特許 7488519 ＬＡＭＰプライマーセット及びプライマー対

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-14

(45)【発行日】2024-05-22

(54)【発明の名称】ＬＡＭＰプライマーセット及びプライマー対

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20240515BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALN20240515BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20240515BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z ZNA

C12Q1/6827 Z

C12N15/29

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2020056441

(22)【出願日】2020-03-26

(65)【公開番号】P2021153460

(43)【公開日】2021-10-07

【審査請求日】2023-03-02

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３１年度、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター、イノベーション創出強化研究推進事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】501186173

【氏名又は名称】国立研究開発法人森林研究・整備機構

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100087398

【弁理士】

【氏名又は名称】水野 勝文

(74)【代理人】

【識別番号】100128783

【弁理士】

【氏名又は名称】井出 真

(74)【代理人】

【識別番号】100128473

【弁理士】

【氏名又は名称】須澤 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100160886

【弁理士】

【氏名又は名称】久松 洋輔

(74)【代理人】

【識別番号】100192603

【弁理士】

【氏名又は名称】網盛 俊

(72)【発明者】

【氏名】上野真義

(72)【発明者】

【氏名】長谷川陽一

(72)【発明者】

【氏名】魏甫錦

(72)【発明者】

【氏名】松本麻子

(72)【発明者】

【氏名】伊原徳子

(72)【発明者】

【氏名】内山憲太郎

(72)【発明者】

【氏名】森口喜成

(72)【発明者】

【氏名】笠原雅弘

(72)【発明者】

【氏名】藤野健

(72)【発明者】

【氏名】重信秀治

(72)【発明者】

【氏名】山口勝司

(72)【発明者】

【氏名】尾納隆大

【審査官】藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】特開２００２－１２５４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１０－２４８４１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平７－１７０９８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Saneyoshi, UENO et al.，Breeding Science，2019年，Vol. 69, No. 1，pp. 19-29

【文献】Yoshinari, MORIGUCHI et al.，Tree Genetics & Genomes，2016年，12: 57，pp. 1-12

【文献】Yoichi, HASEGAWA et al.，PLOS ONE，2018年，13(11), e0206695，pp. 1-11

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出するためのＬＡＭＰプライマーセットであって、
前記ＬＡＭＰプライマーセットは、５´末端側からＦ１ｃ配列のポリヌクレオチドとＦ２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーと、５´末端側からＢ１ｃ配列のポリヌクレオチドとＢ２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーと、Ｆ３配列のポリヌクレオチドからなるＦ３_{ｍｓ１－１}プライマーと、Ｂ３配列のポリヌクレオチドからなるＢ３_{ｍｓ１－１}プライマーと、を有しており、
前記Ｆ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２０２番目から第２２３番目までのＦ１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｆ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第１５９番目から第１７８番目までのＦ２領域に対して相補なＦ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｂ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２５２番目から第２７３番目までのＢ１ｃ領域に対して相補なＢ１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｂ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３１１番目から第３２６番目までのＢ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｆ３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第１２２番目から第１３９番目までのＦ３領域に対して相補なＦｃ３領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｂ３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３４０番目から第３５９番目までのＢ３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ことを特徴とするＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項2】

前記ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号２～６に示す塩基配列のいずれか一つの塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項3】

前記ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号５に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項２に記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項4】

前記ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号７に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項5】

前記Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号８に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１から４のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項6】

前記Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号９に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１から５のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項7】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出するためのプライマー対であって、
少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２９０番目から第３７９番目までの領域を増幅可能なＦ_{ｍｓ１－１}プライマーとＲ_{ｍｓ１－１}プライマーにより構成されることを特徴とするプライマー対。

【請求項8】

前記Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、
前記Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、
前記Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２９０番目から第３１３番目までのＦ_ｐ１領域に対して相補なＦ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３６５番目から第３９２番目までのＲ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ことを特徴とする請求項７に記載のプライマー対。

【請求項9】

前記Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１０に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項８に記載のプライマー対。

【請求項10】

前記Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１１に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項８又は９に記載のプライマー対。

【請求項11】

前記Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドを有しており、
前記Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドを有しており、
前記Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２３４番目から第２５６番目までのＦ_ｐ２領域に対して相補なＦ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３５７番目から第３７９番目までのＲ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ことを特徴とする請求項７に記載のプライマー対。

【請求項12】

前記Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１２に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１１に記載のプライマー対。

【請求項13】

前記Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１３に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のプライマー対。

【請求項14】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出するためのＬＡＭＰプライマーセットであって、
前記ＬＡＭＰプライマーセットは、５’末端側からＦ’１ｃ配列のポリヌクレオチドとＦ’２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーと、５’末端側からＢ’１ｃ配列のポリヌクレオチドとＢ’２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーと、Ｆ’３配列のポリヌクレオチドからなるＦ３_{ｍｓ１－２}プライマーと、Ｂ’３配列のポリヌクレオチドからなるＢ３_{ｍｓ１－２}プライマーと、を有しており、
前記Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２０２３番目から第２０４４番目までのＦ’１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｆ’２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９８３番目から第２０００番目までのＦ’２領域に対して相補なＦ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｂ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２０４６番目から第２０６９番目までのＢ’１ｃ領域に対して相補なＢ’１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｂ’２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２１０５番目から第２１２９番目までのＢ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｆ’３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９６４番目から第１９８２番目までのＦ’３領域に対して相補なＦ’ｃ３領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｂ’３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２１３０番目から第２１４９番目までのＢ’３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ことを特徴とするＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項15】

前記ＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１５に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１４に記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項16】

前記ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１６に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項17】

前記Ｆ３_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１７に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項18】

前記Ｂ３_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１８に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１４から１７のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【請求項19】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出するためのプライマー対であって、
少なくとも配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９６６番目から第２０６７番目までの領域を増幅可能なＦ_{ｍｓ１－２}プライマーとＲ_{ｍｓ１－２}プライマーにより構成されることを特徴とするプライマー対。

【請求項20】

前記Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマーは、Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、
前記Ｒ_{ｍｓ１－２}プライマーは、Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、
前記Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２０４５番目から第２０６７番目までのＦ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
前記Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９６６番目から第１９８８番目までのＲ’_ｐ１領域に相補なＲ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ことを特徴とする請求項１９に記載のプライマー対。

【請求項21】

前記Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１９に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２０に記載のプライマー対。

【請求項22】

前記Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２０に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２０又は２１に記載のプライマー対。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出するためのＬＡＭＰプライマーセット及びプライマー対に関する。

【背景技術】

【0002】

スギ花粉症は、１９６４年、日光市の住民に初めて報告され、その後、花粉症の発症率は全国的に増加している。現在では、日本の人口の２５％以上の人が花粉症であると言われている。なお、花粉症とは、花粉が鼻や目などの粘膜に接触することによって引き起こされるアレルギー性鼻炎のことであり、枯草熱（こそうねつ）とも言われる。花粉症の中でも、スギ花粉に由来する花粉症をスギ花粉症という。花粉症の具体的な症状としては、例えば、くしゃみ、鼻水、鼻づまり、目のかゆみ等が挙げられる。

【0003】

このような状況に鑑み、スギ花粉症の発生を抑制するための様々な検討が行われている。例えば、特許文献１では、スギ黒点病菌（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の菌糸体を含む菌糸体懸濁液をスギ未熟雄花に接種して、スギ花粉の飛散を防止することが検討されている。また、林業分野では、花粉の生成しない無花粉スギ（以下、「雄性不稔スギ」ともいう）へ品種を転換し、スギ花粉の飛散を防止することも検討されている。

【0004】

雄性不稔スギは、全国各地でさまざまな系統が選抜されている。そして、これらの系統についての調査が進められ、スギ花粉を生成しない形質（以下、「雄性不稔形質」ともいう）が単一の遺伝子座により支配され、メンデル遺伝を示すことが明らかにされている。非特許文献１には、雄性不稔形質を支配する遺伝子座として、第９連鎖群に存在する遺伝子座ＭＳ１と、第５連鎖群に存在する遺伝子座ＭＳ２と、第１連鎖群に存在する遺伝子座ＭＳ３と、第４連鎖群に存在する遺伝子座ＭＳ４が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、これらの遺伝子座に存在する、雄性不稔形質の原因となるアレル（以下、「雄性不稔遺伝子」という）および野生型のアレル（以下、「雄性可稔遺伝子」という）を特定するには至っていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２０１１－５２０３９号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Tree Genetics & Genomes，「A high-density linkage map with 2560 markers and its application for the localization of the male-sterile genes ms3and ms4 in Cryptomeria japonica D. Don」，Volume 12, Issue 3, Article 57，2016年6月

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出するためのＬＡＭＰプライマーセット及びプライマー対を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出するためのＬＡＭＰプライマーセットであって、前記ＬＡＭＰプライマーセットは、５´末端側からＦ１ｃ配列のポリヌクレオチドとＦ２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーと、５´末端側からＢ１ｃ配列のポリヌクレオチドとＢ２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーと、Ｆ３配列のポリヌクレオチドからなるＦ３_{ｍｓ１－１}プライマーと、Ｂ３配列のポリヌクレオチドからなるＢ３_{ｍｓ１－１}プライマーと、を有しており、前記Ｆ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２０２番目から第２２３番目までのＦ１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｆ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第１５９番目から第１７８番目までのＦ２領域に対して相補なＦ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｂ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２５２番目から第２７３番目までのＢ１ｃ領域に対して相補なＢ１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｂ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３１１番目から第３２６番目までのＢ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第１２２番目から第１３９番目までのＦ３領域に対して相補なＦｃ３領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３４０番目から第３５９番目までのＢ３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、ことを特徴とするＬＡＭＰプライマーセット。
（２）前記ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号２～６に示す塩基配列のいずれか一つの塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１）に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（３）前記ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号５に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（２）に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（４）前記ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号７に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１）から（３）のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（５）前記Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号８に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１）から（４）のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（６）前記Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーが、配列表の配列番号９に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１）から（５）のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【0009】

（７）雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出するためのプライマー対であって、少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２９０番目から第３７９番目までの領域を増幅可能なＦ_{ｍｓ１－１}プライマーとＲ_{ｍｓ１－１}プライマーにより構成されることを特徴とするプライマー対。
（８）前記Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、前記Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、前記Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２９０番目から第３１３番目までのＦ_ｐ１領域に対して相補なＦ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３６５番目から第３９２番目までのＲ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、ことを特徴とする（７）に記載のプライマー対。
（９）前記Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１０に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする（８）に記載のプライマー対。
（１０）前記Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１１に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする（８）又は（９）に記載のプライマー対。
（１１）前記Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドを有しており、前記Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマーは、Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドを有しており、前記Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第２３４番目から第２５６番目までのＦ_ｐ２領域に対して相補なＦ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の第３５７番目から第３７７番目までのＲ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、ことを特徴とする（７）に記載のプライマー対。
（１２）前記Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１２に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする（１１）に記載のプライマー対。
（１３）前記Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１３に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする（１１）又は（１２）に記載のプライマー対。

【0010】

（１４）雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出するためのＬＡＭＰプライマーセットであって、前記ＬＡＭＰプライマーセットは、５’末端側からＦ’１ｃ配列のポリヌクレオチドとＦ’２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーと、５’末端側からＢ’１ｃ配列のポリヌクレオチドとＢ’２配列のポリヌクレオチドが連結してなるＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーと、Ｆ’３配列のポリヌクレオチドからなるＦ３_{ｍｓ１－２}プライマーと、Ｂ’３配列のポリヌクレオチドからなるＢ３_{ｍｓ１－２}プライマーと、を有しており、前記Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２０２３番目から第２０４４番目までのＦ’１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｆ’２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９８３番目から第２０００番目までのＦ’２領域に対して相補なＦ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｂ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２０４６番目から第２０６９番目までのＢ’１ｃ領域に対して相補なＢ’１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｂ’２配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２１０５番目から第２１２９番目までのＢ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｆ’３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９６４番目から第１９８２番目までのＦ’３領域に対して相補なＦ’ｃ３領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｂ’３配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２１３０番目から第２１４９番目までのＢ’３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、ことを特徴とするＬＡＭＰプライマーセット。
（１５）前記ＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１５に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１４）に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（１６）前記ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１６に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１４）又は（１５）に記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（１７）前記Ｆ３_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１７に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１４）から（１６）のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。
（１８）前記Ｂ３_{ｍｓ１－２}プライマーが、配列表の配列番号１８に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなることを特徴とする（１４）から（１７）のいずれか一つに記載のＬＡＭＰプライマーセット。

【0011】

（１９）雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出するためのプライマー対であって、少なくとも配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９６６番目から第２０６７番目までの領域を増幅可能なＦ_{ｍｓ１－２}プライマーとＲ_{ｍｓ１－２}プライマーにより構成されることを特徴とするプライマー対。
（２０）前記Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマーは、Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、前記Ｒ_{ｍｓ１－２}プライマーは、Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドを有しており、前記Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第２０４５番目から第２０６７番目までのＦ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、前記Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列の第１９６６番目から第１９８８番目までのＲ’_ｐ１領域に相補なＲ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、ことを特徴とする（１９）に記載のプライマー対。
（２１）前記Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１９に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする（２０）に記載のプライマー対。
（２２）前記Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２０に示す塩基配列のポリヌクレオチドであることを特徴とする（２０）又は（２１）に記載のプライマー対。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出するためのＬＡＭＰプライマーセット及びプライマー対を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の塩基配列（配列番号２１）を示す図である。

【図2】雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の塩基配列（配列番号１）を示す図である。

【図3】雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の塩基配列（配列番号１４）を示す図である。

【図4】雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の塩基配列（配列番号２２）を示す図である。

【図5】第１実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを構成する各プライマーの塩基配列と、その塩基配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の領域の関係を説明する図である。

【図6】雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の塩基配列（配列番号１）を示す図である。

【図7】第２実施形態のプライマー対を構成する各プライマーの塩基配列と、その塩基配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の領域の関係を説明する図である。

【図8】第３実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを構成する各プライマーの塩基配列と、その塩基配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の領域の関係を説明する図である。

【図9】雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の塩基配列（配列番号１４）を示す図である。

【図10】第４実施形態のプライマー対を構成する各プライマーの塩基配列と、その塩基配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の塩基配列の関係を説明する図である。

【図11】リード配列のアラインメントの結果を示す図である（参考例１）。

【図12】核酸増幅処理後の増幅反応液の写真である（実施例１－１）。

【図13】増幅反応液の濁度を示すグラフである（実施例１－２）。

【図14】増幅産物の電気泳動写真である（実施例２－１）。

【図15】増幅産物の長さを示すエレクトロフェログラムである（実施例２－２）。

【図16】核酸増幅処理後の増幅反応液の写真である（実施例３）

【図17】増幅産物の電気泳動写真である（実施例４－１）。

【図18】増幅産物の長さを示すエレクトロフェログラムである（実施例４－２）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

