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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-18
(45)【発行日】2023-10-26
(54)【発明の名称】サイトメトリーのための方法及びシステム
(51)【国際特許分類】
G01N 15/14 20060101AFI20231019BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20231019BHJP
【ＦＩ】
G01N15/14 C
C12M1/34 B
G01N15/14 D
G01N15/14 K
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2021518859
(86)(22)【出願日】2019-06-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-11
(86)【国際出願番号】 US2019036849
(87)【国際公開番号】W WO2019241443
(87)【国際公開日】2019-12-19
【審査請求日】2022-06-10
(31)【優先権主張番号】62/684,612
(32)【優先日】2018-06-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/701,395
(32)【優先日】2018-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/804,560
(32)【優先日】2019-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/848,478
(32)【優先日】2019-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２６年度 国立研究開発法人科学技術振興機構 戦略的創造研究推進（さきがけ）事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】517110494
【氏名又は名称】シンクサイト株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】太田 禎生
(72)【発明者】
【氏名】堀▲崎▼ 遼一
(72)【発明者】
【氏名】河村 踊子
(72)【発明者】
【氏名】鵜川 昌士
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 一誠
【審査官】福田 裕司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０７３７３７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２２３４５３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－０５８３６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０８５５７１（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１２７８２３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／００５２１０６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５０８７７５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １５／１４
Ｃ１２Ｍ １／３４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の標識フリー細胞から１つ又は複数の標的細胞を処理するための方法であって、（ａ）構造化照明を生成するために光源からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けし、フローセルのチャネル上へ前記構造化照明を集束させて、前記構造化照明が、前記チャネルから検出器へ向かう透過スペックルパターンを生成するステップと；
（ｂ）前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを通して前記複数の標識フリー細胞のうちの少なくとも１つの標識フリー細胞を通過させるステップであって、前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを前記少なくとも１つの標識フリー細胞が通過するとき、前記透過スペックルパターンが変調されて、変調透過スペックルパターンを生成する、ステップと；
（ｃ）前記検出器を用いて前記変調透過スペックルパターンの少なくとも一部を収集するステップと；
（ｄ）前記変調透過スペックルパターンの前記少なくとも一部を１つ又は複数の時間波形に変換するステップであって、前記少なくとも１つの標識フリー細胞が前記構造化照明を通過するときに、前記１つ又は複数の時間波形が、前記変調透過スペックルパターンによって付与された１つ又は複数の強度分布を含む、ステップと；
（ｅ）前記１つ又は複数の時間波形に１つ又は複数の機械学習分類器を適用して、前記複数の細胞から前記１つ又は複数の標的細胞を直接識別するステップと、
（ｆ）前記１つ又は複数の標的細胞を前記複数の標識フリー細胞から分離又は単離して、それによって、前記複数の標識フリー細胞の標識フリー選別を可能にするステップと、を含む、方法。
【請求項2】
前記１つ又は複数の機械学習分類器が、１つ又は複数の染色した細胞に関連する波形を使用して訓練される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記標的細胞が、１つ又は複数の癌細胞又は循環腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記標的細胞が、１つ又は複数の治療用細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記標的細胞が、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞から分化した細胞、胚性幹細胞から分化した細胞、遺伝子操作された細胞、血液細胞、赤血球、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞、癌細胞、及び芽細胞から成る群から選択される１つ又は複数のメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記１つ又は複数の標的細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、単球及びリンパ球からなる群から選択される１つ又は複数の白血球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記１つ又は複数の標的細胞の機能、タイプ又は特徴に基づいて前記１つ又は複数の標的細胞を分類するステップをさらに含み、前記機能、タイプ又は特徴が、前記１つ又は複数の標的細胞の生存性、発現状態、純度、分化、未分化、グルコースレベル又は解糖レベルに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記１つ又は複数の機械学習分類器が、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、人工ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、深層学習、超深層学習、勾配ブースティング、アダブースティング、決定木、線形回帰、又はロジスティック回帰を用いて作成される、請求項４に記載の方法。
【請求項9】
前記複数の標識フリー細胞は、イメージ再構成なしで選別される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記検出器が単一ピクセル検出器を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記１つ又は複数の標的細胞の１つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記１つ又は複数のイメージの各イメージは、異なる波長又は波長範囲に対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
１つ又は複数のイメージを再構成するステップが、２段階反復収縮／閾値化（ＴｗＩＳＴ）手順を適用するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記複数の標識フリー細胞の形態に基づいて、前記複数の標識フリー細胞を１つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記複数の標識フリー細胞から前記１つ又は複数の標的細胞を分離又は単離するステップが、少なくとも１０細胞／秒の速度で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
（ｃ）が、前記分離又は単離された前記１つ又は複数の標的細胞のうちの１つ又は複数を、収集された細胞の１つ又は複数のグループへ収集して、濃縮された細胞混合物を生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
（ｃ）に続いて、１つ又は複数の標的細胞を１つ又は複数のアッセイに供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記パターン化された光学構造が、規則的なパターン化された光学構造、無秩序なパターン化された光学構造、非周期的なパターン化された光学構造、ランダムに若しくは擬似ランダムにパターン化された光学構造、又は、静的光学構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記パターン化された光学構造が、異なる光学特性を有する複数の領域を含み、前記光学特性が、透過率、吸収率、又は反射率のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
複数の標識フリー細胞から１つ又は複数の標的細胞を処理するためのシステムであって、複数の標識フリー粒子を方向付けるように構成された流体フローセルと；前記流体フローセルの少なくとも一部と感知通信する検出器と；前記検出器に動作可能に結合された１つ又は複数のコンピュータプロセッサと；を含み、前記１つ又は複数のコンピュータプロセッサが個々に又はまとめて：
（ａ）構造化照明を生成するために構造化光学パターンを通して光源からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けし、前記フローセルのチャネル上へ前記構造化照明を集束させて、前記構造化照明が、前記チャネルから前記検出器へ向かう透過スペックルパターンを生成し、
（ｂ）前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを通して前記複数の標識フリー細胞のうちの少なくとも１つの標識フリー細胞を通過させ、前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを前記少なくとも１つの標識フリー細胞が通過するとき、前記透過スペックルパターンが変調されて、変調透過スペックルパターンを生成し、
（ｃ）前記検出器を用いて前記変調透過スペックルパターンの少なくとも一部を収集し、
（ｄ）前記変調透過スペックルパターンの前記少なくとも一部を１つ又は複数の時間波形に変換し、前記少なくとも１つの標識フリー細胞が前記構造化照明を通過するときに、前記１つ又は複数の時間波形が、前記変調透過スペックルパターンによって付与された１つ又は複数の強度分布を含み、
（ｅ）前記１つ又は複数の時間波形に１つ又は複数の機械学習分類器を適用して、前記複数の標識フリー細胞から前記１つ又は複数の標的細胞を直接識別し、
（ｆ）前記１つ又は複数の標的細胞を前記複数の標識フリー細胞から分離又は単離して、前記標的細胞の標識フリー選別を可能にする、
ように構成された、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
［００１］ 本出願は、２０１８年６月１３日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／６８４，６１２号、２０１８年７月２０日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／７０１，３９５号、２０１９年２月１２日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／８０４，５６０号、及び２０１９年５月１５日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／８４８，４７８，４７８号の利益を主張するものであり、これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［００１］ 本出願は、２０１８年６月１３日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／６８４，６１２号、２０１８年７月２０日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／７０１，３９５号、２０１９年２月１２日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／８０４，５６０号、及び２０１９年５月１５日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題する米国仮特許出願第６２／８４８，４７８，４７８号の利益を主張するものであり、これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
［００２］ フローサイトメトリーは、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出及びタンパク質工学における使用のために使用され得る技術である。フローサイトメトリーは、流体の流れに細胞を懸濁させ、電子検出装置に細胞を通過させることによって実施することができる。フローサイトメーターは、粒子の物理的及び化学的特性の同時マルチパラメータ分析を可能にし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
［００３］ 本開示は、ゴーストサイトメトリー（ＧＣ）と呼ばれるプロセスを使用する形態ベースの細胞分類及び選別のための方法及びシステムを提供する。本開示の方法及びシステムは、イメージを取得することなく、高い精度及びスループットで形態ベースの細胞分類及び選別を達成するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【0004】
［００４］ 一態様では、本開示は、（ａ）パターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、少なくとも７０％の任意の精度で粒子の少なくともサブセットを識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された粒子の少なくともサブセットを、少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するステップとを含む、粒子処理又は分析のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）光源からの光をランダム又は擬似ランダムにパターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉ）パターン化された光学構造からの光を粒子に方向付けるステップと、（ｉｉｉ）粒子からの光を検出器に方向付けるステップとを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）光源からの光を粒子に方向付けるステップと、（ｉｉ）パターン化された光学構造を通して粒子からの光を方向付けるステップと、（ｉｉｉ）パターン化された光学構造からの光を検出器に方向付けるステップとを含む。いくつかの実施形態では、光は紫外光又は可視光を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、２段階反復収縮／閾値化（ＴｗＩＳＴ）手順を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、パターン化された光学構造によって付与された１つ又は複数の強度分布を含む時間波形の組み合わせ使用によって少なくとも部分的に粒子の形態をコンピュータ的に再構成するステップを含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の生物学的粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の希少細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の循環腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、粒子の少なくともサブセットを識別するために、信号に対応する圧縮波形に１つ又は複数の機械学習分類器を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の機械学習分類器は、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、人工ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、深層学習、超深層学習、勾配ブースティング、アダブースティング、決定木、線形回帰、及びロジスティック回帰から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、粒子は、イメージ再構成なしで分析される。いくつかの実施形態では、検出器は単一ピクセル検出器を含む。いくつかの実施形態では、単一ピクセル検出器は、光電子増倍管を備える。いくつかの実施形態では、方法は、粒子の１つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のイメージは蛍光イメージを含む。いくつかの実施形態では、方法は、粒子の複数のイメージを再構成するステップをさらに含み、複数の各イメージは、異なる波長又は波長範囲を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のイメージは、ぼけアーチファクトがない。いくつかの実施形態では、粒子は、パターン化された光学構造に対して少なくとも１ｍ／ｓの速度で移動する。いくつかの実施形態では、方法は、粒子の形態に基づいて、粒子を１つ又は複数のグループの選別された粒子に選別するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、速度は少なくとも１００粒子／秒である。いくつかの実施形態では、速度は少なくとも１，０００粒子／秒である。いくつかの実施形態では、（ｄ）は、濃縮された粒子混合物を生成するために１つ又は複数のグループを収集するステップを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のグループは、少なくとも７０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、方法は、１つ又は複数のグループの１つ又は複数の粒子を１つ又は複数のアッセイに供するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアッセイは、溶解、核酸抽出、核酸増幅、核酸配列決定、及びタンパク質配列決定から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）の前に、粒子を流体力学的流れ集束に供するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、パターン化された光学構造に対して粒子が移動するときに、粒子の部分透過スペックルパターンを収集するステップを含む。いくつかの実施形態では、パターン化された光学構造は、規則的なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、パターン化された光学構造は、無秩序なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、無秩序な光学構造は、非周期的なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、無秩序な光学構造は、ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、光学構造は静的光学構造を含む。
【0005】
［００５］ 別の態様では、本開示は、少なくとも７０％の精度で非天然標識を使用することなく、粒子の形態に少なくとも部分的に基づいて粒子を分類又は選別するためのイメージフリーの方法を提供する。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の生物学的粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の希少細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１つ又は複数の循環腫瘍細胞を含む。
【0006】
［００６］ 別の態様では、本開示は、粒子を方向付けるように構成された流体流路と、流体流路の少なくとも一部と感知通信する検出器と、検出器に動作可能に結合された１つ又は複数のコンピュータプロセッサと、を備える粒子処理又は分析のためのシステムを提供し、１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、（ａ）ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得し、（ｂ）空間情報を検出器に順次到達する信号に圧縮変換し、（ｃ）信号を使用して少なくとも７０％の任意の精度で粒子の少なくともサブセットを識別し、（ｄ）（ｃ）で識別された粒子の少なくともサブセットを少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するように個々に又はまとめてプログラムされる。いくつかの実施形態では、検出器は単一ピクセル検出器である。
【0007】
［００７］ 別の態様では、本開示は、１つ又は複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、粒子分析のための方法を実施する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供し、方法は、（ａ）ランダムにパターン化された光学構造に対する粒子の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を単一ピクセル検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、少なくとも７０％の精度で粒子の少なくともサブセットを識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された粒子の少なくともサブセットを、少なくとも１０粒子／秒の速度で１つ又は複数のグループに選別するステップと、を含む。
【0008】
［００８］ 別の態様では、本開示は、（ａ）パターン化された光学構造に対する細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、細胞の少なくともサブセットを癌性であると識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された細胞の少なくともサブセットを、１つ又は複数のグループの癌性細胞及び１つ又は複数のグループの非癌性細胞に選別するステップとを含む、細胞処理又は分析のための方法を提供する。
【0009】
［００９］ 別の態様では、本開示は、（ａ）パターン化された光学構造に対する細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップと、（ｃ）信号を使用して、細胞の少なくともサブセットを治療用であると識別するステップと、（ｄ）（ｃ）で識別された細胞の少なくともサブセットを、１つ又は複数のグループの治療用細胞及び１つ又は複数のグループの非治療用細胞に選別するステップとを含む、細胞処理又は分析のための方法を提供する。
【0010】
［００１０］ 別の態様では、本開示は、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するための方法であって、（ａ）パターン化された光学構造に対する複数の細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を訓練された機械学習アルゴリズムに入力して、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するステップと、を含む方法を提供する。
【0011】
［００１１］ 別の態様では、本開示は、（ａ）複数の細胞の空間情報を取得するステップと、（ｂ）少なくとも空間情報を使用して、少なくとも１，０００細胞／秒の速度で複数の細胞から複数の細胞のサブセットを分離又は単離するステップと、を含む、細胞処理のための方法を提供する。
【0012】
［００１２］ 別の態様では、本開示は、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を処理するための方法であって、（ａ）パターン化された光学構造に対する複数の細胞の運動中に空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を使用して複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するステップと、（ｃ）（ｂ）で識別された１つ又は複数の標的細胞に少なくとも部分的に基づいて、１つ又は複数の標的細胞を複数の細胞から少なくとも１０細胞／秒の速度で分離又は単離するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）光源からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉ）パターン化された光学構造からの光を複数の細胞に方向付けるステップと、（ｉｉｉ）複数の細胞からの光を検出器に方向付けるステップと、を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）光源からの光を複数の細胞に方向付けるステップと、（ｉｉ）複数の細胞からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉｉ）パターン化された光学構造からの光を検出器に方向付けるステップと、を含む。いくつかの実施形態では、パターン化された光学構造は、無秩序なパターン化された光学構造を含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、パターン化された光学構造によって付与された１つ又は複数の強度分布を含む１つ又は複数の時間波形の組み合わせ使用によって少なくとも部分的に細胞の形態をコンピュータ的に再構成するステップを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、１つ又は複数の癌細胞又は循環腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、１つ又は複数の治療用細胞を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞から分化した細胞、胚性幹細胞から分化した細胞、遺伝子操作された細胞、血液細胞、赤血球、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞、癌細胞、及び芽細胞から成る群から選択される１つ又は複数のメンバーを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、空間情報に対応する圧縮波形に１つ又は複数の機械学習分類器を適用して、１つ又は複数の標的細胞を識別するステップを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の機械学習分類器は、感度、特異度、及び少なくとも７０％の精度のうちの１つ又は複数を達成する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の機械学習分類器は、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、人工ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、深層学習、超深層学習、勾配ブースティング、アダブースティング、決定木、線形回帰、及びロジスティック回帰から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、イメージ再構成なしで処理される。いくつかの実施形態では、検出器は単一ピクセル検出器を含む。いくつかの実施形態では、単一ピクセル検出器は、光電子増倍管を備える。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞の１つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞の複数のイメージを再構成するステップをさらに含み、複数の各イメージは、異なる波長又は波長範囲を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のイメージは、ぼけアーチファクトがない。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、パターン化された光学構造に対して少なくとも１ｍ／ｓの速度で移動する。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、（ｉ）複数の細胞を分析した結果に基づいて、複数の細胞を１つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップと、（ｉｉ）１つ又は複数のグループの選別された細胞から１つ又は複数の標的細胞を収集するステップとを含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、複数の細胞の形態に基づいて、複数の細胞を１つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップを含む。いくつかの実施形態では、選別は、少なくとも１０細胞／秒の速度で達成される。いくつかの実施形態では、本方法は、濃縮された細胞混合物を生成するために、１つ又は複数のグループの選別された細胞を収集するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のグループの選別された細胞は、少なくとも７０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、方法は、１つ又は複数のグループの選別された細胞の１つ又は複数の細胞を１つ又は複数のアッセイに供するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアッセイは、溶解、核酸抽出、核酸増幅、核酸配列決定、及びタンパク質配列決定から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）の前に、細胞を流体力学的流れ集束に供するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞が、パターン化された光学構造に対して移動するときに複数の細胞の部分透過スペックルパターンを収集するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、空間情報は、複数の細胞に関する特徴、特性、又は情報に対応する。いくつかの実施形態では、空間情報は、複数の細胞に関する特徴、特性、又は情報と１対１に対応する。いくつかの実施形態では、複数の細胞に関する特徴、特性、又は情報は、以下から成る群から選択される１つ又は複数のメンバーを含む：代謝状態、増殖状態、分化状態、成熟状態、マーカータンパク質の発現、マーカー遺伝子の発現、細胞の形態、細胞小器官の形態、細胞小器官の位置、細胞小器官の大きさ又は範囲、細胞質の形態、細胞質の位置、細胞質の大きさ又は範囲、核の形態、核の位置、核の大きさ又は範囲、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの配置、ミトコンドリアの大きさ又は範囲、リソソームの形態、リゾチームの配置、リゾチームの大きさ又は範囲、細胞内分子の分布、細胞内ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の分布、細胞内核酸の分布、細胞内糖類又は多糖類の分布、及び細胞内脂質の分布。
