特許 7446956 ＤＮＡの検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-01

(45)【発行日】2024-03-11

(54)【発明の名称】ＤＮＡの検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6888 20180101AFI20240304BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALI20240304BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20240304BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240304BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240304BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6888 Z

C12Q1/6895 Z

C12Q1/6813 Z

G01N33/53 M

C12N15/11 Z ZNA

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020147576

(22)【出願日】2020-09-02

(65)【公開番号】P2022042243

(43)【公開日】2022-03-14

【審査請求日】2023-02-15

(73)【特許権者】

【識別番号】000226998

【氏名又は名称】株式会社日清製粉グループ本社

(73)【特許権者】

【識別番号】000103840

【氏名又は名称】オリエンタル酵母工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】石丸 千晶

(72)【発明者】

【氏名】向後 佑佳子

(72)【発明者】

【氏名】野間 聡

(72)【発明者】

【氏名】菊池 洋介

(72)【発明者】

【氏名】久保田 元

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】特開２００８－２６３８５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３５４０６７３（ＣＮ，Ａ）

【文献】Food Chemistry，2014年，Vol.145，pp.1086-1091

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験試料中の動物由来のＤＮＡを検出する方法であって、
被験試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
配列番号１で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号３で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号６で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の動物由来のＤＮＡを検出することを特徴とする、ＤＮＡの検出方法。

【請求項2】

前記プローブが、ＭＧＢプローブである、請求項１に記載のＤＮＡの検出方法。

【請求項3】

前記被験試料が、食品である、請求項１又は２に記載のＤＮＡの検出方法。

【請求項4】

配列番号６で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、動物由来ＤＮＡ検出用プローブ。

【請求項5】

ＭＧＢプローブである、請求項４に記載の動物由来ＤＮＡ検出用プローブ。

【請求項6】

配列番号１で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号３で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号６で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を備える、動物由来ＤＮＡ検出用キット。

【請求項7】

被験試料中の植物由来のＤＮＡを検出する方法であって、
被験試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号７で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の植物由来のＤＮＡを検出することを特徴とする、ＤＮＡの検出方法。

【請求項8】

前記プローブが、ＭＧＢプローブである、請求項７に記載のＤＮＡの検出方法。

【請求項9】

前記被験試料が、食品である、請求項７又は８に記載のＤＮＡの検出方法。

【請求項10】

配列番号７で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、植物由来ＤＮＡ検出用プローブ。

【請求項11】

ＭＧＢプローブである、請求項１０に記載の植物由来ＤＮＡ検出用プローブ。

【請求項12】

配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号７で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を備える、植物由来ＤＮＡ検出用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、食品等に含まれている動物由来のＤＮＡ又は植物由来のＤＮＡを検出する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

日本においては、国民の健康危害の発生を防止する観点から、食品に含まれているアレルギー物質（アレルゲン）の表示が義務化されている。また、その表示の妥当性を科学的に検証するための検査方法が通知されている（非特許文献１）。食品に含まれているアレルギー物質の検査は、当該食品に、アレルギー物質である特定の動植物種に由来する成分が含まれているかを調べるものである。アレルギー物質の検査方法は、定量検査法と定性検査法があり、定性検査法には、ウエスタンブロット法やＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が採用されている。例えば、食物アレルギーのアレルギー物質のうち、小麦、そば、えび、かに、落花生については、ＰＣＲ法が用いられている。

【0003】

ＰＣＲを用いる定性検査法では、食品から抽出されたＤＮＡを鋳型として、検査対象である特定の動植物種に由来するＤＮＡの特定の塩基配列領域を、特異的にＰＣＲ増幅することにより行う。得られた増幅産物は、通常、電気泳動法により分離した後に染色することによって検出されている。増幅産物が検出された場合には、鋳型としたＤＮＡ中に当該特定の動植物種に由来するＤＮＡが含まれていた、すなわち、当該食品中に当該特定の動植物種に由来するアレルギー物質が含まれていた、と評価される。