まず、本発明を完成するに至った経緯を説明する。

【0015】

遺伝子座ＭＳ１～ＭＳ４は、それぞれ独立してスギの雄性不稔形質を支配する。このため、本発明者等は、遺伝子座ＭＳ１～ＭＳ４のうち、少なくとも一つの遺伝子座について、雄性不稔形質の原因となるアレル（以下、「雄性不稔遺伝子」という）を特定し、それを検出できるようにすれば、雄性不稔スギの効率的な育種と雄性不稔スギの種苗の安定供給が期待できると考えた。そこで、第９連鎖群に存在する遺伝子座ＭＳ１に着目し、遺伝子座ＭＳ１に存在する雄性不稔遺伝子（以下、「雄性不稔遺伝子ｍｓ１」ともいう）を特定するため鋭意検討した。

【0016】

本発明者等は、後述する参考例に記載するように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を特定するため、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を保有する交配家系を用いて、雄花や花粉組織で発現する遺伝子の塩基配列を網羅的に収集した。そして、収集した遺伝子の塩基配列を、花粉を生成する可稔スギ（以下、「雄性可稔スギ」ともいう）の遺伝子の塩基配列と比較したところ、アミノ酸配列に異常を来す２つのタイプの突然変異が雄性不稔スギに存在することを見出した。

【0017】

本発明者等は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１のうち、第１突然変異によって変異が生じた変異型アレルを雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１と名付け、第２突然変異によって変異が生じた変異型アレルを雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２と名付けた。これらの変異型アレルをホモ接合型（ｍｓ１－１/ｍｓ１－１や、ｍｓ１－２/ｍｓ１－２や，ｍｓ１－１/ｍｓ１－２）で保有する個体は、１００％の確率で雄性不稔スギとなる。

【0018】

そして、本発明者等は、上述した雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１及び雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の塩基配列を解読し、解読した塩基配列に基づいて本発明を完成するに至った。

【0019】

なお、本明細書において、雄性不稔遺伝子ｍｓ１とは、遺伝子座ＭＳ１に存在し、雄性不稔形質の原因となるアレルを指す。雄性不稔遺伝子ｍｓ１は、当該遺伝子をホモ接合型（ｍｓ１－１/ｍｓ１－１や、ｍｓ１－２/ｍｓ１－２や，ｍｓ１－１/ｍｓ１－２）で保有することで雄性不稔形質を発現する。雄性不稔遺伝子ｍｓ１は、第１突然変異によって生じた雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１と、第２突然変異によって生じた雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の２種類の遺伝子の総称である。

【0020】

また、以下の説明では、遺伝子座ＭＳ１に存在し、スギ花粉を生成する形質（以下、「雄性可稔形質」ともいう）の原因となるアレルを雄性可稔遺伝子Ｍｓ１という。雄性可稔遺伝子Ｍｓ１は、当該遺伝子をホモ接合型（Ｍｓ１／Ｍｓ１）又はヘテロ接合型（Ｍｓ１／ｍｓ１－１やＭｓ１／ｍｓ１－２）で保有することで雄性可稔形質を発現する。

【0021】

雄性可稔遺伝子Ｍｓ１は、一例として、図１や配列表の配列番号２１に示す塩基配列を有している。

【0022】

雄性可稔遺伝子Ｍｓ１は、３つエクソンを有し、脂質転移タンパク質に関連する遺伝子であると考えられる。第１エクソンは、シグナルペプチドに翻訳され、第２エクソンは、Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ｐｌａｎｔ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ （ＩＰＲ０３６３１２）（ＬＴＰドメイン）に翻訳され、第３エクソンは、膜貫通ドメインに翻訳されると考えられる。

【0023】

配列番号２１に示す雄性可稔遺伝子Ｍｓ１において、第１エクソンは、第１番目から第４４９番目までの領域であり、第２エクソンは、第６０４番目から第６４５番目までの領域であり、第３エクソンは、第１８５１番目から第２２６４番目までの領域である。

【0024】

本発明者等が特定した雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１は、上述した第１エクソンの中の連続する４塩基が欠失している点において、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と異なっている。本発明者等が見出した上述の第１突然変異は、第１エクソンにおけるこの４塩基の欠失である。

【0025】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１は、一例として、図２や配列表の配列番号１に示す塩基配列を有している。配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１は、図１に示すように、配列番号２１に示す雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の第３１２番目から第３１５番目までの４塩基が欠失している点において、当該雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と異なっている。

【0026】

一方、本発明者等が特定した雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２は、第３エクソンにおいて連続する３０塩基が欠失している点において、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と異なっている。本発明者等が見出した上述の第２突然変異は、第３エクソンにおけるこの３０塩基の欠失である。

【0027】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２は、一例として、図３や配列表の配列番号１４に示す塩基配列を有している。配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２は、図１に示すように、配列表の配列番号２１に示す雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の第２０４４番目から第２０７３番目までの３０塩基が欠失している点において、当該雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と異なっている。

【0028】

なお、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１は、図１や配列表の配列番号２１に示す塩基配列に限定されず、当該塩基配列にコードされるポリペプチドと相同な機能を発揮するポリペプチドをコードする塩基配列であってもよい。例えば、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１は、図４や配列表の配列番号２２に示す塩基配列を有するものであってもよい。配列番号２２に示す雄性可稔遺伝子Ｍｓ１では、第１エクソンは、第１番目から第４４９番目までの領域であり、第２エクソンは、第６０４番目から第６４５番目までの領域であり、第３エクソンは、第１９０４番目から第２３１７番目までの領域である。

【0029】

また、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１についても、図２や配列表の配列番号１に示す塩基配列に限定されず、当該塩基配列にコードされるポリペプチドと相同な機能を発揮するポリペプチドをコードする塩基配列であってもよい。同様に、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２も、図３や配列表の配列番号１４に示す塩基配列に限定されず、当該塩基配列にコードされるポリペプチドと相同な機能を発揮するポリペプチドをコードする塩基配列であってもよい。

【0030】

（第１実施形態）
まず、本発明の第１実施形態について説明する。

【0031】

本実施形態は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出することができるＬＡＭＰプライマーセットに関する。本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットによれば、雄性不稔遺伝子ｍｓ１のうち、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することができる。

【0032】

本明細書において、ＬＡＭＰプライマーセットとは、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法）による核酸増幅に用いられる少なくとも４種のプライマーを意味する。なお、ＬＡＭＰ法は、栄研化学社（東京）によって開発された核酸増幅の手法であり、例えば、国際公開第００／２８０８２号に記載されている。

【0033】

また、本明細書において、雄性不稔遺伝子を検出できるとは、検体に当該雄性不稔遺伝子（アレル）が含まれているか否かを同定することを指す。言い換えれば、遺伝子を検出できるとは、検体のＤＮＡに当該遺伝子が含まれていると同定すること、及び／又は、検体のＤＮＡに当該遺伝子が含まれていないと同定することを指す。

【0034】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}」ともいう。）と、Ｂａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}」ともいう。）と、Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーと、Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーの４種のプライマーを有している。

【0035】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットに含まれる４種のプライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１における異なる６つの領域（５’末端側から順に、Ｆ３領域，Ｆ２領域，Ｆ１領域，Ｂ１ｃ領域，Ｂ２ｃ領域，Ｂ３ｃ領域）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順に、Ｂ３領域，Ｂ２領域，Ｂ１領域，Ｆ１ｃ領域，Ｆ２ｃ領域，Ｆ３ｃ領域）を考慮して設計されている。

【0036】

本実施形態において、Ｆ３領域は、図２や図５に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第１２２番目から第１３９番目までの領域であり、Ｆ３ｃ領域は、Ｆ３領域に相補な領域である。Ｆ２領域は、図２や図５に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第１５９番目から第１７８番目までの領域であり、Ｆ２ｃ領域は、Ｆ２領域に相補な領域である。Ｆ１領域は、図２や図５に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第２０２番目から第２２３番目までの領域であり、Ｆ１ｃ領域は、Ｆ１領域に相補な領域である。

【0037】

一方、Ｂ１ｃ領域は、図２や図５に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第２５２番目から第２７３番目までの領域であり、Ｂ１領域は、Ｂ１ｃ領域に相補な領域である。Ｂ２ｃ領域は、図２や図５に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第３１１番目から第３２６番目までの領域であり、Ｂ２領域は、Ｂ２ｃ領域に相補な領域である。Ｂ３ｃ領域は、図２や図５に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第３４０番目から第３５９番目までの領域であり、Ｂ３領域は、Ｂ３ｃ領域に相補な領域である。

【0038】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーは、図５に示すように、５´末端側からＦ１ｃ配列のポリヌクレオチドとＦ２配列のポリヌクレオチドが連結してなるプライマーである。Ｆ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、Ｆ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。

【0039】

Ｆ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ１領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｆ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ１ｃ領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｆ１ｃ領域と異なる塩基配列とすることもできる。同様に、Ｆ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ２ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｆ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ２領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｆ２領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0040】

具体的なＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、下記表１に示すように、配列表の配列番号７に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号７に示す塩基配列のＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーでは、Ｆ１ｃ配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ１ｃ領域と同一の塩基配列を有しており、Ｆ２配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ２領域と同一の塩基配列を有している。なお、下記表１に示すＦＩＰ_{ｍｓ１－１}は、４２個の塩基からなり、５’末端から１番目～２２番目までの塩基がＦ１ｃ配列のポリヌクレオチドであり、５’末端から２３番目～４２番目までの塩基がＦ２配列のポリヌクレオチドである。

【0041】

【表1】

【0042】

ここで、本明細書において、特定領域にハイブリダイズ可能とは、核酸増幅処理におけるアニーリングの工程（例えば、５５℃～６６℃で増幅反応液をインキュベートする工程）において、鋳型ＤＮＡの特定領域のみと二本鎖を形成することができ、鋳型ＤＮＡの特定領域以外の領域とは二本鎖を形成しないことを指す。また、本明細書において、プライマーのＴｍ値は、特に限定されるものではないが、例えば、５０℃以上とすることができ、５５℃以上であることが好ましく、６０℃以上であることがより好ましい。

【0043】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーは、図５に示すように、５’末端側からＢ１ｃ配列のポリヌクレオチドとＢ２配列のポリヌクレオチドが連結してなるプライマーである。Ｂ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、Ｂ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。ここで、Ｂ２配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２ｃ領域には、第１突然変異（４塩基欠失）が生じた箇所が含まれる。

【0044】

Ｂ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ１領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｂ１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ１ｃ領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｂ１ｃ領域と異なる塩基配列とすることもできる。同様に、Ｂ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｂ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｂ２領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0045】

具体的なＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、下記表２に示すように、配列表の配列番号２～６に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列のＢＩＰ_{ｍｓ１－１}では、Ｂ１ｃ配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ１ｃ領域と同一の塩基配列を有しており、Ｂ２配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２領域と同一の塩基配列を有している。一方、配列番号３～４に示す塩基配列のＢＩＰ_{ｍｓ１－１}では、配列番号２に示すＢＩＰ_{ｍｓ１－１}の３’末端から２番目の塩基が、チミン（Ｔ）以外の他の塩基（アデニン（Ａ）やシトシン（Ｃ））に変更されている。また、配列番号５～６で表される塩基配列のＢＩＰ_{ｍｓ１－１}では、配列番号２で表されるＢＩＰ_{ｍｓ１－１}の３’末端から３番目の塩基が、グアニン（Ｇ）以外の他の塩基（アデニン（Ａ）やシトシン（Ｃ））に変更されている。なお、下記表２に示すＢＩＰ_{ｍｓ１－１}は、３８個の塩基からなり、５’末端から１番目から２２番目までの塩基がＢ１ｃ配列のポリヌクレオチドであり、５’末端から２３番目から３８番目までの塩基がＢ２配列のポリヌクレオチドである。

【0046】

【表2】

【0047】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、表２に示すＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーの中でも、配列番号５に示す塩基配列のＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーを用いることが好ましい。配列番号５に示す塩基配列のＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーを用いたＬＡＭＰプライマーセットは、表２に示す他のＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーを用いたＬＡＭＰプライマーセットと比較し、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１に対する特異性がより高く、また、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の核酸の増幅効率がより向上する。

【0048】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーは、図５に示すように、Ｆ３配列のポリヌクレオチドからなるプライマーである。Ｆ３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｆ３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ３ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｆ３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ３領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｆ３領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0049】

具体的なＦ３_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、下記表３に示すように、配列表の配列番号８に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号８に示す塩基配列のＦ３_{ｍｓ１－１}プライマーでは、Ｆ３配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ３領域と同一の塩基配列を有している。なお、下記表３に示すＦ３_{ｍｓ１－１}プライマーにおいて、Ｆ３配列のポリヌクレオチドは、２０個の塩基からなる。

【0050】

【表3】

【0051】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーは、図５に示すように、Ｂ３配列のポリヌクレオチドからなるプライマーである。Ｂ３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｂ３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ３ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｂ３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ３領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｂ３領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0052】

具体的なＢ３_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、下記表４に示すように、配列表の配列番号９に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号９で表される塩基配列のＢ３_{ｍｓ１－１}プライマーでは、Ｂ３配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ３領域と同一の塩基配列を有している。なお、下記表４に示すＢ３_{ｍｓ１－１}プライマーにおいて、Ｂ３配列のポリヌクレオチドは、２０個の塩基からなる。

【0053】

【表4】

【0054】

ここで、本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットは、上述したＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー、Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマー及びＢ３_{ｍｓ１－１}プライマーを１つずつ有するプライマーセットであり、その組み合わせについては特に限定されない。一方で、核酸の増幅効率が向上する観点からは、本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットは、下記表５に示す４種のプライマーを有していることが好ましい。

【0055】

【表5】

【0056】

以上説明した本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーのＢ２配列のポリヌクレオチドは、第１突然変異（４塩基欠失）が生じている雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２ｃ領域にハイブリダイズする。このため、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有する検体の核酸増幅を試みると、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＢ２ｃ領域にＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー（Ｂ２配列のポリヌクレオチド）がハイブリダイズし、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーを介した核酸増幅が進行する。一方で、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していない検体（例えば、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１を保有する検体や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有する検体）の核酸増幅を試みると、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーのＢ２配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズするＢ２ｃ領域が存在しないため、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーを介した核酸増幅が進行しない。従って、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有している場合には、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の一部の領域（具体的には、Ｂ２領域とＦ２領域を含む、これらに挟まれる領域。）の核酸が増幅されるが、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していない場合には、核酸が増幅されない。従って、実施形態のＬＡＭＰプライマーセットによれば、この核酸増幅の可否に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することができる。