【0013】
［００１３］ 本開示の別の態様は、１つ又は複数のコンピュータプロセッサによって実行されると、上記又は本明細書の他の箇所の方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【0014】
［００１４］ 本開示の別の態様は、１つ又は複数のコンピュータプロセッサと、それに結合されたコンピュータメモリとを備えるシステムを提供する。コンピュータメモリは、１つ又は複数のコンピュータプロセッサによって実行されると、上記又は本明細書の他の箇所の方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む。
【0015】
［００１５］ 本開示の追加の態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明される以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明白な点で修正が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示的なものとみなされるべきであり、限定的なものとみなされるべきではない。
【0016】
参照による組み込み
［００１６］ 本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
［００１６］ 本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0017】
［００１７］ 本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面（本明細書では「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」及び「図（ＦＩＧ．）」とも呼ばれる）を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1A】［００１８］ゴーストサイトメトリー（ＧＣ）プロセスで使用される光学圧縮感知プロセスの概略図を示す。
【図1B】［００１９］粒子分析方法の例のフローチャートを示す。
【図1C】［００２０］粒子を分類又は選別するためのイメージフリー光学的方法の例のフローチャートを示す。
【図2A】［００２１］構造化照明（ＳＩ）素子を備える運動ベースの圧縮蛍光イメージングのための光学セットアップの例を示す。
【図2B】［００２２］構造化検出（ＳＤ）素子を備える運動ベースの圧縮蛍光イメージングのための光学セットアップの例を示す。
【図2C】［００２３］ＳＩ素子を含む光学系を用いて取得された、移動蛍光ビーズに関連する時間波形の例を示す。
【図2D】［００２４］ＳＩ素子を含む光学系によって取得された時間波形からコンピュータ的に再構成された移動蛍光ビーズの２次元（２Ｄ）蛍光イメージの例を示す。
【図2E】［００２５］ＳＤ素子を含む光学系を使用して取得された、移動蛍光ビーズに関連する時間波形の例を示す。
【図2F】［００２６］ＳＤ素子を含む光学系によって取得された時間波形からコンピュータ的に再構成された移動蛍光ビーズの２Ｄ蛍光イメージの例を示す。
【図2G】［００２７］アレイピクセルカメラを用いて取得された移動蛍光ビーズの蛍光イメージの例を示す。
【図3A】［００２８］ＳＤ素子を備える、多色運動ベースの圧縮蛍光イメージングのための光学セットアップを示す。
【図3B】［００２９］多色運動ベースの圧縮蛍光イメージングのための光学セットアップを使用して取得された移動蛍光細胞に関連する時間波形の例を示す。
【図3C】［００３０］多色運動ベースの圧縮蛍光イメージングのための光学セットアップによって取得された時間波形からコンピュータ的に再構成された、移動蛍光細胞の２Ｄ蛍光イメージの例を示す。
【図3D】［００３１］１０，０００細胞／秒を超えるスループット速度で流れる細胞の多色サブミリ秒蛍光イメージングの例を示す。
【図4A】［００３２］ＧＣ信号に適用される分類器モデルを訓練するための手順を示す。
【図4B】［００３３］分類器モデルを試験するための手順の例を示す。
【図4C】［００３４］種々のサンプルにおけるＭＣＦ－７細胞の濃度比の例を示す。
【図4D】［００３５］分類器モデルに関連する真陽性率と偽陽性率との間の相関の例を示す。
【図4E】［００３６］末梢血単核細胞の複合混合物に対してモデル癌（ＭＣＦ－７）細胞を分類するための能力に基づく分類器モデルに関連する真陽性率と偽陽性率との間の相関の例を示す。
【図5A】［００３７］本開示のシステム及び方法とともに使用するためのマイクロ流体デバイスの例を示す。
【図5B】［００３８］本開示のシステム及び方法を用いた、形態学的に類似したＭＣＦ－７細胞に対するＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の正確な単離を示す。
【図5C】［００３９］本開示のシステム及び方法を使用した、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の複合混合物に対するモデル癌（ＭＩＡ ＰａＣａ－２）細胞の正確な単離の例を示す。
【図6】［００４０］ＳＩ素子又はＳＤ素子などの光学エンコーダパターンの強度分布を推定するための光学系の例を示す。
【図7】［００４１］細胞のＧＣベースの多色蛍光イメージングを実証するために使用される光学エンコーダの、光学セットアップ及び較正された強度分布の例を示す。
【図8】［００４２］超高速多色蛍光イメージング及びＧＣによるイメージフリーイメージングサイトメトリーに使用される光学エンコーダの光学セットアップ及び較正された強度分布の例を示す。
【図9】『図９Ａ』［００４３］本明細書に記載されるシステム及び方法とともに使用するための流体の流体力学的３次元（３Ｄ）集束のための流動細胞の例の幾何学形状の例を示す。 『図９Ｂ』［００４４］緩く及びきつく集束された流れの例を示す。 『図９Ｃ』［００４５］２０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて分類器を訓練した場合に、２０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて細胞を分類するための機械学習分類器の精度の例を示す。 『図９Ｄ』［００４６］３０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて分類器を訓練した場合に、３０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて細胞を分類するための機械学習分類器の精度の例を示す。 『図９Ｅ』［００４７］２０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて分類器を訓練した場合に、３０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて細胞を分類するための機械学習分類器の精度の例を示す。 『図９Ｆ』［００４８］２０μＬ／分の流量及び３０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて分類器を訓練した場合に、２０μＬ／分の流量下で取得されたＧＣ信号を用いて細胞を分類するための機械学習分類器の精度の例を示す。
【図10A】［００４９］ｍＣＦ－７細胞の全青色蛍光強度のヒストグラムの例を示す。
【図10B】［００５０］ｍＩＡ ＰａＣａ－２細胞の全青色蛍光強度のヒストグラムの例を示す。
【図10C】［００５１］ｍＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の混合物の例の全青色蛍光強度のヒストグラムの例を示す。
【図10D】［００５２］ｍＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の混合物の例の全緑色蛍光強度のヒストグラムの例を示す。
【図11】［００５３］サポートベクターマシン（ＳＶＭ）ベースの機械学習分類器を使用して、広範囲の濃度比にわたって分類の一貫した精度を確認する例を示す。
【図12A】［００５４］ソフトリソグラフィー技術を用いて作製された流れ集束セグメント及び細胞選別セグメントを含む細胞選別チップの例を示す。
【図12B】［００５５］流れ集束セグメントの顕微鏡イメージの例を示す。
【図12C】［００５６］細胞選別セグメントの顕微鏡イメージの例を示す。
【図12D】［００５７］本開示のシステム及び方法とともに使用するためのリアルタイム分類及び電気制御システムのためのプロセスフローの例を示す。
【図13】［００５８］本開示の方法及びシステムを実装するようにプログラムされるか、又は別様に構成される、コンピュータシステムの例を示す。
【図14】［００５９］ＧＣを利用した標識フリー細胞選別機の例を示す。
【図15】［００６０］標識フリー細胞選別機のための運動駆動圧縮ＧＣの例を示す。
【図16A】［００６１］標識フリー細胞選別機を用いたＪｕｒｋａｔ及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の選別の例を示す。
【図16B】［００６２］細胞選別前後のＪｕｒｋａｔ及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞集団のヒストグラムの例を示す。
【図17A】［００６３］人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生存、初期アポトーシス、又は死として分類するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びアネキシンＶの蛍光強度の散布図の例を示す。
【図17B】［００６４］ｉＰＳＣについての前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）の散布図の例を示す。
【図17C】［００６５］生細胞及び死細胞の分類のための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図17D】［００６６］生細胞及び初期アポトーシス細胞の分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図17E】［００６７］死細胞及び初期アポトーシス細胞の分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図18A】［００６８］機械学習分類器を訓練するために使用される神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びｉＰＳＣの混合物についてのカルセインＡＭ及びｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５強度の散布図の例を示す。
【図18B】［００６９］ＮＰＣ及びｉＰＳＣの分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図18C】［００７０］機械学習分類器を訓練するために使用される肝芽細胞及びｉＰＳＣの混合物についてのカルセインＡＭ及びｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５強度の散布図の例を示す。
【図18D】［００７１］肝芽細胞及びｉＰＳＣの分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図19A】［００７２］Ｔ細胞のｆａｂ ＦＩＴＣ強度のヒストグラムの例を示す。
【図19B】［００７３］細胞周期における異なる状態を分類するためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図19C】［００７４］ｒａｊｉ細胞の２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）強度のヒストグラムの例を示す。
【図19D】［００７５］高レベル及び低レベルのグルコースを有する細胞を分類するためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図20A】［００７６］好中球の集団を含む訓練データセットを示す。
【図20B】［００７７］好中球及び非好中球に対応する標識フリー光学信号の例を示す。
【図20C】［００７８］好中球及び非好中球の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図20D】［００７９］好酸球の集団を含む訓練データセットを示す。
【図20E】［００８０］好酸球及び非好酸球に対応する標識フリー光学信号の例を示す。
【図20F】［００８１］好酸球及び非好酸球の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図20G】［００８２］好塩基球の集団を含む訓練データセットを示す。
【図20H】［００８３］好塩基球及び非好塩基球に対応する標識フリー光信号の例を示す。
【図20I】［００８４］好塩基球及び非好塩基球の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図21A】［００８５］口腔細胞及びＨｅＬａ細胞の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図21B】［００８６］ＢＭ１細胞及びＫ５６２細胞の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。
【図22A】［００８７］第１のタイプの粒子に起因する信号、第２のタイプの粒子に起因する信号、並びに第１及び第２のタイプの粒子が同時に存在することに起因する信号の例を示す。
【図22B】［００８８］本開示の検出領域に同時に存在する異なるタイプの粒子を区別するための混同行列の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
［００８９］ 本発明の様々な実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を思いつくことができる。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替形態を使用することができることを理解されたい。
【0020】
［００９０］ 「少なくとも」、「より大きい」、又は「以上」という用語が、一連の２つ以上の数値における第１の数値に先行する場合は常に、「少なくとも」、「より大きい」、又は「以上」という用語は、その一連の数値における数値の各々に適用される。例えば、１、２又は３以上とは、１以上、２以上又は３以上と等価である。
【0021】
［００９１］ 用語「以下」、「未満」、「以下」、又は「最大」が、一連の２つ以上の数値における第１の数値に先行するときはいつでも、用語「以下」、「未満」、「以下」、又は「最大」は、その一連の数値における数値のそれぞれに適用される。例えば、３、２、又は１以下は、３以下、２以下、又は１以下と等価である。
【0022】
［００９２］ 本明細書で使用されるように、用語「光学空間情報」は、概して、物体の部品又は構成要素の空間配置に関する光学感知プロセスから導出される情報を指す。例えば、「光学空間情報」は、細胞内の細胞成分（細胞小器官、膜、又は細胞質など）の空間的配置又は組織化、組織内の細胞の空間的配置又は組織化、材料内の微細構造の空間的配置又は組織化などを指し得る。
【0023】
［００９３］ 本明細書で使用されるように、「圧縮感知」、「圧縮された感知」、「圧縮サンプリング」、「圧縮されたサンプリング」、「スパース感知」、及び「スパースサンプリング」という用語は、一般に、ナイキスト－シャノンサンプリング定理によって必要とされるよりも少ない信号のサンプルから光学空間情報を復元することによって、光学空間情報を含む信号を効率的に取得及び再構成するための信号処理技法を指す。圧縮サンプリングは、時間領域、時間周波数領域、空間領域、空間周波数領域、ウェーブレット変換領域、離散コサイン変換領域、又は離散サイン変換領域など、いくつかの領域における光学空間情報のスパース性を利用することができる。
【0024】
［００９４］ 本明細書で使用されるように、「ランダム」という用語は、一般に、パターン若しくは予測可能性を欠くプロセス、又はそのようなプロセスの生成物を指す。ランダムプロセスは、認識可能な順序を有さなくてもよく、及び／又は容易に理解可能なパターンに従わなくてもよい。ランダムプロセスは、結果が決定論的パターンに従わないイベントのシーケンスを含むことができる。ランダムプロセスは、結果が確率的又は確率論的パターンに従うイベントのシーケンスを含むことができる。
【0025】
［００９５］ 本明細書で使用されるように、「擬似ランダム」という用語は、一般に、ほぼランダムな生成物を生成する決定論的又は部分的に決定論的なプロセス、又はそのようなプロセスの生成物を指す。
【0026】
［００９６］ 本開示は、生物学的分析のための方法及びシステムを提供する。そのような方法及びシステムは、細胞などの粒子、又はタンパク質若しくは核酸などの生物学的材料を分析するために使用され得る。
【0027】
［００９７］ 本明細書に記載の方法を用いて分析及び／又は処理される粒子は、細胞などの生物学的粒子であってもよい。細胞は、任意のタイプであり得、任意の特性を有し得る。細胞は、任意のサイズ及び体積を有し得る。細胞は、任意の可能な供給源に由来し得る。例えば、細胞は、ヒト細胞、動物細胞、非ヒト霊長類細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、マウス細胞、植物細胞、細菌細胞、又は他の細胞であり得る。細胞は、組織又は器官に由来し得る。例えば、細胞は、心臓、動脈、静脈、脳、神経、肺、脊椎、脊髄、骨、結合組織、気管、食道、胃、小腸若しくは大腸、膀胱、肝臓、腎臓、脾臓、尿道、尿管、前立腺、精管、陰茎、卵巣、子宮、子宮内膜、卵管、若しくは膣、又は前述のいずれかに関連する任意の組織に由来し得る。細胞は、癌性であり得るか、又は癌性であると疑われ得る（例えば、腫瘍細胞）。例えば、細胞は腫瘍組織に由来し得る。細胞は、天然又は非天然成分を含み得る。例えば、細胞は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸、タンパク質、又は炭水化物を含み得る。細胞は、１つ又は複数のフルオロフォアなどの１つ又は複数の光学的に検出可能な要素を含み得る。フルオロフォアは、細胞にとって天然であっても非天然であってもよい。例えば、フルオロフォアは、１つ又は複数の細胞染色又は標識技術などによって細胞に導入された非天然フルオロフォアであってもよい。
【0028】
［００９８］ いくつかの場合において、複数の粒子が、本明細書中に記載される方法を使用して分析され得る。複数の粒子の粒子は、同じ供給源又は異なる供給源に由来し得る。粒子は、同じ又は異なる特性を有し得る。例えば、第１の粒子は第１のサイズを有してもよく、第２の粒子は第２のサイズを有してもよく、第１のサイズ及び第２のサイズは同じではない。本明細書に記載される方法及びシステムは、複数の粒子を特徴付け及び／又は識別するために使用され得る。例えば、本方法及びシステムは、第１の粒子及び第２の粒子を特徴付け得、粒子のサイズ及び形態に関する情報を提供し得、それによって、第１の粒子を第２の粒子とは異なるものとして識別し得る。
【0029】
［００９９］ 多くの単一細胞のイメージング及び分析は、免疫学（１）、癌（２）、神経科学（３）、血液学（４）、及び発達（５）に関与する不均一系の理解を実質的に増加させる可能性を保持する。これらの分野における多くの重要な用途は、ハイコンテントイメージに含まれる情報に従って、細胞の特定の集団の正確かつハイスループットな単離を必要とする。これはいくつかの課題を提起する。第１に、最近の発展（６－１０）にもかかわらず、高感度、多色性、高シャッター速度、高フレームレート、連続取得、及び低コストの要求を同時に満たすことは困難なままである。第２に、超高速かつ連続的なイメージ取得は、その後、時間及び費用の両方に関して費用がかかるコンピュータによるイメージ再構成及び分析を必要とする（１１）。そのような課題のため、蛍光イメージング活性化細胞選別（ＦｉＣＳ）は、本明細書に開示される方法及びシステムの前には実現されていない。本明細書に開示されるのは、単一ピクセル検出器を使用して測定された圧縮イメージング信号に機械学習方法を適用して、超高速、高感度、かつ正確な形態ベースの細胞分析を可能にし得る、方法及びシステムである。本方法及びシステムは、イメージフリー（イメージ生成を必要としない）であり得るが、本方法及びシステムは、所望される場合、イメージ生成を組み込み得る。本方法及びシステムは、リアルタイムで粒子を選別するようにさらに構成されてもよい。そのような方法及びシステムは、「ゴーストサイトメトリー」（ＧＣ）と呼ばれ得る。
【0030】
［００１００］ 図１Ａは、ＧＣプロセスで使用される光学圧縮感知プロセスの例の概略図を示す。パターン化された光学構造を横切る物体の相対運動を用いて、物体の空間情報を時間信号列に圧縮マッピングすることができる。パターン化された光学構造は、光学構造内の各領域における光学特性（透過率、吸収率、反射率、又はそれらの指標など）の値を含む行列Ｈ（ｘ、ｙ）によって定義され得る。図１Ａに示されるように、Ｆ１及びＦ２は、物体内の代表的な特徴（蛍光特徴など）を描写し得る。物体の運動に基づいて、Ｈ（ｘ、ｙ）の空間的に変化する光学特性は、フルオロフォアＦ１及びＦ２からの光強度（蛍光発光強度など）の時間的変調として符号化され得る（図１Ａにおいて、それぞれ「Ｆ１からの発光強度」及び「Ｆ２からの発光強度」として示される）。それらの合計ｇ（ｔ）は、図１Ａの下部に示されるように、単一ピクセル検出器を使用して記録され得る。イメージングモードでは、物体の２次元（２Ｄ）イメージは、多重化された時間波形ｇ（ｔ）と光学構造の強度分布Ｈ（ｘ、ｙ）との組み合わせ使用によってコンピュータ的に再構成され得る。イメージフリーモードでは、機械学習方法を圧縮時間波形に直接適用することにより、ハイスループット、高精度、イメージフリーの形態ベースの細胞分類をもたらすことができる。図１Ａに示される概略図は、縮尺通りではない。
【0031】
［００１０１］ ＧＣでは、物体が、パターン化された光学構造を通過するとき、構造内の各配置されたスポットは、物体の順次異なる場所であり得る。例えば、構造内に配置された各スポットは、物体の異なる位置にあるフルオロフォアを順次励起することができる。各位置からの符号化された強度は、検出器（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）等の単一ピクセル検出器）を使用して測定される単一時間波形として、多重化され、圧縮的かつ連続的に測定されてもよい。物体が速度ｖで一定の一方向運動をしていると仮定すると、信号取得は数学的に次のように記述することができる。
【0032】
【数1】
【0033】
ここで、ｇ（ｔ）は多重化時間波形であり、Ｈ（ｘ、ｙ）は光学構造の強度分布であり、Ｉ（ｘ、ｙ）は移動物体の強度分布である。空間符号化演算子として作用するＨ（ｘ、ｙ）は、静的であり得、その結果、走査又は連続的な光投影は、ＧＣにおいて必要とされ得ないことに留意されたい。光学構造のためのバイナリランダムパターンは、単純な実装として本明細書に記載される。ＧＣの測定プロセスでは、物体は、ｘ方向に沿って光学構造と畳み込まれてもよく、結果として生じる信号は、ｙ方向に沿って積分されてもよい。圧縮感知の文献では、ランダム化された畳み込みは、イメージングモダリティとみなされ得る（１２）。式（１）が順モデルとして与えられると、イメージ再構成プロセスは逆問題を解くことになる。解は、多重化された時間波形ｇ（ｔ）と光学構造の強度分布Ｈ（ｘ、ｙ）との組み合わせ使用によって計算され得る目的関数を最小化することによって反復的に推定され得る。正則化領域におけるスパースイベントに対して、移動物体は、２段階反復収縮／閾値化（ＴｗＩＳＴ）などの圧縮検知アルゴリズムを採用することによって、測定された信号ｇ（ｔ）から合理的に推定され得る（１３）。このような再構成プロセスは、ゴーストイメージングとその概念を共有することができ、ゴーストイメージングでは、多数のランダムな光学パターンを物体上に順次投影し、単一ピクセル検出器を使用して結果として生じる信号を記録した後に、元のイメージがコンピュータ的に復元される（１４－１９）。ゴーストイメージングは科学界においてかなりの注目を集めてきたが、光パターンの逐次投影はゴーストイメージングを遅くし、その実用的使用を妨げてきた。光投影に必要な時間を短縮するために圧縮感知を使用した場合でも、本方法は従来のアレイピクセルカメラよりも依然として遅かった（１８）。対照的に、ＧＣは、機器のいかなる移動も必要とせず、イメージ取得の速度は、物体の運動とともに増加し得る。ＧＣにおけるイメージ取得の速度は、単一ピクセル検出器の帯域幅によってのみ制限され得る。そのような帯域幅は、少なくとも約１メガヘルツ（ＭＨｚ）、１０ＭＨｚ、１００ＭＨｚ、１ギガヘルツ（ＧＨｚ）、又はそれ以上など、非常に高くなり得る。したがって、ＧＣにおける運動の使用は、低速ゴーストイメージングを実用的な超高速の連続イメージング手順に変換することができる。例えば、ＧＣは、従来の蛍光ゴーストイメージング方法よりも少なくとも１０，０００倍速い取得速度に達し得る。
【0034】
［００１０２］ 一態様では、本開示は、粒子分析のための方法を提供する。方法は、パターン化された光学構造に対する粒子の運動から空間情報を取得するステップを含んでもよい。次に、空間情報は、検出器に順次到達する信号に圧縮変換され得る。次いで、信号を使用して粒子を分析することができる。
【0035】
［００１０３］ 図１Ｂは、粒子分析の方法１００のフローチャートを示す。第１の動作１１０において、方法１００は、パターン化された光学構造に対する粒子の運動から空間情報を取得するステップを含むことができる。空間情報は、光学空間情報を含んでもよく、光学空間情報は、光学感知アプローチによって取得された空間情報であってもよい。代替的に又は組み合わせて、空間情報は、インピーダンス測定等の非光学感知アプローチによって取得され得る、非光学空間情報を備えてもよい。
【0036】
［００１０４］ 粒子は、１つ又は複数の生物学的粒子を含み得る。粒子は、１つ又は複数の細胞を含み得る。
【0037】
［００１０５］ 粒子は、１つ又は複数の希少細胞を含み得る。希少細胞は、最大で約１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１、６００分の１、７００分の１、８００分の１、９００分の１、１，０００分の１、２，０００分の１、３，０００分の１、４，０００分の１、５，０００分の１、６，０００分の１、７，０００分の１、８，０００分の１、９，０００分の１、１０，０００分の１、２０，０００分の１、３０，０００分の１、４０，０００分の１、５０，０００分の１、６０，０００分の１、７０，０００分の１、８０，０００分の１、９０，０００分の１、１００，０００分の１、２００，０００分の１、３００，０００分の１、４００，０００分の１、５００，０００分の１、６００，０００分の１、７００，０００分の１、８００，０００分の１、９００，０００分の１、１，０００，０００分の１、２，０００，０００分の１、３，０００，０００分の１、４，０００，０００分の１、５，０００，０００分の１、６，０００，０００分の１、７，０００，０００分の１、８，０００，０００分の１、９，０００，０００分の１、１０，０００，０００分の１、２０，０００，０００分の１、３０，０００，０００分の１、４０，０００，０００分の１、５０，０００，０００分の１、６０，０００，０００分の１、７０，０００，０００分の１、８０，０００，０００分の１、９０，０００，０００分の１、１００，０００，０００分の１、２００，０００，０００分の１、３００，０００，０００分の１、４００，０００，０００分の１、５００，０００，０００分の１、６００，０００，０００分の１、７００，０００，０００分の１、８００，０００，０００分の１、９００，０００，０００分の１、１，０００，０００，０００分の１、またはそれ以上の濃度で（分析下の他の細胞と比較して）存在し得る。希少細胞は、少なくとも約１，０００，０００，０００分の１、９００，０００，０００分の１、８００，０００，０００分の１、７００，０００，０００分の１、６００，０００，０００分の１、５００，０００，０００分の１、４００，０００，０００分の１、３００，０００，０００分の１、２００，０００，０００分の１、１００，０００，０００分の１、９０，０００，０００分の１、８０，０００，０００分の１、７０，０００，０００分の１、６０，０００，０００分の１、５０，０００，０００分の１、４０，０００，０００分の１、３０，０００，０００分の１、２０，０００，０００分の１、１０，０００，０００分の１、９，０００，０００分の１、８，０００，０００分の１、７，０００，０００分の１、６，０００，０００分の１、５，０００，０００分の１、４，０００，０００分の１、３，０００，０００分の１、２，０００，０００分の１、１，０００，０００分の１、９００，０００分の１、８００，０００分の１、７００，０００分の１、６００，０００分の１、５００，０００分の１、４００，０００分の１、３００，０００分の１、２００，０００分の１、１００，０００分の１、９０，０００分の１、８０，０００分の１、７０，０００分の１、６０，０００分の１、５０，０００分の１、４０，０００分の１、３０，０００分の１、２０，０００分の１、１０，０００分の１、９，０００分の１、８，０００分の１、７，０００分の１、６，０００分の１、５，０００分の１、４，０００分の１、３，０００分の１、２，０００分の１、１，０００分の１、９００分の１、８００分の１、７００分の１、６００分の１、５００分の１、４００分の１、３００分の１、２００分の１、１００分の１、９０分の１、８０分の１、７０分の１、６０分の１、５０分の１、４０分の１、３０分の１、２０分の１、１０分の１、またはそれ以上の濃度で存在し得る。希少細胞は、前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度で存在し得る。
