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特許7541290トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-20
(45)【発行日】2024-08-28
(54)【発明の名称】トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法
(51)【国際特許分類】
A01H 6/82 20180101AFI20240821BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240821BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20240821BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240821BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20240821BHJP
【ＦＩ】
A01H6/82 ZNA
C12N15/09 100
C12N15/29
C12N5/10
A01H1/00 A
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2020557796
(86)(22)【出願日】2019-11-27
(86)【国際出願番号】 JP2019046438
(87)【国際公開番号】W WO2020111149
(87)【国際公開日】2020-06-04
【審査請求日】2022-09-07
(31)【優先権主張番号】P 2018222289
(32)【優先日】2018-11-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2019095150
(32)【優先日】2019-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000004477
【氏名又は名称】キッコーマン株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】新子 泰規
(72)【発明者】
【氏名】中原 健二
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】PIRON, F. et al.，PLoS ONE，2010年06月25日，Vol. 5, e11313，pp. 1-10
【文献】KADIRVEL, P. et al.，Euphytica，2012年12月05日，Vol. 190，pp. 297-308
【文献】CZOSNEK, H. et al.，Viruses，2013年03月22日，Vol. 5，pp. 998-1022
【文献】BMC Plant Biology，2012年，Vol.12，229 (p.1-18)，doi:10.1186/1471-2229-12-229
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｈ ６／８２
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ０１Ｈ １／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記変異は、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子内の配列番号３に示される塩基配列に存在し、前記配列番号３に示される塩基配列が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列に変異しており、
前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記変異は、前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子内の配列番号６に示される塩基配列に存在し、前記配列番号６に示される塩基配列が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列に変異しており、
前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記変異は、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子内の配列番号４１に示される塩基配列に存在し、前記配列番号４１に示される塩基配列が、配列番号５３または５４に示される塩基配列に変異しており、
前記変異によって、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率が、前記変異を有していない対照トマト植物よりも低下したトマト植物であって、
前記罹病率が、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの接種から２０日以上経過した時点における目視判定可能な感染症状の有無、及び／又はＰＣＲによって検出される前記ベゴモウイルス属ウイルスの遺伝子の有無に基づくものである、
トマト植物。
【請求項2】
前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、請求項１に記載のトマト植物。
【請求項3】
前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、請求項１または２に記載のトマト植物。
【請求項4】
前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか一項に記載のトマト植物。（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
【請求項5】
前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子に変異を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のトマト植物。
【請求項6】
前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子に変異を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のトマト植物。
【請求項7】
前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子に変異を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のトマト植物。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のトマト植物の部分。
【請求項9】
果実である、請求項８に記載のトマト植物の部分。
【請求項10】
種子である、請求項８に記載のトマト植物の部分。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のトマト植物またはその部分の加工品。
【請求項12】
食用である、請求項１１に記載の加工品。
【請求項13】
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記変異は、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子内の配列番号３に示される塩基配列に存在し、前記配列番号３に示される塩基配列が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列に変異しており、
前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記変異は、前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子内の配列番号６に示される塩基配列に存在し、前記配列番号６に示される塩基配列が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列に変異しており、
前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記変異は、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子内の配列番号４１に示される塩基配列に存在し、前記配列番号４１に示される塩基配列が、配列番号５３または５４に示される塩基配列に変異しており、
前記変異によって、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率が、前記変異を有していない対照トマト植物細胞よりも低下したトマト植物で細胞あって、
前記罹病率が、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの接種から２０日以上経過した時点における目視判定可能な感染症状の有無、及び／又はＰＣＲによって検出される前記ベゴモウイルス属ウイルスの遺伝子の有無に基づくものである、トマト植物細胞。
【請求項14】
前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、請求項１３に記載のトマト植物細胞。
【請求項15】
請求項１３または１４に記載のトマト植物細胞を有し、トマトに黄化葉巻様症状を呈する前記ベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率が低下した、トマト植物およびその部分。
【請求項16】
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、トマト植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率が低下する変異を導入する工程と、
前記ベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率が、前記変異を有していない対照トマト植物よりも低下したトマト植物を選別する工程と
を含み、
前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記変異を、配列番号３に示される塩基配列に導入し、
前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記変異を、配列番号６に示される塩基配列に導入し、
前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記変異を、配列番号４１に示される塩基配列に導入し、
前記罹病率が、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの接種から２０日以上経過した時点における目視判定可能な感染症状の有無、及び／又はＰＣＲによって検出される前記ベゴモウイルス属ウイルスの遺伝子の有無に基づくものである、
トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率の低下した、ウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項17】
前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、請求項１６に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項18】
前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、請求項１６または１７に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項19】
前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
【請求項20】
前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子に変異を導入する、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項21】
前記受容体様キナーゼＲＬＫ１遺伝子に変異を導入する、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項22】
前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子に変異を導入する、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項23】
前記配列番号３に示される塩基配列が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項２０に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項24】
前記配列番号６に示される塩基配列が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項２１に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項25】
前記配列番号４１に示される塩基配列が、配列番号５３または５４に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項２２に記載のウイルス抵抗性トマト植物の作出方法。
【請求項26】
請求項１～７のいずれか一項に記載のトマト植物またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率の低下したトマト植物の育種後代の作出方法。
【請求項27】
請求項２６に記載の作出方法によって得られた、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対する罹病率の低下したウイルス抵抗性トマト植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
トマト黄化葉巻病を引き起こす代表的なウイルスであるトマト黄化葉巻ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ；以下「ＴＹＬＣＶ」と略す場合がある。）は、１９６４年にイスラエルで発見された比較的新しい植物ウイルスの一種である。世界的にＴＹＬＣＶや、ＴＹＬＣＶが属するベゴモウイルス属のウイルスが多数発見され、熱帯、亜熱帯、温帯地域を中心に、様々な植物や農作物に被害を与えている。ベゴモウイルス属には１分節のタイプと２分節のタイプがあり（それぞれＭｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ, Ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）、ＴＹＬＣＶは１分節タイプである。ＴＹＬＣＶの類縁のウイルスの発生分布は多様であり世界中で発生しているが、例えば、ＴＹＬＣＶの近縁種であるトマト黄化葉巻サルジニアウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓａｒｄｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）は、地中海周辺のみで発生している。一方で、ＴＹＬＣＶは、トマト生産地域を中心に世界的に蔓延している（非特許文献１を参照）。
【0003】
日本では、１９９６年にＴＹＬＣＶを病源とするトマト黄化葉巻病が長崎県、愛知県、および静岡県で同時に発見され、その後、施設トマトの生産地で急速に発生が拡大している。特に、２０００年以降、生食トマト主産地である九州での発生は甚大で、栽培しているトマト全てがＴＹＬＣＶ被害にあう農家も続出している。各県において、農家に対し厳重に注意喚起を行い、薬剤散布等によるＴＹＬＣＶ防除を徹底しているが、ＴＹＬＣＶの被害の発生は続いており、全国に広がっている。２０１６年時点でも、ＴＹＬＣＶはトマト生産において最も被害額の大きい病害となっている。
【0004】
トマト黄化葉巻病の症状は、トマトの葉の黄化から始まり、徐々に葉の縁が下側に巻いて奇形になる（例えば、図３（ｂ）を参照）。症状が激しくなると、株全体がパーマをかけたようになる。果実には症状が出ないが、栽培初期にトマトがＴＹＬＣＶに感染すると、果房２段目程度までしか着果しないため、収穫量が７～８割減となる多大な被害が発生する。
【0005】
トマト黄化葉巻病は、ＴＹＬＣＶの媒介虫であるタバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ （Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ））によって伝染し、永続的に蔓延してしまう。
【0006】
また、植物ウイルス自体に対する、効果的な抗ウイルス薬剤は存在しない。これまでの一般的な植物ウイルスの防除方法は、ウイルスを伝染する媒介虫への殺虫剤散布、栽培施設への媒介虫の進入を物理的に防ぐ防虫ネットや忌避資材の利用、土壌消毒、感染株の抜き取り、栽培管理機具の消毒、障壁作物の利用、およびウイルス抵抗性作物の育種などが中心となっている。
【0007】
ＴＹＬＣＶの防除方法についても同様である。ＴＹＬＣＶの媒介虫であるタバココナジラミの防除と感染株の早期抜き取りなどにより、ＴＹＬＣＶの伝染環を断ち切ることが主な対策である。
【0008】
しかしながら、タバココナジラミの防除のために、侵入阻止に有効な０．４ｍｍ目合い以下の防虫ネットを使用すると、栽培施設内の気温の上昇が懸念される。よって、現場では実施されにくい。
【0009】
また、トマトの大産地である九州などでは、栽培期間の異なる様々な栽培型のトマトが栽培されているため、一年中どこかの地域でトマトが栽培されている。このため、ＴＹＬＣＶを保毒したタバココナジラミは、色々なトマトの栽培型にあわせて野外や施設を移動し、寒い冬の時期にも死滅しない。このようにＴＹＬＣＶの伝染環が途切れることがないため、ＴＹＬＣＶの防除が困難である。
【0010】
さらに、最近は殺虫剤耐性のあるタバココナジラミとして、タバココナジラミ－バイオタイプＱが蔓延してきており、殺虫剤防除にも限界が見られる。
【0011】
ＴＹＬＣＶ抵抗性トマトに関連して、耐性遺伝子と呼ばれるＴｙ－１、Ｔｙ－２、Ｔｙ－３などの遺伝子がトマト野生種から見つかっている。しかし、これら遺伝子の存在によって、病徴が抑制されるものの、ＴＹＬＣＶの感染自体を阻止することはできない。
【0012】
ＴＹＬＣＶ耐性遺伝子を交配で導入したトマトの品種が既に市場に出ているが、これら遺伝子の特性上、いずれの品種もＴＹＬＣＶに感染し、トマトの生体内でウイルスが増殖することが知られている。よって、ＴＹＬＣＶ耐性遺伝子が導入されたトマトを栽培するにあたり、タバココナジラミの防除を怠ると、当該トマトはＴＹＬＣＶを保毒することとなる。このようなトマトはＴＹＬＣＶによる病徴が抑制されても、ＴＹＬＣＶの感染源となるため、周囲のＴＹＬＣＶ感受性のトマト品種をＴＹＬＣＶ感染の危機に曝してしまう（例えば、非特許文献２～４を参照）。
【0013】
上述した問題はＴＹＬＣＶに固有のものではなく、タバココナジラミで媒介され、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して共通の問題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0014】
【文献】European Food Safety Authority, "EFSA Journal," 2013, 11(4):3162
【文献】B. Mabvakure et al., "Virology," 2016, 498: 257-264
【文献】J. Basak, "Journal of Plant Pathology & Microbiology," 2016, 7: 346
【文献】H. Czosnek編, "Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease", Springer, 2007, pp.85-118
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
上述したような従来の植物ウイルスの防除方法では、ＴＹＬＣＶ等の、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの蔓延を十分に防除することが難しかった。また、ＴＹＬＣＶ耐性遺伝子を導入したナス科植物の品種では、例えＴＹＬＣＶ感染に伴う症状が抑制されていても、植物内ではＴＹＬＣＶが増殖するため、ＴＹＬＣＶの伝染環を完全に分断することはできなかった。
【0016】
以上のような背景のもと、本発明は、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染後の当該ウイルスの増殖を抑制する性質および／または当該ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有する、ウイルス抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明は、以下のナス科植物、その部分およびそれらの加工品を提供する。
［１］ 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物。
［２］前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、［１］に記載のナス科植物。
［３］ 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、［１］または［２］に記載のナス科植物。
［４］ 前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［１］～［３］のいずれかに記載のナス科植物。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
［５］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［６］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［７］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［８］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［９］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５］に記載のナス科植物。
［１０］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［９］に記載のナス科植物。
［１１］ 前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［１０］に記載のナス科植物。
［１２］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［６］に記載のナス科植物。
［１３］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１２］に記載のナス科植物。
［１４］ 前記配列番号６に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［１３］に記載のナス科植物。
［１５］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［７］に記載のナス科植物。
［１６］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３５または３８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１５］に記載のナス科植物。
［１７］ 前記配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４８～５０から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、および／または前記配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５１または５２に示される塩基配列に変異している、［１６］に記載のナス科植物。