【0004】

ＰＣＲを用いる定性検査法においては、検査対象である動植物種に由来するＤＮＡをＰＣＲ増幅する前に、食品から抽出されたＤＮＡ試料が、ＰＣＲ増幅に必要な品質を備えていることを確認しておくことが好ましい。この確認は、ＰＣＲ増幅産物が検出されなかった場合に、鋳型としたＤＮＡ試料に目的の動植物由来のＤＮＡが検出限界値未満の量しか含まれていなかったためであるのか、使用したＤＮＡ試料自体に問題があったためなのか、についての判断に役立つ。

【0005】

食品から抽出されたＤＮＡ試料の品質確認は、一般的に、当該ＤＮＡ試料を鋳型として、広範囲の動植物種に由来するＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより行われる。検査対象である特定の動植物種のみならず、様々な動植物種に由来するＤＮＡが含まれていることは、食品からのＤＮＡ抽出が良好に行われたことの指標となる。具体的には、食品から抽出されたＤＮＡ試料を鋳型とし、動物由来のＤＮＡを増幅可能なプライマー又は植物由来のＤＮＡを増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲを行う。

【0006】

動物由来のＤＮＡを増幅可能なプライマーは、広範囲の動物種全般に共通し、他の生物種とは異なる遺伝子配列領域をＰＣＲ増幅するプライマーである。当該プライマーは、例えば、各種生物のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）上の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較検討し、多数の動物種に共通しているが他の生物種とは異なっている遺伝子配列領域を選出し、当該領域をＰＣＲ増幅するようにして設計できる（特許文献１）。

【0007】

植物由来のＤＮＡを増幅可能なプライマーは、広範囲の植物種全般に共通し、他の生物種とは異なる遺伝子配列領域をＰＣＲ増幅するプライマーである。当該プライマーは、例えば、植物の葉緑体ＤＮＡ上のｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ遺伝子間領域の塩基配列を比較検討し、多数の植物種に共通しているが他の生物種は有していない遺伝子配列領域を選出し、当該領域をＰＣＲ増幅するようにして設計できる（非特許文献２）。

【0008】

一方で、核酸増幅には、リアルタイムＰＣＲが広く用いられている。リアルタイムＰＣＲでは、エンドポイントでＰＣＲ増幅産物を確認する従来のＰＣＲ法に対して、ＰＣＲ産物を反応サイクルごとにモニターするため、増幅産物を定量的に測定することができ、また反応後のＤＮＡ増幅産物の検出操作が不要である。さらに、ＰＣＲ産物を蛍光シグナルで検出するため、検出感度が高いといった利点もある。

【0009】

リアルタイムＰＣＲには、主にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法とＴａｑＭａｎプローブ法がある。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法は、配列非特異的に２本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光分子であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの存在下でリアルタイムＰＣＲを行う方法である。当該方法は、プローブが不要である点で簡便であるが、非特異的な増幅産物も検出されてしまう。これに対して、ＴａｑＭａｎプローブ法は、特定の鋳型ＤＮＡに配列特異的に結合し、蛍光物質と消光物質が結合したプローブの存在下でリアルタイムＰＣＲを行う方法であり、目的の増幅産物を特異的に検出できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【文献】特許第４３５７５４１号公報

【非特許文献】

【0011】

【文献】消費者庁、「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」、平成２２年９月１０日消食表第２８６号。

【文献】Watanabe，et al.，Journal of Food Biochemistry, 2006, vol.30(6), p.215-233.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

従来のエンドポイントＰＣＲの増幅産物の確認を電気泳動法で行う場合、染色で得られた電気泳動パターンは目視により確認されるが、目視による評価では客観性に欠けるという問題がある。また、増幅産物の確認を従来の電気泳動法で行う場合、ＰＣＲ後に反応チューブの蓋を開けて泳動用サンプルを回収する必要があるが、反応チューブの開閉によりコンタミネーションが起こるリスクがある。

【0013】

動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡを増幅する増幅反応をリアルタイムＰＣＲで行うことにより、電気泳動による増幅産物の確認が不要となり、また、蛍光シグナルによる検出であるため、目視評価よりも客観性が高い。

【0014】

そこで、本発明は、動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡを、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲで増幅して検出する方法、及び当該方法で使用されるプローブを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