【0057】

次に、本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出する方法について具体的に説明する。

【0058】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出方法は、（１）ＬＡＭＰ法による核酸増幅処理と（２）増幅産物の検出処理を含んでいる。

【0059】

（１）ＬＡＭＰ法による核酸増幅処理は、本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により検体の核酸を増幅する処理である。ＬＡＭＰ法による核酸の増幅は、公知の条件（例えば、栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ（登録商標、以下同じ） ＤＮＡ増幅試薬キットの取扱説明書に記載される条件）を用いることができ、特に限定されるものではない。ＬＡＭＰ法による核酸増幅の一例を、以下に記載する。

【0060】

まず、反応試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）、反応用バッファー（例えば、ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）、ＬＡＭＰプライマーセット、蒸留水）を混合し、増幅反応液を調製する。ＬＡＭＰプライマーセットを除く反応試薬には、例えば栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ（登録商標、以下同じ） ＤＮＡ増幅試薬キットを用いてもよい。Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キットは、以下の成分により構成されている。

【0061】

Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット：２倍濃度反応用バッファー（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．６Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、各終濃度２．８ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ； ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ ８ｕｎｉｔｓ／μｌ。

【0062】

次に、増幅反応液に検体（つまり、スギ）のＤＮＡを加え、例えば、５７℃～６６℃にてインキュベートする。この処理により、ＬＡＭＰプライマーセットの各プライマーがＤＮＡにアニーリングし、検体の核酸が増幅される。インキュベートの温度は、核酸を増幅しやすくなる観点から６０℃～６６℃であることが好ましい。なお、スギからＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍｕｒｒａｙ ＭＧ, Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＷＦ （１９８０） Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｖｏｌ ８： Ｐａｇｅｓ ４３２１－４３２６に記載されている方法）を用いることができる。

【0063】

ここで、ＬＡＭＰ法による核酸増幅は、例えば、次の（ａ）～（ｉ）の過程で進行する。
（ａ）鋳型ＤＮＡ（Ｆ２ｃ領域）にＦＩＰ_{ｍｓ１－１}のＦ２配列のポリヌクレオチドがアニーリングする。
（ｂ）Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、Ｆ２配列のポリヌクレオチド（ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー）の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ｃ）鋳型ＤＮＡにアニーリングしているＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー（Ｆ２配列のポリヌクレオチド）の外側において、Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーのＦ３配列のポリヌクレオチドが鋳型ＤＮＡ（Ｆ３ｃ領域）にさらにアニーリングし、Ｆ３配列のポリヌクレオチドの３’末端を起点として、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーによるＤＮＡ鎖の合成は、ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーによって先に合成されたＤＮＡ鎖を剥がしながら進行する。
（ｄ）Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーにより合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが２本鎖となる。
（ｅ）一方、Ｆ３_{ｍｓ１－１}プライマーによるＤＮＡ鎖合成の際に剥がされたＤＮＡ鎖（ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーにより合成されたＤＮＡ鎖）は、１本鎖ＤＮＡとなる。当該１本鎖ＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的なＦ１ｃ領域及びＦ１領域を持ち、自己アニールを起こしてループを形成する。
（ｆ）上述の（ｅ）においてループが形成された１本鎖ＤＮＡ鎖（Ｂ２ｃ領域）に対し、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーのＢ２配列のポリヌクレオチドがアニーリングする。そして、Ｂ２配列のポリヌクレオチド（ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー）の３’末端を起点として相補的なＤＮＡの合成が行われ、（ｅ）で形成されたループは剥がされて伸びる。ＤＮＡにアニーリングしているＢＩＰ_{ｍｓ１－１}（Ｂ２配列のポリヌクレオチド）の外側において、Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーのＢ３配列のポリヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡ鎖（Ｂ３ｃ領域）にさらにアニーリングする（なお、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーによるＤＮＡ合成が完了している場合には、１本鎖ＤＮＡは２本鎖ＤＮＡになっている。）。Ｂ３配列のポリヌクレオチドの３’末端を起点として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの働きにより、１本鎖ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が合成される。Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーによるＤＮＡ鎖の合成は、ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマーにより先に合成されたＤＮＡ鎖を剥がしながら進行する。
（ｇ）Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーにより合成されたＤＮＡ鎖と１本鎖ＤＮＡが２本鎖となる。
（ｈ）一方、Ｂ３_{ｍｓ１－１}プライマーによるＤＮＡ鎖合成の際に剥がされたＤＮＡ鎖（ＢＩＰ_{ｍｓ１－１}により合成されるＤＮＡ鎖）は、両端に相補的な配列を持つため、自己アニールしてループを形成してダンベル様の構造となる。
（ｉ）上述の（ｈ）で形成されたダンベル様構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー（Ｆ２配列のヌクレオチド）およびそれに続くＢＩＰ_{ｍｓ１－１}プライマー（Ｂ２配列のヌクレオチド）のアニーニングを介したＤＮＡ増幅サイクルが進行する。

【0064】

増幅処理におけるインキュベート時間は、例えば６０分とすることができる。ＬＡＭＰ法におけるアニーリング反応およびＤＮＡ鎖合成により、当該インキュベートの間にＤＮＡ（核酸）を、例えば、１０^９～１０^１０倍に増幅させることが可能である。

【0065】

（２）増幅産物の検出処理は、上記（１）ＬＡＭＰ法による核酸増幅処理で得られる増幅産物を検出する処理である。当該検出処理により増幅産物が検出できれば、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していたと判断することができる。一方、当該検出処理により増幅産物が検出できなければ、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していなかったと判断することができる

【0066】

（２）増幅産物の検出処理には、公知の方法を用いることができるが、例えば、蛍光目視検出を用いることができる。蛍光目視検出は、蛍光目視試薬を添加して増幅産物と反応させ、目視にて反応液の色を確認する方法である。具体的には反応液が蛍光を発していれば陽性、すなわち増幅産物が検出できており、蛍光を発していなければ陰性、すなわち増幅産物が検出できていないと判断することができる。

【0067】

蛍光目視試薬としては、例えば、栄研化学社から市販されているＬｏｏｐａｍｐ 蛍光・目視検出試薬を用いることができる。反応液の蛍光は、紫外線照射装置により、より明確に陽性と陰性の違いを判断することができる。

【0068】

なお、（２）増幅産物の検出処理は、蛍光目視検出に限定されるものではない。例えば、増幅の副産物として生じるピロリン酸マグネシウムの影響により増幅反応液は白濁するが、このときの増幅反応液の濁度を測定することによって核酸増幅の有無を検出するようにしてもよい。また、上述した（２）増幅産物の検出処理では、上述した（１）ＬＡＭＰ法による核酸増幅処理が完了した後に蛍光目視試薬を増幅反応液に添加しているが、反応産物による汚染を抑制するには、（１）ＬＡＭＰ法による核酸増幅処理の過程で反応液に添加することが好ましい。

【0069】

（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態について説明する。

【0070】

本実施形態は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出することができるプライマー対に関し、雄性不稔遺伝子ｍｓ１のうち、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することができるプライマー対に関する。

【0071】

本実施形態において、プライマー対とは、二本鎖ＤＮＡの一方の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマー」という）と、二本鎖ＤＮＡの他方の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマー」という）の２つのプライマーから構成される一対のプライマーを指す。プライマー対は、ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法）による核酸増幅に用いられる。

【0072】

なお、本実施形態において、ＰＣＲ法による核酸増幅は、少なくとも一対のプライマー（つまり、一つのプライマー対）を用いて行われればよく、一対のプライマーに加えて、当該プライマーとは異なる別のプライマー（例えば、後述する蛍光用プライマーや、後述するＳＳＲプライマー）が用いられてもよい。

【0073】

本実施形態のプライマー対は、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の塩基配列のうち、少なくとも第２９０番目から第３７９番目までの領域（以下、「領域２９０－３７９」ともいう）を増幅可能な一対のプライマーである。図６に、領域２９０－３７９を示す。図６に示すように、領域２９０－３７９には、第１突然変異が生じた箇所が含まれる。なお、図６に示す塩基配列は、図２に示す塩基配列と同様に、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の塩基配列である。

【0074】

本実施形態のプライマー対を構成するＦ_{ｍｓ１－１}プライマーとＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、少なくとも領域２９０－３７９を増幅可能なものであればよく、塩基の配列順序や塩基配列の長さやアニーリングする位置などについて特に限定されるものではない。

【0075】

一例として、本実施形態のプライマー対は、図６や図７（ａ）に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１における異なる２つの領域（５’末端側から順に、Ｆ_ｐ１領域，Ｒ_ｐ１ｃ領域）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順に、Ｒ_ｐ１領域，Ｆ_ｐ１ｃ領域）を考慮して設計することができる。ここで、Ｆ_ｐ１領域は、図６や図７（ａ）に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第２９０番目から第３１３番目までの領域であり、Ｆ_ｐ１ｃ領域は、Ｆ_ｐ１領域に相補な領域である。一方、Ｒ_ｐ１ｃ領域は、図６や図７（ａ）に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第３６５番目から第３９２番目までの領域であり、Ｒ_ｐ１領域は、Ｒ_ｐ１ｃ領域に相補な領域である。

【0076】

Ｆ_ｐ１領域（Ｆ_ｐ１ｃ領域）やＲ_ｐ１領域（Ｒ_ｐ１ｃ領域）を考慮して本実施形態のプライマー対を設計する場合、Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、図７（ａ）に示すように、Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成することができる。Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｆ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ１領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｆ_ｐ１領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0077】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１に対する特異性を向上する観点から、Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、下記表６に示すように、配列表の配列番号１０に示すＦ_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されるプライマーが好ましい。配列番号１０に示すＦ_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されるＦ_{ｍｓ１－１}プライマーは、図６から理解できるように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ１領域の３’末端から３番目の塩基が、シトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に変更されていること以外、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ１領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１０に示すＦ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、２４個の塩基からなる。

【表6】

【0078】

一方、Ｆ_ｐ１領域（Ｆ_ｐ１ｃ領域）やＲ_ｐ１領域（Ｒ_ｐ１ｃ領域）を考慮して本実施形態のプライマー対を設計する場合、Ｒプライマー_{ｍｓ１－１}は、図７（ａ）に示すように、Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドから構成することができる。Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｒ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ１領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｒ_ｐ１領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0079】

具体的なＲ_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、例えば、下記表７に示すように、配列表の配列番号１１に示すＲ_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されるプライマーを挙げることができる。配列番号１１に示すＲ_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されるＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ１領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１１に示すＲ_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、２８個の塩基からなる。

【0080】

【表7】

【0081】

表６に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーと表７に示すＲ_{ｍｓ１－１}プライマーから構成されるプライマー対を用いて、ＰＣＲ法による核酸増幅を行うと、Ｆ_ｐ１領域（Ｆ_ｐ１ｃ領域）とＲ_ｐ１領域（Ｒ_ｐ１ｃ領域）を含むこれらに挟まれた領域が増幅される。そして増幅される領域には、領域２９０－３７９が含まれる。

【0082】

本実施形態のプライマー対は、少なくとも領域２９０－３７９を増幅可能なものであればよく、上述した例に限定されない。

【0083】

他の例として、本実施形態のプライマー対は、図６や図７（ｂ）に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１における異なる２つの領域（５’末端側から順に、Ｆ_ｐ２領域，Ｒ_ｐ２ｃ領域）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順に、Ｒ_ｐ２領域，Ｆ_ｐ２ｃ領域）を考慮して設計することができる。ここで、Ｆ_ｐ２領域は、図６や図７（ｂ）に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第２３４番目から第２５６番目までの領域であり、Ｆ_ｐ２ｃ領域は、Ｆ_ｐ２領域に相補な領域である。一方、Ｒ_ｐ２ｃ領域は、図６や図７に示すように、配列表の配列番号１に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の第３５７番目から第３７９番目までの領域であり、Ｒ_ｐ２領域は、Ｒ_ｐ２ｃ領域に相補な領域である。

【0084】

Ｆ_ｐ２領域（Ｆ_ｐ２ｃ領域）やＲ_ｐ２領域（Ｒ_ｐ２ｃ領域）を考慮して本実施形態のプライマー対を設計する場合、Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーは、図７（ｂ）に示すように、Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドからなるプライマーから構成することができる。Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ２領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｆ_ｐ２領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0085】

具体的なＦ_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、例えば、下記表８に示すように、配列表の配列番号１２に示すＦ_ｐ２配列のポリヌクレオチドで構成されるプライマーを挙げることができる。配列番号１２に示すＦ_ｐ２配列のポリヌクレオチドで構成されるＦ_{ｍｓ１－１}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ２領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１２に示すＦ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、２３個の塩基からなる。

【表8】

【0086】

一方、Ｆ_ｐ２領域（Ｆ_ｐ２ｃ領域）やＲ_ｐ２領域（Ｒ_ｐ２ｃ領域）を考慮して本実施形態のプライマー対を設計する場合、Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマーは、図７（ｂ）に示すように、Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドから構成することができる。Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ２領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｒ_ｐ２領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0087】

具体的なＲ_{ｍｓ１－１}プライマーとしては、例えば、下記表９に示すように、配列表の配列番号１３に示すＲ_ｐ２配列のポリヌクレオチドで構成することができる。配列番号１３に示すＲ_ｐ２配列のポリヌクレオチドで構成されるＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ２領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１３に示すＲ_ｐ２配列のポリヌクレオチドは、２３個の塩基からなる。

【0088】

【表9】

【0089】

表８に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーと表９に示すＲ_{ｍｓ１－１}プライマーから構成されるプライマー対を用いて、ＰＣＲ法による核酸増幅を行うと、Ｆ_ｐ２領域（Ｆ_ｐ２ｃ領域）とＲ_ｐ２領域（Ｒ_ｐ２ｃ領域）を含むこれらに挟まれた領域が増幅される。そして増幅される領域には、領域２９０－３７９が含まれる。

【0090】

ここで、表６～９に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーやＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の特定領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのみより構成されている。しかしながら、Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーやＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の特定領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのみにより構成される必要はなく、当該ポリヌクレオチドの５’末端側に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （２０１２） １２, ４５６-４６３（以下、「非特許文献２」という）に記載されるｔａｉｌ配列（ｔａｉｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のポリヌクレオチドが連結されたものであってもよい。Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーとＲ_{ｍｓ１－１}プライマーのいずれか一方に、前述したｔａｉｌ配列のポリヌクレオチドが含まれている場合、非特許文献２記載される方法に基づいて、ＰＣＲ法による核酸増幅を行うことで、蛍光標識された増幅産物を得ることができる。蛍光標識された増幅産物が得られれば、その検出が容易になる。