［１８］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［１７］に記載のナス科植物。
［１９］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１８］に記載のナス科植物。
［２０］ 前記配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５３または５４に示される塩基配列に変異している、［１９］に記載のナス科植物。
［２１］ トマトである、［１］～［２０］のいずれかに記載のナス科植物。
［２２］ ［１］～［２１］のいずれかに記載のナス科植物の部分。
［２３］ 果実である、［２２］に記載のナス科植物の部分。
［２４］ 種子である、［２２］に記載のナス科植物の部分。
［２５］ ［１］～［２４］のいずれかに記載のナス科植物またはその部分の加工品。
［２６］ 食用である、［２５］に記載の加工品。
［１］ 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物。
［２］前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、［１］に記載のナス科植物。
［３］ 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、［１］または［２］に記載のナス科植物。
［４］ 前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［１］～［３］のいずれかに記載のナス科植物。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
［５］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［６］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［７］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［８］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のナス科植物。
［９］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５］に記載のナス科植物。
［１０］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［９］に記載のナス科植物。
［１１］ 前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［１０］に記載のナス科植物。
［１２］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［６］に記載のナス科植物。
［１３］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１２］に記載のナス科植物。
［１４］ 前記配列番号６に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［１３］に記載のナス科植物。
［１５］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［７］に記載のナス科植物。
［１６］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３５または３８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１５］に記載のナス科植物。
［１７］ 前記配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４８～５０から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、および／または前記配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５１または５２に示される塩基配列に変異している、［１６］に記載のナス科植物。
［１８］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［１７］に記載のナス科植物。
［１９］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［１８］に記載のナス科植物。
［２０］ 前記配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５３または５４に示される塩基配列に変異している、［１９］に記載のナス科植物。
［２１］ トマトである、［１］～［２０］のいずれかに記載のナス科植物。
［２２］ ［１］～［２１］のいずれかに記載のナス科植物の部分。
［２３］ 果実である、［２２］に記載のナス科植物の部分。
［２４］ 種子である、［２２］に記載のナス科植物の部分。
［２５］ ［１］～［２４］のいずれかに記載のナス科植物またはその部分の加工品。
［２６］ 食用である、［２５］に記載の加工品。
【0018】
さらに本発明は、以下のナス科植物細胞、ならびにそれを有するナス科植物およびその部分を提供する。
［２７］ 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物細胞。
［２８］前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、［２７］に記載のナス科植物。
［２９］ 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、［２７］に記載のナス科植物細胞。
［３０］ 前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［２７］～［２９］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
［３１］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３２］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３３］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３４］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３５］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３１］に記載のナス科植物細胞。
［３６］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［３５］に記載のナス科植物細胞。
［３７］ 前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［３６］に記載のナス科植物細胞。
［３８］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３２］に記載のナス科植物細胞。
［３９］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［３８］に記載のナス科植物細胞。
［４０］ 前記配列番号６に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［３９］に記載のナス科植物細胞。
［４１］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３３］に記載のナス科植物細胞。
［４２］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３５または３８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［４１］に記載のナス科植物細胞。
［４３］ 前記配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４８～５０から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、および／または前記配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５１または５２に示される塩基配列に変異している、［４２］に記載のナス科植物細胞。
［４４］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［４３］に記載のナス科植物細胞。
［４５］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［４４］に記載のナス科植物細胞。
［４６］ 前記配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５３または５４に示される塩基配列に変異している、［４５］に記載のナス科植物細胞。
［４７］ トマトである、［２７］～［４６］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［４８］ ［２７］～［４７］のいずれかに記載のナス科植物細胞を有し、トマト黄化葉巻ウイルス抵抗性を有する、ナス科植物およびその部分。
［４９］ 果実である、［４８］に記載のナス科植物の部分。
［５０］ 種子である、［４８］に記載のナス科植物の部分。
［５１］ ［４８］～［５０］のいずれかに記載のナス科植物またはその部分の加工品。
［５２］ 食用である、［５１］に記載の加工品。
［２７］ 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物細胞。
［２８］前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、［２７］に記載のナス科植物。
［２９］ 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、［２７］に記載のナス科植物細胞。
［３０］ 前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［２７］～［２９］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
［３１］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３２］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３３］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３４］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、［２７］～［３０］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［３５］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３１］に記載のナス科植物細胞。
［３６］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［３５］に記載のナス科植物細胞。
［３７］ 前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［３６］に記載のナス科植物細胞。
［３８］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３２］に記載のナス科植物細胞。
［３９］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［３８］に記載のナス科植物細胞。
［４０］ 前記配列番号６に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、［３９］に記載のナス科植物細胞。
［４１］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［３３］に記載のナス科植物細胞。
［４２］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３５または３８に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［４１］に記載のナス科植物細胞。
［４３］ 前記配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４８～５０から選ばれる１種に示される塩基配列に変異している、および／または前記配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５１または５２に示される塩基配列に変異している、［４２］に記載のナス科植物細胞。
［４４］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［４３］に記載のナス科植物細胞。
［４５］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、［４４］に記載のナス科植物細胞。
［４６］ 前記配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５３または５４に示される塩基配列に変異している、［４５］に記載のナス科植物細胞。
［４７］ トマトである、［２７］～［４６］のいずれかに記載のナス科植物細胞。
［４８］ ［２７］～［４７］のいずれかに記載のナス科植物細胞を有し、トマト黄化葉巻ウイルス抵抗性を有する、ナス科植物およびその部分。
［４９］ 果実である、［４８］に記載のナス科植物の部分。
［５０］ 種子である、［４８］に記載のナス科植物の部分。
［５１］ ［４８］～［５０］のいずれかに記載のナス科植物またはその部分の加工品。
［５２］ 食用である、［５１］に記載の加工品。
【0019】
さらに本発明は、以下のナス科植物の作出方法、および当該作出方法によって得られたナス科植物を提供する。
［５３］ 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、前記選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または前記選択した遺伝子のコードするタンパク質が、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、前記ウイルスに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程とを含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性の、ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５４］前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、［５３］に記載のナス科植物。
［５５］ 前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、［５３］または［５４］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５６］ 前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［５３］～「５５］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
［５７］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５８］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５９］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６０］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６１］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５７］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６２］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［６１］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６３］ 前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、［６２］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６４］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５８］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６５］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［６４］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６６］ 前記配列番号６に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、［６５］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６７］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５９］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６８］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３５または３８に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［６７］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６９］ 前記配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４８～５０から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、および／または前記配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５１または５２に示される塩基配列になるように変異を導入する、［６８］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７０］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［６０］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７１］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［７０］に記載のトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７２］ 前記配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５３または５４に示される塩基配列になるように変異を導入する、［７１］に記載のトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７３］ 前記ナス科植物がトマトである、［５３］～［７２］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７４］ ［５３］～［７３］のいずれかに記載の作出方法によって得られた、ウイルス抵抗性ナス科植物。
［５３］ 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、前記選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または前記選択した遺伝子のコードするタンパク質が、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、前記ウイルスに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程とを含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性の、ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５４］前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、［５３］に記載のナス科植物。
［５５］ 前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、［５３］または［５４］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５６］ 前記変異が、下記（ａ）～（ｄ）の少なくとも１種である、［５３］～「５５］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
［５７］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５８］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［５９］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６０］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、［５３］～［５６］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６１］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５７］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６２］ 前記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［６１］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６３］ 前記配列番号３に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１３～１８から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、［６２］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６４］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５８］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６５］ 前記受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［６４］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６６］ 前記配列番号６に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号１９～２２から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、［６５］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６７］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または３６に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［５９］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６８］ 前記ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号３５または３８に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［６７］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［６９］ 前記配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号４８～５０から選ばれる１種に示される塩基配列になるように変異を導入する、および／または前記配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５１または５２に示される塩基配列になるように変異を導入する、［６８］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７０］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列に対して８５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、［６０］に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７１］ 前記核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、［７０］に記載のトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７２］ 前記配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号５３または５４に示される塩基配列になるように変異を導入する、［７１］に記載のトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７３］ 前記ナス科植物がトマトである、［５３］～［７２］のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
