特許 7418729 核酸アプタマー、ヒト間葉系幹細胞吸着剤、ヒト間葉系幹細胞の分離方法、ヒト間葉系幹細胞の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-12

(45)【発行日】2024-01-22

(54)【発明の名称】核酸アプタマー、ヒト間葉系幹細胞吸着剤、ヒト間葉系幹細胞の分離方法、ヒト間葉系幹細胞の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20240115BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20240115BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20240115BHJP

【ＦＩ】

C12N15/115 Z ZNA

C12N5/0775

C12Q1/04

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2019146751

(22)【出願日】2019-08-08

(65)【公開番号】P2021023268

(43)【公開日】2021-02-22

【審査請求日】2022-07-11

(73)【特許権者】

【識別番号】504132881

【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100166338

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 正夫

(74)【代理人】

【識別番号】100152054

【弁理士】

【氏名又は名称】仲野 孝雅

(72)【発明者】

【氏名】池袋 一典

(72)【発明者】

【氏名】三村 かおり

(72)【発明者】

【氏名】西尾 真初

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 博之

【審査官】飯濱 翔太郎

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１０／０１７４５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５１８４８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００９／０１８６３５６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０６７７１１９１（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含み、且つ、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に結合性を有する核酸アプタマー。
（ａ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列
（ｂ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列において、１～３個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【請求項2】

以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含み、且つ、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に結合性を有する核酸アプタマー。
（ｃ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列
（ｄ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【請求項3】

前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーである、請求項１又は２に記載の核酸アプタマー。

【請求項4】

前記（ａ）、前記（ｂ）、前記（ｃ）又は前記（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端が修飾されている、請求項１から３のいずれかに記載の核酸アプタマー。

【請求項5】

請求項１から４のいずれかに記載の核酸アプタマーを含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞吸着剤。

【請求項6】

さらに、前記核酸アプタマーが固定化された不溶性担体を含む、請求項５に記載のヒト骨髄由来間葉系幹細胞吸着剤。

【請求項7】

請求項５又は６に記載のヒト骨髄由来間葉系幹細胞吸着剤を用いる工程を含む、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法。

【請求項8】

請求項１から４のいずれかに記載の核酸アプタマーと、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸アプタマー、ヒト間葉系幹細胞吸着剤、ヒト間葉系幹細胞の分離方法、ヒト間葉系幹細胞の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、再生医療に関する研究開発が活発化しており、幹細胞を用いた技術はその中核を占めている。幹細胞の中でも、生体内に存在する体性幹細胞の一種である間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；以下、「ＭＳＣ」ともいう。）は、骨、軟骨、筋肉等の多様な細胞への分化能を有し、骨髄、脂肪組織、歯髄等の多様な採取源があることから、再生医療で使用される組織や臓器の細胞供給源として期待されている（非特許文献１）。

【0003】

ＭＳＣは多様な採取源から取得できる一方で、採取源にはＭＳＣ以外の細胞も存在することから、従来より、採取した組織等の細胞集団からＭＳＣのみを効率よく分離する方法が検討されてきた。このような方法として、例えば、ＭＳＣの細胞表面マーカーに対する抗体及びフローサイトメーター等を利用した方法等が挙げられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３－１４７，１９９９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、従来の方法では、ＭＳＣを特異的に分離することが困難であり得た。

【0006】

本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、ヒト間葉系幹細胞を特異的に分離できる技術の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒト間葉系幹細胞に対して選択的な結合性を有する新規な核酸アプタマーを見出した。さらに、該核酸アプタマーは、ヒト間葉系幹細胞の吸着剤として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下を提供する。

【0008】

（１） 以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含み、且つ、ヒト間葉系幹細胞に結合性を有する核酸アプタマー。
（ａ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列
（ｂ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【0009】

（２） 以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含み、且つ、ヒト間葉系幹細胞に結合性を有する核酸アプタマー。
（ｃ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列
（ｄ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【0010】

（３） 前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーである、（１）又は（２）に記載の核酸アプタマー。

【0011】

（４） 前記（ａ）、前記（ｂ）、前記（ｃ）又は前記（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端が修飾されている、（１）から（３）のいずれかに記載の核酸アプタマー。

【0012】

（５） （１）から（４）のいずれかに記載の核酸アプタマーを含むヒト間葉系幹細胞吸着剤。

【0013】

（６） さらに、前記核酸アプタマーが固定化された不溶性担体を含む、（５）に記載のヒト間葉系幹細胞吸着剤。

【0014】

（７） （５）又は（６）に記載のヒト間葉系幹細胞吸着剤を用いる工程を含む、ヒト間葉系幹細胞の分離方法。

【0015】

（８） （１）から（４）のいずれかに記載の核酸アプタマーと、ヒト間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、ヒト間葉系幹細胞の検出方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、ヒト間葉系幹細胞を特異的に分離できる技術が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】実施例で用いたフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの構成を示したものである。

【図2】フローサイトメトリーによる、実施例で用いたフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの、ｈＭＳＣへの結合能評価を示したものである。

【図3】フローサイトメトリーによる、実施例で用いたフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの、ＨＬ６０細胞への結合能評価を示したものである。

【図4】ドットブロットによる、実施例で用いたフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの、ｈＭＳＣへの結合能評価を示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれに特に限定されない。

【0019】

＜本発明のアプタマー＞
本発明のアプタマーは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、ヒト間葉系幹細胞（以下、「ｈＭＳＣ」ともいう。）に結合性を有する核酸アプタマーである。
（ａ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列
（ｂ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列
（ｃ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列
（ｄ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【0020】

本発明のアプタマーは、本発明者らがＭＳＣと特異的に結合できる分子を探索した結果、「Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法」（Ｇｕｏ，Ｋ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．９：６６８－６７８，２００８等を参照。）を利用して発明されたものである。