【0091】

非特許文献２に基づいて蛍光標識された増幅産物を得るには、本実施形態のプライマー対（Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマー又はＦ_{ｍｓ１－１}プライマーには、ｔａｉｌ配列のポリヌクレオチドが含まれている）に加えて、ｔａｉｌ配列のポリヌクレオチドの５’末端に蛍光標識（例えば、ＦＡＭ（６－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ））が付加された蛍光用プライマーが用いられる。蛍光標識された増幅産物を取得するための具体的なプライマーとしては、例えば、下記表１０に示す３つのプライマーを挙げることができる。下記表１０に示すプライマーのうち、Ｆ_{ｍｓ１－１}プライマーとＲ_{ｍｓ１－１}プライマーが本実施形態のプライマー対である。

【0092】

【表10】

【0093】

上記表１０に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーは、上記表８に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーと同じプライマーであり、Ｆ_ｐ２配列のポリヌクレオチドで構成されている。このため、上記表１０に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＦ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズする。一方、上記表１０に示すＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、上記表９に示すＲ_ｐ２配列のポリヌクレオチドの５’末端にｔａｉｌ配列のポリヌクレオチドが連結されていること以外、上記表９に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーと同じプライマーである。このため、上記表１０に示すＲ_{ｍｓ１－１}プライマーは、ｔａｉｌ配列を除く領域（つまり、Ｒ_ｐ２配列のポリヌクレオチド）が、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１のＲ_ｐ２ｃ領域にハイブリダイズする。これらの上記表１０に示すＦ_{ｍｓ１－１}プライマーとＲ_{ｍｓ１－１}プライマー（本実施形態のプライマー対）を用いてＰＣＲ法による核酸増幅を行うと、Ｆ_ｐ２領域（Ｆ_ｐ２ｃ領域）とＲ_ｐ２領域（Ｒ_ｐ２ｃ領域）を含むこれらに挟まれた領域に加えてｔａｉｌ配列も増幅される。そして、ｔａｉｌ配列を含む増幅産物が、蛍光用プライマーでさらに増幅されていくことで、蛍光標識された増幅産物が得られる。

【0094】

以上説明した本実施形態のプライマー対によれば、少なくとも、領域２９０－３７９の核酸が増幅できる。領域２９０－３７９には、上述したように、第１突然変異が生じた箇所が含まれるため、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を鋳型として増幅される増幅産物（以下、「増幅産物ｍｓ１－１」ともいう）の塩基配列は、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１を鋳型として増幅される増幅産物（以下、「増幅産物Ｍｓ１」ともいう）や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を鋳型として増幅される増幅産物（以下、「増幅産物ｍｓ１－２」ともいう）の塩基配列よりも４塩基分短くなる。従って、検体の増幅産物の長さを、増幅産物ｍｓ１－１の塩基配列の長さや、増幅産物Ｍｓ１の塩基配列の長さや、増幅産物ｍｓ１－２の長さと比較することで、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することができる。

【0095】

なお、本実施形態のプライマー対は、第１突然変異（４塩基の欠失）が生じている箇所が含まれる領域（以下、「４塩基欠失領域」ともいう）にハイブリダイズするプライマーを含むものであってもよい。４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の核酸を増幅することができるが、４塩基欠失領域を含まない雄性可稔遺伝子Ｍｓ１や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２には、ハイブリダイズすることができない。つまり、４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む本実施形態のプライマー対は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を鋳型として核酸を増幅できるが、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を鋳型として核酸を増幅することができない（又は、核酸を増幅できてもその増幅量が少ない）。従って、本実施形態のプライマー対が、４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含んでいる場合には、増幅産物の有無（又は増幅量の違い）に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することもできる。

【0096】

次に、本実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出する方法を具体的に説明する。

【0097】

雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出方法は、（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理と（２）増幅産物の検出処理を含んでいる。

【0098】

（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理は、本実施形態のプライマー対を用いて、ＰＣＲ法により検体の核酸を増幅する処理である。ＰＣＲ法により検体の核酸を増幅する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社から市販されているＱＩＡＧＥＮ（登録商標、以下同じ） Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載される条件）を用いることができる。一例としては、以下の方法を用いることができる。

【0099】

まず、反応試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）、反応用バッファー（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）、プライマー対、蒸留水）を混合し、増幅反応液を調製する。プライマー対を除く反応試薬には、２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等のＰＣＲ試薬キットを用いてもよい。 ２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは、以下の成分により構成されている。

【0100】

２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（ＤＮＡポリメラーゼ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）、ＭｇＣｌ_２等。

【0101】

次に、当該増幅反応液に検体（つまり、スギ）のＤＮＡを加え、インキュベートする。なお、スギからＤＮＡを抽出する方法は、第１実施形態で説明した方法と同様である。

【0102】

ここで、ＰＣＲ法による核酸増幅は、例えば、次の（ｊ）～（ｍ）の過程で進行する。
（ｊ）ＤＮＡを変性させて、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離する。
（ｋ）解離した１本鎖ＤＮＡのそれぞれに本実施形態に係る各プライマーがアニーリングする。
（ｌ）ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、各プライマーの３’末端を起点として、１本鎖ＤＮＡに相補なＤＮＡ鎖が合成される。
（ｍ）上述の（ｊ）～（ｌ）の過程を所定サイクル繰り返すことで、プライマーがアニーリングした領域間（プライマーがアニーリングした領域を含む、これらに挟まれた領域）の核酸が増幅される。

【0103】

インキュベートの条件は、従来公知の条件を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、上記（ｊ）の過程では、インキュベートの温度は、９４℃～９５℃とすることができ、インキュベートの時間は、１５秒から３０秒とすることができる。また、例えば、上記（ｋ）の過程では、インキュベートの温度は、５５℃～６３℃とすることができ、インキュベートの時間は、３０秒から９０秒とすることができる。また、例えば、上記（ｌ）の過程では、インキュベートの温度は、６５℃～７２℃とすることができ、インキュベートの時間は、１５秒から９０秒とすることができる。

【0104】

以上の方法により、（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理を行うことができる。なお、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理では、後述する（２）増幅産物の検出処理を容易にするため、蛍光標識された増幅産物を取得してもよい。蛍光標識された増幅産物の取得方法は、特に限定されるものではなく、例えば、非特許文献２記載される方法に基づき、ＰＣＲ法による核酸増幅を行い、蛍光標識された増幅産物を取得してもよい。

【0105】

非特許文献２の記載される方法に基づいて蛍光標識された増幅産物を得るには、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理において、本実施形態のプライマー対（Ｒ_{ｍｓ１－１}プライマー又はＦ_{ｍｓ１－１}プライマーの５’末端側にｔａｉｌ配列が含まれているプライマー対）と、ｔａｉｌ配列の５’末端側に蛍光標識が付加された蛍光用プライマーの３つのプライマーを用いて核酸増幅を行う。蛍光標識された増幅産物を得るための３つのプライマーの一例は、表１０に記載している。

【0106】

蛍光標識された増幅産物を得るためのＰＣＲの条件は、蛍光用プライマーをさらに増幅反応液に添加すること以外、上述したＰＣＲ法と同様であるため、詳細な説明は省略する。

【0107】

（２）増幅産物の検出処理は、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理で得られる増幅産物（以下、「検体の増幅産物」ともいう）を検出する処理である。当該検出処理により検出される増幅産物の長さを、増幅産物ｍｓ１－１や増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－２の長さと比較することで、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することができる。

【0108】

ここで、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物ｍｓ１－１の長さと同等であれば、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していると判断することができ、一方で、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物ｍｓ１－１の長さよりも長ければ、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していないと判断することができる。また、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－２の長さと同等であれば、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していないと判断することができ、一方で、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－２の長さよりも短ければ、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していると判断することができる。

【0109】

増幅産物を検出し、検出された増幅産物の塩基配列の長さを比較するには、例えば、キャピラリー電気泳動システム（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０）を用いることができる。キャピラリー電気泳動システムによれば、増幅産物の長さを示すエレクトロフェログラムが得られるため、増幅産物の長さの比較が容易になる。キャピラリー電気泳動システムを用いる場合、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理において蛍光標識された増幅産物を取得し、この蛍光標識された増幅産物を用いることが好ましい。

【0110】

キャピラリー電気泳動システムを用いる場合には、例えば、次の方法を用いることができる。まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されているＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標、以下同じ） ６００ ＬＩＺ ｄｙｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｖ２．０の０．２μｌとＨｉＤｉ ホルムアミドの９μｌとを混合してローディングバッファーとする。次いで希釈したＰＣＲ増幅産物の１μｌをローディングバッファー９μｌに加えサンプルを混合し、９５℃で変性する。そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標、以下同じ） ３１３０ジェネティックアナライザーにロードする。そして、標準的なフラグメント解析条件を使用することで、増幅産物の長さを示すエレクトロフェログラムが得られる。

【0111】

なお、上述した方法では、上記（２）増幅産物の検出処理において、検体の増幅産物の長さに基づいて雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出していたが、この方法に限定されるものではない。

【0112】

上述したように、本実施形態のプライマー対を構成する各プライマーは、第１突然変異が生じている箇所を含む４塩基欠失領域にハイブリダイズすることもできる。４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む本実施形態のプライマー対は、４塩基欠失領域を含む雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の核酸を増幅することができるが、４塩基欠失領域を含まない雄性可稔遺伝子Ｍｓ１や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の核酸を増幅することができない。このため、４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む本実施形態のプライマー対を用いる場合には、増幅産物の有無（又は増幅量の違い）に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出することもできる。

【0113】

増幅産物の有無（又は増幅量の違い）を確認するには、例えば、泳動用ゲルを用いて電気泳動を行い、電気泳動後に泳動物（増幅産物）を可視化する方法を用いることができる。この方法によれば、可視化処理により泳動物（増幅産物）が可視化されれば、その検体は雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していると判断することができ、可視化処理により泳動物が可視化されなければ、その検体は雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していないと判断することができる。

【0114】

電気泳動に用いられる泳動用ゲルは、特に制限されず、公知のゲルを使用することができ、例えば、アガロースゲルを用いることができる。アガロースの濃度は、例えば、ゲル１００質量％に対して、１．０～３．０質量％とすることができる。

【0115】

泳動用ゲル中のＤＮＡを可視化する方法は、特に限定されず、例えば、ＤＮＡを染色する染色試薬を用いることができる。例えば、染色試薬としてＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を用いた場合には、紫外線を照射することで蛍光を発する。

【0116】

泳動物（増幅産物）の確認は、バンドを目視で確認することで行ってもよく、バンドを画像化して確認することで行ってもよい。

【0117】

電気泳動を用いる具体的な方法としては、例えば、増幅産物と染色試薬を混合した混合液を用いて、アガロースゲルによる電気泳動を行い、ＵＶランプ下で可視化されたＤＮＡのバンドを観察する方法が挙げられる。電気泳動の電圧は、例えば、５０～１００Ｖとすることができ、試験の簡便性の観点から１００Ｖとすることが好ましい。電気泳動を行う時間は、例えば、２０～１２０分とすることができる。

【0118】

ここで、本実施形態のプライマー対が４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む場合、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有していない検体の核酸を増幅することができないため、上記（２）増幅産物の検出処理において泳動物（増幅産物）が確認できない。しかしながら、このような場合には、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理が適切に行われていないことを理由に、泳動物（増幅産物）が確認できなかった可能性も考えられる。

【0119】

このため、本実施形態のプライマー対が４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む場合には、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理が適切に行われた否かを判断するため、本実施形態のプライマー対（４塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む）に加え、雄性不稔遺伝子ｍｓ１の有無に関わらずスギが普遍的に有している塩基配列を増幅可能なプライマー対を用いて、マルチプレックスＰＣＲ法による核酸増幅を行うことが好ましい。なお、マルチプレックスＰＣＲ法とは、一つのＰＣＲ反応系において３個以上のプライマーを使用し、ＤＮＡの異なる複数の領域を同時に増幅する方法である。

【0120】

本実施形態のプライマー対とともに用いられる上述したプライマー対としては、例えば、スギのＤＮＡ中に広く散在する単純反復配列（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ； ＳＳＲ）を増幅可能なプライマー対（以下、「ＳＳＲプライマー対」ともいう）や、スギの葉緑体ＤＮＡに含まれる配列を増幅可能なプライマー対（以下、「葉緑体プライマー対」ともいう）を挙げることができる。

【0121】

ＳＳＲプライマー対や葉緑体プライマー対による核酸増幅は、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有しているか否かに関わらず進行する。このため、本実施形態のプライマー対とともに、これらのプライマー対（ＳＳＲプライマー対や葉緑体プライマー対）を用いてマルチプレックスＰＣＲ法による核酸増幅を行う場合には、これらのプライマー対によって得られる増幅産物の有無を、上記（１）ＰＣＲ法による核酸増幅処理が適切に行われたかを判断するための指標とすることができ、一方で、本実施形態のプライマー対によって得られる増幅産物の有無を、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有しているか否かの指標とすることができる。

【0122】

好ましいＳＳＲプライマー対としては、例えば、下記表１１に示すように、配列表の配列番号２５に示すＦ_ＳＳＲプライマーと配列番号２６に示すＲ_ＳＳＲプライマーを挙げることができる。

【0123】

【表11】

【0124】

なお、ＳＳＲプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲ法により核酸増幅する方法は、増幅反応液にさらにＳＳＲプライマーをさらに添加すること以外、上述したＰＣＲ法と同様であるため、詳細な説明は省略する。

【0125】

（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態について説明する。

【0126】

本実施形態は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出することができるＬＡＭＰプライマーセットに関する。本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットによれば、雄性不稔遺伝子ｍｓ１のうち、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出することができる。

【0127】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}」ともいう。）と、Ｂａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＢＩＰ_{ｍｓ１－２}」ともいう。）と、Ｆ３_{ｍｓ１－２}プライマーと、Ｂ３_{ｍｓ１－２}プライマーの４種のプライマーを有している。

【0128】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットに含まれる４種のプライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２における異なる６つの領域（５’末端側から順に、Ｆ’３領域，Ｆ’２領域，Ｆ’１領域，Ｂ’１ｃ領域，Ｂ’２ｃ領域，Ｂ’３ｃ領域）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順に、Ｂ’３領域，Ｂ’２領域，Ｂ’１領域，Ｆ’１ｃ領域，Ｆ’２ｃ領域，Ｆ’３ｃ領域）を考慮して設計されている。