【0038】
［００１０６］ 粒子は、１つ又は複数の癌細胞を含み得る。粒子は、１つ又は複数の循環腫瘍細胞を含み得る。粒子は、本明細書に記載される任意の細胞を含み得る。細胞は、本明細書に記載される任意の供給源に由来し得る。細胞は、本明細書に記載される任意の天然又は非天然成分を含み得る。
【0039】
［００１０７］ パターン化された光学構造は、複数の領域を含むことができる。例えば、パターン化された光学構造は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、又はそれ以上の領域を含み得る。パターン化された光学構造は、最大で約１，０００，０００、９００，０００、８００，０００、７００，０００、６００，０００、５００，０００、４００，０００、３００，０００、２００，０００、１００，０００、９０，０００、８０，０００、７０，０００、６０，０００、５０，０００、４０，０００、３０，０００、２０，０００、１０，０００、９，０００、８，０００、７，０００、６，０００、５，０００、４，０００、３，０００、２，０００、１，０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つの領域を含み得る。パターン化された光学構造は、前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内にあるいくつかの領域を含むことができる。
【0040】
［００１０８］ 複数の領域の各領域は、１つ又は複数の透過率、吸収率、又は反射率などの１つ又は複数の特定の光学特性を含むことができる。例えば、各領域は、少なくとも約０％、１％、２％、３％、４％、５％、６０％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の透過率、吸収率、又は反射率を備え得る。各領域は、最大で約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％の透過率、吸収率、又は反射率を備え得る。各領域は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある透過率、吸収率、又は反射率を備えてもよい。
【0041】
［００１０９］ 光学特性は、領域ごとに異なっていてもよい。例えば、任意の２つの領域は、同じ又は異なる透過率、吸収率、又は反射率を含むことができる。光学特性は、領域ごとに異なっていてもよい。
【0042】
［００１１０］ パターン化された光学構造は、空間光変調器（ＳＬＭ）、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、液晶（ＬＣ）デバイス、またはフォトマスクを含むことができる。
【0043】
［００１１１］ パターン化された光学構造は、微細加工またはナノ加工技術を用いて製造され得る。例えば、パターン化された光学構造は、溶媒洗浄、ピラーニャ洗浄、ＲＣＡ洗浄、イオン注入、紫外線フォトリソグラフィー、深紫外線フォトリソグラフィー、極限紫外線フォトリソグラフィー、電子ビームリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、湿式化学エッチング、乾式化学エッチング、プラズマエッチング、反応性イオンエッチング、深部反応性イオンエッチング、電子ビームミリング、熱アニーリング、熱酸化、薄膜堆積、化学蒸着、分子有機化学蒸着、低圧化学蒸着、プラズマ増強化学蒸着、物理蒸着、スパッタリング、原子層蒸着、分子ビームエピタキシー、電気化学蒸着、ウエハボンディング、ワイヤボンディング、フリップチップボンディング、サーモソニックボンディング、ウエハダイシング、又はその他の微細加工若しくはナノ加工製造技術の内の任意の１つ又は複数を用いて製造され得る。
【0044】
［００１１２］ パターン化された光学構造は、規則的なパターン化された光学構造を含んでもよい。規則的なパターン化された光学構造は、異なる光学特性の領域の周期的配置又は他の規則的配置を含んでもよい。パターン化された光学構造は、無秩序なパターン化された光学構造を含んでもよい。無秩序なパターン化された光学構造は、異なる光学特性の領域の無秩序な配置を含むことができる。パターン化された光学構造は、非周期的なパターン化された光学構造を含んでもよい。非周期的なパターン化された光学構造は、異なる光学特性の領域の非周期的配置を含んでもよい。パターン化された光学構造は、ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造を含んでもよい。ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造は、異なる光学特性の領域のランダム又は擬似ランダム配置を含むことができる。
【0045】
［００１１３］ ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造などの無秩序な又は非周期的な光学構造は、例えば、周波数（又はフーリエ）領域にわたる減衰を低減することによって、（物体に対応するイメージのより正確な再構成などの）検査中の物体に対するより高い忠実度を有する光学空間情報の取得を可能にすることができる。本開示のシステム及び方法を使用して測定された信号は、パターン化された光学構造及び検査中の物体の１次元畳み込みと見なされ得る。測定値が周波数領域で解釈されるとき、これは、畳み込み定理に起因して、パターン化された光学構造のフーリエ変換と検査中の物体のフーリエ変換との乗算に対応し得る。したがって、減衰なしに検査中の物体に対応する光学空間情報を測定するために、均一な分布に近いパターン化された光学構造のフーリエ変換を取得することが有益であり得る。無秩序な又は非周期的関数のフーリエ変換は一様分布である。したがって、ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造などの無秩序な又は非周期的なパターン化された光学構造は、検査中の物体に対してより高い忠実度で光学空間情報を取得することを可能にすることができる。
【0046】
［００１１４］ 第２の動作１２０において、方法１００は、空間情報を、検出器に順次到達する信号に圧縮変換するステップを含むことができる。検出器は、１つ又は複数の単一ピクセル検出器を備えてもよい。検出器は、１つ又は複数のマルチピクセル検出器を備えてもよい。検出器は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、又はそれ以上のピクセルを含み得る。検出器は、最大で約１，０００，０００、９００，０００、８００，０００、７００，０００、６００，０００、５００，０００、４００，０００、３００，０００、２００，０００、１００，０００、９０，０００、８０，０００、７０，０００、６０，０００、５０，０００、４０，０００、３０，０００、２０，０００、１０，０００、９，０００、８，０００、７，０００、６，０００、５，０００、４，０００、３，０００、２，０００、１，０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのピクセルを含み得る。検出器は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にあるいくつかのピクセルを備え得る。
【0047】
［００１１５］ 検出器は、１つ又は複数の光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、フォトトランジスタ、逆バイアス発光ダイオード（ＬＥＤ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラを備えてもよい。
【0048】
［００１１６］ 検出器は、光を検出するように構成され得る。光は、赤外（ＩＲ）光、可視光、又は紫外（ＵＶ）光を含むことができる。光は、複数の波長を含むことができる。光は、少なくとも約２００ｎｍ、２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ、２５０ｎｍ、２６０ｎｍ、２７０ｎｍ、２８０ｎｍ、２９０ｎｍ、３００ｎｍ、３１０ｎｍ、３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍ、３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ、６４０ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、７４０ｎｍ、７５０ｎｍ、７６０ｎｍ、７７０ｎｍ、７８０ｎｍ、７９０ｎｍ、８００ｎｍ、８１０ｎｍ、８２０ｎｍ、８３０ｎｍ、８４０ｎｍ、８５０ｎｍ、８６０ｎｍ、８７０ｎｍ、８８０ｎｍ、８９０ｎｍ、９００ｎｍ、９１０ｎｍ、９２０ｎｍ、９３０ｎｍ、９４０ｎｍ、９５０ｎｍ、９６０ｎｍ、９７０ｎｍ、９８０ｎｍ、９９０ｎｍ、１，０００ｎｍ、又はそれ以上の、１つ又は複数の波長を含むことができる。
【0049】
［００１１７］ 光は、少なくとも約１，０００ｎｍ、９９０ｎｍ、９８０ｎｍ、９７０ｎｍ、９６０ｎｍ、９５０ｎｍ、９４０ｎｍ、９３０ｎｍ、９２０ｎｍ、９１０ｎｍ、９００ｎｍ、８９０ｎｍ、８８０ｎｍ、８７０ｎｍ、８６０ｎｍ、８５０ｎｍ、８４０ｎｍ、８３０ｎｍ、８２０ｎｍ、８１０ｎｍ、８００ｎｍ、７９０ｎｍ、７８０ｎｍ、７７０ｎｍ、７６０ｎｍ、７５０ｎｍ、７４０ｎｍ、７３０ｎｍ、７２０ｎｍ、７１０ｎｍ、７００ｎｍ、６９０ｎｍ、６８０ｎｍ、６７０ｎｍ、６６０ｎｍ、６５０ｎｍ、６４０ｎｍ、６３０ｎｍ、６２０ｎｍ、６１０ｎｍ、６００ｎｍ、５９０ｎｍ、５８０ｎｍ、５７０ｎｍ、５６０ｎｍ、５５０ｎｍ、５４０ｎｍ、５３０ｎｍ、５２０ｎｍ、５１０ｎｍ、５００ｎｍ、４９０ｎｍ、４８０ｎｍ、４７０ｎｍ、４６０ｎｍ、４５０ｎｍ、４４０ｎｍ、４３０ｎｍ、４２０ｎｍ、４１０ｎｍ、４００ｎｍ、３９０ｎｍ、３８０ｎｍ、３７０ｎｍ、３６０ｎｍ、３５０ｎｍ、３４０ｎｍ、３３０ｎｍ、３２０ｎｍ、３１０ｎｍ、３００ｎｍ、２９０ｎｍ、２８０ｎｍ、２７０ｎｍ、２６０ｎｍ、２５０ｎｍ、２４０ｎｍ、２３０ｎｍ、２２０ｎｍ、２１０ｎｍ、２００ｎｍ、又はそれ以下の、１つ又は複数の波長を含むことができる。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある１つ又は複数の波長を含んでもよい。
【0050】
［００１１８］ 光は、少なくとも約０．００１ｎｍ、０．００２ｎｍ、０．００３ｎｍ、０．００４ｎｍ、０．００５ｎｍ、０．００６ｎｍ、０．００７ｎｍ、０．００８ｎｍ、０．００９ｎｍ、０．０１ｎｍ、０．０２ｎｍ、０．０３ｎｍ、０．０４ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、又はそれ以上の帯域幅を有し得る。光は、最大で約１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、９ｎｍ、８ｎｍ、７ｎｍ、６ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、１ｎｍ、０．９ｎｍ、０．８ｎｍ、０．７ｎｍ、０．６ｎｍ、０．５ｎｍ、０．４ｎｍ、０．３ｎｍ、０．２ｎｍ、０．１ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０４ｎｍ、０．０３ｎｍ、０．０２ｎｍ、０．０１ｎｍ、０．００９ｎｍ、０．００８ｎｍ、０．００７ｎｍ、０．００６ｎｍ、０．００５ｎｍ、０．００４ｎｍ、０．００３ｎｍ、０．００２ｎｍ、０．００１ｎｍ、またはそれ以下の帯域幅を有し得る。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある帯域幅を有し得る。
【0051】
［００１１９］ 検出器は、少なくとも約１ＭＨｚ、２ｍＨｚ、３ｍＨｚ、４ｍＨｚ、５ｍＨｚ、６ｍＨｚ、７ｍＨｚ、８ｍＨｚ、９ｍＨｚ、１０ｍＨｚ、２０ｍＨｚ、３０ｍＨｚ、４０ｍＨｚ、５０ｍＨｚ、６０ｍＨｚ、７０ｍＨｚ、８０ｍＨｚ、９０ｍＨｚ、１００ｍＨｚ、２００ｍＨｚ、３００ｍＨｚ、４００ｍＨｚ、５００ｍＨｚ、６００ｍＨｚ、７００ｍＨｚ、８００ｍＨｚ、９００ｍＨｚ、１ＧＨｚ、２ＧＨｚ、３ＧＨｚ、４ＧＨｚ、５ＧＨｚ、６ＧＨｚ、７ＧＨｚ、８ＧＨｚ、９ＧＨｚ、１０ＧＨｚ、２０ＧＨｚ、３０ＧＨｚ、４０ＧＨｚ、５０ＧＨｚ、６０ＧＨｚ、７０ＧＨｚ、８０ＧＨｚ、９０ＧＨｚ、１００ＧＨｚ、２００ＧＨｚ、３００ＧＨｚ、４００ＧＨｚ、５００ＧＨｚ、６００ＧＨｚ、７００ＧＨｚ、８００ＧＨｚ、９００ＧＨｚ、１，０００ＧＨｚ、又はそれ以上のリフレッシュレートを有し得る。
【0052】
［００１２０］ 検出器は、最大で約１，０００ＧＨｚ、９００ＧＨｚ、８００ＧＨｚ、７００ＧＨｚ、６００ＧＨｚ、５００ＧＨｚ、４００ＧＨｚ、３００ＧＨｚ、２００ＧＨｚ、１００ＧＨｚ、９０ＧＨｚ、８０ＧＨｚ、７０ＧＨｚ、６０ＧＨｚ、５０ＧＨｚ、４０ＧＨｚ、３０ＧＨｚ、２０ＧＨｚ、１０ＧＨｚ、９ＧＨｚ、８ＧＨｚ、７ＧＨｚ、６ＧＨｚ、５ＧＨｚ、４ＧＨｚ、３ＧＨｚ、２ＧＨｚ、１ＧＨｚ、９００ｍＨｚ、８０ｍＨｚ、７００ｍＨｚ、６００ｍＨｚ、５００ｍＨｚ、４００ｍＨｚ、３００ｍＨｚ、２００ｍＨｚ、１００ｍＨｚ、９０ｍＨｚ、８０ｍＨｚ、７０ｍＨｚ、６０ｍＨｚ、５０ｍＨｚ、４０ｍＨｚ、３０ｍＨｚ、２０ｍＨｚ、１０ｍＨｚ、９ｍＨｚ、８ｍＨｚ、７ｍＨｚ、６ｍＨｚ、５ｍＨｚ、４ｍＨｚ、３ｍＨｚ、２ｍＨｚ、１ＭＨｚ、又はそれ以下のリフレッシュレートを有し得る。検出器は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にあるリフレッシュレートを有し得る。
【0053】
［００１２１］ 第２の動作１２０は、２段階反復収縮／閾値化（ＴｗＩＳＴ）手順を適用するステップを含むことができる。
【0054】
［００１２２］ 第３の動作１３０において、方法１００は、信号を使用して粒子の少なくともサブセットを識別するステップを含むことができる。第３の動作１３０は、（例えば、図１Ａに関して）本明細書に記載されるように、パターン化された光学構造によって付与される１つ又は複数の光強度分布を含む１つ又は複数の時間波形の組み合わせ使用を少なくとも部分的に通して、粒子の形態をコンピュータ的に再構成するステップを含んでもよい。
【0055】
［００１２３］ 第１の動作１１０は、（ｉ）光源からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉ）パターン化された光学構造からの光を粒子に方向付けるステップと、（ｉｉｉ）粒子からの光を検出器に方向付けるステップとを含むことができる。そのようなシナリオでは、パターン化された光学構造は、光と粒子との相互作用の前に、光源からの光に光学符号化を与えることができる。そのようなシナリオは、構造化照明（ＳＩ）と呼ばれることがある。
【0056】
［００１２４］ 代替的に又は組み合わせて、第１の動作１１０は、（ｉ）光源からの光を粒子に方向付けるステップと、（ｉｉ）粒子からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けるステップと、（ｉｉｉ）パターン化された光学構造からの光を検出器に方向付けるステップとを含んでもよい。そのようなシナリオでは、パターン化された光学構造は、光と粒子との相互作用の後に、光源からの光に光学符号化を付与することができる。そのようなシナリオは、構造化検出（ＳＤ）と呼ばれることがある。
【0057】
［００１２５］ 光源はレーザを含むことができる。例えば、光源は連続波レーザを含むことができる。光源は、パルスレーザを含むことができる。光源は、ヘリウム－ネオン（ＨｅＮｅ）レーザ、アルゴン（Ａｒ）レーザ、クリプトン（Ｋｒ）レーザ、キセノン（Ｘｅ）イオンレーザ、窒素（Ｎ２）レーザ、二酸化炭素（ＣＯ２）レーザ、一酸化炭素（ＣＯ）レーザ、横方向励起大気（ＴＥＡ）レーザ、又はエキシマレーザなどのガスレーザを含むことができる。例えば、光源は、アルゴン二量体（Ａｒ２）エキシマレーザ、クリプトン二量体（Ｋｒ２）エキシマレーザ、フッ素二量体（Ｆ２）エキシマレーザ、キセノン二量体（Ｘｅ２）エキシマレーザ、フッ化アルゴン（ＡｒＦ）エキシマレーザ、塩化クリプトン（ＫｒＣｌ）エキシマレーザ、フッ化クリプトン（ＫｒＦ）エキシマレーザ、臭化キセノン（ＸｅＢｒ）エキシマレーザ、塩化キセノン（ＸｅＣｌ）エキシマレーザ、又はフッ化キセノン（ＸｅＦ）エキシマレーザを含むことができる。光源は、色素レーザを含むことができる。
【0058】
［００１２６］ 光源は、ヘリウム－カドミウム（ＨｅＣｄ）金属－蒸気レーザ、ヘリウム－水銀（ＨｅＨｇ）金属－蒸気レーザ、ヘリウム－セレン（ＨｅＳｅ）金属－蒸気レーザ、ヘリウム－銀（ＨｅＡｇ）金属－蒸気レーザ、ストロンチウム（Ｓｒ）金属－蒸気レーザ、ネオン－銅（ＮｅＣｕ）金属－蒸気レーザ、銅（Ｃｕ）金属－蒸気レーザ、金（Ａｕ）金属－蒸気レーザ、マンガン（Ｍｎ）金属－蒸気、又は塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）金属－蒸気レーザなどの金属－蒸気レーザを含むことができる。
【0059】
［００１２７］ 光源は、ルビーレーザ、金属ドープ結晶レーザ、又は金属ドープファイバレーザなどの固体レーザを含むことができる。例えば、光源は、ネオジムドープイットリウムアルミニウムガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザ、ネオジム／クロムドープイットリウムアルミニウムガーネット（Ｎｄ／Ｃｒ：ＹＡＧ）レーザ、エルビウムドープイットリウムアルミニウムガーネット（Ｅｒ：ＹＡＧ）レーザ、ネオジムドープイットリウムフッ化リチウム（Ｎｄ：ＹＬＦ）レーザ、ネオジムドープイットリウムオルトバナジン酸（ＮＤ：ＹＶＯ４）レーザ、ネオジムドープイットリウムカルシウムオキソホウ酸（Ｎｄ：ＹＣＯＢ）レーザ、ネオジムガラス（Ｎｄ：ガラス）レーザ、チタンサファイア（Ｔｉ：サファイア）レーザ、ツリウムドープイットリウムアルミニウムガーネット（Ｔｍ：ＹＡＧ）レーザ、イッテルビウムドープイットリウムアルミニウムガーネット（Ｙｂ：ＹＡＧ）レーザ、イッテルビウムドープガラス（Ｙｔ：ガラス）レーザ、ホルミウムイットリウムアルミニウムガーネット（Ｈｏ：ＹＡＧ）レーザ、クロムドープセレン化亜鉛（Ｃｒ：ＺｎＳｅ）レーザ、セリウムドープフッ化リチウムストロンチウムフッ化アルミニウム（Ｃｅ：ＬｉＳＡＦ）レーザ、セリウムドープリチウムカルシウムフッ化アルミニウム（Ｃｅ：ＬｉＣＡＦ）レーザ、エルビウムドープガラス（Ｅｒ：ガラス）レーザ、エルビウムイッテルビウムコドープガラス（Ｅｒ／Ｙｔ：ガラス）レーザ、ウランドープフッ化カルシウム（Ｕ：ＣａＦ２）レーザ、又はサマリウムドープフッ化カルシウム（Ｓｍ：ＣａＦ２）レーザを含み得る。
【0060】
［００１２８］ 光源は、窒化ガリウム（ＧａＮ）レーザ、窒化インジウムガリウム（ＩｎＧａＮ）レーザ、アルミニウムガリウムインジウムリン（ＡｌＧａＩｎＰ）レーザ、アルミニウムガリウムヒ素（ＡｌＧａＡｓ）レーザ、インジウムガリウムヒ素リン（ＩｎＧａＡｓＰ）レーザ、垂直共振器面発光レーザ（ＶＣＳＥＬ）、又は量子カスケードレーザなどの半導体レーザ又はダイオードレーザを含むことができる。
【0061】
［００１２９］ 光源は、光を放射するように構成され得る。光は、赤外（ＩＲ）光、可視光、又は紫外（ＵＶ）光を含むことができる。光は、複数の波長を含むことができる。光は、少なくとも約２００ｎｍ、２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ、２５０ｎｍ、２６０ｎｍ、２７０ｎｍ、２８０ｎｍ、２９０ｎｍ、３００ｎｍ、３１０ｎｍ、３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍ、３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ、６４０ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、７４０ｎｍ、７５０ｎｍ、７６０ｎｍ、７７０ｎｍ、７８０ｎｍ、７９０ｎｍ、８００ｎｍ、８１０ｎｍ、８２０ｎｍ、８３０ｎｍ、８４０ｎｍ、８５０ｎｍ、８６０ｎｍ、８７０ｎｍ、８８０ｎｍ、８９０ｎｍ、９００ｎｍ、９１０ｎｍ、９２０ｎｍ、９３０ｎｍ、９４０ｎｍ、９５０ｎｍ、９６０ｎｍ、９７０ｎｍ、９８０ｎｍ、９９０ｎｍ、１，０００ｎｍ、又はそれ以上の、１つ又は複数の波長を含むことができる。
【0062】
［００１３０］ 光は、少なくとも約１，０００ｎｍ、９９０ｎｍ、９８０ｎｍ、９７０ｎｍ、９６０ｎｍ、９５０ｎｍ、９４０ｎｍ、９３０ｎｍ、９２０ｎｍ、９１０ｎｍ、９００ｎｍ、８９０ｎｍ、８８０ｎｍ、８７０ｎｍ、８６０ｎｍ、８５０ｎｍ、８４０ｎｍ、８３０ｎｍ、８２０ｎｍ、８１０ｎｍ、８００ｎｍ、７９０ｎｍ、７８０ｎｍ、７７０ｎｍ、７６０ｎｍ、７５０ｎｍ、７４０ｎｍ、７３０ｎｍ、７２０ｎｍ、７１０ｎｍ、７００ｎｍ、６９０ｎｍ、６８０ｎｍ、６７０ｎｍ、６６０ｎｍ、６５０ｎｍ、６４０ｎｍ、６３０ｎｍ、６２０ｎｍ、６１０ｎｍ、６００ｎｍ、５９０ｎｍ、５８０ｎｍ、５７０ｎｍ、５６０ｎｍ、５５０ｎｍ、５４０ｎｍ、５３０ｎｍ、５２０ｎｍ、５１０ｎｍ、５００ｎｍ、４９０ｎｍ、４８０ｎｍ、４７０ｎｍ、４６０ｎｍ、４５０ｎｍ、４４０ｎｍ、４３０ｎｍ、４２０ｎｍ、４１０ｎｍ、４００ｎｍ、３９０ｎｍ、３８０ｎｍ、３７０ｎｍ、３６０ｎｍ、３５０ｎｍ、３４０ｎｍ、３３０ｎｍ、３２０ｎｍ、３１０ｎｍ、３００ｎｍ、２９０ｎｍ、２８０ｎｍ、２７０ｎｍ、２６０ｎｍ、２５０ｎｍ、２４０ｎｍ、２３０ｎｍ、２２０ｎｍ、２１０ｎｍ、２００ｎｍ、又はそれ以下の、１つ又は複数の波長を含むことができる。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある１つ又は複数の波長を含んでもよい。
【0063】
［００１３１］ 光は、少なくとも約０．００１ｎｍ、０．００２ｎｍ、０．００３ｎｍ、０．００４ｎｍ、０．００５ｎｍ、０．００６ｎｍ、０．００７ｎｍ、０．００８ｎｍ、０．００９ｎｍ、０．０１ｎｍ、０．０２ｎｍ、０．０３ｎｍ、０．０４ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、又はそれ以上の帯域幅を有し得る。光は、最大で約１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、９ｎｍ、８ｎｍ、７ｎｍ、６ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、１ｎｍ、０．９ｎｍ、０．８ｎｍ、０．７ｎｍ、０．６ｎｍ、０．５ｎｍ、０．４ｎｍ、０．３ｎｍ、０．２ｎｍ、０．１ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０４ｎｍ、０．０３ｎｍ、０．０２ｎｍ、０．０１ｎｍ、０．００９ｎｍ、０．００８ｎｍ、０．００７ｎｍ、０．００６ｎｍ、０．００５ｎｍ、０．００４ｎｍ、０．００３ｎｍ、０．００２ｎｍ、０．００１ｎｍ、またはそれ以下の帯域幅を有し得る。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある帯域幅を有し得る。
【0064】
［００１３２］ 光は、少なくとも約１マイクロワット（μＷ）、２μＷ、３μＷ、４μＷ、５μＷ、６μＷ、７μＷ、８μＷ、９μＷ、１０μＷ、２０μＷ、３０μＷ、４０μＷ、５０μＷ、６０μＷ、７０μＷ、８０μＷ、９０μＷ、１００μＷ、２００μＷ、３００μＷ、４００μＷ、５００μＷ、６００μＷ、７００μＷ、８００μＷ、９００μＷ、１ミリワット（ｍＷ）、２ｍＷ、３ｍＷ、４ｍＷ、５ｍＷ、６ｍＷ、７ｍＷ、８ｍＷ、９ｍＷ、１０ｍＷ、２０ｍＷ、３０ｍＷ、４０ｍＷ、５０ｍＷ、６０ｍＷ、７０ｍＷ、８０ｍＷ、９０ｍＷ、１００ｍＷ、２００ｍＷ、３００ｍＷ、４００ｍＷ、５００ｍＷ、６００ｍＷ、７００ｍＷ、８００ｍＷ、９００ｍＷ、１ワット（Ｗ）、２Ｗ、３Ｗ、４Ｗ、５Ｗ、ｍＷ、ｍＷ、ｍＷ、ｍＷ、ｍＷ、ｍＷ、ｍＷ、ｍＷ、１ワット（Ｗ）、２Ｗ、３Ｗ、４Ｗ、５Ｗ、６Ｗ、７Ｗ、８Ｗ、９Ｗ、１０Ｗ、又はそれ以上の平均光パワーを有し得る。
【0065】
［００１３３］ 光は、最大で約１０Ｗ、９Ｗ、８Ｗ、７Ｗ、６Ｗ、５Ｗ、４Ｗ、３Ｗ、２Ｗ、１Ｗ、９００ｍＷ、８００ｍＷ、７００ｍＷ、６００ｍＷ、５００ｍＷ、４００ｍＷ、３００ｍＷ、２００ｍＷ、１００ｍＷ、９０ｍＷ、８０ｍＷ、７０ｍＷ、６０ｍＷ、５０ｍＷ、４０ｍＷ、３０ｍＷ、２０ｍＷ、１０ｍＷ、９ｍＷ、８ｍＷ、７ｍＷ、６ｍＷ、５ｍＷ、４ｍＷ、３ｍＷ、２ｍＷ、１ｍＷ、９００μＷ、８００μＷ、７００μＷ、６００μＷ、５００μＷ、４００μＷ、３００μＷ、２００μＷ、１００μＷ、９０μＷ、８０μＷ、７０μＷ、６０μＷ、５０μＷ、４０μＷ、３０μＷ、２０μＷ、１０μＷ、９μＷ、８μＷ、７μＷ、６μＷ、５μＷ、４μＷ、３μＷ、２μＷ、１μＷ、又はそれ以下の平均光パワーを有し得る。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある光パワーを有し得る。
【0066】
［００１３４］ 光は、少なくとも約１ｍＷ、２ｍＷ、３ｍＷ、４ｍＷ、５ｍＷ、６ｍＷ、７ｍＷ、８ｍＷ、９ｍＷ、１０ｍＷ、２０ｍＷ、３０ｍＷ、４０ｍＷ、５０ｍＷ、６０ｍＷ、７０ｍＷ、８０ｍＷ、９０ｍＷ、１００ｍＷ、２００ｍＷ、３００ｍＷ、４００ｍＷ、５００ｍＷ、６００ｍＷ、７００ｍＷ、８００ｍＷ、９００ｍＷ、１Ｗ、２Ｗ、３Ｗ、４Ｗ、５Ｗ、６Ｗ、７Ｗ、８Ｗ、９Ｗ、１０Ｗ、１０Ｗ、２０Ｗ、３０Ｗ、４０Ｗ、５０Ｗ、６０Ｗ、７０Ｗ、８０Ｗ、９０Ｗ、１００Ｗ、２００Ｗ、３００Ｗ、４００Ｗ、５００Ｗ、６００Ｗ、７００Ｗ、８００Ｗ、９００Ｗ、１，０００Ｗ、又はそれ以上のピーク光パワーを有し得る。
【0067】
［００１３５］ 光は、最大で約１，０００Ｗ、９００Ｗ、８００Ｗ、７００Ｗ、６００Ｗ、５００Ｗ、４００Ｗ、３００Ｗ、２００Ｗ、１００Ｗ、９０Ｗ、８０Ｗ、７０Ｗ、６０Ｗ、５０Ｗ、４０Ｗ、３０Ｗ、２０Ｗ、１０Ｗ、９Ｗ、８Ｗ、７Ｗ、６Ｗ、５Ｗ、４Ｗ、３Ｗ、２Ｗ、１Ｗ、９００ｍＷ、８００ｍＷ、７００ｍＷ、６００ｍＷ、５００ｍＷ、４００ｍＷ、３００ｍＷ、２００ｍＷ、１００ｍＷ、９０ｍＷ、８０ｍＷ、７０ｍＷ、６０ｍＷ、５０ｍＷ、４０ｍＷ、３０ｍＷ、２０ｍＷ、１０ｍＷ、９ｍＷ、８ｍＷ、７ｍＷ、６ｍＷ、５ｍＷ、４ｍＷ、３ｍＷ、２ｍＷ、１ｍＷ、又はそれ以下のピーク光パワーを有し得る。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にあるピーク光パワーを有し得る。
【0068】
［００１３６］ 光は、少なくとも約１００フェムト秒（ｆｓ）、２００ｆｓ、３００ｆｓ、４００ｆｓ、５００ｆｓ、６００ｆｓ、７００ｆｓ、８００ｆｓ、９００ｆｓ、１ピコ秒（ｐｓ）、２ｐｓ、３ｐｓ、４ｐｓ、５ｐｓ、６ｐｓ、７ｐｓ、８ｐｓ、９ｐｓ、１０ｐｓ、２０ｐｓ、３０ｐｓ、４０ｐｓ、５０ｐｓ、６０ｐｓ、７０ｐｓ、８０ｐｓ、９０ｐｓ、１００ｐｓ、２００ｐｓ、３００ｐｓ、４００ｐｓ、５００ｐｓ、６００ｐｓ、７００ｐｓ、８００ｐｓ、９００ｐｓ、１ナノ秒（ｎｓ）、２ｎｓ、３ｎｓ、４ｎｓ、５ｎｓ、６ｎｓ、７ｎｓ、８ｎｓ、９ｎｓ、１０ｎｓ、２０ｎｓ、３０ｎｓ、４０ｎｓ、５０ｎｓ、６０ｎｓ、７０ｎｓ、８０ｎｓ、９０ｎｓ、１００ｎｓ、２００ｎｓ、３００ｎｓ、４００ｎｓ、５００ｎｓ、６００ｎｓ、７００ｎｓ、８００ｎｓ、９００ｎｓ、１マイクロ秒（μｓ）、２μｓ、３μｓ、４μｓ、５μｓ、６μｓ、７μｓ、８μｓ、９μｓ、１０μｓ、２０μｓ、３０μｓ、４０μｓ、５０μｓ、６０μｓ、７０μｓ、８０μｓ、９０μｓ、１００μｓ、２００μｓ、３００μｓ、４００μｓ、５００μｓ、６００μｓ、７００μｓ、８００μｓ、９００μｓ、１ミリ秒（１ｍｓ）、又はそれ以上のパルス長を有し得る。
【0069】
［００１３７］ 光は、最大で約１ｍｓ、９００μｓ、８００μｓ、７００μｓ、６００μｓ、５００μｓ、４００μｓ、３００μｓ、２００μｓ、１００μｓ、９０μｓ、８０μｓ、７０μｓ、６０μｓ、５０μｓ、４０μｓ、３０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、９μｓ、８μｓ、７μｓ、６μｓ、５μｓ、４μｓ、３μｓ、２μｓ、１μｓ、９００ｎｓ、８００ｎｓ、７００ｎｓ、６００ｎｓ、５００ｎｓ、４００ｎｓ、３００ｎｓ、２００ｎｓ、１００ｎｓ、９０ｎｓ、８０ｎｓ、７０ｎｓ、６０ｎｓ、５０ｎｓ、４０ｎｓ、３０ｎｓ、２０ｎｓ、１０ｎｓ、９ｎｓ、８ｎｓ、７ｎｓ、６ｎｓ、５ｎｓ、４ｎｓ、３ｎｓ、２ｎｓ、１ｎｓ、９００ｐｓ、８００ｐｓ、７００ｐｓ、６００ｐｓ、５００ｐｓ、４００ｐｓ、３００ｐｓ、２００ｐｓ、１００ｐｓ、９０ｐｓ、８０ｐｓ、７０ｐｓ、６０ｐｓ、５０ｐｓ、４０ｐｓ、３０ｐｓ、２０ｐｓ、１０ｐｓ、９ｐｓ、８ｐｓ、７ｐｓ、６ｐｓ、５ｐｓ、４ｐｓ、３ｐｓ、２ｐｓ、１ｐｓ、９００ｆｓ、８００ｆｓ、７００ｆｓ、６００ｆｓ、５００ｆｓ、４００ｆｓ、３００ｆｓ、２００ｆｓ、１００ｆｓ、又はそれ以下のパルス長を有し得る。光は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にあるパルス長を有し得る。
【0070】
［００１３８］ 方法１００は、１つ又は複数の機械学習分類器を、信号に対応する１つ又は複数の圧縮波形に適用するステップをさらに含むことができる。方法１００は、１つ又は複数の機械学習分類器を、本明細書で説明する１つ又は複数の時間波形に、又は本明細書で説明する１つ又は複数の時間波形に関連する圧縮波形に適用するステップをさらに含むことができる。
【0071】
［００１３９］ １つ又は複数の機械学習分類器を波形に適用して、本明細書に記載される粒子のうちの１つ又は複数を識別することができる。１つ又は複数の機械学習分類器は、１つ又は複数の粒子を識別して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、９９．９９％、又はそれ以上の感度、特異度、及び精度のうちの少なくとも１つ、２つ、又は３つを取得するように構成され得る。
【0072】
［００１４０］ １つ又は複数の機械学習分類器は、１つ又は複数の粒子を識別して、最大で約９９．９９％、９９．９８％、９９．９７％、９９．９６％、９９．９５％、９９．９４％、９９．９３％、９９．９２％、９９．９１％、９９．９％、９９．８％、９９．７％、９９．６％、９９．５％、９９．４％、９９．３％、９９．２％、９９．１％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、又はそれ以下の感度、特異度、及び精度のうちの少なくとも１つ、２つ、又は３つを取得するように構成され得る。機械学習分類器は、１つ又は複数の粒子を識別して、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある、感度、特異度、及び、精度のうちの少なくとも１つ、２つ、又は３つを取得するように構成され得る。
【0073】