【0021】

配列番号１～１６に示される塩基配列を、表１に示す。なお、以下、塩基配列は、５’末端から３’末端の方向に左から右へ記載する。

【0022】

【表1】

【0023】

なお、配列番号９～１６に示される塩基配列は、それぞれ、配列番号１～８に示される塩基配列の３’末端側に、３塩基のチミンからなる「リンカー配列」（ＴＴＴ）及びポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）で増幅するための１８塩基からなる「プライマー配列」を付加した塩基配列である。

【0024】

本発明において、「核酸アプタマー」とは、特定の標的と高い特異性で結合できる核酸分子を意味する。本発明において、核酸アプタマーの標的は、ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；以下、「ｈＭＳＣ」ともいう。）である。

【0025】

本発明において、核酸アプタマーを構成する核酸は、任意の核酸であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの混合物が挙げられる。本発明のアプタマーは、加水分解に対する安定性が高い等の取扱いが容易な点から、好ましくはＤＮＡを含むアプタマー（ＤＮＡアプタマー）である。本発明のアプタマーは、より好ましくは、ＤＮＡからなるアプタマーである。

【0026】

本発明のアプタマーは、上記（ｂ）又は（ｄ）に示されるとおり、ｈＭＳＣに対する結合性を有する限り、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列であってもよい。以下、（ｂ）又は（ｄ）の態様の核酸アプタマーを「改変を含む核酸アプタマー」ともいう。

【0027】

改変を含む核酸アプタマーがｈＭＳＣに対する結合性を有するかどうかは、実施例に示したフローサイトメトリーやドットプロット等の、ｈＭＳＣに対する結合性を評価できる方法によって容易に特定できる。例えば、ｈＭＳＣに対する結合性が、ｈＭＳＣ以外の細胞に対する結合性よりも相対的に高ければ、改変を含む核酸アプタマーがｈＭＳＣに対する結合性を有すると評価できる。

【0028】

改変を含む核酸アプタマーが有する改変（置換、欠失、挿入又は付加）は、ｈＭＳＣに対する結合性を阻害しないように適宜設定できる。例えば、遺伝的アルゴリズム（例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ法（Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．３３， Ｎｏ．１２， ｅ１０８， ２００５））等を用いて、適切な改変を選択できる。

【0029】

改変を含む核酸アプタマーが有する改変は、核酸アプタマーのｈＭＳＣに対する結合性を大きく損なわない範囲で設定でき、好ましくは３個以下、より好ましくは１個の塩基の改変（置換、欠失、挿入又は付加）である。

【0030】

本発明のアプタマーは、ＭＳＣに対する結合性を有する限り、核酸アプタマーの安定性を向上させる点や、後述するｈＭＳＣの検出及びｈＭＳＣの吸着剤への応用をしやすくする点等から、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端に任意の配列や修飾が付加されたものであってもよい。付加され得る配列としては、例えば、ＰＣＲで増幅するためのプライマー配列、スペーサー配列、メチル基等が挙げられる。付加され得る修飾としては、ＤＮＡ修飾、標識物質（蛍光性物質等）による修飾、反応性官能基（カルボキシル基等）、ビオチンによる修飾、プライマー配列に対する相補鎖等が挙げられる。これらの配列や修飾の種類や長さは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列の立体構造に大きな影響を与えず、ＭＳＣに対する結合性を損なわない範囲で適宜設定できる。

【0031】

ＰＣＲで増幅するためのプライマー配列としては、合計１０～３０塩基程度の配列長が好ましく、例えば、配列番号１８や配列番号１９で示される２０塩基程度の配列を挙げることができる。

【0032】

スペーサー配列としては、核酸アプタマーの立体構造を維持しやすいという観点から、合計２～１０塩基程度の配列長が好ましい。

【0033】

ＤＮＡ修飾は、本発明のアプタマーの安定性を向上させる観点等から有効である。

【0034】

標識物質による修飾は、ｈＭＳＣの検出に利用しやすいという観点等から有効である。標識物質としては、例えば、蛍光性物質、放射性物質、反応性を有するタンパク質（酵素や抗体等）、ビオチン等が挙げられる。これらのうち、修飾や検出が容易である点で、蛍光性物質が好ましい。

【0035】

蛍光性物質としては、当該技術分野において通常使用される蛍光性物質を用いることができ、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシリーズ蛍光色素（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、ＤｙＬｉｇｈｔシリーズ蛍光色素（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、緑色蛍光タンパク質等が挙げられる。

【0036】

反応性官能基（カルボキシル基等）、ビオチンによる修飾は、本発明のアプタマーをｈＭＳＣの吸着剤へ応用する際に有効である。

【0037】

プライマー配列に対する相補鎖は、本発明のアプタマーがＰＣＲで増幅するためのプライマー配列を有する場合に、該プライマー配列に対応した配列として適宜設定される。相補鎖は、核酸アプタマーの立体構造を維持しやすいという観点から、合計１０～３０塩基程度の配列長が好ましい。

【0038】

本発明のアプタマーが（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含む場合、該塩基配列に含まれるプライマー配列に対する好ましい相補鎖としては、配列番号２１に示される塩基配列からなるものが挙げられる。

【0039】

本発明のアプタマーの３’末端及び／又は５’末端にプライマー配列や修飾を付加する場合、これらのプライマー配列や修飾は、例えば以下のように配置され得る。
（１）スペーサー配列が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列と、プライマー配列や修飾と、の間に配置される。
（２）プライマー配列に対する相補鎖が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列と、プライマー配列と、の間に配置される。

【0040】

本発明のアプタマーの長さは、ｈＭＳＣに対する結合性を有する限り特に限定されない。例えば、高い安定性を有する点や容易に製造可能である点から、好ましくは合計１５～１００塩基、より好ましくは合計２０～５０塩基の配列長である。