すなわち、本発明は、以下のＤＮＡの検出方法等を提供するものである。
［１］ 被験試料中の動物由来のＤＮＡを検出する方法であって、被験試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号１で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の動物由来のＤＮＡを検出することを特徴とする、ＤＮＡの検出方法。
［２］ 前記プローブが、ＭＧＢプローブである、前記［１］のＤＮＡの検出方法。
［３］ 前記被験試料が、食品である、前記［１］又は［２］のＤＮＡの検出方法。
［４］ 配列番号６で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、動物由来ＤＮＡ検出用プローブ。
［５］ ＭＧＢプローブである、前記［４］の動物由来ＤＮＡ検出用プローブ。
［６］ 配列番号１で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を備える、動物由来ＤＮＡ検出用キット。
［７］ 被験試料中の植物由来のＤＮＡを検出する方法であって、被験試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号７で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の植物由来のＤＮＡを検出することを特徴とする、ＤＮＡの検出方法。
［８］ 前記プローブが、ＭＧＢプローブである、前記［７］のＤＮＡの検出方法。
［９］ 前記被験試料が、食品である、前記［７］又は［８］のＤＮＡの検出方法。
［１０］ 配列番号７で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、植物由来ＤＮＡ検出用プローブ。
［１１］ ＭＧＢプローブである、前記［１０］の植物由来ＤＮＡ検出用プローブ。
［１２］ 配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号７で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を備える、植物由来ＤＮＡ検出用キット。

【発明の効果】

【0016】

本発明において用いられるプローブは、動物又は植物の遺伝子に広く共通する領域にハイブリダイズするものである。これらのプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより、被験試料中の動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡを増幅して検出することができる。このため、本発明は、食物アレルギーの原因となる畜肉、魚介類、穀類、野菜類などに由来するＤＮＡを検出する検査に特に好適に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A】各動物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（前半）のアラインメント図である。

【図1B】各動物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（後半）のアラインメント図である。

【図2】各植物のｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ遺伝子間領域の塩基配列のアラインメント図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明に係るＤＮＡの検出方法は、被験試料中の動物由来のＤＮＡ又は植物由来のＤＮＡを、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより増幅して検出する方法である。リアルタイムＰＣＲでは増幅産物をリアルタイムで検出するため、本発明においては、増幅反応後に電気泳動等による増幅産物を確認する必要がなく、作業時間を短縮できる上に、ＰＣＲ増幅産物のコンタミネーションのリスクを低減できる。

【0019】

＜プライマー及びプローブ＞
本発明に係るＤＮＡの検出方法において、被験試料中の動物由来のＤＮＡを検出するために用いられるプライマー及びプローブは、様々な動物の遺伝子中で広く保存されている領域とハイブリダイズするように設計されている。特に、食物アレルギーの原因となる畜肉、魚介類等に共通する領域を標的としているため、当該プライマー及びプローブを用いることにより、食品から抽出されたＤＮＡ中の畜肉、魚介類等に由来するＤＮＡを網羅的に増幅させることができる。

【0020】

本発明に係るＤＮＡの検出方法において、被験試料中の植物由来のＤＮＡを検出するために用いられるプライマー及びプローブは、様々な植物の遺伝子中で広く保存されている領域とハイブリダイズするように設計されている。特に、食物アレルギーの原因となる穀類、野菜類等に共通する領域を標的としているため、当該プライマー及びプローブを用いることにより、食品から抽出されたＤＮＡ中の穀類、野菜類等に由来するＤＮＡを網羅的に増幅させることができる。

【0021】

本発明に係るＤＮＡの検出方法において、動物由来のＤＮＡの増幅に使用されるプライマーとしては、表１に記載の動物検出用Ｆ１プライマー、動物検出用Ｆ２プライマー、及び動物検出用Ｒ１プライマーを用いる（特許文献１）。植物由来のＤＮＡの増幅に使用されるプライマーとしては、表１に記載の植物検出用Ｆ１プライマー及び植物検出用Ｒ１プライマーを用いる（非特許文献２）。これらの動物由来のＤＮＡの増幅に使用されるプライマーは、各種生物のｍｔＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較検討し、広く動物種全般に共通し、動物以外の生物種では異なっている遺伝子配列領域を選出して設計された。同様に、これらの植物由来のＤＮＡの増幅に使用されるプライマーは、各種生物の葉緑体ＤＮＡのｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ遺伝子間領域の塩基配列を比較検討し、広く植物種全般に共通し、植物以外の生物種は有していない遺伝子配列領域を選出して設計された。