［７４］ ［５３］～［７３］のいずれかに記載の作出方法によって得られた、ウイルス抵抗性ナス科植物。
【0020】
さらに本発明は、以下のナス科植物育種後代の作出方法および当該作出方法によって得られたナス科植物を提供する。
［７５］ ［５３］～［７３］のいずれかに記載の作出方法によって得られたウイルス抵抗性ナス科植物またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性のウイルス抵抗性ナス科植物の育種後代の作出方法。
［７６］ ［７５］に記載の作出方法によって得られた、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性である、ウイルス抵抗性ナス科植物。
［７５］ ［５３］～［７３］のいずれかに記載の作出方法によって得られたウイルス抵抗性ナス科植物またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性のウイルス抵抗性ナス科植物の育種後代の作出方法。
［７６］ ［７５］に記載の作出方法によって得られた、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性である、ウイルス抵抗性ナス科植物。
【発明の効果】
【0021】
本発明によれば、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染後の当該ウイルスの増殖を抑制する性質および／または当該ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有する、当該ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】図１は、トマトの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子（ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）のｃＤＮＡ配列であり、下線部がエクソン２であり、２重下線部がガイドＲＮＡ認識部分（エクソン２の１３５番塩基～１５４番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。
【図2】図２は、トマトの受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子（ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）のｃＤＮＡ配列であり、下線部がエクソン１であり、２重下線部がガイドＲＮＡ認識部分（エクソン１の７９０番塩基～８０９番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。
【図3】図３は、ＴＹＬＣＶ接種から４２日後の、ＴＹＬＣＶ感染の症状を示さない、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の編集系統Ａ１３２のＴ１個体（図中の（ａ））、およびＴＹＬＣＶ感染の症状を示した対照の変異を導入していないトマト（図中の（ｂ））である。
【図4】図４は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の編集系統Ａ１３２のＴ１個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２５日目に症状の有無及びＰＣＲ検定に基づき求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【図6】図６は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の編集系統Ａ１３２－１０のＴ２個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２２日目に症状の有無およびＰＣＲ検定の結果から求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【図7】図７は、ＴＹＬＣＶ接種から２５日後の、ＴＹＬＣＶ感染の症状を示さない、ＲＬＫ遺伝子の編集系統Ｃ６のＴ１個体（図中の（ａ）および（ｂ））、ならびにＴＹＬＣＶ感染の症状を示した対照の変異を導入していないトマト（図中の（ｃ））である。
【図9】図９は、ＲＬＫ遺伝子の編集系統Ｃ７２のＴ１個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２８日目に症状の有無およびＰＣＲ検定の結果から求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【図10】図１０は、ＲＬＫ遺伝子の編集系統Ｃ６－１８のＴ２個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２２日目に症状の有無およびＰＣＲ検定の結果から求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【図13】図１３は、トマトの染色体１番に存在する、ポリマーコート複合体ＣＯＰＩの成分をコードするｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）であり、下線部がエクソン６であり、２重下線部がガイドＲＮＡ認識部分（エクソン６の７０番塩基～８９番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。
【図14】図１４は、トマトの染色体１０番に存在する、ポリマーコート複合体ＣＯＰＩの成分をコードするｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）であり、下線部がエクソン２であり、２重下線部がガイドＲＮＡ認識部分（エクソン２の３１番塩基～５０番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。
【図15】図１５は、トマトの核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）のｃＤＮＡ配列であり、２重下線部がガイドＲＮＡ認識部分（エクソン４の７４番塩基～９３番塩基）であり、四角で囲った部分がＰＡＭ配列である。
【図16】図１６は、染色体１番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の編集系統Ｄ１６のＴ１個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２１日目に症状の有無およびＰＣＲ検定の結果から求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【図17】図１７は、染色体１０番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の編集系統Ｅ４のＴ１個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２１日目に症状の有無およびＰＣＲ検定の結果から求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【図18】図１８は、ＮＳＩ遺伝子の編集系統Ｆ４３のＴ１個体、および対照の変異を導入していないトマトについて、ウイルス接種から２１日目に症状の有無およびＰＣＲ検定の結果から求めた罹病率を示すグラフであり、各バーの下の括弧内の数字はサンプル数である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ナス科植物がその翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子、および／または核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有し、当該変異によって、変異を有する遺伝子（ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、ＲＬＫ遺伝子、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子、ＮＳＩ遺伝子あるいはそれらの相同遺伝子）の発現が抑制されているか、または変異を有する遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルス（例えばＴＹＬＣＶ）に対して非機能的であると、ナス科植物が当該ウイルスに対して抵抗性を有することを見出した。このようなトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルス抵抗性の植物は、ナス科では初めての報告である。
【0024】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」とも言う。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施形態および図面に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【0025】
本発明において、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに特に限定は無いが、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）であることが好ましい。以下、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの具体例としてＴＹＬＣＶを用いて本発明を説明するが、これらの説明は、本発明に係るベゴモウイルス属ウイルスをＴＹＬＣＶに限定するものではない。以下の説明においては、「ＴＹＬＣＶ」を「トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルス」と読み替えることもできることを理解されたい。
【0026】
［Ｉ］ＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物
一態様において、本実施形態は、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物に関する。本実施形態において、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物とは、ＴＹＬＣＶの感染を阻害する性質、感染してもＴＹＬＣＶの増殖を抑制する性質および／またはＴＹＬＣＶの感染症状の発現を抑制する性質を有する植物である。ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、ＴＹＬＣＶの感染を阻害するか、感染してもＴＹＬＣＶの増殖を抑制する性質を有する植物であることが好ましい。
一態様において、本実施形態は、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物に関する。本実施形態において、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物とは、ＴＹＬＣＶの感染を阻害する性質、感染してもＴＹＬＣＶの増殖を抑制する性質および／またはＴＹＬＣＶの感染症状の発現を抑制する性質を有する植物である。ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、ＴＹＬＣＶの感染を阻害するか、感染してもＴＹＬＣＶの増殖を抑制する性質を有する植物であることが好ましい。
【0027】
本実施形態において「トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）」とは、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）ベゴモウイルス属（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）に分類される、環状１本鎖ＤＮＡを１分節ゲノムとして有し、直径約２０ｎｍの球体状のウイルス粒子が２つ結合した双球状であるウイルスを意味する。
【0028】
ＴＹＬＣＶは、中近東、北中米、東南アジア、東アジア（日本、中国）などで主に発生している。日本で発生しているＴＹＬＣＶは、主に２系統存在し、長崎で発見された分離株をはじめ、九州、関東などで発生しているＴＹＬＣＶイスラエル系統と、東海、関東で発生しているイスラエルマイルド系統がある。
【0029】
本実施形態においてナス科植物は、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ科に属する植物である限り特に限定はなく、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ属）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属等に属する植物が挙げられる。具体的には、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）等が挙げられ、好ましくはトマト、ナス、ジャガイモであり、特に好ましくはトマトである。
【0030】
一態様において、本実施形態のＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有する。
【0031】
（ｅＩＦ４Ｅ遺伝子）
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子とは、“ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｃｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ”、即ち、真核生物翻訳開始因子４Ｅをコードする遺伝子である。ｅＩＦ４Ｅは、真核生物における翻訳開始因子の一種であり、タンパク質合成の開始において重要な役割を有する。ｅＩＦ４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとともに、ｅＩＦ４Ｅファミリーを構成している。また、ナス科植物は、複数のｅＩＦ４Ｅのアイソフォームを有すると考えられる。例えば、トマトにおいては、ｅＩＦ４Ｅは２種のアイソフォームからなり、２番染色体および３番染色体上に存在することが知られている。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、トマトにおいて１種存在し、９番染色体上に存在することが知られている。
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子とは、“ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｃｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ”、即ち、真核生物翻訳開始因子４Ｅをコードする遺伝子である。ｅＩＦ４Ｅは、真核生物における翻訳開始因子の一種であり、タンパク質合成の開始において重要な役割を有する。ｅＩＦ４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅとともに、ｅＩＦ４Ｅファミリーを構成している。また、ナス科植物は、複数のｅＩＦ４Ｅのアイソフォームを有すると考えられる。例えば、トマトにおいては、ｅＩＦ４Ｅは２種のアイソフォームからなり、２番染色体および３番染色体上に存在することが知られている。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、トマトにおいて１種存在し、９番染色体上に存在することが知られている。
【0032】
さらに他のナス科植物にも、トマトのｅＩＦ４Ｅと相同な遺伝子の存在が知られている。例えば、トウガラシには、トマトのｅＩＦ４Ｅと相同な遺伝子として、４番染色体上にあるｐｖｒ１およびｐｖｒ２の存在が知られている（尚、ｐｖｒ１とｐｖｒ２はアレルの関係にある）。さらに、トマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと相同な遺伝子として、３番染色体上のｐｖｒ６が知られている。
【0033】
上述したｅＩＦ４Ｅのアイソフォームといった、ｅＩＦ４Ｅファミリーを構成するメンバーの遺伝子や、他のナス科植物について知られているｅＩＦ４Ｅと相同な遺伝子は、全て本発明に係わるｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子である。
【0034】
本実施形態において、「ｅＩＦ４Ｅ遺伝子」は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される塩基配列を含むもの、または配列番号１に示される塩基配列からなるものであることが好ましい。尚、「ｃＤＮＡ配列」とは、遺伝子から転写されたｍＲＮＡから逆転写によって合成されたＤＮＡであり、遺伝子に存在するイントロンが除去された、タンパク質コード領域のみからなるＤＮＡ配列である。
【0035】
さらに本実施形態において、「ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子」とは、そのｃＤＮＡ配列が、配列番号１に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列を含むもの、あるいは配列番号１に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列からなるものであることが好ましい。配列番号１の塩基配列との相同性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、相同性の下限値は、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、９９．５％以上など、どのような値でもかまわない。尚、配列番号１に示す塩基配列と、相同性遺伝子のｃＤＮＡ配列との相同性は、公知の方法で決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴといった公知の相同性検索プログラムを使用して、塩基配列の相同性を決定することができる。
【0036】
（ＲＬＫ遺伝子）
ＲＬＫ遺伝子とは、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ”、即ち、受容体様キナーゼをコードするトマトの遺伝子である。ＲＬＫは、シロイヌナズナではＢＡＭ１（Ｂａｒｅｌｙ Ａｎｙ Ｍｅｒｉｓｔｅｍ １）と呼ばれ、葉や配偶子形成に関わる、シュートと花分裂組織機能に必要なＣＬＡＶＡＴＡ１関連レセプター様キナーゼタンパク質をコードしている。また、シロイヌナズナのＢＡＭ１にはかなり相同性の高いＢＡＭ２の存在が認められており、トマトにおいても、近年の研究から、相同性の高い相同体の存在がわかってきた。このような相同体とは、本実施形態に係わるＲＬＫを「ＲＬＫ１」（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０、２番染色体上）とすると、「ＲＬＫ２」として知られるものである。尚、シロイヌナズナのＢＡＭ１については、ＴＹＬＣＶの近縁ウイルスのＣ４タンパク質との関連や、近縁ウイルスの複製にも関与することが示唆されているものの、トマトのＲＬＫとＴＹＬＣＶとの関係については、今まで報告はない。
ＲＬＫ遺伝子とは、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ”、即ち、受容体様キナーゼをコードするトマトの遺伝子である。ＲＬＫは、シロイヌナズナではＢＡＭ１（Ｂａｒｅｌｙ Ａｎｙ Ｍｅｒｉｓｔｅｍ １）と呼ばれ、葉や配偶子形成に関わる、シュートと花分裂組織機能に必要なＣＬＡＶＡＴＡ１関連レセプター様キナーゼタンパク質をコードしている。また、シロイヌナズナのＢＡＭ１にはかなり相同性の高いＢＡＭ２の存在が認められており、トマトにおいても、近年の研究から、相同性の高い相同体の存在がわかってきた。このような相同体とは、本実施形態に係わるＲＬＫを「ＲＬＫ１」（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０、２番染色体上）とすると、「ＲＬＫ２」として知られるものである。尚、シロイヌナズナのＢＡＭ１については、ＴＹＬＣＶの近縁ウイルスのＣ４タンパク質との関連や、近縁ウイルスの複製にも関与することが示唆されているものの、トマトのＲＬＫとＴＹＬＣＶとの関係については、今まで報告はない。
【0037】
本実施形態において、「ＲＬＫ遺伝子」は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号４に示される塩基配列を含むもの、または配列番号４に示される塩基配列からなるものであることが好ましい。
【0038】
本実施形態において「ＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子」とは、そのｃＤＮＡ配列が、配列番号４に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列を含むもの、あるいは配列番号４に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列からなるものであることが好ましい。配列番号４の塩基配列との相同性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、相同性の下限値は、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、９９．５％以上など、どのような値でもかまわない。尚、配列番号４に示す塩基配列と、相同性遺伝子のｃＤＮＡ配列との相同性は、公知の方法で決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴといった公知の相同性検索プログラムを使用して、塩基配列の相同性を決定することができる。
【0039】
（ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子）
ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、ポリマーコート複合体ＣＯＰＩの成分をコードする遺伝子である。ＣＯＰＩの正確な役割の詳細は不明ではあるが、ゴルジ体との関連、およびゴルジ体への小胞輸送との関連が知られている。シロイヌナズナの研究においては、小胞輸送はジェミニウイルス科のウイルスの移行タンパク質の輸送に関連があるため、ウイルス感染にも関係があると推察されている。
ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、ポリマーコート複合体ＣＯＰＩの成分をコードする遺伝子である。ＣＯＰＩの正確な役割の詳細は不明ではあるが、ゴルジ体との関連、およびゴルジ体への小胞輸送との関連が知られている。シロイヌナズナの研究においては、小胞輸送はジェミニウイルス科のウイルスの移行タンパク質の輸送に関連があるため、ウイルス感染にも関係があると推察されている。
【0040】
トマトでは、２種のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の存在が認められており、それぞれ染色体１番と１０番に存在する（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０、Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）。よって本明細書においては、染色体１番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子を「ｄｅｌｔａ０１遺伝子」と略し、染色体１０番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰを「ｄｅｌｔａ１０遺伝子」と略す場合があり、「ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子」という記載は、上記２種の遺伝子の両方またはいずれか一方を意味するものとする。
【0041】
タバコにおいては、ＴＹＬＣＶと近縁のＴＹＬＣＳＶの感染に関与することが示唆されているものの、トマトのｄｅｌｔａＣＯＰとＴＹＬＣＶとの関係については、今まで報告はない。
【0042】
本実施形態において、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３３または配列番号３６に示される塩基配列を含むもの、あるいは配列番号３３または配列番号３６に示される塩基配列からなるものであることが好ましい。尚、配列番号３３のｃＤＮＡ配列は染色体１番に存在するｄｅｌｔａ０１遺伝子に対応するものであり、配列番号３４のｃＤＮＡ配列は染色体１０番に存在するｄｅｌｔａ１０遺伝子に対応するものである。
【0043】
本実施形態において、「ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の相同遺伝子」とは、そのｃＤＮＡ配列が、配列番号３３または配列番号３６に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列を含むもの、あるいは配列番号３３または配列番号３６に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列からなるものであることが好ましい。配列番号３３または配列番号３６の塩基配列との相同性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、相同性の下限値は、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、９９．５％以上など、どのような値でもかまわない。尚、配列番号３３または配列番号３６に示す塩基配列と、相同性遺伝子のｃＤＮＡ配列との相同性は、公知の方法で決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴといった公知の相同性検索プログラムを使用して、塩基配列の相同性を決定することができる。
【0044】
（ＮＳＩ遺伝子）
ＮＳＩ遺伝子は、核シャトルタンパク質相互作用因子であると考えられている。シロイヌナズナの研究において、ＮＳＩ遺伝子は、ベゴモウイルス属のＣａｂｂａｇｅ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ（ＣａＬＣｕＶ）の移行タンパク（ＮＳＰ；核シャトルタンパク質）と相互作用することが示されている。そのため、ＣａＬＣｕＶのウイルス感染および複製に関与すると推察される。トマトでは、ＮＳＩ遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子として染色体１０番に存在する（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）。アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子は、染色体５番にもう１つ存在する（Ｓｏｌｙｃ０５ｇ０１０２５０）が、前者と後者の相同性は高くない。トマトのＮＳＩ遺伝子とＴＹＬＣＶとの関係については、今まで報告はない。
ＮＳＩ遺伝子は、核シャトルタンパク質相互作用因子であると考えられている。シロイヌナズナの研究において、ＮＳＩ遺伝子は、ベゴモウイルス属のＣａｂｂａｇｅ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ（ＣａＬＣｕＶ）の移行タンパク（ＮＳＰ；核シャトルタンパク質）と相互作用することが示されている。そのため、ＣａＬＣｕＶのウイルス感染および複製に関与すると推察される。トマトでは、ＮＳＩ遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子として染色体１０番に存在する（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）。アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子は、染色体５番にもう１つ存在する（Ｓｏｌｙｃ０５ｇ０１０２５０）が、前者と後者の相同性は高くない。トマトのＮＳＩ遺伝子とＴＹＬＣＶとの関係については、今まで報告はない。
【0045】
本実施形態において、ＮＳＩ遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列が配列番号３９に示される塩基配列を含むもの、または配列番号３９に示される塩基配列からなるものであることが好ましい。
【0046】
本実施形態において「ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子」とは、そのｃＤＮＡ配列が、配列番号３９に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列を含むもの、あるいは配列番号３９に示される塩基配列に対して配列相同性を有する塩基配列からなるものであることが好ましい。配列番号３９の塩基配列との相同性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、相同性の下限値は、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、９９．５％以上など、どのような値でもかまわない。尚、配列番号３９に示す塩基配列と、相同性遺伝子のｃＤＮＡ配列との相同性は、公知の方法で決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴといった公知の相同性検索プログラムを使用して、塩基配列の相同性を決定することができる。
【0047】
（ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子）
本実施形態において、ナス科植物は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子に変異を有する（以下、変異を有する遺伝子を「ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子」ともいう）。当該変異とは、変異を有する遺伝子の発現を抑制するか、または遺伝子がコードするタンパク質をＴＹＬＣＶに対して非機能的とするものである。ＴＹＬＣＶに対して非機能的なタンパク質とは、ＴＹＬＣＶが植物に感染し、増殖する際に利用できないか、ＴＹＬＣＶの感染および増殖を低減させるタンパク質を指す。一態様において、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子は、タンパク質をコードしないように変異したものであってもよい。
本実施形態において、ナス科植物は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子に変異を有する（以下、変異を有する遺伝子を「ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子」ともいう）。当該変異とは、変異を有する遺伝子の発現を抑制するか、または遺伝子がコードするタンパク質をＴＹＬＣＶに対して非機能的とするものである。ＴＹＬＣＶに対して非機能的なタンパク質とは、ＴＹＬＣＶが植物に感染し、増殖する際に利用できないか、ＴＹＬＣＶの感染および増殖を低減させるタンパク質を指す。一態様において、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子は、タンパク質をコードしないように変異したものであってもよい。
【0048】
理論に束縛されるものではないが、ＴＹＬＣＶが植物に感染する際には、ナス科植物に存在する複数のｅＩＦ４Ｅのアイソフォームのうち、特定のｅＩＦ４Ｅを用いると考えられる。このとき、ＴＹＬＣＶの使用する特定のアイソフォーム（即ち、ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ）をコードする遺伝子が変異し、ＴＹＬＣＶが使用する特定のｅＩＦ４Ｅタンパク質が産生されなくなるか、または産生されたｅＩＦ４Ｅタンパク質がＴＹＬＣＶに対して非機能的なものであると、ウイルスゲノム上にコードされる、感染増殖に必要なタンパク質の翻訳が進行しなくなると考えられる。もしくはｅＩＦ４Ｅとの相互作用を必要とするＴＹＬＣＶタンパク質がその機能を果たせなくなり、ＴＹＬＣＶの感染および増殖が阻害されることで、ナス科植物がＴＹＬＣＶ抵抗性を獲得すると考えられる。
【0049】
一方、ナス科植物に存在する複数のｅＩＦ４Ｅ相同体のうちの１つが変異しても、植物自体は他の相同体を利用可能であるか、または植物自体はＴＹＬＣＶに非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質を利用可能であるため、宿主であるナス科植物の生育に影響を与えることなく、ＴＹＬＣＶ抵抗性を付与することが可能であると考えられる。
【0050】
ＲＬＫについても、上述したように、ＲＬＫ１（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０、２番染色体上）と相同性の高いＲＬＫ２の存在が知られており、植物において互いに補佐しながら存在していると考えられる。
【0051】
ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子は、前述のように２つのホモログが存在し、互いに補佐して存在すると考えられる。
【0052】
また、ＮＳＩ遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子と考えられ、トマトには２種の遺伝子が存在している。
【0053】
上述したようにＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を有するナス科植物は、ＴＹＬＣＶ抵抗性を獲得する。例えば、ＴＹＬＣＶ接種から２０日以上経っても、植物体中のＴＹＬＣＶの蓄積量が、ＴＹＬＣＶ非接種株と同程度またはそれ以下であること、および／またはＴＹＬＣＶ感染症状が目視により確認できないことをもって、植物が「ＴＹＬＣＶ抵抗性」を有すると判定することができる。具体的には、後述の実施例に示すとおり、常法により植物にＴＹＬＣＶを感染させ、植物体中のＴＹＬＣＶの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法等の公知の手法で確認することにより、植物のＴＹＬＣＶ抵抗性を判断することができる。また、ＴＹＬＣＶを感染させた植物のＴＹＬＣＶ感染症状（葉のモザイク化や黄化、糸葉、矮化、壊疽等）の有無を確認することによっても、植物のＴＹＬＣＶ抵抗性を判断することができる。
【0054】
ナス科植物が上述したＴＹＬＣＶ抵抗性を有する限り、遺伝子変異は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子に存在すればよい。よって、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子および／またはその相同遺伝子に変異を有するナス科植物、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子および／またはその相同遺伝子に変異を有するナス科植物、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子および／またはその相同遺伝子に変異を有するナス科植物、核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子および／またはその相同遺伝子に変異を有するナス科植物、ならびに翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその相同遺伝子と、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子またはその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子またはその相同遺伝子、および核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子またはその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも２つ以上に変異を有するナス科植物が本実施形態には含まれ得る。
【0055】
さらに本実施形態におけるＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子に変異を有する場合、ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子の全てに変異を有してもよい。例えば、複二倍体等の倍数体植物の場合、複数存在する、ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が、全てＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子に変異していることが好ましい。このようなＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が変異している限り、他の正常なｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有するものであってもよい。また、ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする内生の遺伝子が全て欠失、破壊等して機能を喪失し、代わりに外来のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を導入したものであってもよい。
【0056】
ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物がＲＬＫ遺伝子、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子、および／またはＮＳＩ遺伝子に変異を有する場合も上記と同様である。即ち、本発明に係るＴＹＬＣＶに対して機能的ないずれかのタンパク質をコードする遺伝子の全てに変異を有してもよく、ＴＹＬＣＶに対して機能的なタンパク質をコードする遺伝子が、全てＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子に変異していることが好ましい。このようなＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、ＴＹＬＣＶに対して機能的ないずれかのタンパク質をコードする遺伝子が変異している限り、他の正常な遺伝子を有するものであってもよい。また、ＴＹＬＣＶに対して機能的ないずれかのタンパク質をコードする内生の遺伝子を全て欠失、破壊等して機能を喪失し、代わりに外来の相同な遺伝子を導入したものであってもよい。
【0057】
一態様において、本実施形態におけるＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、そのゲノム内の遺伝子に変異を有する。遺伝子変異の具体例としては、以下の（ａ）～（ｄ）が挙げられる。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
（ａ）フレームシフト変異、
（ｂ）ナンセンス変異、
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７）の欠損、および
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入。
【0058】
（ａ）フレームシフト変異は、塩基の欠失または挿入により、コドンの読み枠がずれ、異なるアミノ酸配列をコードするようになる変異である。コードするアミノ酸配列が変わることにより、変異遺伝子はＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子となる。
【0059】
（ｂ）ナンセンス変異は、本来アミノ酸をコードしていたコドンが終止コドンに変わる変異であり、これにより、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子となる。
【0060】
（ｃ）連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７、好ましくはｎ＝１～３、例えば３ｎ塩基は、３、６または９塩基）の欠損により、当該欠損領域から下流の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が変化する。このような変化が生じるため、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子となる。
【0061】
（ｄ）１または複数の塩基の置換、欠失、付加、および／または挿入により、変異領域の下流の塩基配列がコードするアミノ酸配列の読み枠が変化する。読み枠の変化により、元々コードしていたアミノ酸配列が変わり、タンパク質の構造変化等が生じるため、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子となる。一態様において、この変異は、コドンの３番目以外の塩基の変異であることが好ましい。置換、欠失、付加、および／または挿入される塩基の個数は、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子が得られる限り特に限定されないが、例えば、１～５個、１～３個、または１～２個とすることができる。
【0062】
ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子の有する変異は、上記（ａ）～（ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。尚、上記（ａ）～（ｄ）の変異は、択一的なものではなく、例えば、（ｃ）や（ｄ）の変異の結果として、（ａ）や（ｂ）の変異が起こることもある。
【0063】
ナス科植物のゲノム内の変異は、変異を有する遺伝子の発現を抑制するもの、または当該遺伝子のコードするタンパク質をＴＹＬＣＶに対して非機能的にするものであって、変異遺伝子を有する植物にＴＹＬＣＶ抵抗性を付与し、且つ当該植物の生命および生育に著しい障害を与えないものである限り、特に限定はない。
【0064】
次に、このような変異について具体的に説明する。
【0065】
一態様において、ナス科植物がｅＩＦ４Ｅ遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２（配列番号２）内に存在することが好ましく、エクソン２内の１３５番～１５４番塩基を含む領域、即ち、配列番号３に示したＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣを含む領域に存在することがより好ましい。ナス科植物がｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号２に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号３に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。
【0066】
ナス科植物が配列番号３に示したＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣまたはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、１塩基挿入、３塩基欠損、もしくは９塩基の欠損または置換であることが好ましい。このような変異の具体例としては、１５番目と１６番目の塩基間への１塩基挿入（一例として、Ｃ（シトシン）の挿入）、１６～１８番目の３塩基欠損、８～１８番目のいずれか９塩基の欠損（好ましくは、１０番目および１３番目以外の９塩基の欠損）が挙げられる。このような変異を有する領域の塩基配列を図１１および配列番号１３～１８に示した。
【0067】
また、本発明においては、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のアイソフォームであるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に、上記ｅＩＦ４Ｅ遺伝子と類似した変異を有する、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物の作出にも成功した。
【0068】
一態様において、ナス科植物がＲＬＫ遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、ＲＬＫ遺伝子のエクソン１（配列番号５）内に存在することが好ましく、エクソン１内の７９０番～８０９番塩基を含む領域、即ち、配列番号６に示したＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＴを含む領域内に存在することがより好ましい。ナス科植物がＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号５に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号６に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。
【0069】
ナス科植物が配列番号６に示したＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＴまたはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、５塩基欠損、７塩基欠損、もしくは１塩基の挿入または置換であることが好ましい。このような変異を有する領域の塩基配列を図１２および配列番号１９～２２に示した。
【0070】
一態様において、ナス科植物がｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、染色体１番のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（即ちｄｅｌｔａ０１遺伝子）のエクソン６（配列番号３４）内に存在することが好ましく、ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン６内の７０番～８９番塩基を含む領域、即ち、配列番号３５に示したＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣを含む領域に存在することがより好ましい。ナス科植物がｄｅｌｔａ０１遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号３４に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。