【0129】

本実施形態において、Ｆ’３領域は、図３や図８に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第１９６４番目から第１９８２番目までの領域であり、Ｆ’３ｃ領域は、Ｆ’３領域に相補な領域である。Ｆ’２領域は、図３や図８に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第１９８３番目から第２０００番目までの領域であり、Ｆ’２ｃ領域は、Ｆ’２領域に相補な領域である。Ｆ’１領域は、図３や図８に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第２０２３番目から第２０４４番目までの領域であり、Ｆ’１ｃ領域は、Ｆ’１領域に相補な領域である。

【0130】

一方、Ｂ’１ｃ領域は、図３や図８に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第２０４６番目から第２０６９番目までの領域であり、Ｂ’１領域は、Ｂ’１ｃ領域に相補な領域である。Ｂ’２ｃ領域は、図３や図８に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第２１０５番目から第２１２９番目までの領域であり、Ｂ’２領域は、Ｂ’２ｃ領域に相補な領域である。Ｂ’３ｃ領域は、図３や図８に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第２１３０番目から第２１４９番目までの領域であり、Ｂ’３領域は、Ｂ’３ｃ領域に相補な領域である。

【0131】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーは、図８に示すように、５´末端側からＦ’１ｃ配列のポリヌクレオチドとＦ’２配列のポリヌクレオチドが連結してなるプライマーである。Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、Ｆ’２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。ここで、Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１領域には、第２突然変異（３０塩基欠失）が生じた箇所が含まれる。

【0132】

Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１ｃ領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｆ’１ｃ領域と異なる塩基配列であってもよい。同様に、Ｆ’２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｆ’２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’２領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｆ’２領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0133】

具体的なＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーとしては、下記表１２に示すように、配列表の配列番号１６に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号１６に示す塩基配列のＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーでは、Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１ｃ領域と同一の塩基配列を有しており、Ｆ’２配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’２領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１６に示すＦＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーは、４０個の塩基で構成されており、５’末端側から１番目から２２番目までの塩基がＦ’１ｃ配列のポリヌクレオチドであり、５’末端側から２３番目から４０番目までの塩基がＦ’２配列のポリヌクレオチドである。

【0134】

【表12】

【0135】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、ＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーは、図８に示すように、５’末端側からＢ’１ｃ配列のポリヌクレオチドとＢ’２配列のポリヌクレオチドが連結してなるプライマーである。Ｂ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’１領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、Ｂ’２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。

【0136】

Ｂ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’１領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｂ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’１ｃ領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｂ’１ｃ領域と異なる塩基配列であってもよい。同様に、Ｂ’２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’２ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｂ’２配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’２領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｂ’２領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0137】

具体的なＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーとしては、下記表１３に示すように、配列表の配列番号１５に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号１５に示す塩基配列のＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーでは、Ｂ’１ｃ配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’１ｃ領域と同一の塩基配列を有しており、Ｂ’２配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’２領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１５に示すＢＩＰ_{ｍｓ１－２}プライマーは、４９個の塩基から構成されており、５’末端から１番目から２４番目までの塩基がＢ’１ｃ配列のポリヌクレオチドであり、５’末端から２５番目から４９番目までの塩基がＢ’２配列のポリヌクレオチドである。

【0138】

【表13】

【0139】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、Ｆ３_{ｍｓ１－２}プライマーは、図８に示すように、Ｆ’３配列のポリヌクレオチドからなるプライマーである。Ｆ’３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｆ’３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’３ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、塩基の配列順序について特に限定されるものではない。例えば、Ｆ’３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’３領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｆ’３領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0140】

具体的なＦ３_{ｍｓ１－２}プライマーとしては、下記表１４に示すように、配列表の配列番号１７に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号１７に示す塩基配列のＦ３_{ｍｓ１－２}プライマーでは、Ｆ’３配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’３領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１７に示すＦ３_{ｍｓ１－２}プライマーにおいて、Ｆ’３配列のポリヌクレオチドは、１９個の塩基からなる。

【0141】

【表14】

【0142】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、Ｂ３_{ｍｓ１－２}プライマーは、図８に示すように、Ｂ’３配列のポリヌクレオチドからなるプライマーである。Ｂ’３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’３ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｂ’３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’３ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、その塩基配列や配列の長さについて特に限定されるものではない。例えば、Ｂ’３配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’３領域と同一の塩基配列であってもよく、Ｂ’３領域と異なる塩基配列であってもよい。

【0143】

具体的なＢ３_{ｍｓ１－２}プライマーとしては、下記表１５に示すように、配列表の配列番号１８に示す塩基配列のポリヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。配列番号１８に示す塩基配列のＢ３_{ｍｓ１－２}プライマーでは、Ｂ’３配列のポリヌクレオチドが雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＢ’３領域と同一の塩基配列を有している。なお、下記表１２に示すＢ３_{ｍｓ１－２}プライマーにおいて、Ｂ’３配列のポリヌクレオチドは、２０個の塩基からなる。

【0144】

【表15】

【0145】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットは、上述したＦＩＰ_{ｍｓ１－２}、ＢＩＰ_{ｍｓ１－２}、Ｆ３_{ｍｓ１－２}プライマー及びＢ３_{ｍｓ１－２}プライマーを１つずつ有するプライマーセットであり、その組み合わせについては特に限定されない。一方、核酸の増幅効率が向上する観点からは、本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットは、下記表１６に示す４種のプライマーを有することが好ましい。

【0146】

【表16】

【0147】

以上説明した本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットにおいて、ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}のＦ’１ｃ配列のポリヌクレオチドは、第２突然変異（３０塩基欠失）が生じている雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１領域にハイブリダイズする。このため、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有する検体の核酸増幅を試みると、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’１領域にＦＩＰ（Ｆ’１ｃ配列のポリヌクレオチド）がハイブリダイズし、ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}を介した核酸増幅が進行する。一方で、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有していない検体（雄性可稔遺伝子Ｍｓ１や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有する検体）の核酸増幅を試みると、ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}のＦ’１ｃ配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズするＦ’１領域が存在しないため、ＦＩＰ_{ｍｓ１－２}を介した核酸増幅が進行しない。このため、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有している場合には、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の一部の領域（具体的には、Ｂ２領域とＦ２領域を含む、これらに挟まれる領域。）の核酸が増幅されるが、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有していない場合には、核酸が増幅されない。従って、実施形態のＬＡＭＰプライマーセットによれば、この核酸増幅の可否に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出することができる。

【0148】

本実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出する方法は、第１実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出する方法と同様であるため、詳細な説明は省略する。

【0149】

（第４実施形態）
次に、本発明の第４実施形態について説明する。

【0150】

本実施形態は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１を検出することができるプライマー対に関する。本実施形態のプライマー対によれば、雄性不稔遺伝子ｍｓ１のうち、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出することができる。

【0151】

本実施形態において、プライマー対とは、二本鎖ＤＮＡの一方の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマー」という）と、二本鎖ＤＮＡの他方の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「Ｒ_{ｍｓ１－２}プライマー」という）の２つのプライマーから構成される一対のプライマーを指す。プライマー対は、ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法）による核酸増幅に用いられる。

【0152】

本実施形態のプライマー対は、少なくとも配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の塩基配列の第１９６６番目から第２０６７番目までの領域（以下、「領域１９６６－２０６７」ともいう）を増幅可能な一対のプライマーである。図９に、領域１９６６－２０６７を示す。図９に示すように、領域１９６６－２０６７には、第２突然変異が生じた箇所が含まれる。なお、図９に示す塩基配列は、図３に示す塩基配列と同様に、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の塩基配列である。

【0153】

本実施形態のプライマー対を構成するＦ_{ｍｓ１－２}プライマーやＲ_{ｍｓ１－２}プライマーは、少なくとも領域１９６６－２０６７を増幅可能なものであればよく、塩基の配列順序や塩基配列の長さやアニーリングする位置などについて特に限定されるものではない。

【0154】

一例として、本実施形態のプライマー対は、図９や図１０に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２における異なる２つの領域（５’末端側から順に、Ｒ’_ｐ１領域，Ｆ’_ｐ１ｃ領域）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順に、Ｆ’_ｐ１領域，Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を考慮して設計することができる。ここで、Ｆ’_ｐ１ｃ領域は、図９や図１０に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第２０４５番目から第２０６７番目までの領域であり、Ｆ’_ｐ１領域は、Ｆ’_ｐ１ｃ領域に相補な領域である。一方、Ｒ’_ｐ１領域は、図９や図１０に示すように、配列表の配列番号１４に示す雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の第１９６６番目から第１９８８番目までの領域であり、Ｒ’_ｐ１ｃ領域は、Ｒ’_ｐ１領域に相補な領域である。

【0155】

Ｆ’_ｐ１領域（Ｆ’_ｐ１ｃ領域）やＲ’_ｐ１領域（Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を考慮して本実施形態のプライマー対を設計する場合、Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマーは、図１０に示すように、Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成することができる。Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’_ｐ１領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｆ’_ｐ１領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0156】

Ｆ’_ｐ１領域（Ｆ’_ｐ１ｃ領域）やＲ’_ｐ１領域（Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を考慮して設計される具体的なＦ_{ｍｓ１－２}プライマーは、例えば、下記表１７に示すように、配列表の配列番号１９に示すＦ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成することができる。配列番号１９に示すＦ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されるＦ_{ｍｓ１－２}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’_ｐ１領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号１９に示すＦ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、２３個の塩基からなる。

【表17】

【0157】

一方、Ｆ’_ｐ１領域（Ｆ’_ｐ１ｃ領域）やＲ’_ｐ１領域（Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を考慮して本実施形態のプライマー対を設計する場合、Ｒ_{ｍｓ１－２}プライマーは、図１０に示すように、Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドから構成することができる。Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＲ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＲ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズ可能であればよく、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＲ’_ｐ１領域と同一の塩基配列とすることもでき、Ｒ’_ｐ１領域と異なる塩基配列とすることもできる。

【0158】

Ｆ’_ｐ１領域（Ｆ’_ｐ１ｃ領域）やＲ’_ｐ１領域（Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を考慮して設計される具体的なＲ_{ｍｓ１－２}プライマーとしては、例えば、下記表１８に示すように、配列表の配列番号２０に示すＲ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成することができる。配列番号２０に示すＲ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されるＲ_{ｍｓ１－２}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＲ’_ｐ１領域と同一の塩基配列を有している。なお、配列番号２０に示すＲ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドは、２３個の塩基からなる。

【0159】

【表18】

【0160】

表１７に示すＦ_{ｍｓ１－２}プライマーと表１８に示すＲ_{ｍｓ１－２}プライマーから構成されるプライマー対を用いて、ＰＣＲ法による核酸増幅を行うと、Ｆ’_ｐ１領域（Ｆ’_ｐ１ｃ領域）とＲ’_ｐ１領域（Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を含むこれらに挟まれた領域が増幅される。そして増幅される領域には、領域１９６６－２０６７が含まれる。

【0161】

本実施形態のプライマー対は、少なくとも領域１９６６－２０６７を増幅可能なものであればよく、上述した例に限定されない。

【0162】

ここで、表１７～表１８に示すＦ_{ｍｓ１－２}プライマーやＲ_{ｍｓ１－２}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の特定領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのみより構成されていた。しかしながら、Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマーやＲ_{ｍｓ１－２}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の特定領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのみにより構成される必要はなく、当該ポリヌクレオチドの５’末端側に、上述したｔａｉｌ配列のポリヌクレオチドが連結されたものであってもよい。Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマーとＲ_{ｍｓ１－２}プライマーのいずれか一方にｔａｉｌ配列のポリヌクレオチドが含まれている場合、第２実施形態のプライマー対と同様に、非特許文献２の記載される方法に基づき、蛍光標識された増幅産物を得ることができる。

【0163】

非特許文献２に基づいて蛍光標識された増幅産物を得るための具体的なプライマーとしては、例えば、下記表１９に示す３つのプライマーを挙げることができる。下記表１９に示すプライマーのうち、Ｆ_{ｍｓ１－２}プライマーとＲ_{ｍｓ１－２}プライマーが本実施形態のプライマー対である。

【0164】

【表19】

【0165】

上記表１９に示すＦ_{ｍｓ１－２}プライマーは、５’末端にｔａｉｌ配列を有していること以外、上記表１７に示すＦ_{ｍｓ１－２}プライマーと同じプライマーである。このため、上記表１９に示すＦ_{ｍｓ１－２}プライマーは、Ｆ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドが、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＦ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズする。一方、上記表１９に示すＲ_{ｍｓ１－２}プライマーは、上記表１８に示すＲ_{ｍｓ１－２}プライマーと同じプライマーであり、Ｒ’_ｐ１配列のポリヌクレオチドで構成されている。このため、上記表１９に示すＲ_{ｍｓ１－２}プライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２のＲ’_ｐ１ｃ領域にハイブリダイズする。これらのＦ_{ｍｓ１－２}プライマーとＲ_{ｍｓ１－２}プライマー（本実施形態によればプライマー対）を用いてＰＣＲ法による核酸増幅を行うと、Ｆ’_ｐ１領域（Ｆ’_ｐ１ｃ領域）とＲ’_ｐ１領域（Ｒ’_ｐ１ｃ領域）を含むこれらに挟まれた領域に加えてｔａｉｌ配列も増幅される。そして、ｔａｉｌ配列を含む増幅産物が、蛍光用プライマーでさらに増幅されていくことで、蛍光標識された増幅産物が得られる。

【0166】

以上説明した本実施形態のプライマー対によれば、少なくとも、領域１９６６－２０６７の核酸が増幅できる。領域１９６６－２０６７には、上述したように、第２突然変異が生じた箇所が含まれるため、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を鋳型として増幅される増幅産物（以下、「増幅産物ｍｓ’１－２」ともいう）の塩基配列の長さは、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１を鋳型として増幅される増幅産物（以下、「増幅産物Ｍｓ’１」ともいう）の塩基配列の長さや、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を鋳型として増幅される増幅産物（以下、「増幅産物ｍｓ’１－１」ともいう）の塩基配列の長さよりも３０塩基分短くなる。従って、検体の増幅産物の長さを、増幅産物ｍｓ’１－２の塩基配列の長さや、増幅産物Ｍｓ’１の塩基配列の長さや、増幅産物ｍｓ’１－１と比較することで、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出することができる。