【0041】

＜本発明のアプタマーの製造方法＞
本発明のアプタマーは、当該技術分野において核酸合成方法として知られる公知の方法によって製造できる。

【0042】

＜本発明のアプタマーの特性＞
本発明のアプタマーは、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）への特異的な結合性を有する。

【0043】

本発明において、「ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）」としては、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等のｈＭＳＣ陽性マーカータンパク質を発現していれば、その由来は特に限定されない。例えば、骨髄由来ＭＳＣ、脂肪組織由来ｈＭＳＣ、歯髄由来ｈＭＳＣ、臍帯血由来ｈＭＳＣ、羊膜由来ｈＭＳＣ等が挙げられる。

【0044】

本発明において、「ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）への特異的な結合性を有する」とは、ｈＭＳＣへの結合性と比較して、ｈＭＳＣ以外の細胞への結合性が低いか、又は結合性が認められないことを意味する。ｈＭＳＣ及びｈＭＳＣ以外の結合性は、実施例に示した結合能の評価方法等で特定できる。
なお、ｈＭＳＣ以外の細胞としては、上記のｈＭＳＣ陽性マーカータンパク質を発現していない細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部類上皮がん）、ＨＬ６０細胞（ヒト急性前骨髄性白血病由来細胞株）、Ｒａｍｏｓ細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞））が挙げられる。

【0045】

＜ヒト間葉系幹細胞吸着剤＞
本発明のアプタマーは、ｈＭＳＣに対するその特異的な結合性を利用し、ヒト間葉系幹細胞吸着剤として好ましく利用できる。

【0046】

本発明のヒト間葉系幹細胞吸着剤（以下、「本発明の吸着剤」ともいう。）は、本発明のアプタマーを含む。本発明の吸着剤は、ヒト間葉系幹細胞に対する高い結合能を有する。

【0047】

本発明の吸着剤は、ヒト間葉系幹細胞の単離が容易になるという観点から、好ましくは、本発明のアプタマーと、該アプタマーが固定化された不溶性担体と、を含む。

【0048】

不溶性担体としては、本発明のアプタマーを保持できる不溶性物質であれば特に限定されないが、以下が挙げられる。
アガロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、及びプルラン等の多糖類を原料とした多糖系担体、並びに、これらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体；
ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、及びポリスチレン等の合成高分子系担体、並びに、これらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体。
上記のうち、親水性が高く、ｈＭＳＣ以外の細胞や生体分子（タンパク質等）との非特異的な吸着を低減しやすいという点で、アガロース、セルロース、デキストラン、及びプルラン等の電荷を有さない多糖系担体、並びに、これらの架橋多糖系担体や、ポリメタクリレート、及びポリビニルアルコール等の親水性合成高分子系担体、並びに、これらの架橋親水性合成高分子系担体が好ましい。

【0049】

不溶性担体は、多孔性又は無孔性のいずれであってもよい。

【0050】

不溶性担体の形状に特に制限はなく、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状等のいずれであってもよい。上記のうち、吸着剤への細胞吸着を効率的に行いやすいという点から、粒子状の担体が好ましく、真球状の粒子状担体がより好ましい。

【0051】

不溶性担体は、本発明のアプタマーを担体に固定化するための修飾が容易に行えるという点で、水酸基を有する粒子状担体であることが好ましい。このような粒子状担体としては、ポリ（メタ）アクリレートを原料とした「トヨパール」（東ソー製）や、アガロースを原料とした「Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」（ＧＥヘルスケア製）、セルロースを原料とした「セルフィア」（旭化成製）等の市販品を使用することもできる。

【0052】

不溶性担体の粒径は、ｈＭＳＣが吸着剤の表面と十分接触でき、且つ、吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を目詰まりさせずに通過しやすいという点で、好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上３００μｍ以下である。粒径が１００μｍ未満の場合には吸着剤に結合しない細胞による目詰まりが発生しやすく、ｈＭＳＣの分離が不十分となる可能性がある。粒径が５００μｍ超の場合には、吸着剤とｈＭＳＣとの接触が不十分となりやすく、ｈＭＳＣの吸着剤への結合量が低下する可能性がある。

【0053】

不溶性担体の粒径は、例えば、ベックマンコールター（株）製の精密粒度分布測定装置等を用いて測定することができる。

【0054】

本発明のアプタマーを不溶性担体に固定化する方法は、不溶性担体の種類等に応じて、核酸を固定できる任意の方法を採用できる。例えば、共有結合を形成せずに固定化する方法、共有結合を形成させて固定化する方法等が挙げられる。

【0055】

共有結合を形成せずに固定化する方法は、通常、アフィニティー結合（アビジン－ビオチンのアフィニティー結合等）や配位結合等を利用する。

【0056】

例えば、アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法は以下のように実施できる。当該技術分野において一般的な方法により３’及び／又は５’末端にビオチンを導入した本発明のアプタマーを、アビジン固定化担体に固定化する方法が、アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法として挙げられる。

【0057】

アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法で用いるアビジン固定化担体としては、担体に導入した、アミノ基との反応性を有する官能基（ホルミル基や活性エステル基等）と、アビジン中に存在するリジン残基の側鎖アミノ基とを反応させる方法等の、担体へのタンパク質固定化方法として一般的に使用される方法によりアビジンを固定化した担体を用いることができる。また、「ストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス」（ＧＥヘルスケア製）等の市販品も用いることができる。

【0058】

アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法で用いるアビジンとしては、ストレプトアビジン、アビジン様組換えタンパク質（「Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２」（富士フイルム、和光純薬等）等）を用いることができる。

【0059】

アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法における、担体へのホルミル基の導入法としては、例えば、水酸基を有する担体を、エピクロロヒドリンやエチレングリコールジグリシジルエーテル等でエポキシ化したのち、アミノ基を有する糖類（Ｄ－グルコサミンやＤ－グルカミン等）を反応させ、隣接する水酸基を担体に導入し、次いで、過ヨウ素酸ナトリウムを作用させる方法が挙げられる。

