ましい。更に、不活化日本脳炎ウイルスとの混合時に凝集しにくくするため、電荷を持たない多糖類がより好ましい。針部に含まれる水溶性高分子は、シート部に含まれる水溶性高分子と同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【0035】
針部に含まれる水溶性高分子の重量（質量）平均分子量は５０００以上１００，０００以下であることが好ましく、１０,０００以上１００，０００以下であることがより好ましく、３０,０００以上９０，０００以下であることがさらに好ましい。
【0036】
針部（特に、針部先端領域）には、二糖類を含んでもよく、二糖類としては、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハースまたはセロビオースなどが挙げられ、特にスクロースが好ましい。
【0037】
針部の全固形分は、５０質量％以上が水溶性高分子または二糖類であることが好ましい。針部の全固形分は、５５質量％以上がより好ましく、６０質量％以上がさらに好ましく、６５質量％以上が特に好ましい。
上限は、特に限定されないが、針部の全固形分の９９質量％以下が水溶性高分子または二糖類であることが好ましく、針部の全固形分の９５質量％以下が水溶性高分子または二糖類であることがより好ましく、針部の全固形分の９０質量％以下が水溶性高分子または二糖類であることがさらに好ましい。
針部の全固形分の５０質量％以上が水溶性高分子または二糖類である場合、良好な穿刺性及び良好な薬効を達成することができる。
上限は、特に限定されないが、針部の全固形分の９９質量％以下が水溶性高分子または二糖類であることが好ましく、針部の全固形分の９５質量％以下が水溶性高分子または二糖類であることがより好ましく、針部の全固形分の９０質量％以下が水溶性高分子または二糖類であることがさらに好ましい。
針部の全固形分の５０質量％以上が水溶性高分子または二糖類である場合、良好な穿刺性及び良好な薬効を達成することができる。
【0038】
針部の全固形分における水溶性高分子または二糖類の比率は、以下の方法により測定することができるが、特に限定されない。測定方法としては、たとえば、作製したマイクロニードルアレイの針部を切断し、針部を緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）など、針部を構成する水溶性高分子を溶解するのに適した緩衝液）中に溶解させ、溶液中の水溶性高分子または二糖類の量を高速液体クロマトグラフィー法にて測定することができる。
【0039】
シート部は針部を支持するための土台である。シート部は図１～図８に示すシート部１１６のような平面状の形状を有する。シート部の上面とは、面上に複数の針部がアレイ状に配置された面を指す。
シート部の面積は、特に限定されないが、０．００５～１０００ｍｍ２であることが好ましく、０．０５～５００ｍｍ２であることがより好ましく、０．１～４００ｍｍ２であることがさらに好ましい。
シート部の面積は、特に限定されないが、０．００５～１０００ｍｍ２であることが好ましく、０．０５～５００ｍｍ２であることがより好ましく、０．１～４００ｍｍ２であることがさらに好ましい。
【0040】
シート部の厚さは、錐台部または針部と接している面と、反対側の面の間の距離で表す。シート部の厚さは、１μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましく、３μｍ以上１５００μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。
【0041】
シート部は、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含むことが好ましく、電気的に中性である水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含むことがより好ましい。シート部には、それ以外の添加物（例えば、電荷を有する水溶性高分子など）を含んでいてもよい。なお、シート部には不活化日本脳炎ウイルスを含まないことが好ましい。
【0042】
シート部に含まれる水溶性高分子は、特に限定されないが、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールを挙げることができる。上記多糖類は、例えば、プルラン、デキストラン、デキストリン、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの、セルロースを部分的に変性した水溶性セルロース誘導体）、ヒドロキシエチルデンプン、アラビアゴムなどが挙げられる。上記成分は、１種単独で用いてもよいし、２種以上の混合物として用いてもよい。
【0043】
上記の中でも、シート部に含まれる水溶性高分子として、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びポリビニルアルコールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、ヒドロキシエチルデンプンが特に好ましい。
【0044】
シート部に含まれる水溶性高分子の重量（質量）平均分子量は５０００以上１００，０００以下であることが好ましく、１０,０００以上１００，０００以下であることがより好ましく、３０,０００以上９０，０００以下であることがさらに好ましい。
【0045】
シート部は二糖類を含有してもよい。二糖類は、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハースまたはセロビオースなどが挙げられ、特にスクロースが好ましい。
【0046】
特に好ましくは、針部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含み、シート部が、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む、マイクロニードルアレイを使用することができる。
【0047】
マイクロニードルアレイは、シート部の上面側に、アレイ状に配置された複数の針部から構成される。針部は、先端を有する凸状構造物であって、鋭い先端を有する針形状に限定されるものではなく、先端は先の尖っていない形状でもよい。
針部の形状は、特に限定されず、円錐状、多角錐状（四角錐状など）、または紡錘状などが挙げられる。例えば、図１～図８に示す針部１１２のような形状を有し、針部の全体の形状が、円錐状または多角錐状（四角錐状など）であってもよいし、針部側面の傾き（角度）を連続的に変化させた構造であってもよい。また、針部側面の傾き（角度）が非連続的に変化する、二層またはそれ以上の多層構造をとることもできる。
マイクロニードルアレイを皮膚に適用した場合、針部が皮膚に挿入され、シート部の上面またはその一部が皮膚に接するようになることが好ましい。
針部の形状は、特に限定されず、円錐状、多角錐状（四角錐状など）、または紡錘状などが挙げられる。例えば、図１～図８に示す針部１１２のような形状を有し、針部の全体の形状が、円錐状または多角錐状（四角錐状など）であってもよいし、針部側面の傾き（角度）を連続的に変化させた構造であってもよい。また、針部側面の傾き（角度）が非連続的に変化する、二層またはそれ以上の多層構造をとることもできる。
マイクロニードルアレイを皮膚に適用した場合、針部が皮膚に挿入され、シート部の上面またはその一部が皮膚に接するようになることが好ましい。
【0048】
シート部と複数の針部との間に複数の錐台部とを有する場合、針部はシート部の上面に配置された錐台部の上面に配置されている。この態様では、針部の先端領域は水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種および不活化日本脳炎ウイルスを含み、錐台部及びシート部は水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含むことが好ましい。針部およびシート部に含まれる水溶性高分子は同一でも、異なるものでもよい。
【0049】
錐台部（ただし、錐台部が存在しない場合には針部）とシート部の界面を基底部と呼ぶ。１つの針部の基底における最も遠い点間の距離が、５０μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１５００μｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。
【0050】
[塗布型マイクロニードルアレイ]
塗布型マイクロニードルアレイにおいて、針部の高さ（長さ）、針部の本数、針部の間隔、針部全体における不活化日本脳炎ウイルスの含有量、マイクロニードルアレイ１枚あたりの不活化日本脳炎ウイルスの含有量、シート部の面積、シート部の厚さ、針部の形状、錐台部の有無などは、自己溶解型マイクロニードルアレイと同様に設定できる。
塗布型マイクロニードルアレイにおいて、針部の高さ（長さ）、針部の本数、針部の間隔、針部全体における不活化日本脳炎ウイルスの含有量、マイクロニードルアレイ１枚あたりの不活化日本脳炎ウイルスの含有量、シート部の面積、シート部の厚さ、針部の形状、錐台部の有無などは、自己溶解型マイクロニードルアレイと同様に設定できる。
【0051】
塗布型マイクロニードルアレイの針部およびシート部の材料として、自己溶解型マイクロニードルアレイと同一の材料を用いることもできるが、無機材料および樹脂材料の少なくとも一つから構成されるのが好ましい。無機材料として、シリコン、二酸化ケイ素、セラミック、ステンレス鋼、鉄、アルミニウム、チタン、ニッケル、モリブデン、クロム、コバルト、銅、鉛、ニオブ、タンタル、ジルコニウム、錫、金、銀などの金属、およびそれらの合金が挙げられる。また、樹脂材料として、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸－ｃｏ－ポリグリコリド、プルラン、カプロノラクトン、ポリウレタン、ポリ無水物などの生分解性ポリマー； ポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）などの非分解性ポリマーなどが挙げられる。
【0052】
針部の表面に不活化日本脳炎ウイルスを薄く塗布できるように、表面が濡れやすくする表面処理が施されてもよい。濡れ性を高くする処理は、例えば、表面を粗くする処理、プラズマ処理などが挙げられる。
【0053】
［マイクロニードルアレイの好ましい形態］
以下、添付の図面に従って、本発明の好ましい形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
以下、添付の図面に従って、本発明の好ましい形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
【0054】
図１～図８は、マイクロニードルアレイの一部拡大図であるマイクロニードル１１０を示している。マイクロニードルアレイは、シート部１１６の表面に複数個の針部１１２が形成されることで、構成される（図においては、シート部１１６上に１つの針部１１２のみ、あるいは１つの錘台部１１３と１つの針部１１２を表示し、これをマイクロニードル１１０と称する）。針部１１２は、シート部１１６の表面から針部１１２へ向かって細くなるように形成されている。針部１１２は、頂部方向へ全体として細くなるように突出していればその形状は限定されず、例えば、角数の異なる他の角錐や、円錐で形成されてもよい。