【0167】

なお、本実施形態のプライマー対は、第２突然変異（３０塩基の欠失）が生じている箇所を含む領域（以下、「３０塩基欠失領域」ともいう）にハイブリダイズするプライマーを含むものであってもよい。３０塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２に含まれる３０塩基欠失領域にハイブリダイズすることができるが３０塩基欠失領域を含まない雄性可稔遺伝子Ｍｓ１や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１には、ハイブリダイズすることができない。つまり、３０塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含む本実施形態のプライマー対は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を鋳型として核酸を増幅できるが、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１や雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を鋳型として核酸を増幅することができない（又は、核酸を増幅できてもその増幅量が少ない）。従って、本実施形態のプライマー対が、３０塩基欠失領域にハイブリダイズするプライマーを含んでいる場合には、増幅産物の有無（又は増幅量の違い）に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出することもできる。

【0168】

本実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出する方法は、第２実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出する方法と同様であるため、詳細な説明は省略する。

【0169】

なお、検体の増幅産物の長さを増幅産物ｍｓ１－２の長さと比較する場合、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物ｍｓ１－２の長さと同等であれば、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有していると判断することができ、一方で、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物ｍｓ１－２の長さよりも長ければ、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有していないと判断することができる。また、検体の増幅産物の長さを増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－１の長さと比較する場合、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－１の長さと同等であれば、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有していないと判断することができ、一方で、検体の増幅産物の塩基配列の長さが、増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－１の長さよりも短ければ、検体が雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有していると判断することができる。

【0170】

また、検体の増幅産物の長さを、増幅産物ｍｓ１－２の長さや増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－１の長さと比較する方法は、キャピラリー電気泳動システムを用いる上述した方法に限定されない。例えば、検体の増幅産物を、増幅産物ｍｓ１－２や増幅産物Ｍｓ１や増幅産物ｍｓ１－１とともに電気泳動し、泳動物（増幅産物）を可視化して、泳動距離から増幅産物の長さの比較を行ってもよい。なお、電気泳動の方法や泳動物（増幅産物）の可視化方法は、第２実施形態と同様であるため、詳細な説明は省略する。

【0171】

以上説明した実施形態１～４において、ＬＡＭＰプライマーセットやプライマー対を構成する各プライマーは、公知の方法で製造することができる。例えば、各プライマーは、公知の核酸合成法により化学的に合成して製造してもよく、また、ＤＮＡ合成装置で合成して製造してもよい。核酸合成法には、例えば、固相合成法（ホスホロアミダイト法）を用いることができる。固相合成法（ホスホロアミダイト法）は、例えば、Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H., Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis, Tetrahedron Letters, Vol 22, Pages 1859-1862, 1981年、に記載されている

【実施例】

【0172】

次に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

【0173】

［参考例１：雄性不稔遺伝子ｍｓ１の候補遺伝子の選定］
以下に示す方法により雄性不稔遺伝子ｍｓ１の候補遺伝子を特定した。

【0174】

＜試験材料＞
（ａ）雄性可稔スギＡの雄花
（ｂ）雄性可稔スギＢの雄花
（ｃ）雄性不稔スギＣと雄性可稔スギＢとの交配家系から「雄性可稔スギ」約５０個体程度の雄花
（ｄ）雄性不稔スギＣと雄性可稔スギＢとの交配家系から「雄性不稔スギ」約５０個体程度の雄花
（ｅ）雄性不稔スギＤと雄性可稔スギＢとの交配家系から「雄性可稔スギ」約５０個体程度の雄花
（ｆ）雄性不稔スギＤと雄性可稔スギＢとの交配家系から「雄性不稔スギ」約５０個体程度の雄花

【0175】

上記（ａ）の雄性可稔スギは、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国新潟県村上市鵜渡路で生育されている。上記（ｂ）の雄性可稔スギは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をヘテロ接合型で保有していることが知られており、日本国新潟県村上市鵜渡路で生育されている。上記（ｃ）の雄性可稔スギは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をヘテロ接合型で保有していることが知られており、日本国茨城県かすみがうら市上志筑で生育されている。上記（ｄ）の雄性不稔スギは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国茨城県かすみがうら市上志筑で生育されている。上記（ｅ）の雄性可稔スギは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をヘテロ接合型で保有していることが知られており、日本国茨城県かすみがうら市上志筑で生育されている。上記（ｆ）の雄性不稔スギは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国茨城県かすみがうら市上志筑で生育されている。試験材料は、例えば、非特許文献３：Moriguchi Y, Ueno S, Saito M, Higuchi Y, Miyajima D, Itoo S, Tsumura Y (2014) A simple allele-specific PCR marker for identifying male-sterile trees: Towards DNA marker-assisted selection in the Cryptomeria japonica breeding program. Tree Genetics & Genomes 10: 1069-1077においても言及されている。

【0176】

＜ＲＮＡ抽出＞
液体窒素内にて凍結させた上記試験材料（ａ）～（ｆ）を、ホモジナイザー（製品名：ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ、キアゲン社製）にて粉砕した。次いで、粉砕された各試験材料から、トータルＲＮＡの抽出をＣＴＡＢ抽出バッファー（le Provost G, Herrera R, Paiva JA, Chaumeil P, Salin F, et al. (2007) A micromethod for high throughput RNA extraction in forest trees. Biol Res, Vol 40: 291-297）により行い、クロロホルム・イソアミルアルコール（容量比 ２４：１）を加え、上層を他の容器に移した。この容器に、１／４量の塩化リチウム溶液（１０ｍｏｌ／ｌ）を加えてＲＮＡを沈澱させた。さらにその沈殿物を精製用キット（製品名：ＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）を用いて、当該キットの推奨プロトコルに従い、トータルＲＮＡを得た。

【0177】

＜ＲＮＡシークエンス＞
上述した方法で調製したトータルＲＮＡ２μｇと、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（イルミナ社製）とを用いて、当該キットの推奨プロトコルに従い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、平均約２６２塩基長のｃＤＮＡライブラリーが作製された。作製したｃＤＮＡライブラリーについて、シークエンサーＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑ２５００（イルミナ社製）を用いてシークエンス解析を行い、それぞれリード長２５０ｂｐおよび１０１ｂｐの配列情報を取得した。取得した配列を、以下の説明では、リード配列という。

【0178】

＜シークエンス情報の解析＞
ｃｕｔａｄａｐｔ（Martin M (2011) Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet journal; Vol 17, No 1: Next Generation Sequencing Data Analysis）を用いて、リード配列から品質の低い部分を除去し、高品質（ＨＱ）なリード配列を以降の解析で使用した。ＨＱリード配列をＯａｓｅｓ（Schulz MH, Zerbino DR, Vingron M, Birney E (2012) Oases: robust de novo RNA-seq assembly across the dynamic range of expression levels. Bioinformatics 28: 1086-1092）およびＴｒｉｎｉｔｙ（Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, Levin JZ, Thompson DA, et al. (2011) Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat Biotechnol 29: 644-652）でアセンブリーを行いコンティグ配列を作成した。得られたコンティグ配列はＥｖｉｄｅｎｔｉａｌＧｅｎｅ（Gilbert DG (2019) Longest protein, longest transcript or most expression, for accurate gene reconstruction of transcriptomes? bioRxiv: 829184）で取りまとめ、さらにＢＬＡＳＴ（Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-410）によるホモロジー探索の結果を考慮して手動で統合した。このようにしてスギの参照配列の４９７９５本を得た。以下の説明ではこれらの４９７９５本をＣＪ３００６ＮＲＥと呼ぶ。Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５．９（Bioinformatics. 2009; Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform, vol 25: page,1754-1760）を用いて、取得したリード配列を、スギの参照配列上にマッピングして整列させた。スギの参照配列には、ＣＪ３００６ＮＲＥを用いた。

【0179】

そして、以下の仮説（ｉ）～（ｉｉ）に基づき、リード配列の中から雄性不稔遺伝子ｍｓ１の候補遺伝子を選択した。
（ｉ）雄性不稔遺伝子ｍｓ１の候補遺伝子は、雄性可稔スギの雄花で発現し、雄性不稔スギの雄花や雄花以外の組織では、その発現量が雄性可稔スギよりも少ない。
（ｉｉ）スギの参照配列の各遺伝子に対して整列したリードの本数、つまり、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（以下、「ＴＰＭ」ともいう）が、リードが整列する遺伝子の発現量に比例する。

【0180】

具体的には、本参考例とは別に予め評価しておいた内樹皮と針葉のサンプルでＴＰＭが１０未満、かつ雄性可稔スギの雄花に由来するサンプルのＴＰＭが雄性不稔スギの雄花に由来するサンプルのＴＰＭの２倍より大きいことを条件として、雄性不稔遺伝子ｍｓ１の候補遺伝子を選択した。その結果、８８個の候補遺伝子が得られた。

【0181】

これらの候補遺伝子について、ＲＮＡシークエンスのリード配列のアラインメントから突然変異を探索したところ、図１１に示すように、（ｂ）「雄性可稔スギＢ（Ｍｓ１／ｍｓ１）」の雄花サンプル、（ｃ）「雄性不稔スギＣと雄性可稔スギＢとの交配家系」から雄性可稔スギ（Ｍｓ１／ｍｓ１）約５０個体程度の雄花サンプル、（ｄ）「雄性不稔スギＣと雄性可稔スギＢとの交配家系」から雄性不稔スギ（ｍｓ１／ｍｓ１）約５０個体程度の雄花サンプル、（ｅ）「雄性不稔スギＤと雄性可稔スギＢとの交配家系」から雄性可稔スギ（Ｍｓ１／ｍｓ１）約５０個体程度の雄花サンプル、および（ｆ）「雄性不稔スギＤと雄性可稔スギＢとの交配家系」から雄性不稔スギ（ｍｓ１／ｍｓ１）約５０個体程度の雄花サンプルから、遺伝子ＣＪｔ０２０７６２にアミノ酸配列を大きく変える４塩基の欠失（第１突然変異）の存在が予想された。この遺伝子ＣＪｔ０２０７６２を雄性不稔遺伝子ｍｓ１の候補遺伝子（以下、「候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２」という）として選定した。

【0182】

［参考例２：候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２（雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１）の配列特定］
サンガー方法によって、候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の全長の塩基配列を特定した。具体的な方法を以下に示す。

【0183】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギＥの針葉。
（ｂ）雄性可稔スギＦの針葉。

【0184】

上記（ａ）の雄性不稔スギＥは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合で保有していることが知られており（斎藤真己 (2010) スギ花粉症対策品種の開発. 日本森林学会誌 92: 316-323）、日本国新潟県村上市鵜渡路２２４９-５で育成されている。上記（ｂ）の雄性可稔スギＦは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をヘテロ接合型で保有していることが知られており、日本国静岡県浜松市浜北区で生育されている（静岡県農林技術研究所森林・林業研究センター, 静岡県農林技術研究所 森林・林業研究センター ６０周年記念誌 ２０１７, 静岡県森林・林業研究センター振興協議会）。

【0185】

＜第１のプライマー対の設計＞
参考例１で特定した候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２を増幅するため、候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２のトランスクリプト配列（つまり、ｍＲＮＡの配列）を特定した。候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２のトランスクリプト配列は、ＣＪ３００６ＮＲＥ配列データから抽出した。

【0186】

候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２のトランスクリプト配列に基づき、候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の全長を増幅するためのプライマー対（以下、「プライマー対α」ともいう）を設計し、プライマー対αを合成した。プライマー対αの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。合成したプライマー対αの塩基配列を、下記表２０及び配列表の配列番号２８及び２９に示す。

【0187】

【表20】

【0188】

＜ＤＮＡの抽出＞
上記試験材料（ａ）～（ｂ）から、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出には、改変したＣＴＡＢ法（Murray MG, Thompson WF (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325）を用いた。

【0189】

具体的には、針葉組織（約０．１ｇ）を液体窒素で凍結したのち、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（キアゲン社製）にて破砕し、それを０．９ｍｌの抽出バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３５０ｍＭ ソルビトール、１０％ＰＶＰ、０．１％ＢＳＡ、０．２％メルカプトエタノール）に添加して撹拌した後、沈殿を回収した。沈殿に０．３ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、３５０ｍＭ ソルビトール、０．１％メルカプトエタノール）を加えて撹拌し、１０％Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウムを０．０３ｍｌ加え撹拌した後、１５分間静置した。等量（０．３ｍｌ）の２ｘＣＴＡＢ抽出液を添加して６０度で１０分放置してゲノムＤＮＡを抽出した。ＣＴＡＢ抽出液に等量（０．６ｍｌ）のクロロホルム・イソアミルアルコール（容量比 ２４：１）を加え、上層を他の容器に移した。この容器に、２／３容量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させて、これを分取することによりＤＮＡを抽出した。なお、１ｘＣＴＡＢ抽出液には、１％のＣＴＡＢと、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）と、０．７ＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）が含まれていた。

【0190】

＜ＰＣＲ法による核酸増幅＞
合成したプライマー対αを用いて、試験材料（ａ）～（ｂ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による核酸増幅を行った。具体的には、下記表２１（ａ）に示す各成分を混合して増幅反応液を作成し、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標、以下同様） ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表２１（ｂ）に示す条件でインキュベートした。

【0191】

【表21(a)】

なお、表２１（ａ）において、「２×Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ」は、２倍濃度反応用バッファー（ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔの２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を指す。

【0192】

【表21(b)】

【0193】

得られた増幅産物を電気泳動し、長さが２．５ｋｂ程度の増幅産物が得られたことを確認した。

【0194】

＜シークエンシング解析＞
ＣＪｔ０２０７６２のトランスクリプト配列（evgc57800_g1_i2）に基づき、増幅産物の塩基配列を解析するためのシーケンシングプライマーセット１（以下、「シーケンシングプライマーセット１」ともいう）を設計し、シーケンシングプライマーセット１の各プライマーを合成した。シーケンシングプライマーセット１の各プライマー合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。合成したシーケンシングプライマーセット１の各プライマーの塩基配列を、下記表２２及び配列表の配列番号３０～３３に示す。

【0195】

【表22】

【0196】

得られた増幅産物を精製し、合成したシーケンシングプライマーセット１を用いてサンガー法（Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977. 74(12): p. 5463-7.）により反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標、以下同じ） Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））によりキット付属のプロトコルに従い反応を行った。

【0197】

サンガー法による反応で得られた産物を、キャピラリー式電気泳動装置（製品名：３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で泳動して増幅産物の塩基配列を解読した。具体的には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０／３１３０ｘｌジェネティックアナライザー操作ガイドＲｅｖ．１．１に従い、３６ｃｍキャピラリーアレイ、ＰＯＰ７ポリマー、ＲａｐｉｄＳｅｑ３６＿ＰＯＰ７ランモジュールを使用した。その後、得られた配列について、ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ Ａｌｉｇｎｅｒ （ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ社）を用いて、配列アセンブルを行った。