【0060】

アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法における、担体への活性エステル基の導入法としては、例えば、水酸基を有する担体と、ハロ酢酸（モノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸等）とを反応させたのち、縮合剤存在下でＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させる方法が挙げられる。

【0061】

共有結合を形成させて固定化する方法は、通常、本発明のアプタマーに導入した固定化用官能基と、反応性官能基を導入した担体との反応等を利用する。

【0062】

共有結合を形成させて固定化する方法としては、例えば、当該技術分野において一般的な方法により３’末端及び／又は５’末端にアミノ基を導入した本発明のアプタマーを、アミノ基との反応性を有する反応性官能基（ホルミル基、カルボキシル基、活性エステル基、エポキシ基等）を導入した担体と反応させて固定化する方法が挙げられる。

【0063】

＜本発明の吸着剤を用いたヒト間葉系幹細胞の分離方法＞
本発明の吸着剤を用いることで、任意の細胞混合物から、該細胞混合物中のｈＭＳＣを、ｈＭＳＣ以外の細胞から選択的に分離することができる。

【0064】

例えば、本発明の吸着剤と、ｈＭＳＣ及びｈＭＳＣ以外の細胞を含む細胞混合液とを接触させた後、細胞は通過するが吸着剤は通過しない大きさの目開きを有するフィルター等を利用して吸着剤に結合しなかった細胞を除去することにより、ｈＭＳＣを吸着剤に結合した形で分離することができる。吸着剤に結合したｈＭＳＣは、例えば、核酸分解酵素を作用させて本発明のアプタマーを分解することにより、回収することができる。

【0065】

本発明の吸着剤と、細胞混合液との接触方法は特に制限されず、細胞混合物中に吸着剤を添加し、一定時間振盪する方法や、吸着剤をカラムに充填して細胞混合物と接触させる方法等が挙げられる。

【0066】

＜ヒト間葉系幹細胞の検出方法＞
本発明のアプタマーは、ｈＭＳＣに対する特異的な結合性を利用し、ヒト間葉系幹細胞の検出方法において好ましく利用できる。

【0067】

本発明のヒト間葉系幹細胞の検出方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう。）は、本発明のアプタマーと、ヒト間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む。接触させる条件（本発明のアプタマーやｈＭＳＣの量、温度、時間）等は特に限定されず、ｈＭＳＣ表面に本発明のアプタマーが十分に接触できる条件であればよく、例えば、接触時の温度については２０℃から３０℃、接触時間については１０分から３時間を挙げることができる。

【0068】

例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端に、標識物質（蛍光性物質等）による修飾を有する本発明のアプタマーを利用し、以下のように本発明の検出方法を実施できる。
（１）任意のｈＭＳＣ（組織培養用シャーレ等で培養したｈＭＳＣ、生体から採取した組織や骨髄液中に含まれるｈＭＳＣ等）と、本発明のアプタマーと、を接触させることにより、該アプタマーをｈＭＳＣに結合させる。
（２）接触後、蛍光顕微鏡で観察することにより、ｈＭＳＣを検出する。

【実施例】

【0069】

以下に、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0070】

＜試験１：Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法によるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの探索＞
ランダムＤＮＡライブラリー（配列番号１７、配列長：７２ｍｅｒ、ユーロフィンジェノミクス製）を用い、「Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法」（Ｇｕｏ，Ｋ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．９：６６８－６７８，２００８等を参照。）によりｈＭＳＣ結合性アプタマーの探索を行った。このライブラリーは、３０塩基からなるランダム領域と、その３’末端及び５’末端にリンカーを介して１８塩基からなるプライマー領域と、を含む。

【0071】

表２に、以下の試験で用いた、（１）ランダムＤＮＡライブラリー（配列番号１７）、（２）ＰＣＲ増幅に用いたフォワードプライマー（配列番号１８）、及びリバースプライマー（配列番号１９）、並びに、（３）ブロック配列（配列番号２０及び２１）の塩基配列を示す。ランダムＤＮＡライブラリー及びフォワードプライマーは蛍光検出を可能とするため５’末端側をＦＩＴＣ修飾したものを用いた。リバースプライマーは一本鎖ＤＮＡ分子の分離を可能にするため５’末端側をビオチン修飾したものを用いた。

【0072】

なお、表２のランダムＤＮＡライブラリーにおいて、「Ｎ_３０」は３０塩基からなるランダム領域を意味し、「ｔｔｔ」は３塩基のチミンからなるリンカー配列を示す。

【0073】

【表2】

【0074】

以下の試験で用いた各緩衝液の組成を表３に示す。なお、各緩衝液において、溶媒として高純水製造システム（「Ｅｌｉｘ ＵＶ」、メルクミリポア製）で製造した高純水をオートクレーブ滅菌した滅菌水を用いた。

【0075】

【表3】

【0076】

（ＤＮＡライブラリープール試料の調製）
Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法に使用するランダムＤＮＡライブラリープール試料は、ランダムＤＮＡライブラリーを最終濃度が５μＭとなるように緩衝液Ａに溶解し、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却し、最終濃度が１μＭとなるように緩衝液Ａで希釈することにより調製した。

【0077】

（ｈＭＳＣ試料の準備）
Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法に使用するｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）は、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。

【0078】

（ｈＭＳＣ試料の培養）
ｈＭＳＣ試料の培養及び培養物の処理を以下の方法で行った。

【0079】

［使用培地］
１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製、以下の試験においても同様。）、Ｌ－グルタミン水溶液（富士フイルム和光純薬製、以下の試験においても同様。）及びペニシリン－ストレプトマイシン水溶液（富士フイルム和光純薬製、以下の試験においても同様。）を含むＤ－ＭＥＭ（低グルコース、シグマアルドリッチ製）を用いた。