【0055】
図１Ａにおいて、針部１１２は円錐状の形状を有し、図１Ｂにおいて、針部１１２は四角錐状の形状を有している。図１Ｃにおいて、Ｈは針部１１２の高さを、Ｗは針部１１２の直径（幅）を、Ｔはシート部１１６の高さ（厚み）を示す。
【0056】
図２及び図３は、シート部１１６の表面に、錐台部１１３及び針部１１２が形成された別の形状を有するマイクロニードル１１０を示している。図２において、錐台部１１３は、円錐台の形状を有し、針部１１２は円錐の形状を有している。また、図３において、錐台部１１３は、四角錐台の形状を有し、針部１１２は四角錐の形状を有している。ただし、針部の形状は、これらの形状に限定されるものではない。
【0057】
【0058】
マイクロニードルアレイは、図１Ｃのマイクロニードル１１０の形状より、図４のマイクロニードル１１０の形状とすることが好ましい。このような構造をとることで、針部全体の体積が大きくなり、マイクロニードルアレイの製造時において、より多くの不活化日本脳炎ウイルスを針部の上端に集中させることができる。
【0059】
【0060】
図５に示される針部第１層１１２Ａは円錐状の形状を有し、針部第２層１１２Ｂは円柱状の形状を有している。図６に示される針部第１層１１２Ａは四角錐状の形状を有し、針部第２層１１２Ｂは四角柱状の形状を有している。ただし、針部の形状は、これらの形状に限定されるものではない。
【0061】
針部１１２の頂部の先端の形状は、皮膚を穿刺して角質層に貫通孔を設けることが可能であれば特に限定されない。針部１１２の頂部２１は、完全な頂点でなくてもよく、皮膚を穿刺可能な程度の曲面または平面を有してもよい。
【0062】
【0063】
【0064】
マイクロニードルアレイにおいて、針部は、横列について１ｍｍ当たり約０．１～１０本の間隔で配置されていることが好ましい。マイクロニードルアレイは、１ｃｍ２当たり１～１００００本のマイクロニードルを有することがより好ましい。マイクロニードルの密度を１本／ｃｍ２以上とすることにより効率良く皮膚を穿孔することができ、またマイクロニードルの密度を１００００本／ｃｍ２以下とすることにより、マイクロニードルアレイが十分に穿刺することが可能になる。針部の密度は、好ましくは１０～５０００本／ｃｍ２であり、さらに好ましくは２５～１０００本／ｃｍ２であり、特に好ましくは２５～４００本／ｃｍ２である。
【0065】
マイクロニードルアレイは、乾燥剤と一緒に密閉保存されている形態で供給することができる。乾燥剤としては、公知の乾燥剤（例えば、シリカゲル、生石灰、塩化カルシウム、シリカアルミナ、シート状乾燥剤など）を使用することができる。
【0066】
[自己溶解型マイクロニードルアレイの製造方法]
自己溶解型マイクロニードルアレイは、例えば、特開２０１３－１５３８６６号公報または国際公開ＷＯ２０１４／０７７２４２号公報に記載の方法に準じて以下の方法により製造することができる。
自己溶解型マイクロニードルアレイは、例えば、特開２０１３－１５３８６６号公報または国際公開ＷＯ２０１４／０７７２４２号公報に記載の方法に準じて以下の方法により製造することができる。
【0067】
自己溶解型マイクロニードルアレイの製造方法としては、特に限定されないが、（１）モールドの製造工程、（２）水溶性高分子および二糖類の少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を調製する工程、（３）（２）で得た溶液をモールドに充填し、針部先端領域を形成する工程、（４）水溶性高分子および二糖類の少なくとも一種を含む溶液をモールドに充填し、針部の残部、（所望により錐台部）、及びシート部を形成する工程、（５）モールドから剥離する工程、を含む製造方法によって得ることが好ましい。
【0068】
【0069】
１番目の方法は、Ｓｉ基板上にフォトレジストを塗布した後、露光、現像を行う。そして、ＲＩＥ（リアクティブイオンエッチング）などによるエッチングを行うことにより、原版１１の表面に円錐の形状部（凸部）１２のアレイを作製する。尚、原版１１の表面に円錐の形状部を形成するようにＲＩＥなどのエッチングを行う際には、Ｓｉ基板を回転させながら斜め方向からのエッチングを行うことにより、円錐の形状を形成することが可能である。２番目の方法は、Ｎｉなどの金属基板に、ダイヤモンドバイトなどの切削工具を用いた加工により、原版１１の表面に四角錘などの形状部１２のアレイを形成する方法がある。
【0070】
次に、モールドの作製を行う。具体的には、図９Ｂに示すように、原版１１よりモールド１３を作製する。方法としては以下の４つの方法が考えられる。
１番目の方法は、原版１１にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン、例えば、ダウコーニング社製のシルガード１８４（登録商標））に硬化剤を添加したシリコーン樹脂を流し込み、１００℃で加熱処理し硬化した後に、原版１１より剥離する方法である。２番目の方法は、紫外線を照射することにより硬化するＵＶ(Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ)硬化樹脂を原版１１に流し込み、窒素雰囲気中で紫外線を照射した後に、原版１１より剥離する方法である。３番目の方法は、ポリスチレンやＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）などのプラスチック樹脂を有機溶剤に溶解させた溶液を剥離剤の塗布された原版１１に流し込み、乾燥させることにより有機溶剤を揮発させて硬化させた後に、原版１１より剥離する方法である。４番目の方法は、Ｎｉ電鋳により反転品を作成する方法である。
１番目の方法は、原版１１にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン、例えば、ダウコーニング社製のシルガード１８４（登録商標））に硬化剤を添加したシリコーン樹脂を流し込み、１００℃で加熱処理し硬化した後に、原版１１より剥離する方法である。２番目の方法は、紫外線を照射することにより硬化するＵＶ(Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ)硬化樹脂を原版１１に流し込み、窒素雰囲気中で紫外線を照射した後に、原版１１より剥離する方法である。３番目の方法は、ポリスチレンやＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）などのプラスチック樹脂を有機溶剤に溶解させた溶液を剥離剤の塗布された原版１１に流し込み、乾燥させることにより有機溶剤を揮発させて硬化させた後に、原版１１より剥離する方法である。４番目の方法は、Ｎｉ電鋳により反転品を作成する方法である。
【0071】
これにより、原版１１の円錐形または角錐形の反転形状である針状凹部１５が２次元配列で配列されたモールド１３が作製される。このようにして作製されたモールド１３を図９Ｃに示す。
【0072】
図１０は他の好ましいモールド１３の態様を示したものである。針状凹部１５は、モールド１３の表面から深さ方向に狭くなるテーパ状の入口部１５Ａと、深さ方向に先細りの先端凹部１５Ｂとを備えている。入口部１５Ａをテーパ形状とすることで、溶液を針状凹部１５に充填しやすくなる。
【0073】
図１１は、マイクロニードルアレイの製造を行う上で、より好ましいモールド複合体１８の態様を示したものである。図１１中、（Ａ）部はモールド複合体１８を示す。図１１中、（Ｂ）部は、（Ａ）部のうち、円で囲まれた部分の拡大図である。
【0074】
図１１の（Ａ）部に示すように、モールド複合体１８は、針状凹部１５の先端（底）に空気抜き孔１５Ｃが形成されたモールド１３、及び、モールド１３の裏面に貼り合わされ、気体は透過するが液体は透過しない材料で形成された気体透過シート１９と、を備える。空気抜き孔１５Ｃは、モールド１３の裏面を貫通する貫通孔として形成される。ここで、モールド１３の裏面とは、空気抜き孔１５Ｃが形成された側の面を言う。これにより、針状凹部１５の先端は空気抜き孔１５Ｃ、及び気体透過シート１９を介して大気と連通する。
このようなモールド複合体１８を使用することで、針状凹部１５に充填される溶液は透過せず、針状凹部１５に存在する空気のみを針状凹部１５から追い出すことができる。これにより、針状凹部１５の形状を高分子に転写する転写性が良くなり、よりシャープな針部を形成することができる。
このようなモールド複合体１８を使用することで、針状凹部１５に充填される溶液は透過せず、針状凹部１５に存在する空気のみを針状凹部１５から追い出すことができる。これにより、針状凹部１５の形状を高分子に転写する転写性が良くなり、よりシャープな針部を形成することができる。
【0075】
空気抜き孔１５Ｃの径Ｄ（直径）としては、１～５０μｍの範囲が好ましい。空気抜き孔１５Ｃの径Ｄが１μｍ未満の場合、空気抜き孔としての役目を十分に果たせない。また、空気抜き孔１５Ｃの径Ｄが５０μｍを超える場合、成形されたマイクロニードルの先端部のシャープ性が損なわれる。
【0076】
気体は透過するが液体は透過しない材料で形成された気体透過シート１９としては、例えば気体透過性フィルム（住友電気工業社製、ポアフロン（登録商標）、ＦＰ－０１０）を好適に使用できる。
【0077】
モールド１３に用いる材料としては、弾性素材または金属製素材を用いることができ、弾性素材が好ましく、気体透過性の高い素材が更に好ましい。気体透過性の代表である酸素透過性は、１×１０－１２（ｍＬ／ｓ・ｍ２・Ｐａ）以上が好ましく、１×１０－１０（ｍＬ／ｓ・ｍ２・Ｐａ）以上がさらに好ましい。なお、１ｍＬは、１０－６ ｍ３である。気体透過性を上記範囲とすることにより、モールド１３の凹部に存在する空気を型側から追い出すことができ、欠陥の少ないマイクロニードルアレイを製造することができる。このような材料として、具体的には、シリコーン樹脂（例えば、ダウコーニング社製のシルガード１８４（登録商標）、信越化学工業株式会社のＫＥ－１３１０ＳＴ（品番））、紫外線硬化樹脂、プラスチック樹脂（例えば、ポリスチレン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート））を溶融、または溶剤に溶解させたものなどを挙げることができる。これらの中でもシリコーンゴム系の素材は、繰り返し加圧による転写に耐久性があり、かつ素材との剥離性がよいため好ましい。また、金属製素材としては、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｉｒ、Ｔｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、ＭｇＯ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ、Ｖ、Ｎｂ、Ｔａ、α－酸化アルミニウム，酸化ジルコニウム、ステンレス（例えば、ボーラー・ウッデホルム社（Bohler-Uddeholm KK）のスタバックス材(STAVAX)（商標））などやその合金を挙げることができる。枠１４の材質としては、モールド１３の材質と同様の材質のものを用いることができる。
【0078】
（溶液）
本発明においては、
（ｉ）針部の一部である針部先端領域を形成するための、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含む容液、並びに、