［００１４１］ １つ又は複数の機械学習分類器は、１つ又は複数のデータセットから１つ又は複数の形質を推論するために統計的技法を使用するための任意の方法及び技術を含むことができる。そのような方法及び技術は、教師あり、教師あり、半教師あり、又は教師なしの機械学習技術を含み得る。機械学習技法は、回帰分析、正則化、分類、次元削減、アンサンブル学習、メタ学習、強化学習、相関ルール学習、クラスタ分析、異常検出、又は深層学習を含み得る。機械学習技術は、ｋ平均、ｋ平均クラスタリング、ｋ－最近傍、学習ベクトル量子化、線形回帰、非線形回帰、最小二乗回帰、部分最小二乗回帰、ロジスティック回帰、ステップワイズ回帰、多変量適応回帰スプライン、リッジ回帰、主成分回帰、最小絶対縮小、選択操作、最小角回帰、正準相関分析、因子分析、独立成分分析、線形判別分析、多次元スケーリング、非負行列因数分解、主成分分析、主座標分析、射影追跡、サモンマッピング、ｔ分布確率的近傍埋め込み、ＡｄａＢｏｏｓｔ、ブースティング、ブートストラップ集計、アンサンブル平均化、決定木、条件付き決定木、ブースト決定木、勾配ブースト決定木、ランダムフォレスト、スタック一般化、ベイジアンネットワーク、ベイジアン信念ネットワーク、ナイーブベイズ、ガウシアンナイーブベイズ、多項式ナイーブベイズ、隠れマルコフモデル、階層的隠れマルコフモデル、サポートベクターマシン、エンコーダ、デコーダ、自動エンコーダ、スタック型自動エンコーダ、パーセプトロン、多層パーセプトロン、人工ニューラルネットワーク、フィードフォワードニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、リカレントニューラルネットワーク、長期短期記憶、ディープビリーフネットワーク、ディープボルツマンマシン、ディープ畳み込みニューラルネットワーク、ディープリカレントニューラルネットワーク、又は生成的敵対的ネットワーク、を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【0074】
［００１４２］ １つ又は複数の機械学習分類器は、時間波形又は圧縮された時間波形から直接粒子の識別を学習するように訓練され得る。したがって、粒子は、イメージ再構成なしで分析され得る。
【0075】
［００１４３］ 代替的に又は組み合わせて、１つ又は複数の機械学習分類器は、時間波形又は圧縮された時間波形から再構成された１つ又は複数のイメージから粒子の識別を学習するように訓練され得る。したがって、方法１００は、粒子の１つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含むことができ、粒子は、再構成されたイメージに基づいて分析することができる。１つ又は複数のイメージは、１つ又は複数の明視野、交差偏光、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）、反射干渉、Ｓａｒｆｕｓ、蛍光、エピ蛍光、共焦点、光シート、多光子、超解像、近接場走査光学、近接場光学ランダムマッピング（ＮＯＲＭ）、構造化照明（ＳＩＭ）、空間変調照明（ＳＭＩ）、４－ｐｉ、誘導放出枯渇（ＳＴＥＤ）、基底状態枯渇（ＧＳＤ）、可逆可飽和光学線形蛍光遷移（ＲＥＳＯＬＦＴ）、結合活性化局在化（ＢＡＬＭ）、光活性化局在化（ＰＡＬＭ）、確率的光学再構成（ＳＴＯＲＭ）、直接確率的光学再構成（ｄＳＴＯＲＭ）、超解像光学変動（ＳＯＦＩ）、又は偏在局在化（ＯＬＭ）イメージを含んでもよい。
【0076】
［００１４４］ 方法１００は、粒子の複数のイメージ、例えば、粒子の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又はそれ以上のイメージ、粒子の最大で約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つのイメージ、又は前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある粒子のいくつかのイメージを再構成するステップをさらに含むことができる。複数の各イメージは、異なる波長又は波長範囲を含むことができる。
【0077】
［００１４５］ １つ又は複数のイメージは、ぼけアーチファクトがないことがある。例えば、１つ又は複数のイメージは、粒子が、パターン化された光学構造に対して、少なくとも約１ミリメートル／秒（ｍｍ／ｓ）、２ｍｍ／ｓ、３ｍｍ／ｓ、４ｍｍ／ｓ、５ｍｍ／ｓ、６ｍｍ／ｓ、７ｍｍ／ｓ、８ｍｍ／ｓ、９ｍｍ／ｓ、１０ｍｍ／ｓ、２０ｍｍ／ｓ、３０ｍｍ／ｓ、４０ｍｍ／ｓ、５０ｍｍ／ｓ、６０ｍｍ／ｓ、７０ｍｍ／ｓ、８０ｍｍ／ｓ、９０ｍｍ／ｓ、１００ｍｍ／ｓ、２００ｍｍ／ｓ、３００ｍｍ／ｓ、４００ｍｍ／ｓ、５００ｍｍ／ｓ、６００ｍｍ／ｓ、７００ｍｍ／ｓ、８００ｍｍ／ｓ、９００ｍｍ／ｓ、１メートル／秒（ｍ／ｓ）、２ｍ／ｓ、３ｍ／ｓ、４ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、６ｍ／ｓ、７ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、２０ｍ／ｓ、３０ｍ／ｓ、４０ｍ／ｓ、５０ｍ／ｓ、６０ｍ／ｓ、７０ｍ／ｓ、８０ｍ／ｓ、９０ｍ／ｓ、１００ｍ／ｓ、２００ｍ／ｓ、３００ｍ／ｓ、４００ｍ／ｓ、５００ｍ／ｓ、６００ｍ／ｓ、７００ｍ／ｓ、８００ｍ／ｓ、９００ｍ／ｓ、１，０００ｍ／ｓ、又はそれ以上の速度で移動するとき、ぼけアーチファクトがなくてもよい。
【0078】
［００１４６］ １つ又は複数のイメージは、粒子が、パターン化された光学構造に対して最大で約１，０００ｍ／ｓ、９００ｍ／ｓ、８００ｍ／ｓ、７００ｍ／ｓ、６００ｍ／ｓ、５００ｍ／ｓ、４００ｍ／ｓ、３００ｍ／ｓ、２００ｍ／ｓ、１００ｍ／ｓ、９０ｍ／ｓ、８０ｍ／ｓ、７０ｍ／ｓ、６０ｍ／ｓ、５０ｍ／ｓ、４０ｍ／ｓ、３０ｍ／ｓ、２０ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ、７ｍ／ｓ、６ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、４ｍ／ｓ、３ｍ／ｓ、２ｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、９００ｍｍ／ｓ、８００ｍｍ／ｓ、７００ｍｍ／ｓ、６００ｍｍ／ｓ、５００ｍｍ／ｓ、４００ｍｍ／ｓ、３００ｍｍ／ｓ、２００ｍｍ／ｓ、１００ｍｍ／ｓ、９０ｍｍ／ｓ、８０ｍｍ／ｓ、７０ｍｍ／ｓ、６０ｍｍ／ｓ、５０ｍｍ／ｓ、４０ｍｍ／ｓ、３０ｍｍ／ｓ、２０ｍｍ／ｓ、１０ｍｍ／ｓ、９ｍｍ／ｓ、８ｍｍ／ｓ、７ｍｍ／ｓ、６ｍｍ／ｓ、５ｍｍ／ｓ、４ｍｍ／ｓ、３ｍｍ／ｓ、２ｍｍ／ｓ、１ｍｍ／ｓ、又はそれ以下の速度で移動するとき、ぼけアーチファクトがなくてもよい。粒子が、パターン化された光学構造に対して、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある速度で移動するとき、１つ又は複数のイメージは、ぼけた物品を含まなくてもよい。
【0079】
［００１４７］ 方法１００は、粒子の少なくともサブセットを、選別された粒子の１つ又は複数のグループに選別するステップをさらに含むことができる。例えば、本方法は、粒子の形態に基づいて、粒子を１つ又は複数のグループの選別された粒子に選別するステップを更に含んでもよい。粒子（例えば、細胞）は、１つ又は複数のアクチュエータ（例えば、圧電ユニット）を作動させて、１つ又は複数の粒子、又は１つ又は複数の粒子を含む流体流を、例えば、１つのチャネルから別のチャネルへと方向付けるか又は方向転換させることによって、識別及び分離、単離、又は選別され得る。そのような１つ又は複数のアクチュエータは、例えば、流体又は圧力パルスを（例えば、超音波信号を介して）提供してもよい。
【0080】
［００１４８］ 粒子（例えば細胞）は、少なくとも約１粒子／秒、２粒子／秒、３粒子／秒、４粒子／秒、５粒子／秒、６粒子／秒、７粒子／秒、８粒子／秒、９粒子／秒、１０粒子／秒、２０粒子／秒、３０粒子／秒、４０粒子／秒、５０粒子／秒、６０粒子／秒、７０粒子／秒、８０粒子／秒、９０粒子／秒、１００粒子／秒、２００粒子／秒、３００粒子／秒、４００粒子／秒、５００粒子／秒、６００粒子／秒、７００粒子／秒、８００粒子／秒、９００粒子／秒、１，０００粒子／秒、２，０００粒子／秒、３，０００粒子／秒、４，０００粒子／秒、５，０００粒子／秒、６，０００粒子／秒、７，０００粒子／秒、８，０００粒子／秒、９，０００粒子／秒、１０，０００粒子／秒、２０，０００粒子／秒、３０，０００粒子／秒、４０，０００粒子／秒、５０，０００粒子／秒、６０，０００粒子／秒、７０，０００粒子／秒、８０，０００粒子／秒、９０，０００粒子／秒、１００，０００粒子／秒、２００，０００粒子／秒、３００，０００粒子／秒、４００，０００粒子／秒、５００，０００粒子／秒、６００，０００粒子／秒、７００，０００粒子／秒、８００，０００粒子／秒、９００，０００粒子／秒、１，０００，０００粒子／秒、又はそれ以上の速度で、識別及び分離、単離、又は選別され得る。
【0081】
［００１４９］ 粒子（例えば細胞）は、最大で約１，０００，０００粒子／秒、９００，０００粒子／秒、８００，０００粒子／秒、７００，０００粒子／秒、６００，０００粒子／秒、５００，０００粒子／秒、４００，０００粒子／秒、３００，０００粒子／秒、２００，０００粒子／秒、１００，０００粒子／秒、９０，０００粒子／秒、８０，０００粒子／秒、７０，０００粒子／秒、６０，０００粒子／秒、５０，０００粒子／秒、４０，０００粒子／秒、３０，０００粒子／秒、２０，０００粒子／秒、１０，０００粒子／秒、９，０００粒子／秒、８，０００粒子／秒、７，０００粒子／秒、６，０００粒子／秒、５，０００粒子／秒、４，０００粒子／秒、３，０００粒子／秒、２，０００粒子／秒、１，０００粒子／秒、９００粒子／秒、８００粒子／秒、７００粒子／秒、６００粒子／秒、５００粒子／秒、４００粒子／秒、３００粒子／秒、２００粒子／秒、１００粒子／秒、９０粒子／秒、８０粒子／秒、７０粒子／秒、６０粒子／秒、５０粒子／秒、４０粒子／秒、３０粒子／秒、２０粒子／秒、１０粒子／秒、９粒子／秒、８粒子／秒、７粒子／秒、６粒子／秒、５粒子／秒、４粒子／秒、３粒子／秒、２粒子／秒、１粒子／秒、又はそれ以下の速度で、識別及び分離、単離、又は選別され得る。粒子（例えば、細胞）は、識別及び分離、単離、又は選別され得、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある速度で達成され得る。
【0082】
［００１５０］ 方法１００は、選別された粒子のグループのうちの１つ又は複数を収集して、濃縮された粒子混合物を生成するステップをさらに含むことができる。選別された粒子のグループのうちの１つ又は複数は、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、９９．９９％、又はそれ以上の純度を有し得る。
【0083】
［００１５１］ 選別された粒子のグループのうちの１つ又は複数は、最大で約９９．９９％、９９．９８％、９９．９７％、９９．９６％、９９．９５％、９９．９４％、９９．９３％、９９．９２％、９９．９１％、９９．９％、９９．８％、９９．７％、９９．６％、９９．５％、９９．４％、９９．３％、９９．２％、９９．２％、９９．１％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、又はそれ以下の純度を有し得る。選別された粒子のグループのうちの１つ又は複数は、前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内にある純度を有してもよい。
【0084】
［００１５２］ 方法１００は、選別された粒子の１つ又は複数のグループからの１つ又は複数の粒子を１つ又は複数のアッセイに供するステップをさらに含むことができる。１つ又は複数のアッセイは、溶解、核酸抽出、核酸増幅、核酸配列決定、及びタンパク質配列決定から成る群から選択される１つ又は複数のメンバーを含み得る。
【0085】
［００１５３］ 方法１００は、粒子を流体力学的流れ集束に供するステップをさらに含み得る。粒子は、動作１１０の前に、動作１１０の間に、動作１１０の後に、動作１２０の前に、動作１２０の間に、動作１２０の後に、動作１３０の前に、動作１３０の間に、及び／又は動作１３０の後に、流体力学的流れ集束を受けてもよい。
【0086】
［００１５４］ 方法１００は、粒子が、パターン化された光学構造に対して移動するときに、粒子の部分透過スペックルパターンを収集するステップをさらに含むことができる。スペックルパターンは、パターン化された光学構造を通過した光の回折によって生成され得る。例えば、コヒーレント光は、パターン化された光学構造と相互作用して、構造化照明を生成することができ、これは、対物レンズの焦点に方向付けることができる。合焦後、コヒーレント光は広がり、回折によりスペックルパターンを生成する。焦点から離れたかなりの長さで、スペックルパターンは、スペックルパターンの第１の部分が遮断され得る一方でスペックルパターンの第２の部分が透過されるのに十分な大きさであり得る。そのような遮断は、例えば、虹彩（ｉｒｉｓ）を使用して実施され得る。元のスペックルパターンのこの小さい部分は、本明細書に記載の任意の検出器を使用して検出することができる。細胞粒子が構造化照明を通過するとき、透過光の位相及び強度の変化は、スペックルパターンの変化をもたらす可能性があり、これは、検出器で検出される光の強度の変化を引き起こす可能性がある。検出された信号の変調から、粒子の位相及び／又は強度情報を取得することができる。
【0087】
［００１５５］ 本明細書に記載されるシステム及び方法は、種々の治療用途で使用されてもよい。
【0088】
［００１５６］ 場合によっては、方法１００は、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するために利用され得る。複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するための方法は、方法１００の動作１１０、１２０、及び１３０のうちの１つ又は複数のうちのいずれかなど、本明細書で説明する方法１００の任意の１つ又は複数の動作を含み得る。例えば、複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するための方法は、（ａ）（例えば、方法１００の動作１１０に関して本明細書で説明されるように）パターン化された光学構造に対する複数の細胞の運動から空間情報を取得するステップと、（ｂ）空間情報を使用して複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するステップとを含んでもよい。
【0089】
［００１５７］ 複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するために空間情報を使用するステップは、（例えば、方法１００の動作１３０に関して本明細書で説明したように）１つ又は複数の標的細胞を分析するために空間情報を使用するステップを含み得る。例えば、粒子の形態は、本明細書に記載されるように（例えば、図１Ａに関して）、パターン化された光学構造によって付与される１つ又は複数の光強度分布を含む１つ又は複数の時間波形の組み合わせ使用によって少なくとも部分的にコンピュータ的に再構成され得る。
【0090】
［００１５８］ 複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するために空間情報を使用するステップは、複数の細胞から標的細胞を識別するために１つ又は複数の機械学習分類器を適用するステップを含み得る。１つ又は複数の機械学習分類器は、本明細書で説明される任意の機械学習分類器を備え得る。１つ又は複数の機械学習分類器は、空間情報（又は空間情報に関連付けられた信号）を利用して、標的細胞を識別することができる。例えば、１つ又は複数の機械学習分類器は、方法１００に関して本明細書で説明したように、空間情報に（又は空間情報に関連する信号に）適用され得る。
【0091】
［００１５９］ １つ又は複数の機械学習分類器は、空間情報から（又は空間情報に関連付けられた信号から）直接、複数の細胞の（又は標的細胞の）識別を学習するように訓練され得る。したがって、複数の細胞（又は標的細胞）は、イメージ再構成なしに分析され得る。
【0092】
［００１６０］ 代わりに、又は組み合わせて、１つ又は複数の機械学習分類器は、空間情報から（又は空間情報と関連付けられた信号から）再構成される１つ又は複数のイメージから、複数の細胞の（又は標的細胞の）識別を学習するように訓練されてもよい。したがって、１つ又は複数の標的細胞を識別するために信号を使用するステップは、複数の細胞（又は標的細胞）の１つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含むことができる。複数の細胞（又は標的細胞）は、再構成されたイメージに基づいて分析され得る。１つ又は複数のイメージは、（例えば、方法１００に関して）本明細書で説明する任意のイメージを備え得る。
【0093】
［００１６１］ 空間情報は、複数の細胞に関する特徴、特性、又は情報に対応し得る。空間情報は、複数の細胞に関する特徴、特性、又は情報と１対１に対応し得る。複数の細胞に関する特徴、特性、又は情報は、以下から成る群から選択される１つ又は複数のメンバーを含み得る：代謝状態、増殖状態、分化状態、成熟状態、マーカータンパク質の発現、マーカー遺伝子の発現、細胞の形態、細胞小器官の形態、細胞小器官の位置、細胞小器官の大きさ又は範囲、細胞質の形態、細胞質の位置、細胞質の大きさ又は範囲、核の形態、核の位置、核の大きさ又は範囲、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの配置、ミトコンドリアの大きさ又は範囲、リソソームの形態、リゾチームの配置、リゾチームの大きさ又は範囲、細胞内分子の分布、細胞内ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の分布、細胞内核酸の分布、細胞内糖類又は多糖類の分布、及び細胞内脂質の分布。
【0094】
［００１６２］ １つ又は複数の標的細胞を単離するために信号を使用するステップは、本明細書に記載されるように（例えば、方法１００又は図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、及び１４のいずれかに関して）、複数の細胞の形態に基づいて、複数の細胞を１つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップをさらに含んでもよい。１つ又は複数のグループの選別された細胞は、標的細胞を含み得る。
【0095】
［００１６３］ １つ又は複数の標的細胞を単離するために信号を使用するステップは、本明細書に記載されるように（例えば、方法１００又は図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃのいずれかに関して）、１つ又は複数のグループの選別された細胞を収集して、濃縮された細胞混合物を生成するステップをさらに含んでもよい。
【0096】
［００１６４］ 空間情報は、方法１００に関して本明細書で説明するように、検出器に順次到達する信号に圧縮変換され得る。
【0097】
［００１６５］ １つ又は複数の標的細胞は、空間情報（又は空間情報に関連する信号）に基づいて複数の細胞から単離され得る。１つ又は複数の標的細胞を単離するステップは、（ｉ）空間情報（又は空間情報に関連する信号）を使用して複数の細胞を分析するステップと、（ｉｉ）複数の細胞を分析した結果に基づいて複数の細胞を１つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップと、（ｉｉｉ）１つ又は複数のグループの選別された細胞から１つ又は複数の標的細胞を収集するステップとを含むことができる。
【0098】
［００１６６］ 複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を単離するために空間情報（又は空間情報に関連付けられた信号）を使用するステップは、（例えば、方法１００の動作１３０に関して本明細書で説明したように）１つ又は複数の標的細胞を分析するために空間情報（又は空間情報に関連付けられた信号）を使用するステップを備え得る。例えば、粒子の形態は、本明細書に記載されるように（例えば、図１Ａに関して）、パターン化された光学構造によって付与される１つ又は複数の光強度分布を含む１つ又は複数の時間波形の組み合わせ使用によって少なくとも部分的にコンピュータ的に再構成され得る。
【0099】
［００１６７］ 複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を単離するために空間情報（又は空間情報に関連付けられた信号）を使用するステップは、（例えば、方法１００に関して）本明細書で説明するように、空間情報に（又は空間情報に関連付けられた信号に）対応する１つ又は複数の時間波形又は圧縮された時間波形に１つ又は複数の機械学習分類器を適用するステップを含み得る。
【0100】
［００１６８］ 空間情報（又は空間情報に関連付けられた信号）を使用して１つ又は複数の標的細胞を単離するステップは、複数の細胞を分析した結果に基づいて、複数の細胞を１つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップをさらに含むことができる。例えば、１つ又は複数のグループの選別された細胞は、本明細書に記載されるように（例えば、方法１００又は図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、及び１４のいずれかに関して）、複数の細胞の形態に基づいてもよい。１つ又は複数のグループの選別された細胞は、標的細胞を含み得る。
【0101】
［００１６９］ １つ又は複数の標的細胞を単離するために空間情報（又は空間情報に関連する信号）を使用するステップは、１つ又は複数のグループの選別された細胞から１つ又は複数の標的細胞を収集するステップをさらに含むことができる。例えば、１つ又は複数のグループの選別された細胞は、本明細書に記載されるように（例えば、方法１００又は図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃのいずれかに関して）、濃縮された細胞混合物を生成するために収集され得る。
【0102】
［００１７０］ 標的細胞は、１つ又は複数の治療用細胞を含み得る。標的細胞は、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞から分化した細胞、胚性幹細胞から分化した細胞、遺伝子操作された細胞、血液細胞、赤血球、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞、癌細胞、及び芽細胞から成る群から選択される１つ又は複数のメンバーであり得る。
【0103】
［００１７１］ 別の態様では、本開示は、少なくとも８０％又はそれ以上の精度で非天然標識を使用することなく、粒子の形態に少なくとも部分的に基づいて粒子を分類又は選別するためのイメージフリーの方法を提供する。
【0104】
［００１７２］ 図１Ｃは、粒子を分類又は選別するためのイメージフリー光学的方法１５０の一例のフローチャートを示す。第１の動作１６０において、方法１５０は、非天然標識を使用せずに、粒子の形態に少なくとも部分的に基づいて粒子を分類又は選別するステップを含み得る。動作１６０は、本明細書で説明する動作１１０、１２０、及び１３０のうちの任意の１つ又は複数など、本明細書で説明する方法１００の動作のうちの任意の１つ又は複数を備え得る。
【0105】
［００１７３］ 本明細書で提供される方法１００又は１５０に基づく多くの変形、変更、及び適合が可能である。例えば、方法１００又は１５０の動作の順序は、必要に応じて、変更されてもよく、動作のうちのいくつかは除去されてもよく、動作のうちのいくつかは複製されてもよく、追加の動作が追加されてもよい。動作のうちのいくつかは、連続して実施されてもよい。動作のうちのいくつかは、並列に実施され得る。動作のうちのいくつかは、１回実施され得る。動作のうちのいくつかは、２回以上実施され得る。動作のうちのいくつかは、サブ動作を含むことができる。動作のうちのいくつかは自動化されてもよく、動作のうちのいくつかは手動であってもよい。
【0106】
［００１７４］ 別の態様では、本開示は、粒子分析のためのシステムを提供する。システムは、粒子を方向付けるように構成された流体流路を備えることができる。システムは、流体流路の少なくとも一部と感知通信する検出器と、検出器に動作可能に結合された１つ又は複数のコンピュータプロセッサとをさらに備えることができる。１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、本明細書で説明される方法１００又は１５０を実施するように個々に又はまとめてプログラムされ得る。例えば、１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、（ｉ）ランダムに又は擬似ランダムにパターン化された光学構造に対する粒子の運動から空間情報を取得し、（ｉｉ）空間情報を検出器に順次到達する信号に圧縮変換し、（ｉｉｉ）信号を使用して粒子を分析するように、個々に又はまとめてプログラムすることができる。いくつかの実施形態では、検出器はマルチピクセル検出器である。あるいは、検出器は単一ピクセル検出器であってもよい。
【0107】
コンピュータシステム
［００１７５］ 本開示は、開示の方法及びシステムを実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１３は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも呼ばれる）１３０５を含むコンピュータシステム１３０１を示し、中央処理装置は、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、又は並列処理のための複数のプロセッサとすることができる。コンピュータシステム１３０１はまた、メモリ又はメモリ位置１３１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１３１５（例えば、ハードディスク）、１つ又は複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース１３２０（例えば、ネットワークアダプタ）、並びにキャッシュ、他のメモリ、データストレージ及び／又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス１３２５を含む。メモリ１３１０、記憶装置１３１５、インターフェース１３２０、及び周辺デバイス１３２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１３０５と通信する。記憶装置１３１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（又はデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１３０１は、通信インターフェース１３２０の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク１３３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、又はインターネットと通信するイントラネット及び／又はエクストラネットとすることができる。ネットワーク１３３０は、場合によっては、電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワーク１３３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１つ又は複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク１３３０は、場合によってはコンピュータシステム１３０１の助けを借りて、コンピュータシステム１３０１に結合されたデバイスがクライアント又はサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装することができる。
［００１７５］ 本開示は、開示の方法及びシステムを実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１３は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも呼ばれる）１３０５を含むコンピュータシステム１３０１を示し、中央処理装置は、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、又は並列処理のための複数のプロセッサとすることができる。コンピュータシステム１３０１はまた、メモリ又はメモリ位置１３１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１３１５（例えば、ハードディスク）、１つ又は複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース１３２０（例えば、ネットワークアダプタ）、並びにキャッシュ、他のメモリ、データストレージ及び／又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス１３２５を含む。メモリ１３１０、記憶装置１３１５、インターフェース１３２０、及び周辺デバイス１３２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１３０５と通信する。記憶装置１３１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（又はデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１３０１は、通信インターフェース１３２０の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク１３３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、又はインターネットと通信するイントラネット及び／又はエクストラネットとすることができる。ネットワーク１３３０は、場合によっては、電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワーク１３３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１つ又は複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク１３３０は、場合によってはコンピュータシステム１３０１の助けを借りて、コンピュータシステム１３０１に結合されたデバイスがクライアント又はサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装することができる。
【0108】
［００１７６］ ＣＰＵ１３０５は、プログラム又はソフトウェアで具現化することができる機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１３１０などのメモリ位置に記憶され得る。命令は、ＣＰＵ１３０５に向けられることができ、ＣＰＵ１３０５は、その後、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ１３０５をプログラムするか、又はそうでなければ構成することができる。ＣＰＵ１３０５によって実施される動作の例は、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを含むことができる。
【0109】
［００１７７］ ＣＰＵ１３０５は、集積回路などの回路の一部とすることができる。システム１３０１の１つ又は複数の他の構成要素は、回路に含まれ得る。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【0110】