【0080】

［培養条件］
直径１０ｃｍの組織培養用シャーレ（コーニング製）にｈＭＳＣを播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養を行った。

【0081】

［培養物の処理］
培養後、以下の操作を順に行い、ｈＭＳＣに結合性を有する一本鎖ＤＮＡ分子（以下、「ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子」ともいう。）を調製した。
（１）培養後、シャーレから培地を除去したのち、緩衝液Ｂを用いて、培養物を２回洗浄した。
（２）洗浄後のシャーレに、ランダムＤＮＡライブラリープール試料１ｍＬを添加し、室温で１時間放置してｈＭＳＣとランダムＤＮＡライブラリーとを接触させた。次いで、緩衝液Ｂを用いて３回洗浄し、ｈＭＳＣに結合しなかったランダムＤＮＡライブラリーを除去した。
（３）ＤＮＡ分解酵素を含まない水（０．５ｍＬ）をシャーレに添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離して遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで３分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。
（４）遠心分離容器に緩衝液Ｃ（０．１２ｍＬ）を添加してｈＭＳＣを含む沈殿物を懸濁し、９５℃で１０分間加熱処理してｈＭＳＣに結合したＤＮＡ分子を遊離させたのち、１３１００ｇで５分間遠心分離処理を行い、ｈＭＳＣに結合性を有するＤＮＡ分子を含む上清を回収した。
（５）回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却して一本鎖に調製した。

【0082】

（ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のスクリーニング）
上記で回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を、定量ＰＣＲにより増幅することで、該ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の回収量を算出した。

【0083】

［定量ＰＣＲの条件］
定量ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ製）を用い、プライマーとして表２に記載のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いた。定量ＰＣＲの条件は用いた試薬や装置に基づき適切に設定した。

【0084】

（ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の定量－１（１～９ラウンド））
上記「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した１連の操作を「１ラウンド」として繰り返し、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法によるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のスクリーニングを、合計９ラウンド行った。

【0085】

なお、４ラウンド目はカウンターセレクションとして、ｈＭＳＣの代わりにＪＣＲＢ細胞バンクより入手したＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ９００４：ヒト子宮頸部類上皮がん細胞）を使用し、ＨｅＬａ細胞に結合しないＤＮＡ分子を回収した。４ラウンド目におけるカウンターセレクションは以下の方法で行った。
（１）ＨｅＬａ細胞の培養は、直径１０ｃｍの組織培養用シャーレ（コーニング製）を用いて、培地として１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン溶液及びペニシリン－ストレプトマイシン溶液を含むＤ－ＭＥＭ（シグマアルドリッチ製）を用い、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で行った。
（２）ＨｅＬａ細胞をコンフルエントになるまで培養し、シャーレから培地を除去したのち、緩衝液Ｂを用いて２回洗浄した。
（３）洗浄後のシャーレに、３ラウンド目に回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子溶液１ｍＬを添加し、室温で１時間放置してＨｅＬａ細胞とｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子とを接触させたのち、緩衝液Ｂを用いて３回洗浄し、ＨｅＬａ細胞に結合しないｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を回収した。

【0086】

（ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の定量－２（１０～１３ラウンド））
９ラウンド目で回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子について、下記のカウンターセレクション及びポジティブセレクションを併用した方法により、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法によるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のスクリーニングを行った。

【0087】

［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のカウンターセレクション］
カウンターセレクションは、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手したＨＬ６０細胞（ＪＣＲＢ００８５：ヒト急性前骨髄性白血病由来細胞）を用いて、以下の方法で行った。
（２）ＨＬ６０細胞の培養は、培地として１０％ＦＢＳとペニシリン－ストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にＨＬ６０細胞を播種し、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で行った。培養終了後、ＨＬ６０細胞を遠心分離容器に添加したのち、遠心分離処理により細胞を回収し、緩衝液Ｂを用いて２回洗浄した。
（３）洗浄後、９ラウンド目で回収した一本鎖調製後のｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を添加し、室温で１時間放置して、ＨＬ６０細胞と、ランダムＤＮＡライブラリーとを接触させたのち、４℃において１５０ｇで３分間、遠心分離処理を行い、ＨＬ６０細胞に結合しないｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を含む上清を回収した。

【0088】

［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のポジティブセレクション］
ポジティブセレクションは、ｈＭＳＣを用いて、以下の方法で行った。
（１）上記「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、直径１０ｃｍの組織培養用シャーレでｈＭＳＣを培養後、緩衝液Ｂを用いて２回洗浄した。
（２）洗浄後のシャーレに、９ラウンド目で回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を含む上清を添加し、室温で１時間放置して、ｈＭＳＣと、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子とを接触させたのち、緩衝液Ｂを用いて３回洗浄し、ｈＭＳＣに結合しないｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を除去した。
（３）ＤＮＡ分解酵素を含まない水０．５ｍＬをシャーレに添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離して遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで３分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。
（４）遠心分離容器に緩衝液Ｃ（０．１２ｍＬ）を添加してｈＭＳＣを含む沈殿物を懸濁し、９５℃で１０分間加熱処理してｈＭＳＣに結合したＤＮＡ分子を遊離させたのち、１３１００ｇで５分間遠心分離処理を行い、ｈＭＳＣに結合性を有するＤＮＡ分子を含む上清を回収した。
（５）回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子は、上記［定量ＰＣＲの条件］の項と同様の条件で定量ＰＣＲを用いた増幅を行ったのち、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の回収量を算出するとともに、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却した。

【0089】

上記［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のカウンターセレクション］及び［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のポジティブセレクション］に示した一連の操作を「１ラウンド」として繰り返し、合計４ラウンド（１０～１３ラウンド）行った。