（ｉｉ）針部のうちの針部先端領域以外の針部根元領域とシート部（または針部のうちの針部先端領域以外の針部根元領域と、錐台部と、シート部）とを形成するための、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液、
を準備することが好ましい。
本発明においては、
（ｉ）針部の一部である針部先端領域を形成するための、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルス、および界面活性剤を含む容液、並びに、
（ｉｉ）針部のうちの針部先端領域以外の針部根元領域とシート部（または針部のうちの針部先端領域以外の針部根元領域と、錐台部と、シート部）とを形成するための、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液、
を準備することが好ましい。
【0079】
水溶性高分子、二糖類、および界面活性剤の種類は、本明細書上記した通りである。
上記溶液中の、水溶性高分子または二糖類の濃度は、使用する物質の種類によっても異なるが、一般的には１～５０質量％であることが好ましい。また、溶解に用いる溶媒は、水以外であっても揮発性を有するものであればよく、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、アルコールなどを用いることができる。
上記溶液中の、水溶性高分子または二糖類の濃度は、使用する物質の種類によっても異なるが、一般的には１～５０質量％であることが好ましい。また、溶解に用いる溶媒は、水以外であっても揮発性を有するものであればよく、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、アルコールなどを用いることができる。
【0080】
（針部先端領域の形成）
図１２Ａに示すように、２次元配列された針状凹部１５を有するモールド１３が、基台２０の上に配置される。モールド１３には、５×５の２次元配列された、２組の複数の針状凹部１５が形成されている。不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を収容するタンク３０、タンクに接続される配管３２、及び、配管３２の先端に接続されたノズル３４、を有する液供給装置３６が準備される。なお、本例では、針状凹部１５が５×５で２次元配列されている場合を例示しているが、針状凹部１５の個数は５×５に限定されるものではなく、Ｍ×Ｎ（Ｍ及びＮはそれぞれ独立に１以上の任意の整数を示し、好ましくは２～３０、より好ましくは３～２５、さらに好ましくは３～２０である）で２次元配列されていればよい。
図１２Ａに示すように、２次元配列された針状凹部１５を有するモールド１３が、基台２０の上に配置される。モールド１３には、５×５の２次元配列された、２組の複数の針状凹部１５が形成されている。不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を収容するタンク３０、タンクに接続される配管３２、及び、配管３２の先端に接続されたノズル３４、を有する液供給装置３６が準備される。なお、本例では、針状凹部１５が５×５で２次元配列されている場合を例示しているが、針状凹部１５の個数は５×５に限定されるものではなく、Ｍ×Ｎ（Ｍ及びＮはそれぞれ独立に１以上の任意の整数を示し、好ましくは２～３０、より好ましくは３～２５、さらに好ましくは３～２０である）で２次元配列されていればよい。
【0081】
図１３はノズルの先端部の概略斜視図を示している。図１３に示すように、ノズル３４の先端には平坦面であるリップ部３４Ａ及びスリット形状の開口部３４Ｂを備えている。スリット形状の開口部３４Ｂにより、例えば、１列を構成する複数の針状凹部１５に同時に、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を充填することが可能となる。開口部３４Ｂの大きさ（長さと幅）は、一度に充填すべき針状凹部１５の数に応じて適宜選択される。開口部３４Ｂの長さを長くすることで、より多くの針状凹部１５に一度に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を充填することができる。これにより、生産性を向上させることが可能となる。
【0082】
ノズル３４に用いる材料としては、弾性素材または金属製素材を用いることができる。例えば、テフロン（登録商標）、ステンレス鋼（ＳＵＳ(Steel Use Stainless)）、チタンなどが挙げられる。
【0083】
図１２Ｂに示すように、ノズル３４の開口部３４Ｂが針状凹部１５の上に位置調整される。ノズル３４のリップ部３４Ａとモールド１３の表面とは接触している。液供給装置３６から不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２がモールド１３に供給され、ノズル３４の開口部３４Ｂから不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が針状凹部１５に充填される。本実施形態では、１列を構成する複数の針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が同時に充填される。ただし、これに限定されず、針状凹部１５に一つずつ充填するようにすることもできる。
【0084】
モールド１３が気体透過性を有する素材で構成される場合、モールド１３の裏面から吸引することで不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を吸引でき、針状凹部１５内への不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２の充填を促進させることができる。
【0085】
図１２Ｂを参照して充填工程に次いで、図１２Ｃに示すように、ノズル３４のリップ部３４Ａとモールド１３の表面とを接触させながら、開口部３４Ｂの長さ方向と垂直方向に液供給装置３６を相対的に移動し、ノズル３４を、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が充填されていない針状凹部１５に移動する。ノズル３４の開口部３４Ｂが針状凹部１５の上に位置調整される。本実施の形態では、ノズル３４を移動させる例で説明したが、モールド１３を移動させてもよい。
【0086】
ノズル３４のリップ部３４Ａとモールド１３の表面とを接触させて移動しているので、ノズル３４がモールド１３の針状凹部１５以外の表面に残る不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を掻き取ることができる。不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２をモールド１３の針状凹部１５以外に残らないようにすることができる。
【0087】
モールド１３へのダメージを減らすことと、モールド１３の圧縮による変形をできるだけ抑制するため、移動する際のノズル３４のモールド１３への押付け圧はできる限り小さい方が好ましい。また、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２がモールド１３の針状凹部１５以外に残らないようにするため、モールド１３もしくはノズル３４の少なくとも一方がフレキシブルな弾性変形する素材であることが望ましい。
【0088】
図１２Ｂの充填工程と、図１２Ｃの移動工程とを繰り返すことで、５×５の２次元配列された針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が充填される。５×５の２次元配列された針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が充填されると、隣接する５×５の２次元配列された針状凹部１５に液供給装置３６を移動し、図１２Ｂの充填工程と、図１２Ｃの移動工程とを繰り返す。隣接する５×５の２次元配列された針状凹部１５にも不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が充填される。
【0089】
上述の充填工程と移動工程について、（１）ノズル３４を移動しながら不活化日本脳炎ウイルスを含む水溶液２２を針状凹部１５に充填する態様でもよいし、（２）ノズル３４の移動中に針状凹部１５の上でノズル３４を一旦静止して不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を充填し、充填後にノズル３４を再度移動させる態様でもよい。充填工程と移動工程との間、ノズル３４のリップ部３４Ａがモールド１３の表面に接触している。
【0090】
図１４は、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を針状凹部１５に充填中におけるノズル３４の先端とモールド１３との部分拡大図である。図１５に示すように、ノズル３４内に加圧力Ｐ１を加えることで、針状凹部１５内へ不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を充填するのを促進することができる。さらに、針状凹部１５内へ不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を充填する際、ノズル３４をモールド１３の表面に接触させる押付け力Ｐ２を、ノズル３４内の加圧力Ｐ１以上とすることが好ましい。押付け力Ｐ２≧加圧力Ｐ１とすることにより、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２が針状凹部１５からモールド１３の表面に漏れ出すのを抑制することができる。
【0091】
図１５は、ノズル３４の移動中における、ノズル３４の先端とモールド１３との部分拡大図である。ノズル３４をモールド１３に対して相対的に移動する際、ノズル３４をモールド１３の表面に接触させる押付け力Ｐ３を、充填中のノズル３４をモールド１３の表面に接触させる押付け力Ｐ２より小さくすることが好ましい。モールド１３へのダメージを減らし、モールド１３の圧縮による変形を抑制するためである。
【0092】
５×５で構成される複数の針状凹部１５への充填が完了すると、ノズル３４は、隣接する５×５で構成される複数の針状凹部１５へ移動される。液供給に関して、隣接する５×５で構成される複数の針状凹部１５へ移動する際、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２の供給を停止するのが好ましい。５列目の針状凹部１５から次の１列目の針状凹部１５までは距離がある。その間をノズル３４が移動する間、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を供給し続けると、ノズル３４内の液圧が高くなりすぎる場合がある。その結果、ノズル３４から不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２がモールド１３の針状凹部１５以外に流れ出る場合があり、これを抑制するため、ノズル３４内の液圧を検出し、液圧が高くなりすぎると判定した際には不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２の供給を停止するのが好ましい。
【0093】
なお、上記においてはノズルを有するディスペンサーを用いて不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を供給する方法を説明したが、ディスペンサーによる塗布に加えて、バー塗布、スピン塗布、スプレーなどによる塗布などを適用することもできる。