【0022】

【表1】

【0023】

各プライマー及びプローブは、本発明の効果を阻害しない範囲において、各種の修飾がなされていてもよい。当該修飾としては、ＰＣＲに用いられるプライマー及びプローブに一般的になされる各種の修飾を適宜用いることができる。また、当該プライマー及びプローブは、プライマー又はプローブとしての機能が損なわれない限度において、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの５’側に、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドが付加されていてもよい。また、当該プローブは、蛍光物質等で修飾されていてもよい。当該蛍光物質は、リアルタイムＰＣＲにおける蛍光シグナルの検出を阻害しない蛍光波長であることが好ましい。

【0024】

本発明において用いられる動物検出用プローブは、様々な動物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の動物検出用Ｆ１プライマーと動物検出用Ｒ１プライマー、又は動物検出用Ｆ２プライマーと動物検出用Ｒ１プライマーで挟まれた領域の塩基配列の中から、広く動物種全般に共通し、動物以外の生物種では異なっている遺伝子配列領域と特異的にハイブリダイズするように設計されている。同様に、本発明において用いられる植物検出用プローブは、様々な植物のｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ遺伝子間領域の植物検出用Ｆ１プライマーと植物検出用Ｒ１プライマーで挟まれた領域の塩基配列の中から、広く植物種全般に共通して存在し、植物以外の生物種では存在しない遺伝子配列領域と特異的にハイブリダイズするように設計されている。各プローブの塩基配列を表２に示す。

【0025】

【表2】

【0026】

本発明において用いられる動物検出用プローブ及び植物検出用プローブは、使用するプライマーよりも塩基長が短く、融解温度（Ｔｍ）値が低い。そこで、表１に記載のプライマーと同程度のＴｍ値となるように、Ｔｍ値を高める各種の修飾がなされていることが好ましい。当該修飾としては、例えば、ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）が挙げられる。ＭＧＢは、ＤＮＡ２重螺旋構造の副溝（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ）に結合する構造をもつ分子である。本発明において用いられるプローブとしては、リアルタイムＰＣＲ用のプローブとして広く用いられているＭＧＢプローブであることが好ましい。

【0027】

本発明において用いられるプローブが有するＭＧＢとしては、例えば、１，２－ジヒドロ－（３Ｈ）－ピロロ［３，２－ｅ］インドール－７－カルボキサミド（ＣＤＰＩ３）のトリマー、Ｎ－メチルピロール－４－カルボキシ－２－アミド（ＭＰＣ５）のペンタマー等の、特許第４９４２４８４号公報等に記載のものを用いることができる。ＭＧＢは、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする、プローブ中のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端に直接又はリンカーを介して間接的に結合させてもよく、当該オリゴヌクレオチドの内部に結合していてもよい。本発明において用いられるプローブとしては、ＰＣＲにおいてＴａｑポリメラーゼによる５’－ヌクレアーゼ消化に対する影響が小さいことから、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする、プローブ中のオリゴヌクレオチドの３’末端に直接又はリンカーを介して間接的に結合させてあるものが好ましい。

【0028】

本発明において用いられるプローブは、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されている、いわゆるＴａｑＭａｎプローブである。鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする、プローブ中のオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端のいずれに蛍光物質が結合していてもよいが、５’末端に蛍光物質が結合しており、３’末端にＭＧＢ分子と消光物質が結合しているオリゴヌクレオチドや、５’末端にＭＧＢ分子と消光物質が結合しており、３’末端に蛍光物質が結合しているオリゴヌクレオチドが好ましい。

【0029】

本発明において用いられるプローブの修飾に用いられる蛍光物質及び消光物質としては、いずれも一般的なＴａｑＭａｎプローブに使用されるものの中から適宜選択して用いることができる。蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。また、消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）、ＲＯＸ（６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標） Ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＢＨＱ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＤＡＢＣＹＬ等が挙げられる。