【0090】

表４に、各ラウンド（全１３ラウンド）で使用したランダムＤＮＡライブラリー量、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の回収量及び回収率を示す。

【0091】

【表4】

【0092】

＜試験２：ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの配列解析＞
上記試験１のスクリーニングで得られたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の配列解析を以下の方法で行った。
（１）ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を、「Ｅｘ ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ」（タカラバイオ製）を用いてＰＣＲにより増幅し、「ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（日本ジェネティクス製）により精製した。
（２）精製したＰＣＲ増幅産物を、「ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター」（プロメガ製）にＴＡクローニングし、得られたサブクローニングベクターにより、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
（３）形質転換された大腸菌ＤＨ５αを培養し、生育したコロニーについて「ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（ＧＥヘルスケア製）を用いて、配列解析用の鋳型を調製し、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の塩基配列を決定した。
（４）塩基配列を決定したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の中で、重複配列が観察された８種の塩基配列をｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー候補配列として特定した。これらの候補配列を表５（配列番号１～８）に示す。

【0093】

なお、表５において、「Ｇ４」に丸印が付された候補配列は、該配列がＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造（Ｇ４構造）を形成可能であることを示す。Ｇ４構造は一つの配列に対して複数の立体構造を形成可能であり、その中で特定の構造が標的分子に対して強い結合を示す可能性が示唆されている。

【0094】

【表5】

【0095】

＜試験例３：フローサイトメトリーによるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの結合能評価＞
表５に示した各候補配列（配列番号１～８のいずれかの塩基配列）について、プライマー配列等を付加することでアプタマー（以下、「ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー」ともいう。）を調製し、以下の方法により、ｈＭＳＣに対する結合能をフローサイトメトリーにより評価した。

【0096】

（フローサイトメトリーに用いたアプタマー試料）
図１に、フローサイトメトリーによる評価に使用したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの構成を示す。より詳細には、このアプタマーは、以下の関係を満たすように「アプタマー候補配列」、「ＴＴＴ」、「プライマー配列」、「相補鎖」、「ＦＩＴＣ（フルオレセイン修飾）」を含む。
「アプタマー候補配列」は、各候補配列（配列番号１～８のいずれかの塩基配列）に相当する。
この「アプタマー候補配列」の３’末端側には、３塩基のチミンからなるリンカー配列「ＴＴＴ」を介して、１８塩基からなる「プライマー配列」が付加されている。「アプタマー候補配列」、「ＴＴＴ」、及び「プライマー配列」の塩基配列を表６に示す。
上記プライマー配列に対する「相補鎖」（配列番号２１）を介して、この分子はフルオレセイン修飾（「ＦＩＴＣ」）されている。
以下、フローサイトメトリーによる評価に使用した、図１の構成を有する上記ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、「フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー」ともいう。

【0097】

【表6】

【0098】

（フローサイトメトリーの方法）
試験１の「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、ｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３）をコンフルエントになるまで培養後、Ｄ－ＰＢＳ（－）１ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離してｈＭＳＣ懸濁液を調製した。
調製したｈＭＳＣ懸濁液を１．５ｍＬ容の遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで４分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。遠心分離容器内のｈＭＳＣを再度Ｄ－ＰＢＳ（－）で懸濁し、懸濁液中のｈＭＳＣ数を測定して細胞数が１．５×１０^６個となるように調製した。
得られた細胞懸濁液に、濃度を５００ｎＭに調整したフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液（詳細を後述する。）を添加し、室温で１時間放置して、ｈＭＳＣとフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーとを接触させた。
室温で１時間放置後、Ｄ－ＰＢＳ（－）を用いてｈＭＳＣを３回洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ ＡＣＣＵＲＩ Ｃ６ ＰＬＵＳ、ＢＤバイオサイエンス製）を用いてフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのｈＭＳＣへの結合性を評価した。
また、ｈＭＳＣの代わりにＨＬ６０細胞（ＪＣＲＢ００８５）を用いた以外は前記と同様の方法を行うことにより、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのＨＬ６０細胞への結合性を評価した。

【0099】

（フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液の調製）
上記のフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液（濃度：５００ｎＭ）は、以下のように調製した。
フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを緩衝液Ｄに溶解し、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却した。冷却後の溶液を緩衝液Ａで希釈して、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー濃度を５００ｎＭに調製した。

【0100】

（フローサイトメトリーの結果）
フローサイトメトリーによる評価結果を図２及び図３に示す。

【0101】

図２及び図３において、「ＤＮＡ」と示した実線グラフは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いた結果を示す。「抗体」と示した実線グラフは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いる代わりに、該アプタマーの陽性対照である、ＭＳＣ陽性マーカータンパク質であるＣＤ１０５に対する抗体（フルオレセイン標識抗ＣＤ１０５抗体：サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いた結果を示す。

【0102】

図２及び図３において、破線グラフは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー又はフルオレセイン標識抗ＣＤ１０５抗体を用いる代わりに、これらの陰性対照である２次抗体（フルオレセイン標識抗マウスＩｇＧ抗体）を用いた結果を示す。

【0103】

図２に、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、ｈＭＳＣと接触させた後のフローサイトメトリーによる評価結果を示す。図２に示すように、「ＤＮＡ」と示した実線グラフは、いずれも、陰性対照である破線グラフよりもピークが右にずれており、評価した８種類全てのフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーが、ｈＭＳＣに結合性を有することが明らかとなった。

【0104】

図３に、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、ＨＬ６０細胞と接触させた後のフローサイトメトリーによる評価結果を示す。図３に示すように、「ＤＮＡ」と示した実線グラフは、いずれも、陰性対照である破線グラフとピークの位置がほぼ変わらず、評価した８種類全てのフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーがＨＬ６０細胞に結合しないことが明らかとなった。