【0071】
ナス科植物が配列番号３５に示したＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣまたはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、２塩基欠損、３塩基欠損、もしくは６塩基の欠損および1塩基置換であることが好ましい。このような変異の具体例としては、１６～１７番目の２塩基欠損、１５～１７番目の３塩基欠損、１１番目の塩基の置換と１２～１７番目の６塩基の欠損が挙げられる。
【0072】
あるいは、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の変異は、染色体１０番のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（即ちｄｅｌｔａ１０遺伝子）のエクソン２（配列番号３７）に存在することが好ましく、ｄｅｌｔａ１０遺伝子のエクソン２内の３１番～５０番塩基を含む領域、即ち、配列番号３８に示したＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴを含む領域に存在することがより好ましい。ナス科植物がｄｅｌｔａ１０遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号３７に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。
【0073】
ナス科植物が配列番号３８に示したＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴまたはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、１塩基欠損、もしくは４塩基の欠損であることが好ましい。このような変異の具体例としては、１７番目の１塩基欠損、１４～１７番目の４塩基欠損が挙げられる。
【0074】
ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子の変異を有する領域の塩基配列を図１９、配列番号４８～５２に示した。
【0075】
一態様において、ナス科植物がＮＳＩ遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、ＮＳＩ遺伝子のエクソン４（配列番号４０）内に存在することが好ましく、エクソン４内の７４番～９３番塩基を含む領域、即ち、配列番号４１に示したＧＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＴＧＡを含む領域に存在することがより好ましい。ナス科植物がＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子に変異を有する場合、当該変異は、当該相同遺伝子内の、配列番号４０に示される塩基配列に対応する領域に存在することが好ましく、当該領域内の配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域に存在することがより好ましい。
【0076】
ナス科植物が配列番号４１に示したＧＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＴＧＡまたはそれに対応する領域に変異を有する場合、当該変異は、１塩基挿入、もしくは９塩基の欠損であることが好ましい。このような変異の具体例としては、３番目と４番目の塩基間への１塩基挿入（一例として、Ｔ（チミン）の挿入）、４～１２番目の９塩基の欠損が挙げられる。このような変異を有する領域の塩基配列を図２０および配列番号５３と５４に示した。
【0077】
本実施形態は、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子である、配列番号１３～１８のいずれかに示した変異領域を有する変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子自体、配列番号１９～２２のいずれかに示した変異領域を有する変異ＲＬＫ遺伝子自体、配列番号４８～５０および配列番号５１～５２のいずれかに示した変異領域を有する変異ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子自体、ならびに配列番号５３～５４のいずれかに示した変異領域を有する変異ＮＳＩ遺伝子自体に関する。このような遺伝子としては、ｃＤＮＡ配列が配列番号２３～２８のいずれかに示した塩基配列を含むか、または配列番号２３～２８のいずれかに示した塩基配列からなる変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、ｃＤＮＡ配列が配列番号２９～３２のいずれかに示した塩基配列を含むか、または配列番号２９～３２のいずれかに示した塩基配列からなる変異ＲＬＫ遺伝子、ｃＤＮＡ配列が配列番号５５～５９のいずれかに示した塩基配列を含むか、または配列番号５５～５９のいずれかに示した塩基配列からなる変異ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子、ｃＤＮＡ配列が配列番号６０～６１のいずれかに示した塩基配列を含むか、または配列番号６０～６１のいずれかに示した塩基配列からなる変異ＮＳＩ遺伝子が好ましい。本実施形態は、また、ナス科植物にＴＹＬＣＶ抵抗性を付与するための、上記変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、変異ＲＬＫ遺伝子、変異ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子、または変異ＮＳＩ遺伝子の使用にも関する。
【0078】
尚、ナス科植物の有する変異は、上述した領域に限定されるものではなく、ＴＹＬＣＶ抵抗性が損なわれない限り、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、ＲＬＫ遺伝子、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子、ＮＳＩ遺伝子内の他の領域や、他の遺伝子に変異が存在してもよい。
【0079】
一態様において、ナス科植物の遺伝子の変異は、後述するＣＲＩＳＰＲシステム等のゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものであることが好ましい。
【0080】
ゲノム内の変異遺伝子は、２つの対立遺伝子の両方に存在するホモ接合型であっても、一方の対立遺伝子にのみ存在するヘテロ接合型であってもよいが、ホモ接合型であることが好ましい。これは同じ変異配列によって２つの対立遺伝子が特徴付けられるホモ接合型の方が、変異遺伝子によってもたらされる性質が、より強く発現されると考えられるためである。
【0081】
（ＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物およびその部分）
本実施形態におけるＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物は、ＴＹＬＣＶに抵抗性を示す限り、他のウイルスや細菌に対する抵抗性を示す、複合抵抗性ナス科植物であってもよい。他のウイルスの具体例としては、ナス科に感染する全てのポティウイルス（ＰＶＹ等）、ＰＶＹと同様のＶＰｇをウイルスゲノムの５’末端に有し、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているＢｙｍｏｖｉｒｕｓ属およびＳｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルス、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているＣａｒｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルス等が挙げられる。
本実施形態におけるＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物は、ＴＹＬＣＶに抵抗性を示す限り、他のウイルスや細菌に対する抵抗性を示す、複合抵抗性ナス科植物であってもよい。他のウイルスの具体例としては、ナス科に感染する全てのポティウイルス（ＰＶＹ等）、ＰＶＹと同様のＶＰｇをウイルスゲノムの５’末端に有し、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているＢｙｍｏｖｉｒｕｓ属およびＳｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルス、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているＣａｒｍｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルス等が挙げられる。
【0082】
一態様において、本実施形態は、ＴＹＬＣＶ抵抗性を有するナス科植物の部分に関する。当該部分には、上記特徴を有するナス科植物およびその後代植物やクローンの植物体から採取される部分、あるいは植物体または部分から得られる派生物が含まれる。部分の具体例としては、果実、シュート、茎、根、若枝、葯といった器官、ならびに植物の組織や細胞が挙げられる。このような部分はいかなる形態であってもよく、懸濁培養物、プロトプラスト、胚、カルス組織、葉片、配偶体、胞子体、花粉および小胞子でもよい。ナス科植物の派生物としては、種子が挙げられる。
【0083】
また、本実施形態におけるＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物の部分は、接ぎ木に利用する穂木、台木等であってもよい。また、一態様において、本実施形態は、上述のＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物を再生し得る植物細胞（カルスを含む）等にも関し、本実施形態におけるＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物は、このような植物細胞から得られた植物も含む。
【0084】
ＴＹＬＣＶ抵抗性を有するナス科植物の部分は、生食用や加工用に有用である果実が好ましい。また、後代の作出等に有用であることから、当該部分は種子であることも好ましい。
【0085】
（ナス科植物またはその部分の加工品）
一態様において、本実施形態は、ナス科植物またはその部分の加工品に関する。当該加工品に特に限定はなく、食用、工業用、医療用などの加工品が挙げられ、特に食用の加工品であることが好ましい。
一態様において、本実施形態は、ナス科植物またはその部分の加工品に関する。当該加工品に特に限定はなく、食用、工業用、医療用などの加工品が挙げられ、特に食用の加工品であることが好ましい。
【0086】
例えばＴＹＬＣＶ抵抗性を有するナス科植物がトマトの場合、トマトの食用加工品としては、缶詰トマト、トマトペースト、ケチャップ、トマトソース、トマトスープ、乾燥トマト、トマトジュース、トマトパウダー、トマト濃縮物等が挙げられる。また、トマトを原料とする栄養補助食品（サプリメント）等も加工品の一例である。
【0087】
［II］ＴＹＬＣＶ抵抗性を有する、ナス科植物細胞
一態様において、本実施形態は、ＴＹＬＣＶ抵抗性を有するナス科植物細胞に関する。
一態様において、本実施形態は、ＴＹＬＣＶ抵抗性を有するナス科植物細胞に関する。
【0088】
本実施形態のナス科植物細胞は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子が変異を有する。これら遺伝子およびその変異については、ＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物に関連して上述した通りである。
【0089】
ナス科植物細胞のＴＹＬＣＶ抵抗性は、上述した方法によって確認することができる。例えば、常法により植物細胞にＴＹＬＣＶを感染させ、細胞中のＴＹＬＣＶの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法等の公知の手法で検出することにより、ＴＹＬＣＶ抵抗性の有無を確認することができる。
【0090】
本実施形態のＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物細胞は、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物およびその後代植物やクローンの植物体または部分から単離したものであってもよいし、後述するＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物の作出方法によって得られる、遺伝子変異を導入した植物細胞でもよい。さらにＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物細胞の形態にも特に限定はなく、懸濁培養物やプロトプラストも含まれる。
【0091】
当該植物細胞は、ナス科植物の細胞である限りその種類に特に限定はないが、トマト、ナス、タバコ、トウガラシ、ジャガイモの細胞であることが好ましく、トマト、ナス、ジャガイモの細胞であることがより好ましく、トマトの細胞であることがさらに好ましい。
【0092】
一態様において、本実施形態は、上述したナス科植物細胞を有し、ＴＹＬＣＶ抵抗性を有する、ナス科植物体およびその部分に関する。当該ナス科植物体およびその部分には、遺伝子変異を導入した植物細胞から再生した植物体または組織や器官といった部分が含まれる。植物細胞から再生した植物体の部分もまた、上述したナス科植物細胞を有する部分である。尚、部分の詳細については、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物に関連して上述した通りである。
【0093】
また、ナス科植物の部分は、生食用や加工用に有用である果実が好ましい。また、後代の作出等に有用であることから、当該部分は種子であることも好ましい。
【0094】
一態様において、本実施形態は、ナス科植物またはその部分の加工品に関する。当該加工品に特に限定はなく、食用、工業用、医療用などの加工品が挙げられ、特に食用の加工品であることが好ましい。
【0095】
［III］ＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物の作出方法
一態様において、本実施形態は、本発明のＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物の作出方法に関する。具体的には、下記の工程を含む作出方法に関する。
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、
ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または選択した遺伝子のコードするタンパク質がＴＹＬＣＶに対して非機能的になる変異を導入する工程と、ＴＹＬＣＶに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程。
一態様において、本実施形態は、本発明のＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物の作出方法に関する。具体的には、下記の工程を含む作出方法に関する。
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より少なくとも１種の遺伝子を選択する工程と、
ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または選択した遺伝子のコードするタンパク質がＴＹＬＣＶに対して非機能的になる変異を導入する工程と、ＴＹＬＣＶに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程。
【0096】
初めに、変異を導入する標的遺伝子を選択する。翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼＲＬＫ遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子ＮＳＩ遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より少なくとも１種の遺伝子を標的遺伝子として選択する。選択する遺伝子は、１種でもよいし、異なる２種以上の遺伝子の組み合わせでもよい。これら遺伝子については、ＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物に関連して上述した通りである。
【0097】
次に、選択した遺伝子に変異を導入する。ゲノム内の遺伝子に変異を導入するための方法としては、大別すると、以下に例示する２通りの方法を挙げることができる。
（１）直接ゲノム編集： ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ、ＲＬＫ、ｄｅｌｔａＣＯＰまたはＮＳＩを有する植物のゲノムを直接編集することにより、目的とする箇所にピンポイントで変異を導入し、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を有する植物を作出する方法。
（２）変異遺伝子導入： 次の手順（Ａ）と（Ｂ）とを組み合わせた方法である。（Ａ）：ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。（Ｂ）：植物が有する、上記（Ａ）で作製したＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、ＴＹＬＣＶに対して機能的な遺伝子をＴＹＬＣＶに対して非機能的なものとする。
以下、それぞれの方法について説明する。
（１）直接ゲノム編集： ＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ、ＲＬＫ、ｄｅｌｔａＣＯＰまたはＮＳＩを有する植物のゲノムを直接編集することにより、目的とする箇所にピンポイントで変異を導入し、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を有する植物を作出する方法。
（２）変異遺伝子導入： 次の手順（Ａ）と（Ｂ）とを組み合わせた方法である。（Ａ）：ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。（Ｂ）：植物が有する、上記（Ａ）で作製したＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、ＴＹＬＣＶに対して機能的な遺伝子をＴＹＬＣＶに対して非機能的なものとする。
以下、それぞれの方法について説明する。
【0098】
（１）直接ゲノム編集
直接ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ等、部位特異的ヌクレアーゼを用いた公知のゲノム編集技術を用いて実施することができる。ゲノムの特定部位を切断可能な制限酵素を用いて二本鎖切断を導入すると、これが修復される際に、修復エラーにより各種変異が導入される。その結果、標的遺伝子（本実施形態ではＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ、ＲＬＫ、ｄｅｌｔａＣＯＰまたはＮＳＩをコードする遺伝子）に変異が導入される。
直接ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ等、部位特異的ヌクレアーゼを用いた公知のゲノム編集技術を用いて実施することができる。ゲノムの特定部位を切断可能な制限酵素を用いて二本鎖切断を導入すると、これが修復される際に、修復エラーにより各種変異が導入される。その結果、標的遺伝子（本実施形態ではＴＹＬＣＶに対して機能的なｅＩＦ４Ｅ、ＲＬＫ、ｄｅｌｔａＣＯＰまたはＮＳＩをコードする遺伝子）に変異が導入される。
【0099】
特に高い特異性および高効率で変異を導入することができるため、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることが好ましく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いることが特に好ましい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、標的遺伝子と相補的な２０塩基長程度の配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が標的を認識し、Ｃａｓ９タンパク質が二本鎖を切断し、これが非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路によって修復される際に、修復エラーにより標的部位に変異が導入される。
【0100】
植物へのＣａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡの送達は、それらをコードするベクターを介して、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、標準的なトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルボンバードメント法等を用いて行うことができる。
【0101】
簡便には、後述の実施例に示すように、Ｃａｓ遺伝子およびｓｇＲＮＡを組み込んだバイナリベクターを構築し、これを用いてアグロバクテリウムを形質転換した後、このアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換することで、植物へのＣａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡの送達を行うことができる（Friedrich Fauser et al., "The Plant Journal," 2014, 79: 348-359、および大澤良および江面浩、「新しい植物育種技術を理解しよう－ＮＢＴ（New plant breeding techniques）」、国際文献社、２０１３等を参照）。
【0102】
アグロバクテリウムにより形質転換する植物の形態は、植物体を再生しうるものであれば特に限定されず、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が挙げられる。アグロバクテリウムの除去後、用いたベクターに応じた薬剤を含む培地中で培養して、薬剤耐性を指標に目的遺伝子が組み込まれた切片の選別培養をすることができる。
【0103】
高効率で標的部位への変異導入が可能になるように、ガイドＲＮＡを設計することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＰＡＭ配列と呼ばれる３塩基の配列（最も一般的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９を用いる場合はＮＧＧ）の３塩基前が基本的に切断される。標的配列の直後にＰＡＭ配列が存在する必要があるため、ＰＡＭ配列の上流を標的配列として、ガイドＲＮＡを設計することができる。
【0104】
ガイドＲＮＡの設計においては、塩基配列のＧＣ含有率が高いほど切断効率が高くなるため、ＧＣ含有率を考慮することが好ましい。また、オフターゲット効果による非特異的な切断を極力減らすよう設計することができる。一態様において、植物がトマトである場合、ガイドＲＮＡは、３番染色体のエクソン２中の特定の配列（例えば、配列番号３）および／または２番染色体のエクソン１中の特定の配列（例えば、配列番号６）を標的とする塩基配列を有するように設計することが好ましい。
【0105】
例えば、トマトの３番染色体上に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す図１中、エクソン２（図１中の下線部、配列番号２）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（配列番号３）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の相同遺伝子内の、配列番号３に示される塩基配列に対応する領域を標的として選択し、ＰＡＭ配列の選択およびガイドＲＮＡの設計を行うことができる。このようにして標的部位に変異を導入して、ＴＹＬＣＶ抵抗性のｅＩＦ４Ｅ遺伝子を有する植物を作出することができる。