【0094】
本発明においては、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を針状凹部に供給した後、乾燥処理を実施することが好ましい。
好ましくは、マイクロニードルアレイは、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填した針部形成用モールドを、乾燥することによって針部の一部を形成する工程；及び、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液を、上記で形成された針部の一部の上面に充填して乾燥する工程によって製造することができる。
好ましくは、マイクロニードルアレイは、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填した針部形成用モールドを、乾燥することによって針部の一部を形成する工程；及び、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液を、上記で形成された針部の一部の上面に充填して乾燥する工程によって製造することができる。
【0095】
不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填した針部形成用モールドを乾燥する際の条件としては、乾燥開始後３０分から３００分間経過してから、上記溶液の含水率が２０％以下に到達する条件であることが好ましい。
特に好ましくは、上記の乾燥は、不活化日本脳炎ウイルスが失効しない温度以下に保ち、かつ乾燥開始後６０分以上経過してから、溶液の含水率が２０％以下に到達するように制御することができる。
特に好ましくは、上記の乾燥は、不活化日本脳炎ウイルスが失効しない温度以下に保ち、かつ乾燥開始後６０分以上経過してから、溶液の含水率が２０％以下に到達するように制御することができる。
【0096】
上記した乾燥速度の制御の方法としては、例えば、温度、湿度、乾燥風量、容器の使用、容器の容積及び／または形状など、乾燥を遅らすことが可能な任意の手段を取ることができる。
【0097】
乾燥は、好ましくは、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填した針部形成用モールドを、容器を被せた状態または容器に収容した状態で、行うことができる。
乾燥の際の温度は、好ましくは１～４５℃であり、より好ましくは１～４０℃である。
乾燥の際の相対湿度は、好ましくは１０～９５％であり、より好ましくは２０～９５％であり、さらに好ましくは３０～９５％である。
乾燥の際の温度は、好ましくは１～４５℃であり、より好ましくは１～４０℃である。
乾燥の際の相対湿度は、好ましくは１０～９５％であり、より好ましくは２０～９５％であり、さらに好ましくは３０～９５％である。
【0098】
（シート部の形成）
シート部を形成する工程について、いくつかの態様を説明する。
シート部を形成する工程について、第１の態様について図１６Ａから図１６Ｄを参照して説明する。モールド１３の針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２をノズル３４から充填する。次いで、図１６Ｂに示すように、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を乾燥固化させることで、針状凹部１５内に不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０が形成される。次いで、図１６Ｃに示すように、不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０が形成されたモールド１３に、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液２４をディスペンサーにより塗布する。ディスペンサーによる塗布に加えて、バー塗布、スピン塗布、スプレーなどによる塗布などを適用することができる。不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０は固化されているので、不活化日本脳炎ウイルスが、上記溶液２４に拡散するのを抑制することができる。次いで、図１７Ｄに示すように、上記溶液２４を乾燥固化させることで、複数の針部１１２、錐台部１１３及び、シート部１１６から構成されるマイクロニードルアレイ１が形成される。
シート部を形成する工程について、いくつかの態様を説明する。
シート部を形成する工程について、第１の態様について図１６Ａから図１６Ｄを参照して説明する。モールド１３の針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２をノズル３４から充填する。次いで、図１６Ｂに示すように、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を乾燥固化させることで、針状凹部１５内に不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０が形成される。次いで、図１６Ｃに示すように、不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０が形成されたモールド１３に、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液２４をディスペンサーにより塗布する。ディスペンサーによる塗布に加えて、バー塗布、スピン塗布、スプレーなどによる塗布などを適用することができる。不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０は固化されているので、不活化日本脳炎ウイルスが、上記溶液２４に拡散するのを抑制することができる。次いで、図１７Ｄに示すように、上記溶液２４を乾燥固化させることで、複数の針部１１２、錐台部１１３及び、シート部１１６から構成されるマイクロニードルアレイ１が形成される。
【0099】
第１の態様において、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２、及び水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液２４の針状凹部１５内への充填を促進させるために、モールド１３の表面からの加圧、及び、モールド１３の裏面からの減圧吸引を行うことも好ましい。
【0100】
次に、第２の態様について図１７Ａから１７Ｃを参照して説明する。図１７Ａに示すように、モールド１３の針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２をノズル３４から充填する。次いで、図１６Ｂと同様に、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２を乾燥固化させることで、不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０が針状凹部１５内に形成される。次に、図１７Ｂに示すように、別の支持体２９の上に、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液２４を塗布する。支持体２９は限定されるものではないが、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース、ガラスなどを使用することができる。次に、図１７Ｃに示すように、針状凹部１５に不活化日本脳炎ウイルスを含む層１２０が形成されたモールド１３に、支持体２９の上に形成された上記溶液２４を重ねる。これにより、上記溶液２４を針状凹部１５の内部に充填させる。不活化日本脳炎ウイルスを含む層は固化されているので、不活化日本脳炎ウイルスが、上記溶液２４に拡散するのを抑制することができる。次に、上記溶液２４を乾燥固化させることで、複数の針部１１２、錐台部１１３及びシート部１１６から構成されるマイクロニードルアレイが形成される。
【0101】
第２の態様において、水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液２４の針状凹部１５内への充填を促進させるために、モールド１３の表面からの加圧及びモールド１３の裏面からの減圧吸引を行うことも好ましい。
【0102】
水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液２４を乾燥させる方法として、溶液中の溶媒を揮発させる工程であればよい。その方法は特に限定するものではなく、例えば加熱、送風、減圧などの方法が用いられる。乾燥処理は、１～５０℃で１～７２時間の条件で行うことができる。送風の場合には、０．１～１０ｍ／秒の温風を吹き付ける方法が挙げられる。乾燥温度は、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液２２内の不活化日本脳炎ウイルスを熱劣化させない温度であることが好ましい。
【0103】
（剥離）
マイクロニードルアレイをモールド１３から剥離する方法は特に限定されない。剥離の際に針部が曲がったり折れたりしないことが好ましい。具体的には、図１８に示すように、マイクロニードルアレイの上に、粘着性の粘着層が形成されているシート状の基材４０を付着させた後、端部から基材４０をめくるように剥離を行うことができる。ただし、この方法では針部が曲がる可能性がある。そのため、図１９に示すように、マイクロニードルアレイの上の基材４０に吸盤（図示せず）を設置し、エアーで吸引しながら垂直に引き上げる方法を適用することができる。なお、基材４０として支持体２９を使用してもよい。
マイクロニードルアレイをモールド１３から剥離する方法は特に限定されない。剥離の際に針部が曲がったり折れたりしないことが好ましい。具体的には、図１８に示すように、マイクロニードルアレイの上に、粘着性の粘着層が形成されているシート状の基材４０を付着させた後、端部から基材４０をめくるように剥離を行うことができる。ただし、この方法では針部が曲がる可能性がある。そのため、図１９に示すように、マイクロニードルアレイの上の基材４０に吸盤（図示せず）を設置し、エアーで吸引しながら垂直に引き上げる方法を適用することができる。なお、基材４０として支持体２９を使用してもよい。
【0104】
図２０はモールド１３から剥離されたマイクロニードルアレイ２を示している。マイクロニードルアレイ２は、基材４０、基材４０の上に形成された針部１１２、錐台部１１３及びシート部１１６で構成される。針部１１２は、円錐形状または多角錐形状を少なくとも先端に有しているが、針部１１２はこの形状に限定されるものではない。
【0105】
[塗布型マイクロニードルアレイの製造方法]
塗布型マイクロニードルアレイの製造方法は、シート部上に針部を形成することが可能であれば特に限定されないが、（１）マイクロニードルアレイを製造する工程、（２）不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を調製する工程、（３）不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液をマイクロニードルアレイに塗布する工程、を含む製造方法によって得ることが好ましい。