【0030】

＜被験試料＞
本発明に係るＤＮＡの検出方法では、被験試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とする。当該被験試料としては、動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡが含まれているか否かを調べる必要があるものであれば特に限定されるものではない。本発明において用いられるプローブ及びプライマーは、特に、食物アレルギーの原因となる動物や植物に由来するＤＮＡを特異的に増幅可能であることから、当該被験試料は、ヒトを含む各種の動物が使用等する、アレルギー物質の有無が問題となるものであることが好ましく、特に食品が好ましい。当該食品としては、生若しくは加熱した食品原料、添加物、加工食品、調味料、飲料等が挙げられる。食品原料としては、牛肉、豚肉、鶏肉等の畜肉；さけ、さば、かれい、いわし、たこ、えび、いか、かに、いくら、あわび等の魚介類；米、小麦、そば等の穀類；じゃがいも等のいも類；大豆；落花生、カシューナッツ、くるみ、ごま等の種実類；にんじん、ほうれんそう、きゅうり、たまねぎ等の野菜類；オレンジ、キウイフルーツ、バナナ、もも、りんご等の果実類；まつたけ、マッシュルーム等のきのこ類；青のり等の海藻類；緑茶、コーヒー、ココア等の嗜好性飲料の原料；等が挙げられる。本発明はＰＣＲ法を用いるため、微量のＤＮＡが存在すれば検出可能であり、主原料の一部に混入した動物性又は植物性の原料等の検出にも使用可能である。

【0031】

ＰＣＲ法を用いた検査では、検査に供されるＤＮＡの品質は、検査結果の信頼性に大きく影響する。例えば、食品から抽出されたＤＮＡがひどく損傷していた場合には、当該食品中にアレルゲンとなる特定の動植物の細胞や組織等が含まれていた場合でも、当該特定の動植物由来ＤＮＡを検出可能なプライマーを用いたＰＣＲによって目的の大きさの増幅断片が得られないことがある。このため、目的の増幅産物が得られなかった場合に、被験試料中に目的のＤＮＡが存在していなかったのか、それとも被験試料のＤＮＡの品質に問題があったのか、を判断する必要がある。

【0032】

本発明に係るＤＮＡの検出方法は、ＰＣＲ法を用いた特定の動植物の食品への混入検査の検査対象となるＤＮＡの品質保証にも使用できる。被験試料から抽出されたＤＮＡに対して本発明に係るＤＮＡの検出方法を行い、目的とする増幅産物が検出された場合には、当該ＤＮＡには、少なくともＰＣＲに反応可能な状態にある動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡが存在していることが確認できる。つまり、本発明に係るＤＮＡの検出方法によって当該検査に供される被験試料中の動物ＤＮＡ又は植物ＤＮＡの存在の有無を確認しておくことにより、検査に供されるＤＮＡの品質が保証され、検査の信頼性を高めることができる。このため、本発明に係るＤＮＡの検出方法は、食品の原料製造会社や加工製造会社等、異物分析業者等で利用が可能である。

【0033】

＜被験試料からのＤＮＡ抽出＞
被験試料からのＤＮＡ抽出は、一般的な既知のＤＮＡ抽出法や市販の各種ＤＮＡ抽出キット［例えば、Ｎｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ，ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）、ＧＭ ｑｕｉｃｋｅｒ ４（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等］を用いて実施することができる。これらのＤＮＡ抽出法により、ゲノムＤＮＡ及び細胞小器官由来ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡや葉緑体ＤＮＡ）を被験試料から抽出できる。中でも、被験試料が食品の場合には、非特許文献１に記載の方法又はこれに準じて行うことが好ましい。

【0034】

＜リアルタイムＰＣＲ＞
動物由来ＤＮＡを検出する場合には、被験試料から抽出されたＤＮＡと、動物検出用Ｆ１プライマー、動物検出用Ｆ２プライマー、動物検出用Ｒ１プライマー、及び動物検出用プローブを含有させた反応液を調製し、当該反応液をリアルタイムＰＣＲ装置に設置して常法によりリアルタイムＰＣＲを行う。動物検出用Ｆ１プライマーと動物検出用Ｆ２プライマーは、リアルタイムＰＣＲの反応液中に等モル量となるように添加する。同様に、植物由来ＤＮＡを検出する場合には、被験試料から抽出されたＤＮＡと、植物検出用Ｆ１プライマー、植物検出用Ｒ１プライマー、及び植物検出用プローブを含有させた反応液を調製し、当該反応液をリアルタイムＰＣＲ装置に設置して常法によりリアルタイムＰＣＲを行う。