【0105】

＜試験例４：ドットブロットによるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの結合能評価＞
表５に示した各候補配列（配列番号１～８のいずれかの塩基配列）について、以下の方法により、ｈＭＳＣに対する結合能をドットブロットにより評価した。

【0106】

（ドットブロットに用いたアプタマー試料）
フローサイトメトリーによる評価に使用したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを含む塩基配列の構成は、図１及び上記「（フローサイトメトリーに用いたアプタマー試料）」の項で説明したものと同様である。

【0107】

（ドットブロットの方法）
試験１の「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、ｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３）をコンフルエントになるまで培養後、Ｄ－ＰＢＳ（－）１ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離してｈＭＳＣ懸濁液を調製した。
調製したｈＭＳＣ懸濁液を１．５ｍＬ容の遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで４分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。遠心分離容器内のｈＭＳＣを再度Ｄ－ＰＢＳ（－）で懸濁し、懸濁液中のｈＭＳＣ数を測定したのち、細胞数が１．５×１０^４個となるようニトロセルロース膜上にｈＭＳＣを固定した。
ｈＭＳＣを固定したニトロセルロース膜を緩衝液Ｅ中で室温において１時間振盪してブロッキングしたのち、再度緩衝液Ｅで洗浄した。
次に、ｈＭＳＣを固定したニトロセルロース膜を、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液（濃度：４００ｎＭ）とともに室温で１時間振盪して、ｈＭＳＣとフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーとを接触させたのち、緩衝液Ｅを用いて３回洗浄した。なお、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液の調製方法は、試験例３の「（フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液の調製）」の項と同様である。
洗浄後のニトロセルロース膜を、画像解析装置（Ｔｙｐｈｏｏｎ８６００、ＧＥヘルスケアライフサイエンス製）を用いて、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのｈＭＳＣへの結合性を評価した。

【0108】

また、ｈＭＳＣの代わりにＨＬ６０細胞（ＪＣＲＢ００８５）を用いた以外は前記と同様の方法を行うことにより、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのＨＬ６０細胞への結合性を評価した。

【0109】

ドットブロットによる評価結果を図４に示す。ニトロセルロース膜上に明確なブロットが認められることは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーと、細胞（ｈＭＳＣ又はＨＬ６０細胞）との結合性が高いことを意味する。
図４に示されるとおり、評価した８種類全てのフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーがｈＭＳＣに選択的に結合性を有することが明らかとなった。

【0110】

＜試験例５：ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを不溶性担体に固定化した吸着剤の製造＞
本発明のアプタマーは、ＭＳＣの特異的な吸着剤や回収剤として有用であり得る。そこで、上記試験例３及び４において、ｈＭＳＣに結合能を持つことが確認されたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いて、これを不溶性担体に固定化した吸着剤を調製した。

【0111】

（吸着剤の製造に用いたアプタマー試料）
ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーとしては、図１及び上記試験例３の「（フローサイトメトリーに用いたアプタマー試料）」の項で説明したものと同様の構成を有する試料を用いた。ただし、アプタマー候補配列、ＴＴＴ、及びプライマー配列の塩基配列が、配列番号１１又は配列番号１３の塩基配列であるものを用いた。また、「ＦＩＴＣ（フルオレセイン修飾）」の代わりにビオチン修飾を用いた。
以下、吸着剤の製造に使用した上記ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、「ビオチン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー」ともいう。

【0112】

（吸着剤の製造に用いた不溶性担体）
不溶性担体として、水に懸濁した「トヨパールＨＷ－４０ＥＣ」（東ソー製、１００－３００μｍ）を、目開きが１５０μｍのステンレス製標準ふるい（東京スクリーン製）と２５０μｍのステンレス製標準ふるい（東京スクリーン製）を用いて分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。
なお、本明細書の実施例において、特段の説明がない限り、不溶性担体を「重量」で記載した場合は、水に懸濁した不溶性担体をグラスフィルターでろ過したのちに秤量した含水重量を意味する。不溶性担体を「容積」で記載した場合は、水に懸濁した不溶性担体を目盛付き容器に添加し、１２時間以上放置したときの沈降容積を目視により測定した値を意味する。

【0113】

（吸着剤の製造方法）
上記のアプタマー試料及び不溶性担体を用いて、以下の方法により、吸着剤を製造した。
（１）１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に、２．５ｇのトヨパールＨＷ－４０ＥＣ、３．７５ｍＬの水、０．５ｇの１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（東京化成製）を添加したのち、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で３０分間振盪した。
（２）振盪後、反応容器に４７μＬの４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で８時間振盪することにより担体にエポキシ基を導入した。
（３）反応終了後、担体を、グラスフィルター上で、ろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、担体全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加した。
（４）反応容器に５．０ｍＬの０．５Ｍ Ｄ－グルカミン水溶液（東京化成製のＤ－グルカミンから調製）を添加したのち、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で３時間振盪することにより担体に隣接する水酸基を導入した。
（５）反応終了後、担体を、グラスフィルター上で、ろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、担体全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加した。
（６）反応容器に５．０ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（濃度：５．０ｍｇ／ｍＬ、関東化学製の過ヨウ素酸ナトリウムから調製）を添加したのち、振盪機内で３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより担体のホルミル化を行った。
（７）反応終了後、担体をグラスフィルター上で水、Ｄ－ＰＢＳ（－）で順次洗浄したのち、ホルミル化担体全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加した。
（８）ホルミル化担体を添加した反応容器に、３．０ｍＬの緩衝液Ｆと、１．５ｍＬのＴａｍａｖｉｄｉｎ２（富士フイルム和光純薬製、アビジン様組換えタンパク質）のＤ－ＰＢＳ（－）溶液（濃度１．０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、振盪機内で３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪した。次いで、１５０μＬの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（濃度４．０ｍｇ／ｍＬ、関東化学製の水素化ホウ素ナトリウムから調製）を添加し、さらに３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより還元アミノ化による担体へのアビジン様組換えタンパク質の固定化を行った。
（９）反応終了後、反応液全量を１５ｍＬ容の容器に移し、Ｄ－ＰＢＳ（－）で繰り返し洗浄することにより、目的のＴａｍａｖｉｄｉｎ２固定化担体を得た。
（１０）Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用い、反応に使用したＴａｍａｖｉｄｉｎ２量から洗浄液中の未反応のＴａｍａｖｉｄｉｎ２量を差し引くことで各担体へのＴａｍａｖｉｄｉｎ２の固定化量を測定した結果、固定化量は０．４５ｍｇ／ｍＬ－吸着剤であった。
（１１）得られたＴａｍａｖｉｄｉｎ２固定化担体５００ｍｇと、ビオチン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのＤ－ＰＢＳ（－）溶液５００μＬ（濃度：２００ｎＭ）とを５ｍＬ容の容器に添加した。
（１２）容器を振盪機内で３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２固定化担体へのビオチン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの固定化を行った。
（１３）固定化終了後の担体を、遠心分離処理によりＤ－ＰＢＳ（－）で繰り返し洗浄することにより、目的のｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー固定化担体を製造した。
なお、以下、配列番号１１の塩基配列を含むｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー固定化担体を「ｈＭＳＣ吸着剤Ａ」ともいう。配列番号１３の塩基配列を含むｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー固定化担体を「ｈＭＳＣ吸着剤Ｂ」ともいう。