【0198】

＜第２～第４のプライマー対の設計＞
候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の全長の塩基配列をさらに正確に把握するため、アセンブルされた配列に基づき、候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の全長を増幅するためのプライマー対（以下、「プライマー対β～δ」ともいう）を設計し、プライマー対β～δを合成した。プライマー対β～δの各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。合成したプライマー対β～δの各プライマーの塩基配列を、下記表２３（ａ）～（ｃ）及び配列表の配列番号３４～３９に示す。

【0199】

【表23(a)】

【表23(b)】

【表23(c)】

【0200】

＜ＰＣＲ法による核酸増幅＞
プライマー対αにかえてプライマー対β～δを用いたこと以外は、上記表２１（ａ）に示す成分と同じ成分を混合して、増幅反応液を作成した。温度条件の６６℃を６３℃に変更したこと以外は、上記表２１（ｂ）に示す条件と同様の条件で、それぞれの増幅反応液をインキュベートし、ＰＣＲ法による核酸増幅を行った。得られた増幅産物をそれぞれ電気泳動し、増幅産物の長さが期待されるサイズであることを確認した。

【0201】

＜シークエンシング解析＞
前述した配列アセンブルの結果に基づき、増幅産物の塩基配列を解析するためのシーケンシングプライマーセット２（以下、「シーケンシングプライマーセット２」ともいう）を設計し、プライマーセット２を合成した。シーケンシングプライマーセット２の各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。合成したシーケンシングプライマーセット２の各プライマーの塩基配列を、下記表２４及び配列表の配列番号４０～４４に示す。

【0202】

【表24】

【0203】

得られた増幅産物を精製し、合成したシーケンシングプライマーセット２を用いてサンガー法により反応を行った。なお、サンガー法は、シーケンシングプライマーセットを変更したこと以外は上述した方法と同様の方法で行った。

【0204】

サンガー法による反応で得られた産物を、それぞれキャピラリー式電気泳動装置（製品名：３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で泳動して増幅産物の塩基配列を解読した。なお、キャピラリー式電気泳動装置による塩基配列の解読は、上述した方法と同様の方法で行った。その後、得られた配列について、ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ社）を用いて、配列アセンブルを行った。

【0205】

アセンブルの結果から、（ａ）雄性不稔スギＥの候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の配列を完成させた。この増幅産物の配列を、ＣＪ３００６ＮＲＥのＣＪｔ０２０７６２と比較したところ、４塩基の欠失が確認された。（ａ）雄性不稔スギＥが保有する候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の塩基配列は、図２や配列表の配列番号１に示す通りであり、本発明者等は、これを雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１と名付けた。

【0206】

また、（ａ）雄性不稔スギＥから特定した雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の４塩基の欠失箇所に、シーケンシングにより特定した４塩基を挿入し、これを雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と仮定した。この仮定した雄性可稔遺伝子Ｍｓ１（以下、「仮定雄性可稔遺伝子Ｍｓ１」ともいう）の配列に、ＢＷＡを用いて、上述した方法で特定した候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２のトランスクリプト配列をマッピングし、第１～第３のエクソンを特定した。

【0207】

一方、（ｂ）雄性可稔スギＦについては、たんぱく質をコードしているＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に３０塩基の欠失（第２突然変異）が含まれることが明らかになったが、３０塩基の欠失を含むことに加えて、３０塩基の欠失を含む雄性不稔遺伝子ｍｓ１をヘテロ型で保有している個体であったため、候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２に対応する遺伝子の塩基配列を完成させることはできなかった。本発明者等は、ＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において３０塩基欠失している遺伝子を、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２と名付けた。

【0208】

［参考例３：雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２と雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の配列決定］
アンプリコンシークエンス法により、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２と雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の塩基配列を決定した。具体的な方法を以下に示す。

【0209】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｅ」の針葉。
（ｂ）雄性不稔スギ「Ｇ」の針葉。
（ｃ）雄性不稔スギ「Ｄ」の針葉。
（ｄ）雄性不稔スギ「Ｈ」の針葉。
（ｅ）雄性不稔スギ「Ｉ」の針葉。
（ｆ）雄性不稔スギ「Ｊ」の針葉。
（ｇ）雄性不稔スギ「Ｋ」の針葉。
（ｈ）雄性可稔スギ「Ｌ」の針葉。
（ｉ）雄性可稔スギ「Ｆ」の針葉。
（ｊ）天然スギ（雄性可稔スギ）７４個体の針葉。

【0210】

上記（ａ）の雄性不稔スギＥは、参考例２で用いた（ａ）の雄性不稔スギＥと同じスギであり、上記（ｉ）の雄性可稔スギＦは、参考例２で用いた（ｂ）の雄性可稔スギＦと同じスギである。

【0211】

上記（ｂ）の雄性不稔スギＧは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており（斎藤真己 (2010) スギ花粉症対策品種の開発. 日本森林学会誌 92: 316-323）、日本国新潟県村上市で生育されている。上記（ｃ）の雄性不稔スギＤは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国新潟県新潟市で生育されている。上記（ｄ）の雄性不稔スギＨは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国新潟県新潟市で生育されている。上記（ｅ）の雄性不稔スギＩは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国新潟県新潟市で生育されている。上記（ｆ）の雄性不稔スギＪは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国神奈川県厚木市で生育されている。上記（ｇ）の雄性不稔スギＫは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をホモ接合型で保有していることが知られており、日本国新潟県新潟市で生育されている。上記（ｈ）の雄性可稔スギＬは、雄性不稔遺伝子ｍｓ１をヘテロ接合型で保有していることが知られており、日本国神奈川県厚木市で生育されている。上記（ｊ）の天然スギは、日本国内のスギ天然林（１８箇所）に由来する７４個体で日本国茨城県つくば市で生育されている。

【0212】

＜プライマー対ε～λのプライマー対の設計＞
雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２と雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の塩基配列を決定するため、下記表２５（ａ）～（ｇ）に示すプライマー対（以下、「プライマー対ε～λ」ともいう）を設計し、プライマー対ε～λの各プライマーを合成した。なお、プライマー対ε～λは、参考例２で特定した候補遺伝子ＣＪｔ０２０７６２の塩基配列に基づき、ソフトウェアＰＣＲ ｓｕｉｔｅ（Marijke J. van Baren and Peter Heutink, Bioinformatics, The PCR Suite Volume 20, Issue 4, 1 March 2004, Pages 591-593）を用いて設計した。また、プライマー対ε～λの各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。合成したプライマー対ε～λの各プライマーの塩基配列を、下記表２５（ａ）～（ｇ）及び配列表の配列番号４５～５８に示す。

【0213】

【表25(a)】

【表25(b)】

【表25(c)】

【表25(d)】

【表25(e)】

【表25(f)】

【表25(g)】

【0214】

＜ＤＮＡの抽出＞
参考例２と同様の方法で、上記試験材料（ａ）～（ｊ）から、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。ＤＮＡの抽出は、参考例２と同様の方法で行った。

【0215】

＜ＰＣＲ法による核酸増幅＞
プライマー対ε～λを用いて、試験材料（ａ）～（ｊ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、参考例２におけるプライマー対β～δを用いたＰＣＲと同様の方法で行った。

【0216】

＜アンプリコンシークエンス法による解析＞
ＰＣＲで得られた増幅産物にバーコード配列を付与した。バーコード配列は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社の提供するアダプター（Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ（商標） Ｂａｒｃｏｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ-３８４， Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を使用して、そのユーザーガイドに従って付与した。

【0217】

バーコード配列が付与された増幅産物の塩基配列を、ＭｉＳｅｑシーケンサー（イルミナ社製）を用いて解読した。

【0218】

得られたリード配列を、バーコード配列をもとに個体別に振り分けた後、参考例２で得られた仮定雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の配列にマップし、各個体の配列決定を行った。この過程では、ソフトウェアＢＷＡを用いた。さらに、ソフトウェアＰＨＡＳＥ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１）を使用して、非特許文献４（Stephens M, Donnelly P (2003) A comparison of bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data. Am J Hum Genet 73: 1162-1169.，Stephens M, Smith NJ, Donnelly P (2001) A new statistical method for haplotype reconstruction from population data. Am J Hum Genet 68: 978-989.）に記載される方法に従い、雄性不稔遺伝子ｍｓ１及び雄性可稔遺伝子Ｍｓ１に係る４９種類のハプロタイプを得た。

【0219】

そして、取得した４９種類のハプロタイプのうち、ＣＤＳにおいて３０塩基欠失しているハプロタイプを、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２として特定した。特定した雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２は、（ｉ）雄性可稔スギＦが保有するものであり、その塩基配列は、図３や配列表の配列番号１４に示している。

【0220】

そして、取得した４９種類のハプロタイプのうち、ＣＤＳにおいて４塩基の欠失や３０塩基欠失の欠失が見つからないハプロタイプを、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１として特定した。代表的な雄性可稔遺伝子Ｍｓ１の塩基配列は、図１や配列表の配列番号２１と、図４や配列表の配列番号２２に示している。

【0221】

なお、本参考例から、３０塩基の欠失が確認される雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２は、上述した試験材料のうち、（ｉ）の雄性可稔スギ「Ｆ」および（ｊ）の天然スギ７４個体のうちの３個体に見つかり、４塩基の欠失が確認される雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１は、上述した試験材料のうち、（ａ）～（ｈ）の雄性不稔スギ及び雄性可稔スギで見つかった。（ｉ）の雄性可稔スギ「Ｆ」は、花粉を生成する雄性可稔個体であることから、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２をヘテロ接合型で保有する個体（以下、「Ｍｓ１／ｍｓ１－２」ともいう）であることが明らかとなった。また、（ａ）～（ｇ）の雄性不稔スギ「Ｅ」「Ｇ」「Ｄ」「Ｈ」「Ｉ」「Ｊ」及び「Ｋ」は、花粉を生成しない雄性不稔個体であることから、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１をホモ接合型で保有している個体（以下、「ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」ともいう）であることが明らかとなった。また、（ｈ）の雄性可稔スギ「Ｌ」は、花粉を生成する雄性可稔個体であることから、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１をヘテロ接合型で保有する個体（以下、「Ｍｓ１／ｍｓ１－１」ともいう）であることが明らかとなった。

【0222】

［実施例１－１：ＬＡＭＰプライマーセットによる雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出］
第１実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出を行った。具体的な方法を以下に示す。

【0223】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｄ：ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」の針葉。
（ｂ）雄性可稔スギ「Ｆ：Ｍｓ１／ｍｓ１－２」の針葉。

【0224】

上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｄ」は、参考例３で用いた（ｃ）の雄性不稔スギＤと同じスギであり、上記（ｂ）の雄性可稔スギ「Ｆ」は、参考例３で用いた（ｉ）の雄性可稔スギＦと同じスギである。

【0225】

＜ＬＡＭＰプライマーセットの用意＞
下記表２６に示すＬＡＭＰプライマーセットを用意した。各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0226】

【表26】

【0227】

＜ＤＮＡの抽出＞
参考例２と同様の方法で、上記試験材料（ａ）～（ｂ）から、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。

【0228】

＜ＬＡＭＰ法による核酸増幅＞
用意したＬＡＭＰプライマーセットを用いて、試験材料（ａ）～（ｂ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ法による核酸増幅を行った。

【0229】

具体的には、０．２ｍｌマイクロチューブに、ＬＡＭＰプライマーセット、試験材料から抽出したＤＮＡ、ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学（株））の各試薬、およびＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学（株））を下記表２７に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0230】

【表27】

なお、表２７において、「２×ＲＭ」は、２倍濃度反応用バッファー（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を指し、「ＦＤ」は、Ｌｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬を指す。

【0231】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表２８に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0232】

【表28】

【0233】

増幅反応液が４℃になった後の増幅反応液の写真を図１２に示す。図１２に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有する雄性不稔スギ「Ｄ」のＤＮＡを添加した増幅反応液は、ポジティブコントロール（ＰＣ）と同様に、緑色の蛍光を発しており、核酸が増幅されていることが確認できた。一方、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有しない雄性可稔スギ「Ｆ」のＤＮＡを添加した増幅反応液は、ネガティブコントロール（ＮＣ）と同様に、緑色の蛍光を発しておらず、核酸の増幅が確認できなかった。この結果から、表２６に示すＬＡＭＰプライマーセットセットによれば、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出できたことが理解できた。

【0234】

なお、本実施例において、ネガティブコントロールには、蒸留水を用いた。

【0235】

［実施例１－２：ＬＡＭＰプライマーセットによる雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出］
第１実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出を行った。具体的な方法を以下に示す。なお、試験材料と、試験材料からＤＮＡを抽出する方法は、実施例１－１と同じであるため、説明を省略する。

【0236】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｄ：ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」の針葉。

【0237】

上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｄ」は、参考例３で用いた（ｃ）の雄性不稔スギＤと同じスギである。

【0238】

＜ＬＡＭＰプライマーセットの用意＞
下記表２９（ａ）～（ｂ）に示すＬＡＭＰプライマーセットＡ～Ｅを用意した。各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0239】

【表29(a)】

【表29(b)】

【0240】

＜ＬＡＭＰ法による核酸増幅＞
用意したＬＡＭＰプライマーセットＡ～Ｅを用いて、試験材料（ａ）から抽出したＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ法による核酸増幅を行った。

【0241】

具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに、ＬＡＭＰプライマーセット、試験材料から抽出したＤＮＡ、ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学（株））の各試薬を下記表３０に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0242】

【表30】

なお、表３０において、「２×ＲＭ」は、２倍濃度反応用バッファー（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を指す。

【0243】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、リアルタイム濁度測定装置ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡ（栄研化学（株））に設置し、下記表３１に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0244】

【表31】

【0245】

６３℃でインキュベート中の増幅反応液の濁度変化を、図１３に示す。なお、濁度は、リアルタイム濁度測定装置ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡ（栄研化学（株））により測定した。図１３に示すように、ＬＡＭＰプライマーセットＡ～Ｆいずれを用いた場合であっても、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有する雄性不稔スギ「Ｄ」のＤＮＡを添加した増幅反応液では、ネガティブコントロール（ＮＣ）よりも濁度が高く、核酸が増幅されていることが確認できた。