【0035】

リアルタイムＰＣＲでは、アニーリングにおいて動物検出用プローブ又は植物検出用プローブが目的とする増幅産物にハイブリダイズし、その後の伸長反応において当該プローブが加水分解され、蛍光物質が消光物質から分離して蛍光を発する。この遊離した蛍光物質からの蛍光シグナルがリアルタイムＰＣＲ装置の検出システムによってサイクル毎にモニターされる。この測定された蛍光シグナルに基づいて、動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡを検出できる。

【0036】

このリアルタイムＰＣＲにより、動物由来ＤＮＡ又は植物由来ＤＮＡの増幅産物が得られる。動物由来ＤＮＡの増幅産物は、生物種や被験試料ごとに異なるものの、おおよそ３５０～４７０ｂｐである。植物由来ＤＮＡの増幅産物は、生物種や被験試料ごとに異なるものの、おおよそ１２０～１３０ｂｐである。

【0037】

本発明に係るＤＮＡの検出方法により得られた増幅産物の塩基配列を一般的な方法で解析することにより、さらに詳細に生物種の同定を行うこともできる。塩基配列の解析は、一般的なＤＮＡシークエンサー及びＮＣＢＩ等の公共のデータベースを用いて常法により解析可能である。

【0038】

＜検出用キット＞
本発明に係るＤＮＡの検出方法において、動物由来ＤＮＡの検出に用いられる動物検出用Ｆ１プライマー、動物検出用Ｆ２プライマー、動物検出用Ｒ１プライマー、及び動物検出用プローブをまとめてキット化することが好ましい。同様に、植物由来ＤＮＡの検出に用いられる植物検出用Ｆ１プライマー、植物検出用Ｒ１プライマー、及び植物検出用プローブをまとめてキット化することが好ましい。これらのキットにより、各方法をより簡便に実施することができる。さらに、これらのキットは、リアルタイムＰＣＲを行うためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、反応バッファー等を含むことが好ましい。

【実施例】

【0039】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0040】

＜ＤＮＡの抽出＞
以降の実験において、被験試料からの動物由来ＤＮＡの抽出には、市販の抽出キット「ＧＭ ｑｕｉｃｋｅｒ ４」（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を使用した。また、植物由来ＤＮＡの抽出には、市販の抽出キット「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。抽出方法は、いずれもプロトコルに従った。

【0041】

＜プライマー及びプローブ＞
以降の実験において、動物由来ＤＮＡを検出するためのリアルタイムＰＣＲには、表１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（動物検出用Ｆ１プライマー、動物検出用Ｆ２プライマー、及び動物検出用Ｒ１プライマー）を用いた。植物由来ＤＮＡを検出するためのリアルタイムＰＣＲには、表１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（植物検出用Ｆ１プライマー、及び植物検出用Ｒ１プライマー）を用いた。

【0042】

以降の実験において、リアルタイムＰＣＲで使用するプローブとしては、５’末端をＦＡＭで標識し、３’末端をＭＧＢとＥｃｌｉｐｓｅで修飾したオリゴヌクレオチドを用いた。

【0043】

＜リアルタイムＰＣＲ＞
以降の実験において、リアルタイムＰＣＲは以下の方法で行った。
ＰＣＲ反応組成液（動植物共通）は、１μＬのＤＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）、１２．５μＬの「ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）、０．２５μＬの各プライマー（５０μＭ）（ただし、動物由来ＤＮＡの検出の場合には、０．１２５μＬの動物検出用Ｆ１プライマー、０．１２５μＬの動物検出用Ｆ２プライマー、０．２５μＬの動物検出用Ｒ１プライマー（いずれも５０μＭ））、及び０．５μＬのプローブ（１０μＭ）を加え、さらに反応液の液量が２５μＬとなるように超純水を添加した。また、抽出したＤＮＡの濃度が２０ｎｇ／μＬに満たない場合は、抽出ＤＮＡ溶液原液１μＬを使用した。