［００１７８］ 記憶装置１３１５は、ドライバ、ライブラリ、及び保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置１３１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザ選好及びユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム１３０１は、場合によっては、イントラネット又はインターネットを介してコンピュータシステム１３０１と通信するリモートサーバ上に配置されるなど、コンピュータシステム１３０１の外部にある１つ又は複数の追加のデータ記憶装置を含むことができる。
【0111】
［００１７９］ コンピュータシステム１３０１は、ネットワーク１３３０を介して１つ又は複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１３０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレート又はタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、又は携帯情報端末を含む。ユーザは、ネットワーク１３３０を介してコンピュータシステム１３０１にアクセスすることができる。
【0112】
［００１８０］ 本明細書に記載される方法（例えば、本明細書に記載される、粒子分析のための１つ又は複数の方法、イメージフリー光学的方法、又は複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するための方法）は、コンピュータシステム１３０１の電子記憶位置、例えば、メモリ１３１０又は電子記憶装置１３１５など、に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施され得る。機械実行可能コード又は機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードは、プロセッサ１３０５によって実行され得る。場合によっては、コードは、記憶装置１３１５から取り出され、プロセッサ１３０５による容易なアクセスのためにメモリ１３１０上に記憶され得る。いくつかの状況では、電子記憶装置１３１５を除外することができ、機械実行可能命令がメモリ１３１０に記憶される。
【0113】
［００１８１］ コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械とともに使用するために事前にコンパイルされ、構成され得るか、又はランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、コードが事前コンパイルされた形又はコンパイルされたままの形で実行できるように選択することができるプログラミング言語で供給することができる。
【0114】
［００１８２］ コンピュータシステム１３０１などの、本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングにおいて具現化され得る。本技術の様々な態様は、典型的には、あるタイプの機械可読媒体上で搬送されるか又はその中で具現化される機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形態の「製品」又は「製造品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶装置に記憶することができる。「ストレージ」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、又は、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的ストレージを提供することができる、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどその関連モジュールのいずれか又はすべてを含むことができる。ソフトウェアのすべて又は一部は、インターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを介して通信されることがある。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサへの、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を担持し得る別のタイプの媒体は、有線及び光固定ネットワークを通して、並びに様々なエアリンクを介して、ローカルデバイス間の物理インターフェースにわたって使用されるような、光、電気、及び電磁波を含む。有線又は無線リンク、光リンクなど、そのような波を搬送する物理素子も、ソフトウェアを担持する媒体と見なすことができる。本明細書で使用される場合、非一時的有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
【0115】
［００１８３］ したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体又は物理伝送媒体を含むが、それらに限定されない、多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるデータベース等を実装するために使用され得るような、任意のコンピュータ等における任意の記憶デバイス等の光ディスク又は磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的メモリを含む。有形の伝送媒体は、コンピュータシステム内のバスを備えるワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号、又は無線周波数（ＲＦ）データ通信及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音響波若しくは光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ又はＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、ホールのパターンを有する任意の他の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ又はカートリッジ、データ又は命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブル又はリンク、あるいはコンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読み取ることができる任意の他の媒体を含む。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のために１つ又は複数の命令の１つ又は複数のシーケンスをプロセッサに搬送することに関与し得る。
【0116】
［００１８４］ コンピュータシステム１３０１は、例えば、ユーザに情報を提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）１３４０を備える電子ディスプレイ１３３５を含むか、又はそれと通信することができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザインターフェースが挙げられるが、これらに限定されない。
【0117】
［００１８５］ 本開示の方法及びシステムは、１つ又は複数のアルゴリズム（例えば、粒子分析のための１つ又は複数の方法、イメージフリーの光学的方法、又は本明細書中に記載される複数の細胞から１つ又は複数の標的細胞を識別するための方法に対応する１つ又は複数のアルゴリズム）によって実施され得る。アルゴリズムは、中央処理装置１３０５による実行時にソフトウェアによって実施することができる。
【0118】
［００１８６］ 方法及びシステムは、例えば、ＷＯ２０１６１３６８０１及びＷＯ２０１７０７３７３７などの、他の方法及びシステムと組み合わされてもよく、又は他の方法及びシステムによって修正されてもよく、これらのそれぞれは、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0119】
実施例
実施例１：材料及び方法
［００１８７］ 本研究で使用した全ての光電子増倍管は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入した。図２、３Ｂ及び３Ｃでは、ＰＭＴ信号は、オシロスコープ（８ビット、１ＧＨｚ、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）を使用して１０６オーム抵抗を使用して記録された。増幅器（Ｈ１０７２３－２１０ＭＯＤ２）を内蔵した１０ＭＨｚの帯域幅を有するＰＭＴを青色及び緑色信号の検出に使用し、電流増幅器（ＨＣＡ－４０Ｍ－１００Ｋ－Ｃ，ＦＥＭＴＯ）に接続された別のＰＭＴ（７４２２－４０）を赤色信号の検出に使用した。
実施例１：材料及び方法
［００１８７］ 本研究で使用した全ての光電子増倍管は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入した。図２、３Ｂ及び３Ｃでは、ＰＭＴ信号は、オシロスコープ（８ビット、１ＧＨｚ、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）を使用して１０６オーム抵抗を使用して記録された。増幅器（Ｈ１０７２３－２１０ＭＯＤ２）を内蔵した１０ＭＨｚの帯域幅を有するＰＭＴを青色及び緑色信号の検出に使用し、電流増幅器（ＨＣＡ－４０Ｍ－１００Ｋ－Ｃ，ＦＥＭＴＯ）に接続された別のＰＭＴ（７４２２－４０）を赤色信号の検出に使用した。
【0120】
［００１８８］ 図３Ｄ、４、及び５では、ＰＭＴ信号は、デジタイザ（Ｍ４ｉ．４４５１又はＭ２ｉ．４９３２－Ｅｘｐａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はアナログ／デジタルコンバータ（ＡＤＣ、部分的に修正された、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＡＤ１１４４５ＥＶＭ）を有するＦＰＧＡ開発ボード（ＴＲ４、Ｔｅｒａｓｉｃ）を使用して、電子フィルタを用いて記録された。デジタイザ及び／又はＦＰＧＡは、緑色信号に適用される固定トリガ条件を用いて、各色チャネルから同時に固定長の信号セグメントを連続的に収集した。
【0121】
［００１８９］ 図１７Ａ～Ｅ、図１８Ａ～Ｆ、及び図１９Ａ～１９Ｄでは、内蔵増幅器（Ｈ１０７２３－２１０ｍＯＤ２）を有する１０ＭＨｚの帯域幅を有するＰＭＴを使用してＧＣ信号を検出し、一方、１ＭＨｚ（Ｈ１０７２３－２１０ｍＯＤ３）又は１０ＭＨｚ（Ｈ１０７２３－２１０ｍＯＤ２）の帯域幅を有するＰＭＴを使用して蛍光及び側方散乱（ＳＳＣ）信号を検出した。前方散乱（ＦＳＣ）信号は、光検出器（ＰＤＡ１００Ａ又はＰＤＡ１００Ａ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を使用して取得された。ＰＭＴ信号は、デジタイザ（Ｍ４ｉ．４４５１又はＭ２ｉ．４９３２－Ｅｘｐａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ドイツ）又はアナログ／デジタルコンバータ（部分的に修正された、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＡＤ１１４４５ＥＶＭ）を有するＦＰＧＡ開発ボード（ＴＲ４、Ｔｅｒａｓｉｃ）を使用して電子フィルタで記録された。デジタイザ及び／又はＦＰＧＡは、緑色信号に適用される固定トリガ条件を用いて、各色チャネルから同時に固定長の信号セグメントを連続的に収集した。
【0122】
［００１９０］ ＴｗＩＳＴ手順（１３）を使用して以下の最適化問題を解くことによって、式（１）に規定されるように、ＧＣを使用して測定された時間信号から物体のイメージを再構成した。
【0123】
【数2】
【0124】
ここで、ｇは、測定された時間信号のベクトルであり、Ｈ（ｘ、ｙ）は、ＧＣのシステム行列であり、ｉは、入力物体イメージｌから再形成されたベクトルであり、Ｒは、スパース性を有する正則化項であり、τは、正則化のための定数である。
【0125】
【数3】
【0126】
は
【0127】
【数4】
【0128】
ノルムを表す。ＣＳでは、イメージ物体は、正則化空間においてスパースであり得、式（１）に示されるランダム化畳み込み測定プロセスとインコヒーレントである（３２）。
【0129】
［００１９１］ 図３Ｃのパネル（ｉ）におけるイメージを再構成する際に、ウェーブレット変換が、正則化項としてＦｅｊｅｒ－Ｋｏｒｏｖｋｉｎスケーリングフィルタを用いて選択された（３３）。他のイメージを再構成する際に、全変動（ｔｏｔａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が正則化項として選択された（３４）。２次元の全変動ＲＴＶは次のように書かれる。
【0130】
【数5】
【0131】
全変動は、物体のイメージ内のエッジを保存しながら滑らかさを向上させる。ＴｗＩＳＴは、ウェーブレット変換又は全変動を用いて符号化する。
【0132】
［００１９２］ 図３Ｃのパネル（ｉｖ）における再構成されたイメージＩは、ピーク信号対雑音比（ＰＳＮＲ）に基づいて、アレイピクセルカラーカメラによって撮影された図３Ｃのパネル（ｖ）におけるベースラインイメージＩ’を用いて評価された。ＰＳＮＲは以下のように計算される。
【0133】
【数6】
【0134】
ここで、ＭＡＸ（Ｉ’）はＩ’における最大ピクセル強度であり、ＭＳＥ（Ｉ、Ｉ’）はＩとＩ’との間の平均二乗誤差である。より大きなＰＳＮＲは、より良好な再構成を意味し、その最大値は無限大である。
【0135】
［００１９３］ 全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｗａｋｏ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのいずれかから購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液には、Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｗａｋｏ）を用いた。
【0136】
［００１９４］ Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を、すべてのサプリメントとともに、１０μＭのＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ）及び０．２５μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１シルク（Ｎｉｐｐｉ）とともに、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養培地として使用した。サプリメントＣを含まず、１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ）及び１０μＭのＤＭＨ（Ｗａｋｏ）を含むＳｔｅｍ Ｆｉｔ ＡＫ０２Ｎを、神経前駆細胞（ＮＰＣ）分化培地として使用した。サプリメントＣを含まず、１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｗａｋｏ）及び３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ）を含むＳｔｅｍ Ｆｉｔ ＡＫ０２Ｎを、内胚葉分化培地として使用した。２０％Ｓｔｅｍｓｕｒｅ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、１％Ｌ－アラニルＬ－グルタミン溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、１％モノチオグリセロール溶液（Ｗａｋｏ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）及び１％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＳｔｅｍｓｕｒｅ ＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ）を肝芽細胞分化培地として使用した。
【0137】
［００１９５］ｍＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞は、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫから購入した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＡｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｙ－７９網膜芽細胞腫細胞、及びＲａｊｉ細胞は、ＪＣＲＢから購入した。Ｔ細胞はＰｒｏＭａｂから購入した。ｉＰＳＣは以前に報告されたように調製し、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＧＭ２５２５６）から購入することができる。
【0138】
［００１９６］ｍＩＡ ＰａＣａ－２細胞を、Ｌ－グルタミン、フェノールレッド及び１０％ＦＢＳを含むピルビン酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）を含むＤ－ＭＥＭ（高グルコース）中で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＲａｊｉ細胞を、それぞれ１０％及び２０％ＦＢＳを含むＬ－グルタミン及びフェノールレッド（Ｗａｋｏ）を含むＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。Ｙ－７９細胞を、２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
【0139】
［００１９７］ ＮＰＣを以下の手順でｉＰＳＣから分化させた。ｉＰＳＣをｉＰＳ培養培地中に２，５００細胞／ｃｍ２で播種した（０日目）。１日目に、培地をＮＰＣ分化培地に交換した。３日目及び５日目に培地を同じ培地に交換した。６日目に、９０％を超える細胞がＰＡＸ６陽性ＮＰＣであった。
【0140】
［００１９８］ 肝芽細胞を以下の手順でｉＰＳＣから分化させた。ｉＰＳＣをｉＰＳ培養培地中に２，５００細胞／ｃｍ２で播種した（０日目）。１日目に、培地を内胚葉分化培地に交換した。３日目に、培地を同じ培地に交換した。５日目に、培地を肝芽細胞分化培地に交換し、培地を７日目と９日目に同じ培地に交換した。１０日目に、細胞は免疫染色試験下でＡＦＰ陽性を示した。
【0141】
［００１９９］ｍＩＡ ＰａＣａ－２細胞を、トリプシンを用いて培養フラスコから分離した。培養フラスコからＪｕｒｋａｔ細胞をピペッティングにより取り出した。ＰＢＳ溶液で洗浄後、各々の型の細胞を４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液（Ｗａｋｏ）で１５分間固定した。その後、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ細胞にＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して３０分間培養した。染色したＪｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳ溶液で洗浄した。次に、各々の型の細胞を混合して、選別システムに流した。
【0142】
［００２００］ ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、又はｒａｊｉ細胞のいずれかを各実験に使用した。分離する前に、ｉＰＳＣのための培養培地を、ＰＢＳ溶液中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡに交換し、３分間培養した。次いで、培地をｉＰＳＣ培養培地に戻し、細胞スクレーパーを使用して細胞を剥離した。培養フラスコからＴ細胞及びｒａｊｉ細胞をピペッティングにより取り出した。結合緩衝液で洗浄した後、細胞をＰＩ（医学生物学研究所）及びアネキシンＶ－ＦＩＴＣ（医学生物学研究所）で１５分間染色し、次いで洗浄せずに系に流した。細胞を最初にＦＳＣ－ＳＳＣ散布図を用いてゲートしてデブリを除去し、次いでＦＳＣ高さ対幅散布図を用いてゲートしてダブレットを除去した。ゲートされた細胞をさらにゲートし、ＰＩ及びアネキシンＶ－ＦＩＴＣの蛍光強度に従って、生細胞、死細胞又はアポトーシス細胞として標識した。同数の未分化細胞及び分化細胞を用いてランダムに（重複なしで）それぞれ選択された１，０００個の細胞を、訓練データ及び試験データとして使用した。
【0143】
［００２０１］ ｉＰＳＣ、ＮＰＣ、及び肝芽細胞をそれぞれ、細胞スクレーパーを使用して培養フラスコから分離した。緩衝液（１％ＦＢＳ、Ｘ％ＥＤＴＡ ｉｎ Ｄ－ＰＢＳ）で洗浄後、カルセイン ＡＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）、ｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５（Ｗａｋｏ）で染色し、緩衝液で洗浄した。未分化細胞（ｉＰＳＣ）及び分化細胞（ＮＰＣ又は肝芽細胞）の分類のために、各細胞を等しい濃度で混合した。混合懸濁液をｉＳＧＣシステムに流した。細胞を最初にＦＳＣ－ＳＳＣ散布図を用いてゲートして死細胞及びデブリを除去し、次いでＦＳＣ高さ対幅散布図を用いてゲートしてダブレットを除去し、再びＦＳＣ－カルセインＡＭ散布図を用いてゲートして残りの死細胞を除去した。ゲートされた細胞をさらにゲートし、ｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５及びカルセインＡＭの蛍光強度に従って未分化細胞又は分化細胞として標識した。同数の未分化細胞及び分化細胞を用いてランダムに（重複なしで）選択した５，０００個及び１，０００個の細胞を、それぞれ訓練データ及び試験データとして使用した。
【0144】
［００２０２］ 細胞を、石英フローセル（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）又はＰＤＭＳマイクロ流体デバイスのいずれかを通して、シース流体のためのカスタマイズされた圧力ポンプ（ＩｓｏＦｌｏｗ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びサンプル流体のためのシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して流した。石英フローセルは、測定位置におけるチャネル断面寸法が２５０μｍ×５００μｍであり、これを使用する場合、シースフローは、特に明記しない限り、約２５ｋＰａの圧力で駆動された。ＰＤＭＳデバイスは、測定位置で５０×５０μｍのチャネル断面寸法を有し、これを使用する場合、シースフローは、特に明記しない限り、約１７０ｋＰａの圧力で駆動された。サンプル流体は、特に明記しない限り、２０μＬ／分の流量で駆動した。
【0145】
［００２０３］ 細胞染色前に、細胞計数チップを用いて、細胞数を１試験あたり約８×１０６細胞となるように調整した。染色後、細胞の濃度を調整して、ＰＢＳ中約１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。ＭＣＦ－７細胞を複数の色で染色した場合（図３Ｂから５に示されるように）、それらの膜を、まず、１００μＬの、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、次いで５μＬのＰＥ－ＣＦ５９４－ＥｐＣＡＭ抗体溶液を添加することによって、ＰＥ－ＣＦ５９４－ＥｐＣＡＭ（ＢＤ、ＰＥ－ＣＦ５９４マウス抗ヒトＣＤ３２６抗体）で標識し、続いて室温で１５分間培養した。ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、２ｍＬの、ＰＢＳ中の３－６０μＭ ＤＡＰＩストック溶液を細胞ペレットに添加し、それらを室温で１５分間培養することによって、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＤＡＰＩ核酸染色）で標識した。細胞をＰＢＳで厳密に洗浄した後、２００μＬの、ＰＢＳ中１％Ｔｗｅｅｎ２０、次いで５μＬのＦＧ蛍光反応性色素溶液を細胞ペレットに添加することによって、細胞質を最終的にＦＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、４８８ｎｍ波長励起用）で標識し、室温で１時間超培養した。細胞イメージングのために、細胞懸濁液を一対のカバースライドの間に挟んで細胞の位置を固定し、０．２ｍｍ／ｓの一定速度で所望の方向に細胞を移動させるための電子ステージ（Ｓｉｇｍａ Ｋｏｋｉ，Ｊａｐａｎ）上にサンプルを載せた。
【0146】
［００２０４］ 図４Ｃ～４Ｅに示されるイメージフリーＧＣ分析実験では、全てのＭＣＦ－７、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞及びＰＢＭＣの細胞質を、ＦＧを用いて緑色で標識した。異なる細胞型間で全蛍光強度が同等になるように、反応時間及び色素濃度が調整された。これにより、正確な分類は形態学的情報によるものであり、総強度によるものではないことが確認された。ＭＣＦ－７細胞の膜は、ホルムアルデヒドによる固定とその後の室温での２時間の培養後、細胞ペレットに４２０μＬの、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ及び８０μＬのＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭ抗体溶液を添加することによって、ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭ（ＢＶ４２１結合マウス抗ヒトＣＤ３２６抗体、ＢＤ）を使用して青色発光のために標識した。
【0147】
［００２０５］ （図５Ｂに示されるような）ＭＣＦ－７細胞及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を分類するイメージフリーＧＣ選別実験において、ＭＣＦ－７細胞の膜を、上記と同じ様式でＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭを使用して青色発光について標識した。（図５Ｃに示されるような）ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞及びＰＢＭＣを分類する実験において、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の細胞質を、一次マウスモノクローナル抗パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３抗体（Ａｂｃａｍ）及び二次ＡＦ４０５結合ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して青色発光について標識した。この染色は、まず４５０μＬの、ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡ、並びに５０μＬの一次抗体溶液を固定細胞のペレットに添加し、続いて４℃で一晩培養し、次いで４９０μＬの、ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡ、並びに１０μＬの二次抗体溶液を添加し、続いて室温で１時間培養することによって行った。ＭＣＦ－７、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞及びＰＢＭＣの細胞質を、両実験において上記免疫染色後にＦＧを用いて緑色で標識した。異なる細胞型間で総蛍光発光強度が同等になるように、反応時間及び色素濃度が調整された。各染色プロセス後に細胞を厳密に洗浄した。
【0148】
［００２０６］ 図４において、モデルを訓練するために、時間波形の訓練データセットを、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ）及びカスタマイズされた高圧ポンプを使用して、光学構造を通して各細胞型（ＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２）を別々に流すことによって収集した。過剰適合を回避するために十分に一般化されたモデルを構築することは、訓練されていない信号に対して信頼できる予測を行うための鍵である。この目的のために、外側流体の流量を維持しながら内側流体の流量を変化させることによって様々な時間波形を収集した：内側流量を２０μＬ／分及び３０μＬ／分で変化させ、外側流量を１８０ｋＰａの圧力で駆動した。モデルを試験する前に、ＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の混合溶液を異なる濃度比で調製した。モデルを実験的に試験する際、内側流量を２０μＬ／分に維持した。ＳＶＭモデルの訓練及び試験を通して、細胞のフローストリームの中心線を同じ位置に維持した。最後に、同じ条件を複合ＰＢＭＣからの癌細胞検出の実証に適用した。
【0149】
［００２０７］ 全ての信号を、ＰＭＴを用いて検出し、ＡＤＣボードを用いて収集及び変換し、Ｐｙｔｈｏｎを用いて処理した。データセットを準備する際に、流れる単一の物体の波形は、訓練のために記録された信号全体の平均レベルに基づく閾値化によって選択的に収集された。この研究で使用される放射基底関数（ＲＢＦ）を有するＳＶＭは、以下のスコアリング関数ｆを計算することによって入力時間信号／波形ｇの標識を推定する。
【0150】
【数7】
【0151】
［００２０８］ ここで、αｊ（０≦αｊ≦Ｃ）及びｙｊは、第ｊ番目の訓練された時間信号ｇｊについての訓練された係数及びクラス標識であり、ｂは、バイアス項であり、γは、カーネルスケールパラメータであり、Ｎは、訓練された時間信号の数であり、Ｃは、正則化係数である。Ｃ及びγは、グリッド検索によって最適化された。ＦＰＧＡにおけるハイスループット処理のために、Ｎ、及び、ｇの長さは、生物学的サンプル及び分類目的に応じて、オフラインコンピュータにおいて調整された。
【0152】
［００２０９］ 細胞の分類のために、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）技術は、線形又は放射基底関数カーネルのいずれかを使用した。ＳＶＭにおけるハイパーパラメータは、グリッド検索によって調整された。特に明記しない限り、訓練及び検証は、各クラス標識について細胞型の等しい混合物を使用して実施し、精度、ＲＯＣ曲線、及びＲＯＣ－ＡＵＣは、１０回のランダムサンプリングで検証し、１０回の試行の平均及び標準偏差で表した。
【0153】
実施例２：ゴーストサイトメトリーの感度の推定
［００２１０］ システム全体について、検出可能なフルオロフォアの最小数は、モデルフルオロフォアがフルオレセイン分子であり、ＰＭＴが単一光子を検出することができ、フルオロフォアが光飽和から遠く、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルタによる光損失が無視できるという仮定の下で、以下のように推定することができる。
［００２１０］ システム全体について、検出可能なフルオロフォアの最小数は、モデルフルオロフォアがフルオレセイン分子であり、ＰＭＴが単一光子を検出することができ、フルオロフォアが光飽和から遠く、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルタによる光損失が無視できるという仮定の下で、以下のように推定することができる。
【0154】
［００２１１］ 検出可能なフルオロフォア分子の最小数は、以下によって与えられる。