塗布型マイクロニードルアレイの製造方法は、シート部上に針部を形成することが可能であれば特に限定されないが、（１）マイクロニードルアレイを製造する工程、（２）不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を調製する工程、（３）不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液をマイクロニードルアレイに塗布する工程、を含む製造方法によって得ることが好ましい。
【0106】
塗布型マイクロニードルアレイを製造する方法として、自己溶解型マイクロニードルの製造方法も同様に用いることができる。具体的には、自己溶解型マイクロニードルの製造方法において、（２）水溶性高分子および二糖類の少なくとも一種、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を調製する工程、および（３）（２）で得た溶液をモールドに充填し、針部先端領域を形成する工程を省略して製造する。製造された自己溶解型マイクロニードルアレイに不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を塗布すればよい。
【0107】
塗布型マイクロニードルアレイを製造する方法として、材料に応じて、各種の公知技術を用いて製造することができる。例えば、射出成形、押出成形、インプリント、ホットエンボス、またはキャスティング等の成形技術によって、マイクロニードルアレイを形成することができる。例えば、マイクロニードルアレイの原版を形成し、原版の凹凸を反転させた凹版を作製して、凹版に熱可塑性樹脂を充填することによって、熱可塑性樹脂から構成されるマイクロニードルアレイを形成することができる。または、フォトリソグラフィ法、３Ｄプリンタを用いた造形方法、ウェットエッチング法、ドライエッチング法、サンドブラスト法、レーザー加工法、精密機械加工技術を用いてマイクロニードルを形成することもできる。また、成形技術および精密機械加工技術の複数を組み合わせてマイクロニードルアレイを形成してもよい。
【0108】
不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を調製する工程では、溶媒として、微量に残留しても人体に害の少ない、水、エタノール、イソプロパノール、ジエチレングリコール、グリセリンのようなアルコール系などの水性溶媒を用いることができる。その他の溶媒として、脂肪族炭化水素系、トルエンのような芳香族炭化水素系、ハロゲン炭化水素系、酢酸エチル、酢酸プロピルのようなエステル系、ニトリル系、アミド系などの１種又は２種以上を混合して用いることができる。溶液には、針部表面に薬剤を塗布または担持させるために、高分子化合物および／または低分子化合物を混合させることが好ましい。例えば、ポリエチレンオキサイド、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース系、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、プルラン、ヒアルロン酸等の高分子化合物、塩化ナトリウムなどの塩類やグルコースなどの糖類等の低分子化合物が挙げられる。特にヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プルラン、ヒアルロン酸等が好ましい。
【0109】
不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液をマイクロニードルアレイに塗布する工程では、ノズルなどを介して溶液を吐出することにより針部に塗布するインクジェット法、ノズルなどを介して溶液を針部に塗布するディスペンサー法、針部を浸漬させて溶液を付着させる浸漬法（ディッピング法）などを用いることができる。これらの方法の中でも、針部先端領域に不活化日本脳炎ウイルスを集中的に塗布するために、浸漬法が有効である。
【0110】
浸漬法では、針部の頂部を下方に向けて溶液に浸漬させる。この後、針部を溶液から引き上げて、溶液の溶媒を蒸発させることで針部表面に不活化日本脳炎ウイルスを含む層が形成される。針部を浸漬させる深さ、時間などを調節することで、不活化日本脳炎ウイルスの塗布量を調整することができる。
【0111】
[マイクロニードルアレイの投与及びマイクロニードルアレイの用途]
本発明はさらに、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイ（以下、マイクロニードルアレイと言う）を、対象に投与することを含む、日本脳炎の予防方法に関する、
本発明はさらに、マイクロニードルアレイを、対象に投与することを含む、日本脳炎に対する免疫を付与する方法に関する。
本発明はさらに、シート部と、シート部の上面に存在する複数の針部とを有するマイクロニードルアレイであって、上記針部が不活化日本脳炎ウイルスを内包又は担持しているマイクロニードルアレイ（以下、マイクロニードルアレイと言う）を、対象に投与することを含む、日本脳炎の予防方法に関する、
本発明はさらに、マイクロニードルアレイを、対象に投与することを含む、日本脳炎に対する免疫を付与する方法に関する。
【0112】
マイクロニードルアレイの投与の対象は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
マイクロニードルアレイの好ましい形態、マイクロニードルアレイの好ましい投与量は、本明細書中上記した通りである。
マイクロニードルアレイの投与は、アプリケータを用いて行うこともできる。アプリケータは特に限定されないが、例えば、特開２０１８－１９１７８３、特開２０１９－０９７８８５号公報などに記載されている形態のものを使用することができる。
マイクロニードルアレイの好ましい形態、マイクロニードルアレイの好ましい投与量は、本明細書中上記した通りである。
マイクロニードルアレイの投与は、アプリケータを用いて行うこともできる。アプリケータは特に限定されないが、例えば、特開２０１８－１９１７８３、特開２０１９－０９７８８５号公報などに記載されている形態のものを使用することができる。
【0113】
本発明はさらに、日本脳炎を予防するための処置において使用するための上記マイクロニードルアレイ、並びに日本脳炎に対する免疫を付与するための処置において使用するための上記マイクロニードルアレイに関する。
本発明はさらに、日本脳炎予防剤の製造のための上記マイクロニードルアレイの使用、並びに日本脳炎ワクチン剤の製造のための、上記マイクロニードルアレイの使用に関する。
マイクロニードルアレイの好ましい形態は、本明細書中上記した通りである。
本発明はさらに、日本脳炎予防剤の製造のための上記マイクロニードルアレイの使用、並びに日本脳炎ワクチン剤の製造のための、上記マイクロニードルアレイの使用に関する。
マイクロニードルアレイの好ましい形態は、本明細書中上記した通りである。
【0114】
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【実施例0115】
実施例における略号は以下を意味する。
ＨＥＳ：ヒドロキシエチルスターチ７００００（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ株式会社）（重量平均分子量は７００００）
ＤＥＸ：デキストラン７００００（名糖産業株式会社）（重量平均分子量は７００００）
ＣＳ：コンドロイチン硫酸ナトリウム（マルハニチロ株式会社）（重量平均分子量は９００００）
Ｓｕｃ：精製白糖（スクロース）（富士フイルム和光純薬株式会社）
ＧｌｕＮａ：Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）
Ｔｗ：Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｅｐｐｉｃ）
ＥＭＥＭ：イーグル最小必須培地
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＣＰＥ：細胞変性効果
ＭＮＡ－Ｈ：マイクロニードル日本脳炎ワクチン高用量
ＭＮＡ－Ｌ：マイクロニードル日本脳炎ワクチン低用量
ＳＣ：皮下注射日本脳炎ワクチン
ＩＣＤＲＧ：国際接触皮膚炎研究班
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝食塩水
Ｔｒｉｓ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス
ＨＢｓ：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
ＨＣＶ：Ｃ型肝炎ウイルス
ＴＰ：梅毒トレポネーマ
ＨＴＬＶ－１：ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型
ＨＥＳ：ヒドロキシエチルスターチ７００００（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ株式会社）（重量平均分子量は７００００）
ＤＥＸ：デキストラン７００００（名糖産業株式会社）（重量平均分子量は７００００）
ＣＳ：コンドロイチン硫酸ナトリウム（マルハニチロ株式会社）（重量平均分子量は９００００）
Ｓｕｃ：精製白糖（スクロース）（富士フイルム和光純薬株式会社）
ＧｌｕＮａ：Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）
Ｔｗ：Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｅｐｐｉｃ）
ＥＭＥＭ：イーグル最小必須培地
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＣＰＥ：細胞変性効果
ＭＮＡ－Ｈ：マイクロニードル日本脳炎ワクチン高用量
ＭＮＡ－Ｌ：マイクロニードル日本脳炎ワクチン低用量
ＳＣ：皮下注射日本脳炎ワクチン
ＩＣＤＲＧ：国際接触皮膚炎研究班
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝食塩水
Ｔｒｉｓ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス
ＨＢｓ：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
ＨＣＶ：Ｃ型肝炎ウイルス
ＴＰ：梅毒トレポネーマ
ＨＴＬＶ－１：ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型
【0116】
＜マイクロニードルアレイの製造＞
（モールドの製造)
一辺４０ｍｍの平滑なＮｉ板の表面に、図２１に示すような、底面が５００μｍの直径Ｄ１で、１５０μｍの高さＨ１の円錐台５０上に、３００μｍの直径Ｄ２で、５００μｍの高さＨ２の円錐５２が形成された針状構造の形状部１２を、１０００μｍのピッチＬ１にて四角形状に１００本の針を２次元正方配列に研削加工することで、原版１１を作製した。この原版１１の上に、シリコンゴム（ダウ・コーニング社製SILASTIC MDX4-4210）を０．６ｍｍの厚みで膜を形成し、膜面から原版１１の円錐先端部５０μｍを突出させた状態で熱硬化させ、剥離した。これにより、約３０μｍの直径の貫通孔を有するシリコンゴムの反転品を作製した。このシリコンゴム反転品の、中央部に１０列×１０行の２次元配列された針状凹部が形成された、一辺３０ｍｍの平面部外を切り落としたものをモールドとして用いた。針状凹部の開口部が広い方をモールドの表面とし、３０μｍの直径の貫通孔（空気抜き孔）を有する面をモールドの裏面とした。