【0044】

調製した反応液を、９６ウェルＰＣＲプレートに注入し、当該プレートをリアルタイムＰＣＲ装置「７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）にセットし、リアルタイムＰＣＲを行った。動物由来ＤＮＡの検出のためのＰＣＲでは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間を各１回行った後、９５℃で１５秒間の変性ステップ、５５℃１５秒間のアニーリングステップ、６０℃１分間のＤＮＡ伸長ステップを含むサイクルを、５０回繰り返した。植物由来ＤＮＡの検出のためのＰＣＲでは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間を各１回行った後、９５℃で１５秒間の変性ステップ、６０℃で１分間のアニーリング・ＤＮＡ伸長ステップを含むサイクルを、５０回繰り返した。

【0045】

反応終了後、各ウェルの反応液について、それぞれの伸長ステップ後に取得した蛍光データを解析した。解析は、ベースラインを３－１５サイクル、閾値を０．２として行った。Ｃｔ値（相対蛍光量が閾値に達したサイクル数）が４３以下のＤＮＡ試料について、当該ＤＮＡ試料は目的の増幅産物が得られて検出できた、と判定した。

【0046】

［実施例１］
食品原料となる様々な動植物について、表１に記載のプライマーによって増幅される遺伝子領域にプローブを設計した。動物検出用プローブはｍｔＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、植物検出用プローブは葉緑体ＤＮＡのｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ遺伝子間領域の塩基配列を比較検討して、設計した。設計したプローブを用いてリアルタイムＰＣＲで各動植物由来のＤＮＡが検出できるかを調べた。

【0047】

動物検出用プローブの設計は、食品原料となる１３品目（さけ、さば、かれい、牛肉、豚肉、鶏肉、たこ、えび、いか、かに、いくら、いわし、あわび）の増幅領域の塩基配列を比較し、より多くの動物種で共通する４つの領域を、プローブの候補領域とした。植物検出用プローブの設計は、食品原料となる２４品目（米、小麦、そば、じゃがいも、大豆、落花生、カシューナッツ、くるみ、ごま、にんじん、ほうれんそう、きゅうり、たまねぎ、オレンジ、キウイフルーツ、バナナ、もも、りんご、まつたけ、マッシュルーム、青のり、緑茶、コーヒー、ココア）の増幅領域の塩基配列を比較し、より多くの植物種で共通する４つの領域を、プローブの候補領域とした。動物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列、及び植物のｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ遺伝子間領域の塩基配列は、ＤＤＢＪデータベースに登録されているものを用いた。各候補プローブの領域と塩基配列を図１Ａ、図１Ｂ、図２、及び表３に示す。なお、Ｍ１プローブ、Ｍ４プローブ、及びＰ４プローブは、図に示す領域の相補鎖配列である。

【0048】

【表3】

【0049】

食品原料検体３７品目（動物１３品目、植物２４品目）について、それぞれＤＮＡを抽出し、表１に記載のプライマー、及び表３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをＦＡＭ、ＭＧＢ、及びＥｃｌｉｐｓｅで修飾したプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。Ｍ１～Ｍ４プローブを使用する反応では、表１に記載の動物検出用Ｆ１プライマー、動物検出用Ｆ２プライマー、及び動物検出用Ｒ１プライマーを用い、Ｐ１～Ｐ４プローブを使用する反応では、表１に記載の植物検出用Ｆ１プライマー及び植物検出用Ｒ１プライマーを用いた。各プライマー及びプローブは、ユーロフィンジェノミクス株式会社で合成されたものを使用した。結果を表４及び５に示す。表中、「〇」は増幅産物が検出されたことを、「×」は増幅産物が検出されなかったことを示す。また、「検出率（％）」は、増幅産物が検出された食品原料の割合を示す。