【0155】
【数8】
【0156】
［００２１２］ 実験セットアップにおける光子収集の効率は、以下によって与えられる。
【0157】
【数9】
【0158】
［００２１３］ 開口数ａ＝０．７５。一群のフルオロフォアがランダムな光学パターンによって規定される単位スポットを通過するときの放出される蛍光光子の数は、Ｎｓによって与えられる。フルオロフォアの数は、Ｎｆによって与えられる。１分子当たりの光子吸収率は次式で与えられる。
【0159】
【数10】
【0160】
［００２１４］ 入射光子束は次式で与えられる。
【0161】
【数11】
【0162】
［００２１５］ サンプル面における構造化照明の輝点への入射光子束は、ｆによって与えられる。吸収断面積は次式で与えられる。ｓ＝１．５×１０－２０［ｍ２］（３５）．量子効率は次式で与えられる。ｑ＝０．９５（３６）．露光時間は次式で与えられる。
【0163】
【数12】
【0164】
［００２１６］ ターンオーバー速度（１／寿命）は次式で与えられる。γｔ＝１／４［１／ｎｓｅｃ］（３７）．したがって、理想的な場合には、約３つのフルオロフォア（Ｎｆ～３）が必要とされる。
【0165】
実施例３：運動ベースの圧縮蛍光イメージング
［００２１７］ 図２Ａ～２Ｇは、運動ベースの圧縮蛍光イメージングの実証を示す。ＳＩモード及びＳＤモードのための光学セットアップを、それぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示す。蛍光ビーズの凝集体を、電子並進ステージを用いて光学構造を横切ってガラスカバースリップ上で移動させた。図２（ｃ）に示すように、ＳＩモードの場合、ビーズが運動に応じて構造化照明を通過し、蛍光強度の時間波形が生成される。図２Ｄに示されるように、この取得された時間信号から、２Ｄ蛍光イメージがコンピュータ的に再構成される。図２Ｅに示すように、ＳＤモードの場合、ビーズは均一な光によって照射される。次いで、ビーズの結合蛍光イメージは、構造化ピンホールアレイを通過し、時間波形の生成をもたらす。図２Ｆに示すように、この時間信号から、２Ｄ蛍光イメージがコンピュータ的に再構成される。図２Ｇは、アレイピクセルカメラを用いて得られた、同じ凝集ビーズの蛍光イメージを示す。
［００２１７］ 図２Ａ～２Ｇは、運動ベースの圧縮蛍光イメージングの実証を示す。ＳＩモード及びＳＤモードのための光学セットアップを、それぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示す。蛍光ビーズの凝集体を、電子並進ステージを用いて光学構造を横切ってガラスカバースリップ上で移動させた。図２（ｃ）に示すように、ＳＩモードの場合、ビーズが運動に応じて構造化照明を通過し、蛍光強度の時間波形が生成される。図２Ｄに示されるように、この取得された時間信号から、２Ｄ蛍光イメージがコンピュータ的に再構成される。図２Ｅに示すように、ＳＤモードの場合、ビーズは均一な光によって照射される。次いで、ビーズの結合蛍光イメージは、構造化ピンホールアレイを通過し、時間波形の生成をもたらす。図２Ｆに示すように、この時間信号から、２Ｄ蛍光イメージがコンピュータ的に再構成される。図２Ｇは、アレイピクセルカメラを用いて得られた、同じ凝集ビーズの蛍光イメージを示す。
【0166】
［００２１８］ イメージングモードにおけるＧＣの実験的概念実証として、ガラスカバースリップ上に載せられた蛍光ビーズをイメージングし、電子並進ステージを使用して、ランダム又は擬似ランダムにパターン化された光学構造にわたって移動させた。ビーズは、Ｈ（ｘ、ｙ）の列方向に平行な方向に移動する際に焦点が合った状態に保たれた。サンプルの前又は後の光路に、パターン化された光学構造を組み込むことは、数学的に等価である。これは、ＧＣベースのイメージングが、（図２Ａに示されるような）ランダム擬似ランダムに構造化された照明、又は（図２Ｂに示されるような）ランダムな構造化検出のいずれかによって実験的に実現され得ることを意味する。これらの構成は、それぞれ、コンピュータによるゴーストイメージング及び単一ピクセル圧縮イメージングに対応する。ＳＩモードにおける式（１）における符号化演算子Ｈ（ｘ、ｙ）は、試料面内の励起強度分布として実験的に測定することができる。他方、ＳＤモードにおける演算子Ｈ（ｘ、ｙ）は、サンプル面における励起強度分布と、サンプルと検出器との間の結合面におけるフォトマスクの透過率分布との点に関する積として測定することができる。正確な演算子Ｈ（ｘ、ｙ）は、蛍光ポリマーの薄いシートをサンプル面に配置し、空間分解マルチピクセル検出器を用いてその強度分布を測定することによって実験的に較正することができる。インコヒーレントな青色発光ダイオード（ＬＥＤ）を励起光源として使用した。物体の運動中に、ＰＭＴは、（ＳＩモード及びＳＤモードそれぞれに関して図２Ｃ及び２Ｅに示されるように）時間的に変調された蛍光強度として物体から放出された光子を収集した。図２Ｄ及び２Ｆは、各波形について、複数のビーズのコンピュータ的に復元された蛍光イメージを示す。比較のために、図２Ｇは、アレイ検出器ベースの科学的相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラを使用して取得されたイメージを示す。ビーズの形態学的特徴は明らかであり、ＳＩモード及びＳＤモードの両方でのＧＣイメージングを確認する。
【0167】
実施例４：多色ハイスループット蛍光細胞イメージング
［００２１９］ 図３Ａ～３Ｄは、ＧＣによる多色及びハイスループット蛍光細胞イメージングの実証を示す。図３Ａは、多色運動ベースの圧縮蛍光イメージング（ＳＤモード）のための光学セットアップを示す。このセットアップは、ダイクロイックミラーによって結合された励起光源として、コヒーレントな４７３ｎｍ波長の青色レーザ及びインコヒーレントな３７５ｎｍ波長のＵＶ ＬＥＤを利用した（図７）。実験は、それぞれ赤色、緑色及び青色に蛍光染色された膜、細胞質及び核を有する培養ＭＣＦ－７細胞を使用した。標識された細胞が電子並進ステージで移動すると、それらの結合イメージは光学エンコーダを通過し、時間波形を生成する。次いで、信号を、ダイクロイックミラーを使用して（ｉ）赤色、（ｉｉ）緑色、及び（ｉｉｉ）青色の３色チャネルに分割し、異なるＰＭＴによって最終的に記録し、代表的なトレースを図３Ｂに示す。図３Ｃに示されるように、各ＰＭＴについての時間信号から、標識された細胞の蛍光イメージを、それぞれ赤色（図３Ｃのパネル（ｉ））、緑色（図３Ｃのパネル（ｉｉ））、及び青色（図３Ｃのパネル（ｉｉｉ））でコンピュータ的に復元した。図３Ｃのパネル（ｉｖ）は、図３Ｃのパネル（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）から組み合わされた擬似カラー多色イメージを示す。図３Ｃのパネル（ｉｖ）は、アレイピクセルカラーカメラを使用して取得された多色蛍光イメージを示す。１０，０００細胞／秒を超えるスループット速度で流れる細胞の多色サブミリ秒蛍光イメージングを図３Ｄに示す。実験では、４８８ｎｍ波長の青色レーザ及び４０５ｎｍ波長の紫色レーザが回折光学素子を通過して、細胞流に対するランダム構造化照明を生成した。図３Ｄのパネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、それぞれ細胞質及び核からの緑色及び青色蛍光信号を示す。各ＰＭＴについての時間信号から、標識された細胞の蛍光イメージを、それぞれ緑色（図３Ｄのパネル（ｉｉｉ））及び青色（図３Ｄのパネル（ｉｖ））でコンピュータ的に復元した。図３Ｄのパネル（ｖ）は、再構成された多色蛍光イメージを示す。
［００２１９］ 図３Ａ～３Ｄは、ＧＣによる多色及びハイスループット蛍光細胞イメージングの実証を示す。図３Ａは、多色運動ベースの圧縮蛍光イメージング（ＳＤモード）のための光学セットアップを示す。このセットアップは、ダイクロイックミラーによって結合された励起光源として、コヒーレントな４７３ｎｍ波長の青色レーザ及びインコヒーレントな３７５ｎｍ波長のＵＶ ＬＥＤを利用した（図７）。実験は、それぞれ赤色、緑色及び青色に蛍光染色された膜、細胞質及び核を有する培養ＭＣＦ－７細胞を使用した。標識された細胞が電子並進ステージで移動すると、それらの結合イメージは光学エンコーダを通過し、時間波形を生成する。次いで、信号を、ダイクロイックミラーを使用して（ｉ）赤色、（ｉｉ）緑色、及び（ｉｉｉ）青色の３色チャネルに分割し、異なるＰＭＴによって最終的に記録し、代表的なトレースを図３Ｂに示す。図３Ｃに示されるように、各ＰＭＴについての時間信号から、標識された細胞の蛍光イメージを、それぞれ赤色（図３Ｃのパネル（ｉ））、緑色（図３Ｃのパネル（ｉｉ））、及び青色（図３Ｃのパネル（ｉｉｉ））でコンピュータ的に復元した。図３Ｃのパネル（ｉｖ）は、図３Ｃのパネル（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）から組み合わされた擬似カラー多色イメージを示す。図３Ｃのパネル（ｉｖ）は、アレイピクセルカラーカメラを使用して取得された多色蛍光イメージを示す。１０，０００細胞／秒を超えるスループット速度で流れる細胞の多色サブミリ秒蛍光イメージングを図３Ｄに示す。実験では、４８８ｎｍ波長の青色レーザ及び４０５ｎｍ波長の紫色レーザが回折光学素子を通過して、細胞流に対するランダム構造化照明を生成した。図３Ｄのパネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、それぞれ細胞質及び核からの緑色及び青色蛍光信号を示す。各ＰＭＴについての時間信号から、標識された細胞の蛍光イメージを、それぞれ緑色（図３Ｄのパネル（ｉｉｉ））及び青色（図３Ｄのパネル（ｉｖ））でコンピュータ的に復元した。図３Ｄのパネル（ｖ）は、再構成された多色蛍光イメージを示す。
【0168】
［００２２０］ ＧＣ光学系の単純な設計は、複数の光源、誘電体ミラー、及び光学フィルタを追加することにより、図３Ａに示すように、単一のフォトマスクを用いた多色蛍光イメージングが可能になることを意味する。細胞イメージングのためのＧＣを検証するために、ＭＣＦ－７細胞（乳腺癌に由来するヒト細胞株）を３色で染色した－膜、核、及び細胞質をそれぞれ赤色（ＥｐＣＡＭ ＰＥ－ＣＦ５９４）、青色（ＤＡＰＩ）、及び緑色（ＦＧ：ｆｉｘａｂｌｅ ｇｒｅｅｎ）色素で染色した。染色した細胞をカバーガラススリップ上に載せた。コヒーレント青色連続波（ＣＷ）レーザ及びインコヒーレント紫外（ＵＶ）ＬＥＤ光源を、フルオロフォアを励起するために使用した。ＳＤモードを使用し、各励起光源について演算子Ｈ（ｘ、ｙ）を実験的に推定した。実験では、カバーガラスを載せたステージを移動させ、各色チャネルからの時間信号を３つのＰＭＴをそれぞれ用いて測定した。各色についてのコンピュータ的に再構成された蛍光イメージは、細胞膜、細胞質及び核の微細な特徴を明らかに示す。比較のために、図３Ｃのパネル（ｉｖ）は、重ね合わされたカラーイメージを示し、図３Ｃのパネル（ｖ）は、従来のカラーカメラ（Ｗｒａｙｃａｍ ＳＲ１３０、ＷＲＡＹＭＥＲ Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を使用して取得された蛍光イメージを示す。式（８）に従って計算される、赤、緑、及び青チャネルのピーク信号対雑音比の平均は、ＧＣの再構成イメージ（図３Ｃのパネル（ｉｖ）に示される）とカメライメージ（図３Ｃのパネル（ｖ）に示される）との間で２６．２ｄＢである。これらの結果は、細胞の形態学的特徴を描写する際の多色ＧＣイメージングの良好な性能を実証する。
【0169】
［００２２１］ ＧＣはまた、流動細胞の高速多色連続蛍光イメージングを達成することができる。３次元空間における流れる蛍光細胞の流れを集束させるためのフローセルアセンブリ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、細胞が、エンコーダＨ（ｘ、ｙ）の長さ方向に平行に整列された流れに垂直な平面内で集束されるようにすることができる。フローセル内で構造化照明を生成する回折光学素子を使用して、１００ピクセルの連続的な広がった光学点走査を、コンピュータによる再構成におけるｙ方向のイメージサイズに対応して、流れに対して垂直に実施した。図３Ｄのパネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、その細胞質がＦＧで標識され、その核がＤＡＰＩで標識された、単一のＭＣＦ－７細胞の各色チャネルからの時間波形を示す。蛍光イメージは、それぞれ図３Ｄのパネル（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の各波形についてコンピュータ的に再構成した。図３Ｄのパネル（ｖ）は、コンピュータ的に再構成された多色蛍光イメージを示し、明確に分解された細胞の形態学的特徴を有する。電荷結合素子（ＣＣＤ）及びＣＭＯＳなどのアレイピクセルカメラが完全に運動をぼかしたイメージを生成する速度である１０，０００細胞／秒より高いスループットで細胞を流した。対物レンズ後の構造化照明の全入力励起強度は、４８８ｎｍ及び４０５ｎｍレーザに対してそれぞれ～５８ｍＷ及び～１４ｍＷであったが、個々のランダムスポットに割り当てられたものは、平均でそれぞれ＜４３μＷ及び＜１０μＷであった。適切なＤＯＥを設計及び採用することによって、光パターンは、最小限の損失で作成され、単一分子レベルに近い、（方法において詳述されるような）検出可能なフルオロフォアの最小数として計算される、ＧＣイメージングの高い感度を示唆した。
【0170】
［００２２２］ 光学符号化及びスパースサンプリングのために光パターンＨ（ｘ、ｙ）にわたる物体の運動を使用して、ぼけのない高フレームレートイメージングが、高い信号対雑音比で達成された。フレームレートｒ及びピクセル走査速度ｐは次のように定義される。
【0171】
【数13】
【0172】
【数14】
【0173】
ここで、Ｉは最終イメージであり、ｐはフルオロフォアがＨ（ｘ、ｙ）における各励起スポットを通過するのに要する時間の逆数である。第１に、圧縮符号化は、Ｈ（ｘ、ｙ）の長さによって定義され、１つのフレーム取得に必要とされる、サンプリング点の数を低減し、その結果、高いフレームレートを達成するための必要とされる帯域幅が効果的に低減される。ショットノイズは帯域幅が増加するにつれて増加するので、この低減は、特に少数の光子を用いる超高速イメージングにおいて重要である。この特徴により、蛍光信号の励起パワーを効果的に低減してノイズを克服することができる。第２に、十分な信号対雑音比では、ＧＣは、物体が励起光のピクセルを通過する前に励起強度を時間的に変調する他の技法とは異なり、時間的に静的であり得るＨ（ｘ、ｙ）として単一ピクセル検出器の高帯域幅を十分に利用することができる。したがって、ピクセル走査速度がＰＭＴの帯域幅速度の少なくとも２倍を超えない限り、ＧＣはぼけのないイメージをもたらす。例えば、５００ｎｍのスポットサイズを有するＨ（ｘ、ｙ）及び１００ＭＨｚの高帯域幅を有するＰＭＴに関して、ＧＣは、１００ｍ／ｓまでの流量に対してぼけのないイメージを提供する。
【0174】
実施例５：蛍光標識細胞の機械学習分類
［００２２３］ 図４Ａ～４Ｅは、圧縮信号の直接機械学習を介したＧＣによるハイスループットかつ高精度の蛍光イメージフリー「イメージング」サイトメトリーを示す。図４Ａは、ＧＣにおいて分類器モデルを訓練するための手順を示す。図４Ａのパネル（ｉ）は、異なるが形態学的に類似した細胞型（ＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞）が蛍光標識されたことを示す。両方の細胞型について、細胞質はＦＧによって緑色に染色され、ＭＣＦ－７細胞のみの膜はＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭによって青色に染色された。スケールバー＝２０μｍ。図４Ａのパネル（ｉｉ）は、＞１０，０００細胞／秒のスループット速度で、図３Ｄで使用される符号化光学構造を通して異なる細胞型を別々に流すことを示す。図４Ａのパネル（ｉｉｉ）は、蛍光強度の時間変調信号からまとめて抽出された各細胞型の圧縮波形を示す。図４Ａのパネル（ｉｖ）は、細胞分類器を構築するための訓練データセットとして使用された各細胞型で標識された波形のライブラリを示す。サポートベクターマシンモデルをこの研究で使用した。図４Ｂは、分類器モデルを試験するための手順を示す。図４Ｂのパネル（ｉ）は、異なる型の細胞が、分析前に種々の濃度比で実験的に混合されたことを示す。図４Ｂのパネル（ｉｉ）は、同じスループット速度でエンコーダを通る細胞混合物の流れを示す。図４Ｂのパネル（ｉｉｉ）は、細胞型を分類するために、訓練されたモデルを波形に直接適用することを示す。図４Ｃのパネル（ｉ）に示されるように、青色のプロットは、ＢＶ４２１の総強度を測定することによって取得されたもの（図４Ｃのパネル（ｉｉ）に詳細に示される）と比較した、ＦＧ強度の波形（図４Ｃのパネル（ｉｖ）に詳細に示される）に訓練されたＳＶＭベースの分類を直接適用することによって推定された、各サンプル中のＭＣＦ－７細胞の濃度比である。赤色プロットは、ＳＶＭベースの分類の同じ手順を総ＦＧ強度に適用することによって推定されたＭＣＦ－７細胞の濃度比である：ＢＶ４２１の測定された総強度と比較して、訓練されたＳＶＭベースの分類を（図４Ｃのパネル（ｉｉｉ）に詳細に示される）総ＦＧ強度に適用すること。７０個のサンプルを様々な濃度比について測定し、各サンプルはランダムに混合した細胞の７００回の試験を含んだ。イメージフリーＧＣの結果（図４Ｃのパネル（ｉ）に青色のプロットで示される）は、ｙ＝ｘからの０．０４６の小さい二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、及び約５０００個の細胞にわたる０．９７１の受信者動作特性（ＲＯＣ、図４Ｄに示される）曲線下面積（ＡＵＣ）を明らかにするが、これらの細胞の形態はヒトの眼に類似しているように見える。ＲＯＣ曲線上の各点は、訓練されたＳＶＭモデルからのスコアに適用される閾値に対応し、ヒストグラム中の赤色及び青色は、ＢＶ４２１の強度に従って標識される。対照的に、図４Ｃのパネル（ｉ）の赤色プロットは、０．２８９の大きなＲＭＳＤ及び０．５９６の不良なＲＯＣ－ＡＵＣを有する劣った分類結果を示す。図４Ｅに示すように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の複合混合物に対してモデル癌（ＭＣＦ－７）細胞を分類する際に、超高速イメージフリーＧＣは、ＡＵＣ～０．９９８の高い値を記録し、実際の使用におけるそのロバストで正確な性能を確認した。
［００２２３］ 図４Ａ～４Ｅは、圧縮信号の直接機械学習を介したＧＣによるハイスループットかつ高精度の蛍光イメージフリー「イメージング」サイトメトリーを示す。図４Ａは、ＧＣにおいて分類器モデルを訓練するための手順を示す。図４Ａのパネル（ｉ）は、異なるが形態学的に類似した細胞型（ＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞）が蛍光標識されたことを示す。両方の細胞型について、細胞質はＦＧによって緑色に染色され、ＭＣＦ－７細胞のみの膜はＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭによって青色に染色された。スケールバー＝２０μｍ。図４Ａのパネル（ｉｉ）は、＞１０，０００細胞／秒のスループット速度で、図３Ｄで使用される符号化光学構造を通して異なる細胞型を別々に流すことを示す。図４Ａのパネル（ｉｉｉ）は、蛍光強度の時間変調信号からまとめて抽出された各細胞型の圧縮波形を示す。図４Ａのパネル（ｉｖ）は、細胞分類器を構築するための訓練データセットとして使用された各細胞型で標識された波形のライブラリを示す。サポートベクターマシンモデルをこの研究で使用した。図４Ｂは、分類器モデルを試験するための手順を示す。図４Ｂのパネル（ｉ）は、異なる型の細胞が、分析前に種々の濃度比で実験的に混合されたことを示す。図４Ｂのパネル（ｉｉ）は、同じスループット速度でエンコーダを通る細胞混合物の流れを示す。図４Ｂのパネル（ｉｉｉ）は、細胞型を分類するために、訓練されたモデルを波形に直接適用することを示す。図４Ｃのパネル（ｉ）に示されるように、青色のプロットは、ＢＶ４２１の総強度を測定することによって取得されたもの（図４Ｃのパネル（ｉｉ）に詳細に示される）と比較した、ＦＧ強度の波形（図４Ｃのパネル（ｉｖ）に詳細に示される）に訓練されたＳＶＭベースの分類を直接適用することによって推定された、各サンプル中のＭＣＦ－７細胞の濃度比である。赤色プロットは、ＳＶＭベースの分類の同じ手順を総ＦＧ強度に適用することによって推定されたＭＣＦ－７細胞の濃度比である：ＢＶ４２１の測定された総強度と比較して、訓練されたＳＶＭベースの分類を（図４Ｃのパネル（ｉｉｉ）に詳細に示される）総ＦＧ強度に適用すること。７０個のサンプルを様々な濃度比について測定し、各サンプルはランダムに混合した細胞の７００回の試験を含んだ。イメージフリーＧＣの結果（図４Ｃのパネル（ｉ）に青色のプロットで示される）は、ｙ＝ｘからの０．０４６の小さい二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、及び約５０００個の細胞にわたる０．９７１の受信者動作特性（ＲＯＣ、図４Ｄに示される）曲線下面積（ＡＵＣ）を明らかにするが、これらの細胞の形態はヒトの眼に類似しているように見える。ＲＯＣ曲線上の各点は、訓練されたＳＶＭモデルからのスコアに適用される閾値に対応し、ヒストグラム中の赤色及び青色は、ＢＶ４２１の強度に従って標識される。対照的に、図４Ｃのパネル（ｉ）の赤色プロットは、０．２８９の大きなＲＭＳＤ及び０．５９６の不良なＲＯＣ－ＡＵＣを有する劣った分類結果を示す。図４Ｅに示すように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の複合混合物に対してモデル癌（ＭＣＦ－７）細胞を分類する際に、超高速イメージフリーＧＣは、ＡＵＣ～０．９９８の高い値を記録し、実際の使用におけるそのロバストで正確な性能を確認した。
【0175】
［００２２４］ 強力なイメージング装置としてのＧＣの使用に加えて、ＧＣからの圧縮的に生成された信号の直接分析は、他のイメージング方法と比較して著しく低いコンピュータによるコストで細胞の形態のハイスループットかつ正確な分類を可能にし、超高速蛍光「イメージング」活性化細胞分析及び選別（ＦｉＣＳ）の実現につながる。これは、ＧＣにおける圧縮感知が、物体イメージを再構成するための十分な情報を保持しながら、イメージングデータのサイズを著しく低減するために達成され得る。ヒトの認知は波形を直接分類することができないが、機械学習方法は、イメージ生成なしに波形を分析することができる。～１０，０００細胞／秒の速度で測定された波形に直接適用された教師あり機械学習は、既存のフローサイトメーター及びヒトのイメージ認知のものを超える高い性能を有する蛍光標識細胞を分類した。さらに、このイメージフリーＧＣは、リアルタイムＦｉＣＳを可能にするために、マイクロ流体選別システムと統合することができる。
【0176】
［００２２５］ イメージフリーＧＣは、２つのステップを含むことができる。細胞分類のモデルを１）訓練すること、及び２）試験すること。モデルは、異なる細胞型からの蛍光信号の波形をコンピュータ的に混合することによって、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）技術（２３）に基づいて構築した。波形のこの訓練データは、各細胞型を別々に光学エンコーダに実験的に通すことによって収集された。次いで、実験的に混合した細胞を流し、細胞型を分類することによってモデルを試験した。実験前に、２つの異なる型の細胞を培養し、固定し、蛍光標識した：図４Ａのパネル（ｉ）に示すように、ＭＣＦ－７細胞及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞。両方の細胞型について、図４Ａのパネル（ｉ）に示すように、イメージフリーＧＣによる分類のために、ＦＧを用いて細胞質を緑色で標識した。一方、ＭＣＦ－７細胞においてのみ、ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭを用いて膜を青色で標識した。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞は、青色チャネルにおいて低い自己蛍光のみを有し、図１０Ａ～１０Ｃに示されるように、このチャネルにおいて容易に区別可能なコントラストを提供した）。これを使用して、両方の細胞型における類似の細胞質標識に依存するＧＣの分類を検証した。これらのフルオロフォアを励起するために、紫色及び青色ＣＷレーザの両方を使用し、一方で、デジタイザ（Ｍ４ｉ．４４５１，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＰＭＴからの得られた信号を記録した。マイクロ流体システムは、再構成されたイメージにおける細胞の位置に対応する、ランダムな光学構造に対して細胞の流れの位置を空間的に制御するために開発された。この光学流体プラットフォームを用いて、各細胞型について細胞質から緑色蛍光強度の波形を収集した。この訓練データセットから、任意の特徴抽出を伴わないＳＶＭベースの分類器を構築した。この訓練された分類器を試験するために、様々な濃度比で混合された異なる細胞型の組み合わせを含有する一連の溶液を導入した。次いで、各分類器は、混合細胞の～７００個の波形を単一のデータセットとして識別し、それぞれについて濃度比を推定した。ＭＣＦ－７とＭＩＡ ＰａＣａ－２との組み合わせを使用したので、ＭＣＦ－７細胞の膜におけるＢＶ４２１の全蛍光強度を測定することによって、分類結果を定量的にスコア化することができた。
【0177】
［００２２６］ 青色蛍光強度を用いて測定したＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の濃度比対モデルを緑色蛍光波形に適用することによって測定した濃度比のプロットは、ｙ＝ｘから０．０４６の小さい二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を有する対角線上の線を与える。～４９，０００個の混合細胞のＧＣベースの分類を評価するためにＢＶ４２１の測定値を使用すると、０．９７１の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）が得られ、ＧＣによる細胞分類が正確であることが確認された。ＲＯＣ曲線上の各点は、訓練されたＳＶＭモデルから得られたスコアに適用された閾値に対応し、ヒストグラム中の赤色及び青色は、図４Ｄ中のＢＶ４２１の強度に従って標識される。ＧＣの高い性能が波形において符号化された空間情報によるものであることを確認するために、ＳＶＭベースの分類の同じ手順を、各ＧＣ波形を経時的に積分することによって取得された全緑色蛍光強度に適用した。図４Ｃにおいて赤色プロットとして見られる結果は、ｙ＝ｘからの０．５９６の乏しいＲＯＣ－ＡＵＣ及び０．２８９の大きいＲＭＳＥを与え、したがって、ＧＣの高い性能に対する全蛍光強度の寄与がほとんどないことを示す。加えて、単純な線形適合を計算することによって（図１１に示されるように）、ＳＶＭベースの分類が、広範囲の濃度比にわたってその精度を一貫して保持することが確認された。したがって、イメージフリーＧＣは、標的細胞が、サイズ、全蛍光強度、及び見かけの形態学的特徴において類似しており、異なる濃度で混合物中に存在する場合であっても、正確な細胞分類器である。実際、分子特異的標識が存在しない場合、そのような類似の細胞型を分類することは、以前のサイトメーターにとって、さらにはヒトの認知にとっても重要な課題であった。
【0178】
［００２２７］ 類似の形態を共有する２つの細胞型を分類することに加えて、ＧＣは、ハイスループットで複合細胞混合物から特定の細胞型を正確に分類することができる。このような技術は、例えば、患者の末梢血中の希少な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する際に重要である（２４－２７）。モデル癌細胞（ＭＣＦ－７）を末梢血単核細胞（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ＩｎｃからのＰＢＭＣ）、リンパ球及び単球を含む血液細胞の不均一集団から分類するためのイメージフリーＧＣのワークフローを適用した。再度、全ての細胞の細胞質を、イメージフリーＧＣによる分類のためにＦＧを用いて緑色で標識し、一方、ＭＣＦ－７細胞のみの膜を、ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭを用いて青色で標識して、ＧＣ分類結果を確認した。分類器ＳＶＭモデルは、標識されたＭＣＦ－７細胞及びＰＢＭＣ細胞についての緑色蛍光波形を実験的に収集し、それらをコンピュータ的に混合することによって最初に訓練された。次いで、実験的に混合した細胞を流し、それらの細胞型を１つずつ分類することによってこのモデルを試験した。全ての信号を、１０，０００細胞／秒を超えるスループットで測定した。モデルを訓練するために、１，０００個のＭＣＦ－７細胞及び１，０００個のＰＢＭＣを使用した。モデルを試験するために、ＭＣＦ－７細胞及びＰＢＭＣのランダム混合物からの１，０００個の細胞を使用した。相互検証を１０回行った後、ＧＣ波形のＳＶＭベースの分類器についてＡＵＣは０．９９８を記録した。図４Ｅは、ＲＯＣ曲線のうちの１つを示し、複合細胞混合物からの特定の細胞型の超高速かつ正確な検出の能力を証明する。
【0179】
実施例６：超高速精密細胞選別
［００２２８］ 図５Ａ～５Ｃは、機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化細胞選別機（ＦｉＣＳ）の実証を示す。図５Ａの左パネルに示されるように、マイクロ流体デバイスは、３つの機能的部位を含み得る。細胞のフローストリームは、最初に３Ｄ流体力学的流れ集束によって集束され、次いでランダム構造化光照明を受け、最後に選別領域に到達した。選別動作時に、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）アクチュエータが入力電圧によって駆動され、標的細胞を収集出口に選別するために流体を接合部に向かって横方向に変位させるように曲げられた。図５Ａの右パネルに示されるように、細胞のリアルタイム分類及び選択的単離のために、ＰＭＴで測定されたアナログ信号をデジタル化し、次いで、訓練されたＳＶＭベースの分類器が実装されたＦＰＧＡで分析した。分類結果がポジティブであった場合、ＦＰＧＡは時間遅延パルスを送出し、その結果、ＰＺＴデバイスを作動させた。実験は、～３，０００細胞／秒のスループット速度で実施した。全てのＭＩＡ ＰａＣａ－２、ＭＣＦ－７、及びＰＢＭＣ細胞の細胞質を、ＦＧを用いて緑色で標識した。（図５Ｂに示す）中のＭＣＦ－７細胞の膜及び（図５Ｃに示す）中のＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の細胞質を、それぞれＢＶ４２１結合ＥｐＣＡＭ抗体及び抗パンサイトケラチン一次／ＡＦ４０５結合二次抗体を用いて青色で標識した。