【0114】

＜試験例６：ｈＭＳＣ吸着剤の評価－１＞
以下の方法により、試験例５で製造した２種類のｈＭＳＣ吸着剤について、ｈＭＳＣへの結合能（吸着能）を評価した。

【0115】

（１）試験１の「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、ｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）をコンフルエントになるまで培養後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（シグマアルドリッチ製）で処理することによりｈＭＳＣをシャーレから剥離し、培地で懸濁した。
（２）培地で懸濁したｈＭＳＣを容器に添加したのち、遠心分離処理により細胞を回収し、緩衝液Ｇで再懸濁したのち、３５μｍのセルストレーナー（コーニング製）で処理することによりシングルセル化した。シングルセル化した細胞の密度をコールターカウンターＺ２型（ベックマンコールター製）で測定し、評価用のｈＭＳＣ懸濁液を調製した。
（３）２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）との間に目開き１００μｍのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。
（４）ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｇで懸濁することにより、５０％（ｖ／ｖ）懸濁液を調製し、上記（３）で作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、各吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（５）吸着剤を充填したカラムに、上記（２）で調製したｈＭＳＣ懸濁液（５．０×１０^５個／５０μＬ）を添加したのち、カラムに１．０ｍＬの緩衝液Ｇを添加して吸着剤を洗浄し、コールターカウンターを用いて回収した洗浄液中の細胞密度を測定することにより、ｈＭＳＣの回収率を測定した。

【0116】

ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢによる、ｈＭＳＣの回収率を表７の「試験例６」の項に示す。以下、「細胞回収率」の値が低いほど、吸着剤のｈＭＳＣへの結合能（吸着能）が高いことを示す。表７の結果から、ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢはいずれもｈＭＳＣへの結合能が高いことがわかった。

【0117】

＜試験例７：ｈＭＳＣ吸着剤の評価－２＞
試験例６では、ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢはいずれもｈＭＳＣへの結合能が示された。この結合能がｈＭＳＣに特異的であるかを評価するために、ｈＭＳＣの代わりに、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手したＲａｍｏｓ細胞（ＪＣＲＢ９１１９：ヒトバーキットリンパ腫細胞）を用いて、以下の方法により、ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢによる結合能を評価した。

【0118】

（１）培地として１０％ＦＢＳとペニシリン－ストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ １６４０培地を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）に細胞を播種し、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃でＲａｍｏｓ細胞の培養を行った。
（２）培養終了後、遠心分離処理により細胞を回収し、試験例６の「（２）」で示した方法と同様に、緩衝液Ｆで再懸濁してシングルセル化した。シングルセル化した細胞の密度をコールターカウンターＺ２型で測定し、評価用のＲａｍｏｓ細胞懸濁液を調製した。
（３）試験例６の「（３）」及び「（４）」で示した方法と同様にカラムの作製及び吸着剤の充填を行った（吸着剤容量：５００μＬ）。
（４）吸着剤を充填したカラムに、上記（２）で調製したＲａｍｏｓ細胞懸濁液（４．９×１０^５個／５０μＬ）を添加したのち、カラムに１．０ｍＬの緩衝液Ｇを添加して吸着剤を洗浄し、コールターカウンターを用いて回収した洗浄液中の細胞密度を測定することにより、Ｒａｍｏｓ細胞の回収率を測定した。

【0119】

ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢによる、Ｒａｍｏｓ細胞の回収率を表７の「試験例７」の項に示す。表７に示されるとおり、いずれの結果も細胞回収率の値が高く、ｈＲａｍｏｓ細胞は吸着剤Ａ及びＢに吸着しないことがわかった。

【0120】

＜試験例８：ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを固定化していない不溶性担体の評価＞
ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢの代わりに、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを固定化していない不溶性担体（トヨパールＨＷ－４０ＥＣ（１５０－２５０μｍ））を用いた以外は、試験例６及び７と同様の方法で、ｈＭＳＣとＲａｍｏｓ細胞の回収率を測定した。

【0121】

上記不溶性担体による、ｈＭＳＣ及びＲａｍｏｓ細胞の回収率を表７の「試験例８」の項に示す。表７に示されるとおり、いずれの結果も細胞回収率の値が高く、ｈＭＳＣ及びＲａｍｏｓ細胞のいずれも上記不溶性担体に吸着しないことがわかった。

【0122】

【表7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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