（モールドの製造)
一辺４０ｍｍの平滑なＮｉ板の表面に、図２１に示すような、底面が５００μｍの直径Ｄ１で、１５０μｍの高さＨ１の円錐台５０上に、３００μｍの直径Ｄ２で、５００μｍの高さＨ２の円錐５２が形成された針状構造の形状部１２を、１０００μｍのピッチＬ１にて四角形状に１００本の針を２次元正方配列に研削加工することで、原版１１を作製した。この原版１１の上に、シリコンゴム（ダウ・コーニング社製SILASTIC MDX4-4210）を０．６ｍｍの厚みで膜を形成し、膜面から原版１１の円錐先端部５０μｍを突出させた状態で熱硬化させ、剥離した。これにより、約３０μｍの直径の貫通孔を有するシリコンゴムの反転品を作製した。このシリコンゴム反転品の、中央部に１０列×１０行の２次元配列された針状凹部が形成された、一辺３０ｍｍの平面部外を切り落としたものをモールドとして用いた。針状凹部の開口部が広い方をモールドの表面とし、３０μｍの直径の貫通孔（空気抜き孔）を有する面をモールドの裏面とした。
【0117】
（不活化日本脳炎ウイルスを含む水溶液（Ｉ液とも言う）の調製）
日本脳炎ワクチン原液(阪大微生物病研究会より提供)を遠心限外濾過法によって濃縮した後、水溶性高分子、精製白糖（スクロース）(富士フイルム和光純薬株式会社)、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）、界面活性剤と混合した。各成分の使用量は表１及び表４に示す。なお、表１及び表４における各成分の量は、マイクロニードルアレイ１枚当たりの量である。マイクロニードルアレイ１枚の面積は、１ｃｍ２である。
日本脳炎ワクチン原液(阪大微生物病研究会より提供)を遠心限外濾過法によって濃縮した後、水溶性高分子、精製白糖（スクロース）(富士フイルム和光純薬株式会社)、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）、界面活性剤と混合した。各成分の使用量は表１及び表４に示す。なお、表１及び表４における各成分の量は、マイクロニードルアレイ１枚当たりの量である。マイクロニードルアレイ１枚の面積は、１ｃｍ２である。
【0118】
（シート部を形成する溶液（ＩＩ液とも言う）の調製）
ヒドロキシエチルデンプン７００００（ＨＥＳ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ株式会社）を水に溶解して、ＨＥＳの５６質量％水溶液を調製した。使用量は表１に示す。
また、ＤＥＸ及びＣＳを比率（質量比）７：３において水に溶解して、ＤＥＸ及びＣＳの水溶液を調製した。使用量は表４に示す。
なお、表１及び表４における各成分の量は、マイクロニードルアレイ１枚当たりの量である。マイクロニードルアレイ１枚の面積は、１ｃｍ２である。
ヒドロキシエチルデンプン７００００（ＨＥＳ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ株式会社）を水に溶解して、ＨＥＳの５６質量％水溶液を調製した。使用量は表１に示す。
また、ＤＥＸ及びＣＳを比率（質量比）７：３において水に溶解して、ＤＥＸ及びＣＳの水溶液を調製した。使用量は表４に示す。
なお、表１及び表４における各成分の量は、マイクロニードルアレイ１枚当たりの量である。マイクロニードルアレイ１枚の面積は、１ｃｍ２である。
【0119】
（不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液の充填及び乾燥）
図２２に示す充填装置を使用した。充填装置は、モールドとノズルの相対位置座標を制御するＸ軸駆動部６１及びＺ軸駆動部６２、ノズル６３を取り付け可能な液供給装置６４（武蔵エンジニアリング社製超微量定量ディスペンサーSMP-III）、モールド６９を固定する吸引台６５、モールド表面形状を測定するレーザー変位計６６（パナソニック社製ＨＬ－Ｃ２０１Ａ）、ノズル押し込み圧力を測定するロードセル６７（共和電業製ＬＣＸ－Ａ－５００Ｎ）、及び表面形状及び押し付け圧力の測定値のデータを基にＺ軸を制御する制御機構６８を備える。
図２２に示す充填装置を使用した。充填装置は、モールドとノズルの相対位置座標を制御するＸ軸駆動部６１及びＺ軸駆動部６２、ノズル６３を取り付け可能な液供給装置６４（武蔵エンジニアリング社製超微量定量ディスペンサーSMP-III）、モールド６９を固定する吸引台６５、モールド表面形状を測定するレーザー変位計６６（パナソニック社製ＨＬ－Ｃ２０１Ａ）、ノズル押し込み圧力を測定するロードセル６７（共和電業製ＬＣＸ－Ａ－５００Ｎ）、及び表面形状及び押し付け圧力の測定値のデータを基にＺ軸を制御する制御機構６８を備える。
【0120】
水平な吸引台上に一辺１５ｍｍの気体透過性フィルム（住友電気工業社製、ポアフロン（登録商標）、ＦＰ－０１０）を置き、その上に表面が上になるようにモールドを設置した。モールド裏面方向からゲージ圧９０ｋＰａの吸引圧で減圧して、気体透過性フィルムとモールドをバキューム台に固定した。
【0121】
図１３に示すような形状のＳＵＳ製（ステンレス鋼）のノズルを準備し、長さ２０ｍｍ、幅２ｍｍのリップ部の中央に、長さ１２ｍｍ、幅０．２ｍｍのスリット状の開口部を形成した。このノズルを液供給装置に接続した。３ｍＬの不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を、液供給装置とノズル内部に装填した。開口部を、モールドの表面に形成された複数の針状凹部で構成される１列目と平行となるようにノズルを調整した。１列目に対して２列目と反対方向に２ｍｍの間隔をおいた位置で、ノズルを１．３７２×１０４Ｐａ（０．１４ｋｇｆ／ｃｍ２）の圧力でモールドに押し付けた。ノズルを押し付けたまま、押し付け圧の変動が±０．４９０×１０４Ｐａ（０．０５ｋｇｆ／ｃｍ２）に収まるようにＺ軸を制御しつつ、０．５ｍｍ／秒で開口部の長さ方向と垂直方向に移動させながら、液供給装置にて、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を、０．１５μＬ／秒で２０秒間、開口部から放出した。２次元配列された複数の針状凹部の孔パターンを通過して、２ｍｍ間隔を置いた位置でノズルの移動を停止し、ノズルをモールドから離した。
【0122】
不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填したモールドを、２３℃、４５％の環境下でフタ(箱)内に収め、乾燥した。このとき、不活化日本脳炎ウイルス含む溶液は、徐々に乾燥され、１８０分以上経過した後に、含水率が２０％以下となる。また乾燥の手段は、フタに限定されるものではなく、温湿度制御や風量制御などの他の手段を用いても良い。
【0123】
（シート部の形成及び乾燥）
シート部を形成する支持体としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（１７５μｍ）をクラウドリムーバー(Victor jvc社)を用いて、以下条件(使用ガス：Ｏ２、ガス圧：13Pa、高周波（ＲＦ）電力：100W、照射時間：3分、Ｏ２流量：SV250、目標真空度（CCG）：2.0×10-4Pa)にて親水化プラズマ処理したものを用いる。処理を施したＰＥＴ上に、シート部を形成する溶液を、表裏面を７５μｍの膜厚で塗布した。一方で、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填したモールドを吸引台に吸引固定した。シート部を形成する溶液を塗布したＰＥＴの表面側を、モールド表面を向かい合わせに配置し、更にＰＥＴとモールド間の空隙、また、ＰＥＴのモールドと反対側の空間を２分間減圧した。減圧後、ＰＥＴのモールドと反対側の空間のみ大気圧開放することで、シート部を形成する溶液を塗布したＰＥＴと、モールドを貼り合せた。１０分間接触状態を維持した後、ＰＥＴとモールドが貼り合わさって一体となったものを２３℃、４５％（相対湿度）の環境下で乾燥させた。
シート部を形成する支持体としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（１７５μｍ）をクラウドリムーバー(Victor jvc社)を用いて、以下条件(使用ガス：Ｏ２、ガス圧：13Pa、高周波（ＲＦ）電力：100W、照射時間：3分、Ｏ２流量：SV250、目標真空度（CCG）：2.0×10-4Pa)にて親水化プラズマ処理したものを用いる。処理を施したＰＥＴ上に、シート部を形成する溶液を、表裏面を７５μｍの膜厚で塗布した。一方で、不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液を充填したモールドを吸引台に吸引固定した。シート部を形成する溶液を塗布したＰＥＴの表面側を、モールド表面を向かい合わせに配置し、更にＰＥＴとモールド間の空隙、また、ＰＥＴのモールドと反対側の空間を２分間減圧した。減圧後、ＰＥＴのモールドと反対側の空間のみ大気圧開放することで、シート部を形成する溶液を塗布したＰＥＴと、モールドを貼り合せた。１０分間接触状態を維持した後、ＰＥＴとモールドが貼り合わさって一体となったものを２３℃、４５％（相対湿度）の環境下で乾燥させた。
【0124】
（剥離工程）
乾燥固化したマイクロニードルアレイをモールドから慎重に剥離することで、不活化日本脳炎ウイルスを内包したマイクロニードルアレイが形成された。本マイクロニードルは、錘台部と針部から構成されており、針状凸部の長さＬが約８００μｍ、基底部の幅：約３５０μｍ、錘台部が、高さ約１９０μｍ、上底面直径約３５０μｍ、下底面直径約７００μｍの円錐台構造であり、針本数１０９本、針の間隔約１ｍｍで配置されている。
乾燥固化したマイクロニードルアレイをモールドから慎重に剥離することで、不活化日本脳炎ウイルスを内包したマイクロニードルアレイが形成された。本マイクロニードルは、錘台部と針部から構成されており、針状凸部の長さＬが約８００μｍ、基底部の幅：約３５０μｍ、錘台部が、高さ約１９０μｍ、上底面直径約３５０μｍ、下底面直径約７００μｍの円錐台構造であり、針本数１０９本、針の間隔約１ｍｍで配置されている。
【0125】
＜試験１：日本脳炎予防剤のヒト臨床試験＞
（実施場所）
北海道大学病院
（実施場所）
北海道大学病院
【0126】
（研究のデザイン）
無作為化比較、非盲検、実薬対照、並行群間比較
無作為化比較、非盲検、実薬対照、並行群間比較
【0127】
（被験者）
２０～３５歳の日本脳炎ウイルスに対する抗体を有しない健常成人３９例
１３例１群として、ＭＮＡ－Ｈ、ＭＮＡ－Ｌ、ＳＣの３群にブロックランダム化にて無作為割付した。
除外基準は以下の状況を含む：明らかな発熱（３７．５℃以上）を呈している；投与部位に投与の支障となり得る皮膚疾患を有する；免疫不全疾患（エイズ、原発性免疫不全症等）を有する；過去に日本脳炎ワクチン予防接種を受けたことがある；過去に日本脳炎に罹患したことがある；他のワクチン接種によってアナフィラキシーを呈したことがある；過去にけいれんの既往がある；重篤な急性疾患に罹患している；投与開始前６日以内に不活化ワクチンの接種を受けた；投与開始前２７日以内に生ワクチンの接種を受けた；投与開始前９０日以内に輸血あるいはγグロブリン製剤の投与を受けた；スクリーニング時の免疫血清学的検査で日本脳炎ウイルス中和抗体価が陽性である；スクリーニング時の感染症検査でＨＩＶ抗原・抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＴＰ抗体、ＨＴＬＶ－１抗体いずれかが陽性である；（女性で）妊婦又は妊娠している可能性がある、本研究期間中に妊娠を希望している、授乳中、本研究期間中に子宮内装具又はバリア法（ペッサリー、コンドーム）などの機械的避妊具の使用、及びそれらを組み合わせるなどの方法で避妊することが困難；医師が本研究への参加を不適当と判断した。