［００２２８］ 図５Ａ～５Ｃは、機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化細胞選別機（ＦｉＣＳ）の実証を示す。図５Ａの左パネルに示されるように、マイクロ流体デバイスは、３つの機能的部位を含み得る。細胞のフローストリームは、最初に３Ｄ流体力学的流れ集束によって集束され、次いでランダム構造化光照明を受け、最後に選別領域に到達した。選別動作時に、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）アクチュエータが入力電圧によって駆動され、標的細胞を収集出口に選別するために流体を接合部に向かって横方向に変位させるように曲げられた。図５Ａの右パネルに示されるように、細胞のリアルタイム分類及び選択的単離のために、ＰＭＴで測定されたアナログ信号をデジタル化し、次いで、訓練されたＳＶＭベースの分類器が実装されたＦＰＧＡで分析した。分類結果がポジティブであった場合、ＦＰＧＡは時間遅延パルスを送出し、その結果、ＰＺＴデバイスを作動させた。実験は、～３，０００細胞／秒のスループット速度で実施した。全てのＭＩＡ ＰａＣａ－２、ＭＣＦ－７、及びＰＢＭＣ細胞の細胞質を、ＦＧを用いて緑色で標識した。（図５Ｂに示す）中のＭＣＦ－７細胞の膜及び（図５Ｃに示す）中のＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の細胞質を、それぞれＢＶ４２１結合ＥｐＣＡＭ抗体及び抗パンサイトケラチン一次／ＡＦ４０５結合二次抗体を用いて青色で標識した。
【0180】
［００２２９］ 図５Ｂは、形態学的に類似したＭＣＦ－７細胞に対するＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の正確な単離を示す。ＧＣは、イメージ再構成なしに緑色蛍光波形を直接分類した。図５Ｂのパネル（ｉ）は、細胞混合物について測定された最大青色蛍光強度のヒストグラムを示し、０．６２６のＭＩＡ ＰａＣａ－２の純度を示し、一方、図５Ｂのパネル（ｉｉ）は、ＦｉＣＳを適用した後の同じ混合物についての最大青色蛍光強度のヒストグラムを示し、０．９５１のＭＩＡ ＰａＣａ－２の純度を示す。０．０５の閾値に対応する破線を使用して、２つの細胞型の集団を区別した。
【0181】
［００２３０］ 図５Ｃは、ＰＢＭＣの複合混合物に対するモデル癌（ＭＩＡ ＰａＣａ－２）細胞の正確な単離を示す。図５Ｃのパネル（ｉ）は、細胞混合物について測定された最大青色蛍光強度のヒストグラムを示し、０．１１７のＭＩＡ ＰａＣａ－２の純度を示し、一方、図５Ｃのパネル（ｉｉ）は、ＦｉＣＳを適用した後の同じ混合物についての最大青色蛍光強度のヒストグラムを示し、０．９５１のＭＩＡ ＰａＣａ－２の純度を示す。破線は、２つの細胞型の集団を区別するために使用された４０の閾値に対応する。
【0182】
［００２３１］ 圧縮感知によるデータサイズの低減及びＧＣにおけるイメージ再構成の回避は、単一波形を分類するために必要とされる計算時間を短縮する。この効率的な信号処理をマイクロ流体システムと組み合わせることによって、「イメージング」データのリアルタイム分析に基づく超高速且つ正確な細胞選別が実現された。形態学的に類似した細胞の別の集団から及び複合細胞混合物から特定の細胞集団を単離する能力が、ハイスループットかつ高精度で実証された。図５Ａの左パネルは、ポリジメチルシロキサン製のマイクロ流体デバイスを示す。図１２Ａに示すように、３つの機能的部位を設計した。まず、図１２Ｂに示すように、細胞のフローストリームを、３Ｄ流体力学的流れ集束（２８，２９）構造によって密なストリームに集束させた。次いで、細胞は、ＧＣのランダム構造化光照明を受け、最終的に選別接合部に到達した。鉛チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）アクチュエータを、図１２Ｃに示すように、メインのフローストリームに垂直な方向に方向付けられたチャネルを通してこの接合部に接続した。選別動作のために、アクチュエータを入力電圧によって駆動して、流体を曲げて、接合部に向かって横方向に変位させて、標的細胞を収集出口に選別した。図５Ａ及び図１２Ｄに示すように、細胞のリアルタイム分類及び選択的単離のために、それらの蛍光信号をＰＭＴによってアナログ電圧として記録し、アナログ－デジタルコンバータによってデジタル化し、次いでフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ、Ｓｔｒａｔｉｘ ＩＶ、Ａｌｔｅｒａ）によって分析した。ＳＶＭベースの分類器は、事前に実装された。関心のある細胞をＦＰＧＡがポジティブと分類したとき、ＦＰＧＡは時間遅延パルスを送出し、その結果、チップ内のＰＺＴアクチュエータを駆動した。各圧縮波形を分類するためのＦＰＧＡにおける計算時間は、再現可能な選別を可能にするのに十分に短かった（＜１０μ秒）。実験を通して、ＧＣ波形の長さは、約３，０００細胞／秒のスループットに対応する約３００μ秒に維持された。最大青色蛍光強度によって作製されたそれらの標識を有する陽性及び陰性細胞の緑色蛍光波形を測定した後、分類器モデルをオフラインでコンピュータにおいて構築し、ＦＰＧＡに実装した。実験では、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、ＭＣＦ－７及びＰＢＭＣ細胞の全ての細胞質を、ＦＧを用いて緑色で標識し、さらに、ＭＣＦ－７細胞の膜（図５Ｂに示す）及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の細胞質（図５Ｃに示す）を、それぞれＢＶ４２１結合ＥｐＣＡＭ抗体及び抗パンサイトケラチン一次／ＡＦ４０５結合二次抗体を用いて青色で標識した。
【0183】
［００２３２］ 統合されたＦｉＣＳは、ＭＣＦ－７細胞からのＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の正確な単離を可能にし、これは、サイズ、全蛍光強度、及び見かけの形態が類似している。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の２００個の波形及びＭＣＦ－７細胞の２００個を、ＳＶＭモデルを訓練するために使用した。２つの細胞型を混合し、それらの最大青色蛍光強度を、自家製フローサイトメーター（分析器）を使用して測定し、（図５Ｂのパネル（ｉ）に示すように）ヒストグラムに現れた２つの細胞型に対応する２つの別個のピークを得た。緑色蛍光波形を分類することによって同じ細胞混合物に機械学習駆動ＦｉＣＳを適用した後、選別された混合物の最大青色蛍光強度を同様に測定した。その結果、ＭＣＦ－７細胞に対応する、より強い強度のピークは消失し、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の純度は０．６２５（図５Ｂのパネル（ｉ）に示す）から０．９５１（図５Ｂのパネル（ｉｉ）に示す）に増加した。これにより、標的分子を特異的に標識しない、細胞質染色（ＦＧ）のみを使用するだけで、ＦｉＣＳは、見かけ上類似する細胞型を、それらの形態に基づいて高い精度及びスループットで認識し、物理的に単離することができることが確認された。
【0184】
［００２３３］ ＦｉＣＳはまた、ＰＢＭＣの複合混合物に対してＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を正確に濃縮することができる。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の２００個の波形及びＰＢＭＣの２００個を、ＳＶＭモデルを訓練するために使用した。２つの細胞型を混合し、それらの最大青色蛍光強度を、自家製フローサイトメーター（分析器）を使用して測定した。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の集団に対応する、より強い強度でのピークは、比較的小さかった（図５Ｃのパネル（ｉ）に示す）。緑色蛍光波形を分類することによって同じ細胞混合物にＦｉＣＳを適用した後、選別された混合物の最大青色蛍光強度を同じ方法で測定した。その結果、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の純度は、０．１１７（図５Ｃのパネル（ｉ）に示す）から０．９５１（図５Ｃのパネル（ｉｉ）に示す）に増加した。これにより、ＦｉＣＳが、いかなる特定のバイオマーカーなしで、高い精度及びスループットで、複合細胞混合物のバックグラウンドに対してモデル癌細胞を有意に濃縮できることが確認された。
【0185】
［００２３４］ 最近の研究は、腫瘍学、免疫学及び薬物スクリーニングを含む様々な分野において、重要な細胞の検出及び／又は特徴付けのためにイメージングフロー分析器を広く使用している（３０，３１）。分析スループットを有意に増加させ、高含有量情報に従ってリアルタイムで細胞集団を選択的に単離するＧＣの能力は、単一細胞レベルでの包括的な下流オミクス分析との形態ベースの分析の統合をもたらし得る。ヒトの限られた知識及び能力に依存する従来のイメージ生成及び処理を超えて、圧縮モダリティに直接適用される機械学習方法は、大量かつ高次元のデータのリアルタイム適用のための広い適用可能性を有し得る。
【0186】
実施例７：光学エンコーダパターンの取得
［００２３５］ 図６は、ＳＩモードにおける及びＳＤモードにおけるビーズの蛍光イメージングにおいて使用される光学エンコーダパターンＨ（ｘ、ｙ）の取得を示す。図６の左下の部分は、（図６の右上の部分に示されるような）エンコーダＨ（ｘ、ｙ）の正確な強度分布を推定するために使用される光学セットアップを示す。同一の擬似ランダムホールアレイを有するクロム層で作製されたフォトマスクを、ＳＩモード及びＳＤモードに関するサンプルの前（図６に示す平面１）及び後（図６に示す平面２）のいずれかの結合イメージ面にそれぞれ配置した。作製したホールは、一辺が８μｍの正方形であり、８００×９，６００μｍ２の矩形領域にわたってランダムに広がっており、充填率は～１％であった。光学構造のスパース性（充填率）は、ＧＣの測定プロセスを実験ノイズに対してロバストにするように設計された（３８，３９）。これら８μｍのホールは、回折及び幾何学的収縮後のサンプル面における約１μｍのスポットに対応し、ＧＣベースのイメージングの空間分解能を規定する。各光学部品に起因する色収差に由来する誤差を最小限に抑えるために、蛍光ポリマーの薄いフィルムをサンプル面に配置し、そのパターン化された発光を記録した。
［００２３５］ 図６は、ＳＩモードにおける及びＳＤモードにおけるビーズの蛍光イメージングにおいて使用される光学エンコーダパターンＨ（ｘ、ｙ）の取得を示す。図６の左下の部分は、（図６の右上の部分に示されるような）エンコーダＨ（ｘ、ｙ）の正確な強度分布を推定するために使用される光学セットアップを示す。同一の擬似ランダムホールアレイを有するクロム層で作製されたフォトマスクを、ＳＩモード及びＳＤモードに関するサンプルの前（図６に示す平面１）及び後（図６に示す平面２）のいずれかの結合イメージ面にそれぞれ配置した。作製したホールは、一辺が８μｍの正方形であり、８００×９，６００μｍ２の矩形領域にわたってランダムに広がっており、充填率は～１％であった。光学構造のスパース性（充填率）は、ＧＣの測定プロセスを実験ノイズに対してロバストにするように設計された（３８，３９）。これら８μｍのホールは、回折及び幾何学的収縮後のサンプル面における約１μｍのスポットに対応し、ＧＣベースのイメージングの空間分解能を規定する。各光学部品に起因する色収差に由来する誤差を最小限に抑えるために、蛍光ポリマーの薄いフィルムをサンプル面に配置し、そのパターン化された発光を記録した。
【0187】
［００２３６］ ＳＩモードでは、ポリマーフィルムはフォトマスクを通過する光で励起された。フィルムの蛍光イメージを平面２に転写し、さらに、各々が２００ｍｍの焦点距離を有する２つの色収差補正レンズを備える４ｆ顕微鏡システムを通してイメージセンサに転写した。ＳＤモードでは、ポリマーフィルムは、均一に広がった光で励起された。フィルムの蛍光イメージを、フォトマスクが配置された平面２に転写した。擬似ランダムにパターン化されたホールを通過する光子は、各々が２００ｍｍの焦点距離を有する２つの色収差補正レンズを備える４ｆ顕微鏡システムを通してそのイメージを形成した。スケールバーは５０μｍである。実験では、青色ＬＥＤ（ＵＨＰ－Ｔ－ＬＥＤ－４６０ＵＶ ＬＥＤ、Ｐｒｉｚｍａｔｉｘ、イスラエル）を励起光源として使用し、科学的ＣＭＯＳカメラ（Ｆｌａｓｈ４．０Ｖ２、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）をイメージの取得のために使用した。対物レンズは２０倍であり、オリンパス（ＵＰｌａｎＳＡｐｏ）から入手した。イメージ化ビーズはＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から購入した。（ＦＰ－１００５２－２蛍光黄色粒子、直径：１０．０－１４．０μｍ）。青色ＬＥＤからの励起光は、４７４／２７ｎｍバンドパスフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を通過し、ダイクロイックミラー（ＺＴ４８８ｒｄｃ、Ｃｈｒｏｍａ）によって反射され、サンプルを照射した。放出された光は、ミラーを通過し、５２５／５０ｎｍバンドパスフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を通過して収集された。
【0188】
［００２３７］ 図７は、蛍光標識された細胞の３色イメージングのために使用されたエンコーダＨ（ｘ、ｙ）の光学設定及び測定された強度分布を示す。擬似ランダムホールアレイを有するクロム層のフォトマスクを、ＳＤモード用のサンプルの後の結合イメージ面に配置した。作製したホールは、辺長が８μｍの正方形であり、８００×１０，８００μｍ２の矩形領域にわたって～１％の充填率でランダムに広がっていた。
【0189】
［００２３８］ 青色レーザ（ＧＥＭ４７３－５００、Ｌａｓｅｒ Ｑｕａｎｔｕｍ）からの光は、クリアリングフィルタ（実施例１、Ｓｅｍｒｏｃｋ）を通過し、ＵＶ ＬＥＤ（ＵＨＰ－Ｔ－ＬＥＤ－３８５ＵＶ ＬＥＤ、Ｐｒｉｚｍａｔｉｘ）からの光は３７７／５０ｎｍバンドパスフィルタ（実施例２、Ｓｅｍｒｏｃｋ）を通過した。これらの励起光源は、４２０ロングパスダイクロイックミラー（ＤＭ１、Ｃｈｒｏｍａ）と組み合わされ、トリプルエッジダイクロイックミラー（ＤＭ２、Ｄｉ０１－Ｒ４０５／４８８／５９４、Ｓｅｍｒｏｃｋ）によって反射され、２０倍の対物レンズを通してサンプルを均一に照射した。サンプルからの発光は、ＤＭ２、トリプルバンドパス発光フィルタ（Ｅｍ．１，ＦＦ０１－４３２／５２３／７０２，Ｓｅｍｒｏｃｋ）、及び光学的に符号化されるフォトマスクを通過した。ＧＣベースのイメージングでは、フォトマスク後の放射光は、ダイクロイックミラー（ＤＭ３は、Ｓｅｍｒｏｃｋ製のＦＦ－５７３－Ｄｉ０１であり、ＤＭ４は、Ｃｈｒｏｍａ製のＺＴ４８８ｒｄｃである）の組み合わせ使用によって３つの色チャネルに分割され、各バンドパスフィルタ（Ｅｍ．２、Ｅｍ．３、及びＥｍ．４は、Ｓｅｍｒｏｃｋ製の５９３ロングパスフィルタ、５３５／５０ｎｍバンドパスフィルタ、及び４３５／４０ｎｍバンドパスフィルタである）を通して３つのＰＭＴを使用して記録された。Ｈ（ｘ、ｙ）の較正では、蛍光ポリマーの薄いフィルムをサンプル面に配置し、５３６／４０ｎｍバンドパスフィルタ（Ｅｍ．５、Ｃｈｒｏｍａ）及びｓＣＭＯＳカメラを使用した異なる励起による照明下で、パターン化された発光を別々に記録した。スケールバーは５０μｍである。
【0190】
［００２３９］ 図８は、超高速多色蛍光イメージング及びＧＣによるイメージフリーイメージングサイトメトリーに使用される光学エンコーダの光学セットアップ及び較正された強度分布を示す。図８の左下の部分は、イメージフリーＧＣに使用される光学セットアップを示しており、回折光学素子（ＤＯＥ）を使用する構造化照明が、サンプルの前に結合イメージ面において各波長レーザに関して照明された。構造化照明は、～１％の輝点を有する擬似ランダムパターンを有する１００×１３５０ピクセルのパターンを有するように設計され、各正方形ピクセルは、４０５ｎｍ（ＤＯＥ－１）に対して１５０ｍｍの焦点距離を有するレンズを使用して～１０．５μｍ及び４８８ｎｍ（ＤＯＥ－２）に対して～１２μｍの辺長を有する。サンプルの前の結合イメージ面に、空間フィルタを配置して、０次及び多次の回折パターンを遮断した。
【0191】
［００２４０］ ４８８ｎｍ青色レーザ（Ｃｏｂｏｌｔ０６－ＭＬＤ４８８ｎｍ、Ｃｏｂｏｌｔ）からの光及び４０５ｎｍ紫色レーザ（Ｓｔｒａｄｕｓ４０５－２５０、Ｖｏｒｔｒａｎ）からの光を、ロングパスダイクロイックミラー（ＤＭ１、ＣｈｒｏｍａからのＺＴ４０５ｒｄｃ－ＵＦ１）と組み合わせ、クワッドバンドダイクロイックミラー（ＤＭ２、Ｄｉ０３－Ｒ４０５／４８８／５６１／６３５－ｔ３、Ｓｅｍｒｏｃｋ）によって反射し、２０倍対物レンズを通してサンプルを均一に照射した。サンプルからの発光は、ＤＭ２を通過し、ダイクロイックミラー（ＤＭ３、Ｓｅｍｒｏｃｋ製のＦＦ５０６－Ｄｉ０３）によって２つの色チャネルに分割され、各バンドパスフィルタ（Ｅｍ．１及びＥｍ．２は、Ｓｅｍｒｏｃｋ製の５３５／５０ｎｍバンドパスフィルタ及び４４０／４０ｎｍバンドパスフィルタである）を通して２つのＰＭＴを使用して記録された。較正は、図７に関して本明細書で説明したように、Ｅｍ．５およびｓＣＭＯＳを使用して同じ方法で実施した。イメージフリーイメージングサイトメトリーを実施する場合（図４）、ＤＯＥ－１を円柱レンズに置き換えた。スケールバーは５０μｍである。
【0192】
実施例８：流体力学的流れ集束
［００２４１］ 図９Ａ～９Ｆは、流体力学的集束強度を制御することの、イメージフリーＧＣによる分類の性能に対する効果を示す。図９Ａに示されるフローセル（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，Ｊａｐａｎ）の幾何学的形状は、外側流体による内側流体の流体力学的３次元（３Ｄ）流れ集束をもたらし、流れる細胞が集束した状態に保たれることを可能にし、示されるようなイメージにおけるそれらの位置の制御を可能にする。さらに、デバイスは、図９Ｂに示されるように、内側流体と外側流体との間の流量比を変化させることによって、集束強度の制御を可能にする。すなわち、１つの型の細胞を緩く集束した状態で流すと、強く集束した状態と比較して、より多様で一般化された時間波形が生成される。以下のような集束強度の様々な組合せを包括的に調査した後、高度に一般化され、ロバストで、感度の高い分類器モデルの構築を可能にする流体条件の組合せを使用した：モデルを訓練するために緩い集束条件ときつい集束条件を組み合わせ、モデルを試験するためにきつい集束条件を使用した。
［００２４１］ 図９Ａ～９Ｆは、流体力学的集束強度を制御することの、イメージフリーＧＣによる分類の性能に対する効果を示す。図９Ａに示されるフローセル（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，Ｊａｐａｎ）の幾何学的形状は、外側流体による内側流体の流体力学的３次元（３Ｄ）流れ集束をもたらし、流れる細胞が集束した状態に保たれることを可能にし、示されるようなイメージにおけるそれらの位置の制御を可能にする。さらに、デバイスは、図９Ｂに示されるように、内側流体と外側流体との間の流量比を変化させることによって、集束強度の制御を可能にする。すなわち、１つの型の細胞を緩く集束した状態で流すと、強く集束した状態と比較して、より多様で一般化された時間波形が生成される。以下のような集束強度の様々な組合せを包括的に調査した後、高度に一般化され、ロバストで、感度の高い分類器モデルの構築を可能にする流体条件の組合せを使用した：モデルを訓練するために緩い集束条件ときつい集束条件を組み合わせ、モデルを試験するためにきつい集束条件を使用した。
【0193】
［００２４２］ ＳＶＭベースのイメージフリーＧＣを使用して流れ集束が細胞分類に及ぼす効果を決定するために、図図９Ｃ～９Ｆに示すように、モデルを訓練及び試験する際に、集束強度の様々な組み合わせを包括的に試験した。ＧＣの分類結果を評価するために、モデルを訓練することに関する各タイプ（ＭＣＦ－７又はＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞）で標識された波形のセットから波形をランダムに選択した。図９Ｃ～図９Ｆに示すように、モデルは、分類器を訓練するために使用される波形の数を増加させることによって改善する。モデルを試験するために他の波形からの各細胞型について１，０００個の波形を選択し、それを１０回繰り返すことによってエラーバーを取得した。ここで、きつく集束されたストリームとは、体積における内側流量及び流速における外側速度がそれぞれ２０μＬ／分及び＞１０ｍ／秒であるシナリオを示す。緩く集束されたストリームは、内側速度が３０μＬ／分であるシナリオを示す。
【0194】
［００２４３］ 図９Ｃの曲線は、きつく集束されたストリームが、高度に制御された実験条件（最小の実験誤差）下で訓練及び試験の両方に使用されるとき、精度が、少数の訓練点で高いプラトーに急速に達することを示す。図９Ｄの曲線は、緩く集束されたストリームが訓練及び試験の両方に使用されるとき、精度がゆっくりと増加し、より多くの数の訓練点を必要とすることを示す。これらの結果は、きつく集束された条件が、分類器の感度を増加させるのに役立つことを示す。しかし、厳密な条件で訓練されたモデルは、試験条件が訓練条件と完全には同じでない場合、過剰適合され、精度を失う可能性があり、これは実際にはよくあることである。実際に、図９Ｅの曲線は、きつく集束されたストリームが訓練に使用され、緩く集束されたストリームが試験に使用された場合、精度ははるかにゆっくりと増加し、低いプラトーに達したことを示す。
【0195】
［００２４４］ 細胞分類に対する高い感度及びロバスト性を同時に追求するために、訓練データセットは、きつく集束されたストリーム及び緩く集束されたストリームの両方を使用して収集されたデータセットからランダムに選択された波形を含むように調製された。この訓練されたモデルが、きつく集束されたストリームを使用することによって測定されたデータセットを試験するために使用された場合、図９Ｆに示されるように、精度は急速に増加し、最終的に高いプラトーに達した。したがって、モデルは一般化され、良好に機能する。これらの結果は、緩く集束されたストリームを使用してモデルを訓練することが感度を低減する一方で、サンプルに関するモデルのロバスト性が増加し、これは、機械学習モデルにおける一般化能力と等価であることを示す。高感度でロバストなサイトメトリーを達成するために、本発明者らは、モデルを訓練するために緩い集束条件ときつい集束条件とを組み合わせ、モデルを試験するためにきつい集束条件を使用した。
【0196】
実施例９：イメージフリーゴーストサイトメトリーによる分類の検証
［００２４５］ 図１０Ａ～１０Ｄは、イメージフリーＧＣの分類及びイメージフリーＧＣのワークフローのＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭベースの検証を示す。時間的に変調された緑色蛍光強度を分類する際のイメージフリーＧＣの性能を評価するために、同じ細胞の全青色蛍光（ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭ）強度を定量した。図１０Ａは、ＭＣＦ－７細胞のみの全青色蛍光強度のヒストグラムを示し、図１０Ｂは、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞のみの全青色蛍光強度のヒストグラムを示す。図１０Ｃは、細胞混合物の例のデータセットについての強度ヒストグラムを示し、これは、図４Ｄにおける単一のドットに対応する。図４Ａ～４Ｅにおける実験の全体を通して、ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭの全蛍光強度を使用して、２，５００をＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を区別するための上部ゲーティング閾値として使用し、４，０００を、ＭＣＦ７細胞を区別するための下部ゲーティング閾値として使用した。このゲーティングによって排除された細胞は、全集団のわずか０．７％であり、無視できると考えられた。ＢＶ４２１の全強度の明確な分布とは対照的に、同じサンプル細胞についてのＦＧの全蛍光強度のヒストグラムは、図１０Ｄに示されるように、区別できない分布を示す。
［００２４５］ 図１０Ａ～１０Ｄは、イメージフリーＧＣの分類及びイメージフリーＧＣのワークフローのＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭベースの検証を示す。時間的に変調された緑色蛍光強度を分類する際のイメージフリーＧＣの性能を評価するために、同じ細胞の全青色蛍光（ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭ）強度を定量した。図１０Ａは、ＭＣＦ－７細胞のみの全青色蛍光強度のヒストグラムを示し、図１０Ｂは、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞のみの全青色蛍光強度のヒストグラムを示す。図１０Ｃは、細胞混合物の例のデータセットについての強度ヒストグラムを示し、これは、図４Ｄにおける単一のドットに対応する。図４Ａ～４Ｅにおける実験の全体を通して、ＢＶ４２１－ＥｐＣＡＭの全蛍光強度を使用して、２，５００をＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を区別するための上部ゲーティング閾値として使用し、４，０００を、ＭＣＦ７細胞を区別するための下部ゲーティング閾値として使用した。このゲーティングによって排除された細胞は、全集団のわずか０．７％であり、無視できると考えられた。ＢＶ４２１の全強度の明確な分布とは対照的に、同じサンプル細胞についてのＦＧの全蛍光強度のヒストグラムは、図１０Ｄに示されるように、区別できない分布を示す。
【0197】
［００２４６］ 図１０Ｄは、区別可能なピークが明らかでないＦＧの全蛍光強度のヒストグラムを示す。対照的に、図４Ｄは、式（９）を使用して計算されたスコアのヒストグラムを示し、これは区別可能な２つのピークを有する。図４ＤのＲＯＣ曲線上の各点は、この訓練されたＳＶＭモデルから取得されたスコアに適用された閾値に対応する。ＳＶＭベースの細胞分類方法は、０．９７１のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される高い性能を実証した。図４及び図１１の実証で採用したサンプル及び流体条件を表１に要約する。
【0198】
【表1】
【0199】
実施例１０：ＳＶＭベースの分類の一貫した精度の確認
［００２４７］ 図１１は、広範囲の濃度比にわたるＳＶＭベースの分類の一貫した精度の確認を示す。
単純な線形適合を計算して、モデルが広範囲の濃度比にわたってその精度を一貫して保持することを実証した。図１１において、ＧＣによってＭＣＦ－７を区別する真陽性率及び偽陽性率をそれぞれα及びβとして示すと、ＢＶ４２１の強度の測定についての結果に対するＧＣについての結果は、以下のように推定され得る。
ｎ＝αｍ＋β（１－ｍ）
ここで、ｍはＢＶ４２１の測定により推定されたＭＣＦ－７の濃度比であり、ｎはＧＣ分類により取得されたものである。量α及びβは、ＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２の純粋な溶液についてのＤＡＰＩ測定に対するＧＣ分類結果を比較することによって計算した。計算されたα及びβは、図４Ｄに示されるフィッティングに対して０．９４９及び０．０６８である。これは、異なる濃度比について、プロットとフィットとの間の一貫して良好な一致を実証する。図４Ａのパネル（ｉ）に示されるように、ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＭＣＦ－７細胞の緑色蛍光細胞質イメージ間のサイズ及び真円度などの明らかに異なる形態学的特徴を見出すことは、肉眼では困難である。
［００２４７］ 図１１は、広範囲の濃度比にわたるＳＶＭベースの分類の一貫した精度の確認を示す。
単純な線形適合を計算して、モデルが広範囲の濃度比にわたってその精度を一貫して保持することを実証した。図１１において、ＧＣによってＭＣＦ－７を区別する真陽性率及び偽陽性率をそれぞれα及びβとして示すと、ＢＶ４２１の強度の測定についての結果に対するＧＣについての結果は、以下のように推定され得る。
ｎ＝αｍ＋β（１－ｍ）
ここで、ｍはＢＶ４２１の測定により推定されたＭＣＦ－７の濃度比であり、ｎはＧＣ分類により取得されたものである。量α及びβは、ＭＣＦ－７及びＭＩＡ ＰａＣａ－２の純粋な溶液についてのＤＡＰＩ測定に対するＧＣ分類結果を比較することによって計算した。計算されたα及びβは、図４Ｄに示されるフィッティングに対して０．９４９及び０．０６８である。これは、異なる濃度比について、プロットとフィットとの間の一貫して良好な一致を実証する。図４Ａのパネル（ｉ）に示されるように、ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＭＣＦ－７細胞の緑色蛍光細胞質イメージ間のサイズ及び真円度などの明らかに異なる形態学的特徴を見出すことは、肉眼では困難である。
【0200】
実施例１１：機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化オンチップ細胞選別
［００２４８］ 図１２Ａ～１２Ｄは、機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化オンチップ細胞選別システム（ＦｉＣＳ）を示す。図１２Ａ～１２Ｃは、ＧＣシステムと組み合わせてＦｉＣＳを可能にした機能的マイクロ流体デバイスを示す。図１２Ａに示す細胞選別チップは、標準的なソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。チャネルの特徴を、ＳＵ－８フォトレジストモールドによってフォトリソグラフィーでパターニングし、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写した。ＰＤＭＳチャネルを、酸素プラズマ活性化結合によってガラス基板上に固定した。サンプル及びシース注入の両方を、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｐｕｍｐ１１ Ｅｌｉｔｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ）によって、それぞれ約１０μＬ／分及び４００μＬ／分の一定流量で駆動した。顕微鏡イメージとして図１２Ｂに示されるチップ設計（２８）は、光学測定部位の前の３Ｄ流体力学的流れ集束によって、狭い細胞ストリームにサンプル流れが集束されることを可能にした。顕微鏡イメージとして図１２Ｃに示されるチップ設計（２９）は、分類に基づく選択的細胞選別を可能にした。この選別部位で、圧電ＰＺＴアクチュエータを、メインのフローストリームに対して垂直に走るチャネルを通して接合部に接続した。選別部位に入る標的細胞は、ＰＺＴアクチュエータの曲げ作用によって駆動される変位流体によって収集出口に偏向された。圧電アクチュエータの直径は２０ｍｍであり、固有共振周波数は約６．５ｋＨｚである。図１２Ｂ及び図１２Ｃにおけるスケールバーは５０μｍである。