【0106】
トマトの２番染色体上に存在するＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号４）を示す図２中、エクソン１（図２中の下線部、配列番号５）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（配列番号６）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、ＲＬＫ遺伝子の相同遺伝子内の、配列番号６に示される塩基配列に対応する領域を標的として選択し、ＰＡＭ配列の選択およびガイドＲＮＡの設計を行うことができる。このようにして標的部位に変異を導入して、ＴＹＬＣＶ抵抗性のＲＬＫ遺伝子を有する植物を作出することができる。
【0107】
トマトの１番染色体上に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（即ちｄｅｌｔａ０１遺伝子）のｃＤＮＡ配列（配列番号３３）を示す図１３中、エクソン６（図１３中の下線部、配列番号３４）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（配列番号３５）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、ｄｅｌｔａ０１遺伝子の相同遺伝子内の、配列番号３５に示される塩基配列に対応する領域を標的として選択し、ＰＡＭ配列の選択およびガイドＲＮＡの設計を行うことができる。このようにして標的部位に変異を導入して、ＴＹＬＣＶ抵抗性のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子を有する植物を作出することができる。
【0108】
同様に、トマトの１０番染色体上に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（即ちｄｅｌｔａ１０遺伝子）のｃＤＮＡ配列（配列番号３６）を示す図１４中、エクソン２（図１４中の下線部、配列番号３７）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（配列番号３８）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、ｄｅｌｔａ１０遺伝子の相同遺伝子内の、配列番号３８に示される塩基配列に対応する領域を標的として選択し、ＰＡＭ配列の選択およびガイドＲＮＡの設計を行うことができる。このようにして標的部位に変異を導入して、ＴＹＬＣＶ抵抗性のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子を有する植物を作出することができる。
【0109】
トマトの１０番染色体上に存在するＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号３９）を示す図１５中、エクソン４（図１５中の下線部、配列番号４０）に存在する四角で示した箇所をＰＡＭ配列とし、この３塩基から上流の通常２０塩基（配列番号４１）を標的としてガイドＲＮＡを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、ＮＳＩ遺伝子の相同遺伝子内の、配列番号４１に示される塩基配列に対応する領域を標的として選択し、ＰＡＭ配列の選択およびガイドＲＮＡの設計を行うことができる。このようにして標的部位に変異を導入して、ＴＹＬＣＶ抵抗性のＮＳＩ遺伝子を有する植物を作出することができる。
【0110】
ＣＲＩＳＰＲシステムにより遺伝子内に１箇所の二本鎖切断を導入すると、２０塩基程度が修復され、修復エラーにより変異が導入されると考えられる。よって、一態様において、本実施形態のＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子が有する変異は、連続または非連続の３ｎ塩基（ｎ＝１～７、好ましくは１～３）の変異である。
【0111】
さらに本実施形態は、上記ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物を作出するために使用したガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むベクターにも関する。ガイドＲＮＡが有する配列は上述したとおりである。本実施形態は、さらに、上記ガイドＲＮＡを含むキットにも関する。当該キットは、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集を実施するために必要な部位特異的ヌクレアーゼ等を含んでいてもよく、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物を作出するために使用することができる。
【0112】
（２）変異遺伝子導入
変異遺伝子導入は、下記（Ａ）と（Ｂ）の手順を組み合わせた方法である。
（Ａ）：ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。
（Ｂ）：植物が有する、上記（Ａ）で作製したＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、ＴＹＬＣＶに対して機能的な遺伝子をＴＹＬＣＶに対して非機能的なものとする。
上記（Ａ）と（Ｂ）を実施する順序は、植物が死に至らない限り、特に限定はなく、（Ｂ）を先に実施してもよい。なお、（Ｂ）のみを特定の部位において実施する方法が、上記（１）直接ゲノム編集である。
変異遺伝子導入は、下記（Ａ）と（Ｂ）の手順を組み合わせた方法である。
（Ａ）：ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。
（Ｂ）：植物が有する、上記（Ａ）で作製したＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、ＴＹＬＣＶに対して機能的な遺伝子をＴＹＬＣＶに対して非機能的なものとする。
上記（Ａ）と（Ｂ）を実施する順序は、植物が死に至らない限り、特に限定はなく、（Ｂ）を先に実施してもよい。なお、（Ｂ）のみを特定の部位において実施する方法が、上記（１）直接ゲノム編集である。
【0113】
手順（Ａ）において、ＴＹＬＣＶに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする変異遺伝子、非機能的なＲＬＫタンパク質をコードする変異遺伝子、非機能的なｄｅｌｔａＣＯＰタンパク質をコードする変異遺伝子、および／または非機能的なＮＳＩタンパク質をコードする変異遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。変異遺伝子の作製は、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。例えば、所望の変異を有する塩基配列を合成し、これをＰＣＲ等で増幅して得ることができる。ここで導入する変異は、ＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物に関連して上述した通りである。
【0114】
作製した変異遺伝子の植物への導入も、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。簡便には、変異遺伝子を搭載したベクターを用いて、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を用いて実施することができる。ここで導入する変異遺伝子は、ナス科植物由来のｅＩＦ４Ｅ遺伝子（またはその相同遺伝子）、ＲＬＫ遺伝子（またはその相同遺伝子）、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（またはその相同遺伝子）および／またはＮＳＩ遺伝子（またはその相同遺伝子）を変異させたＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子であり、別種の植物のＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子であってもよい。
【0115】
上記ベクターを導入する植物の形態は、植物体を再生しうるものであれば特に限定されず、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が挙げられる。
【0116】
次に手順（Ｂ）において、植物が有する内生のｅＩＦ４Ｅ遺伝子（またはその相同遺伝子）、ＲＬＫ遺伝子（またはその相同遺伝子）、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（またはその相同遺伝子）および／またはＮＳＩ遺伝子（またはその相同遺伝子）の中でＴＹＬＣＶに対して機能的なものを、ＴＹＬＣＶに対して非機能的なものに変化させる。手順（Ｂ）の実施には、植物に変異を導入する方法として公知の手法を用いることができる。例えば、イオンビーム、ＥＭＳなどの変異原処理を用いることができる。上述のＣＲＩＳＰＲやＴＡＬＥＮなどのゲノム編集技術等によっても実施することができる。内生ｅＩＦ４Ｅ、ＲＬＫ、ｄｅｌｔａＣＯＰおよび／またはＮＳＩの中で、ＴＹＬＣＶに対して機能的なものの全てを、ＴＹＬＣＶに対して非機能的なものとすることが望ましい。
【0117】
次に、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を有する植物の部分（葉片や植物細胞等）から植物体を再生する。植物体の再生は、植物の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、トマトについては、Sun H.J. et al., "Plant Cell Physiol.," 2006, 47: 426等、タバコについては、Jefferson R.A. et al., "EMBO J.," 1987, 6: 3901等を参照して行うことができる。
【0118】
さらに再生した植物の中から、ＴＹＬＣＶに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する。当該選別は、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性を確認するための方法によって行うことができる。例えば、常法により植物にＴＹＬＣＶを感染させ、植物体中のＴＹＬＣＶの蓄積をＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ方等の公知の手法で確認することにより、ＴＹＬＣＶ抵抗性を有する植物を選別することができる。また、ＴＹＬＣＶを感染させた植物のＴＹＬＣＶ感染症状（葉のモザイク化や黄化、糸葉、矮化、壊疽等）の有無を確認することによっても、ＴＹＬＣＶに対して抵抗性を有するナス科植物を選別することができる。
【0119】
上記方法によって作出するナス科植物としては、トマト、ナス、タバコ、トウガラシ、ジャガイモ等が挙げられ、好ましくはトマト、ナス、ジャガイモであり、特に好ましくはトマトである。
【0120】
一態様において、本実施形態は、上述した方法により作出したナス科植物に関する。当該ナス科植物は、上記で説明したＴＹＬＣＶ抵抗性のナス科植物と同様である。
【0121】
ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子を有するＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物が一旦得られれば、当該植物の後代やクローンを公知の手法により得ることができる。したがって、本実施形態のＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物には、これらの後代およびクローンも含まれる。
【0122】
一態様において、本実施形態は、上述の作出方法によって得られたＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物（初代）またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、ＴＹＬＣＶ抵抗性ナス科植物の育種後代の作出方法に関する。植物の自家受粉または他家受粉は、当業界で公知の方法で実施することが可能であり、自然状態で行われてもよいし、人為的に行われてもよい。このようにして得られた後代をさらに自家受粉または他家受粉させて、さらなる後代を作出することもできる。
【0123】
他家受粉において初代または後代と掛け合わせるナス科植物は、同じ遺伝子に同じ変異を有するナス科植物、同じ遺伝子に異なる変異を有するナス科植物、または異なる遺伝子に変異を有するナス科植物のいずれであってもよい。例えば、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子に変異を有する植物、ＲＬＫ遺伝子に変異を有する植物、ｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子に変異を有する植物、およびＮＳＩ遺伝子に変異を有する植物から選ばれた２種の間で掛け合わせも可能である。また、複数回の交配を実施することによって、３種以上の遺伝子に変異を有する植物を作出することも可能である。
【実施例】
【0124】
［実施例１］
ｅＩＦ４遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＡの作製
トマトの３番染色体に存在するとされるｅＩＦ４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）のエクソン２（配列番号２）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号３：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＡを構築した。なお、野生株のトマトの３番染色体に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１および配列番号１に示した。
ｅＩＦ４遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＡの作製
トマトの３番染色体に存在するとされるｅＩＦ４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）のエクソン２（配列番号２）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号３：ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＡを構築した。なお、野生株のトマトの３番染色体に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１および配列番号１に示した。
【0125】
構築した組換えベクターＡからガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターＡを得た。このバイナリベクターＡを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社製）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＡを得た。
【0126】
［実施例２］
ＲＬＫ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＢの作製
トマトの２番染色体に存在するとされるＲＬＫ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）のエクソン１（配列番号５）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号６：ＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＴ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＢを構築した。なお、野生株のトマトの２番染色体に存在するＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図２および配列番号４に示した。
ＲＬＫ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＢの作製
トマトの２番染色体に存在するとされるＲＬＫ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）のエクソン１（配列番号５）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号６：ＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＴ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＢを構築した。なお、野生株のトマトの２番染色体に存在するＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図２および配列番号４に示した。
【0127】
構築した組換えベクターＢからガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターＢを得た。このバイナリベクターＢを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社製）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＢを得た。
【0128】
［実施例３］
染色体１番のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＣの作製
トマトの１番染色体に存在するとされるｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）のエクソン６（配列番号３４）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号３５：ＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＣを構築した。なお、野生株のトマトの１番染色体に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１３および配列番号３３に示した。
染色体１番のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＣの作製
トマトの１番染色体に存在するとされるｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）のエクソン６（配列番号３４）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号３５：ＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＣを構築した。なお、野生株のトマトの１番染色体に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１３および配列番号３３に示した。
【0129】
構築した組換えベクターＣからガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターＢを得た。このバイナリベクターＢを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社製）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＣを得た。
【0130】
［実施例４］
染色体１０番のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＤの作製
トマトの１０番染色体に存在するとされるｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）のエクソン２（配列番号３７）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号３８：ＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＤを構築した。なお、野生株のトマトの１０番染色体に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１４および配列番号３６に示した。
染色体１０番のｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＤの作製
トマトの１０番染色体に存在するとされるｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）のエクソン２（配列番号３７）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号３８：ＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＤを構築した。なお、野生株のトマトの１０番染色体に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１４および配列番号３６に示した。
【0131】
構築した組換えベクターＤからガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターＢを得た。このバイナリベクターＤを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社製）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＤを得た。
【0132】
［実施例５］
ＮＳＩ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＥの作製
トマトの１０番染色体に存在するとされるＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）のエクソン４（配列番号４０）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号４１：ＧＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＴＧＡ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＥを構築した。なお、野生株のトマトの１０番染色体に存在するＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１５および配列番号３９に示した。
ＮＳＩ遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムＥの作製
トマトの１０番染色体に存在するとされるＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）のエクソン４（配列番号４０）内に、ガイドＲＮＡが認識する部位を任意に設定した。設定した２０塩基長の部位（配列番号４１：ＧＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＴＧＡ）に対応する二本鎖ＤＮＡを合成し、ベクターｐＵＣ１９＿ＡｔＵ６ｏｌｉｇｏ（国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手）内の制限酵素ＢｂｓＩサイトに挿入し、組換えベクターＥを構築した。なお、野生株のトマトの１０番染色体に存在するＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列を図１５および配列番号３９に示した。
【0133】
構築した組換えベクターＥからガイドＲＮＡ配列領域を含むカセット部位を切り出し、バイナリベクター ｐＺＤ＿ＯｓＵ３ｇＹＳＡ＿ＨｏｌｇｅｒＣａｓ９＿ＮＰＴII内の制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩサイトに挿入し、組換えバイナリベクターＥを得た。このバイナリベクターＥを用いて、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（タカラバイオ社製）を常法により形質転換させ、組換えアグロバクテリウムＥを得た。