２０～３５歳の日本脳炎ウイルスに対する抗体を有しない健常成人３９例
１３例１群として、ＭＮＡ－Ｈ、ＭＮＡ－Ｌ、ＳＣの３群にブロックランダム化にて無作為割付した。
除外基準は以下の状況を含む：明らかな発熱（３７．５℃以上）を呈している；投与部位に投与の支障となり得る皮膚疾患を有する；免疫不全疾患（エイズ、原発性免疫不全症等）を有する；過去に日本脳炎ワクチン予防接種を受けたことがある；過去に日本脳炎に罹患したことがある；他のワクチン接種によってアナフィラキシーを呈したことがある；過去にけいれんの既往がある；重篤な急性疾患に罹患している；投与開始前６日以内に不活化ワクチンの接種を受けた；投与開始前２７日以内に生ワクチンの接種を受けた；投与開始前９０日以内に輸血あるいはγグロブリン製剤の投与を受けた；スクリーニング時の免疫血清学的検査で日本脳炎ウイルス中和抗体価が陽性である；スクリーニング時の感染症検査でＨＩＶ抗原・抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＴＰ抗体、ＨＴＬＶ－１抗体いずれかが陽性である；（女性で）妊婦又は妊娠している可能性がある、本研究期間中に妊娠を希望している、授乳中、本研究期間中に子宮内装具又はバリア法（ペッサリー、コンドーム）などの機械的避妊具の使用、及びそれらを組み合わせるなどの方法で避妊することが困難；医師が本研究への参加を不適当と判断した。
【0128】
（試験方法）
ＭＮＡ－Ｈ：不活化日本脳炎ウイルスを０．６３μｇ含有
ＭＮＡ－Ｌ：不活化日本脳炎ウイルスを０．２５μｇ含有
ＳＣ：不活化日本脳炎ウイルスを２．５μｇ含有（ジェービックＶ、一般財団法人阪大微生物病研究会）
ＭＮＡ－Ｈ群及びＭＮＡ－Ｌ群は、マイクロニードルアレイを初回（０週）１枚、３週後１枚を上腕部にアプリケータを用いて貼付投与した。ＳＣ群はジェービックＶを初回（０週）１回、３週後１回を上腕部に皮下注射した。
ＭＮＡ－Ｈ：不活化日本脳炎ウイルスを０．６３μｇ含有
ＭＮＡ－Ｌ：不活化日本脳炎ウイルスを０．２５μｇ含有
ＳＣ：不活化日本脳炎ウイルスを２．５μｇ含有（ジェービックＶ、一般財団法人阪大微生物病研究会）
ＭＮＡ－Ｈ群及びＭＮＡ－Ｌ群は、マイクロニードルアレイを初回（０週）１枚、３週後１枚を上腕部にアプリケータを用いて貼付投与した。ＳＣ群はジェービックＶを初回（０週）１回、３週後１回を上腕部に皮下注射した。
【0129】
（検査項目）
有効性の評価として、スクリーニング時、初回投与時（０週）、初回投与２週後、２回目投与時（初回投与３週後）、初回投与６週後、初回投与２７週後において免疫血清学的検査（中和抗体価測定）を行った。安全性の評価として、スクリーニング時、初回投与時（０週）、初回投与２日後、初回投与２週後、２回目投与時（初回投与３週後）、初回投与６週後、初回投与２７週後に血液学的検査、生化学的検査及び前述観察時期に加えて初回投与１５週後に投与部位の自他覚症状を確認した。
有効性の評価として、スクリーニング時、初回投与時（０週）、初回投与２週後、２回目投与時（初回投与３週後）、初回投与６週後、初回投与２７週後において免疫血清学的検査（中和抗体価測定）を行った。安全性の評価として、スクリーニング時、初回投与時（０週）、初回投与２日後、初回投与２週後、２回目投与時（初回投与３週後）、初回投与６週後、初回投与２７週後に血液学的検査、生化学的検査及び前述観察時期に加えて初回投与１５週後に投与部位の自他覚症状を確認した。
【0130】
（倫理面への配慮）
本臨床研究は北海道大学病院認定臨床研究審査委員会の承認を受けた特定臨床研究であり、また、施行時には研究の内容を十分に説明した上で、文書によるインフォームドコンセントを得て行った。
本臨床研究は北海道大学病院認定臨床研究審査委員会の承認を受けた特定臨床研究であり、また、施行時には研究の内容を十分に説明した上で、文書によるインフォームドコンセントを得て行った。
【0131】
（安全性）
本臨床研究において、重大な副反応（ショック、アナフィラキシー、急性散在性脳脊髄炎、けいれん、血小板減少性紫斑病、脳炎・脳症）は見られなかった。
本臨床研究において、重大な副反応（ショック、アナフィラキシー、急性散在性脳脊髄炎、けいれん、血小板減少性紫斑病、脳炎・脳症）は見られなかった。
【0132】
（有効性の評価）
被験者の血清中に含まれる中和抗体を、以下に示すＣＰＥマイクロプレート法を用いて測定した。
被験者の血清中に含まれる中和抗体を、以下に示すＣＰＥマイクロプレート法を用いて測定した。
【0133】
Ｖｅｒｏ細胞播種：
トリプシン処理したＶｅｒｏ細胞を、細胞培養用ＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＋１０％ＦＢＳ、＋カナマイシン）を用いて２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したものを細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を細胞培養用マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｆｌａｔ、ＡＧＣテクノグラス）に１００μＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーターで１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
トリプシン処理したＶｅｒｏ細胞を、細胞培養用ＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＋１０％ＦＢＳ、＋カナマイシン）を用いて２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したものを細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を細胞培養用マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｆｌａｔ、ＡＧＣテクノグラス）に１００μＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーターで１日培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
【0134】
血清サンプルの調製：
被験者の血清は５６℃で３０分間加熱して非働化した。血清希釈用マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｏｕｎｄ、ＡＧＣテクノグラス）上で、すべてのｗｅｌｌが２０μＬになるようにＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＋２％ＦＢＳ）を用いて１０倍～１０２４０倍の２倍段階希釈系列を作製した。
被験者の血清は５６℃で３０分間加熱して非働化した。血清希釈用マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｏｕｎｄ、ＡＧＣテクノグラス）上で、すべてのｗｅｌｌが２０μＬになるようにＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＋２％ＦＢＳ）を用いて１０倍～１０２４０倍の２倍段階希釈系列を作製した。
【0135】
中和反応：
攻撃ウイルスとして、ＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＋２％ＦＢＳ）を用いて４．０×１０３ｐｆｕ／ｍＬになるように調製した日本脳炎ウイルス北京株（国立感染症研究所）を、上記血清希釈用マイクロプレートに２０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えてＣＯ２インキュベーターで１．５時間中和反応させた（３７℃、５％ＣＯ２）。
攻撃ウイルスとして、ＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＋２％ＦＢＳ）を用いて４．０×１０３ｐｆｕ／ｍＬになるように調製した日本脳炎ウイルス北京株（国立感染症研究所）を、上記血清希釈用マイクロプレートに２０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えてＣＯ２インキュベーターで１．５時間中和反応させた（３７℃、５％ＣＯ２）。
【0136】
ベロ細胞への感染実験：
上記中和反応させた血清と攻撃ウイルスの混合液を、上記細胞培養用マイクロプレートに２５μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーターで６日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
上記中和反応させた血清と攻撃ウイルスの混合液を、上記細胞培養用マイクロプレートに２５μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーターで６日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
【0137】
細胞固定及び染色：
上記細胞培養用マイクロプレートにホルマリン液を４０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、２時間以上静置した。その後ホルマリン液を除去し、水道水でプレートを洗浄後、０．０２％メチレンブルー染色液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して１時間以上静置し、細胞を染色した。攻撃ウイルスによるＣＰＥを５０％以上防いだ上記血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とした。１０倍未満の場合は５（常用対数は０．７）として扱った。
上記細胞培養用マイクロプレートにホルマリン液を４０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、２時間以上静置した。その後ホルマリン液を除去し、水道水でプレートを洗浄後、０．０２％メチレンブルー染色液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して１時間以上静置し、細胞を染色した。攻撃ウイルスによるＣＰＥを５０％以上防いだ上記血清の最高希釈倍の常用対数を中和抗体価とした。１０倍未満の場合は５（常用対数は０．７）として扱った。
【0138】
【表1】
【0139】
（試験１の結果）
３９人の被験者は、条件を満たしランダム化された。投与前においてＳＣ群、ＭＮＡ－Ｌ群、ＭＮＡ－Ｈ群はいずれも血清中の中和抗体価が０．７であった（表２）。血清中の中和抗体価が１．３以上になった被験者を陽転とし，陽転率を算出した。初回投与２週後において、ＭＮＡ－Ｈ群は１００％が陽転したものの、ＳＣ群では陽転率が４６％、ＭＮＡ－Ｌ群では陽転率が５４％であった。初回投与６週後において、全ての群で１００％の陽転率が得られた。