【0050】

【表4】

【0051】

【表5】

【0052】

図１Ａ、図１Ｂ、及び図２に示すように、いずれのプローブも動物種間又は植物種間で広く保存されている領域に設計した。しかし、検出率はプローブごとに大きく異なった。動物由来ＤＮＡの検出においては、Ｍ１プローブは全ての動物種で増幅産物が検出されたのに対して、残る３種のプローブは検出率がいずれも８０％未満であり、検出できない動物が多かった（表４）。植物由来ＤＮＡの検出においては、Ｐ１プローブは全ての植物種で増幅産物が検出されたのに対して、残る３種のプローブは検出率が非常に低く、特にＰ２プローブを用いたリアルタイムＰＣＲでは、いずれの植物も検出できなかった（表５）。この結果、動物由来ＤＮＡの検出はＭ１プローブが、植物由来ＤＮＡの検出はＰ１プローブが最適であることが確認された。

【0053】

次に、Ｍ１プローブと動物検出用Ｆ１プライマーと動物検出用Ｆ２プライマーと動物検出用Ｒ１プライマーとを用いた動物ＤＮＡ検知系を用いて、表５に記載の植物２４品目に対して同様にリアルタイムＰＣＲを行い、当該検出系の特異性を確認した。その結果を表５に示す。また、Ｐ１プローブと植物検出用Ｆ１プライマーと植物検出用Ｒ１プライマーとを用いた植物ＤＮＡ検出系を用いて、表４に記載の動物１３品目に対して同様にリアルタイムＰＣＲを行い、当該検出系の特異性を確認した。その結果を表４に示す。この結果、いずれの検出系においても検出率は０％であり、Ｍ１プローブを用いた動物ＤＮＡ検知系及びＰ１プローブを用いた植物ＤＮＡ検知系は、それぞれ動物由来ＤＮＡ及び植物由来ＤＮＡに特異的であることが確認された。

【0054】

次に、動物検体２品目（牛肉、えび）及び植物検体２品目（大豆、カシューナッツ）から抽出したＤＮＡを表６に記載の濃度に段階希釈し、それぞれＭ１プローブを用いた動物ＤＮＡ検知系及びＰ１プローブを用いた植物ＤＮＡ検知系を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、検出下限値を調べた。その結果を表６に示す。表中、「〇」は増幅産物が検出されたことを、「×」は増幅産物が検出されなかったことを、「－」は未検討を、それぞれ示す。

【0055】

【表6】

【0056】

この結果、Ｍ１プローブを用いた動物ＤＮＡ検知系の検出下限値は、牛肉が１ｐｇ／μＬ、えびが５ｐｇ／μＬであった。また、Ｐ１プローブを用いた植物ＤＮＡ検知系の検出下限値は、大豆が５０ｐｇ／μＬ、カシューナッツが１ｐｇ／μＬであった。

【0057】

以降の実施例において、Ｍ１プローブを動物検出用プローブ、Ｐ１プローブを植物検出用プローブとした。

【0058】

［実施例２］
表７及び表８に記載の加工食品について、ＤＮＡを抽出し、実施例１の動物検出用プローブを用いた動物ＤＮＡ検知系及び植物検出用プローブを用いた植物ＤＮＡ検知系を用いて、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。表７に記載の加工食品については動物検出用プローブを用いた動物ＤＮＡ検知系で、表８に記載の加工食品については植物検出用プローブを用いた植物ＤＮＡ検知系を用いた。その結果を表７及び８に示す。表中、「〇」は増幅産物が検出されたことを、「×」は増幅産物が検出されなかったことを示す。

【0059】

【表7】

【0060】

【表8】

【0061】

動物検出用プローブを用いた動物ＤＮＡ検知系は、動物検体を含む加工食品１１品目のうち、１０品目で動物由来ＤＮＡを検出した（表７）。また、植物検出用プローブを用いた植物ＤＮＡ検知系は、植物検体を含む加工食品１５品目のうち、１４品目で植物由来ＤＮＡを検出した（表８）。動物の加工食品検体のうち、「さば水煮」から動物由来ＤＮＡが検出されなかったのは、缶詰であり、加工時の加熱処理によって動物由来ＤＮＡが分解したためと推察された。また、植物の加工食品検体のうち、「即席 松茸お吸い物」から植物由来ＤＮＡが検出されなかったのは、フリーズドライであり、抽出されたＤＮＡがＰＣＲに適していなかったためと推察された。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【配列表】

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