【0246】

また、図１３から理解できるように、ＬＡＭＰプライマーセットＡ～Ｅの中でも、配列番号４に示すＢＩＰ_{ｍｓ１－１}を用いたＬＡＭＰプライマーセットＣや、配列番号５に示すＢＩＰ_{ｍｓ１－１}を用いたＬＡＭＰプライマーセットＤで核酸を増幅したときの方が、他のＬＡＭＰプライマーセットで核酸増幅したときと比べて、濁度がより高かった。濁度が高いことは、核酸の増幅がより進んでいることを指す。従って、本実施例の結果から、ＬＡＭＰプライマーセットＣやＬＡＭＰプライマーセットＤで核酸を増幅したときの方が、他のＬＡＭＰプライマーセットで核酸増幅したときと比べて、核酸増幅の効率が高いことが明らかとなった。

【0247】

なお、雄性可稔スギ「Ｆ：Ｍｓ１／ｍｓ１－２」の針葉を試験材料として核酸増幅を行ったところ、ほぼ全てのＬＡＭＰプライマーセットを用いた増幅反応液において、濁度がネガティブコントロール（ＮＣ）と同等程度であった。しかしながら、核酸増幅処理の条件によっては、ＬＡＭＰプライマーセットＡやＣを用いた増幅反応液は、これら以外のＬＡＭＰプライマーセット（ＬＡＭＰプライマーセットＢ、Ｄ、Ｅ）を用いた増幅反応液と比較して、濁度が高くなることがあった。つまり、ＬＡＭＰプライマーセットＢ、Ｄ、Ｅは、ＬＡＭＰプライマーセットＡやＣと比較して、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１に対する特異性が高いことが明らかになった。

【0248】

以上の結果から、ＬＡＭＰプライマーセットＡ～Ｅの中でも、ＬＡＭＰプライマーセットＤが、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の核酸増幅効率がより向上するとともに、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１に対する特異性がより高いことから、最も好ましいことが明らかとなった。

【0249】

［実施例２－１：プライマー対による雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出］
第２実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出を行った。この実施例では、増幅産物の有無に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出した。具体的な方法を以下に示す。

【0250】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｅ：ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」の針葉。
（ｂ）雄性可稔スギ「Ｇ４９２」の針葉。
（ｃ）雄性可稔スギ「Ｆ：Ｍｓ１／ｍｓ１－２」の針葉。

【0251】

なお、上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｅ」は、参考例３で用いた（ａ）の雄性不稔スギＥと同じスギであり、上記（ｃ）の雄性可稔スギ「Ｆ」は、参考例３で用いた（ｉ）の雄性可稔スギＦと同じスギである。また、上記（ｂ）の雄性可稔スギは、上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｅ」と上記（ｃ）の雄性可稔スギ「Ｆ」の交配家系であり、可稔スギであることから、雄性可稔遺伝子Ｍｓ１と雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１をヘテロ型で保有している個体（以下、「Ｍｓ１／ｍｓ１－１」ともいう）であると判断できる。上記（ｂ）の雄性可稔スギ「Ｇ４９２」は、日本国静岡県浜松市浜北区で生育されている。

【0252】

＜プライマー対の用意＞
下記表３２に示すプライマー対を用意した。各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0253】

【表32】

【0254】

＜ＳＳＲプライマー対の用意＞
核酸増幅処理が適切に行われたか否かを確認するため、下記表３３に示すＳＳＲプライマー対（Tani N, Takahashi T, Ujino-Ihara T, Iwata H, Yoshimura K, Tsumura Y (2004) Development and characteristics of microsatellite markers for sugi (Cryptomeria japonica D. Don) derived from microsatellite-enriched libraries. Annals of Forest Science 61:569--575）を用意した。各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0255】

【表33】

【0256】

＜ＤＮＡの抽出＞
参考例２と同様の方法で、上記試験材料から、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。

【0257】

＜ＰＣＲ法による核酸増幅＞
用意したプライマー対及びＳＳＲプライマー対を用いて、試験材料（ａ）～（ｃ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による核酸増幅を行った。

【0258】

具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに、プライマー対、ＳＳＲプライマー対、試験材料から抽出したＤＮＡ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）の試薬を下記表３４に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0259】

【表34】

なお、表３４において、「２×Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ」は、２倍濃度反応用バッファー（２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を指す。
を指す。

【0260】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表３５に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0261】

【表35】

【0262】

増幅反応液の温度を４℃にした後、各増幅反応液をアガロースゲルのウェルに注入して電気泳動を行い、電気泳動後にエチジウムブロマイド液で染色した。そして、これらについて、ＵＶ照射により増幅産物の有無を確認することによって、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出を行った。電気泳動写真を図１４に示す。

【0263】

図１４に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有する「Ｅ」及び「Ｇ４９２」は、２本のバンドが確認できた。一方、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有しない「Ｆ」は、１本のバンドしか確認できなかった。２本のバンドが確認できることは、ＳＳＲプライマー対によって増幅された増幅産物に加えて、本実施形態のプライマー対によって増幅された増幅産物が得られたことを意味する。一方、１本のバンドしか確認できないことは、ＳＳＲプライマー対によって増幅された増幅産物しか得られなかったことを意味する。従って、図１４に示す結果から、表３２に示す本実施形態のプライマー対により、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出できたことが理解できた。

【0264】

［実施例２－２：プライマー対による雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出］
第２実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１の検出を行った。具体的な方法を以下に示す。この実施例では、蛍光標識された増幅産物を取得し、増幅産物の長さに基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出した。なお、試験材料からＤＮＡを抽出する方法は、実施例２－１と同じであるため、説明を省略する。

【0265】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｅ：ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」の針葉。
（ｂ）雄性可稔スギ「Ｆ：Ｍｓ１／ｍｓ１－２」の針葉。

【0266】

なお、上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｅ」は、参考例３で用いた（ａ）の雄性不稔スギＥと同じスギであり、上記（ｂ）の雄性可稔スギ「Ｆ」は、参考例３で用いた（ｉ）の雄性可稔スギＦと同じスギである。

【0267】

＜プライマー対の用意＞
下記表３６に示すプライマー対と、蛍光用プライマーを用意した。プライマー対を構成する各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。蛍光用プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0268】

【表36】

【0269】

＜核酸増幅＞
表３６に示す各プライマーを用いて、試験材料（ａ）～（ｂ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による核酸増幅を行った。

【0270】

具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに、試験材料から抽出したＤＮＡ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）の試薬、上記表１６に示す各プライマーを下記表３７に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0271】

【表37】

なお、表３７において、「２×Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ」は、２倍濃度反応用バッファー（２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を指す。

【0272】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表３８に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0273】

【表38】

【0274】

増幅反応液の温度を４℃にした後、キャピラリー電気泳動システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０）を用いてエレクトロフェログラムを取得した。具体的には、まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されているＧｅｎｅＳｃａｎ ６００ ＬＩＺ ｄｙｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｖ２．０の０．２μｌとＨｉＤｉ ホルムアミドの９μｌとを混合してローディングバッファーとした。次いで、希釈したＰＣＲ増幅産物の１μｌをローディングバッファー９μｌに加えサンプルを混合し、９５℃で変性した。そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ジェネティックアナライザーにロードし、標準的なフラグメント解析条件を使用することで、増幅産物の長さを示すエレクトロフェログラムを得た。

【0275】

取得したエレクトロフェログラムを図１５に示す。図１５に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有する「Ｅ」を鋳型として増幅された増幅産物は、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を保有しない「Ｆ」を鋳型として増幅された増幅産物よりも４塩基短くなっていることが確認できた。この結果から、表３６に示す本実施形態のプライマー対により、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－１を検出できたことが理解できた。

【0276】

［実施例３：ＬＡＭＰプライマーセットによる雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の検出］
第３実施形態のＬＡＭＰプライマーセットを用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の検出を行った。具体的な方法を以下に示す。

【0277】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｄ：ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」の針葉。
（ｂ）雄性可稔スギ「Ｆ：Ｍｓ１／ｍｓ１－２」の針葉。

【0278】

なお、上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｄ」は、参考例３で用いた（ｃ）の雄性不稔スギＤと同じスギであり、上記（ｂ）の雄性可稔スギ「Ｆ」は、参考例３で用いた（ｉ）の雄性可稔スギＦと同じスギである。

【0279】

＜ＬＡＭＰプライマーセットの用意＞
下記表３９に示すＬＡＭＰプライマーセットを用意した。各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0280】

【表39】

【0281】

＜ＤＮＡの抽出＞
参考例２と同様の方法で、上記試験材料（ａ）～（ｂ）から、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。

【0282】

＜ＬＡＭＰ法による核酸増幅＞
用意したＬＡＭＰプライマーセットを用いて、試験材料（ａ）～（ｂ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ法による核酸増幅を行った。

【0283】

具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに、ＬＡＭＰプライマーセット、試験材料から抽出したＤＮＡ、ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学（株））の各試薬、およびＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学（株））を下記表４０に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0284】

【表40】

なお、表４０において、「２×ＲＭ」は、２倍濃度反応用バッファー（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を指し、「ＦＤ」は、Ｌｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬を指す。

【0285】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表４１に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0286】

【表41】

【0287】

増幅反応液の温度を４℃にした後の増幅反応液の写真を図１６に示す。図１６に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有する「Ｆ」のＤＮＡを添加した増幅反応液は、ポジティブコントロール（ＰＣ）と同様に、緑色の蛍光を発しており、核酸が増幅されていることが確認できた。一方、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有しない「Ｄ」のＤＮＡを添加した増幅反応液は、ネガティブコントロール（ＮＣ）と同様に、緑色の蛍光を発しておらず、核酸の増幅が確認できなかった。この結果から、表３９に示すＬＡＭＰプライマーセットによれば、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出できたことが理解できた。

【0288】

なお、本実施例において、ネガティブコントロールには、蒸留水を用いた。

【0289】

［実施例４－１：プライマー対による雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の検出］
第４実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の検出を行った。この実施例では、増幅産物の泳動距離に基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出した。具体的な方法を以下に示す。

【0290】

＜試験材料＞
（ａ）雄性不稔スギ「Ｄ：ｍｓ１－１／ｍｓ１－１」の針葉。
（ｂ）雄性可稔スギ「Ｌ：Ｍｓ１／ｍｓ１－１」の針葉。
（ｃ）雄性可稔スギ「Ｆ：Ｍｓ１／ｍｓ１－２」の針葉。

【0291】

なお、上記（ａ）の雄性不稔スギ「Ｄ」は、参考例３で用いた（ｃ）の雄性不稔スギと同じスギであり、上記（ｂ）の雄性可稔スギ「Ｌ」は、参考例３で用いた（ｈ）の雄性可稔スギと同じスギであり、上記（ｃ）の雄性可稔スギ「Ｆ」は、参考例３で用いた（ｉ）の雄性可稔スギと同じスギである。

【0292】

＜プライマー対の用意＞
下記表４２に示すプライマー対を用意した。プライマー対を構成する各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0293】

【表42】

【0294】

＜ＤＮＡの抽出＞
参考例２と同様の方法で、試験材料（ａ）～（ｃ）から、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。

【0295】

＜ＰＣＲ法による核酸増幅＞
用意したプライマー対を用いて、試験材料（ａ）～（ｃ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による核酸増幅を行った。

【0296】

具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに、抽出したＤＮＡ、プライマー対、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）の試薬を下記表４３に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0297】

【表43】

なお、表４３において、「２×Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ」は、２倍濃度反応用バッファー（２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を指す。

【0298】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表４４に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0299】

【表44】

【0300】

増幅反応液を４℃にした後、各増幅反応液をアガロースゲルのウェルに注入して電気泳動を行い、電気泳動後にエチジウムブロマイド液で染色した。そして、泳動物の移動距離により、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２が検出できたか否かを判断した。電気泳動写真を図１７に示す。

【0301】

図１７に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有しない雄性不稔スギ「Ｄ」と雄性可稔スギ「Ｌ」では、同等の泳動距離となる位置に明瞭な１本のバンドが確認できた。一方、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有する雄性可稔スギ「Ｆ」では、雄性不稔スギ「Ｄ」及び雄性可稔スギ「Ｌ」で確認されたバンドよりも泳動距離が短い位置から長い位置にかけてブロードなバンドが確認できた。雄性可稔スギ「Ｆ」では、雄性不稔スギ「Ｄ」及び雄性可稔スギ「Ｌ」で確認されたバンドよりも泳動距離が長い位置にもバンドが確認できたことから、これらよりも短い増幅産物が得られていることが理解できる。従って、表４２に示すプライマー対から、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出できたことが理解できた。

【0302】

なお、雄性可稔スギ「Ｆ」で確認されたバンドが泳動方向に延びている理由は、雄性可稔スギ「Ｆ」が保有する雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２に由来する増幅産物の一部と、雄性可稔スギ「Ｆ」が保有する雄性可稔遺伝子Ｍｓ１に由来する増幅産物の一部がヘテロ二本鎖（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成したためと考えられた。

【0303】

［実施例４－２：プライマー対による雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の検出］
第４実施形態のプライマー対を用いて、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２の検出を行った。この実施例では、測定した増幅産物の長さに基づき、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出した。具体的な方法を以下に示す。なお、試験材料は、実施例４－１と同じであり、ＤＮＡの抽出方法も同じであるため、これらについての詳細な説明は省略する。

【0304】

＜プライマー対の用意＞
下記表４５に示すプライマー対を用意した。各プライマーの合成は、固相合成法（ホスホロアミダイト法）でＤＮＡ合成装置により行った。

【0305】

【表45】

【0306】

＜核酸増幅＞
表４５に示すプライマーを用いて、試験材料（ａ）～（ｃ）から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による核酸増幅を行った。

【0307】

具体的にはまず、０．２ｍｌマイクロチューブに、抽出したＤＮＡ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）の試薬、表４５に示す各プライマーを、下記表４６に示す分量で分注し、増幅反応液を作成した。

【0308】

【表46】

なお、表４６において、「２×Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ」は、２倍濃度反応用バッファー（２ｘ ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）を指す。

【0309】

次に、増幅反応液が充填されたマイクロチューブを、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に設置し、下記表４７に示す温度及び時間でインキュベートした。

【0310】

【表47】

【0311】

増幅反応液を４℃にした後、キャピラリー電気泳動システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ジェネティックアナライザー）を用いてエレクトロフェログラムを取得した。なお、エレクトロフェログラムは、実施例２－２と同様の方法で取得した。

【0312】

エレクトロフェログラムを図１８に示す。図１８に示すように、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有する雄性可稔スギ「Ｆ」を鋳型として増幅された増幅産物には、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を保有しない雄性不稔スギ「Ｄ」や雄性可稔スギ「Ｌ」を鋳型として増幅された増幅産物よりも、３０塩基短い増幅産物が含まれていることが確認できた。この結果から、表４５に示す本実施形態のプライマー対により、雄性不稔遺伝子ｍｓ１－２を検出できたことが理解できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

0007488519000001.app