３９人の被験者は、条件を満たしランダム化された。投与前においてＳＣ群、ＭＮＡ－Ｌ群、ＭＮＡ－Ｈ群はいずれも血清中の中和抗体価が０．７であった（表２）。血清中の中和抗体価が１．３以上になった被験者を陽転とし，陽転率を算出した。初回投与２週後において、ＭＮＡ－Ｈ群は１００％が陽転したものの、ＳＣ群では陽転率が４６％、ＭＮＡ－Ｌ群では陽転率が５４％であった。初回投与６週後において、全ての群で１００％の陽転率が得られた。
【0140】
【表2】
【0141】
（各被験者における不活化日本脳炎ウイルスの投与量の測定）
日本脳炎ウイルスＥｎｖｅｌｏｐｅタンパク質特異的ＩｇＧ抗体（一般財団法人阪大微生物病研究会）を固相化Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素塩緩衝液）で３１００倍に希釈し、その液を９６ｗｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ ｈａｌｆ ａｒｅａプレートの使用するｗｅｌｌに５０μＬずつ入れた。そのプレートを４℃で一晩以上静置し固相化プレートとした。
日本脳炎ウイルスＥｎｖｅｌｏｐｅタンパク質特異的ＩｇＧ抗体（一般財団法人阪大微生物病研究会）を固相化Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素塩緩衝液）で３１００倍に希釈し、その液を９６ｗｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ ｈａｌｆ ａｒｅａプレートの使用するｗｅｌｌに５０μＬずつ入れた。そのプレートを４℃で一晩以上静置し固相化プレートとした。
【0142】
検体については投与後のマイクロニードルアレイを希釈Ｂｕｆｆｅｒ（ＤＰＢＳ＋ＢＳＡ０．１％＋Ｔｗ０．５％）に溶解したものを試料溶液とした。希釈Ｂｕｆｆｅｒ ２１８ μＬに標準抗原（一般財団法人阪大微生物病研究会）３０μＬを加えたものを標準溶液原液とし、希釈Ｂｕｆｆｅｒを用いて標準溶液原液を１０倍、１６．６倍、５０倍、１００倍、５００倍希釈したものをそれぞれ標準溶液とした。
【0143】
ＰＢＳ－Ｔ（ＤＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で固相化プレートを３回洗浄した。１２チャンネルマイクロピペットを用いて試料溶液及び標準溶液が入った添加用丸底プレートから１００μＬずつ固相化プレートの同じ位置に移注し、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ－Ｔで固相化プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ標識日本脳炎ウイルスＥｎｖｅｌｏｐｅタンパク質特異的ＩｇＧ抗体（一般財団法人阪大微生物病研究会）をＦＢＳが１０％となるようにＰＢＳ－Ｔを加えたもので１１０００倍に希釈した液を１００ μＬずつ入れ、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ－Ｔでプレートを洗浄し、ＴＭＢを全ｗｅｌｌに８０μＬずつ入れ、遮光して室温で１５分間反応させた。１５分後、反応停止液（０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４）を全ｗｅｌｌに８０μＬずつ入れ、プレートリーダーを用いて吸光度４５０ｎｍ（リファレンス６２０ｎｍ）を測定した。
上記により各被験者における不活化日本脳炎ウイルスの投与量を測定した結果を図２３に示す。
上記により各被験者における不活化日本脳炎ウイルスの投与量を測定した結果を図２３に示す。
【0144】
＜試験２：日本脳炎予防剤の動物に対する中和抗体産生試験＞
（マウスへのワクチン投与試験）
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、日本脳炎予防剤の投与試験を行った。初回投与として適切に希釈したジェービックＶをマウスの頸背部に１００μＬ皮下投与した。その後、１５日間飼育を続け、２回目投与としてマイクロニードルアレイ群は麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイ(処方は表４に示す)を１０分間穿刺した。皮下注射群は適切に希釈したジェービックＶをマウスの頸背部に１００μＬ皮下投与した。すべての試験は４匹で実施した。
（マウスへのワクチン投与試験）
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、日本脳炎予防剤の投与試験を行った。初回投与として適切に希釈したジェービックＶをマウスの頸背部に１００μＬ皮下投与した。その後、１５日間飼育を続け、２回目投与としてマイクロニードルアレイ群は麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイ(処方は表４に示す)を１０分間穿刺した。皮下注射群は適切に希釈したジェービックＶをマウスの頸背部に１００μＬ皮下投与した。すべての試験は４匹で実施した。
【0145】
（有効性の評価）
投与後、１週間飼育したマウスを麻酔下で開腹し、後部大静脈より採血を行った。室温で静置した血液を遠心分離にかけ、上清を採取することで血清を得た。得られた血清中に含まれる日本脳炎ウイルスに特異的な抗体（ＩｇＧ）の量を、下記の手法で測定した。
投与後、１週間飼育したマウスを麻酔下で開腹し、後部大静脈より採血を行った。室温で静置した血液を遠心分離にかけ、上清を採取することで血清を得た。得られた血清中に含まれる日本脳炎ウイルスに特異的な抗体（ＩｇＧ）の量を、下記の手法で測定した。
【0146】
（ＩｇＧ抗体産生量の測定）
Ｍｉｃｒｏｌｏｎプレート（平底、９６ｗｅｌｌ）に、日本脳炎ワクチンを２５μＬ／ｗｅｌｌ分注し、シールにて４℃で終夜静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗ）で４回洗浄した。その後、ブロッキング液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１％ＢＳＡ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で３０分静置した。静置後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。洗浄後、希釈液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗ）で約１０，０００倍に希釈したサンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｍｉｃｒｏｌｏｎプレート（平底、９６ｗｅｌｌ）に、日本脳炎ワクチンを２５μＬ／ｗｅｌｌ分注し、シールにて４℃で終夜静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗ）で４回洗浄した。その後、ブロッキング液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１％ＢＳＡ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で３０分静置した。静置後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。洗浄後、希釈液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗ）で約１０，０００倍に希釈したサンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴで４回洗浄した。
【0147】
次に、希釈液で希釈したＨＲＰ標識抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（５００倍）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴで４回洗浄した。さらに、基質反応として、ＴＭＢを８０μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、遮光下室温で１５分間静置した。その後、ストップ液（１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ）を８０μＬ／ｗｅｌｌ滴下した。
滴下後、λ＝４５０ｎｍの吸光度（リファレンス６２０ｎｍ）を測定することにより、吸光度の大きさでＩｇＧ抗体産生量を表した。４匹のマウスから得られた平均の結果を表３に示す。
滴下後、λ＝４５０ｎｍの吸光度（リファレンス６２０ｎｍ）を測定することにより、吸光度の大きさでＩｇＧ抗体産生量を表した。４匹のマウスから得られた平均の結果を表３に示す。
【0148】
【表3】
【符号の説明】
【0149】
１ マイクロニードルアレイ
２ マイクロニードルアレイ
１１０ マイクロニードル
１１２ 針部
１１２Ａ 針部第１層
１１２Ｂ 針部第２層
１１３ 錐台部
１１６ シート部
１２０ 不活化日本脳炎ウイルスを含む層
１２２ 不活化日本脳炎ウイルスを含まない層
Ｗ 直径（幅）
Ｈ 高さ
Ｔ 高さ（厚み）
１１ 原版
１２ 形状部
１３ モールド
１５ 針状凹部
１５Ａ 入口部
１５Ｂ 先端凹部
１５Ｃ 空気抜き孔
Ｄ 径（直径）
１８ モールド複合体
１９ 気体透過シート
２０ 基台
２２ 不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液
２４ 水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液
２９ 支持体
３０ タンク
３２ 配管
３４ ノズル
３４Ａ リップ部
３４Ｂ 開口部
３６ 液供給装置
Ｐ１ 加圧力
Ｐ２ 押付け力
Ｐ３ 押付け力
４０ 基材
５０ 円錐台
５２ 円錐
Ｄ１ 直径
Ｄ２ 直径
Ｌ１０ ピッチ
Ｈ１ 高さ
Ｈ２ 高さ
６１ Ｘ軸駆動部
６２ Ｚ軸駆動部
６３ ノズル
６４ 液供給装置
６５ 吸引台
６６ レーザー変位計
６７ ロードセル
６８ 制御機構
６９ モールド
２ マイクロニードルアレイ
１１０ マイクロニードル
１１２ 針部
１１２Ａ 針部第１層
１１２Ｂ 針部第２層
１１３ 錐台部
１１６ シート部
１２０ 不活化日本脳炎ウイルスを含む層
１２２ 不活化日本脳炎ウイルスを含まない層
Ｗ 直径（幅）
Ｈ 高さ
Ｔ 高さ（厚み）
１１ 原版
１２ 形状部
１３ モールド
１５ 針状凹部
１５Ａ 入口部
１５Ｂ 先端凹部
１５Ｃ 空気抜き孔
Ｄ 径（直径）
１８ モールド複合体
１９ 気体透過シート
２０ 基台
２２ 不活化日本脳炎ウイルスを含む溶液
２４ 水溶性高分子および二糖類のうちの少なくとも一種を含む溶液
２９ 支持体
３０ タンク
３２ 配管
３４ ノズル
３４Ａ リップ部
３４Ｂ 開口部
３６ 液供給装置
Ｐ１ 加圧力
Ｐ２ 押付け力
Ｐ３ 押付け力
４０ 基材
５０ 円錐台
５２ 円錐
Ｄ１ 直径
Ｄ２ 直径
Ｌ１０ ピッチ
Ｈ１ 高さ
Ｈ２ 高さ
６１ Ｘ軸駆動部
６２ Ｚ軸駆動部
６３ ノズル
６４ 液供給装置
６５ 吸引台
６６ レーザー変位計
６７ ロードセル
６８ 制御機構
６９ モールド
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