【0134】
［実施例６］
トマトの形質転換
形質転換するトマトとして、公知の品種であるマニーメーカーもしくは自社品種Ｓを用いた。アグロバクテリウムを用いたトマトの形質転換は一般的な教科書（例えば、田部井豊編、「形質転換プロトコール＜植物編＞（Protocols for plant transformation）」、株式会社化学同人社、２０１２）に記載の方法に準じて実施した。具体的には、トマトの種子を無菌培地中で発芽させて得た子葉片、または通常播種した子葉片若しくは本葉片を殺菌したものを用意した。次に、実施例１～５で得た組換えアグロバクテリウムＡ～Ｅのそれぞれを、濁度が０．１～１．０になるまで培養した培養液を用意し、当該培養液に葉片を１０分程度浸漬して、アグロバクテリウムに感染させた。
トマトの形質転換
形質転換するトマトとして、公知の品種であるマニーメーカーもしくは自社品種Ｓを用いた。アグロバクテリウムを用いたトマトの形質転換は一般的な教科書（例えば、田部井豊編、「形質転換プロトコール＜植物編＞（Protocols for plant transformation）」、株式会社化学同人社、２０１２）に記載の方法に準じて実施した。具体的には、トマトの種子を無菌培地中で発芽させて得た子葉片、または通常播種した子葉片若しくは本葉片を殺菌したものを用意した。次に、実施例１～５で得た組換えアグロバクテリウムＡ～Ｅのそれぞれを、濁度が０．１～１．０になるまで培養した培養液を用意し、当該培養液に葉片を１０分程度浸漬して、アグロバクテリウムに感染させた。
【0135】
感染から３日後に、アグロバクテリウムを除去した。トマトの葉片をカルベニシリン（１００～５００ｍｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２０～１００ｍｇ／ｍｌ）を加えたムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地と略すこともある）（ＭＳ基本培地に３％ショ糖、１．５ｍｇ／Ｌゼアチン、１％寒天を添加しもの）上に移し、２５℃照明下（１６時間照明／８時間暗黒）での選抜培養に付した。培養開始から１０日～２週間毎に培地を交換して移植継代することで、葉片からのカルス形成を促した。引き続き継代培養を繰り返すことで不定芽を誘導した。
【0136】
不定芽が数センチほどに大きくなったら、発根培地（ＭＳ基本培地に１．５％ショ糖、１％寒天、５０～２５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン、２０～１００ｍｇ／ｍｌカナマイシン、場合によってナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を添加したもの）に移植し、１ヶ月毎に継代しながら１～３ヶ月培養した。
【0137】
発根培地による培養までは全て無菌培養とした。発根した個体は、無菌培地から取り出し、市販の黒土や赤玉土などを混合したポット培土に移植し、生育させた。このようにして得られた再生個体をトランスジェニック当代（以下、Ｔ０と略すこともある）とした。
【0138】
［実施例７］
遺伝子編集継代の選抜
トランスジェニック当代の標的遺伝子内に遺伝子組み換えおよび編集（塩基の欠損、挿入または置換）部位が存在するか否かを確認するために、下記プライマーを用いたＰＣＲによって目的の部位を増幅した。
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）内の領域に対しては、プライマー１（ＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴ（配列番号７））およびプライマー２（ＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣ（配列番号８））、
ＲＬＫ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）内の領域に対しては、プライマー３（ＴＴＡＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＣＣＴＣ（配列番号９））およびプライマー４（ＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＣ（配列番号１０））、
ｄｅｌｔａ０１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）内の領域に関しては、プライマー７（ＣＧＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＡＡＴＧ（配列番号４２））およびプライマー８（ＧＴＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＴ（配列番号４３））、
ｄｅｌｔａ１０遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）内の領域に関しては、プライマー９（ＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧ（配列番号４４））およびプライマー１０（ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣ（配列番号４５））、
ＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）内の領域に関しては、プライマー１１（ＣＡＧＧＴＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号４６））およびプライマー１２（ＴＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧ（配列番号４７））。
尚、プライマー７は、ｄｅｌｔａ０１遺伝子のイントロン内の配列に基づくものであるため、配列番号３３のｃＤＮＡ配列中には対応する配列は存在しない。
遺伝子編集継代の選抜
トランスジェニック当代の標的遺伝子内に遺伝子組み換えおよび編集（塩基の欠損、挿入または置換）部位が存在するか否かを確認するために、下記プライマーを用いたＰＣＲによって目的の部位を増幅した。
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）内の領域に対しては、プライマー１（ＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴ（配列番号７））およびプライマー２（ＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣ（配列番号８））、
ＲＬＫ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）内の領域に対しては、プライマー３（ＴＴＡＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＣＣＴＣ（配列番号９））およびプライマー４（ＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＣＣ（配列番号１０））、
ｄｅｌｔａ０１遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）内の領域に関しては、プライマー７（ＣＧＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＡＡＴＧ（配列番号４２））およびプライマー８（ＧＴＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＴ（配列番号４３））、
ｄｅｌｔａ１０遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）内の領域に関しては、プライマー９（ＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧ（配列番号４４））およびプライマー１０（ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣ（配列番号４５））、
ＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）内の領域に関しては、プライマー１１（ＣＡＧＧＴＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号４６））およびプライマー１２（ＴＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧ（配列番号４７））。
尚、プライマー７は、ｄｅｌｔａ０１遺伝子のイントロン内の配列に基づくものであるため、配列番号３３のｃＤＮＡ配列中には対応する配列は存在しない。
【0139】
ＰＣＲには東洋紡社製の「ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ」を使用し、添付のマニュアルに従ってＤＮＡの増幅を実施した。
【0140】
次に、標的部位内に制限酵素切断部位の存在する制限酵素、具体的には、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子はＰｖｕＩＩ、ＲＬＫ遺伝子はＸｂａＩ、ｄｅｌｔａ０１遺伝子についてはＨｉｎｆＩ、ｄｅｌｔａ１０遺伝子についてはＮｃｏＩ、ＮＳＩ遺伝子についてはＢｓｕ３６Iによって、増幅断片を処理し、当該増幅断片が切断されるか否かを確認した。遺伝子組み換えおよび編集が生じた遺伝子においては、制限酵素部位が変化していることから、制限酵素によって増幅断片が切断されない。これをもって、遺伝子組み換えおよび編集が標的遺伝子内で生じたと判断した（データ非表示）。
【0141】
その結果、いくつかの再生個体において、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子、ＲＬＫ遺伝子、ｄｅｌｔａ０１遺伝子、ｄｅｌｔａ１０遺伝子、またはＮＳＩ遺伝子の配列が編集されていることが確認され、編集系統が選抜された。
【0142】
［実施例８］
ｅＩＦ４Ｅ変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
ＴＹＬＣＶは自然界ではコナジラミにより虫媒されるが、感染葉汁液による機械的接種では感染しない。そのため多検体に効率よくＴＹＬＣＶを感染させるために、アグロバクテリウムによるウイルス感染性クローン接種法を用いた。この方法では、遺伝子組み換えの方法と同様に、アグロバクテリウムのバイナリベクターにＴＹＬＣＶの全長配列を組み込んだもの（感染性クローン）を作製し、当該クローンでアグロバクテリウムを形質転換する。得られた組換えアグロバクテリウムを液体培養した後、培地を０．０１ＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．７）に置換し、植物体（ここではトマト）の成長点、若めの茎もしくは葉柄にアグロバクテリウムを注射等で接種すると、注射部位付近の細胞にアグロバクテリウムが感染する。感染したアグロバクテリウムが植物のゲノムにＴＹＬＣＶのＤＮＡを導入すると、植物ゲノムに導入されたＴＹＬＣＶのＤＮＡはバイナリベクターに設計されたＮＯＳプロモーター等によって発現されて、ウイルスが産生され、感染が成立する。自然界のＴＹＬＣＶも植物細胞の核内で複製されることから、この感染性クローン接種を疑似接種として用いた。
ｅＩＦ４Ｅ変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
ＴＹＬＣＶは自然界ではコナジラミにより虫媒されるが、感染葉汁液による機械的接種では感染しない。そのため多検体に効率よくＴＹＬＣＶを感染させるために、アグロバクテリウムによるウイルス感染性クローン接種法を用いた。この方法では、遺伝子組み換えの方法と同様に、アグロバクテリウムのバイナリベクターにＴＹＬＣＶの全長配列を組み込んだもの（感染性クローン）を作製し、当該クローンでアグロバクテリウムを形質転換する。得られた組換えアグロバクテリウムを液体培養した後、培地を０．０１ＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．７）に置換し、植物体（ここではトマト）の成長点、若めの茎もしくは葉柄にアグロバクテリウムを注射等で接種すると、注射部位付近の細胞にアグロバクテリウムが感染する。感染したアグロバクテリウムが植物のゲノムにＴＹＬＣＶのＤＮＡを導入すると、植物ゲノムに導入されたＴＹＬＣＶのＤＮＡはバイナリベクターに設計されたＮＯＳプロモーター等によって発現されて、ウイルスが産生され、感染が成立する。自然界のＴＹＬＣＶも植物細胞の核内で複製されることから、この感染性クローン接種を疑似接種として用いた。
【0143】
実施例７で選抜した、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験の方法で、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。尚、対照として、変異導入を実施していない野生型品種についても試験を行った。
【0144】
その結果、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の編集系統Ａ１３２のＴ１個体であるＡ１３２－４などの数個体では、ウイルス接種から２０日以上たってもウイルス感染の症状（葉のモザイク化や黄化、糸葉、矮化、壊疽等）が見られなかった。図３に、ウイルス接種から４２日目のＡ１３２－４（図３（ａ））および対照の変異を導入していない野生型トマト（図３（ｂ））を示した。対照では、葉の縁が下側に巻いて奇形になっていることがわかる。また、ウイルス接種から２５日目の感染症状の有無を目視により判定した。検査した植物個体数（サンプル数）に対する、症状及びＰＣＲで陽性を示した植物個体数の割合を罹病率とした。その結果、対照の罹病率は約０．９であり、ｅＩＦ４Ｅ編集系統Ａ１３２の罹病率は０．６と低かった（図４を参照）。尚、ここで実施した試験方法は、自然界の虫媒によるウイルス感染よりも感染圧が高い方法であるため、本試験における罹病率０．６は、自然界においてウイルス感染が生じないと推定される値である。
【0145】
次に無症状株の葉からＤＮＡを抽出し、ＴＹＬＣＶ検出用のプライマー５（ＣＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡ、配列番号１１）およびプライマー６（ＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＧＧＲＣＴＣＴＣＡＡ、配列番号１２）を用いてＰＣＲ検定を行った。その結果、無症状のｅＩＦ４Ｅ編集系統の１株（Ａ１３２－８）からはＰＣＲによってウイルスが検出されたが、残りの株（ｅＩＦ４Ｅ編集系統Ａ１３２－２、Ａ１３２－４、Ａ１３２－９およびＡ１３２－１０）からはウイルスは検出されなかった（図５を参照）。
【0146】
さらに、Ｔ１世代で抵抗性の見られたｅＩＦ４Ｅ編集系統Ａ１３２－１０から種子を採取し、当該種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗（Ｔ２世代に当たる）に対して上述のＴＹＬＣＶ感染性クローン接種を行った。変異導入前のＳ８株を対照とした。ウイルス感染から２２日目に症状の有無に基づき罹病率を求めたところ、対照は０．９％以上であり、ｅＩＦ４Ｅ編集系統Ａ１３２－１０は０．６未満であり、罹病率に明確な差が認められた。さらに無症状株の葉からＴＹＬＣＶのＤＮＡを抽出し、上述のようにＰＣＲ検定を行ったところ、無症状株の１つからウイルス感染が確認された。ＰＣＲによってウイルス感染が確認された個体数を、目視で症状の確認された個体数と合計し、サンプル数に対する合計数の割合をＰＣＲ検査後の罹病率として求めた。その結果、ｅＩＦ４Ｅ編集系統の罹病率は約０．７となったが、それでも対照よりも明らかに低い値であった（図６を参照）。この結果から、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子に導入した変異によって、ＴＹＬＣＶ抵抗性が遺伝していることを確認した。
【0147】
［実施例９］
ＲＬＫ変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ＲＬＫ遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例８と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
ＲＬＫ変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ＲＬＫ遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例８と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
【0148】
その結果、ＲＬＫ遺伝子の編集系統については、接種から２５日目に、ウイルスを接種した４１株中３株が無症状であった。一方、対照では、ウイルスを接種した４２株全てが症状を示していた。図７に、ウイルス接種から３５日目のＣ６－１８（図７（ａ））、Ｃ６－３７（図７（ｂ））、および対照の変異を導入していないトマト（図７（ｃ））を示した。対照では、葉の縁が下側に巻いて奇形になっていることがわかる。次に無症状株であるＣ６－１８およびＣ６－３７の葉からＤＮＡを抽出し、ＴＹＬＣＶ検出用プライマーを用いてＰＣＲ検定を行った。その結果、これら２株からはウイルスは検出されなかった（図８を参照）。
【0149】
また、他のＲＬＫ遺伝子の編集系統であるＣ７２のトランスジェニック後代（Ｔ１）についても、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験を実施した。その結果、ウイルス感染から２５日目に症状の有無に基づき求めた罹病率は、対照が約０．９であり、ＲＬＫ編集系統は約０．４と低かった。さらに無症状の葉におけるウイルスの有無についてＰＣＲ検定を行ったところ、ウイルスは検出されなかった（図９を参照）。
【0150】
さらに、Ｔ１世代で抵抗性の見られたＲＬＫの編集系統Ｃ６－１８から種子を採取し、当該種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗（Ｔ２世代に当たる）に対してＴＹＬＣＶ感染性クローン接種を再度行った。ウイルス接種から２２日目には、対照と比較して、罹病率に差が見られ、ＲＬＫ遺伝子に導入した変異によって、ＴＹＬＣＶ抵抗性が遺伝していることを確認した（図１０を参照）。尚、罹病率の測定は２回実施したが、いずれも同様の結果が得られた。
【0151】
［実施例１０］
ｄｅｌｔａ０１変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ｄｅｌｔａ０１遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例８と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
ｄｅｌｔａ０１変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ｄｅｌｔａ０１遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例８と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
【0152】
その結果、ｄｅｌｔａ０１遺伝子の編集系統であるＤ１６のトランスジェニック後代（Ｔ１）について、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験を実施した。その結果、ウイルス感染から２１日目に症状の有無に基づき求めた罹病率は、対照が約０．９であり、Ｄ１６編集系統は約０．７５と低かった。さらに無症状の葉におけるウイルスの有無についてＰＣＲ検定を行ったところ、ウイルスは検出されなかった（図１６）。
【0153】
［実施例１１］
ｄｅｌｔａ１０変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ｄｅｌｔａ１０遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例５と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
ｄｅｌｔａ１０変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ｄｅｌｔａ１０遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例５と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
【0154】
その結果、ｄｅｌｔａ１０遺伝子の編集系統であるＥ４のトランスジェニック後代（Ｔ１）について、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験を実施した。その結果、ウイルス感染から２１日目に症状の有無に基づき求めた罹病率は、対照が約０．９であり、Ｅ４編集系統は約０．６と優位に低かった。さらに無症状の葉におけるウイルスの有無についてＰＣＲ検定を行ったところ、ウイルスは検出されなかった（図１７）。
【0155】
［実施例１２］
ＮＳＩ変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ＮＳＩ遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例５と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
ＮＳＩ変異トマトのＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験
実施例８と同様に、実施例７で選抜した、ＮＳＩ遺伝子の編集系統の個体（Ｔ０）を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代（Ｔ１）となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例５と同様に、ＴＹＬＣＶ－イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
【0156】
その結果、ＮＳＩ遺伝子の編集系統であるＦ４３のトランスジェニック後代（Ｔ１）について、上述したＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験を実施した。その結果、ウイルス感染から２１日目に症状の有無に基づき求めた罹病率は、対照が約０．９であり、Ｆ４３編集系統は約０．６と優位に低かった。さらに無症状の葉におけるウイルスの有無についてＰＣＲ検定を行ったところ、ウイルスは検出されなかった（図１８）。
【0157】
［実施例１３］
ＴＹＬＣＶ抵抗性ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー１およびプライマー２を用いてＴＹＬＣＶ抵抗性Ｔ１個体のｅＩＦ４Ｅ編集部位付近（すなわち、３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子内のエクソン２（配列番号２）の１４番塩基近傍から３’側の領域）をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
ＴＹＬＣＶ抵抗性ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー１およびプライマー２を用いてＴＹＬＣＶ抵抗性Ｔ１個体のｅＩＦ４Ｅ編集部位付近（すなわち、３番染色体上のｅＩＦ４Ｅ遺伝子内のエクソン２（配列番号２）の１４番塩基近傍から３’側の領域）をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
【0158】
その結果、同領域に数塩基の欠損、挿入または置換が確認された。確認された６種のｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異配列を、配列番号３に示した野生型の塩基配列と共に、図１１に示した。
【0159】
［実施例１４］