［００２４８］ 図１２Ａ～１２Ｄは、機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化オンチップ細胞選別システム（ＦｉＣＳ）を示す。図１２Ａ～１２Ｃは、ＧＣシステムと組み合わせてＦｉＣＳを可能にした機能的マイクロ流体デバイスを示す。図１２Ａに示す細胞選別チップは、標準的なソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。チャネルの特徴を、ＳＵ－８フォトレジストモールドによってフォトリソグラフィーでパターニングし、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写した。ＰＤＭＳチャネルを、酸素プラズマ活性化結合によってガラス基板上に固定した。サンプル及びシース注入の両方を、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｐｕｍｐ１１ Ｅｌｉｔｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ）によって、それぞれ約１０μＬ／分及び４００μＬ／分の一定流量で駆動した。顕微鏡イメージとして図１２Ｂに示されるチップ設計（２８）は、光学測定部位の前の３Ｄ流体力学的流れ集束によって、狭い細胞ストリームにサンプル流れが集束されることを可能にした。顕微鏡イメージとして図１２Ｃに示されるチップ設計（２９）は、分類に基づく選択的細胞選別を可能にした。この選別部位で、圧電ＰＺＴアクチュエータを、メインのフローストリームに対して垂直に走るチャネルを通して接合部に接続した。選別部位に入る標的細胞は、ＰＺＴアクチュエータの曲げ作用によって駆動される変位流体によって収集出口に偏向された。圧電アクチュエータの直径は２０ｍｍであり、固有共振周波数は約６．５ｋＨｚである。図１２Ｂ及び図１２Ｃにおけるスケールバーは５０μｍである。
【0201】
［００２４９］ 図１２Ｄは、この研究で使用されるリアルタイム分類及び電気制御システムのプロセスフローを示す。ＰＭＴによってアナログ電圧として検出されたＧＣ波形は、まず、１４ビットの分解能で２０ＭＨｚのサンプリング速度を有するアナログ－デジタルコンバータ（ＡＤＣ、部分的に修正されたＴｅｘａｓ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＡＤ１１４４５ＥＶＭ）を介してデジタル化された。ＦＰＧＡ開発ボード（Ｔｅｒａｓｉｃ ＴＲ４）上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ、Ｓｔｒａｔｉｘ ＩＶ、Ａｌｔｅｒａ）によるＳＶＭベースの分類では、各波形を１，０００データ点に間引いた。ＦＰＧＡが分類に基づいて標的細胞の存在を決定すると、それは自動的に時間遅延信号を出力して関数発生器（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ ＡＧＦ１０２２）を駆動する。関数発生器から直ちに送出される矩形パルスは、高電圧増幅器（Ｔｒｅｋｍｏｄ ｅｌ２２１０）を介して増幅され、選別作用を誘発するためにＰＺＴアクチュエータの電極に送出された。ＦＰＧＡはまた、訓練データを収集し、ＳＶＭパラメータをアップロードし、トリガ条件を設定し、試験データを記憶するためにコンピュータに接続された。
【0202】
［００２５０］ 細胞選別システムの性能を評価するために、フローセル（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を備えた（図８に示されるような）光学セットアップを含む自家製分析器を使用して、選別の前後にサンプルを分析した。ここで、サンプルからの最大青色蛍光強度（標識として）及び緑色蛍光強度は、緑色蛍光信号に適用されるトリガ条件によって単純に検出された。
【0203】
［００２５１］ 例の流体力学的流れ集束デバイスでは、細胞ストリームの位置は、内側流れと外側流れとの間の速度の比を変化させることによって、３次元空間内で制御された。
【0204】
実施例１２：部分透過スペックルパターンに基づく標識フリー選別
［００２５２］ 本明細書に記載のシステム及び方法は、標識フリー選別を実施するために使用することができる。そのような標識フリー選別は、圧縮感知によってマイクロ流体チャネル内の高速で流れる細胞の位相情報を取得することによって達成され得る。これは、細胞が本明細書に記載の構造化照明を通過するときに、検出器（単一ピクセルＰＭＴ又は本明細書に記載の任意の他の検出器など）を用いて透過スペックルパターンの変調波形を測定することによって行うことができる。位相回復イメージング技術と比較して、この方法は、イメージを再生成するために必要なスペックルパターン全体の一部のみを取得することができる。それでもなお、高精度で細胞を分類することは十分であり得、取得前のこの光学次元の低減は、高速かつリアルタイムの分類及び選別を可能にし得る。
［００２５２］ 本明細書に記載のシステム及び方法は、標識フリー選別を実施するために使用することができる。そのような標識フリー選別は、圧縮感知によってマイクロ流体チャネル内の高速で流れる細胞の位相情報を取得することによって達成され得る。これは、細胞が本明細書に記載の構造化照明を通過するときに、検出器（単一ピクセルＰＭＴ又は本明細書に記載の任意の他の検出器など）を用いて透過スペックルパターンの変調波形を測定することによって行うことができる。位相回復イメージング技術と比較して、この方法は、イメージを再生成するために必要なスペックルパターン全体の一部のみを取得することができる。それでもなお、高精度で細胞を分類することは十分であり得、取得前のこの光学次元の低減は、高速かつリアルタイムの分類及び選別を可能にし得る。
【0205】
［００２５３］ 図１４は、ＧＣを利用した標識フリー細胞選別機を示す。光検出器（ＰＤ）によって取得された波形から直接、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）は、ＰＤを通過する各セルを分類する機械学習分類器を実装し得る。次に、ＦＰＧＡは、ＰＺＴにパルスを送信して、対象の細胞として識別された細胞を隣接チャネルに押し出すことができる。
【0206】
［００２５４］ 図１５は、標識フリー細胞選別機のための運動駆動圧縮ゴーストサイトメトリーを示す。細胞が構造化照明を通過するとき、透過スペックルパターンは、構造化照明によって変調され得る。このスペックルパターンの一部を光検出器（ＰＤ）で取得することにより、変調波形を取得することができる。
【0207】
［００２５５］ｍＩＡ ＰａＣａ－２細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞（類似のサイズ及び見かけの形態を有する２つの細胞株）を、本開示のシステム及び方法を使用して分類及び選別した。細胞を３ｍ／ｓの速度で流し、各細胞の波形を１１０マイクロ秒（μｓ）で取得したが、これは９，０００細胞／秒を超えるスループットに対応する。機械分類器を訓練し、検証するために、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を緑色蛍光で染色した。各細胞型の１５０個の細胞を用いて機械分類器を訓練することによって、混合物中の２つの型の細胞を９３％の精度で分類することができた。実際に選別された細胞を蛍光により分析したところ、８９％の純度を有していた。従来の前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）プロットは、２つの細胞がサイズで完全に分類することが困難であることを示す。
【0208】
［００２５６］ 図１６Ａは、標識フリー細胞選別機を用いたＪｕｒｋａｔ及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の選別を示す。図１６Ａの左上部分は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の位相差イメージを示す。図１６Ａの右上部分は、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞の位相差イメージを示す。図１６Ａの左下の部分は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＦＳＣ及びＳＳＣプロットを示す。図１６Ａの右下部分は、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞のＦＳＣ及びＳＳＣプロットを示す。図１６Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞のＦＳＣ及びＳＳＣプロットは重複し、ＦＳＣ及びＳＳＣプロット単独によるサイズ決定を用いて２つの型の細胞を区別することを困難にする。
【0209】
［００２５７］ 図１６Ｂは、細胞選別前後のＪｕｒｋａｔ及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞集団のヒストグラムを示す。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞のみが緑色で染色された。図１６Ｂの上部は、選別前のサンプルを示す。図１６Ｂの下部は、選別後のサンプルを示す。選別後、ＰａＣａ－２に対するＭＩＡの比率は５１％から８９％に増加した。
【0210】
実施例１３：死滅及び初期アポトーシス人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分類
［００２５８］ 図１７Ａは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生存、初期アポトーシス、又は死として分類するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びアネキシンＶの蛍光強度の散布図の例を示す。図１７Ａに示されるように、青色、赤色、及び緑色領域内の集団は、それぞれ、生細胞、死細胞、及び初期アポトーシス細胞として標識される。
［００２５８］ 図１７Ａは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生存、初期アポトーシス、又は死として分類するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びアネキシンＶの蛍光強度の散布図の例を示す。図１７Ａに示されるように、青色、赤色、及び緑色領域内の集団は、それぞれ、生細胞、死細胞、及び初期アポトーシス細胞として標識される。
【0211】
［００２５９］ 図１７Ｂは、ｉＰＳＣについての前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）の散布図の例を示す。青色、赤色及び緑色の点は、それぞれ、生細胞、死細胞及び初期アポトーシス細胞に対応する。ＦＳＣ及びＳＳＣなどの従来の方法を使用して、生細胞は、死／アポトーシス細胞からほとんど区別され得るが、死細胞及びアポトーシス細胞は、互いに区別することが困難である。
【0212】
［００２６０］ 図１７Ｃは、本開示のシステム及び方法を用いた生細胞及び死細胞の分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。点線は、参照のために従来のＦＳＣ及びＳＳＣのみを用いた分類についてのＲＯＣ曲線である。図１７Ｃに示されるように、従来のＦＳＣ及びＳＳＣは、生細胞及び死細胞が０．８７６のＡＵＣで区別されることを可能にし、一方、本開示のシステム及び方法を使用する分類は、０．９９５になるＡＵＣを達成し、非常に優れた性能を示す。
【0213】
［００２６１］ 図１７Ｄは、本開示のシステム及び方法を用いた生細胞及び初期アポトーシス細胞の分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。点線は、参照のために従来のＦＳＣ及びＳＳＣのみを用いた分類についてのＲＯＣ曲線である。図Ｃに示されるシナリオと同様に、本開示のシステム及び方法による分類は、従来のＦＳＣ及びＳＳＣ（ＡＵＣ＝０．８７５）を使用して取得されるものと比較して、優れた性能（ＡＵＣ＝０．９４７）を示す。
【0214】
［００２６２］ 図１７Ｅは、本開示のシステム及び方法を使用した、死細胞及び初期アポトーシス細胞の分類のためのＲＯＣ曲線及びＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。点線は、参照のために従来のＦＳＣ及びＳＳＣのみを用いた分類についてのＲＯＣ曲線である。従来のＦＳＣ及びＳＳＣを単独で使用すると、２つの集団を区別するのが困難である（ＡＵＣ＝０．６５７）が、本開示のシステム及び方法では、それらは０．９３１のＡＵＣで区別することができる。
【0215】
［００２６３］ 本明細書で説明されるシステム及び方法は、再生医療及び細胞療法等のプロセスで使用するための細胞製造プロセスへの有意な適用性を示し得る。このようなプロセスでは、細胞の品質は、様々な要件に従って監視及び制御されるべきである。本明細書に記載されるシステム及び方法は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用するパイプラインに適用され得る。パイプラインは、凍結保存されたｉＰＳＣの解凍で開始されてもよく、これは次いで、複数の分化ステップを通過し、最終細胞産物をもたらす。このパイプライン全体を通して、細胞集団の生存性、発現状態、及び純度を監視する必要がある場合があり、細胞を選別する必要がある場合がある。ｉＰＳＣの以前の試験は、細胞に対してしばしば毒性であるか、又はそうでなければ（例えば、免疫応答に起因して）細胞に悪影響を及ぼす分子染色を必要とした。さらに、細胞生成物の化学的汚染は、これらがヒトの体内に誘導されるとき、患者に対して潜在的な副作用を有し得る。対照的に、本明細書に記載されるシステム及び方法は、実際の生産ライン細胞を染色することなく、それらの生存性、発現状態、及び純度に基づく細胞の高速評価を可能にし得、したがって、分子染色によって潜在的に引き起こされる問題を解決する。
【0216】
［００２６４］ 本明細書に記載されるシステム及び方法は、死細胞だけでなく、初期アポトーシス状態にある細胞を生細胞から高い精度で区別することができる。これは、品質制御のために細胞集団を監視する際に不可欠であり得る。なぜなら、死細胞の残りは、周囲の細胞にストレスを潜在的に引き起こし、ｉＰＳＣ又は他の幹細胞の分化を変化させ得るからである。さらに、死細胞及び初期アポトーシス細胞による汚染は、移植における機能的細胞数の不正確な推定をもたらし得る。培養フラスコから分離した培養ｉＰＳＣの生存率及びアポトーシス分析を実施した。図１７Ａに示すように、訓練標識は、それぞれ死細胞及び初期アポトーシス細胞の指標であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びアネキシンＶの蛍光強度を用いて作成した。死細胞及び初期アポトーシス細胞は、図１７Ｂに示されるように、従来のＦＳＣ及びＳＳＣプロットから、生細胞からある程度の正確さで区別され得る。しかしながら、そのような分類は完全に正確ではない可能性があり、従来の方法は、死細胞を排除するために追加の死細胞排除染色を必要とする場合がある。
【0217】
［００２６５］ 本開示のシステム及び方法を使用して、波形の訓練データセットを、生細胞、死細胞、及び初期アポトーシス細胞としてゲートされ標識された細胞集団を用いて調製した。図１７Ｂに示されるように、死細胞は、０．９９６±０．００１の高いＲＯＣ－ＡＵＣを有する生細胞と区別され（図１７Ｃの実線によって示されるように）、初期アポトーシス細胞は、０．９４７±０．００５のＲＯＣ－ＡＵＣを有する生細胞と区別された（図１７Ｄの実線によって示されるように）。対照的に、同じ標識を有する従来のＦＳＣ及びＳＳＣデータのみを使用して、従来のフローサイトメトリーは、死－生及びアポトーシス－生の区別について、それぞれ、０．８９０±０．００９（図１７Ｃにおいて破線によって示されるように）及び０．８７５±０．０１３（図１７Ｄにおいて破線によって示されるように）のＲＯＣ－ＡＵＣを有する限定された性能を達成した。加えて、本開示のシステム及び方法は、０．９３１±０．００６のＲＯＣ－ＡＵＣ（図１７Ｅの実線によって示されるように）で初期アポトーシス細胞を死細胞から区別することができ、これは、０．６５７±０．０１２のＲＯＣ－ＡＵＣ（図１７Ｅの破線によって示されるように）を達成する従来のＦＳＣ及びＳＳＣのみでは困難であった。
【0218】
実施例１４：分化及び未分化ｉＰＳＣの分類
［００２６６］ 図１８Ａは、機械学習分類器を訓練するために使用される神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びｉＰＳＣの混合物についてのカルセインＡＭ及びｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５強度の散布図の例を示す。青色領域及び赤色領域内の集団を、それぞれＮＰＣ及びｉＰＳＣと標識した。
［００２６６］ 図１８Ａは、機械学習分類器を訓練するために使用される神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びｉＰＳＣの混合物についてのカルセインＡＭ及びｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５強度の散布図の例を示す。青色領域及び赤色領域内の集団を、それぞれＮＰＣ及びｉＰＳＣと標識した。
【0219】
［００２６７］ 図１８Ｂは、本開示のシステム及び方法を用いたＮＰＣ及びｉＰＳＣの分類のためのＲＯＣ曲線（図１８Ｂの外側パネル）及びＳＶＭスコアヒストグラム（図１８Ｂの内側パネル）の例を示す。ＲＯＣ曲線のＡＵＣは０．９３３であった。青色及び赤色のＳＶＭスコアヒストグラムは、図１８Ａに由来する、それぞれＮＰＣ及びｉＰＳＣと標識された細胞に対応する。
【0220】
［００２６８］ 図１８Ｃは、機械学習分類器を訓練するために使用される肝芽細胞及びｉＰＳＣの混合物についてのカルセインＡＭ及びｒＢＣ２ＬＣＮ－６３５強度の散布図の例を示す。青色領域及び赤色領域内の集団を、それぞれ肝芽細胞及びｉＰＳＣと標識した。
【0221】
［００２６９］ 図１８Ｄは、本開示のシステム及び方法を使用した、肝芽細胞及びｉＰＳＣの分類のためのＲＯＣ曲線（図１８Ｄの外側パネル）及びＳＶＭスコアヒストグラム（図１８Ｄの内側パネル）の例を示す。ＲＯＣ曲線のＡＵＣは０．９４７であった。青色及び赤色のＳＶＭスコアヒストグラムは、図１８Ｃに由来する、それぞれ肝芽細胞及びｉＰＳＣと標識された細胞に対応する。
【0222】
［００２７０］ 本開示のシステム及び方法は、未分化細胞を分化細胞から分類することができ、これは、細胞製造パイプラインにおける最も重要なプロセスのうちの１つを表し得る。残りの未分化細胞が依然として増殖する能力を有し得、これが最終的に細胞を癌細胞にさせ得るため、そのような分類は重要であり得る。未分化ｉＰＳＣを、両方とも同じｉＰＳＣに由来する、神経前駆細胞（ＮＰＣ）及び肝芽細胞の形態における分化細胞と比較した。訓練プロセスでは、未分化であったｉＰＳＣのみを染色した未分化マーカーで細胞を標識した。標識フリーのサイトメトリー様式も実施した。訓練標識は、未分化細胞を示すマーカーであるｒＢＣＬＣＮ－６３５（Ｗａｋｏ）で細胞を染色し、ｒＢＣＬＣＮ－６３５強度を測定することにより作成した（図１８Ａ及び図１８Ｃに示す）。未分化マーカーによって標識された各細胞型についての波形を訓練データセットとして使用して、分類器は、（図１８Ｂに示されるように）０．９３３±０．００８のＲＯＣ－ＡＵＣでｉＰＳＣ及びＮＰＣを、並びに（図１８Ｄに示されるように）０．９４４±０．００４のＲＯＣ－ＡＵＣでｉＰＳＣ及び肝芽細胞を区別し、その高い分類能力を示した。対照的に、従来のＦＳＣ及びＳＳＣ情報のみを使用して、細胞の各対の分類についてのＲＯＣ－ＡＵＣは、それぞれ０．８６２±０．０１３及び０．６９７±０．０２０に限定された。
【0223】
実施例１５：機能に基づく細胞の分類
［００２７１］ 図１９Ａは、Ｔ細胞のｆａｂ ＦＩＴＣ強度のヒストグラムの例を示す。赤色閾値線の右側の細胞をＣＡＲ Ｔ細胞と標識した。閾値は陰性対照サンプルによって決定した。
［００２７１］ 図１９Ａは、Ｔ細胞のｆａｂ ＦＩＴＣ強度のヒストグラムの例を示す。赤色閾値線の右側の細胞をＣＡＲ Ｔ細胞と標識した。閾値は陰性対照サンプルによって決定した。
【0224】
【0225】
［００２７３］ 図１９Ｃは、ｒａｊｉ細胞の２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）強度のヒストグラムの例を示す。緑色閾値線の左側の細胞を低グルコース細胞として標識し、赤色閾値の右側の細胞を高グルコース細胞として標識した。
【0226】
【0227】
［００２７５］ 本明細書に記載されるシステム及び方法は、それらの機能に基づいて細胞を選択することによって、細胞集団の質を改善するために使用され得る。これは、例えば、免疫細胞が癌細胞を攻撃するように改変され得る癌治療において重要であり得る。
【0228】
［００２７６］ 非形質導入Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞の混合物からのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の分類を、図１９Ａに示されるように、ＣＡＲ Ｔ細胞上でのみ発現されるｆａｂマーカーに対して訓練された機械学習を用いて、本開示のシステム及び方法を使用して実施した。ＲＯＣ－ＡＵＣは、（図１９Ｂに示されるように）０．８８７±０．００７であり、本開示のシステム及び方法を使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞を、これらの細胞が患者を処置するために直接使用され得るように、標識フリー様式で高精度に精製することができることを示す。
【0229】
［００２７７］ 解糖レベルに基づく細胞分類も実施した。解糖レベルの差は、異なる細胞代謝をもたらし、異なる細胞活性をもたらす。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞において、低グルコースレベルの細胞は、癌に対してより高い有効性を有することが報告されている。解糖レベルを監視するために、蛍光グルコース類似体である２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）が一般に使用されるが、細胞に対して非常に毒性である。したがって、解糖レベルに基づいて生細胞を選別する従来の方法は困難であった。Ｒａｊｉ細胞を２－ＮＢＤＧで処理した。全集団内の高レベル及び低レベルの２－ＮＢＤＧを有する細胞を、オフラインで抽出した（図１９Ｃに示すように）。高２－ＮＢＤＧレベル及び低２－ＮＢＤＧレベルのこれらの細胞を使用して、分類器を訓練し、次いで検証した。結果として、分類器は、０．８８の精度で２つの集団を分類することができ（図１９Ｄに示されるように）、本開示のシステム及び方法が、それらの解糖レベルに基づいて細胞を分類することができることを示す。
【0230】
実施例１６：混合流体中の特定の細胞型の検出
［００２７８］ 本開示のシステム及び方法は、混合流体（血液、尿、涙、唾液、胸水、脳脊髄液、又は本明細書に記載される任意の他の流体等）中の特定の細胞型（疾患細胞等）を検出又は選別するために使用されてもよい。システム及び方法は、種々の従来の実験室試験において必要とされ得るような、フルオロフォアによる標識又は抗体による免疫染色を必要とせずに、そのような特定の細胞型の検出又は選別を可能にし得る。
［００２７８］ 本開示のシステム及び方法は、混合流体（血液、尿、涙、唾液、胸水、脳脊髄液、又は本明細書に記載される任意の他の流体等）中の特定の細胞型（疾患細胞等）を検出又は選別するために使用されてもよい。システム及び方法は、種々の従来の実験室試験において必要とされ得るような、フルオロフォアによる標識又は抗体による免疫染色を必要とせずに、そのような特定の細胞型の検出又は選別を可能にし得る。
【0231】
［００２７９］ 図２０Ａ～Ｉは、混合流体中の様々なタイプの白血球の標識フリー検出を示す。
【0232】
［００２８０］ 図２０Ａは、好中球の集団を含む訓練データセットを示す。好中球は、ＣＤ６６マーカーの比較的高レベルの発現及びＣＤ１９３マーカーの比較的低レベルの発現によって特徴付けられた。好中球を、本明細書に記載のパターン化された光学構造を通過させて流し、好中球に対応する光学信号を記録した。
【0233】
［００２８１］ 図２０Ｂは、好中球及び非好中球に対応する標識フリー光学信号の例を示す。光学信号は、好中球及び非好中球の事前標識なしで取得された。光学信号を使用して、機械学習分類器を訓練して、好中球を非好中球から区別した。
【0234】
［００２８２］ 図２０Ｃは、好中球及び非好中球の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。分類は、好中球及び非好中球の事前標識なしで取得された。ＳＶＭ分類は、９１．４％の精度及び０．９４１のＲＯＣ－ＡＵＣを取得した。
【0235】
［００２８３］ 図２０Ｄは、好酸球の集団を含む訓練データセットを示す。好酸球は、ＣＤ６６マーカーの比較的高レベルの発現及びＣＤ１９３マーカーの比較的高レベルの発現によって特徴付けられた。好酸球を本明細書に記載のパターン化された光学構造を通過させて流し、好酸球に対応する光学信号を記録した。
【0236】
［００２８４］ 図２０Ｅは、好酸球及び非好酸球に対応する標識フリー光学信号の例を示す。光学信号は、好酸球及び非好酸球の事前標識なしで取得された。光学信号を使用して、機械学習分類器を訓練して、好酸球を非好酸球から区別した。
【0237】
［００２８５］ 図２０Ｆは、好酸球及び非好酸球の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。分類は、好酸球及び非好酸球の事前標識なしで取得された。ＳＶＭ分類は、９４．７％の精度及び０．９９２のＲＯＣ－ＡＵＣを取得した。
【0238】
［００２８６］ 図２０Ｇは、好塩基球の集団を含む訓練データセットを示す。好塩基球は、ＣＤ６６マーカーの比較的低レベルの発現及びＣＤ１９３マーカーの比較的低レベルの発現によって特徴付けられた。好塩基球を、本明細書に記載のパターン化された光学構造を通過させて流し、好塩基球に対応する光学信号を記録した。
【0239】
［００２８７］ 図２０Ｈは、好塩基球及び非好塩基球に対応する標識フリー光信号の例を示す。光学信号は、好塩基球及び非好塩基球の事前標識なしで取得された。光学信号を使用して、機械学習分類器を訓練して、好塩基球を非好塩基球から区別した。
【0240】
［００２８８］ 図２０Ｉは、好塩基球及び非好塩基球の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。分類は、好塩基球及び非好塩基球の事前標識なしで取得された。ＳＶＭ分類は、９４．０％の精度及び０．９７０のＲＯＣ－ＡＵＣを取得した。
【0241】
［００２８９］ 図２１Ａ～２２Ｂは、混合流体中の疾患細胞の標識フリー検出を示す。
【0242】
［００２９０］ 図２１Ａは、口腔細胞及びＨｅＬａ細胞の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。口腔細胞及びＨｅＬａ細胞を、本明細書に記載のパターン化された光学構造を通過させて流し、口腔細胞及びＨｅＬａ細胞に対応する光学信号を記録した。光学信号は、口腔細胞又はＨｅＬａ細胞の事前標識なしで取得された。光学信号を使用して、機械学習分類器を訓練して、口腔細胞をＨｅＬａ細胞から区別した。ＳＶＭ分類により、０．９９５のＲＯＣ－ＡＵＣが取得された。
【0243】
［００２９１］ 図２１Ｂは、ＢＭ１細胞及びＫ５６２細胞の分類のためのＳＶＭスコアヒストグラムの例を示す。ＢＭ１細胞及びＫ５６２細胞を、本明細書に記載のパターン化された光学構造を通過させて流し、ＢＭ１細胞及びＫ５６２細胞に対応する光学信号を記録した。光学信号は、ＢＭ１細胞又はＫ５６２細胞の事前標識なしで取得された。光学信号を使用して、機械学習分類器を訓練して、ＢＭ１細胞をＫ５６２細胞から区別した。ＳＶＭ分類により、０．９６９のＲＯＣ－ＡＵＣが取得された。
【0244】
実施例１６：検出領域に同時に存在する異なるタイプの粒子の区別（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）
［００２９２］ 本開示のシステム及び方法は、異なるタイプの粒子が、本開示の検出器が感度を有する領域内に同時に存在する場合であっても、異なるタイプの粒子を区別するために適用され得る。２つ以上の粒子がそのような領域に同時に位置する場合、検出器によって検出される信号に重複が生じ得る。本明細書に記載されるシステム及び方法は、線形方程式に関して表現されることができるため、そのようなイベントは、領域内の全ての他の粒子から独立した各粒子に起因する信号の合計として表され得る。
［００２９２］ 本開示のシステム及び方法は、異なるタイプの粒子が、本開示の検出器が感度を有する領域内に同時に存在する場合であっても、異なるタイプの粒子を区別するために適用され得る。２つ以上の粒子がそのような領域に同時に位置する場合、検出器によって検出される信号に重複が生じ得る。本明細書に記載されるシステム及び方法は、線形方程式に関して表現されることができるため、そのようなイベントは、領域内の全ての他の粒子から独立した各粒子に起因する信号の合計として表され得る。
【0245】
［００２９３］ 本明細書に記載されるシステム及び方法は、本明細書で説明されるように、異なるタイプの粒子に対応する異なる波形を学習するために使用され得る。そのような波形は、異なる時間間隔中に領域を通って移動する異なる粒子を考慮するために任意の時間オフセットを使用して、任意に合計され得る。多種多様なそのような総和を生成し、異なるタイプの粒子が同時に存在することに起因する測定波形と比較することができる。このようにして、粒子を区別することができる。
【0246】
［００２９４］ 代わりに、又は組み合わせて、本明細書に説明される機械学習手順は、異なるタイプの粒子の同時存在のために生じる重複波形を使用して訓練されてもよい。
【0247】
［００２９５］ 図２２Ａは、第１のタイプの粒子に起因する信号（図２２Ａの上部）、第２のタイプの粒子に起因する信号（図２２Ａの中央部）、及び第１及び第２のタイプの粒子が同時に存在することに起因する信号（図２２Ａの下部）の例を示す。
【0248】
［００２９６］ 図２２Ｂは、本開示の検出領域に同時に存在する異なるタイプの粒子を区別するための混同行列の例を示す。混同行列は、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞及びＭＣＦ－７細胞を含む粒子の混合物について生成された６つの状態を示す。図２２Ｂに示されるように、本開示のシステム及び方法は、検出器が感知できる領域における２つの型の細胞の同時存在に対応する重複信号の場合でさえ、ＭＣＦ－７細胞からＭＩＡ ＰａＣａ－２を正確に区別した。
【0249】
［００２９７］ 本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書中に提供される特定の実施例によって限定されることは意図されない。本発明を前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書における実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意図していない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を思いつくであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載の特定の描写、構成、又は相対的比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、任意のそのような代替形態、修正形態、変形形態、又は均等物も包含するものとすることが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの等価物がそれによって包含されることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図20F】
【図20G】
【図20H】
【図20I】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】