ＴＹＬＣＶ抵抗性ＲＬＫ遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー３およびプライマー４を用いてＴＹＬＣＶ抵抗性Ｔ１個体のＲＬＫ編集部位付近（すなわち、２番染色体上のＲＬＫ遺伝子内のエクソン１（配列番号５）の６３１番塩基近傍から３’側の領域）をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
ＴＹＬＣＶ抵抗性ＲＬＫ遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー３およびプライマー４を用いてＴＹＬＣＶ抵抗性Ｔ１個体のＲＬＫ編集部位付近（すなわち、２番染色体上のＲＬＫ遺伝子内のエクソン１（配列番号５）の６３１番塩基近傍から３’側の領域）をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
【0160】
その結果、同領域に数塩基の欠損が確認された。確認された２種のＲＬＫ遺伝子の変異配列を、配列番号６に示した野生型の塩基配列と共に図１２に示した。
【0161】
［実施例１５］
ｄｅｌｔａ０１遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー７（配列番号４２）およびプライマー８（配列番号４３）を用いてＴ０個体のｄｅｌｔａ０１遺伝子エクソン６内の編集部位付近をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
ｄｅｌｔａ０１遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー７（配列番号４２）およびプライマー８（配列番号４３）を用いてＴ０個体のｄｅｌｔａ０１遺伝子エクソン６内の編集部位付近をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
【0162】
その結果、同領域に数塩基の欠損および置換が確認された。確認された３種のｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異配列を、配列番号３５に示した野生型の塩基配列と共に図１９の（Ａ）に示した。
【0163】
［実施例１６］
ｄｅｌｔａ１０遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー９（配列番号４４）およびプライマー１０（配列番号４５）を用いてＴ０個体のｄｅｌｔａ１０遺伝子エクソン２内の編集部位付近をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
ｄｅｌｔａ１０遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー９（配列番号４４）およびプライマー１０（配列番号４５）を用いてＴ０個体のｄｅｌｔａ１０遺伝子エクソン２内の編集部位付近をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
【0164】
その結果、同領域に数塩基の欠損が確認された。確認された２種のｄｅｌｔａ１０遺伝子の変異配列を、配列番号３８に示した野生型の塩基配列と共に図１９の（Ｂ）に示した。
【0165】
［実施例１７］
ＮＳＩのシーケンシング
前述のプライマー１１（配列番号４６）およびプライマー１２（配列番号４７）を用いてＴ１個体のＮＳＩ遺伝子エクソン４内の編集部位付近をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
ＮＳＩのシーケンシング
前述のプライマー１１（配列番号４６）およびプライマー１２（配列番号４７）を用いてＴ１個体のＮＳＩ遺伝子エクソン４内の編集部位付近をＰＣＲ（Ｔ１００サーマルサイクラー、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
【0166】
その結果、同領域に数塩基の欠損および挿入が確認された。確認された２種のＮＳＩ遺伝子の変異配列を、配列番号４１に示した野生型の塩基配列と共に図２０に示した。
【0167】
［実施例１８］
ＴＹＬＣＶ抵抗性のｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびＲＬＫ遺伝子を導入したトマトの形質転換体の作出
実施例１で得た組換えアグロバクテリウムＡおよび実施例２で得た組み換えアグロバクテリウムＢを用いるか、もしくは実施例１及び２のガイドＲＮＡ認識部位をつなげて配したバイナリベクターＦで組み替えたアグロバクテリウムＦを用いて、実施例６と同様に、トマトにアグロバクテリウムを感染させて、トランスジェニック当代を得る。
ＴＹＬＣＶ抵抗性のｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびＲＬＫ遺伝子を導入したトマトの形質転換体の作出
実施例１で得た組換えアグロバクテリウムＡおよび実施例２で得た組み換えアグロバクテリウムＢを用いるか、もしくは実施例１及び２のガイドＲＮＡ認識部位をつなげて配したバイナリベクターＦで組み替えたアグロバクテリウムＦを用いて、実施例６と同様に、トマトにアグロバクテリウムを感染させて、トランスジェニック当代を得る。
【0168】
次に、トランスジェニック当代の標的遺伝子、即ち、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびＲＬＫ遺伝子の両方に、遺伝子組み換えおよび編集（塩基の欠損、挿入または置換）部位が存在するか否かを実施例７と同様に確認し、両方の遺伝子に変異を有する編集系統を選抜する。
【0169】
選抜した編集系統について、実施例８および実施例９と同様の試験方法でＴＹＬＣＶ抵抗性確認試験を実施する。このような試験によって、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびＲＬＫ遺伝子の両方に遺伝子組み換えおよび編集（塩基の欠損、挿入または置換）が存在し、ＴＹＬＣＶ抵抗性を獲得したトマトの作出が確認できる。
【0170】
本出願は、２０１８年１１月２８日出願の特願２０１８－２２２２８９および２０１９年５月２１日出願の特願２０１９－０９５１５０に基づく優先権を主張する。当該出願明細書に記載された内容は、全て本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【0171】
本発明によれば、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスの感染を阻害する性質、感染後の当該ウイルスの増殖を抑制する性質および／または当該ウイルスの感染症状の発現を抑制する性質を有する、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法を提供する。本発明は、当該ウイルスの感染によるナス科植物の収穫量の低減といった、主に農業分野における問題を解消することができる。
【配列表フリーテキスト】
【0172】
配列番号１： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ００５８７０）のｃＤＮＡ配列であり、３１７番～４８２番塩基がエクソン２であり、４５１番～４７０番塩基が標的配列である。
配列番号２： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２であり、１３５番～１５４番塩基が標的配列である。
配列番号３： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２内の標的配列
配列番号４： ＲＬＫ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）のｃＤＮＡ配列であり、１番～２８１８番塩基がエクソン１であり、７９０番～８０９番塩基が標的配列である。
配列番号５： ＲＬＫ遺伝子のエクソン１であり、７９０番～８０９番塩基が標的配列である。
配列番号６： ＲＬＫ遺伝子のエクソン１内の標的配列
配列番号７： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子検出用のプライマー１
配列番号８： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子検出用のプライマー２
配列番号９： ＲＬＫ遺伝子検出用のプライマー３
配列番号１０： ＲＬＫ遺伝子検出用のプライマー４
配列番号１１： ＴＹＬＣＶ検出用のプライマー５
配列番号１２： ＴＹＬＣＶ検出用のプライマー６
配列番号１３： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ１
配列番号１４： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ２
配列番号１５： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ３
配列番号１６： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ４
配列番号１７： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ５
配列番号１８： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ６
配列番号１９： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ１
配列番号２０： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ２
配列番号２１： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ３
配列番号２２： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ４
配列番号２３： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４７１番塩基が変異領域Ｉ１である。
配列番号２４： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ２である。
配列番号２５： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ３である。
配列番号２６： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ４である。
配列番号２７： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６１番塩基が変異領域Ｉ５である。
配列番号２８： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ６である。
配列番号２９： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８０４番塩基が変異領域Ｒ１である。
配列番号３０： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８０２番塩基が変異領域Ｒ２である。
配列番号３１： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８１０番塩基が変異領域Ｒ３である。
配列番号３２： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８０４番塩基が変異領域Ｒ４である。
配列番号３３： 染色体１番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（ｄｅｌｔａ０１遺伝子）（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）のｃＤＮＡ配列であり、４０２番～５７２番塩基がエクソン６であり、４７１番～４９０番塩基が標的配列である。
配列番号３４： ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン６であり、７０番～８９番塩基が標的配列である。
配列番号３５： ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン６の標的配列
配列番号３６： 染色体１０番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（ｄｅｌｔａ１０遺伝子）（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）のｃＤＮＡ配列であり、１０６番～２７４番塩基がエクソン２であり、１３６番～１５５番塩基が標的配列である。
配列番号３７： ｄｅｌｔａ１０遺伝子のエクソン２であり、３１番～５０番塩基が標的配列である。
配列番号３８： ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン２の標的配列
配列番号３９： ＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）のｃＤＮＡ配列であり、２０９番～３９３番塩基がエクソン４であり、２８３番～３０２番塩基が標的配列である。
配列番号４０： ＮＳＩ遺伝子のエクソン４であり、７４番～９３番塩基が標的配列である。
配列番号４１： ＮＳＩ遺伝子のエクソン４の標的配列
配列番号４２： ｄｅｌｔａ０１遺伝子検出用のプライマー７
配列番号４３： ｄｅｌｔａ０１遺伝子検出用のプライマー８
配列番号４４： ｄｅｌｔａ１０遺伝子検出用のプライマー９
配列番号４５： ｄｅｌｔａ１０遺伝子検出用のプライマー１０
配列番号４６： ＮＳＩ遺伝子検出用のプライマー１１
配列番号４７： ＮＳＩ遺伝子検出用のプライマー１２
配列番号４８： ｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異領域Ｄ０１１
配列番号４９： ｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異領域Ｄ０１２
配列番号５０： ｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異領域Ｄ０１３
配列番号５１： ｄｅｌｔａ１０遺伝子の変異領域Ｄ１０１
配列番号５２： ｄｅｌｔａ１０遺伝子の変異領域Ｄ１０２
配列番号５３： ＮＳＩ遺伝子の変異領域Ｎ１
配列番号５４： ＮＳＩ遺伝子の変異領域Ｎ２
配列番号５５： 変異ｄｅｌｔａ０１遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４７１番～４８８番塩基が変異領域Ｄ０１１である。
配列番号５６： 変異ｄｅｌｔａ０１遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４７０番～４８７番塩基が変異領域Ｄ０１２である。
配列番号５７： 変異ｄｅｌｔａ０１遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４７０番～４８４番塩基が変異領域Ｄ０１３である。
配列番号５８： 変異ｄｅｌｔａ１０遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、１３５番～１５４番塩基が変異領域Ｄ１０１である。
配列番号５９： 変異ｄｅｌｔａ１０遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、１３５番～１５１番塩基が変異領域Ｄ１０２である。
配列番号６０： 変異ＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、２８３番～３０３番塩基が変異領域Ｎ１である。
配列番号６１： 変異ＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、２８３番～２９３番塩基が変異領域Ｎ２である。
配列番号２： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２であり、１３５番～１５４番塩基が標的配列である。
配列番号３： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のエクソン２内の標的配列
配列番号４： ＲＬＫ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０９１８４０）のｃＤＮＡ配列であり、１番～２８１８番塩基がエクソン１であり、７９０番～８０９番塩基が標的配列である。
配列番号５： ＲＬＫ遺伝子のエクソン１であり、７９０番～８０９番塩基が標的配列である。
配列番号６： ＲＬＫ遺伝子のエクソン１内の標的配列
配列番号７： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子検出用のプライマー１
配列番号８： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子検出用のプライマー２
配列番号９： ＲＬＫ遺伝子検出用のプライマー３
配列番号１０： ＲＬＫ遺伝子検出用のプライマー４
配列番号１１： ＴＹＬＣＶ検出用のプライマー５
配列番号１２： ＴＹＬＣＶ検出用のプライマー６
配列番号１３： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ１
配列番号１４： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ２
配列番号１５： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ３
配列番号１６： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ４
配列番号１７： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ５
配列番号１８： ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の変異領域Ｉ６
配列番号１９： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ１
配列番号２０： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ２
配列番号２１： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ３
配列番号２２： ＲＬＫ遺伝子の変異領域Ｒ４
配列番号２３： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４７１番塩基が変異領域Ｉ１である。
配列番号２４： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ２である。
配列番号２５： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ３である。
配列番号２６： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ４である。
配列番号２７： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６１番塩基が変異領域Ｉ５である。
配列番号２８： 変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４５１番～４６７番塩基が変異領域Ｉ６である。
配列番号２９： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８０４番塩基が変異領域Ｒ１である。
配列番号３０： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８０２番塩基が変異領域Ｒ２である。
配列番号３１： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８１０番塩基が変異領域Ｒ３である。
配列番号３２： 変異ＲＬＫ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、７９０番～８０４番塩基が変異領域Ｒ４である。
配列番号３３： 染色体１番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（ｄｅｌｔａ０１遺伝子）（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ１０３４８０）のｃＤＮＡ配列であり、４０２番～５７２番塩基がエクソン６であり、４７１番～４９０番塩基が標的配列である。
配列番号３４： ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン６であり、７０番～８９番塩基が標的配列である。
配列番号３５： ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン６の標的配列
配列番号３６： 染色体１０番に存在するｄｅｌｔａＣＯＰ遺伝子（ｄｅｌｔａ１０遺伝子）（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０３８１２０）のｃＤＮＡ配列であり、１０６番～２７４番塩基がエクソン２であり、１３６番～１５５番塩基が標的配列である。
配列番号３７： ｄｅｌｔａ１０遺伝子のエクソン２であり、３１番～５０番塩基が標的配列である。
配列番号３８： ｄｅｌｔａ０１遺伝子のエクソン２の標的配列
配列番号３９： ＮＳＩ遺伝子（Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０７４９１０）のｃＤＮＡ配列であり、２０９番～３９３番塩基がエクソン４であり、２８３番～３０２番塩基が標的配列である。
配列番号４０： ＮＳＩ遺伝子のエクソン４であり、７４番～９３番塩基が標的配列である。
配列番号４１： ＮＳＩ遺伝子のエクソン４の標的配列
配列番号４２： ｄｅｌｔａ０１遺伝子検出用のプライマー７
配列番号４３： ｄｅｌｔａ０１遺伝子検出用のプライマー８
配列番号４４： ｄｅｌｔａ１０遺伝子検出用のプライマー９
配列番号４５： ｄｅｌｔａ１０遺伝子検出用のプライマー１０
配列番号４６： ＮＳＩ遺伝子検出用のプライマー１１
配列番号４７： ＮＳＩ遺伝子検出用のプライマー１２
配列番号４８： ｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異領域Ｄ０１１
配列番号４９： ｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異領域Ｄ０１２
配列番号５０： ｄｅｌｔａ０１遺伝子の変異領域Ｄ０１３
配列番号５１： ｄｅｌｔａ１０遺伝子の変異領域Ｄ１０１
配列番号５２： ｄｅｌｔａ１０遺伝子の変異領域Ｄ１０２
配列番号５３： ＮＳＩ遺伝子の変異領域Ｎ１
配列番号５４： ＮＳＩ遺伝子の変異領域Ｎ２
配列番号５５： 変異ｄｅｌｔａ０１遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４７１番～４８８番塩基が変異領域Ｄ０１１である。
配列番号５６： 変異ｄｅｌｔａ０１遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４７０番～４８７番塩基が変異領域Ｄ０１２である。
配列番号５７： 変異ｄｅｌｔａ０１遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、４７０番～４８４番塩基が変異領域Ｄ０１３である。
配列番号５８： 変異ｄｅｌｔａ１０遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、１３５番～１５４番塩基が変異領域Ｄ１０１である。
配列番号５９： 変異ｄｅｌｔａ１０遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、１３５番～１５１番塩基が変異領域Ｄ１０２である。
配列番号６０： 変異ＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、２８３番～３０３番塩基が変異領域Ｎ１である。
配列番号６１： 変異ＮＳＩ遺伝子のｃＤＮＡ配列であり、２８３番～２９３番塩基が変異領域Ｎ２である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】